CN110331099A - 一种产油丝状真菌遗传改造菌株的快速筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种产油丝状真菌遗传改造菌株的快速筛选方法，属于微生物技术领域。本发明以表征脱氢酶活性的氯化三苯基四氮唑(TTC)为筛选指示剂并在筛选培养基中进行应用，确定了这一培养基的配方和使用方法，建立了一种在产油微生物遗传改造实验中快速区分及挑选转化子的培养基和实验方法。所述筛选方法能够准确且高效地区分转化子与非转化子，缩短重组菌株筛选的时间，所获转化子均为阳性，可正常生长及产脂，为产油微生物的遗传改造实验提供了极大便利。

Description

一种产油丝状真菌遗传改造菌株的快速筛选方法
技术领域
本发明涉及一种产油丝状真菌遗传改造菌株的快速筛选方法，尤其是一种用于快速筛选产油丝状真菌遗传改造菌株的培养基及其应用技术，属于微生物技术领域。
背景技术
脂质是构成细胞膜的主要成分，是维持生命活动的重要物质，通过参与细胞膜的流动性在物质运转、能量转换、细胞识别、免疫应答等方面起重要作用。脂肪酸分为饱和脂肪酸(SFAs)、单不饱和脂肪酸(MUFAs)和多不饱和脂肪酸(PUFAs)。PUFAs是指含有18～22个碳和两个及以上双键的长链脂肪酸，是人类膳食中必需的营养物质之一，在维持身体健康和预防疾病等方面发挥着重要作用，其中，ω-3系列PUFAs中的二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)因在防治癌症、心血管疾病和肥胖等代谢综合征中的有益作用而备受关注。
对于人类而言，最常见的膳食PUFAs是亚麻酸(LNA)和α-亚麻酸(ALA)，但这类PUFAs不具备上述保健功能。尽管LA和ALA可被转化成EPA和DHA，但转化效率过低，因此，需要通过外源摄取以满足膳食需求。ω-3系列PUFAs的传统来源是深海鱼油，由于近年来海洋资源过度捕捞、海洋污染等全球性问题，使得鱼油来源的ω-3PUFAs存在潜在的食用安全问题，而资源的有限性亦无法满足日益增长的市场需求，这使得微生物来源的PUFAs成为该领域的研究热点。因此，对微生物来源的油脂进行开发是获得优质膳食脂肪酸资源、保护生态环境、发展绿色经济的重要举措。
微生物油脂又称单细胞油脂(SCOs)，是在合适的培养条件下从酵母、细菌、霉菌和藻类中获得的脂质，大多以甘油三酯(TAGs)形式储存于胞内，一般将脂质积累量超过细胞干重20％的微生物定义为产油微生物。产油微生物可将外界营养物质转化为脂质积累于胞内，其脂质积累能力受培养条件及自身特性等多重影响。通过发酵工程和基因工程手段对产油微生物培养条件和代谢途径进行改造可使目标脂质得到大量且定向的积累。与植物油和鱼油相比，微生物油脂具有来源广泛、不受季节和环境限制、质量可控、无鱼腥味等多种优势，且其脂肪酸组成更为丰富，包括多种具有生物活性的PUFAs，如共轭亚麻酸(CLNA)、花生四烯酸(ARA)、二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)等，克服了传统PUFAs来源不足的问题，属于可再生资源，对社会经济可持续发展及环境友好型产品的开发具有积极的推动作用，极具工业化开发潜力。目前对微生物油脂的研究主要集中于生产具有高附加值的PUFAs及生物柴油，近年来已经有部分菌株应用于商业化生产。
目前，高山被孢霉(Mortierella alpina)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)、三角褐指藻(Phaeodactylum tricornutum)、圆红冬孢酵母(Rhodosporidium toruloides)、耶氏解脂酵母(Yarrowia lipolytica)和斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)等多种产油微生物脂质合成通路均已解析，研究人员通过基因工程手段对相关菌株脂质代谢途径进行遗传改造，提高了产油微生物的脂质积累能力，为微生物油脂的挖掘奠定了良好的研究基础。
以产油丝状真菌高山被孢霉为例，目前主要通过发酵条件优化、诱变育种、遗传改造等手段提高其脂质积累能力，其中，遗传改造因具有更为精准的定向调控特点而备受关注并被广泛应用。高山被孢霉的遗传改造主要方法包括原生质体转化法和根癌农杆菌介导转化法，实验过程中均需对转化子进行挑选和鉴定。在更为常用的根癌农杆菌介导转化法中，首先将带有重组质粒的根癌农杆菌与高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株(ura5-)孢子悬浮液混合涂布于贴有赛璐玢玻璃纸(再生纤维素薄膜)的IM诱导培养基上进行共培养，用于根癌农杆菌的侵染转化。在这一过程中，根癌农杆菌能够把带有筛选标记(ura5)和目的基因的T-DNA区域整合在高山被孢霉营养缺陷型菌株的基因组中，被成功转化的高山被孢霉能够恢复合成尿嘧啶的性状。之后，将带有共培养体系的玻璃纸转移至不添加尿嘧啶的全合成筛选培养基SC-CS中(Synthetic Complete Medium,添加100μM头孢噻肟钠Cef和100μM壮观霉素Spe)，被成功转化的高山被孢霉可以在该培养基中生长，而未被转化的菌株则无法生长，由此达到筛选转化子的目的。一般来讲，约7天后陆续可见转化子长出。
Ando等实验结果显示，高山被孢霉与根癌农杆菌共培养时间是影响转化效率的重要因素。在共培养时间为2～5天的范围内，所获的转化子数目随时间的延长显著提高(AndoA.,et al.,Establishment of Agrobacterium tumefaciens-mediated transformationof an oleaginous fungus,Mortierella alpina 1S-4,and its application foreicosapentaenoic acid producer breeding[J].Appl Environ Microb，2009，75(17):5529-5.)。然而，共培养阶段使用的IM培养基中含有尿嘧啶，因此高山被孢霉营养缺陷型菌株也可以生长，这就导致在2～5天的共培养结束后，赛璐玢玻璃纸上已长出较多白色的霉菌菌落，且由于培养基和玻璃纸均呈白色，为后续转化子的挑选工作带来较大干扰。此外，SC-CS筛选培养基营养成分有限，被成功转化的高山被孢霉重组菌生长较慢，待菌落较大时才可被肉眼识别，由此会使转化周期变长而降低实验效率。Ando等通过直接在SC-CS筛选培养基中添加耐尔蓝A(Nile Blue A)染色以区分菌落和培养基/玻璃纸，但转化成功和未被转化成功的菌落均可被染色，较难区分，同样影响了阳性转化子的有效筛选。因此，寻找一种可以只对转化成功的菌株进行染色、而无法对未被转化的菌落进行染色的方法，对于快速、准确挑选高山被孢霉及其他产油丝状真菌遗传改造菌株的转化子具有重要意义。
氯化三苯基四氮唑(triphenyltetrazolium chloride，TTC)可用于表征细胞内脱氢酶活性，因此常被用作产油菌株的筛选指示剂。TTC是一种氧化剂，其溶于水时为无色溶液，当被脱氢酶还原后可变为红色的三苯基甲臢(triphenyl formazan，TF)，因此，这一氧化还原反应前后颜色变化的速度及深浅可以作为初步判定细胞内脱氢酶的活性的依据，由于脱氢酶广泛存在于细胞膜结构中，这一颜色变化也反映了细胞自身活性。目前，TTC已广泛应用于产油微生物的筛选鉴定，朱敏等人发现TTC对高山被孢霉的染色程度与菌体油脂中ARA含量具有正相关性(朱敏,余龙江,肖靓,马德松.高山被孢霉的红四氮唑染色程度与菌体油脂中花生四烯酸含量的关系.生命科学研究,2004,04:339-343)。Zhu等人通过使用TTC染色法成功分离出一株高产ARA的高山被孢霉(Zhu,M.,et al.,IsolatingMortierella alpina strains of high yield of arachidonic acid.Lett ApplMicrobiol,2004.39(4):p.332-5.)。姚青蔚等将TTC与脂肪酸合酶抑制剂浅蓝菌素相结合添加至培养基中构建了一种高效筛选策略，直接用于自然界中野生型产油菌株尤其是高产PUFAs菌株的筛选(Yao,Q.,et al.,An efficient strategy for screeningpolyunsaturated fatty acid-producing oleaginous filamentous fungi from soil.JMicrobiol Methods，2019,158,80-85.)。在此研究中，姚青蔚等还针对产油丝状真菌生长情况优化了TTC添加量，确定了最适TTC添加浓度为0.5g/L，在不影响菌株生长的情况下能够迅速在众多微生物中筛选出目标菌株。这些研究表明，TTC作为一种表征细胞内脱氢酶活性的指示剂在快速筛选高产PUFAs菌株中的成功应用为其作为筛选指示剂直接用于传统筛选高产多不饱和脂肪酸的产油微生物提供了可能性。
发明内容
[技术问题]
本发明的目的在于提供一种快速筛选产油丝状真菌的遗传改造菌株的培养基及其使用方法，旨在快速、准确获得遗传改造阳性转化子。
[技术方案]
本发明提供了一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，所述遗传改造是指基因过表达、RNA干扰和/或基因敲除，所述产油丝状真菌是不具备特定抗生素抗性的或者营养缺陷型的高山被孢霉(Mortierella alpina)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)和深黄被孢霉(Mortierella isabellina)；所述方法包括以下步骤：将待筛选菌株在筛选培养基上培养一段时间，使得未成功实现遗传改造的营养缺陷型菌株或未成功实现遗传改造的不具备特定抗生素抗性的菌株丧失活性，然后，向筛选培养基中添加TTC(氯化三苯基四氮唑，triphenyltetrazolium chloride)或者将待筛选菌株转移至含TTC的筛选培养基中培养一段时间，成功实现遗传改造的恢复生长因子合成能力或具有相应抗生素抗性的菌株繁殖为粉色或红色菌落，该有色菌落即为成功实现遗传改造的目标菌株；所述筛选培养基包括全合成培养基(synthetic complete medium)或带有抗生素(如潮霉素)的培养基。
在本发明的一种实施方式中，所述遗传改造是指利用根癌农杆菌介导转化法，所述产油丝状真菌是营养缺陷型的或者不具备特定抗生素抗性的高山被孢霉(Mortierellaalpina)，首先将含有重组质粒的根癌农杆菌与所述高山被孢霉的孢子悬浮液混合，在IM诱导培养基中进行共培养，用于根癌农杆菌的侵染将目的基因转化到高山被孢霉菌株中。在这一过程中，根癌农杆菌能够把带有筛选标记(某种氨基酸合成基因或抗生素抗性基因)和目的基因的T-DNA区域整合在高山被孢霉的基因组中，被成功转化的高山被孢霉能够恢复合成所需生长因子的性状或者或的对特定抗生素的抗性。进一步地，所述共培养，是将混合的菌液涂布于贴有赛璐玢玻璃纸(再生纤维素薄膜)的IM诱导培养基上进行共培养。
在本发明的一种实施方式中，所述遗传改造是指利用根癌农杆菌介导转化法，所述产油丝状真菌是营养缺陷型的高山被孢霉(Mortierella alpina)，首先将含有重组质粒的根癌农杆菌与高山被孢霉营养缺陷型菌株的孢子悬浮液混合，在IM诱导培养基中进行共培养，用于根癌农杆菌的侵染将目的基因转化到高山被孢霉营养缺陷型菌株中。在这一过程中，根癌农杆菌能够把带有某种氨基酸合成基因和目的基因的T-DNA区域整合在高山被孢霉营养缺陷型菌株的基因组中，被成功转化的高山被孢霉能够恢复合成所需生长因子的性状。进一步地，所述共培养，是将混合的菌液涂布于贴有赛璐玢玻璃纸(再生纤维素薄膜)的IM诱导培养基上进行共培养。
在本发明的一种实施方式中，所述筛选培养基还在全合成培养基(SC)的基础上添加了壮观霉素和头孢霉素，得到SC-CS筛选培养基，SC-CS筛选培养基的组成为(1L)：葡萄糖20g，酵母氮源(无氨基酸和硫酸铵)5g，硫酸铵1.7g，苯丙氨酸60mg，亮氨酸60mg，苏氨酸50mg，异亮氨酸60mg，赖氨酸40mg，腺嘌呤20mg，酪氨酸30mg，精氨酸20mg，组氨酸20mg，甲硫氨酸10mg，头孢噻肟钠Cef 100μM，壮观霉素Spe 100μM，余量为水，pH 6.8。其中，头孢噻肟钠和壮观霉素用于抑制根癌农杆菌生长，也可以根据实验情况选择其他抗生素。含有TTC的筛选培养基：SC-CS-TTC培养基，是在SC-CS培养基的基础上添加了0.25g/L～2.0g/L TTC，优选0.5g/L。为保证抗生素和TTC的作用效果，SC-CS和SC-CS-TTC培养基需低温避光保存，尤其需要避免紫外光照射，2周内使用完毕。
在本发明的一种实施方式中，所述高山被孢霉营养缺陷型菌株包括：高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株(ura5-)，也可以是其他氨基酸缺陷型。
在本发明的一种实施方式中，所述不具备特定抗生素抗性的高山被孢霉，包括不具备潮霉素抗性的高山被孢霉。
在本发明的一种实施方式中，筛选得到的有色菌落还可以结合其他验证手段进行进一步的检验。例如，将挑选出红色菌落边缘新长出的菌丝转接至新SC-CS-TTC筛选培养基，传代三次后，再将可稳定生长的菌株接入Kendrick活化培养基扩大培养后提基因组验证。
在本发明的一种实施方式中，所述筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法包括以下步骤；
(1)利用根癌农杆菌介导转化法，将含有重组质粒的根癌农杆菌与高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株的孢子悬浮液混合，在IM诱导培养基中进行共培养，然后将带有共培养体系的赛璐玢玻璃纸转移至SC-CS筛选培养基，玻璃纸上带菌的一面朝上，相对湿度40％～70％，12℃～23℃培养8～24小时，通过低温和抗生素共同作用快速抑制根癌农杆菌的生长，之后将温度调至25℃～28℃用于转化子萌发；
(2)玻璃纸在上述SC-CS培养基上放置48～72小时后，转移至添加了TTC的SC-CS-TTC培养基，相对湿度40％～70％、25℃～28℃避光培养，约6小时后成功转化的菌落即可被染成红色，且随着时间的延长，菌落颜色可进一步加深。
在本发明中，所述菌株可以是高山被孢霉，也可以是其他经过遗传改造的产油微生物或丝状真菌，包括产油丝状真菌和酵母。由于脱氢酶广泛存在于微生物中，该培养基也可用于其他非产油微生物遗传改造菌株转化子的挑选中。但由于不同菌株脱氢酶活性不同，菌落颜色深浅程度有所差异。
在本发明中，所述遗传转化方法可以是根癌农杆菌介导转化法，也可以是其他遗传转化方法，包括原生质体转化法、电击转化法等。
本发明还提供了用于筛选经过遗传改造的高山被孢霉的筛选培养基，是在全合成培养基的基础上添加TTC，或者在马铃薯(PDA)、葡萄糖-酵母(GY)等培养基基础上添加TTC及抗生素。
本发明以高山被孢霉为例，使用可以表征脱氢酶活性的氯化三苯基四氮唑(TTC)作为指示剂添加在筛选培养基中，通过遗传转化所用的赛璐玢玻璃纸上菌落颜色(红色)变化作为筛选指标，从共培养体系中快速、准确地筛选被成功转化的重组菌，同时可根据颜色深浅对转化子脂质积累水平进行初步判断用于初筛。之后，将所选转化子在筛选培养基中传代三次后，选择可以稳定生长的转化子进行活化和酵培养，收集湿菌体，取少量样品经液氮研磨、破壁和基因组DNA提取后，通过PCR扩增目的条带并序验证菌株的正确性；发酵后的菌体经真空冷冻干燥后通过盐酸-甲醇法提取脂肪酸，使用气相色谱-质谱(GC-MS)对脂肪酸组成进行定性及定量检测，用于进一步分析所选转化子的性状。
[有益效果]
由于脱氢酶在微生物中广泛存在，具有活性的菌落均可被染色，特别是产油微生物中脱氢酶、脂肪酸脱饱和酶活性和含量均很高，TTC对其染色效果最佳。此外，青霉、曲霉等其他丝状真菌，或者酵母也可被染成粉红色或玫红色，其染色程度与菌株中脱氢酶含量和活性有关，因此，本发明还可以应用于其他非产油微生物遗传改造后转化子的筛选中，为微生物遗传改造提供了极大的便利和更高的效率。
本发明方法非常简便。本发明只需要在将筛选培养基中培养了一段时间的培养物转移到添加了TTC的筛选培养基中，就可以通过颜色将成功转化的和未转化的菌株区分开来。
本发明方法非常有效。在根癌农杆菌转化法中，IM培养基中含有尿嘧啶，未经转化的高山被孢菌在IM培养基中是可以生长的，若将共培养体系直接从IM培养基转移至SC-CS-TTC培养基，那么，虽然，未经转化的高山被孢菌无法在不含尿嘧啶的SC-CS-TTC中继续生长繁殖，但是，由于刚刚从IM培养基中转移过来的未经转化的高山被孢菌仍具备活性，就会与能够在SC-CS-TTC培养基中生长的成功转化的高山被孢霉一起被染上颜色，这就为转化子的辨别带来了很大的干扰，无法发挥SC-CS-TTC培养基的筛选优势。特别地，本发明先把共培养体系从IM培养基转移到SC-CS培养基中培养3天，在这个过程中，由于未经转化的高山被孢菌无法在不含尿嘧啶的SC-CS培养基中继续生长繁殖，那么，刚刚从IM培养基中转移过来的未经转化的高山被孢菌将在SC-CS培养基中逐渐失去活性，被成功转化的高山被孢霉则开始慢慢生长；然后，再将共培养体系从SC-CS培养基转移至SC-CS-TTC培养基，此时，被成功转化的高山被孢霉将在短时间内(＜6小时)迅速形成被染成红色的菌落，这有助于实验人员在筛选平板上快速、准确的区分出转化子。使用上述方法挑选到转化子后进行PCR验证分析，发现所选转化子均为阳性菌株，且其生长和产脂性能符合预期值，极大地提高了遗传转化实验的效率和准确性，缩短了实验周期，突破了传统筛选方法的缺点，具有很好的应用价值。
附图说明
图1共培养体系在未添加染色剂的SC-CS筛选培养基和分别添加耐尔蓝A(NileBlue A)、氯化三苯基四氮唑(TTC)的SC-CS筛选培养基上的不同时间下的特征和转化子外观；
A：在IM诱导培养基中完成2天的共培养后直接转移至相应培养基；
B：共培养后先转至SC-CS筛选培养基放置2天，再转移至添加染色剂的培养基上放置6小时；
C、D：共培养后先转至S-CS C筛选培养基放置3天，再转至相应培养基上放置6小时(C)或24小时(D)；
E：自然光下转化子在不同培养基上的外观及辨别度。
图2为高山被孢霉在SC-CS筛选培养基和SC-CS-TTC筛选培养基上的生长状态。
图3为SC-CS-TTC筛选培养基在高山被孢霉等丝状真菌重组菌筛选中的应用流程。
图4为在SC-CS-TTC筛选平板上挑选的高山被孢霉转化子PCR验证图。其中M为Marker；N1为以水代替DNA模板的阴性对照；N2为高山被孢霉原养型菌株(CCFM505)阴性对照；编号1～14为所选14个转化子；PC,带有目的基因载体的阳性对照。
图5为SC-CS-TTC筛选平板上高山被孢霉转化子在Kendrick发酵培养基中生长和产脂情况。其中，图5A为各转化子总生物量(g/L)；图5B为各转化子总脂肪酸占细胞干重(DCW)比例。
具体实施方式
IM培养基的组成为(1L)：磷酸二氢钾1.37g，甘油5mL，氯化钠0.146g，七水硫酸镁0.49g，七水硫酸亚铁0.0025g，磷酸氢二钾1.74g，氯化钙0.078g，硫酸铵0.53g，葡萄糖0.9g，MES缓冲液(pH 5.2)7.8g，余量为水。固体添加琼脂粉20g，灭菌后通过0.22μm水系滤器加入乙酰丁香酮(AS)至终浓度为200μM。
SC-CS筛选培养基的组成为(1L)：葡萄糖20g，酵母氮源(无氨基酸和硫酸铵)5g，硫酸铵1.7g，苯丙氨酸60mg，亮氨酸60mg，苏氨酸50mg，异亮氨酸60mg，赖氨酸40mg，腺嘌呤20mg，酪氨酸30mg，精氨酸20mg，组氨酸20mg，甲硫氨酸10mg，余量为水，pH 6.8。固体添加琼脂20g。115℃高温高压灭菌20min后，添加壮观霉素和头孢霉素(0.22μm水系滤器过滤除菌)至终浓度为100μM，即完成SC-CS培养基的配制。为保证抗生素的作用效果，SC-CS筛选培养基需低温避光保存，
尤其需要避免紫外光照射，2周内使用。
SC-CS-TTC培养基是在SC-CS的基础上添加0.5g/L TTC(TTC经0.22μm水系滤器过滤除菌后加入灭菌的培养基中)。为保证抗生素和TTC的作用效果，SC-CS-TTC培养基需低温避光保存，尤其需要避免紫外光照射，2周内使用。
Kindrick种子培养基和发酵培养基配方(Kendrick A，Ratledge C.Desaturationof polyunsaturated fatty acids in Mucor circinelloides and the involvement ofa novel membrane-bound malic enzyme[J].Febs Journal，1992，209(2):667-673)：葡萄糖30g(种子)/50g(产脂)；酒石酸铵3.3g(种子)/2.0g(产脂)；酵母提取物1.5g/L；KH2PO47g/L；Na2HPO4 2.0g/L；MgSO4·7H2O 1.5g/L；CaCl2·2H2O 0.008g/L；微量元素母液(FeCl3·7H2O 0.001g/L；ZnSO4·7H2O 0.0001g/L；CuSO4·5H2O 0.0001g/L；Co(NO3)2·6H2O0.0001g/L；MnSO4·5H2O0.0001g/L)。
实施例1快速挑选遗传改造菌株转化子方法的建立
(1)菌株的选择：
高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株，在不含尿嘧啶的SC-CS筛选培养基上无法生长。
高山被孢霉尿嘧啶回补型菌株，作为对照，在不含尿嘧啶的SC-CS筛选培养基上可以生长。
带有尿嘧啶回补标记的表达载体的根癌农杆菌。
(2)遗传改造
利用根癌农杆菌介导转化法对高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株进行改造。将含有携带了目的基因的重组质粒的根癌农杆菌与高山被孢霉营养缺陷型菌株的孢子悬浮液混合，在IM诱导培养基中进行共培养。
根癌农杆菌介导转化法参考Ando等报道的方法进行。
(3)筛选：
在诱导培养基(IM培养基)上完成2天的共培养后，需将带有共培养体系的玻璃纸先转移至添加抗生素的全合成筛选培养基(SC-CS)上，玻璃纸上带菌的一面朝上，相对湿度40％～70％，12℃～23℃培养8～24小时(通过低温和抗生素共同作用快速抑制根癌农杆菌的生长，培养时间根据菌体生长速度决定)，之后将温度调至25℃～28℃用于转化子萌发；
玻璃纸在上述SC-CS培养基上放置48～72小时后，转移至SC-CS-TTC培养基，相对湿度40％～70％、25℃～28℃避光培养，约6小时后成功转化的菌落即可被染成红色，且随着时间的延长，菌落颜色可进一步加深。
(4)进一步验证
每天观察步骤(3)的SC-CS-TTC平板上菌落的生长情况，并挑选出红色菌落边缘新长出的菌丝至新SC-CS-TTC筛选培养基，传代三次，将可稳定生长的菌株接入Kendrick活化培养基扩大培养后提基因组验证，并接入Kendrick发酵培养基进行发酵培养，分析其生长和产脂水平。挑选未被染色的菌落的菌丝至新SC-CS-TTC筛选培养基，培养后并无新的菌丝长出，不会在SC-CS-TTC上生长。
实验结果：共培养体系在SC-CS筛选培养基和分别添加耐尔蓝A(NBA)和氯化三苯基四氮唑(TTC)的SC-CS筛选培养基上的特征和转化子外观如图1所示。
如图1A所示，步骤(3)中，将在IM诱导培养基中完成2天共培养后的共培养体系直接转移至SC-CS-TTC培养基后，约6小时玻璃纸上所有的菌落都被菌落颜色，虽然未经转化的高山被孢菌无法在不含尿嘧啶的SC-CS-TTC中继续生长繁殖，但是，由于刚刚从IM培养基中转移过来的未经转化的高山被孢菌仍具备活性，就会与能够在SC-CS-TTC培养基中生长的成功转化的高山被孢霉一起被染上红色，这就为转化子的辨别带来了很大的干扰。
如图1B所示，如果，将共培养体系在SC-CS筛选培养基上放置2天后再分别转至添加不同染色剂(耐尔蓝A或TTC)的培养基上，28℃避光放置6小时后，可见，普通SC-CS培养基和添加耐尔蓝A的SC-CS培养基都不能将成功转化的和未成功转化的菌落区分开；而SC-CS-TTC培养基上的菌落未出现图A中大面积被染色的情况，说明在普通SC-CS培养基上放置2天后可以使共培养期间生长但未被转化的菌落活性丧失，导致其无法被染色。但在这个时间内，转化子还未长出，因此未被染色。
如图1C和图1D所示，在完成共培养后，先将带有共培养体系的玻璃纸先转至SC-CS筛选培养基放置3天，在这个过程中未被转化的菌逐渐丧失活性，再转至SC-CS-TTC培养基上放置6小时(C)或24小时(D)后，被成功转化的菌生长繁殖形成被染色的单菌落，这个单菌落就是阳性转化子。图1C和图1D中，SC-CS-TTC上可呈现非常明显的肉眼可见的红色斑点。而在不含染色剂的SC-CS培养基或SC-CS-NBA培养基上则无法区分成功转化的菌株与未经成功转化的菌株。本结果表明，先将共培养体系在SC-CS培养基上放置3天再转移至SC-CS-TTC培养基上，仅放置6小时即可明显区分出转化子，且随着时间的延长，转化子颜色逐渐加深。
如图1E所示，自然光线下转化子在不同培养基上的外观具有明显的区别。在SC-CS培养基或SC-CS-NBA培养基上，转化子与培养基和其他未被成功转化的菌落的颜色区别较小，不易区分。而在添加SC-CS-TTC的培养基上，只有转化子可以被染成红色，与未被成功转化的菌落具有明显的区别。且可以区分重叠生长的转化子、分离单克隆。
图2为高山被孢霉重组菌株在SC-CS筛选培养基和SC-CS-TTC筛选培养基上的生长状态，由图2可以看出添加0.5g/L的TTC对高山被孢霉生长无影响，因此该方法不会影响遗传转化实验的效率。
图3为SC-CS-TTC筛选培养基在高山被孢霉等丝状真菌重组菌筛选中的应用流程。
图4为在SC-TTC筛选平板上挑选的高山被孢霉转化子PCR验证图。其中，M为Marker；N1为以水代替DNA模板的阴性对照；N2为高山被孢霉原养型菌株阴性对照；挑取了14个转化子，编号1～14；PC是带有目的基因载体的阳性对照。由图可知在SC-TTC筛选平板上挑选的14个转化子PCR验证均为阳性，阳性率100％。说明使用该方法提高了阳性转化子的挑选效率。
图5为SC-TTC筛选平板上高山被孢霉转化子在Kendrick发酵培养基中生长和产脂情况。其中，图5A为各转化子总生物量(g/L)；图5B为各转化子总脂肪酸占细胞干重(DCW)比例。由本图可看出所选转化子生长和脂质积累水平均符合高山被孢霉产脂特点，而转化子之间的差异通常由基因的随机插入位点所致。
表1为SC-TTC筛选平板上的高山被孢霉转化子脂肪酸组成及比例，本表仅列出占总脂肪酸比例超过1％的脂肪酸种类，脂肪酸类别通过质谱(MS)的特征离子峰、标准品及出峰时间鉴定。由表可看出所选转化子脂肪酸组分和比例均符合高山被孢霉脂质积累特点。
从以上未添加染色剂或添加其他染色剂的SC-CS平板上转化子外观形状可以看出，本发明的培养基及快速挑选转化的方法可以准确、高效地在共培养体系中挑选转化子，且可以区分重叠生长的转化子、分离单克隆。此外，添加TTC对转化子生长速度和生长状态无影响，因此提高了遗传转化中转化子挑选效率的问题。由于脱氢酶和多不饱和脂肪酸还广泛存在于其他微生物尤其是产油微生物中，本发明提供的培养基和筛选方法还可以在其他微生物的遗传改造中进行应用，为通过基因工程构建遗传改造菌株提供了极大便利。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述遗传改造包括基因过表达、RNA干扰和/或基因敲除，所述产油丝状真菌是不具备特定抗生素抗性的或者营养缺陷型的高山被孢霉(Mortierella alpina)、卷枝毛霉(Mucor circinelloides)或深黄被孢霉(Mortierella isabellina)；所述方法包括以下步骤：将待筛选菌株在筛选培养基上培养，使得未成功实现遗传改造的营养缺陷型菌株或未成功实现遗传改造的不具备特定抗生素抗性的菌株丧失活性，然后，向筛选培养基中添加氯化三苯基四氮唑或者将待筛选菌株转移至含氯化三苯基四氮唑的筛选培养基中培养，挑选繁殖得到的粉色或红色菌落，即为成功实现遗传改造的恢复生长因子合成能力或具有相应抗生素抗性的菌株；所述筛选培养基是全合成培养基或者含抗生素的培养基。
2.根据权利要求1所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述遗传改造是指利用根癌农杆菌介导转化法，所述产油丝状真菌是营养缺陷型的或者不具备特定抗生素抗性的高山被孢霉(Mortierella alpina)；筛选过程中，在将待筛选菌株在筛选培养基上培养之前，先将含有重组质粒的根癌农杆菌与所述高山被孢霉的孢子悬浮液混合，在IM诱导培养基中进行共培养，利用根癌农杆菌的侵染将目的基因转化到高山被孢霉菌株中。
3.根据权利要求1或2所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述遗传改造是指利用根癌农杆菌介导转化法，所述产油丝状真菌是营养缺陷型的高山被孢霉(Mortierella alpina)。
4.根据权利要求3所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述筛选培养基是额外添加了头孢噻肟钠、壮观霉素的全合成培养基，组成为：葡萄糖20g/L，无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源5g/L，硫酸铵1.7g/L，苯丙氨酸60mg/L，亮氨酸60mg/L，苏氨酸50mg/L，异亮氨酸60mg/L，赖氨酸40mg/L，腺嘌呤20mg/L，酪氨酸30mg/L，精氨酸20mg/L，组氨酸20mg/L，甲硫氨酸10mg/L，头孢噻肟钠Cef 100μM/L，壮观霉素Spe 100μM/L，余量为水，pH 6.8。
5.根据权利要求1～4任一所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，营养缺陷型的高山被孢霉(Mortierella alpina)包括：高山被孢霉尿嘧啶营养缺陷型菌株(ura5-)。
6.根据权利要求1～4任一所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述不具备特定抗生素抗性的高山被孢霉，包括不具备潮霉素抗性的高山被孢霉。
7.根据权利要求1所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，筛选得到的有色菌落还结合其他验证手段进行进一步的检验；包括，将挑选出红色菌落边缘新长出的菌丝转接至新鲜SC-CS-TTC筛选培养基，传代三次后，再将可稳定生长的菌株接入Kendrick活化培养基经过扩大培养后提基因组进行验证；所述SC-CS-TTC筛选培养基是添加了头孢噻肟钠、壮观霉素、氯化三苯基四氮唑的全合成培养基。
8.根据权利要求1所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法包括以下步骤；
(1)利用根癌农杆菌介导转化法，将含有重组质粒的根癌农杆菌与高山被孢霉尿嘧啶缺陷型菌株的孢子悬浮液混合，在IM诱导培养基中进行共培养，然后将带有共培养体系的赛璐玢玻璃纸转移至SC-CS筛选培养基，玻璃纸上带菌的一面朝上，相对湿度40％～70％，12℃～23℃培养8～24小时，通过低温和抗生素共同作用快速抑制根癌农杆菌的生长，之后将温度调至25℃～28℃用于转化子萌发；所述SC-CS筛选培养基是添加了头孢噻肟钠、壮观霉素的全合成培养基；
(2)玻璃纸在上述SC-CS培养基上放置48～72小时后，转移至添加了TTC的SC-CS-TTC筛选培养基，相对湿度40％～70％、25℃～28℃避光培养，约6小时后成功转化的菌落即可被染成红色，且随着时间的延长，菌落颜色可进一步加深；所述SC-CS-TTC筛选培养基是添加了头孢噻肟钠、壮观霉素、氯化三苯基四氮唑的全合成培养基。
9.根据权利要求1所述的一种筛选经过遗传改造的产油丝状真菌的方法，其特征在于，所述遗传转化方法可以是根癌农杆菌介导转化法，或者其他遗传转化方法，包括原生质体转化法、电击转化法等。
10.一种用于筛选经过遗传改造的高山被孢霉的筛选培养基，其特征在于，是在全合成培养基的基础上添加氯化三苯基四氮唑，或者在马铃薯(PDA)或葡萄糖-酵母(GY)培养基基础上添加氯化三苯基四氮唑及抗生素。
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