KR101383340B1 - 애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법 - Google Patents

애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법에 관한 것이다.

Description

애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법{Method for Controling Growth and Development in the Arabidopsis Shoot System}
본 발명은 애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법에 관한 것이다.
일반적으로 식물은 줄기 세포를 가지고 있고, 그들은 각각 두 반대편 극인 슛(shoot)과 뿌리 분열조직(meristems)에서 자기재생(self-renewal)을 하고 미분화 상태이다(Weigel D, and Jurgen, G (2002) Nature 415: 751-754; Laux T (2003) Cell 113: 281-283; Scheres B (2007) Nat Rev Mol Cell Biol 8: 345-354). 배 발생 동안, 슛과 뿌리 분열조직이 확립되고 식물 생활사를 통하여 유지된다. 일반적으로 슛 분열조직으로부터 기중 기관(aerial organs)과 뿌리 분열조직으로부터 지하 부분(underground parts)을 생성하는 유전적 프로그램이 서로 독립적일 것이라고 믿어 왔다. 그러나 비록 개별적인 분자적 구성요소에서 다양성을 보이지만, 여러 증거들이 Arabidopsis thaliana의 슛 및 뿌리 분열조직에서 발달 과정의 조절기작이 근본적로는 서로 상당히 유사함을 시사한다. 예를 들어, CLAVATA (CLV)/WUSCHEL (WUS) 경로는 슛과 뿌리 분열조직 모두에서 줄기 세포 niche의 유지를 조절한다(Casamitjana-Martinez E, 외 (2003) Curr Biol 13: 1435-1441; Fiers M, 외(2005) Plant Cell 17: 2542-2553; Sarkar AK, 외(2007) Nature 446: 811-814; Stahl Y, 외(2009) Curr Biol 19: 909-914).
초기에는, 뿌리 radial 패턴닝의 주된 조절자로 동정된(Benfey PN, 외(1993) Development 119: 57-70; Di Laurenzio L, 외(1996) Cell 86: 423-433;Helariutta Y, 외(2000) Cell 101: 555-567), SHR 및 SCR 또한 뿌리 줄기 세포 niche의 유지(Sabatini S, 외(2003) Genes Dev 17: 354-358), 여러 맥관 조직의 분화(Carlsbecker A, 외(2010) Nature 465: 316-321; Yu NI, 외(2010) Mol Cells 30: 113-119; Cui H, 외(2011) Plant Physiol 157: 1221-1231), 및 지근과 부정근(adventitious root)의 발달의 유지에서 중요한 역할을 한다(Lucas M, 외(2011) Plant Physiol 155: 384-398). 뿌리에서 발달적 결손 이외에, Fukaki H, 외(1998)Plant J 14: 425-430는 그러한 radial 패턴닝이 슛에서 보존되는 것 같고, SHR 및 SCR에서 돌연변이는 줄기 및 배축(hypocotyl) 모두를 중력 센싱을 위한 기능적인 내피/전분 집층(endodermis/starch sheath layer)을 결손되게 한다는 것을 보였다.
본 발명에서, 본 발명자들은 슛 시스템에서 SHR 및 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23) 사이의 상호작용의 분자적 상세도를 보고한다. 본 발명자들은 슛 시스템에서 새로운 SHR/SCL23 경로의 기능을 분석하였다. 구체적인 발현 분석에서, 본 발명자들은 SHR 및 SCL23 모두는 떡잎(cotyledons) 및 잎의 맥관구조(vasculature)에서 동시 발현되었다는 것을 발견하였다. 흥미롭게도, SCL23의 전사는 SHR에 의하여 조절되고 그것은 SCL23 프로모터에 직접적으로 결합하고 그 결합은 SCL23-의존적이다. 그러므로 SHR 및 SCL23은 뿌리 시스템에서 단백질 복합체를 형성하는 것으로 사료된다. 분자유전학적인 분석을 통해 SHR은 슛 성장 및 발달에서 주된 조절자로 작용하는 반면 SHR의 다운 스트림에서 작용하는 SCL23 및 SCR은 부분적으로 기능적으로 과잉(redundant)일 것임을 발견하였다. 또한 본 발명자들은 SCL23 또는 SCL23 - SRDX를 과발현하는 형질전환 Arabidopsis 식물체를 제조하였다. 흥미롭게도, 양 형질전환 식물체에서 그 SHR 발현은 감소하였고 지체된 슛 성장 및 발달을 야기하였다. 게다가, shr scl23 scr 삼중 돌연변이체는 둥근 형태 잎, 매우 짧아진 잎자루(petioles) 및 지연된 개화기(flowering)를 포함하는 새로운 슛 형태를 나타내었다. 이 결과들과 일치하여, 개화 관련된 유전자들의 전사 수준은 삼중 돌연변이체에서 구별되게 변화하였다.
따라서 세 GRAS 전사 조절자(SHR, SCL23 및 SCR)의 분자적 상호작용은 슛 시스템에서 성장과 발달을 조절한다. 이러한 결과는 식물 성장 및 발달의 조절에서 SHR/SCL23/SCR 조절 모듈에 대한 더욱 깊은 이해를 제공한다.
관련특허로 대한민국 특허공개번호 제1020110092148호는 식물의 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ATHG1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도에 관한 것으로, 식물의 노화 지연 기능 및 스트레스 내성 기능을 갖는 ATHG1 단백질과 그 유전자 및 이들의 용도를 개시하고, 상기 유전자로 형질전환된 식물체는 식물체의 노화를 지연시키고, 생산량 증가 특성을 보이며, 환경 스트레스 특히 산화 스트레스 및 가뭄 스트레스에 내성을 보인다고 기재되어 있다.
본 발명은 상기의 필요성에 의하여 안출된 것으로서 본 발명의 목적은 애기장대 슛 시스템에서 성장 및 발달을 조절하는 방법을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 식물에서 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23) 유전자를 과발현하는 형질전환체를 제조하여 잎의 성장 및 발달을 지체시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식물은 Arabidopsis thaliana인 것이 바람직하나 이에 한정되지 아니한다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23)유전자는 서열번호 1의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 돌연변이를 유도하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
또 본 발명은 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23) 유전자를 과발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계, (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계, (c) 잎의 성장 및 발달이 지연된 표현형을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 잎의 성장 및 발달이 지연된 식물체의 제조 방법을 제공한다.
또 본 발명은 식물에서 SHORT-ROOT (SHR), SCARECROW (SCR) 및 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23) 삼중 돌연변이체를 유도하여 식물의 개화시기를 늦추는 방법을 제공한다.
본 발명의 삼중 돌연변이체는 각각의 변이체 shr-2 (Helariutta Y,외 (2000) Cell 101: 555-567)), scr-5 (Paquette and Benfey 2005,Plant Physiology, June 2005, Vol. 138, pp. 636-640), scl23-1(Lee MH, 외(2008) Plant Mol Biol 67: 659-670)에 언급되어 있으며, 이를 각각 교배해서 삼중 변이체를 제작하였다.
본 발명의 삼중변이체 제작은 상기 기재된 이미 알려진 각각의 변이체들을 교배를 통해 확보하였다.
구체적으로 shr-2 변이체는 ((Helariutta Y,외 (2000) 논문 페이지 3의 그림 2C) 10 bp deletion과 431　bp insertion이 있고, scr-5 (Paquette and Benfey 2005,Plant Physiology.sup의 페이지 1 참조) point mutation in codon 239 CAG가 stop codon TAG로 치환되어있고,　scl23-1 (Lee MH, 외(2008) Plant Mol Biol 67 페이지 5의 그림 2 참조) T-DNA가 삽입된 변이체이며, 이들을 일일이 교배를 하여 각각의 유전자에 변이가 있다는 것을 찾아 삼중변이체를 제작하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 SHORT-ROOT (SHR) 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 돌연변이를 유도하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 SCARECROW (SCR) 유전자는 서열번호 3의 염기서열을 가지는 것이 바람직하나 이들 서열에 하나 이상의 돌연변이를 유도하여 본 발명이 목적하고자 하는 효과를 달성하는 모든 돌연변이체도 본 발명의 범위에 포함된다.을 가지는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기를 늦추는 방법.
이하 본 발명을 설명한다.
GRAS 전사 조절자 SHORT-ROOT (SHR) 및 SCARECROW (SCR)는 Arabidopsis thaliana의 뿌리에서 기본 조직 패터닝(ground tissue patterning) 및 줄기 세포 유지에서 중요한 역할을 한다. 본 발명자들은 SHR이 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23)와 상호작용을 하는 분자적 상세도를 제공한다. 그 SHR-상호작용하는 SCL23이 SCL23 프로모터에 직접적으로 결합하는 SHR에 의하여 전사 조절을 당한다. SCL23 프로모터에 SHR 결합은 SCL23 자신에 의존하고, 그것은 SHR 및 SCL23은 단백질 복합체를 형성할 수 있다는 것을 시사한다. 흥미롭게도, SCL23 또는 SCL23 - SRDX의 과발현은 SHR mRNA 축적 및 SHR 단백질 운동을 감소시키고 지체된 슛 성장 및 발달을 야기한다.
이하 본 발명을 상세하게 설명한다.
슛 시스템에서 shr 표현형의 분석
슛 시스템에서 SHR의 역할을 조사하기 위하여, 본 발명자들은 shr 돌연변이체의 더 상세한 표현형 분석을 수행하였다. Columbia (Col-0) 야생형 식물체와 비교하여, shr는 rosette 잎의 크게 감소된 크기를 가지는 왜소한 슛 성장을 나타내었다(도 1A). shr -2 (null allele)의 잎 면적은 야생형의 것에 약 10분의 1이다(도 1B). shr-2 잎에서 세포수는 Col-0와 비교하여 3배 이상 감소하였다(도 1C). 또 shr -2 잎에서 세포 크기는 약 3 배 감소하였다(도 1D). 또, shr -2도 일차 꽃대(primary inflorescence stems)에서 관다발의 수와 배열에서 가시적인 결손을 보였다(도 1E). 실시예의 성장 조건 하에서, shr의 식물 키는 야생형의 약 20%인(Col-0 29.1±4.24 vs. shr -2 6.3±2.47 or shr -6 5.0±1.78) 반면에, 절간(internodes)의 수는 주어진 시간(6주령)에서 크게 다르지 않았다(표 1). 흥미롭게도 각 절간의 길이는 Col-0의 것과 비교하여 shr에서 더 짧았고, 이것은 shr에서 줄기 신장의 저해를 시사한다. 또, siliques의 수는 야생형과 비교할 때 shr에서 크게 감소하였다(표 1). 장일 조건 하에서, shr의 개화 시기는 Col-0의 것 보다 약간 빨라졌다(표 2). SHR에서 돌연변이체는 슛 시스템에서 형태적으로 및 생리적인 결손을 나타내었다.
Figure 112012047534550-pat00001
표 1은 발아 6주 후 Col-0, shr, 및 scr 식물체의 정량 분석을 나타낸 표. 값들은 평균± SE (표준 편차)를 나타냄 (n>50).
Figure 112012047534550-pat00002
표 2는 장일 조건 하에서 Col-0 및 shr 식물체의 개화시기를 나타낸 표.
값들은 평균± SE (표준 편차)를 나타냄 (n>50).
슛 시스템에서 SHR 발현의 분석
본 발명자들은 in situ 교잡에서 mRNA 및 프로모터-GUS 융합 분석의 두 독립적인 접근에 의하여 슛에서 SHR의 발현 패턴을 분석하였다. SHR mRNA는 경정분열조직(shoot apical meristem)에서 검출되지 않았지만, 그것의 발현은 슛 맥관구조에서만 관찰되었다(도 2A). GUS 마커 유전자에 SHR 프로모터의 전사적 융합체를 운반하는 형질전환 Arabidopsis 식물체(pSHR :: GUS)의 분석은 GUS 발현은 잎 및 자엽의 유관속 조직에서 현저하게 검출되었다(도 2, B 및 C). 또한, pSHR :: GUS의 발현은 체관부로부터 배제된 꽃대의 맥관구조에서도 발견되었다(도 2D). 슛 맥관구조 조직에서 SHR mRNA의 축적은 슛 시스템에서 그것의 기능에 강한 지지를 제공한다.
슛 맥관구조에서 SHR -상호작용 파트너 SCL23
본 발명자들은 주로 프로모터-GUS 전사 융합체(pSCL23::GUS)에 의하여 SCL23의 조직 특이적인 발현 패턴 및 정량적인 실시간 polymerase chain reaction (qRT-PCR) 결과(도 10)에 의하여 분석하였다. SCL23 발현은 자엽(cotyledons), 잎, 슛 분열조직 및 꽃대를 포함하는 슛 시스템에서만 관찰되었다(도 3, A-D). SCL23 및 SHR 모두는 잎의 맥관구조에서 주로 검출되었다(도 2C 및 3B). 이것은 SCL23 은 슛 성장 및 발달 동안 SHR 경로에 관여한다는 것을 시사한다.
본 발명자들은 SHR 프로모터의 조절하에서 SCL23-GFP 번역 융합체(pSHR :: SCL23 - GFP)를 작동하여 인접한 세포로 SCL23이 이동하여 그 융합체 유전자가 중심주(stele)에서 발현되게 하는지를 테스트하였다 (Helariutta Y, 외 (2000)Cell 101: 555-567; Nakajima K, 외(2001) Nature 413: 307-311; Gallagher KL, 외(2004)Curr Biol 14: 1847-1851). SCL23-GFP의 위치는 뿌리 중심주에서만 관찰되었고, 그것은 SCL23이 인접한 세포로 이동하지 않는다는 것을 시시한다(도 11). pSHR :: SCL23 - GFP 융합체를 운반하는 형질전환 Arabidopsis 식물은 내피 및 피층에서 일어나는 비대칭 분열에서 결손을 나타낸다(도 11B).
요약하면, SHR-상호작용 SCL23 단백질은 세포간 이동을 나타내지 않고, 슛 시스템의 맥관 구조에서 SCL23 및 SHR의 동시발현은 SHR 경로에서 SCL23의 가능한 연관을 시사한다.
shr , scl23 및 scr 사이의 유전적 관련성
본 발명자들은 shr (shr -2) 및 scl23 (scl23 -1)의 강한 null alleles를 상호 교배시켜서 shr scl23 이중 돌연변이체를 제조하였다. 유식물(seedling) 단계에서, shr scl23 이중 돌연변이체는 shr 단일 돌연변이체와 비슷한 표현형을 나타내었다(도 4, A-D). shr scl23 슛 표현형도 shr의 것과 차이가 없었고(도 4, E-H), shr가 scl23에 상위성(epistatic)이라는 것을 시사한다. 따라서 SHR은 SCR의 업스트림을 작용을 한다.
scl23이 가시적인 표현형의 차이를 나타내지 않은 관찰에 기초하여, 본 발명자들은 SCL23이 SCR과 중복적으로 작용할 수 있을 것으로 추론하였다. 따라서, 본 발명자들은 scl23 (scl23-1) 및 scr (scr-3)를 교차하여 SCL23 및 SCR 사이의 유전적 상호작용을 조사하였다. 결과적으로, scl23 scr 이중 돌연변이체는 유식물 단계에서 뿌리에서 SCL23 발현이 발견되지 않는 것을 확증하는 scr 단일 돌연변이체와 거의 동일한 뿌리 표현형을 나타낸다(도 5, A-D). 그러나 scl23 scr의 rosette 잎은 scr과 비교하여 크기에서 더 작았고(도 5, E-H), 그것은 SCL23 및 SCR이 부분적으로 잎 성장 및 발달의 조절에서 중복된다는 것을 시사한다. SCL23 및 SCR 사이의 중복된 관계를 더 증명하기 위하여, 본 발명자들은 scr 배경에서 35S Cauliflower Mosaic Virus 프로모터를 사용하여 SCL23를 과발현하는 형질전환 식물체(35S::SCL23)를 제조하였다. 그 결과, SCL23의 과발현은 잎에서 scr 표현형을 부분적으로 복원할 수 있음을 확인하였다(도 5, F, I 및 J).
상기의 내용을 종합하여, shr는 scl23 및 scr 모두에 상위적이고, 이것은 SHR이 뿌리 및 슛 시스템 모두에서 주된 조절자로 작용한다는 것을 시사한다. 또 SCL23 및 SCR 는 잎 성장 및 발달의 조절에서 부분적으로 중복된 역할을 하는 것 같다.
SHR에 의한 SCL23 의 전사적 조절
SCL23이 SHR와 상호작용을 하고, SCL23이 SCR와 가장 근접한 유사 유전자라는 발견에 기초하여, 본 발명자들은 SCL23의 전사도 SHR 전사 조절자에 의하여 조절을 당하는 지를 조사하였다. 이 가설을 테스트하기 위하여, 본 발명자들은 먼저 pSCL23::GUS 전사 융합체 및 qRT-PCR를 채택하여서 shr에서 SCL23의 발현을 조사하였다. shr 배경에서, pSCL23::GUS의 수준 및 원래 SCL23 mRNA 축적은 실질적으로 감소하였고(도 6, A 및 B), 이것은 SCL23 발현이 SHR에 의하여 조절되는 것 같다는 것을 시사한다. 본 발명자들은 SHR가 SCL23 프로모터에 결합하는지에 대한 정보를 얻기 위하여 크로마틴 면역침전(ChIP)-qPCR 실험을 수행하였다. 프로모터 스캐닝 중에서, 본 발명자들은 SHR가 SCR 프로모터의 SHR-결합 부위를 비교대조군으로 포함된 경우에 SCL23 프로모터와 상호작용한다는 것을 발견하였다(도 6C).
특히, 본 발명자들은 SHR가 SCL23 프로모터에 직접 결합하는지를 테스트하기 위하여 SCL23 프로모터 부위 중 특정 부분(-550)에 초점을 맞추었다. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)를 이용하여 본 발명자들은 SHR가 농도의존적으로 distal cis-element에 직접 결합한다는 것을 보였다(도 6D). 또한, 본 발명자들은 SCL23 cis-element에 SHR의 결합이 SCL23 그 자체에 의존적인지를 테스트하였다. ChIP-PCR에 의하여 scl23에서 조사된 경우, 그 부위에 SHR 결합의 향상(enrichment)은 실질적으로 감소되었다(도 6E). SHR 및 SCR의 동시 발현과 함께 이 사실은 슛에서 SHR이 SCL23의 전사 조절을 위한 프로모터에 직접적으로 결합한다는 것을 시사한다. 또, SHR 및 SCL23은 슛 시스템에서 단백질 복합체를 형성하는 것으로 해석할 수 있다.
SCL23 의 과발현은 잎 성장 및 발달에 결손을 야기
다음으로 본 발명자들은 scl23 (scl23 -1)의 강한 null allele가 가시적인 결손을 나타내지 않았기 때문에 35S CaMV 프로모터 하에서 SCL23 (35S:: SCL23) 또는 SCL23 - SRDX (35S:: SCL23 - SRDX)을 과발현하는 형질전환 Arabidopsis 식물체를 제조하였다. 야생형 배경에서 SCL23의 과발현(35S:: SCL23)은 Col-0의 것보다 약간 더 작은 rosette 잎을 야기하였다(도 5, E 및 J). 앞에서 언급한 것과 같이, scr에서 35S:: SCL23는 scr 잎 표현형을 부분적으로 억제할 수 있었다(도 5I). SCL23-SRDX의 과발현은 잎에서 더 극적인 표현형을 나타내었고(도 7, A 및 B), 따라서 본 발명자들은 추가적인 분석을 위하여 35S:: SCL23 - SRDX 식물체에 주목하였다. rosette 잎의 수와 길이는 Col-0의 것과 비교해서 35S:: SCL23 - SRDX 식물체에서 실질적으로 감소하였다(도 7, C 및 D). 또, 잎 잎자루의 길이는 35S:: SCL23 - SRDX에서 실질적으로 짧아졌다(도 7E). 또, Col-0에서 siliques는 수분에서 점차적으로 길어진 반면에 35S::SCL23-SRDX의 silique 신장은 제한되었다(도 7F). 더 흥미롭게도, SHR mRNA 축적의 수준은 SCL23의 과발현에서 실질적으로 감소되었다(도 12A). 게다가, 인접한 내피로 SHR 단백질의 이동은 Col-0에서와 비교하여서 35S:: SCL23에서 크게 감소되었다(도 12B-D). SHR 프로모터에 의한 SCL23의 유도는 SHR 운동을 적어도 부분적으로 억제한다(도 11).
상기의 결과를 종합하면, 본 결과는 SCL23 및 SCL23 - SRDX의 과발현에서 잎의 지체된 성장 및 발달은 SHR 단백질이 SCR의 발현이 활성화되는 인접한 세포로의 이동과 SHR mRNA의 감소에 부분적으로 기인한다. 따라서SHR/SCR 모듈과 마찬가지로 SCL23은 잎 성장 및 발달에서 역할을 하는 것 같다.
shr scl23 scr 삼중 돌연변이체는 새로운 슛 표현형을 나타냄
SHR, SCL23 및 SCR의 기능적인 상호작용을 더 입증하기 위하여 본 발명자들은 shr scl23 scr 삼중 돌연변이체를 제조하였다. 정상적인 성장 조건 하에서, 본 발명자들은 타입 I 및 II로 명명한 두 타입의 삼중 돌연변이체가 있다는 것을 발견하였다. 약 70%의 삼중 돌연변이체가 타입 I으로 30%가 타입 II으로 분류될 수 있다.
두 타입의 삼중 돌연변이체는 Col-0, 단일 또는 이중 돌연변이체와 비교하여 아주 짧아진 잎자루를 가지는 둥근 형태의 rosette 잎을 나타내었다(도 8, A-I). 표현형의 공통성에도 불구하고, 타입 I 및 II 사이의 차이는 ~3-4 꽃차례(inflorescences)가 타입 I에서는 같이 일어나지만(도 8G), 단지 1차 꽃차례만이 타입 II에서는 나온다(도 8H)는 점에서 구별되게 관찰될 수 있었다. 비교된 경우, 그 삼중 돌연변이체의 식물 키는 shr -2, shr scl23 및 shr scr 와 차이가 없이 비슷하였고(도 8J), 이것은 SHR이 주된 조절자인 것 같다는 것을 시사한다.
또 scl23 scr의 키는 scr 단일 돌연변이체보다 더 짧고(도 8J), 이것은 SCL23 및 SCR이 슛 성장 및 발달에서 부분적으로 중복된다는 것을 확증한다. 흥미롭게도, rosette 잎들의 수는 이중 돌연변이체 조합과 비교하여 shr scl23 scr에서 증가하였고(도 8K), 이것은 개화 시간의 지체를 시사한다. Col-0에서, 꽃차례의 작업 빈도(bolting frequency)는 결국 종결되었다[25 DAG에서 60% vs. 28 DAG에서 100%], 반면에 shr scl23 scr는 꽃차례 bolting의 빈도에서 큰 감소를 보였다[25 DAG에서 ~35% vs. 28 DAG에서 ~55%] (도 8L).
shr scl23 scr의 늦은 개화 표현형은 본 발명자들은 삼중 돌연변이체에서 개화 관련 유전자들의 수준을 조사하게 하였다. 테스트한 개화 관련 유전자들 중에서, 삼중 돌연변이체 슛에서 FT (FLOWERING LOCUS T), SOC1 (SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CO 1) 및 SPL3 (SQUAMOSA PROMOTER - BINDING - LIKE PROTEIN 3)의 전사 수준이 감소하였고, 반면에 FLC (FLOWERING LOCUS C)의 발현은 증가되었다(도 13). 이들 데이터들은 삼중 돌연변이체는 크기가 작고 늦은 개화를 가진다는(도 8) 사실과 일치하였다. 대조적으로, 다른 계수들(잎 면적, 세포 크기, 세포 수 및 silique 길이는 shr scl23 scr 와 이중 돌연변이체 조합 사이에 구별되지 않았다 (도 14).
결론적으로, 이 사실들은 슛 시스템에서 세 GRAS 전사 조절자(SHR, SCL23 및 SCR)가 포지티브 조절자로 작용한다는 것을 시시한다.
본 발명을 통해서 알 수 있는 바와 같이, 본 발명은 슛 시스템에서 세 GRAS 전사 조절자 SHR, SCL23 및 SCR의 분자적 상호작용을 나타내었다(도 9). SHR는 각각 슛 맥관 구조에서 SCL23의 발현 및 내피/유관속초/전분 속초(endodermis/bundle sheath/starch sheath)에서 SCR의 발현을 활성화한다. SHR에 의한 SCL23 및 SCR의 전사 활성화는 각각 SCL23 및 SCR에 의존적이고, 이것은 따라서 발달 피층에서 SHR이 SCL23 또는 SCR과 헤테로다이머를 형성할 수 있다는 것을 시사한다.
또한, SCL23의 과발현은 SHR mRNA 축적과 SHR 단백질 이동 모두를 감소시킬 수 있고 그것은 SHR 기능의 항상성이 유지될 수 있도록 조절하는 일종의 네거티브 피드백 기작을 시사한다. 주된 조절자 SHR 및 그것의 직접적 타겟 SCL23 및 SCR의 상호작용은 개화를 포함하는 Arabidopsis 슛 시스템의 성장 및 발달을 조절한다.
도 1은 shr 슛 표현형의 특징을 나타냄. A, 장일 조건 하에서 25 DAG (days after germination)에서 Col-0, shr -2 및 shr -6 (왼편에서 오른편)의 토양 성장된 성체 식물(Bar = 1 cm). B, Col-0 및 shr -2 (n>20)에서 처음 두 잎의 잎 날개 면적(blade area)의 측정. C, Col-0 및 shr -2 (n>20)에서 처음 두 잎의 잎 당 세포 수 측정. D, Col-0 및 shr -2 (n>20)에서 처음 두 잎의 싱글 세포 크기. E, Col-0 및 shr -2 일차 꽃대(inflorescence stems)의 횡단면(Bar = 100 ㎛). (If, 관다발간 섬유(interfascicular fiber); P, 체관; Pc, 전형성층(procambium); X, 물관부) 차이의 통계적 유의성은 Student's t-테스트에 의하여 결정됨(별표는 P<0.05를 나타냄). 에러 바는 평균들의 표준 편차(SE)를 나타냄.
도 2는 슛 시스템에서 SHR의 공간적 발현 패턴을 나타낸 그림. A, 슛 분열조직에서 in situ 교잡에서 SHR mRNA. B에서 D는 10 DAG에서 유식물 슛 (B), rosette 잎 (C) 및 일차 꽃대(횡단 절편) (D)에서 GUS 전사 융합체(pSHR::GUS)의 조직 특이적 발현(If, 관다발간 섬유(interfascicular fiber); P, 체관; Pc, 전형성층(procambium); X, 물관부). A 및 D에서 바= 100 ㎛, B 및 C에서는 1 cm.
도 3은 슛 시스템에서 SCL23의 조직 특이적 발현을 나타낸 그림. A에서 D는 10 DAG에서 유식물 슛 (A), rosette 잎 (B) 슛 분열조직(C) 및 일차 꽃대(손 절편) (D)에서 GUS 전사 융합체(pSCL23::GUS)의 조직 특이적 발현(If, 관다발간 섬유; P, 체관; Pc, 전형성층; X, 물관부). A 및 B에서 바는 1 cm, C와 D는 100 ㎛.
도 4는 shr scl23 이중 돌연변이체의 표현형 분석을 나타낸 그림. A에서 D, MS 아가 플레이트에서 성장한 Col-0 (A), shr -2 (B), shr -2 scl23 -1 (C) 및 scl23 -1 (D) 유식물(Bars = 1 cm). E에서 H, 흙에서 성장한 Col-0 (E), shr -2 (F), scl23 -1 (G) 및 shr -2 scl23 -1 (H) 3주령의 식물(Bar = 1 cm). 이들 결과들은 shr가 scl23에 상위적이다는 것을 나타냄.
도 5는 scl23 scr 이중 돌연변이체의 표현형 분석을 나타낸 그림. A에서 D, MS 아가 플레이트에서 성장한 Col-0 (A),scr -3 (B), scl23 -1 scr -3 (C) 및 scl23 -1 (D) 유식물(Bar = 1 cm). E에서 J, 흙에서 성장한 Col-0 (E), scr -3 (F), scl23 -1 scr-3 (G), scl23 -1 (H), 35S:: SCL23 in scr -3 (I) 및 35S:: SCL23 (J) 3주령의 식물(Bar = 1 cm). SCL23 및 SCR 모두는 잎 성장 및 발달의 조절에서 부분적으로 중복적인 작용을 하는 것 같다.
도 6은 SHR 전사 조절자에 SCL23의 전사 조절을 나타낸 그림. A, Col-0 및 shr-2에서 pSCL23 :: GUS의 발현. B, qRT-PCR에 의한 Col-0, shr -2 및 scl23 -1에서 SHR 및 SCL23 mRNA축적의 수준. SCL23 발현은 shr -2에서 감소됨. C, pSHR :: SHR - GFP 번역 융합체를 가지는 형질전환 Arabidopsis 식물체를 사용한 SCL23 프로모터의 ChIP-qPCR. SCL23 프로모터에서 대표적인 부분을 나타내고, SCR 프로모터에서 SHR-결합 부위는 포지티브 대조군으로서 포함됨. SHR 단백질은 SCL23 프로모터에 결합. SCL23 프로모터에서 대표적인 부위(ATG로부터 -1,450 bp)를 나타내고, SCR 프로모터에서 SHR-결합부위를 포지티브 컨트롤로 포함. SCL23 프로모터에서 추정적인 SHR결합부위 중, 흰 화살표는 본 발명의 추가분석에 사용된 distal cis-element (-550)를 나타냄. D, SCL23 프로모터의 distal cis-element (-550)의 EMSA. 별표는 그 프로브의 이동 쉬프트를 나타냄. E, Col-0 및 scl23 -1에서 pSHR :: SHR - GFP 번역 융합체를 사용한 SCL23 프로모터의 distal cis-element (-550)의 ChIP-qPCR. 에러바는 세 반복 실험으로부터 평균들의 표준오차를 나타냄.
도 7은 35S:: SCL23 - SRDX 식물체의 특성을 나타낸 그림. 20 DAG에서 Col-0 (A) 및 35S:: SCL23 - SRDX (B)의 Rosette 잎(Bars = 1 cm). 좌에서 우측으로, 순서대로 자엽은 true leaves에 의하여 수반됨. C, Col-0 및 35S:: SCL23 - SRDX의 rosette 및 cauline 잎들의 수, D, 20 DAG에서 형성의 순서에서 잎의 길이. E, 20 DAG에서 잎자루의 길이. F, Col-0 및 35S:: SCL23 - SRDX의 Silique 길이. 차이의 통계적 유의성은 Student's t-테스트에 의하여 결정됨(별표는 P<0.05를 나타냄). 에러 바는 n>20에서 평균들의 표준 편차(SE)를 나타냄.
도 8은 shr scl23 scr 삼중 돌연변이체의 표현형 분석을 나타낸 그림. A에서 I, 흙에서 성장한 3주령의 shr scl23 scr의 shr -2 (A), shr -2 scl23 -1 (B), scl23-1 (C), scr -3 (D), scl23 -1 scr -3 (E), shr -6 scr -5 (F), 타입 I (G), 타입 II (H) 및 Col-0 (I) (Bar = 1 cm). 삼중 돌연변이체들은 둥근 형태 잎 및 짧아진 잎자루를 가지는 크기가 매우 작았다. J, 식물체의 크기 측정. K, rosette 잎, cauline 잎, 및 이차 가지의 수. L, 25 DAG (적색) 및 28 DAG (청색) 모두에서 bolting의 빈도수(n>30). 삼중 돌연변이체들은 지연된 개화 시간을 나타내었다. 에러 바는 평균들의 SE를 나타냄.
도 9는 슛 시스템에서 세 GRAS 전사 조절자 SHR, SCL23 및 SCR의 분자적 상호작용을 위한 도식적 모델을 나타낸 그림. SHR는 각각 맥관 구조에서 SCL23의 발현 및 내피/유관속초/전분 속초에서 SCR 발현을 활성화한다. 과발현된 경우, SCL23은 SHR 발현을 다운 조절할 수 있다. SCL23 및 SCR 단백질 각각은 SHR 단백질과 상호작용을 하고, SHR 운동의 제한을 야기한다(분홍 선). SCL23 및 SCR의 활성화는 각각 SCL23 및 SCR에도 의존한다. 전사 조절은 진한 청색으로 단백질-단백질 상호작용은 분홍으로 나타내었다. 화살은 활성화를 바는 SHR 운동의 제한을 나타냄. 점선은 아직 알려지지 않은 조절을 묘사함.
도 10은 SHR, SCL23 및 SCR 발현을 나타낸 그림. 전사체 수준을 꽃, 잎, 뿌리 및 전체 유식물을 가지고 qRT-PCR로 결정하였다. 에러 바는 세 반복 실험으로부터 평균들의 표준오차를 나타냄.
도 11은 SCL23 단배질이 세포간 이동이 없다는 것을 나타내는 그림.
A,뿌리에서 pSHR :: SHR - GFP의 발현. SHR-GFP의 위치는 quiescent center 및 내피계(endodermis lineage)를 포함하는 인접한 세포 및 중심주(stele) 모두에서 관찰됨.
B, 뿌리에서 SHR 프로모터에 의한 SCL23-GFP의 위치화. SCL23-GFP은 인접한 세포가 아니라 단지 중심주에서만 위치. 백색 화살표는 내피 및 피층에 대한 비대칭 분열에서 결손을 나타냄 (C, 피층; E, 내피). Bars = 100 μm.
도 12는 SCL23 과발현은 SHR mRNA 축적 및 SHR 단백질 이동 모두를 감소시키는 것을 나타낸 그림. A, 20DAG에서 Col-0, scl23 -1, 및 35S:: SCL23 shoots슛에서 SHR의 전사체의 수준. 에러 바는 세 반복 실험으로부터 평균들의 표준오차를 나타냄.
B, 야생형 뿌리에서 pSHR :: SHR - GFP의 발현.
C 및 D,4DAG에서 35S:: SCL23에서 pSHR :: SHR - GFP 의 발현. D, 고 확대.
인접한 세포로 SHR-GFP의 이동은 35S:: SCL23에서 제한됨(C, 피층; E,내피; Ep, 외피; St, 중심주).
도 13은 Col-0 및 삼중 돌연변이체 슛에서 개화 관련 유전자들의 발현을 나타낸 그림. 전사체 수준을 qRT-PCR에 의하여 결정함. A, FLC. B, FT. C, SOC1. D,SPL3. 에러 바는 세 반복 실험으로부터 평균들의 표준오차를 나타냄.
도 14는 A. 첫 번째 두 잎의 shr scl23 scr 삼중 면적의 특징을 나타냄. B, 첫 번째 두 잎의 세포크기. C, 첫 번째 두 잎으로부터 유래한 잎 당 세포 수. D, Col-0, shr -2, shr scl23 및 shr scl23 scr에서 성숙한 잎들의 향축 책상 세포(Adaxial palisade cells). E, Silique 길이. 에러 바는 평균값들(n>30)의 표준오차를 나타냄.
이하 비한정적인 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 단 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 의도로 기재된 것으로서 본 발명의 범위는 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되지 아니한다.
실시예 1:식물 재료 및 성장 조건
본 발명에서 사용된 식물체는 Arabidopsis thaliana ecotype Columbia (Col-0) 및 그 유도체들이다. 본 발명에서 사용된 돌연변이체 및 형질전환주는 하기와 같다: scr -3 (Fukaki H, 외(1998) Plant J 14: 425-430), scr -5 (Gallagher KL, 외(2004) Curr Biol 14: 1847-1851), scl23 -1 (Lee MH, 외(2008) Plant Mol Biol 67: 659-670), shr -2 (Fukaki H, 외(1998) Plant J 14: 425-430; Helariutta Y,외 (2000) Cell 101: 555-567), shr -6 (Yu NI, 외(2010) Mol Cells 30: 113-119), pSHR::GUS(Yu NI,외(2010) Mol Cells 30: 113-119),pSHR :: SHR - GFP (Helariutta Y,외(2000) Cell 101: 555-567; Nakajima K, 외(2001)Nature 413: 307-311) 및 pSCL23::GUS(Lee MH, 외(2008) Plant Mol Biol 67: 659-670).
종자들은 Heo JO, 외 (2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 2166-2171에 기재된 것과 같이 MS 아가 플레이트(1x Murashige-Skoog salts, 0.5 mM MES pH 5.7, 1% sucrose 및 0.8% agar) 상에 위치시켰다. 종자를 가지는 MS 아가 플레이트를 3일 동안 4℃에 두고 계속적인 광 조건하의 22℃의 성장 챔버로 옮겼다. 성체 식물을 위하여, 유식물을 흙으로 옮기고 장일 조건 (16 h 광/ 8 h 암 주기)하에서 22℃에서 완전한 성장까지 성장시켰다.
실시예 2: 잎 표현형의 분석
처음 두 rosette 잎의 디지털 이미지는 스캐너를 사용하여 얻었고, 잎 면적은 Lee BH, 외(2009)Plant Physiol 151: 655-668에 기재된 것과 같이 이미지 분석 프로그램 SCIONIMAGE (Scion Corp.)으로 결정하였다. 그 후 그 잎들을 모아서, 4시간 동안 ethanol:acetic acid (v/v, 6:1)로 고정하고, 100% ethanol로 3회 세척하고 최종적으로 70% ethanol로 1회 세척하였다. 고정된 모든 잎들을 chloral hydrate:glycerol:H2O (8:1:2) 용액에서 청정시키고 슬라이드 글래스에 마운트하였다. Heo JO, 외(2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 2166-2171에 기재된 것과 같이, 샘플들을 Axio Imager.A1 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 차등 간섭 대비(differential interference contrast;DIC) 광학으로 관찰한 후, 그 디지털 이미지를 그 현미경에 구비된 AxioCam MRc5 디지털 카메라(Carl Zeiss)로 얻었다. 세포 면적을 얻기 위하여, 가장 넓은 지점에서 주맥에서 잎둘레(leaf margin)로 중간에 그룹화한 20 세포들을 분석하였고, 향축 아표피층 엽육 세포(adaxial subepidermal mesophyll cells)의 전체 수는 Lee BH, 외(2009)Plant Physiol 151: 655-668에 기재된 것과 같이 세포 면적으로 잎 면적을 나누어서 결정하였다.
실시예 3: 플라즈미드 구축 및 형질전환
pSHR::SCL23-GFP 융합체를 가지는 형질전환체 식물을 제조하기 위하여 SHR 프로모터 및 SCL23의 코딩 부위 모두를 Lee MH, 외(2008) Plant Mol Biol 67: 659-670; Yu NI, 외(2010) Mol Cells 30: 113-119에 기재된 것을 약간 변형하여서 Phusion High-Fidelity DNA polymerase (Finnzymes)로 Col-O 유전자 DNA를 사용하여 증폭하였다. SHR 프로모터의 3'말단 및 SHR23 코딩 부위의 5'말단을 BamHI 제한자리를 가지는 프라이머로 증폭하고 처리하고 pENTRTM/D-TOPO vector (Invitrogen)에 서브클로닝하였다. 그 후 생성된 플라즈미드로부터 pSHR::SCL23 카세트를 제조업자(Invitrogen)의 지시에 따라 pMDC162 Gateway-compatible binary 벡터(Curtis and Grossniklaus, 2003)로 옮겼다. SRDX 프라이머를 가지거나 가지지 않는 SCL23 코딩 부위를 35S CaMV 프로모드의 조절 하에서, 증폭하여 제조업자 지시에 따라서 재조합 반응에 의하여 pEarleyGate100 (Earley KW, 외(2006) Plant J 45: 616-629)에 서브클로닝하였다. 그 생성된 플라즈미드를 Agrobacterium tumefaciens (GV3101)에 넣은 후, floral dipping method (Clough and Bent, 1998)에 의하여 Arabidopsis thaliana Col-0 식물체로 넣었다. 그 프라이머 서열은 표 3에 리스트하였다.
Figure 112012047534550-pat00003
표 3은 본 발명에 사용된 PCR 프라이머의 서열 정보. Gateway-compatible 벡터에서 방향적 클로닝에 대한 서열은 소문자 이태릭체로, SRDX에 대해서는 대문자 이태릭체로 제한 효소 부위는 굵은 대문자 이태릭체로 표시.
실시예 4: GUS 염색 및 현미경법
조직화학적 GUS 어세이에 사용된 프로토콜은 Lee MH, 외(2008)Plant Mol Biol 67: 659-670; Yu NI, 외(2010)Mol Cells 30: 113-119; Heo JO, 외(2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 2166-2171에 기재된 것과 기본적으로 동일하다. 형질전환체 Arabidopsis 식물의 조직 또는 유식물을 모아서 GUS 염색 버퍼(5 mM K3Fe(CN)6, 5 mM K4Fe(CN)6; 0.5 M EDTA pH 8.0, 1 M sodium phosphate buffer pH 7.0, 0.1 % Triton X-100, 및 20 mM 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide)에서 암 조건에서 2에서 16시간 37℃에서 배양하였다. 그 염색은 염색 버퍼를 70% 에탄올 용액으로 대체하여서 종결하였다. GUS-염색된 샘플의 플라스틱 절편을 Technovit 7100 (Heraeus Kulzer)에 충진하고, 계대 절편들을 Yu NI, 외(2010)Mol Cells 30: 113-119에 기재된 것과 같이 HM 355S microtome (Microm)를 사용하여 제조하였다.
샘플들을 Axio Imager.A1 현미경(Carl Zeiss), 또는 Stemi 2000-C stereo microscope (Carl Zeiss)를 사용하여 차등 간섭 대비(differential interference contrast;DIC) 광학으로 관찰하였다. GFP 육안화를 위하여, 4DAG에서 형질전환체 Arabidopsis 유식물의 뿌리를 propidium iodide (10 ㎍/ml) (Sigma)으로 염색하고 Lee MH, 외(2008) Plant Mol Biol 67: 659-670; Yu NI, 외(2010)Mol Cells 30: 113-119; Heo JO, 외(2011) Proc Natl Acad Sci U S A 108: 2166-2171에 기재된 것과 같이 이미지들을 기록하기 위하여 505-530 nm 및 561-700 nm에서 방출 필터와 488 nm 및 543 nm에서 여기 미러를 가지는 Carl Zeiss LSM510 공초점 레이져 스캐닝 현미경으로 관찰하였다.
실시예 5: qRT - PCR 분석
qRT-PCR에 사용된 프로토콜은 Lee MH, 외(2008)Plant Mol Biol 67: 659-670; Yu NI, 외(2010)Mol Cells 30: 113-119; Heo JO, 외(2011)Proc Natl Acad Sci U S A 108: 2166-2171에 기재된 것과 기본적으로 동일하다. Easy-Blue reagent (Intron)로 정제된 총 RNA를 RQ1 RNase free-DNase (Promega)로 처리한 후, 제조업자의 지시에 따라 지노믹 DNA를 제거하기 위하여 RNeasy Plant Mini kit (Qiagen)를 사용하여 더욱 정제하였다. 정제된 RNA의 양과 질을 젤 전기영동 및 분광기를 사용하여 평가하였다.
약 1 ㎍의 전체 RNA를 qRT-PCR를 위한 주형으로 cDNA 합성(iScript cDNA 합성 키트, Bio-Rad)을 위하여 사용하였다. SYBR Premix ExTaq reagents (Takara)을 qRT-PCR 반응에 첨가하고, Mx3000P®QPCR System (Agilent Technologies)을 qRT-PCR에 사용하였다. ACTIN2 (At3g18780) 유전자를 internal 레퍼런스로 사용하였다. 실험은 독립적으로 3회 반복하였고, 데이터들은 Excel statistical package (Microsoft)를 사용하여 분석하였다. 3회 반복의 평균값들과 SE를 비교하기 위하여 수행된 Student's t-test를 나타내었다. 그 프라이머 서열은 표 3에 기재하였다.
실시예 6: ChIP - qPCR
ChIP-PCR에 사용된 프로토콜은 Cui H, 외(2007) Science 316: 421-425;Cui H, 외(2011) Plant Physiol 157: 1221-1231에 기재된 것과 기본적으로 동일하다.
pSHR :: SHR - GFP를 가지는 2주령의 형질전환체 식물들의 슛을 ChIP 분석에 사용하였다. 항-GFP 항체들을 Johnson et al. 2003에 기재된 것과 같이 크로마틴을 침전시키기 위하여 사용하였다. 약 0.5g의 슛을 10분간 진공 하에서 고정 버퍼(1% formamide, 5 mM EDTA in PBS)에서 크로스 링크시켰다. 그 후, 100 mM Glycine 을 그 혼합물에 첨가하고 그 고정을 종료하기 위하여 5분간 배양하였다.
5 mM EDTA를 가지는 미리 냉각한 1X PBS를 첨가하고, 5분간 4℃에서 회전시킨 후 그 고정화된 샘플들을 액체 질소로 갈은 뒤에 추출 버퍼(50 mM Tris pH 7.5, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.1% Na deoxychlorate, 2.5 mM EDTA, 10% glycerol, 1X protease 저해제 칵테일 및 1 mM PMSF)에 재부유한 후 핵을 분리하였다. 그 핵 제조물을 Sonics Ultra Cell sonicator (Sonics Ultra Cell Co.)을 사용하여 크로마틴을 0.5에서 1kb 절편으로 깨기 위하여 소니케이션하였다. GFP-태그된 SHR의 면역침전을 위하여, protein G agarose 비드를 가지는 anti-GFP 항체(Ab290, ABcam)를 4℃에서 16시간 동안 초음파분쇄된 크로마틴 복합체와 함께 배양하고, 세척하고, 용출 버퍼(25 mM Tris pH 8.0, 5 mM EDTA, 및 0.5% SDS)로 65℃에서 15 분간 용출하였다.
그 다음 모아진 상등액을 42℃에서 10분간 RNAase A 와 proteinase K로 연속적으로 배양하였다. 그 후, 그 용액을 새로운 마이크로센트리푸즈 튜브에 옮기고 크로스링킹을 역전시키기 위하여 16시간 동안 65℃에서 가열하였다. 크로마틴을 스핀 컬럼을 사용하여 정제하고 50 ㎕의 TE 버퍼로 용출하였다. 인풋 및 면역침전된 크로마틴을 SCL23 프로모터에 대하여 특이적인 프라이머로 qPCR 분석을 위하여 사용하였다. 포지티브 대조군으로 qPCR에서 공지된 SCR 프로모터 부위(Cui H, 외(2007) Science 316: 421-425)를 포함하였다. 대표적인 프라이머에 대한 서열을 표 3에 리스트하였다.
실시예 7: EMSA
6xHis::SHR 융합 단백질들을 Ni-NTA 아가로스 레진(Qiagen) 상에서 정제하였고, EMSA에 사용하였다. EMSA에 대한 프로브를 크기 약 100에서 200 bp 절편으로 증폭한 후 그 증폭된 프로브들의 표지 반응을 제조업자의 지시에 따라서 3'-말단 DIG Labeling Mix (Roche)로 수행하였다.
EMSA 반응 용액을 제조업자(Thermo Fisher Scientific)의 지시에 따라서 LightShift Chemiluminescent EMSA 키트로 제조하였다. 그 단백질-프로브 혼합물을 6% 폴리아크릴아마이드 네이티브 젤에서 분리하고 Hybond-N+ 나이론 막(Amersham Bioscience)에 옮겼다. DIG 표지된 프로브들의 이동을 제조업자(Roche)의 지시에 따라서 CSPD 작업 용액 컨쥬게이트를 사용하여 X-ray film (AGFA) 상에서 검출하였다.
본 명세서의 서열 데이터는 하기 accession 번호 하에서 Arabidopsis Genome Initiative 또는 GenBank/EMBL 데이터베이스에서 발견될 수 있다: At4g37650 (SHR), At5g41920 (SCL23), At3g54220 (SCR), At5g10140 (FLC), At1g65480 (FT), At2g45660 (SOC1), 및 At2g33810 (SPL3).
서열목록 전자파일 첨부

Claims (7)

  1. 서열번호 1의 염기서열로 이루어진 SCARECROW-LIKE 23 (SCL23) 유전자를 과발현시킬 수 있는 조절 서열에 작동 가능하게 연결되도록 발현벡터에 삽입시키는 단계, (b) 그 발현벡터를 식물체에 형질전환하는 단계, (c) 잎의 성장 및 발달이 지연된 표현형을 갖는 식물체를 선별하는 단계를 포함하는 잎의 성장 및 발달이 지연된 식물체의 제조 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 식물은 Arabidopsis thaliana인 것을 특징으로 하는 잎의 성장 및 발달이 지연된 식물체의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US6441270B1 (en) 1996-04-26 2002-08-27 New York University Scarecrow gene
KR20030028580A (ko) * 2000-08-22 2003-04-08 독립행정법인농업생물자원연구소 외래유전자 산물을 식물의 종자내에 고도로 축적시키는방법
KR20100095868A (ko) * 2009-02-23 2010-09-01 포항공과대학교 산학협력단 개화 지연 또는 성장 억제 기능을 지니는 폴리펩티드, 이를암호화하는 폴리뉴클레오티드 및 이들의 용도

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