CN103497968A - 一种高效改造丝状真菌的方法及改造的丝状真菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效改造丝状真菌的方法及改造的丝状真菌菌株，方法是向丝状真菌细胞中同时导入多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体，再通过筛选得到高效改造丝状真菌；其中多基因干扰构建体包含可以在丝状真菌细胞内起始转录的启动子、由内含子隔开的由2-30个靶基因的编码区序列嵌合连接在一起的反向重复序列、可以在丝状真菌细胞内终止转录的终止子；目的蛋白表达构建体包含可以在丝状真菌细胞内起始转录的启动子、目的蛋白的编码区序列、可以在丝状真菌细胞内终止转录的终止子。本发明提高了丝状真菌的改造效率，降低了目的蛋白的下游分离纯化成本。经过一次转化后改造的丝状真菌细胞能够用于生产食品安全级酶制剂。

Description

一种高效改造丝状真菌的方法及改造的丝状真菌菌株

技术领域

本发明属于分子生物学和酶学技术领域。具体的方法就是用含多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体两种元件的DNA转化丝状真菌，筛选2-30个靶基因受到干扰，并且能够高效表达目的蛋白的转化子。

背景技术

丝状真菌具有较强的胞外蛋白分泌能力，可以用来表达许多酶种。（Kobayashi等，2007）没有经过改造的野生型丝状真菌在发酵的时候会分泌大量的胞外水解酶系。目的蛋白和丝状真菌自身分泌的水解酶系共用细胞内的分泌系统。这样会竞争性抑制目标蛋白的分泌所需的各种资源，降低目的蛋白的表达量（Yoon等，2010）。同时丝状真菌分泌的胞外蛋白酶还会降解目的蛋白。野生型的丝状真菌作为表达宿主会导致发酵液中掺杂有大量丝状真菌自身表达的内源分泌蛋白（潘力等，2010）。这样不利于下游的分离纯化，同时也造成丝状真菌分泌能力的浪费。传统的基因敲除方法能破坏黑曲霉自身的大量分泌表达的水解酶系（Maruyama等，2011）。但是一般的丝状真菌具有多核细胞结构，生长周期长，一般的敲除手段耗时比较长，效率低下。同时也无法解决多拷贝基因的问题。例如米曲霉中的淀粉酶就有三个拷贝（Takashi等，2012）。DSM公司在改造一株蛋白表达宿主黑曲霉时，采用的基因敲除的方法。前后共敲除了7个基因，共经历了7次转化和6次pyrG抗性标记回收利用。构建过程较费时（Jeenes等，1993）。因此常规的基因敲除方法很难将没有经过分子改造的丝状真菌改造成了可以高效分泌目的蛋白，同时培养体系中的内源分泌蛋白比较少表达宿主。

RNA干扰(RNA interference,RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(double strandRNA,dsRNA)介导的细胞内mRNA发生特异性降解，最终导致相应的转录后基因沉默。RNA干扰在医药学、生理研究、菌种改良方面得到了广泛的应用。在原核生物中没有发现RNA干扰现象。王斌等利用RNA-sequencing技术在米曲霉的RNA中发现有RNA干扰调节的现象。可见RNA干扰现象是普遍存在于曲霉中的。

在基因功能研究方法中，基因敲除方法应用时间长，理论体系完备，构建方法成熟。一般的载体构建特点是将目的基因的2个片段中间插入抗性标记基因，然后转化。在真菌细胞中，通过同源重组，抗性基因替换了原来的基因片段，从而导致基因序列缺失或部分缺失而丧失功能。这项重组技术是一项可以在染色体水平进行遗传操作的新技术，是研究基因功能和构建新菌株的有力工具。但是这项技术工作量大，耗时比较长，而且无法应用在对多拷贝基因的敲除。对于生物体必须的基因，无法通过基因敲除的方法调控或者消除其对目标蛋白表达的影响。

相对于基因敲除，RNAi技术通用性强，快捷简便，靶向性高，在植物和动物细胞的研究中已经取得了很好的进展。RNAi还没有广泛应用于丝状真菌的研究中，近几年，相继报道了一些丝状真菌中RNAi引起的基因沉默。2007年，Osamu Yamada等米曲霉(Aspergillusoryzae)中用RNAi技术成功沉默了brlA基因，并且同时沉默了α-淀粉酶的三个拷贝。另外，在烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、稻温病菌(Magnaportheoryzae)和毛盘孢属(Colletotrichum)的丝状真菌中也有RNAi诱发基因沉默的报道。Takashi等人在2009年发现，RNA干扰高表达量的alpha-amylase可以提高外源的牛凝乳酶的表达量。在他们的研究中，牛凝乳酶的表达和RNA干扰是分成多步完成的，并且采用了两种不同的筛选标记。野生型的黑曲霉能够利用的筛选标记十分有限，被广泛使用的潮霉素抗性基因还不能应用于食品行业。因此多步转化筛选的方法难以在一般的生产菌株中采用。本专利发明了一种一次转化，同步实现多基因的干扰和目标蛋白表达的方法。一次转化仅需要一种筛选标记，减少了带入非食品安全级别的抗生素筛选标记。同时多基因干扰构建体的导入，可以同时干扰多个基因的表达。多基因的干扰可以发挥协同作用，进一步减少内源分泌蛋白的表达。内源蛋白表达量的减少一方面可以减少菌体能量的消耗，同时可以减少发酵液中杂蛋白的量，降低目的蛋白下游分离成本。

关于丝状真菌RNA干扰的专利有诺维信公司的移行RNA干扰技术。该技术的特点是将需要干扰的靶基因编码区序列连接在一段与目的基因不相关的反向重复序列之后，通过RNA依赖的RNA聚合酶形成dsRNA。诺维信公司的移行RNA干扰技术没有涉及到多个基因的通过一个RNA干扰构建体同时干扰。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过一次转化同步实现2-30个基因干扰和目的蛋白表达的方法。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种高效改造丝状真菌的方法，向丝状真菌细胞中同时导入多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体，再通过筛选得到高效改造丝状真菌；其中：1>向丝状真菌细胞中同时导入多基因干扰构建体和目的蛋白构建体。其中多基因干扰构建体包含可以在丝状真菌细胞内起始转录的启动子、由内含子隔开的由2-30个靶基因的编码区序列连接在一起的反向重复序列、可以在丝状真菌细胞内终止转录的终止子。目的蛋白表达构建体包含可以在丝状真菌细胞内起始转录的启动子、目的蛋白的编码区序列、可以在丝状真菌细胞内终止转录的终止子。2>诱导多基因干扰构建体的转录，转录出来的RNA具有由2-30个靶基因编码区序列连接在一起形成的反向重复序列，可以直接通过互补配对形成由2-30个靶基因编码区连接而成的双链RNA。双链RNA经过剪切加工后形成带有与2-30个靶基因具有同源序列的siRNA，可以指导2-30个靶基因的干扰。3>诱导目的蛋白表达构建体的转录和目的蛋白的翻译，其中目的蛋白表达构建体所表达的蛋白是通过分泌型表达。

所述的2-30个靶基因的编码区序列嵌合连接在一起的反向重复序列的单个靶基因的序列为靶基因的编码区，不包含内含子等非编码区。

多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体的启动子选择：

多基因干扰构建体中的启动子的功能是发挥转录起始作用。启动子会决定多基因干扰作用是组成型还是诱导型。组成型启动子在宿主细胞中是组成型发挥转录起始作用，他的转录强度不会因外界环境的变化产生巨大的波动，连接有组成型启动子的多基因干扰构建体比较适合干扰组成型基因的表达。例如丝状真菌细胞内的一些结构蛋白的基因如肌动蛋白actinα。常用的组成型启动子有黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶启动子。诱导型启动子只有在培养条件中含有诱导物的情况下才可以高效的起始转录。例如米曲霉淀粉酶amyase B启动子在有淀粉水解物存在的情况下可以高效的起始转录，指导米曲霉中淀粉酶的大量表达。本发明通过替换不同类型的启动子，构建出不同特性的多基因干扰构建体。组成型启动子优选为黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，诱导型启动子优选为米曲霉淀粉酶B或黑曲霉糖化酶A的启动子PamyB、PglaA。PgpdA启动子可以在含有淀粉水解物，或者麦芽糖存在的情况下，高效的起始转录。多基因干扰构建体和目的蛋白表达优选采用同一种启动子或者同一类启动子，这样可以使多基因干扰的强度和目标蛋白表达的强度一致。

多基因的干扰会在菌体生长的初期对菌体的生长有一定的抑制作用。同时目标蛋白的表达对菌体生物量的积累也有抑制作用。在丝状真菌发酵的早期，需要保证菌体的生物量积累，不需要多基因的干扰和目的蛋白表达。当菌体达到一定的量时，需要及时控制菌体的生长和多种基因的表达，同时目标蛋白也可以开始大量表达。优选启动子为强诱导型启动子，利用强诱导型启动子可以满足发酵中，对菌体生长和目的蛋白表达控制的需求。

多基因干扰构建体的反向重复序列：

多基因干扰构建体的反向重复序列是一段由内含子隔开的反向重复序列。内含子两端的反向重复序列由2-30个靶基因的编码区序列连接而成。单个靶基因的编码区长度大于50个碱基的序列。优选为大于50个碱基，小于1000个碱基；更优选为大于50个碱基，小于500个碱基。发挥RNA干扰作用的siRNA的长度在20个碱基左右，50个碱基可以经过加工，形成具有RNA干扰活性的siRNA。

多基因干扰构建体可以通过优选不同的靶基因组合达到最优化多基因干扰效果。丝状真菌的胞外分泌酶系基因可以选定作为多基因干扰的靶基因。丝状真菌常会分泌大量的胞外水解酶，这些水解酶系可以保证丝状真菌生长所需的营养物质需求。产这些胞外水解酶系会大量消耗菌体的能量和营养物质。丝状真菌在发酵的过程中，可以通过流加各种营养物质的方法来保证丝状真菌必须的营养物质需求，同时也不会产生葡萄糖效应。

转录因子基因也可以作为多基因干扰的靶基因。转录因子可以控制一类蛋白的表达，通过干扰转录因子基因的表达，可以做到高效的抑制一类基因的表达。例如prtT基因，编码一种C6锌指结构域蛋白，是曲霉特有的胞外蛋白酶编码基因的调控因子。抑制prtT基因的表达后，可以抑制曲霉的胞外蛋白酶的表达。

多个靶基因编码区序列的排列方式对单个靶基因干扰的效果没有明显的影响。其中靶基因碱基序列和碱基的长度对单个靶基因的干扰效果有较大的影响。靶基因编码区序列的选择没有可以套用既定原则，需要通过实验筛选验证。单个靶基因编码区序列的选择需要考虑该段区域在靶基因自身RNA结构中形成高级结构时的结构特点。容易和RNA其它区域形成互补结构的区域不易被RNA干扰中的RISC复合体识别切割，因此RNA干扰的效果不好。但是RNA干扰的效率与多种因素有关，因此不能仅考虑RNA的能量问题和高级结构，最终还是需要实验筛选确定。

靶基因序列的长度并不是越长越好，也不是越短越好，最优选的长度为50-500个碱基。选择的靶基因编码区序列越长，该段序列越容易形成高级结构，不容易形成可以发挥RNA干扰效应的siRNA。太短则缺乏足够的碱基序列用来剪切和加工可以发挥活性的20个碱基左右的siRNA。优选之后的长度范围不是对所有的靶基因都是有效的，只是提供了用来减少筛选工作量的方法，最终的多基因干扰序列的确定需要筛选实验的验证。

目的蛋白表达构建体：

目的蛋白表达构建体含有编码目的蛋白的编码区，该段编码区可以是丝状真菌自身基因组上的序列，RNA序列或者其它生物的基因组序列或者RNA序列，也可以是人工合成的序列。不同的来源的目的蛋白编码区序列具有不同的密码子分布特点。其中编码区的序列所用的密码子分布符合丝状真菌密码子的偏好性可以更为高效地在丝状真菌中表达。

在丝状真菌中，分泌表达的蛋白具有分泌信号肽。信号肽可以指导该蛋白的胞外转运和分泌。在表达外源蛋白或者非分泌蛋白，需要目的蛋白分泌型表达时，可以在目的蛋白的编码区前添加丝状真菌大量分泌表达蛋白的信号肽。对于外源的蛋白，可以采用融合表达的方案。例如直接将目的蛋白接在黑曲霉糖化酶的496氨基酸序列后，可以保证目的蛋白在分泌表达过程中，不被黑曲霉自身的溶酶体识别和降解。分泌出来的融合蛋白可以通过酶切激活。或者直接在糖化酶的编码区和目的蛋白的编码区之间加入一个KEX酶切位点，直接在分泌表达的过程中加工成熟为目的蛋白。

目的蛋白表达构建体可以采用与多基因干扰构建体一致的启动子，可以保证多基因的干扰和目的蛋白的表达时协同效应。目的蛋白表达强度大的时候，多基因干扰的强度也很大。一般目的蛋白的表达会采用诱导型启动子，这样可以保证目的蛋白在表达过程是可控调节的。

丝状真菌具体改造过程如下：

通过蜗牛酶和纤维素酶将丝状真菌制备成原生质体，PEG介导经过Sal1内切酶线性化的多基因干扰质粒和蛋白表达质粒转化丝状真菌细胞内；SDS-PAGE蛋白电泳和酶活测定筛选高效RNA干扰和蛋白表达的丝状真菌菌株。

本发明提供了一株通过一次转化同时转入了多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体的丝状真菌菌株。该菌株可以是曲霉属（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）、毛霉素属（Mucor），优选为曲霉属（Aspergillus）丝状真菌。经过改造后的菌株可以在诱导表达目的蛋白的同时，2-30个靶基因的表达受到干扰。该菌株在发酵过程中，由于多个靶基因受到干扰，目的蛋白的表达会有一定的促进。当多基因干扰构建体干扰的靶基因包含丝状真菌胞外分泌酶系时，发酵液中的相应的靶基因编码的蛋白的量会减少。这种多基因的干扰方式可以减少发酵液中内源胞外分泌蛋白的量，减少细胞的能耗，增加目的蛋白在整个发酵液上清中的比例。

本发明提供了一种目的蛋白生产的方法。在可以诱导多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体的培养条件下培养上述的丝状真菌菌株。多基因干扰构建体可以转录出由内含子隔开的由2-30个靶基因的编码区序列连接在一起的反向重复序列，2-30个靶基因被干扰后非目的蛋白的表达量下降。直接收获发酵上清，分离纯化目的蛋白。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

（1）本发明通过一种一次转化，同步实现多基因的干扰和目标蛋白表达的方法，改造过程快速，效果明显。一次转化仅需要一种筛选标记，减少了带入非食品安全级别的抗生素筛选标记。同时多基因干扰构建体的导入，可以同时干扰多个基因的表达。多基因的干扰可以发挥协同作用，进一步减少内源分泌蛋白的表达。内源蛋白表达量的减少一方面可以减少菌体能量的消耗，同时可以减少发酵液中杂蛋白的量，降低目的蛋白下游分离成本。

（2）本发明建立了可快速筛选能发挥高效指导多基因干扰作用的序列的质粒pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA。RNA干扰的效率受所选择的序列的大小和碱基序列影响，pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA可以高效的完成RNA干扰区域长度和碱基序列的选择。

（3）本发明优化了多基因干扰构建体的启动子，保证了多基因干扰之后内源分泌蛋白的表达量降低，同时菌体的正常生长不受抑制。

（4）本发明的转化方法构建出两株胞外分泌蛋白背景降低，可以分别高效表达脯氨酰内肽酶和嗜热脂肪酶的黑曲霉菌株，可以降低相应酶的下游分离成本。

附图说明

图1为中间质粒pPTR1-2ccdB-TagdA构建过程示意图。

图2为多基因干扰骨架质粒pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA构建过程示意图。

图3糖化酶glaA干扰黑曲霉转化子发酵上清SDS-PAGE胶图。

图4多基因（glaA、amyB和prtT）干扰黑曲霉转化子发酵上清SDS-PAGE胶图。

图5为脯氨酰内肽酶表达构建体、多基因干扰构建体和抗性标记共同转化黑曲霉得到的转化子发酵上清SDS-PAGE胶图。

图6为嗜热脂肪酶表达构建体、多基因干扰构建体和抗性标记共同转化黑曲霉得到的转化子发酵上清SDS-PAGE胶图。

具体实施方式

以下是实施的实例，进而对本发明方法的进一步说明；以下实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下面阐述的实施例来限定本发明方法的保护范围。

实施例1

构建RNA干扰的骨架载体pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA

1.1提取黑曲霉（Aspergillus niger）CBS513.88基因组。

洗涤干燥后的黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88菌体（美国典型培养物保藏中心ATCC）液氮研磨，酚氯仿抽提黑曲霉基因组DNA。

1.2构建中间质粒pHGW-ccdB-TagdA

以黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88基因组DNA为模板，用引物SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2进行PCR扩增扩增出的片段命名为TagdA。将SpeⅠ和SacⅠ处理后的TagdA片段接入质粒Phgw-ccdB的SpeⅠ和SacⅠ，得到pHGW-ccdB-TagdA。将此质粒送华大基因公司测序，结果表明扩增到的糖苷酶A终止子的DNA序列如SEQ ID NO.31。

1.3构建中间质粒pSIMPLE18-intron8

以黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88基因组DNA为模板通过引物SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:28进行PCR扩增。将目的片段连接到分子克隆载体pSIMPLE18EcoRV/BAP（购自大连宝生物工程有限公司）上，得到质粒pSIMPLE18-intron8。将此质粒送华大基因测序。结果表明，扩增得到的片段的DNA序列如SEQ ID NO:29。

1.4构建中间质粒pSIMPLE18-intron8-ccdB

以商品化质粒pDONOR211(Gateway)为模板，通过引物对SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4扩增出ccdB基因。将扩增出的ccdB基因插入质粒pSIMPLE18-intron8的HindIII位点获得质粒pSIMPLE18-intron8-ccdB，提取质粒送华大基因测序。结果表明，扩增得到的片段的DNA序列如SEQ ID NO:3O,包含有1712个碱基对。

1.5构建中间质粒pHGW-2ccdB-TagdA

SpeI处理质粒pSIMPLE18-intron8-ccdB后得到包含intron8和ccdB的片段，插入质粒pHGW-ccdB-TagdA SpeⅠ位点获得质粒pHGW-2ccdB-TagdA。

1.6构建中间质粒pPTR1-2ccdB-TagdA

提取pHGW-2ccdB-TagdA,XbaⅠ和SacⅠ双酶切，得到片段2ccdB-TagdA,片段末端平滑化后接入商业化质粒PPTR1的SmaⅠ酶切位点，构建出质粒pPTR1-2ccdB-TagdA。

1.7构建中间质粒pPTR1-PgpdA-ccdB-TagdA

以黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88基因组DNA为模板，通过引物SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6进行PCR扩增。可以扩增得到大小为975bp的DNA片段，该片段为三磷酸甘油醛脱氢酶A的启动子，命名为PgpdA。用KpnI处理扩增出来的片段PgpdA插入质粒pPTR1-2ccdB-TagdA的KpnⅠ位点。得到质粒pPTR1-PgpdA-2ccdB-TagdA。将此质粒送华大基因公司测序，结果表明正确扩增并连接了三磷酸甘油醛脱氢酶的DNA序列，如SEQ IDNO:32。

1.8构建多基因干扰骨架质粒pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA

按照如上提取黑曲霉基因组的方法提取构巢曲霉基因组DNA。以构巢曲霉基因组DNA为模板，分别以引物SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8进行PCR扩增。扩增得到大小为3430bp的DNA片段，该片段为构巢曲霉乙酰胺代谢的基因amdS的整个表达框，可以用作黑曲霉转化的抗性标记，插入质粒pPTR1-PgpdA-2ccdB-TagdA的平滑化后NdeⅠ位点得到质粒pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA。提取质粒送华大基因公司测序，测序结果与数据库给出的序列一致，为SEQ ID NO:38所示的序列。

实施例2

构建含有单基因干扰构建体的质粒

2.1构建单基因干扰中间载体pDONR221-long和pDONR221-short

单基因干扰质粒的构建过程中设计了两对引物，可以用黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88基因组DNA为模板，通过引物SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10扩增出糖化酶编码区long。通过引物SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12扩增出的糖化酶的编码区序列short。

两个片段的引物5’均加了进行BP反应的组合位点，正向引物加了attB1位点，反向引物加了attB2位点。将扩增的片段和质粒pDONR221（购自上海英潍捷基）通过BP ClonaseII enzyme mix酶作用，进行BP反应，生成两种Entry载体pDONR221-long和pDONR221-short。长度为long的片段和长度为short的片段分别被替换到pDONR221-long和pDONR221-short上。

2.2构建单基因干扰质粒pamdS-PgpdA-long-TagdA和pamdS-PgpdA-short-TagdA

将pDONR221-long质粒和pDONR221-short质粒分别和pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA质粒混合。在LR clonase酶（购自上海英潍捷基）的作用下发生LR反应。pDONR221-long中的long片段替换了pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA上的两个ccdB区域，生成RNA干扰质粒pamdS-PgpdA-long-TagdA。同理也可生成RNA干扰质粒pamdS-PgpdA-short-TagdA。

实施例3

构建含有多基因干扰构建体的质粒

3.1扩增出含有多个基因编码区序列的DNA片段

以黑曲霉基因组为模板，通过引物SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14扩增出淀粉酶amyA编码区片段。通过引物SEQ ID NO:15和SEQ ID NO:16扩增出糖化酶glaAB编码区片段。通过SEQ ID NO:17和SEQ ID NO:18扩增出prtT基因的编码区片段。这三个片段之间含有重叠的区域。纯化这些片段之后，通过重叠延伸PCR技术，将这三个片段按照一定的顺序融合在一起。三个片段融合之后的序列为SEQ ID NO:33所示的序列。

3.2构建含有多基因干扰的质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA

融合后的三片段的5’端和3’端均加了可以进行BP反应的位点，5’端加了attB1位点，3’端加了attB2位点。将融合后的片段和质粒pDONR221按一定比例混合，通过BP Clonase IIenzyme mix酶作用，进行BP反应。反应液转化DH5α后，可以筛选到Entry载体pDONR221-Fragments。长度为761bp的融合片段被替换到了Entry载体pDONR221-Fragments上。

将pDONR221-Fragments质粒和pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA质粒按一定的比例混合。在LR clonase酶的作用下发生LR反应。pDONR221-Fragments中的融合片段替换了pamdS-PgpdA-2ccdB-TagdA上的两个ccdB区域，生成RNA干扰质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA。

3.3替换多基因干扰构建体的启动子

以黑曲霉基因组DNA为模板，通过引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20扩增出黑曲霉的糖化酶A的启动子PglaA。以米曲霉基因组DNA为模板，通过引物SEQ ID NO:39和SEQID NO:40扩增出米曲霉的的淀粉酶B的启动子PamyB。米曲霉基因组DNA的提取方法与上述黑曲霉基因组DNA的提取方法相同。

质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA经过Kpn1内切酶处理后切除启动子PgpdA，然后用T4DNA聚合酶处理，末端平滑化。最后将PglaA和PamyB分别连接到切除启动子的pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA质粒上。构建成多基因干扰质粒pamdS-PglaA-Fragments-TagdA和pamdS-PamyB-Fragments-TagdA。构建好的质粒送华大基因测序，测序结果显示Pgla序列和PamyB序列和数据库中序列一致，序列分别为SEQ IDNO:34和SEQ ID NO:41。

实施例4

构建含有目的蛋白表达构建体的质粒

4.1构建含有脯氨酰内肽酶（pesp）表达构建体的质粒pMD20-Pgla-pesp-Tgla

以黑曲霉基因组DNA为模板，通过引物SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20扩增出黑曲霉的糖化酶启动子PglaA，序列为SEQ ID NO:34。以黑曲霉基因组DNA为模板，通过引物SEQ ID NO:23和SEQ ID NO:24扩增出黑曲霉的糖化酶终止子TglaA，序列为SEQ IDNO:36。以黑曲霉cDNA为模板（TaKaRa RT reagent试剂盒制备），通过引物SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22扩增出黑曲霉的脯氨酰内肽酶编码区序列SEQ ID NO:35。纯化这些片段之后，通过重叠延伸PCR技术，将这三个片段按照一定的顺序融合在一起。

回收融合好的表达框后通过rTaq酶（购自大连宝生物工程有限公司）在PCR产物的3’加Ａ。按照一定的比例将加Ａ后的PCR片段和Ｔ载体pMD20-T(TaKaRa公司产品)混合后，加入高效连接液solution1进行连接反应，然后转化DH5α感受态。筛选出阳性转化子含有质粒pMD20-Pgla-pesp-Tgla，然后送华大基因公司测序。测序结果显示与需要构建的目的序列一致。

4.2构建含有嗜热脂肪酶（TLL）表达构建体的质粒pMD20-Pgla-TLL-Tgla

全基因合成疏棉状嗜热丝胞菌（Thermomyces lanuginosus）耐热脂肪酶基因tll，通过引物SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26扩增出tll基因编码区序列SEQ ID NO:37。纯化这些片段之后，通过重叠延伸PCR技术，将PglaA,tll,TglaA这三个片段按照一定的顺序融合在一起。

回收融合好的表达框后通过rTaq酶在PCR产物的3’加Ａ。按照一定的比例将加Ａ后的PCR片段和Ｔ载体pMD20-T载体（TaKaRa公司）混合后，进行连接反应，然后转化大肠杆菌DH5α感受态。筛选出阳性转化子含有质粒pMD20-Pgla-tll-Tgla，然后送华大基因公司测序。测序结果显示与需要构建的目的序列一致，在载体上依次有SEQ ID NO:34、SEQID NO:36、SEQ ID NO:37。

实施例5

原生质体法转化黑曲霉，筛选转化子

5.1质粒pamdS-PgpdA-short-TagdA单独转化黑曲霉

将得到的干扰质粒pamdS-PgpdA-short-TagdA用SalI切割，除去质粒上的在E.col中复制和AmpR抗性筛选所必需的区域。最终的收获的片段含有amdS和RNA干扰区域的线性化片段。用含有amdS和RNA干扰区域的线性化片段通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以得到含有amdS抗性的和单基因干扰构建体PgpdA-short-TagdA的转化子PgpdA-RNAi-short1。

5.2质粒pamdS-PgpdA-long-TagdA单独转化黑曲霉

将得到的干扰质粒pamdS-PgpdA-long-TagdA通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以得到含有amdS抗性和单基因干扰构建体PgpdA-long-TagdA的转化子PgpdA-RNAi-long1。

5.3质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA单独转化黑曲霉

将得到的多基因干扰质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以得到含有amdS抗性和多基因基因干扰构建体的转化子PgpdA-RNAi-multi1。

5.4质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA和pMD20-Pgla-pesp-Tgla共转黑曲霉

将带有三磷酸甘油醛脱氢酶gpdA启动子的多基因干扰质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA和含有脯氨酰内肽酶表达构建体的质粒pMD20-Pgla-pesp-Tgla等摩尔比混合在一起。通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillusniger CBS513.88。通过PCR筛选，可以筛选出既具有多基因干扰构建体，又具有脯氨酰内肽酶表达构建体的转化子PgpdA-RNAi-pesp1。

5.5质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA和pMD20-Pgla-TLL-Tgla共转黑曲霉

将带有三磷酸甘油醛脱氢酶gpdA启动子的多基因干扰质粒pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA和含有嗜热脂肪酶表达构建体的质粒pMD20-Pgla-TLL-Tgla等摩尔比混合在一起。通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillusniger CBS513.88。通过PCR筛选，可以筛选出既具有多基因干扰构建体，又具有嗜热脂肪酶表达构建体的转化子PgpdA-RNAi-tll1。

5.6质粒pamdS-PglaA-Fragments-TagdA和pMD20-Pgla-pesp-Tgla共转黑曲霉

将带有糖化酶glaA启动子的多基因干扰质粒pamdS-PglaA-Fragments-TagdA和含有脯氨酰内肽酶表达构建体的质粒pMD20-Pgla-pesp-Tgla等摩尔比混合在一起。通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以筛选出既具有多基因干扰构建体，又具有脯氨酰内肽酶表达构建体的转化子PglaA-RNAi-pesp1。

5.7质粒pamdS-PglaA-Fragments-TagdA和pMD20-Pgla-TLL-Tgla共转黑曲霉

将带有糖化酶glaA启动子的多基因干扰质粒pamdS-PglaA-Fragments-TagdA和含有嗜热脂肪酶表达构建体的质粒pMD20-Pgla-TLL-Tgla等摩尔比混合在一起。通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以筛选出既具有多基因干扰构建体，又具有嗜热脂肪酶表达构建体的转化子PglaA-RNAi-pesp1。

5.8质粒pamdS-PamyB-Fragments-TagdA和pMD20-Pgla-pesp-Tgla共转黑曲霉

将带有米曲霉淀粉酶amyB启动子的多基因干扰质粒pamdS-PamyB-Fragments-TagdA和含有脯氨酰内肽酶表达构建体的质粒pMD20-Pgla-pesp-Tgla等摩尔比混合在一起。通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以筛选出既具有多基因干扰构建体，又具有脯氨酰内肽酶表达构建体的转化子PamyB-RNAi-pesp1。

5.9质粒pamdS-PamyB-Fragments-TagdA和pMD20-Pgla-TLL-Tgla共转黑曲霉

将带有米曲霉淀粉酶amyB启动子的多基因干扰质粒pamdS-PamyB-Fragments-TagdA和含有嗜热脂肪酶表达构建体的质粒pMD20-Pgla-TLL-Tgla等摩尔比混合在一起。通过原生质转化的方法转化黑曲霉Aspergillus niger CBS513.88。通过PCR筛选，可以筛选出既具有多基因干扰构建体，又具有嗜热脂肪酶表达构建体的转化子PamyB-RNAi-tll1。

实施例6

转化子摇瓶发酵，SDS-PAGE电泳检测转化子分泌蛋白图谱

6.1摇瓶发酵黑曲霉转化子

原生质体转化后得到的转化子，等接种量接种到含有50ml YPD培养基（葡萄糖2%，酵母提取物1%，蛋白胨2%）中培养。其中发酵用的是500ml摇瓶。3天培养后，通过1000g离心力，10min收集发酵上清。

6.2SDS-PAGE电泳判断黑曲霉转化子的胞外蛋白分泌图谱

将发酵收集的上清经过处理后等体积的加样进行SDS-PAGE电泳。其中图3是单基因干扰后黑曲霉转化子的的胞外分泌图谱的变化。其中1-3泳道依次为野生型、

pamdS-PgpdA-long-TagdA单基因干扰转化子PgpdA-RNAi-long1、pamdS-PgpdA-short-TagdA单基因干扰转化子PgpdA-RNAi-short1，三者等体积上样。泳道M为蛋白Marker，由上至下大小依次250,150,100,70,50,40,30,20（单位：KDa）。4-6

依次为野生型、pamdS-PgpdA-long-TagdA单基因干扰转化子PgpdA-RNAi-long1、pamdS-PgpdA-short-TagdA转化子PgpdA-RNAi-short1，三者蛋白总量等量上样。可以看出在选择干扰靶基因时，所选取的编码区序列不是越长干扰的效果就越好。

其中图4是多基因干扰后黑曲霉转化子的胞外分泌蛋白图谱的变化。其中1-3泳道依次为野生型、pamdS-PgpdA-short-TagdA单基因干扰转化子PgpdA-RNAi-short1、pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA多基因干扰转化子PgpdA-RNAi-multi1，三者等体积上样。泳道M为蛋白Marker，由上至下大小依次为250,150,100,70,50,40,30,20,15,10（单位：KDa）。泳道4-6依次为野生型、pamdS-PgpdA-short-TagdA单基因干扰转化子PgpdA-RNAi-short1、pamdS-PgpdA-Fragments-TagdA多基因干扰转化子PgpdA-RNAi-multi1，三者蛋白总量等量上样。可以看出多基因干扰之后，内源分泌蛋白的量减少了很多。相对单基因干扰的转化子发酵上清图谱而言，多基因干扰的转化子的内源分泌蛋白背景更为清晰。

图5是脯氨酰内肽酶表达框和多基因干扰构建体共同转化黑曲霉之后的转化子发酵上清分泌蛋白图谱。泳道1中的多基因干扰构建体的启动子有米曲霉的淀粉酶启动子PamyB，为转化子PamyB-RNAi-pesp1发酵上清。泳道2的多基因干扰构建体的启动子为黑曲霉三磷酸甘油醛脱氢酶启动子PgpdA，为转化子PgpdA-RNAi-pesp1发酵上清。泳道3的多基因干扰构建体的启动子为黑曲霉糖化酶启动子PglaA，为转化子PglaA-RNAi-pesp1发酵上清。泳道4为野生型对照。其中脯氨酰内肽酶达到为63kD。由图可以看出不同的启动子对多基因的干扰效果也有影响。

图6是嗜热脂肪酶表达框和多基因干扰构建体共同转化黑曲霉之后的转化子发酵上清的分泌蛋白图谱。两端为蛋白Marker，泳道CBS513.88为野生型对照。泳道T9的多基因干扰启动子为PgpdA,为转化子PgpdA-RNAi-tll1。泳道AR10、AR11的多基因干扰启动子为Pgla,为转化子PglaA-RNAi-tll1和PglaA-RNAi-tll1发酵上清电泳。泳道HR10、HR11的多基因干扰的启动子为PamyB，为转化子PamyB-RNAi-tll1和PamyB-RNAi-tll2。

Claims (9)

1.一种高效改造丝状真菌的方法，其特征在于，向丝状真菌细胞中同时导入多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体，再通过筛选得到高效改造丝状真菌；其中多基因干扰构建体包含可以在丝状真菌细胞内起始转录的启动子、由内含子隔开的由2-30个靶基因的编码区序列嵌合连接在一起的反向重复序列、可以在丝状真菌细胞内终止转录的终止子；目的蛋白表达构建体包含可以在丝状真菌细胞内起始转录的启动子、目的蛋白的编码区序列、可以在丝状真菌细胞内终止转录的终止子，所述目的蛋白表达构建体的蛋白表达是分泌型表达。

2.根据权利要求1中所述方法，其特征在于，所述的2-30个靶基因的编码区序列嵌合连接在一起的反向重复序列的单个靶基因的序列为靶基因的编码区；该反向重复序列中的单个靶基因编码区序列最小长度为50bp。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多基因干扰构建体和目的蛋白表达构建体采用同一种启动子或者同一类启动子。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述启动子为强诱导型启动子。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述启动子为米曲霉淀粉酶B或黑曲霉糖化酶A的启动子PamyB、PglaA。

6.根据权利要求1～5任意一项所述的方法，其特征在于，所述反向重复序列中的单个靶基因编码区序列长度为50-500个碱基。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述丝状真菌是曲霉（Aspergillus）、青霉属（Penicillium）或毛霉素属（Mucor）。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，改造过程如下：

通过蜗牛酶和纤维素酶将丝状真菌制备成原生质体，PEG介导经过Sal1内切酶线性化的多基因干扰质粒和蛋白表达质粒转化丝状真菌细胞内；SDS-PAGE蛋白电泳和酶活测定筛选高效RNA干扰和蛋白表达的丝状真菌菌株。

9.权利要求1～8任意一项方法改造的丝状真菌菌株。

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