CN112481290B - 一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法，包括构建几丁质合成酶多基因干扰载体转化黑曲霉获得形态突变菌株、利用黑曲霉形态突变菌株发酵生产柠檬酸；多基因干扰载体的转录受启动子Pgas和Pgmt调控，实现形态基因在不同条件下的顺序调控；Pgas序列为SEQ ID NO.35、Pgmt序列为SEQ ID NO.36；几丁质合成酶多基因干扰基因为几丁质合成酶基因家族的双基因或三基因组合。本发明成功地在黑曲霉中共干扰几丁质合成酶的双基因或三基因，并提供了一种基于形态基因共干扰的方法提高柠檬酸发酵生产水平的方法，为促进丝状真菌发酵生产有机酸及丝状真菌形态基因相互作用等方面提供了有效的方法和新的思路。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法。
背景技术
黑曲霉是酶、抗生素、有机酸等多种物质的重要工业生产菌，因其安全性较高，培养基原料价格适中，生产率高，通过基因操纵提高有机酸产量的能力强等优势，具有广阔的应用前景。黑曲霉作为柠檬酸工业生产菌株已有近百年的历史，我国是全世界柠檬酸生产大国，特别是2004年以来，我国柠檬酸行业发展迅速，成功进入世界柠檬酸生产强国行列。
丝状真菌黑曲霉在液态培养过程中具有独特的形态学特征，其液体深层发酵菌丝体分为离散菌丝、团块状与球形。离散菌丝形态会增加发酵液的粘度，形成假塑型流体，降低物质和氧气的传递效率；此外还易与搅拌桨缠绕，进而使发酵罐的性能降低，不利于产物的合成。团块状菌丝体形态会严重限制菌体内部营养物质和氧气的传递，也不利于产物的积累；而菌球形态可以降低发酵液的粘度，提高物质和氧气在发酵液中的传递效率，有利于产物的积累。
丝状真菌黑曲霉的菌丝体形态和代谢产物的积累密切相关，因此调控菌丝体形态是控制产物积累的有效方法。直径不超过1mm的细小而致密的球状黑曲霉菌丝体为柠檬酸积累的最佳形态。通过改造单个形态基因来控制黑曲霉菌丝体的形态从而实现目的产物的积累已有报道。但丝状真菌形态建成是多个形态基因共同作用的结果，共同调控多个形态基因可能对其形态调控具有更加明显的效果，获得柠檬酸积累的最优形态，从而进一步提高柠檬酸发酵生产水平，并且探索形态基因间的相互作用关系。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法。
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法，其特征在于：包括构建几丁质合成酶多基因干扰载体转化黑曲霉获得形态突变菌株、利用黑曲霉形态突变菌株发酵生产柠檬酸；多基因干扰载体的转录受启动子Pgas和Pgmt调控，实现形态基因在不同条件下的顺序调控；Pgas序列为SEQ IDNO.1、Pgmt序列为SEQ ID NO.2；几丁质合成酶多基因干扰基因为几丁质合成酶基因家族的双基因或三基因组合，几丁质合成酶多基因干扰基因的核苷酸序列如下：
(1)NCBI登录号为NT_166519.1:c538422-532757的核苷酸序列；
(2)NCBI登录号为NT_166519.1:542477-547414的核苷酸序列；
(3)NCBI登录号为NT_166529.1:185552-189524的核苷酸序列；
(4)NCBI登录号为NT_166525.1:c907538-904183的核苷酸序列；
(5)NCBI登录号为NT_166523.1:c1197203-1193790的核苷酸序列；
(6)NCBI登录号为NT_166527.1:c2418896-2415532的核苷酸序列；
(7)NCBI登录号为NT_166520.1:1423528-1427101的核苷酸序列；
(8)NCBI登录号为NT_166525.1:c505580-501385的核苷酸序列；
(9)NCBI登录号为NT_166524.1:1269741-1272182的核苷酸序列；
(10)NCBI登录号为NT_166527.1:c1813579-1810781的核苷酸序列；
(11)NCBI登录号为NT_166526.1:2652985-2656424的核苷酸序列；
(12)NCBI登录号为NT_166527.1:1259072-1262176的核苷酸序列；
(13)NCBI登录号为NT_166524.1:1057056-1058867的核苷酸序列；
(14)NCBI登录号为NT_166523.1:c2166462-2164417的核苷酸序列。
优选的技术方案为：包括下列步骤：
步骤1：提取丝状真菌黑曲霉的全基因组DNA得到黑曲霉基因组DNA；
步骤2：几丁质合成酶多基因干扰载体的构建，包括以下步骤：
第一步：以步骤1提取到的黑曲霉基因组DNA为模板，以14对引物分别进行扩增几丁质合成酶基因家族14个单基因片段；所述14对引物为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28；
同时，合成Pgas，Pgmt序列，并以步骤1提取到的黑曲霉基因组DNA为模板，以引物Pgas-F和Pgas-R进行扩增Pgas，引物Pgmt-F和Pgmt-R进行扩增Pgmt；
第二步：将第一步得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行双基因及三基因的融合，在基因片段的上游添加Pgas，Pgmt片段，并在该片段两端添加EcoRI酶切位点及保护碱基；
第三步：将上述片段通过SanPrep PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段；
步骤3：构建相应的干扰载体，包括以下步骤：
第一步：将步骤2的第三步得到的纯化酶切片段转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体；
第二步：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
步骤4：接种步骤3的第二步构建得到的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；包括以下步骤：
第一步：摇瓶发酵培养基的制备
25％的玉米粉调浆，加入适量淀粉酶，充分混匀，调pH为6.0-6.5，95℃保温2h，获得玉米液化液，将玉米液化液经200目筛网进行过滤，弃残渣，取清液；将清液：液化液按照4:1的比例进行配制，稀释至总糖为16％；按照0.08g/100mL的浓度加入(NH4)2SO4，得到发酵培养基；
第二步：孢子悬液的制备
将多基因共干扰菌株分散于无菌水中得到孢子悬液；
步骤5：摇瓶发酵
按3x105个/mL的浓度接种孢子悬液至发酵培养基，36.5℃，300rpm发酵72h，即得含有柠檬酸的发酵液。
优选的技术方案为：：双基因组合表达框为Pgas-chsA-chsD，核苷酸序列如SEQIDNO.33所示；三基因组合表达框为Pgas-chsA-chsD-chs，核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
本发明成功地在黑曲霉中共干扰几丁质合成酶的双基因或三基因，并提供了一种基于形态基因共干扰的方法提高柠檬酸发酵生产水平的方法，为促进丝状真菌发酵生产有机酸及丝状真菌形态基因相互作用等方面提供了有效的方法和新的思路。
附图说明
图1为改造菌株柠檬酸产量。
具体实施方式
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
请参阅图1。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
实施例：一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法
一种提高黑曲霉发酵柠檬酸生产水平的方法，其特征在于，所述方法是构建几丁质合成酶多基因干扰载体转化黑曲霉获得形态突变菌株，利用黑曲霉形态突变菌株发酵生产柠檬酸；所述多基因干扰载体的转录受启动子Pgas,Pgmt调控，实现形态基因在不同条件下的顺序调控。
所述几丁质合成酶多基因干扰基因为：几丁质合成酶基因家族中chsA、chsB、chsC，chsD、chs3、chs等14个基因的双基因或三基因组合；所述Pgas,Pgmt启动子均为低pH诱导型启动子，诱导pH分别为2，3。
几丁质合成酶家族相关基因如下：
设计的引物如下：
Pgas,Pgmt启动子均为低pH诱导型启动子，诱导pH分别为2，3，该启动子的序列如---所示。
所述黑曲霉形态突变菌株的构建方法为：
(1)设计并扩增几丁质合成酶家族中14个基因的双基因或三基因组合序列；其特征在于：
包括下列步骤：
步骤1：提取黑曲霉的全基因组DNA；
步骤2：几丁质合成酶多基因干扰载体的构建，包括以下步骤：
第一步：以步骤1提取到的全基因组DNA为模板，以14对引物进行扩增几丁质合成酶基因家族14个单基因片段；同时，合成Pgas、Pgmt并以引物Pgas-F和Pgas-R进行扩增Pgas,Pgmt-F和Pgmt-R进行扩增Pgmt。
第二步：将第一步得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行双基因及三基因的融合，在基因片段的上游添加Pgas,Pgmt片段，并在该片段两端添加EcoRI酶切位点及保护碱基。
第三步：将上述片段进行纯化后,与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段。
(2)构建相应的干扰载体，其特征在于：
包括下列步骤：
步骤1：将上一步得到的酶切纯化后的融合基因片段和pSilent-Dual1片段进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体；
步骤2：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
(3)将步骤2获得的干扰载体转化黑曲霉，抗性筛选和PCR鉴定获得的形态干扰菌株。
(4)接种步骤(3)构建的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；培养结束后进行发酵液中柠檬酸含量及纯度的检测。
包括以下步骤：
步骤一：摇瓶发酵培养基的制备
25％的玉米粉调浆，加入适量淀粉酶，充分混匀，调pH为6.0-6.5，95℃保温2h，获得玉米液化液。将玉米液化液经200目筛网进行过滤，弃残渣，取清液；将清液：液化液按照4:1的比例进行配制,稀释至总糖为16％；按照0.08g/100mL的浓度加入(NH4)2SO4，可得发酵培养基。
步骤二：孢子悬液的制备
刮取黑曲霉菌株斜面上的孢子溶解于含有玻璃珠的无菌水中，100rpm震荡2h，使孢子被充分打散，用三层无菌纱布过滤，制备成孢子悬液。并进行平板计数。
步骤三：摇瓶发酵
500mL摇瓶装50mL培养基，按3x105个/mL的浓度接种孢子悬液至发酵培养基，36.5℃，300rpm发酵72h。
最优的双基因组合表达框为Pgas-chsA-chsD；最优的三基因组合表达框为Pgas-chsA-chsD-chs。
在本发明的一种实施方法中，所述Pgas,Pgmt启动子为低pH诱导型启动子，诱导pH分别为2，3。
在本发明的一种实施方法中，所述应用，是将几丁质合成酶家族的14个基因进行双基因或三基因片段组合，并在融合基因片段中添加1～2个低pH诱导型启动子，连接至沉默质粒转化入丝状真菌细胞中，顺序调控几丁质合成酶基因的转录。
菌株稳定性分析：
改造菌株由低pH诱导启动子Pgas起始转录，保证外源基因在发酵前期不过量表达，使重组质粒稳定地遗传；到后期通过低pH诱导启动子Pgas起始转录、翻译，使外源基因高效表达，使得外源基因的表达最小程度地影响菌丝生长，实现改造菌株较高的稳定性。
黑曲霉几丁质合成酶家族基因及低pH诱导启动子的获取
(1)黑曲霉基因组DNA的提取
将黑曲霉孢子接种到发酵培养基中，36.5℃，300rpm，摇床培养72h。收集菌球，用滤纸吸干，迅速液氮冷冻并研磨成细粉末，用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA后，-20℃保存备用。
(2)几丁质合成酶家族14个基因的获取
以步骤(1)提取到的全基因组DNA为模板，分别以14对正向引物和反向引物扩增14个几丁质合成酶基因家族基因片段，所述14对引物的序列为SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.28。
PCR反应体系如表所示，PCR反应条件如下。
几丁质合成酶基因PCR反应体系
几丁质合成酶基因PCR反应条件
同时，送上海生工生物合成Pgas，Pgmt序列，并以引物Pgas-F和Pgas-R进行扩增Pgas，Pgmt-F和Pgmt-R进行扩增Pgmt；PCR反应体系如表所示，PCR反应条件如表所示。引物的序列为SEQ ID NO.29-SEQ ID NO.32。
PCR反应体系如表所示，PCR反应条件如下。
Pgas，Pgmt的PCR反应体系
Pgas，Pgmt的PCR反应条件
将得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行双基因及三基因的融合，同时在基因片段的上游通过重叠PCR或Gibson组装添加Pgas，Pgmt片段，并通过PCR方法在该片段两端添加EcoRI酶切位点及保护碱基；
PCR产物纯化步骤：
1.将PCR反应液或酶促反应液移至一干净的1.5ml离心管中，加入5倍体积的Buffer B3，充分混匀。
2.将混合液全部移入吸附柱，8,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
3.向吸附柱中加入500μl Wash Solution，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
4.重复步骤3一次。
5.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000×g离心1min。
6.在吸附膜中央加入30μl Elution Buffer，室温静置1-2min，9,000×g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20保存或用于后续试验。
重叠PCR进行基因融合/组装的步骤：
1、融合PCR制备几丁质合成酶融合基因所述Pgas-chsA-chsD序列，碱基序列如SEQID NO.1所示；
2、以上步中所纯化的chsA的PCR扩增产物和chsD的PCR扩增产物为模板，融合PCR扩增得到chsA-chsD时，引物序列设计如下：正向引物：5’-CGGGGATCCTTTTGTCGATGTTACCTCAACGTCCGGGGAA-3’，反向引物：5’-TTCCCCGGACGTTGAGGTAA CATCGACAAA AGGATCCCCG-3’；
3、对步骤二中得到的PCR产物进行纯化后，以该纯化的PCR产物chsA-chsD和上步Pgas的PCR扩增产物为模板，融合PCR扩增获得Pgas-chsA-chsD时，引物序列设计如下：正向引物：5’-CAGACTAGCAAAGGTTCGCCTGAATCTCCTCCGGCAGCAT-3’，反向引物：5’-ATGCTGCCGGAGGAGATTCA GGCGAACCTT TGCTAGTCTG-3’；
4、第三步：将上述片段通过SanPrep PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段；具体的实验操作方法如下：
EcoRI进行单酶切步骤：
按以下酶切反应体系(表)，对干扰载体pSilent-Dual1和纯化后的PCR产物分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，先置于37℃酶切过夜，再置于65℃水浴20min以终止酶反应。
pSilent-Dual1酶切反应体系
PCR产物酶切反应体系
按以下反应体系(表)，使用碱性磷酸酶处理酶切之后的pSilent-Dual1以防止线性载体自连。
碱性磷酸酶处理pSilent-Dual1反应体系
回收纯化步骤：
酶切片段对酶切后的PCR产物和碱性磷酸酶处理后的pSilent-Dual1进行1％的琼脂糖凝胶电泳，并对二者进行切胶回收。
1.通过琼脂糖凝胶电泳尽可能将目的DNA片段与其它片段分开，用干净的手术刀片将含目的DNA片段的琼脂糖凝胶块切下，放入1.5ml离心管中，称重。
2.根据胶块的重量和浓度，按每100mg琼脂糖(如胶块不足100mg则用水补充至100mg)加300-600μl的比例加入Buffer B2。
3.将离心管置于50水浴5-10min，间或混匀，直至胶块完全溶化。
4.加入所使用的Buffer B2体积1/3的异丙醇，混匀。
5.将溶化好的溶液全部移入吸附柱，8,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
6.向吸附柱中加入300μl Buffer B2，9,000×g离心30sec。倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
7.向吸附柱中加入500μl Wash Solution，9,000×g离心30sec，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。
8.重复步骤7一次。
9.将空吸附柱和收集管放入离心机，9,000×g离心1min。
10.在吸附膜中央加入15-40μl Elution Buffer 1-2min，9,000×g离心1min。将所得到的DNA溶液置于-20保存或用于后续试验。步骤3：构建相应的干扰载体，包括以下步骤：
第一步：将步骤2的第三步得到的纯化酶切片段转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体；
第二步：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
(3)将步骤2获得的干扰载体转化黑曲霉，抗性筛选获得的形态干扰菌株。具体步骤如下：在30℃下使用10mg mL-1蜗牛酶，10mg mL-1纤维素酶和5mg mL-1溶菌酶混合酶溶液消化在36.5℃条件下培养16h的幼小菌丝3h。随后，将反应混合物在4℃孵育15分钟以灭活酶。通过三层灭菌的镜纸过滤除去未消化的物质。通过聚乙二醇(PEG)介导的转化方法将重组载体引入纯化的原生质体中，并根据对G418(50μg mL-1)的抗性选择转化子克隆。在36.5℃条件下培养2-3天后，通过单孢子分离法纯化琼脂平板表面上的再生菌落。
步骤4：接种步骤2的第三步构建得到的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；包括以下步骤：
第一步：摇瓶发酵培养基的制备
25％的玉米粉调浆，加入适量淀粉酶，充分混匀，调pH为6.0-6.5，95℃保温2h，获得玉米液化液，将玉米液化液经200目筛网进行过滤，弃残渣，取清液；将清液：液化液按照4:1的比例进行配制，稀释至总糖为16％；按照0.08g/100mL的浓度加入(NH4)2SO4，得到发酵培养基；
第二部：：孢子悬液的制备
刮取黑曲霉菌株斜面上的孢子溶解于含有玻璃珠的无菌水中，100rpm震荡2h，使孢子被充分打散，用三层无菌纱布过滤，制备成孢子悬液。并进行平板计数。将多基因共干扰菌株分散于无菌水中得到孢子悬液；
步骤4：摇瓶发酵
按3x105个/mL的浓度接种孢子悬液至发酵培养基，36.5℃，300rpm发酵72h，即得含有柠檬酸的发酵液
几丁质合成酶家族双基因共干扰
(1)将单基因片段进行纯化后,将得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行双基因融合。与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段。
(2)构建相应的干扰载体，其特征在于：
包括下列步骤：
步骤1：将上一步得到的酶切纯化后的融合基因片段和pSilent-Dual1片段进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体。
步骤2：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
(3)将步骤2获得的干扰载体转化黑曲霉，抗性筛选和PCR鉴定获得的形态干扰菌株。
(4)接种步骤(3)构建的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；培养结束后进行发酵液中柠檬酸含量及纯度的检测。
根据上述的方法，几丁质合成酶家族低pH诱导的双基因共干扰
(1)步骤1：将单基因片段进行纯化后,将得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行chsA-chsD双基因融合，同时在基因片段的上游添加Pgas或Pgmt片段,获得Pgas-chsA-chsD,Pgmt-chsA-chsD,Pgas-chsA-Pgmt-chsD,Pgmt-chsA-Pgas-chsD四个基因片段。
步骤2：与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段。
(2)构建相应的干扰载体，其特征在于：
包括下列步骤：
步骤1：将上一步得到的酶切纯化后的融合基因片段和pSilent-Dual1片段进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体。
步骤2：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
(3)将步骤2获得的干扰载体转化黑曲霉，抗性筛选和PCR鉴定获得的形态干扰菌株。
(4)接种步骤(3)构建的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；培养结束后进行发酵液中柠檬酸含量及纯度的检测。
根据上述的方法，最优的低pH诱导双基因组合为：Pgas-chsA-chsD。
几丁质合成酶家族三基因共干扰
(1)将单基因片段进行纯化后,将得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行三基因融合，与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段。
(2)构建相应的干扰载体，其特征在于：
包括下列步骤：
步骤1：将上一步得到的酶切纯化后的融合基因片段和pSilent-Dual1片段进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体。
步骤2：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
(3)将步骤2获得的干扰载体转化黑曲霉，抗性筛选和PCR鉴定获得的形态干扰菌株。
(4)接种步骤(3)构建的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；培养结束后进行发酵液中柠檬酸含量及纯度的检测。
根据上述的方法，最优的三基因组合为chsA-chsD-chs。
实施例5：几丁质合成酶家族低pH诱导的三基因共干扰
(1)步骤1：将单基因片段进行纯化后,将得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行chsA-chsD-chs双基因融合，同时在基因片段的上游添加Pgas或Pgmt片段,获得Pgas-chsA-chsD-chs,Pgmt-chsA-chsD-chs,Pgas-chsA-Pgmt-chsD-chs,Pgas-chsA-chsD-Pgmt-chs,Pgmt-chsA-Pgas-chsD-chs,Pgmt-chsA-chsD-Pgas-chs六个基因片段。
步骤2：与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段。
(2)构建相应的干扰载体，其特征在于：
包括下列步骤：
步骤1：将上一步得到的酶切纯化后的融合基因片段和pSilent-Dual1片段进行连接后，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体。
步骤2：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
(3)将步骤2获得的干扰载体转化黑曲霉，抗性筛选和PCR鉴定获得的形态干扰菌株。
(4)接种步骤(3)构建的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；培养结束后进行发酵液中柠檬酸含量及纯度的检测。
根据上述的方法，最优的低pH诱导三基因组合为：Pgas-chsA-chsD-chs。
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
序列表
<110> 中国科学院合肥物质科学研究院
<120> 一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase正向引物
<400> 1
actgacgatg acacggtcag 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase反向引物
<400> 2
ggctaccgca gaggaaacat 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase正向引物
<400> 3
accctatact ccctgctggt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase反向引物
<400> 4
ggcttgagag aatccaggga 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase A正向引物
<400> 5
tgaatctcct ccggcagcat 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase A反向引物
<400> 6
catcgacaaa aggatccccg 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase B正向引物
<400> 7
actctgcaca gtctggagag 20
<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase B反向引物
<400> 8
cacaagcttg acctttctgg 20
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase c正向引物
<400> 9
actggatgcc ccgttcagat 20
<210> 10
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase C反向引物
<400> 10
ccacacatcg ggtcaacatc 20
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase C正向引物
<400> 11
ctggatgtgt tggcgacgat 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase C反向引物
<400> 12
attcaaactg cggcggtcag 20
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase C正向引物
<400> 13
actgctcgaa ctcttcatgg 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase C反向引物
<400> 14
cgactgtggc caagacatca 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase D正向引物
<400> 15
tgcctgcgca aagaagatca 20
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase D
<400> 16
ctgatgggga ttcggctgat 20
<210> 17
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase D正向引物
<400> 17
ttacctcaac gtccggggaa 20
<210> 18
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase D反向引物
<400> 18
gacctgatgg ggattcggct 20
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase activator (Chs3)正向引物
<400> 19
ttatcccggt gatagcgcag 20
<210> 20
<211> 21
<212> DNA
<213> chitin synthase activator (Chs3)反向引物
<400> 20
ctcatctgtg gaggtggtct g 21
<210> 21
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase activator (Chs3)正向引物
<400> 21
accacagcca gtatgatcgt 20
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase activator (Chs3)反向引物
<400> 22
gattgcgcag gactgggaat 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> activator of chitin synthase正向引物
<400> 23
caaggacagt cagaccagct 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> activator of chitin synthase反向引物
<400> 24
tcgaaagcga gcgacgattg 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase export chaperone正向引物
<400> 25
cgattcgtta tgcgagaagg 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> chitin synthase export chaperone反向引物
<400> 26
ataatcacgg tcatccccag 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> export control CHS7-like protein正向引物
<400> 27
catccgactc cctaacttgt 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> export control CHS7-like protein反向引物
<400> 28
caaacaatgc gccgttaatc 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> Pgas-F
<400> 29
ctctgctctc tttctgcgct 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Pgas-R
<400> 30
ggcgaacctt tgctagtctg 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> Pgmt-F
<400> 31
gacaaagccc caattgccgt 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> Pgmt-R
<400> 32
gagacgcaaa cgcgagaaat 20
<210> 33
<211> 1521
<212> DNA
<213> Pgas-chsA-chsD
<400> 33
ctctgctctc tttctgcgct ctctgtgtcg gcactaaccc cgaatggggc gggtatcggc 60
agtccgacgg atctccgggg gccgcacgtc cagcgccgat cgttactcaa ccgagcagag 120
gagagagagc agtgagcagt ggtgtcaccg accataaaaa tgcttgcttc tgcccatcca 180
gccatcagtt gtccagtctg ctccattgtg tgccagtctc gcccccaagg ccgcgcatct 240
gaaaccaacc ggttgggtga aatcagccgg cgggtggcac ccgagcggcc actggctggg 300
atcatcgccc gcaacgcgtc aacagcaatc aaacgaagga tgcgaaatta ttcagcgsgc 360
ggttcctttc caatttttcc ccgttcctgt cagcatgtct actctatcat actgtaacat 420
tattatattg tgattatttt tattctggtg atgtgtccac tggaccgcac gtggaatgaa 480
gattttcctt ccctcgggac gagaaaccat ggcgcagttg gtgttgtgtg cgtgtgtgtg 540
cgtgtcggtt gtccgaaaat cgccctaaac tccgaggcac gcaccatttg ccattaattc 600
ccttgcgatt gatttctgcc tgtccctgcg accctttgtg accctttgtg accctttgac 660
cctggattca gggcttggtg gactcatagc gatgggatag ggacttttga cccttttgac 720
cctttgaccc tcccattttc cctggcctaa gtacgctgta gtcgtaatta tagaaagaat 780
cttgcgtgga ctggggcaaa aggggaacag aacttatcca tgtccgagca gcgatcgscc 840
agtcaccaag ccggctggat ccgagacccg ctacgtggaa ctcccaagag tcgttaagca 900
aagccaagag atcagccaag atgtcgctca cgagcctaat tgctggattg ccatatcgct 960
tgtcgttgta ccatcgcgta agattttatc attgtttctg ggggctgtca gctagtctaa 1020
aacgtactcc tcaaaccaga gaggctgatg atgctgatga tgggcctcca ccccccaaat 1080
tggtagcgcc gttccatgag aggcccagtc tctctctgcc cgtcctcgac cattgtttgg 1140
cccagcactg acacaacctt cagggggggc caatggacgt attccgtagg cagcaggcaa 1200
atgcggccct aagaactccc caactaataa gagtccagac tagcaaaggt tcgcctgaat 1260
ctcctccggc agcatctcgt gcgcatggag ctactatgcg cttgctgcca accagcacga 1320
ttgtagaaag cgatttgagt gccgatacag gagttagctc agagtaccac tacggggatc 1380
cttttgtcga tgttacctca acgtccgggg aaagcctccc cgcgacgaga agatccctac 1440
tcctccttcc gggagtcctc ccgccgacgg caccgcaccc acgagagcgc ccaccacaat 1500
gattcatcag ccgaatcccc a 1521
<210> 34
<211> 1770
<212> DNA
<213> Pgas-chsA-chsD-chs
<400> 34
ctctgctctc tttctgcgct ctctgtgtcg gcactaaccc cgaatggggc gggtatcggc 60
agtccgacgg atctccgggg gccgcacgtc cagcgccgat cgttactcaa ccgagcagag 120
gagagagagc agtgagcagt ggtgtcaccg accataaaaa tgcttgcttc tgcccatcca 180
gccatcagtt gtccagtctg ctccattgtg tgccagtctc gcccccaagg ccgcgcatct 240
gaaaccaacc ggttgggtga aatcagccgg cgggtggcac ccgagcggcc actggctggg 300
atcatcgccc gcaacgcgtc aacagcaatc aaacgaagga tgcgaaatta ttcagcgsgc 360
ggttcctttc caatttttcc ccgttcctgt cagcatgtct actctatcat actgtaacat 420
tattatattg tgattatttt tattctggtg atgtgtccac tggaccgcac gtggaatgaa 480
gattttcctt ccctcgggac gagaaaccat ggcgcagttg gtgttgtgtg cgtgtgtgtg 540
cgtgtcggtt gtccgaaaat cgccctaaac tccgaggcac gcaccatttg ccattaattc 600
ccttgcgatt gatttctgcc tgtccctgcg accctttgtg accctttgtg accctttgac 660
cctggattca gggcttggtg gactcatagc gatgggatag ggacttttga cccttttgac 720
cctttgaccc tcccattttc cctggcctaa gtacgctgta gtcgtaatta tagaaagaat 780
cttgcgtgga ctggggcaaa aggggaacag aacttatcca tgtccgagca gcgatcgscc 840
agtcaccaag ccggctggat ccgagacccg ctacgtggaa ctcccaagag tcgttaagca 900
aagccaagag atcagccaag atgtcgctca cgagcctaat tgctggattg ccatatcgct 960
tgtcgttgta ccatcgcgta agattttatc attgtttctg ggggctgtca gctagtctaa 1020
aacgtactcc tcaaaccaga gaggctgatg atgctgatga tgggcctcca ccccccaaat 1080
tggtagcgcc gttccatgag aggcccagtc tctctctgcc cgtcctcgac cattgtttgg 1140
cccagcactg acacaacctt cagggggggc caatggacgt attccgtagg cagcaggcaa 1200
atgcggccct aagaactccc caactaataa gagtccagac tagcaaaggt tcgcctgaat 1260
ctcctccggc agcatctcgt gcgcatggag ctactatgcg cttgctgcca accagcacga 1320
ttgtagaaag cgatttgagt gccgatacag gagttagctc agagtaccac tacggggatc 1380
cttttgtcga tgttacctca acgtccgggg aaagcctccc cgcgacgaga agatccctac 1440
tcctccttcc gggagtcctc ccgccgacgg caccgcaccc acgagagcgc ccaccacaat 1500
gattcatcag ccgaatcccc attacctcaa cgtccgggga aagcctcccc gcgacgagaa 1560
gatccctact cctccttccg ggagtcctcc cgccgacggc accgcaccca cgagagcgcc 1620
caccacaatg attcatcagc cgaatcccca accctatact ccctgctggt ggcctatatc 1680
tttgagggga tcaatcagcg gatatgcgcg gctgaagaca gtgtggcgaa cactgtctcc 1740
attctcgact tccctggatt ctctcaagcc 1770
<210> 35
<211> 1255
<212> DNA
<213> Pgas
<400> 35
ctctgctctc tttctgcgct ctctgtgtcg gcactaaccc cgaatggggc gggtatcggc 60
agtccgacgg atctccgggg gccgcacgtc cagcgccgat cgttactcaa ccgagcagag 120
gagagagagc agtgagcagt ggtgtcaccg accataaaaa tgcttgcttc tgcccatcca 180
gccatcagtt gtccagtctg ctccattgtg tgccagtctc gcccccaagg ccgcgcatct 240
gaaaccaacc ggttgggtga aatcagccgg cgggtggcac ccgagcggcc actggctggg 300
atcatcgccc gcaacgcgtc aacagcaatc aaacgaagga tgcgaaatta ttcagcgsgc 360
ggttcctttc caatttttcc ccgttcctgt cagcatgtct actctatcat actgtaacat 420
tattatattg tgattatttt tattctggtg atgtgtccac tggaccgcac gtggaatgaa 480
gattttcctt ccctcgggac gagaaaccat ggcgcagttg gtgttgtgtg cgtgtgtgtg 540
cgtgtcggtt gtccgaaaat cgccctaaac tccgaggcac gcaccatttg ccattaattc 600
ccttgcgatt gatttctgcc tgtccctgcg accctttgtg accctttgtg accctttgac 660
cctggattca gggcttggtg gactcatagc gatgggatag ggacttttga cccttttgac 720
cctttgaccc tcccattttc cctggcctaa gtacgctgta gtcgtaatta tagaaagaat 780
cttgcgtgga ctggggcaaa aggggaacag aacttatcca tgtccgagca gcgatcgscc 840
agtcaccaag ccggctggat ccgagacccg ctacgtggaa ctcccaagag tcgttaagca 900
aagccaagag atcagccaag atgtcgctca cgagcctaat tgctggattg ccatatcgct 960
tgtcgttgta ccatcgcgta agattttatc attgtttctg ggggctgtca gctagtctaa 1020
aacgtactcc tcaaaccaga gaggctgatg atgctgatga tgggcctcca ccccccaaat 1080
tggtagcgcc gttccatgag aggcccagtc tctctctgcc cgtcctcgac cattgtttgg 1140
cccagcactg acacaacctt cagggggggc caatggacgt attccgtagg cagcaggcaa 1200
atgcggccct aagaactccc caactaataa gagtccagac tagcaaaggt tcgcc 1255
<210> 36
<211> 1366
<212> DNA
<213> Pgmt
<220>
<221> misc_feature
<222> (356)..(356)
<223> n is a, c, g, or t
<400> 36
gacaaagccc caattgccgt tttgggcgcc aacgcgctcc ttccaaaaac ggacggcaca 60
gagggcacaa aaaatttcag gcggcgaaat gataatttgt gagggcaaga aaagtttcag 120
tgcggaaagg ggggaacttc agtggggagg aaaaaaaaaa aagcggcgga gtacagagaa 180
attggatggt tttccccccc atcagttgta aaattgacaa ttttttcgag tgtctgtttc 240
acttttgaag ttggtttatg aatcttgtct tgatataatt tgctttactt aagtatattt 300
tatttaactc tattttattt cagtttattt tagtttattt cagtttattt tagtgnattt 360
tatttaactc tattttattt tagtttattt tagtttattt tattttcttc cttctccaac 420
ttgaacgtcc catagagtaa ccatgtctgc agagaagaaa gatatcgagc aaccacaaga 480
tcttaacaag atcagaatca ccttcacctc caccaatgtc agagcattgg aaaaggtttc 540
tggcttagtc atcagaaacg ctagaagaga aggtatcaac aagaagggtc ctgtcagaat 600
gccaaccaag gcgctctcca ttgcaaccag aaagactcct aatggtgaag gttccaagac 660
ctgggaacat tatgaaatga gaatccacaa gagatacatt gacttggaag ctccatccac 720
cttgatcaag aagattactt ccttgaccat tgagccaggt gttgatgtcg aagtcactgt 780
ctctgtctaa ggacatggac aggtgtcgtt attttccttt tttttttctt ttttttttct 840
gttctggcat tgttgttgag tggttgattg cccaataatc ctctgacatc acatatcgca 900
gccgtactcc ggcgtgccgt gttgtgcaca ccctctaggc gtgccgtgta tgagacaagt 960
ccagcttatc aagttcttca acaattttta gatggttatc tcgtatatga gacgttgcgg 1020
tagacagcta tcagcgtgtg tattccacgg cgcaatatgt atcttgttta gctttatagt 1080
gtcgttaatg ctcttcacac agtactacaa acagcaatat ccaatgtaga tatttaaaca 1140
tgttggtcct tgcctttgta ttgtttttag acttttaacc tatttgcgcc cgtgtcacgt 1200
gacacacatt atcgttagta tgcaagtcac gtgccacgca ccccctcccc ccaccgagac 1260
ttatatttac acactttaac gcggttttct atatttaacg agttcaggca cctgcatttt 1320
cttcacattt ggcctgttta aatgaaattt ctcgcgtttg cgtctc 1366
Claims (2)
1.一种基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法，其特征在于：包括构建几丁质合成酶多基因干扰载体转化黑曲霉获得形态突变菌株、利用黑曲霉形态突变菌株发酵生产柠檬酸；多基因干扰载体的转录受启动子Pgas和Pgmt调控，实现形态基因在不同条件下的顺序调控；Pgas序列为SEQ ID NO.35、Pgmt序列为SEQ ID NO.36；几丁质合成酶多基因干扰基因为几丁质合成酶基因家族的双基因或三基因组合；
包括下列步骤：
步骤1：提取丝状真菌黑曲霉的全基因组DNA得到黑曲霉基因组DNA；
步骤2：几丁质合成酶多基因干扰载体的构建，包括以下步骤：
第一步：以步骤1提取到的黑曲霉基因组DNA为模板，以14对引物分别进行扩增几丁质合成酶基因家族14个单基因片段；所述14对引物为SEQ ID NO.1- SEQ ID NO.28；
同时，合成Pgas，Pgmt序列，并以步骤1提取到的黑曲霉基因组DNA为模板，以引物Pgas-F和Pgas-R进行扩增Pgas，引物Pgmt-F和Pgmt-R进行扩增Pgmt；
第二步：将第一步得到的单基因片段通过重叠PCR或Gibson组装进行双基因及三基因的融合，在基因片段的上游添加Pgas，Pgmt片段，并在该片段两端添加EcoRI酶切位点及保护碱基；
第三步：将上述片段通过SanPrep PCR产物纯化试剂盒进行纯化后，与干扰载体pSilent-Dual1分别使用限制性内切酶EcoRI进行单酶切，并胶回收纯化酶切片段；
步骤3：构建相应的干扰载体，包括以下步骤：
第一步：将步骤2的第三步得到的纯化酶切片段转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，通过含100μg/mL氨苄青霉素抗性LB平板筛选正确连接的阳性克隆；挑取阳性克隆，接种到含100μg/mL氨苄青霉素的LB液体培养基中，培养12-16h后从菌液中提取得到重组载体；
第二步：将重组载体通过原生质体转化或萌发孢子电转化的方法转至黑曲霉中，在含50μg/mLG418的完全培养基平板上培养4～5d，筛选得到多基因共干扰菌株；
步骤4：接种步骤3的第二步构建得到的多基因共干扰菌株于发酵培养基中，进行培养；包括以下步骤：
第一步：摇瓶发酵培养基的制备
25%的玉米粉调浆，加入适量淀粉酶，充分混匀，调pH为6.0-6.5，95℃保温2h，获得玉米液化液，将玉米液化液经200目筛网进行过滤，弃残渣，取清液；将清液：液化液按照4:1的比例进行配制，稀释至总糖为16%；按照0.08g/100mL的浓度加入(NH4)2SO4，得到发酵培养基；
第二步：孢子悬液的制备
将多基因共干扰菌株分散于无菌水中得到孢子悬液；
步骤5：摇瓶发酵
按3x105个/mL的浓度接种孢子悬液至发酵培养基，36.5℃，300rpm发酵72h，即得含有柠檬酸的发酵液。
2.根据权利要求1所述的基于形态基因共干扰提高柠檬酸发酵生产水平的方法，其特征在于：双基因组合表达框为Pgas-chsA-chsD，核苷酸序列如SEQ ID NO.33所示；三基因组合表达框为Pgas-chsA-chsD-chs，核苷酸序列如SEQ ID NO.34所示。
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