CN105274124A - 生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种华根霉脂肪酶表达盒、含有华根霉脂肪酶表达盒的表达载体、含有华根霉脂肪酶表达盒的黑曲霉基因工程菌及其制备方法，所述黑曲霉基因工程菌的制备方法为：获得华根霉脂肪酶的编码基因RCL、构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子TtrpC和扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp，构建出RCL超表达盒Pgpdp-RCL-TtrpC，经T-DNA二元载体转化根癌农杆菌，再转化黑曲霉。本发明黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品级的华根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高达到263IU/mL，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，非常适合大规模生产食品级的华根霉脂肪酶。

Description

生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法，以及所述黑曲霉基因工程菌在生产华根霉脂肪酶中的应用。

背景技术

黑曲霉(Aspergillusniger)是一种重要的工业微生物，在工业酶制剂方面应用广泛，可以产生脂肪酶、淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶等30多种酶制剂；此外黑曲霉用于食品酿造和加工方面已经有上百年的历史，因此被美国FDA认定为GRAS(Generallyrecognizedassafe，通常认为是安全的)菌株，可以用于食品和药品级酶制剂的生产。由于黑曲霉具备出色的蛋白质分泌能力、高度的安全性，成熟的发酵及后处理工艺，因此，常被作为宿主菌用以表达异源酶基因。

华根霉脂肪酶（Rhizopuschinensislipase，RCL）是丝状真菌华根霉分泌的脂肪酶，研究表明RCL能够显著增加面包的比容、改善面包结构、延缓面包老化，与国内同类产品相比，RCL在改善面包和馒头的硬度、弹性、胶着性和咀嚼性方面效果更佳，能够替代传统的化学改良剂（如溴酸钾），具有重要应用价值。但是，天然的华根霉产脂肪酶能力有限，而且出于食品安全方面的考虑，它所分泌的脂肪酶不能直接作为食品添加剂。随着分子生物学的发展，RCL的基因被克隆，研究人员在毕赤酵母中实现了RCL的高效表达（中国专利，公开号：CN102911888A），但是毕赤酵母发酵过程中需要添加甲醇，甲醇一种剧毒化学物质，微量的甲醇就会导致中枢神经损害、眼部损害及代谢性酸中毒，因此以甲醇作为诱导剂生产的RCL仍然不能作为食品添加剂。本发明人研究中发现，如果将RCL与其它真菌表达研究中的常用启动子（如构巢曲霉色氨酸合成酶启动子PtrpC、黑曲霉糖化酶启动子PglaA等）融合时，不能有效实现RCL的表达；另外，如果将RCL的成熟肽与其它分泌信号融合时，在黑曲霉中不能有效地实现分泌表达。为了实现RCL在食品加工领域的应用，急需开发一种高产食品级的RCL的菌株。

发明内容

本发明提供一种生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法，所述黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品级的华根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高达到263IU/mL，产生的华根霉脂肪酶分泌到胞外，无需破碎菌体，华根霉脂肪酶存在于培养基中，操作简单，便于分离纯化；并且该黑曲霉基因工程菌培养条件粗放，适合固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，非常适合大规模生产食品级的华根霉脂肪酶。

为解决上述技术问题，本发明的一个方面是涉及一种华根霉脂肪酶表达盒，所述表达盒从5’至3’依次包含以下元件：

（1）扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp；

（2）华根霉脂肪酶基因RCL；

（3）构巢曲霉色氨酸合成酶C基因的终止子TtrpC；

所述Pgpdp的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述RCL的编码序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述TtrpC的序列为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。

本发明人经过广泛而深入的研究，经过大量筛选，意外地发现，将华根霉RCL编码基因，扩展青霉Pgpdp启动子、构巢曲霉TtrpC终止子等元件组合在一起，可以实现RCL在黑曲霉中的高效表达。同时，本发明人还发现，采用RCL自身的信号肽序列，可以实现RCL的高效分泌表达，分泌水平远高于RCL的成熟肽与其它分泌信号组合的情况。另外，采用扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp可以实现RCL的高效表达，表达量远高于其它启动子，并且生产的RCL分泌到胞外，无需破碎菌体即可分离纯化，操作简单，便于后续产物的回收和精制。黑曲霉为GRAS菌株，它所表达的RCL可以作为食品添加剂，应用于各食品加工领域。

本发明的另一个方面还涉及一种表达载体，所述表达载体含有华根霉脂肪酶表达盒，并且分泌表达华根霉脂肪酶。

本发明的另一个方面还涉及一种黑曲霉基因工程菌，所述黑曲霉基因工程菌含有所述的华根霉脂肪酶表达盒或所述的表达载体，并且表达分泌表达华根霉脂肪酶。

所述的黑曲霉基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

（1）获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；

（2）分别扩增华根霉的脂肪酶基因RCL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp和构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子TtrpC，得到有强启动子的RCL基因超表达盒；

（3）将所述RCL基因超表达盒插入潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的RCL基因超表达载体；

（4）将含潮霉素筛选标记的RCL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将RCL基因超表达盒转化到黑曲霉菌株中，获得高表达脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。

进一步地，所述的黑曲霉基因工程菌的制备方法包括如下步骤：

（1）利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆至质粒pCHAMBIA2300上，获得潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；

（2）利用RT-PCR技术从华根霉RNA中获得华根霉脂肪酶的编码基因RCL，利用PCR技术扩增构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子TtrpC，然后利用重叠延伸PCR技术获得RCL-TtrpC的融合片段，将该融合片段克隆至pMD18-T载体，构建出pMD18-T：：RCL-TtrpC；

（3）利用PCR技术扩增扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp，然后克隆至pMD18-T：：RCL-TtrpC载体上，构建出pMD18-T：：Pgpdp-RCL-TtrpC；

（4）利用限制性内切酶将表达盒Pgpdp-RCL-TtrpC酶切出来，克隆至pCHAMBIA2302载体上，构建出最终载体pCHAMBIA2302：：Pgpdp-RCL-TtrpC；

（5）将载体pCHAMBIA2302：：Pgpdp-RCL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105，利用农杆菌介导转化法将RCL基因超表达盒转化到黑曲霉菌株中，获得高表达脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。其中，利用PCR鉴定长出的黑曲霉转化子，PCR鉴定为阳性的黑曲霉转化子进一步用Southern杂交确认，Southern杂交确认为阳性的转化子用于发酵和酶活力检测。

本发明的另一个方面还涉及一种华根霉脂肪酶的生产方法，包括培养所述的黑曲霉基因工程菌，从培养体系中获得华根霉脂肪酶。其中，所述的培养采用两步生长法，即菌体生长阶段和表达阶段。

本发明的有益效果：

（1）黑曲霉基因工程菌能高效地分泌食品级的华根霉脂肪酶，脂肪酶活力最高达到263IU/mL，并且该黑曲霉基因工程菌培养条件粗放，适合固体培养和液体深层发酵，在产酶条件下不会产生真菌毒素和抗生素，非常适合大规模生产食品级的华根霉脂肪酶；

（2）产生的华根霉脂肪酶分泌到胞外，无需破碎菌体，华根霉脂肪酶存在于培养基中，操作简单，便于分离纯化；

（3）使用黑曲霉作为宿主菌，它与原核表达系统和酵母表达系统相比有以下优点：a、是食品安全菌株，表达产物可以应用于食品和药品领域；b、易培养；c、高表达；d、强大的翻译、加工和折叠系统；e、发达的分泌系统。

附图说明

图1是华根霉脂肪酶表达盒；

Pgpdp：扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，RCL：华根霉脂肪酶基因，TtrpC：色氨酸合成酶C基因的终止子；

图2是黑曲霉表达质粒pCHAMBIA2302::Pgpdp-RCL-TtrpC的物理图谱；

Pgpdp：扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因启动子，RCL：华根霉脂肪酶基因，TtrpC：色氨酸合成酶C基因的终止子，PtrpC：色氨酸合成酶C基因的终止子的启动子，HygB：潮霉素磷酸转移酶基因，SalI、SpeI、PmeI：限制性内切酶位点，LB、RB：T-边界的左边界、右边界；

图3是黑曲霉转化子的PCR检测结果；

T1至T5：5个独立的转化子，+：阳性对照质粒，WT：未转化的黑曲霉菌株，M：DL-2000Marker；

图4是黑曲霉转化子的Southern杂交结果；T1至T5：5个独立的转化子，+：阳性对照质粒，WT：未转化的黑曲霉菌株；

图5是黑曲霉转化子的发酵酶活力检测结果。T1-T5：5个独立的转化子，WT：未转化的黑曲霉菌株。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例对本发明进行进一步描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人的分子克隆实验手册（NewYork：ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989）中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。

华根霉菌株从中国工业微生物菌种保藏管理中心（Chinacenterofindustrialculturecollection，CICC）购买，保藏编号为CICC4195。购买后，接种在PDA斜面培养基上，在26℃条件下培养20天，然后保存于4℃冰箱。

扩展青霉菌株从中国药用微生物菌种保藏管理中心（Centerforculturecollectionofpharmaceuticalmicroorganisms，CPCC）购买，保藏编号为CPCC460013。购买后，接种在PDA斜面培养基上，在26℃条件下培养20天，然后保存于4℃冰箱。

黑曲霉菌株从中国工业微生物菌种保藏管理中心（Chinacenterofindustrialculturecollection，CICC）购买，保藏编号为CICC2475。购买后，接种在PDA斜面培养基上，在26℃条件下培养20天，然后保存于4℃冰箱。

大肠杆菌DH5a菌株已在《刘静华，包英华，陈燕飞；大肠杆菌DH5a感受态细胞转化率的改进，韶关学院学报，2008，29（03）：87-90》文献中公开。大肠杆菌DH5a菌株的感受态细胞可通过供应商天根生化科技（北京）有限公司购买，货号CB101-03。

根癌农杆菌EHA105已在《黄亚丽，蒋细良，田云龙，郭萍，朱昌雄；根癌农杆菌介导的哈茨木霉遗传转化的研究，中国生物工程杂志，2008，28(3):38-43》文献中公开。根癌农杆菌EHA105可通过公开市售的商业渠道取得，如可以从中国质粒载体菌株细胞株基因保藏中心BiovectorScienceLab购得，货号为Biovector-375。

pAN7-1质粒购至广州吉赛生物科技有限公司，货号为：geneseed901。

pCHAMBIA2302质粒已在中国专利CN102154358中公开，它是通过pCAMBIA2300为载体骨架改造而来，pCAMBIA2300购至北京鼎国昌盛生物技术有限公司，货号为：MCV036。

实施例1：超表达载体的构建

（1）利用限制性内切酶SacI，KpnI将潮霉素抗性表达盒从质粒PV2+上酶切出来，片段经凝胶回收，克隆到pCAMBIA2300质粒的相应酶切位点上，获得具有潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；潮霉素表达盒也可来自其它含该序列的任何DNA或者直接合成，用于构建RCL基因超表达载体的质粒除pCAMBIA2300外，还可用其它含有T-边界的质粒如pCAMBIA1300、pCAMBIA3300等pCAMBIA系列载体和pHB载体；

（2）取华根霉菌丝体0.2g经液氮研磨，加入1mL的trizol，常温下静置5min，加入0.2mL的氯仿,抽提一次，然后离心将上清转移至另一干净的离心管中，加入0.5mL异丙醇沉淀RNA，离心弃上清，沉淀用75%的乙醇洗涤两次，然后溶于RNA-free的水中，备用；；

（3）对步骤（2）中的RNA进行反转录，反转录的步骤参见Takara公司的反转录试剂盒说明书（货号：RR012A），获得了cDNA；

（4）根据华根霉脂肪酶基因RCL（EF405962.2）的序列设计引物（正向引物：ACTAGTATGGTTTCATTCATTTCCATTTC，下划线的序列为限制性酶SpeI切点；反向引物：ATTTAAATTTACAAACAGCTTCCTTCGTTAA，下划线的序列为限制性酶swaI切点），以步骤（3）中的cDNA为模板，PCR技术扩增RCL全基因序列。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min；

（5）根据质粒pPAN7-1（Puntetal.1987Gene56:117-124）的序列设计引物（正向引物：AAGGAAGCTGTTTGTAAATTTAAATGGATCCACTTAACGTTA，下划线的序列为限制性酶SwaI切点；反向引物：GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGC，下划线的序列为限制性酶PmeI切点）利用PCR技术扩增出色氨酸合成酶终止子TtrpC。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃60s，35个循环；72℃10min；

（6）取（4）和（5）的反应液各1μL作为模板，以（ACTAGTATGGTTTCATTCATTTCCATTTC）作为正向引物；以（GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGC）作为反向引物，进行PCR扩增，PCR的反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃150s，35个循环；72℃10min；反应结束后，将PCR扩增产物进行凝胶柱回收，并克隆到pMD18-T载体，获得中间载体pMD18-T::RCL-TtrpC；

（7）取扩展青霉菌丝体0.2g经液氮研磨，加入1mL高盐低pH提取液，65℃水浴30min，12000rpm/min离心10min，取上清液；入0.7mL的KAc（2.5M，pH4.8），12000rpm/min离心10min离心，取上清液；然后往上清液中加入1.2mL的异丙醇，沉淀DNA；基因组DNA经75%的乙醇洗涤两次，溶解于双蒸水中备用；

（8）根据SEQNO:1所示的PgpdP全长序列，设计引物（正向引物:GAGAGTCGACGCGTCTTCGAGGGGCAG下划线的序列为限制性酶SalI切点；反向引物：GAGAACTAGTGATTGCGGTTTACTGGAAGCTGT下划线的序列为限制性酶SpeI切点），以扩展青霉基因组DNA为模板，利用利用PCR技术扩增全基因序列。PCR反应条件为：95℃5min；95℃30s，56℃30s，72℃180s，35个循环；72℃10min。然后将目标片段回收，利用限制性内切酶SalI和SpeI对该片段进行消化，回收酶切产物，克隆到载体pMD18-T::RCL-TtrpC的相应位点，获得中间载体pMD18-T::PgpdP-RCL-TtrpC；至此，构建出了华根霉脂肪酶表达盒（如图1）；

（9）利用限制内切酶SalI和PmeI对载体pMD18-T::PgpdP-RCL-TtrpC进行消化，回收表达盒PgpdP-RCL-TtrpC，然后克隆至pCHAMBIA2302相应位点，获得最终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-RCL-TtrpC（如图2）；

（10）对含有最终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-RCL-TtrpC的菌进行扩大培养，并抽提质粒，利用冻融法转化工程农杆菌EHA105。以（ACTAGTATGGTTTCATTCATTTCCATTTC）作为正向引物；以（GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGC）作为反向引物，以载体pMD18-T::PgpdP-RCL-TtrpC为阳性对照，空EHA105为阴性对照，对长出的转化子进行PCR鉴定，PCR鉴定为阳性的转化子用于侵染黑曲霉。

实施例2：黑曲霉基因工程菌的获得

（1）挑取黑曲霉接种于PDA平板上，于28℃培养20天左右，用无菌水洗下成熟孢子；

（2）将实例1中含终载体pCHAMBIA2302::PgpdP-RCL-TtrpC的工程农杆菌EHA105接种于含有100μg/mL链霉素、100μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中28℃，200rpm过夜培养，用含有100μg/mL链霉素和100μg/mL卡那霉素的MM培养基重新活化，28℃，220rpm培养48小时。吸取适量的培养物5000rpm离心去上清，并用IM液体培养基洗涤，最后用IM液体培养基稀释至OD600=0.15，然后在28℃，220rpm的条件下培养6~8小时，至OD600=0.5~0.6。

（3）将第（1）步得到的新鲜孢子配制成1×10⁵个/mL浓度的悬浮液，随后取上述孢子悬液与步骤（2）中的工程农杆菌等体积混合，取200μL均匀涂布到铺有玻璃纸的CM培养基（含AS200μg/mL）之上，28℃共培养60h，然后将玻璃纸反铺到含有潮霉素（150μg/mL转化选择抗生素）、头孢菌素（500μg/mL，抑制农杆菌生长抗生素）的PDA培养基上28℃培养2天，揭下玻璃纸，在28℃条件下培养1~3天，将抗潮霉素的转化子挑出接种到二筛培养基上，如稳定传代，即是所述青霉基因工程菌，如此获得了20株黑曲霉基因工程菌。随机挑选5株转化子进行扩大培养，并分别抽提基因组DNA，以（ACTAGTATGGTTTCATTCATTTCCATTTC）作为正向引物；以（GTTTAAACTCGAGTGGAGATGTGGAGTGGGC）作为反向引物，以载体pMD18-T::RCL-TtrpC为阳性对照，野生型黑曲霉基因组DNA为阴性对照，对这5株菌进行PCR鉴定，结果显示这5株菌均为阳性，请参见图3；

（4）用CTAB法大量抽提上述5株黑曲霉工程菌基因组DNA，然后利用Southern杂交技术对这七株转化子进行进一步的鉴定，Southern杂交的步骤参见GE公司的操作手册（货号：W4628097）；杂交结果显进一步证实这5株菌均为阳性，而且RCL表达以随机插入的方式，整合到黑曲霉基因组中，其中T4、T5含有2个拷贝，请参见图4；

MM培养基：1MK2HPO4-KH2PO4（pH7.0）10mL，M-N（MgSO4·7H2O30g/L，NaCl15g/L）20mL，1%CaCl2·2H2O1mL，20%葡萄糖10mL，0.01%FeSO410mL，Sporeelement（ZnSO4·7H2O100mg/L，CuSO4·5H2O100mg/L，H3BO3100mg/L，MnSO4·H2O100mg/L，Na2MoO4·2H2O100mg/L)）5mL，20%NH4NO32.5mL，无菌水941.5mL。

IM培养基：1MK2HPO4-KH2PO4（pH7.0）10mL，M-N（MgSO4·7H2O30g/L，NaCl15g/L）20mL，1%CaCl2·2H2O1mL，20%葡萄糖10mL，0.01%FeSO410mL，Sporeelement（ZnSO4·7H2O100mg/L，CuSO4·5H2O100mg/L，H3BO3100mg/L，MnSO4·H2O100mg/L，Na2MoO4·2H2O100mg/L）5mL，20%NH4NO32.5mL，50%甘油10mL，1MMES（pH5.5）40mL，100mMAS（乙酰丁香酮）2mL，无菌水898.7mL。

CM培养基：加一半IM培养基的葡萄糖量，外加1.5%琼脂，其它成份同IM培养基。

PDA培养基（g/L）：马铃薯，200；蔗糖，20；琼脂，15；PH自然。

高盐低pH提取液：NaAc0.1M，pH4.8；EDTA-Na20.05M，pH8.0;；NaCl0.5M；PVP2%；SDS2%；调节最终pH至5.5。

实施例3：产脂肪酶能力分析

将实例2中所得的5株Southern杂交阳性的黑曲霉转化子接种到PDA培养基上，待其长出孢子后，用蒸馏水洗下来，稀释至10⁷个/mL。在200mL的三角瓶中装入25mL的PDA培养液，接入2.5mL的黑曲霉工程菌孢子，在26℃，220rpm摇床培养24h，然后以10%的接种量分别转入发酵培养基YPD（250mL三角瓶装30mL发酵培养基），在26℃，220rpm条件下发酵96h；然后将发酵液离心，取上清液进行脂肪酶活力检测。

利用酸碱滴定法对脂肪酶活力进行检测，检测步骤为：取100mL三角瓶20只，分别加入4.0mLpH9.4的Gly-NaOH缓冲液和5.0mL橄榄油乳化液；放入震荡恒温水浴锅36℃水浴锅预热5分钟。酶液过滤后，用0.05mol/LpH9.4的Gly-NaOH缓冲液稀释使酶活为4-5IU/mL后测定。往其中两个各加入1mL稀释好的酶液，缓慢振荡（60次/min）10分钟（精确计时）。另外两瓶做空白对照.立即加入95%酒精20mL（空白对照加入1mL稀释好的酶液），摇匀，加入10mL30%的氯化钠溶液，摇匀；用0.01mol/LNaOH溶液滴定样品使其与空白对照的pH相同，记下0.01mol/LNaOH用量。

计算

X=A×B×1/T×n

式中：

X——样品的酶活力（u/g或u/mL）；

A——滴定样品时消耗标准0.01mol/LNaOH的体积（mL）；

B—-滴定用NaOH的浓度（μmol/mL）

T——酶促反应时间（min）；

n——稀释倍数；

同时做两份平行，结果取平均值，所得结果表示至整数，平行试验相对误差不得超过5.0%，结果如图5所示。从图5可以看出，未转化的黑曲霉发酵液几乎检测不到脂肪酶活力，而转入了RCL表达盒的黑曲霉工程菌的发酵液中检测到了很强的脂肪酶活力，最高达到263IU/mL。

PDA培养液（g/L）：马铃薯，200；蔗糖，20；pH自然。

YPD培养基（g/L）：酵母提取物，10；蛋白胨，20；葡萄糖，20。

橄榄油乳化液的制取：4%PVA溶液和橄榄油为2:1（v/v），放到小三角瓶里（外包冰块），调整为转速为10000转/分，一次乳化3分钟，间隔3分钟，共乳化3次。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解，根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

序列表

<110>深圳市绿微康生物工程有限公司

<120>生产华根霉脂肪酶的黑曲霉基因工程菌及其制备方法

<130>LVK201401

<160>3

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>3158

<212>DNA

<213>扩展青霉（Penicilliumexpansum）

<400>1

gtcgacgcgtcttcgaggggcagttttcatcgagtaactcatcgctcgtatcgcatgacc60

actctcgcacgagatgatttctaagccagcaatgagaggagtcataatcccactaacctg120

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<210>2

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<213>华根霉（Rhizopuschinensis）

<400>2

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<210>3

<211>776

<212>DNA

<213>构巢曲霉（Aspergillusnidulans）

<400>3

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Claims (6)

1.一种华根霉脂肪酶表达盒，其特征在于，所述表达盒从5’至3’依次包含以下元件：

（1）扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp；

（2）华根霉脂肪酶基因RCL；

（3）构巢曲霉色氨酸合成酶C基因的终止子TtrpC；

所述Pgpdp的序列为SEQIDNO：1所示的核苷酸序列，所述RCL的编码序列为SEQIDNO：2所示的核苷酸序列，所述TtrpC的序列为SEQIDNO：3所示的核苷酸序列。

2.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体含有权利要求1所述的华根霉脂肪酶表达盒，并且分泌表达华根霉脂肪酶。

3.一种黑曲霉基因工程菌，其特征在于，所述黑曲霉基因工程菌含有权利要求1所述的华根霉脂肪酶表达盒或权利要求2所述的表达载体，并且分泌表达华根霉脂肪酶。

4.权利要求3所述的黑曲霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）获得潮霉素抗性表达盒并克隆至目标质粒上，获得潮霉素抗性的重组质粒；

（2）分别扩增华根霉的脂肪酶基因RCL、扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp和构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子TtrpC，得到有强启动子的RCL基因超表达盒；

（3）将所述RCL基因超表达盒插入潮霉素抗性的重组质粒中，获得含潮霉素筛选标记的RCL基因超表达载体；

（4）将含潮霉素筛选标记的RCL基因超表达载体转化工程农杆菌，利用农杆菌介导转化法将RCL基因超表达盒转化到黑曲霉菌株中，获得高表达脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。

5.根据权利要求4所述的黑曲霉基因工程菌的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）利用PCR技术或限制性酶切技术获得潮霉素抗性表达盒并克隆至质粒pCHAMBIA2300上，获得潮霉素抗性的重组质粒pCHAMBIA2302；

（2）利用RT-PCR技术从华根霉RNA中获得华根霉脂肪酶的编码基因RCL，利用PCR技术扩增构巢曲霉色氨酸合成酶C的终止子TtrpC，然后利用重叠延伸PCR技术获得RCL-TtrpC的融合片段，将该融合片段克隆至pMD18-T载体，构建出pMD18-T：：RCL-TtrpC；

（3）利用PCR技术扩增扩展青霉甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因的启动子Pgpdp，然后克隆至pMD18-T：：RCL-TtrpC载体上，构建出pMD18-T：：Pgpdp-RCL-TtrpC；

（4）利用限制性内切酶将表达盒Pgpdp-RCL-TtrpC酶切出来，克隆至pCHAMBIA2302载体上，构建出最终载体pCHAMBIA2302：：Pgpdp-RCL-TtrpC；

（5）将载体pCHAMBIA2302：：Pgpdp-RCL-TtrpC通过冻融法转化工程农杆菌EHA105，利用农杆菌介导转化法将RCL基因超表达盒转化到黑曲霉菌株中，获得高表达脂肪酶的黑曲霉基因工程菌。

6.一种华根霉脂肪酶的生产方法，其特征在于，包括培养权利要求3所述的黑曲霉基因工程菌，从培养体系中获得华根霉脂肪酶。