CN103911296B - 一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株 - Google Patents
一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株，该菌株命名为草酸青霉（Penicillium？oxalicum）RE-10，所述菌株已于2014年3月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCC？No.8922。本发明还公开了所述菌株在生产纤维素酶和半纤维素酶中的应用。实验证实利用本发明提供的菌株在产酶培养基条件下滤纸酶活相比出发菌株提高52倍，相比目前已有工业菌株，本发明提供的工程菌生产周期明显缩短，且纤维素酶和半纤维素酶产量高，生产成本低，并可以应用于纤维素酶和半纤维素酶中的大规模生产，具有良好的工业开发和应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种具有纤维素酶和半纤维素酶活性的工程菌株，尤其涉及一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉（Penicilliumoxalicum）菌，属于基因工程领域。
背景技术
草酸青霉是一种高产纤维素酶和半纤维素酶的丝状真菌(Qu,etal.2013.ImprovinglignocellulolyticenzymeproductionwithPenicillium:fromstrainscreeningtosystemsbiology.Biofuels,4(5),12)，在纤维素酶的表达调控以及高产纤维素酶的遗传改造方面取得了广泛进展，并且该菌已应用于了纤维素酶的工业生产。随着自然界石化能源资源的枯竭，可再生能源越来越受到重视，特别是木质纤维素，作为自然界中储存量最为丰富的可再生资源，与其有关的生物炼制产业很有可能成为解决我国石化资源紧张的有效途径之一。在生物质原料的生物转化过程中，木质纤维素的难降解特性是将其转化可发酵糖类的重要障碍，而提高纤维素酶及半纤维素酶的表达量可有效降低木质纤维素生物转化的成本，然而，工业菌株中纤维素酶及半纤维素酶的表达量的提高并不仅是通过对菌株发酵工艺的优化即能解决的问题，目前，通过基因工程方法对细胞中纤维素酶表达调控的网络进行重构，是提高宿主细胞纤维素酶表达强度的有效方法。
近年来，草酸青霉菌株的遗传改造工作已逐步展开(Qu,etal.2013.ImprovinglignocellulolyticenzymeproductionwithPenicillium:fromstrainscreeningtosystemsbiology.Biofuels,4(5),12.)，并且申请人课题组于2013年公布了草酸青霉基因组序列(Liu,G.,etal.2013.GenomicandsecretomicanalysesrevealuniquefeaturesofthelignocellulolyticenzymesystemofPenicilliumdecumbens.PLoSOne,8(2),e55185.)，更有助于该菌基因功能的研究以及基因工程菌株的理性改造。近期成功构建的草酸青霉转录因子突变株库也为解析该菌纤维素酶的表达调控机制提供了有效的资源。其它丝状真菌中，发现了一些显著调控纤维素酶和半纤维素酶基因表达的转录因子，如在里氏木霉中转录因子CRE1编码基因的敲除(Kubicek,C.Petal.2011.TheCRE1carboncataboliterepressorofthefungusTrichodermareesei:amasterregulatorofcarbonassimilation.BMCGenomics,12.)、粗糙脉孢菌转录因子ClrB的过表达(Coradetti,S.T.etal.2013.Analysisofaconservedcellulasetranscriptionalregulatorrevealsinducer-independentproductionofcellulolyticenzymesinNeurosporacrassa.Microbiologyopen.)均可以促使纤维素酶和半纤维素酶的高表达，然而经检索，丝状真菌中没有文献报道ClrB的过表达与CRE1的敲除存在强烈的协同正调控纤维素酶和半纤维素酶表达的作用。
β-葡萄糖苷酶在产纤维素酶丝状真菌中普遍存在(Chen,M.,etal.2013.Promotionofextracellularlignocellulolyticenzymesproductionbyrestrainingtheintracellularbeta-glucosidaseinPenicilliumdecumbens.BioresourTechnol,137,33-40.)，但不同属种中β-葡萄糖苷酶同源蛋白的细胞功能存在明显的差异，比如在粗糙脉孢菌中多种β-葡萄糖苷酶基因的单独敲除菌株对纤维素酶的表达没有明显的影响(Znameroski,E.Aetal.2013.EvidencefortransceptorfunctionofcellodextrintransportersinNeurosporacrassa.JBiolChem)，但在里氏木霉中敲除同源的β-葡萄糖苷酶编码基因cel1a（bglII），Δcel1a突变株在纤维素条件下，纤维素酶反而出现表达显著下降和延迟表达(Zhou,Qetal.2012.Differentialinvolvementofbeta-glucosidasesfromHypocreajecorinainrapidinductionofcellulasegenesbycelluloseandcellobiose.EukaryotCell)。然而经检索，目前在丝状真菌中，没有文献报道β-葡萄糖苷酶Bgl2的缺失会明显促进转录因子ClrB对纤维素酶和半纤维素酶表达的正调控作用，更没有将此应用于高产纤维素酶菌株的遗传改造。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是提供一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株。
本发明的技术方案是基于申请人发现草酸青霉纤维素酶和半纤维素酶表达正转录因子ClrB（GenBank:EPS31045.1）在同时敲除CreA（GenBank:EPS28222.1）和Bgl2（GenBank:EPS25645.1）编码基因时，所表现出的协同促进纤维素酶和半纤维素酶基因表达的特点，采用在草酸青霉中组成型过表达转录因子ClrB，并敲除转录因子CreA编码基因和敲除-葡萄糖苷酶Bgl2编码基因，即得到提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名为草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10。在纤维素诱导产酶培养基条件下应用该菌即可生产纤维素酶和半纤维素酶。
本发明所述的提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株，其特征在于：所述菌株命名为草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10，该菌株已于2014年3月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.8922。
上述提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株的构建方法，步骤是：
（1）ClrB过表达载体的构建及转化：
以草酸青霉CGMCCNo.5302基因组为模板，克隆clrB基因的编码区与终止子区，然后以质粒pAN7-1(GenBank:Z32698.1)为模板，扩增来源于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的3’-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因（gpdA）的启动子序列gpdA(p)(GenBank:Z32524.1)，将所获得的gpdA(p)启动子区与ClrB（GenBank:EPS31045.1）基因的编码区和终止子区，以及筛选标记ptra基因序列（硫胺吡啶抗性基因）利用Double-jointPCR方法融合成clrB组成型过表达盒重组片段，然后将此重组片段与克隆载体pMD18-T(TaKaRaCode:D103A)经T/A连接，从而获得携带有ClrB过表达盒的载体pTClrB。然后通过制备原生质体转化的方法，将ClrB过表达盒的载体pTClrB转入到草酸青霉菌株CGMCCNo.5302获得转化子ClrB的过表达菌株，命名为草酸青霉RE-ClrB，其基因型为gpdA(p)::clrB::ptra。
（2）CreA基因的敲除：
通过同源重组双交换的方法在获得的草酸青霉RE-ClrB中敲除CreA（GenBank:EPS28222.1）基因；得到缺失creA基因的重组草酸青霉，命名为草酸青霉RE-CCreA，其基因型为ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra。
上述基因重组方法，是通过设计带有creA基因序列同源臂的和筛选标记bar（草胺磷抗性基因）的重组片段。然后通过制备原生质体转化的方法，将creA敲除盒重组片段转入到草酸青霉重组菌株RE-ClrB中，creA敲除盒两端的同源臂与基因组上的目的基因creA相对应的同源序列发生双交换重组，从而使抗性基因bar将原有的基因的编码区置换下来，然后获得CreA基因敲除同时ClrB组成型过表达的重组菌株草酸青霉RE-CCreA（ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra）。
（3）Bgl2基因的敲除：
通过同源重组双交换的方法在获得的草酸青霉RE-CCreA中进一步敲除Bgl2（GenBank:EPS25645.1）基因，得到缺失bgl2基因的草酸青霉重组菌株即为提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名为草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10，其基因型为Δbgl2::hph-ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra。
上述基因重组方法，是通过Double-jointPCR方法合成带有bgl2基因序列同源臂的和筛选标记hph（潮霉素抗性基因）的重组片段，其中bgl2基因序列同源臂位于筛选标记hph的两侧。然后通过制备原生质体转化的方法，将bgl2敲除盒重组片段转入到草酸青霉菌株RE-CCreA中，bgl2敲除盒两端的同源臂与基因组上的目的基因bgl2相对应的同源序列发生双交换重组，从而使抗性基因hph将原有的基因的编码区置换下来，获得敲除Bgl2基因的重组菌株，命名为草酸青霉RE-10（Δbgl2::hph-ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra）。
本发明所述提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株在生产纤维素酶和半纤维素酶中的应用，方法是：
（1）菌种选择：选工程菌草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10CGMCCNo.8922；
（2）平板培养：将上述工程菌草酸青霉RE-10菌种接种于含有质量百分比为1.5～2.0%的琼脂的固体基本培养基平板上，30℃条件下，静置培养48h；
（3）种子培养：将步骤（2）培养的菌株，在无菌条件下用接种环接1～2环分生孢子于100毫升并加有2%（质量百分比）葡萄糖（或3%麸皮）为碳源的液体基本培养基中，30℃条件下，150～250转/分钟，pH5.0～5.8，摇床振荡培养16～24小时，制得种子液；
（4）产酶培养：以体积比为10％的接种量，将步骤（3）的种子液接种于200毫升并加有终浓度3%微晶纤维素和3%麸皮为碳源的液体产酶培养基中，pH5.0～5.8，30℃条件下，150～250转/分钟振荡培养72～168h，制得扩大量的发酵培养菌液；
（5）收集发酵培养菌液：发酵结束后，将发酵液在8,000转/分钟的转速下离心10分钟，收集上清液，常规方法分离提纯纤维素酶和半纤维素酶；
上述的应用中，步骤（3）、（4）中所述振荡培养，优选200转/分钟。
上述的应用中，步骤（4）所述的振荡培养，优选培养时间为120小时。
上述的应用中，步骤（4）所述的pH优选为pH5.6。
本发明应用生物工程技术获得并公开了草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10（Δbgl2::hph-ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra）工程菌株（CGMCCNo.8922），实验证实利用本发明提供的工程菌在生产纤维素酶和半纤维素酶中，其纤维素酶和半纤维素酶生产能力明显增强，在产酶培养基条件下滤纸酶活相比野生出发菌株（CGMCCNo.5302）提高52倍，相比目前工业生产纤维素酶和半纤维素酶诱变突变株，本发明提供的工程菌生产周期明显缩短（缩短24～36h），且纤维素酶和半纤维素酶产量高，生产成本低，并可以应用于纤维素酶和半纤维素酶中的大规模生产，具有良好的工业开发和应用前景。
附图说明
本发明所述草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10菌株已于2014年3月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.8922。
图1：本发明所述草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10（CGMCCNo.8922）与野生(Wild-type)出发菌株（CGMCCNo.5302）在纤维素液体培养条件下培养液中纤维素酶和半纤维素酶活测定：滤纸酶活(A图)，外切纤维素酶活（B图），内切纤维素酶（C图）和木聚糖酶（D图）测定。
图2：本发明所述酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10（CGMCCNo.8922）与野生(Wild-type)出发菌株（CGMCCNo.5302）在麸皮和纤维素复合碳源产酶发酵条件下培养液中滤纸酶活。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
一般性说明：
微生物来源
实施例中的出发菌株草酸青霉（Penicilliumoxalicum）CGMCCNo.5302是申请人先前专利申请时保藏的菌株，该菌株已于2011年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），其保藏号为CGMCCNo.5302。
培养基
所述基本培养基（Vogel’s）盐组分（1L）：Na3Citrate·2H20，125g，KH2PO4，250g，NH4NO3，100g，MgSO4·7H20，10g，CaCl2·2H20，5g，微量元素溶液5ml，生物素溶液2.5ml，121℃灭菌30min。
所述微量元素溶液(100ml)：Citricacid·H20，5g,ZnSO4·7H205g，Fe(NH4)2(SO4)2·6H201g，CuSO4·5H200.25g，MnSO4·H200.05g，H3BO30.05g，Na2MoO4·2H200.05g。
所述生物素溶液：5.0mg溶于50ml无菌水中。
所述转化培养基：基本培养基中加2%的葡萄糖为碳源，1MD-山梨醇为原生质体的渗透压稳定剂。基本培养基中根据转化外源片段遗传筛选标记基因的不同，分别加入终浓度200ug/ml的潮霉素B（EMRESCO，产品编号2012C098，抗性基因hph）、终浓度300ng/ml的硫胺吡啶(Sigma，产品编号P0256，抗性基因ptra)或终浓度1.6mg/ml的草胺磷（PESTANAL，产品编号278-636-5，抗性基因bar），121℃灭菌30min，pH5.6。
所述分单孢培养基：基本培养基中加2%的葡萄糖为碳源，根据转化外源片段中遗传筛选标记基因的不同，分别加入终浓度200ug/ml的潮霉素B（hph）、终浓度300ng/ml的硫胺吡啶(ptra)或终浓度1.6mg/ml的草胺磷（bar），121℃灭菌30min，pH5.6。
所述发酵产酶培养基：基本培养基盐组分中，添加2%的微晶纤维素（或3%的微晶纤维素+3%的麸皮）为碳源，pH5.6。
硫胺吡啶溶液配制：用无菌水配制100ug/ml的硫胺吡啶母液。
草胺磷溶液：用无菌水配制10%的草胺磷母液。
所述纤维素酶和半纤维素酶活测定缓冲液试剂配制：
醋酸-醋酸钠缓冲液：量取590ml0.2M的NaAC溶液与410ml0.2M的HAC溶液，混合配制成pH≈4.8的0.2M的HAC-NaAC缓冲液1000ml；
pNP溶液：300ng/μl的pNP(4-Nitrophenol，Aldrich产品编号241326)溶液储存液，使用时稀释到60ng/μl；
pNPG溶液：将pNPG（p-Nitrophenylβ-D-cellobioside，Sigma产品编号N5759）溶于0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液中，配成10mM反应液；
pNPC溶液：将pNPC(4-Nitrophenylβ-D-cellobioside，Sigma产品编号N5759)溶于0.2mol/l醋酸-醋酸钠缓冲液中，配成1mg/ml反应液；
10%Na2CO3酶反应终止液：准确称量10gNa2CO3，加入100ml的双蒸水，充分溶解后混匀；
DNS试剂：首先将NaOH104g溶于1300ml蒸馏水中，加入3，5-二硝基水杨酸30g，混匀，加热溶解；其次，称取酒石酸钾钠910g溶于2500ml蒸馏水中，再加入25g重蒸酚和25g无水亚硫酸钠，加入到酒石酸钾钠溶液中；将以上各步骤的溶液混合，加入1200ml蒸馏水（总体积5000ml），放在棕色瓶中，暗处放置一周后即可使用；
木聚糖溶液：称取1g的木聚糖（BeechwoodXylan，Sigma产品编号X4252）溶于100ml醋酸-醋酸钠缓冲液。
洗分生孢子生理盐水：0.9%的NaCl和0.05%的吐温-80水溶液，121℃灭菌30min。
蛋白质浓度测定：吸取稀释10倍的发酵液上清液10μl与200ul反应液试剂(Bio-Ras试剂盒)充分混合，595nm测吸光值。
pME2892质粒采用如下论文中记载的方法制备(Krappmann,Setal.2005.DeletionandallelicexchangeoftheAspergillusfumigatusveAlocusviaanovelrecyclablemarkermodule.EukaryotCell,4(7),1298-307.)。
pSilent-1质粒采用如下论文中记载的方法制备(Nakayashiki,Hetal.2005.RNAsilencingasatoolforexploringgenefunctioninascomycetefungi.FungalGeneticsandBiology,42(4),275-283.)。
pUC-bar质粒采用如下论文中记载的方法制备(Luo,Z.etal.2013.AblationofthecreAregulatorresultsinaminoacidtoxicity,temperaturesensitivity,pleiotropiceffectsoncellulardevelopmentandlossofvirulenceinthefilamentousfungusBeauveriabassiana.EnvironMicrobiol.)。
pAN7-1质粒采用如下论文中记载的方法制备(Punt,P.J.etal.1990.FunctionalelementsinthepromoterregionoftheAspergillusnidulansgpdAgeneencodingglyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase.Gene,93(1),101-9.)。
草酸青霉染色体DNA大量提取：
(1)将草酸青霉1×106数量的分生孢子接种于100ml的Vogel’s盐基本培养基中，碳源为2%的葡萄糖，200rpm，30℃培养48h。
(2)将菌悬液用真空抽滤泵除去培养基，并用0.09MNaCl溶液洗涤一次，转移抽干的菌丝体至研钵中，加液氮冷冻并将菌丝体研磨至粉末状。
(3)把菌丝体粉末以质量体积比1：5（菌丝重：抽提液）加入到抽提液缓冲液（200mMTris-HCl、pH8.5，250mMNaCl，25mMEDTA，2％SDS）中，混匀，65℃保温30min。
(4)加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25:24:1）溶液至样品中，颠倒混匀，12000rpm室温离心10min。
(5)缓慢吸取上层水相至另一离心管中，加入0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置20min，12000rpm，4℃，10min，收集沉淀。
(6)以70%乙醇洗涤沉淀一次，12000rpm，2min，然后，真空干燥，用适量ddH2O完全溶解沉淀。
(7)加入终浓度0.1μg/μl的RNAase，37℃温育1h。
(8)再加入等体积苯酚/氯仿抽提一次，12000rpm，20min。
(9)上清转移至另一离心管中，加0.1倍体积3MNaAc（pH4.8）和0.6倍体积异丙醇，于-20℃放置20min，12000rpm，4℃，10min，收集沉淀。
(10)加70％乙醇，洗涤一次，待乙醇挥发完全，用适量ddH2O溶解，制得草酸青霉基因组DNA。
实施例1、草酸青霉ClrB基因过表达菌株的构建
(1)草酸青霉ClrB编码区及终子区片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，在ClrB编码区及终子区设计特异引物clrB-Fa和clrB-Ra进行PCR扩增，获得片段1，引物序列如下：
上游引物
clrB-Fa:
5’-AACAGCTACCCCGCTTGAGCAGACATCACCATGTTCCACACCTTTGAAGG-3’
下游引物
clrB-Ra:
5’-CCAATGGGATCCCGTAATCAATTGCCCGTAGCACCAGCGAAACATAC-3’。
(2)草酸青霉ClrB过表达盒启动子区gpdA(p)的克隆
ClrB过表达盒启动子采用来源于构巢曲霉3‘-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因（gpdA）的启动子序列。gpdA启动子序列的扩增以质粒PAN7-1为模板，设计引物PgpdA-F1和PgpdA-F2进行PCR扩增，获得片段2，引物序列如下：
上游引物PgpdA-F1:5’-AGTCAGACGGCGTAACCAAA-3’
下游引物PgpdA-F2:5’-GTAAGGATTTCGGCACGG-3’。
(3)ClrB过表达盒筛选标记ptra序列的扩增
筛选标记表达盒的构建以质粒PME2892为模板，设计引物PtraF1和PtraR1，PCR扩增制得片段3，引物序列如下：
上游引物PtraF1:5’-GGGCAATTGATTACGGGATC-3’
下游引物PtraR1:5’-ATGGGGTGACGATGAGCCGC-3’。
(4)ClrB过表达盒gpdA(p)::clrB::ptra的扩增
将上述(1)、(2)和(3)步骤中PCR扩增出的片段1、片段2和片段3以摩尔比2∶1∶1混合并作为融合PCR反应的模板（50ul融合PCR反应体系中，模板总添加量不超过500ng），获得融合PCR产物4。融合PCR条件为：94℃，90s，12个循环（94℃，30s，58℃，10min，72℃3min），72℃10min，然后将上述PCR产物4稀释20倍后作为模板，设计引物PgpdA-F2和PtraR1进行PCR扩增，获得ClrB过表达盒片段，引物序列如下：
上游引物：PgpdA-F2:5’-GTAAGGATTTCGGCACGG-3’
下游引物：PtraR1:5’-ATGGGGTGACGATGAGCCGC-3’
将上述获得ClrB过表达盒片段与克隆载体PMD18-T（TakaraCode6011）经T/A连接，获得携带有ClrB过表达盒的载体PTClrB。
(5)质粒PTClrB转化草酸青霉菌株
(I)草酸青霉菌株（菌种保藏号：CGMCCNo.5302）原生质体的制备
①取新鲜生孢的草酸青霉平板或斜面，用无菌的生理盐水(0.9%NaCl,0.05%Tween)，将分生孢子洗下，制备草酸青霉分生孢子悬液。
②在Vogel’s基本培养基（2%葡萄糖为碳源）平板上盖一层玻璃纸，并用玻璃棒铺平，在玻璃纸上加入50-100μl孢子悬液，涂布均匀。做8-10个同样处理，30℃培养约12-15h。
③加0.1g裂解酶（LysingEnzymesfromTrichodermaharzianum，Sigma产品编号L1412）到20ml溶液1中（1.2Msorbitol，0.1MKH2PO4，pH5.6），轻轻摇均，并用0.2μm滤器过滤除菌到培养皿或试管中。
④吸取2-3ml裂解酶溶液到无菌培养皿中，在溶液表面覆盖一层长有草酸青霉菌体的玻璃纸，然后再加2-3ml裂解酶液，按此顺序依次叠放6-7层，在两层玻璃纸之间不能留存大的气泡。放置培养皿于30℃培养箱中，为使酶液在培养皿中分布均匀，酶解期间可轻轻晃动培养皿1-2次。
⑤酶解约90min后，用镊子挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，大的菌丝团块可用移液枪（枪尖剪掉）缓慢吹打。
⑥准备带有玻璃棉的漏斗，并滴加数滴溶液1到玻璃棉使其紧贴漏斗内壁。用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到50ml离心管中，并置于冰上，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，过滤液的总体积不超过35ml。利用水平转子2000rpm，4℃离心10min后，小心弃掉上清液，并用4ml冰冷的溶液2（1Msorbitol18.22g；50mmol/LCaCl2；10mM/LTrisHCl，pH7.5）重悬原生质体，然后离心4℃，2000rpm，离心10min，小心弃掉上清液，并用0.5-1.0ml冰冷的溶液2重悬原生质体，置原生质体悬液于冰上。
⑦原生质体的质量控制（显微镜观察）：a、在载玻片上滴加3μl原生质体悬液，在盖玻片旁滴加3μl无菌水，原生质体细胞内因渗透压高于细胞外水的渗透压吸水胀裂，而分生孢子则不受影响；b、通过血球计数板小室计算原生质体数量（几个小格即可）。原生质体终浓度应大于108，如果原生质体数量太高，可用溶液2稀释到5×108。z=n×(400/f)×105，n=原生质体计数数量，f=计数的小格数量。
(II)草酸青霉原生质体的转化
①在200μl草酸青霉原生质体悬液中加入不超过10μl的质粒PTClrB和50μlPEG溶液（25%PEG6000，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTrisHCl，pH7.5），混匀转化体系，并在冰上放置20min。转化用DNA片段应纯化，DNA浓度应不少于1μg/μl。
②加2mlPEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，然后加入4ml溶液2，轻轻混匀。
③吸取0.2-1ml转化体系混合液到4ml预保温（55℃）的上层转化培养基中，轻轻混匀，并立即倒入铺有下层转化培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养，其中转化培养基的上、下层均加有终浓度300ng/ml的硫胺吡啶作为筛选转化子的抗性试剂。
④在转化培养基上培养3-4天后，用接种针挑取转化子到分单孢培养基，分单孢培养基中加入终浓度300ng/ml的硫胺吡啶作为转化子的筛选试剂，30℃培养2-3天，长出分生孢子，用无菌的生理盐水将分生孢子洗下，制成孢子悬液，并将其在含有Triton-X100的分单孢培养基平板上划线培养，以消除转化子异核体的影响，获得ClrB过表达的重组草酸青霉，命名为草酸青霉RE-ClrB（gpdA(p)::clrB::ptra）。
实施例2、草酸青霉CreA编码基因的敲除
(1)草酸青霉⊿creA::bar敲除盒上游同源臂片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物CreA-F2和CreAbar-R进行PCR扩增CreA编码基因敲除盒上游同源臂片段1，引物序列如下：
上游引物CreA-F1:5’-CATTCCAGAGATGAACGACC-3’
下游引物
CreAbar-R:5’-GAAGGCCTGTAAGCGAATTAGCAAGCGTCGATGTGGGAACACCGGATAT-3’。
(2)草酸青霉⊿creA::bar敲除盒下游同源臂片段的克隆
以上述一般性说明中的方法提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物CreAbar-F和CreA-R2进行PCR扩增CreA编码基因敲除盒下游同源臂片段2，引物序列如下：
上游引物CreAbar-F:
5’-GCAGGGCAAGAGAGGGCAGCAAGCCAGTGCACTCTCACGACTCATTGCTC-3’
下游引物CreA-R1:5’-CCAGAGGATGGAACAAACAC-3’。
(3)⊿creA::bar敲除盒遗传转化筛选标记表达盒bar序列的扩增
以质粒pUC-bar为模板，设计引物Bar-F和Bar-R进行PCR扩增，获得筛选标记表达盒片段3，引物序列如下：
上游引物Bar-F:5’-GACGCTTGCTAATTCGCTTAC-3’
下游引物Bar-R:5’-GCACTGGCTTGCTGCCCTC-3’。
(4)creA敲除盒序列的扩增
将实施例2中上述(1)、(2)和(3)步骤PCR扩增出的片段1、片段2和片段3以摩尔比1∶1∶2混合并作为融合PCR反应的模板（50ul融合PCR反应体系中，模板总添加量不超过500ng），获得融合PCR产物4，将PCR产物4稀释20倍后作为模板，设计引物CreA-F2和CreA-R2进行特异性扩增，获得⊿creA::bar敲除盒片段，引物序列如下：
上游引物：CreA-F2:5’-CGAACGGTCACCTCATCAAA-3’
下游引物：CreA-R2:5’-AAGGACGGATTCCCCGAGAT-3’。
(5)草酸青霉重组菌株RE-ClrB原生质体的制备
creA的敲除以实施例1中构建的重组草酸青霉菌株RE-ClrB为出发菌株，该菌株原生质体的制备方法根据实施例1中草酸青霉出发菌株(CGMCCNo.5302)原生质体的制备方法执行。
(6)⊿creA::bar敲除盒片段的原生质体转化
①在200μl草酸青霉ClrB过表达菌株RE-ClrB原生质体悬液中加入不超过10μl的⊿creA::bar敲除盒和50μlPEG溶液（25%PEG6000，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTrisHCl，pH7.5），混匀转化体系，并在冰上放置20min。转化用DNA片段应纯化，DNA浓度应不少于1μg/μl。
②加2mlPEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，然后加入4ml溶液2，轻轻混匀。
③吸取0.2-1ml转化体系混合液到4ml预保温（55℃）的上层选择培养基中，轻轻混匀，并立即倒入铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养，其中转化的上、下层培养基中均加入终浓度1.6mg/ml的草胺磷作为筛选试剂。
④在转化培养基上培养3-4d后，用接种针挑取转化子到分单孢培养基，分单孢培养基中加入终浓度1.6mg/ml的草胺磷作为转化子的筛选试剂，30℃培养2-3天，长出分生孢子，用无菌的生理盐水将分生孢子洗下，制成孢子悬液，并将其在含有Triton-X100的分单孢培养基平板上划线培养，以消除转化子异核体的影响，获得ClrB过表达同时敲除CreA基因的重组草酸青霉，命名为草酸青霉RE-CCreA（ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra）。
实施例3、草酸青霉β-葡萄糖苷酶Bgl2编码基因的敲除
(1)草酸青霉⊿bgl2::hph敲除盒上游同源臂片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物bgl2-F2和bgl2Hph-R进行PCR扩增Bgl2编码基因敲除盒上游同源臂片段1，引物序列如下：
上游引物Bgl2-F1:5’-GGCGGATACCCACTATGACC-3’
下游引物Bgl2hph-R:
5’-GCTCCTTCAATATCAGTTAACGTCGTGGGTGTTGGTGGCAGAGTG-3’。
(2)草酸青霉Bgl2敲除盒下游同源臂片段的克隆
以提取到的草酸青霉基因组DNA为模板，设计特异引物bgl2Hph-F和bgl2-R2，PCR扩增Bgl2编码基因敲除盒下游同源臂片段2，引物序列如下：
上游引物Bgl2hph-F:
5’-GAAAATTCCGTCACCAGCCCTGGGTTGTCTCCTGCTTTCTTGTTCGC-3’
下游引物Bgl2-R1:5’-CGATTACGTTTCTGCTCCAC-3’。
(3)草酸青霉Bgl2敲除盒遗传转化筛选标记表达盒序列的扩增
以质粒PSlient-1为模板，设计引物Hphs-F和Hphs-R进行PCR扩增，获得筛选标记hph表达盒片段3，引物序列如下：
上游引物Hphs-F:5’-CGACGTTAACTGATATTGAA-3’
下游引物Hphs-R:5’-CAACCCAGGGCTGGTGACGG-3’。
(4)草酸青霉Bgl2敲除盒序列的扩增
将实施例3中上述(1)、(2)和(3)步骤PCR扩增出的片段1、片段2和片段3以摩尔比1∶1∶2混合并作为融合PCR反应的模板（50ul融合PCR反应体系中，模板总添加量不超过500ng），获得融合PCR产物4，将PCR产物4稀释20倍后作为模板，设计引物bgl2-F2和bgl2-R2进行特异性扩增，获得⊿bgl2::hph敲除盒片段，引物序列如下：
上游引物：Bgl2-F2:5’-GCTTGGCACGGGCTTGATTG-3’
下游引物：Bgl2-R2:5’-GAGTAGACGGTGGCCGAGGA-3’。
(5)草酸青霉重组菌株RE-CCreA原生质体的制备
bgl2的敲除以实施例2中构建的重组草酸青霉菌株RE-CCreA为出发菌株，该菌株原生质体的制备方法根据实施例1中草酸青霉出发菌株(CGMCCNo.5302)原生质体的制备方法执行。
(6)⊿bgl2::hph敲除盒片段的原生质体转化
①在200μl重组草酸青霉菌株RE-CCreA原生质体悬液中加入不超过10μl的⊿bgl2::hph敲除盒片段和50μlPEG溶液（25%PEG6000，50mmol/LCaCl2，10mmol/LTrisHCl，pH7.5），混匀转化体系，并在冰上放置20min。转化用⊿bgl2::hph敲除盒片段应纯化，DNA浓度应不少于1μg/μl。
②加2mlPEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，然后加入4ml溶液2，轻轻混匀。
③吸取0.2-1ml转化体系混合液到4ml预保温（55℃）的上层转化培养基中，轻轻混匀，并立即倒入铺有下层转化培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养，其中转化培养基的上、下层均加有终浓度200ug/ml的潮霉素B作为筛选转化子的抗性试剂。
④在转化培养基上培养3-4天后，用接种针挑取转化子到分单孢培养基，分单孢培养基中加入终浓度200ug/ml的潮霉素B作为转化子的筛选试剂，30℃培养2-3天，长出分生孢子，用无菌的生理盐水将分生孢子洗下，制成孢子悬液，并将其在含有Triton-X100的分单孢培养基平板上划线培养，以消除转化子异核体的影响，获得ClrB过表达同时敲除CreA和Bgl2基因的重组草酸青霉即为提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名为草酸青霉RE-10，其基因型为Δbgl2::hph-ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra。
上述草酸青霉RE-10菌株已于2014年3月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.8922。
实施例4纤维素酶和半纤维素酶液的制备及酶活性测定
(1)纤维素酶和半纤维素酶液的制备纤维素酶
将草酸青霉出发菌株CGMCCNo.5302以及草酸青霉重组菌株RE-10（CGMCCNo.8922），接种于基本培养基（50ml），碳源为2%葡萄糖，200rpm，30℃培养24h，分别制备出发菌株CGMCCNo.5302以及草酸青霉重组菌株RE-10种子培养液，然后各量取10ml的种子培养液分别转接到装有100ml2%微晶纤维素为碳源（或3%微晶纤维素+3%麸皮为碳源）培养基的三角瓶中，200rpm，30℃培养，分别在转接培养后时间点24h、48h、72h、96h、120h、144h和168h时取菌体培养液样品，然后将所获取的每个时间点的样品10000rpm离心5min，吸取样品上清液，然后分别检测培养上清液中的滤纸酶活、外切葡聚糖酶活、内切葡聚糖酶活和木聚糖酶活。
(2)纤维素酶和半纤维素酶液的制备及酶活性测定
滤纸酶活测定：称取50mgWaterman定量滤纸片（Whatman产品编号CatNo1001125），加入1ml醋酸缓冲液(pH=4.8)和0.5ml稀释5-30倍的粗酶液，混匀。50℃水浴60min，加入2mlDNS终止反应，煮沸5min，静置冷却后，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，在光吸收波长540nm测OD值。
内切葡聚糖酶活测定：取0.5ml稀释10-30倍的粗酶液，加入1ml1%CMC-Na溶液，混匀，50℃水浴30min，加入2mlDNS，终止反应，煮沸5min，静置冷却后，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，在光吸收波长540nm测OD值。
外切葡聚糖酶活测定：取0.5ml稀释10-30倍的粗酶液，加入50μlpNPC（1mg/ml），50℃保温30min；加入150μl10%NaCO3终止反应，405nm测定对硝基酚生成量计算酶活力。
木聚糖酶酶活测定：在1ml用0.2MpH4.8的HAC-NaAC缓冲液配制的1%的燕麦木聚糖悬浮液中，添加0.5ml稀释50-700倍的酶液，50℃反应30min，加入2mlDNS，终止反应，煮沸5min，静置冷却后，加蒸馏水定容到25ml，摇匀，在光吸收波长540nm测OD值，DNS法测定酶解液中的还原糖量（以木糖计）。
β-葡萄糖苷酶活测定：取0.5ml稀释10倍的粗酶液，加入50μlpNPG（10mM），50℃保温30min；加入150μl10%NaCO3终止反应，405nm测定对硝基酚生成量计算酶活力。
草酸青霉出发菌株（CGMCCNo.5302）菌株与本发明构建重组菌株RE-10(Δbgl2-ΔcreA-gpdA(p)::clrB)在产酶培养基(3%的微晶纤维素+3%的麸皮为碳源)条件下培养120h时发酵液中纤维素酶及半纤维素酶活如表1。
酶活力单位：一分钟内水解底物产生1μmol还原糖或对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活单位。
表1产酶发酵培养基(3%的微晶纤维素+3%的麸皮为碳源)条件下野生菌株（CGMCCNo.5302）与本发明构建重组菌株RE-10培养120h时上清液中纤维素酶和半纤维素酶活
本发明应用生物工程技术获得并公开了草酸青霉（Penicilliumoxalicum）RE-10（Δbgl2::hph-ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra）工程菌株（CGMCCNo.8922），在产酶培养基条件下滤纸酶活相比出发菌株（CGMCCNo.5302）提高52倍，并且纤维素酶和半纤维素酶的生产周期明显缩短（缩短24～36h），可以应用于纤维素酶和半纤维素酶中的大规模生产，具有良好的工业开发和应用前景。
Claims (1)
1.一种提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株的构建方法，其中所述草酸青霉菌株命名为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)RE-10，该菌株已于2014年3月17日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其保藏号为CGMCCNo.8922；该菌株的构建方法是：
(1)ClrB过表达载体的构建及转化：以草酸青霉CGMCCNo.5302基因组为模板，克隆clrB基因的编码区与终止子区，然后以质粒pAN7-1为模板，扩增来源于构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的3’-磷酸甘油醛脱氢酶编码基因(gpdA)的启动子序列gpdA(p)，将所获得的gpdA(p)启动子区与ClrB基因的编码区和终止子区，利用Double-jointPCR方法融合成clrB组成型过表达盒重组片段，然后将此重组片段与克隆载体pMD18-T经T/A连接，从而获得携带有ClrB过表达盒的载体pTClrB，将ClrB过表达盒的载体pTClrB转入到草酸青霉菌株CGMCCNo.5302获得转化子ClrB的过表达菌株，命名为草酸青霉RE-ClrB，其基因型为gpdA(p)::clrB::ptra；
(2)CreA基因的敲除：通过同源重组双交换的方法在获得的草酸青霉RE-ClrB中敲除CreA基因；得到缺失creA基因的重组草酸青霉，命名为草酸青霉RE-CCreA，其基因型为ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra；
(3)Bgl2基因的敲除：通过同源重组双交换的方法在获得的草酸青霉RE-CCreA中进一步敲除Bgl2基因，得到缺失bgl2基因的草酸青霉重组菌株即为提高纤维素酶和半纤维素酶酶活性的草酸青霉菌株，命名为草酸青霉(Penicilliumoxalicum)RE-10，其基因型为Δbgl2::hph-ΔcreA::bar-gpdA(p)::clrB::ptra。
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