CN103436542A

CN103436542A - 纤维素酶和半纤维素酶激活因子及其表达基因与应用

Info

Publication number: CN103436542A
Application number: CN2013103842844A
Authority: CN
Inventors: 方诩; 王方忠; 梁亚; 王明钰
Original assignee: Shandong University
Current assignee: Shandong University
Priority date: 2013-08-29
Filing date: 2013-08-29
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-08-29
Also published as: CN103436542B

Abstract

本发明涉及纤维素酶和半纤维素酶激活因子及其表达基因与应用。一种纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；纤维素酶和半纤维素酶激活因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2。本发明还提供了上述纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因在提高纤维素酶和半纤维素酶酶活中的应用。本发明将CreA的结合结构域与XlnR的激活结构域相结合，获得了一个新的纤维素酶和半纤维素酶的转录因子表达基因，将该表达基因导入丝状真菌中，能够提高纤维素酶和半纤维素酶的酶活。

Description

纤维素酶和半纤维素酶激活因子及其表达基因与应用

技术领域

本发明涉及纤维素酶和半纤维素酶激活因子及其表达基因与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

纤维素酶和半纤维素酶已经广泛地应用于食品，纺织，木质纤维素生物转化等方面。提高纤维素酶和半纤维素酶活对于降低工业生产成本有十分重要的意义。

制备纤维素酶和半纤维素酶往往利用丝状真菌进行生产，而改造丝状真菌工业菌株提高纤维素酶和半纤维素酶酶活的方法有诱变育种技术，原生质体融合技术，基因重排技术等。在本发明中，在细胞体外人工构建出一种自然界不存在的新型基因片段，将其导入丝状真菌工业菌株中，能有效提高纤维素酶和半纤维素酶酶活。

真菌当中存在许多转录因子。它们通过结合各个酶基因的启动子区的特定序列，抑制或激活基因的表达。丝状真菌中主要的转录抑制因子有CreA，主要的转录激活因子有XlnR等。

CreA是含有两个带有Cys2His2的锌指结构域的蛋白，其结合的靶位点为SYGGRG，在丝状真菌分泌的纤维素酶基因的启动子区含有许多的结合位点。在葡萄糖存在的条件下，能够抑制主要的纤维素酶基因的表达。

XlnR是对纤维素酶基因和半纤维素素酶基因都有激活作用的转录因子。在N-端含有一个Zn双核簇的DNA结合结构域，C-端含有一个D-葡萄糖抑制结合域，一个激活结合域和一个与核定位有关的结构域。在黑曲霉中，XlnR控制20-30个半纤维素酶和纤维素酶基因的表达。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种纤维素酶和半纤维素酶激活因子及其表达基因与应用。

本发明技术方案如下：

一种纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

一种纤维素酶和半纤维素酶激活因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

上述纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因在提高纤维素酶和半纤维素酶酶活中的应用。

根据本发明优选的，上述应用的步骤为：将纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因导入丝状真菌中，即可。

根据本发明进一步优选的，所述的丝状真菌为草酸青霉（Penicillium oxalicum）。更优的，所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）的菌种保藏号为CGMCC NO.5302。

有益效果

本发明将CreA的结合结构域与XlnR的激活结构域相结合，获得了一个新的纤维素酶和半纤维素酶的转录因子表达基因，将该表达基因导入丝状真菌中，能够提高纤维素酶和半纤维素酶的酶活。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

微生物来源

实施例中的草酸青霉（Penicillium oxalicum）CGMCC5302来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），菌种保藏编号5302。

培养基

麸皮培养基组分如下，均为重量百分比：10wt%麸皮浸出液，2wt%琼脂，余量水。

基本培养基组分如下，每升组分如下：

葡萄糖20g，（NH₄）SO₄5g，KH₂PO₄15g，MgSO₄0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O0.0014g，CoCl₂0.002g，胰蛋白胨10g，pH5.5。

下层培养基组分如下,每升组分如下：

葡糖糖20g,KH₂PO₄15g,Sorbitol182.1g,琼脂糖10g,0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。

上层培养基组分如下,每升组分如下：

葡萄糖20g，（NH₄）SO₄5g，KH₂PO₄15g，MgSO₄0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O0.0014g，CoCl₂0.002g，胰蛋白胨10g，Sorbitol182.1g，0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。

选择培养基组分如下,每升组分如下：

葡萄糖20g，（NH₄）SO₄5g，KH₂PO₄15g，MgSO₄0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O0.0014g，CoCl₂0.002g，胰蛋白胨10g，0.2μg/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。

生理盐水组分如下，均为重量百分比：0.9wt%NaCl，0.5wt%吐温80。

抽提缓冲液组分如下：200mM Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，2％十二烷基硫酸钠，pH8.5。

pME2892质粒采用如下论文中记载的方法制备：

Takafumi KUBODERA,Nobuo YAMASHITA,Akira NISHIMURA.2000.

Pyrithiamine resistance gene(ptrA)of Aspergillus oryzae:cloning,characterization andapplication as a dominant selectable marker for transformation.Bioscience,Biotechnology,andBiochemistry.Vol.64(2000)No.7P1416-1421)

实施例1

真菌纤维素酶酶活调控基因敲除盒的获得：

（1）将草酸青霉CGMCC5302在麸皮培养基上培养三天，然后用生理盐水将孢子洗脱下来，按照1×10⁸比例接入基本培养基中，200rpm，30℃生长两天，4000rpm离心，收集菌体，收集于1.5ml离心管中；

（2）向离心管中加入500μl抽提缓冲液和0.1g石英砂，漩涡剧烈振荡1min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃，放置20min；加入500μl苯酚/氯仿（混合比例1：1），漩涡剧烈振荡30s，12000rpm室温离心10min，收集上清；

将上清液转至另一无菌的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的3M NaAc溶液（pH4.8）和0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min；12000rpm，4℃，10min，弃上清，加浓度为0.1μg/μl RNAase的ddH₂O200μl，37℃，静置1h；加入200μl苯酚/氯仿（混合比例1：1）抽提一次，12000rpm，10min；上清转移至另一1.5ml离心管中，加0.1倍体积3M NaAc（pH4.8）和0.6倍体积异丙醇，-20℃放置20min，12000rpm，4℃，10min，收集沉淀；加700μl70％乙醇（V/V），洗涤一次（12000rpm，2min）；待乙醇挥发完全，用50μl ddH₂O溶解基因组DNA，制得基因组DNA；

（3）以(2)中制得基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物creA1：GAGTCCACAAAAAAGGGCAAGCACGTACTCTATGGGCACGCACTC，

下游引物creA2：GATGTACCCGACCCTCCCGAGCCGTTGGCCGCGTTGACCATG；

PCR条件为：95℃2min；95℃20s，65℃20s，72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段1。

（4）以(2)中制得基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物XA1：GCACGAGAACGCAAAAAGCGTGGGAAG，和

下游引物XA3：TTGTGCATAAACGTCCAGCTGGCGGGT,

PCR条件为：95℃2min；95℃20s，62℃20s，72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段2。

（5）将片段1和片段2以等摩尔比混合，进行PCR扩增，

采用的PCR条件为：95℃2min；95℃20s，58℃10min，72℃3min，12个循环；72℃，10min，4℃保存。

（6）将（5）中的片段稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物XA5：CGGTGGTTGAGGCTGTTCGAGATGGAC；

下游引物XA6：GTCGCAAGATGGACGTAGGTGGCG

进行PCR扩增，PCR条件为：95℃2min；95℃20s，62℃20s,72℃3min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段5。

（7）以(2)中制得基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物creA terminator1：

TCTTGCGACGAGCCATGGAGCGTAAACTTGTGCATTTTCATCCCCCTC，和

下游引物creA terminator2：

CATGACACAGAACAGGCTCAACATGTACATGCCCGGGTAAATCAGC；

PCR条件为：95℃2min；95℃20s，65℃20s,72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段3。

（8）以pME2892质粒作为模板，利用引物进行PCR扩增硫胺嘧啶基因，引物序列如下：

上游引物ptrA1：ATAGGGTGGAGGTTTGCATGGTCCGgggcaattgattacgggatc，和

下游引物ptrA2：CGAAATCCCGCCTCGCCAAGAGGCCAACCCCCA，

PCR条件为：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段4。

（9）将片段3和片段4以等摩尔比混合，进行PCR扩增，引物序列如下：

PCR条件为：95℃2min；95℃20s，58℃10min，72℃3min，12个循环；72℃，10min，4℃保存。

（10）将（7）中的片段稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物XA7：CGCCACCTACGTCCATCTTGCGAC

下游引物XA8：CTCTCCGAACATGGACACTCACTGAACTG

进行PCR扩增，PCR条件为：95℃2min；95℃20s，62℃20s,72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段6。

(11)将片段5和片段6以等摩尔比混合，进行PCR扩增，引物序列如下：

(12)将（9）中的片段稀释10倍，利用引物进行PCR扩增，引物序列如下：

上游引物XA9：TCGATGGTTCCTGAGCCGGGTCCAAT

下游引物XA10：CGGACCATGCAAACCTCCACCCTATCG

PCR条件为：95℃2min；95℃20s，62℃20s，72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段7，该片段7为转录因子表达基因，序列如SEQ ID NO.1所示，即得纯化pE。

转化草酸青霉菌株

（1）将草酸青霉菌株CGMCC5302在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μl孢子悬液，涂布均匀，30℃培养约25h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。

（2）加0.1g裂解酶（购自sigma公司，商品名称sigma#L-1412）到20ml溶液1（1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄）中，轻轻摇均；吸取2～3ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加2～3ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30℃培养箱中。酶解约90min后，用镊子（无菌）挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4℃离心10min，去除上清液并用4ml溶液2（1M山梨醇，50mmol/LCaCl₂，10mmol/L TrisHCl）重悬原生质体，2000rpm，4℃离心10min，去除上清液，用0.5～1.0ml溶液2（4℃）重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。

（3）将转化体系（200μl原生质体悬液，10μl纯化pE，50μl聚乙二醇分子量(5000-7000)）在冰上放置20min，后加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取0.2～1ml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在下铺有下层培养基的平板上，等培养基凝固后，置30℃培养。在筛选培养基上培养3～4d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢。

（4）传两代后（培养3天），将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证后，获得变异菌株WFX。

实施例2

纤维素酶和半纤维素酶的制备和测定：

取草酸青霉（Penicillium oxalicum）CGMCC5302和变异菌株WFX，接种于下述种子培养基中，在32℃的条件下培养1天，然后按10%的体积比转接于下述产酶培养基中，在28℃、180rpm的条件下发酵培养6天，制得微生物培养液。将培养液12000r/min离心15min，吸取上清液为粗酶液。

上述的种子培养基组分如下，均为重量百分比：

葡萄糖1%，蛋白胨1%，麸皮1%，硝酸钠0.1%，硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.04%，尿素0.15%，余量水。

上述的产酶培养基组分如下，均为重量百分比：

玉米芯粉3%，蛋白胨1%，麸皮3%，微晶纤维素0.4%，硝酸钠0.1%，硫酸铵0.1%，磷酸二氢钾0.1%，硫酸镁0.04%，尿素0.15%，吐温80 0.2%，余量水。

粗酶液中的纤维素酶和半纤维素酶的酶活测定方法如下：

滤纸酶活：1×6cm定量滤纸条，1mL醋酸缓冲液(pH=4.8)和0.5mL稀释后的粗酶液，50℃酶解1h。木聚糖酶活：1mL1%的燕麦木聚糖悬浮液，0.5mL稀释后的酶液，50℃酶解30min。内切葡聚糖酶活：1mL1%的CMC-Na溶液，0.5mL稀释后的酶液，50℃酶解30min。以上三种酶活测定中，均以DNS法测定酶解液中的还原糖量。外切葡聚糖酶活：0.5mL稀释后的粗酶液，加入50μL pNPC(1mg/mL)，50℃保温30min；加入150μL10%NaCO3终止反应。酶活力单位：一分钟内水解底物产生1μmol还原糖或对硝基苯酚所需的酶量定义为1个酶活力单位(IU)。

草酸青霉CGMCC5302和变异菌株WFX酶液中的纤维素酶和半纤维素酶的酶活如表1所示：

表1

Claims

1.一种纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种纤维素酶和半纤维素酶激活因子，氨基酸序列如SEQ ID NO.2。

3.权利要求1所述纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因在提高纤维素酶和半纤维素酶酶活中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，应用的步骤为：将纤维素酶和半纤维素酶激活因子的表达基因导入丝状真菌中，即可。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的丝状真菌为草酸青霉（Penicilliumoxalicum）。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述草酸青霉（Penicillium oxalicum）的菌种保藏号为CGMCC NO.5302。