CN103224921B - 一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用。将里氏木霉中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段敲除后，插入尿苷筛选标记，然后经固态发酵后，制得高活性真菌纤维素酶系。本发明通过敲除盒取代该真菌纤维素酶酶活调控基因后，在固态发酵下，相比原初发菌株，外切葡聚糖甘酶比活力提高2.5倍，β-葡萄糖苷酶比活力提高3倍，调整了真菌胞外纤维素酶酶系，可以适用于不同领域的需求。

Description

一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用

技术领域

本发明涉及一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用，特别涉及一种在固态发酵培养下真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

固态发酵是微生物在没有或基本没有游离水的固态基质上的发酵方式，固态基质中气、液、固三相并存，即多孔性的固态基质中含有水和水不溶性物质。与其他培养方式相比，固态发酵具有很多优点，因此，固态培养已经成为一种普适性的培养方法，在白酒、陈醋和产酶的生产工艺上应用较为成熟。

真菌分泌的纤维素酶主要有外切葡聚糖苷酶，内切葡聚糖苷酶和β-葡萄糖苷酶，其中外切酶占大多数。自然界中植物光合作用产物的绝大部分是作为植物细胞壁组分的木质纤维素类物质，大约占生物质资源总量的80%以上，此外，每年农林废弃物和工业纤维性废渣也有上亿吨，而木质纤维素中纤维素主要以结晶状态存在,外切葡聚糖酶是唯一对结晶纤维素起作用的纤维素酶,在木质纤维素降解成还原糖的过程中,外切葡聚糖酶起着非常关键的作用。因此要更加充分利用自然界中广泛存在的纤维素资源，外切葡聚糖酶是不可缺少的。β-葡萄糖苷酶在其它方面也有重要作用，比如芳香植物中有许多以糖苷键合态形式存在的风味前体物质，通过β-葡萄糖苷酶的水解可以释放出其中潜在的芳香成分,从而可以增加植物芳香物，这对于天然香精香料工业有着重要意义(陈军杰（2005）。β-葡萄糖苷酶的液态发酵生产及其应用。江南大学)。在纤维素降解上，真菌分泌的纤维素酶液中β-葡萄糖苷酶酶活较低，通常导致纤维二糖的积累，致使其反馈抑制纤维二糖水解酶和内切酶的酶活，因此，若酶液中β-葡萄糖苷酶酶活提高，会降解纤维二糖解除这种抑制作用，从而促进纤维素的降解。（张裕卿，梁江华，李滨县（2007），β-葡萄糖苷酶促进纤维素降解的应用，天津大学学报第40卷第3期317-320）。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，在固态条件下提供一种真菌纤维素酶酶系组成/特性调控基因的应用。

本发明技术方案如下：

一种核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的真菌纤维素酶酶活调控基因在制备高活性真菌纤维素酶系中的应用。

上述应用，将里氏木霉中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段敲除后，插入尿苷筛选标记，然后经固态发酵后，制得高活性真菌纤维素酶系。

上述应用，具体步骤如下：

将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示基因片段转化入里氏木霉（Trichodermareesei）中，转化的同时敲除了里氏木霉中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，制得转基因里氏木霉，然后在固体培养基中，28～32℃培养4～6天，用pH4.8、浓度为0.05mol/L柠檬酸缓冲液浸泡菌体2～3h，经离心分离，取上清，制得高活性真菌纤维素酶系。

根据本发明优选的，所述固体培养基组分如下，每十五克组分如下：

麸皮2g，（NH₄）SO₄0.5g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄0.06g，CaCl₂0.06g，微晶纤维素2g，余量水。

根据本发明优选的，所述里氏木霉（Trichodermareesei）为里氏木霉（Trichodermareesei）QM9414△Ku70菌株，菌种保藏编号：26921，购自美国菌种保藏中心（ATCC）。

根据本发明优选的，所述的离心，条件为12000rpm离心10min。

有益效果

本发明所述的真菌纤维素酶酶活调控基因可用于调控真菌中纤维素酶酶系，通过敲除盒取代该真菌纤维素酶酶活调控基因后，相比原初发菌株，在固态条件下培养，外切葡聚糖甘酶酶活和β-葡聚糖甘酶比酶活分别提高2.5倍和3倍，相较现有采用复配提高酶活的方法，更加方便，从而可以满足各行业对不同纤维素酶酶活的需求。

附图说明

图1是实施例1制得的敲除盒的电泳图。

其中：1、实施例1中里氏木霉（Trichodermareesei）QM9414△Ku70当中构建的敲除盒，2、2kb PlusⅡMarker；

图2是实施例3得到的转化子验证示意图。

图3是实施例3得到的转化子PCR验证图。

其中：M：2kb Plus Marker，1：利用yzF和yzR验证出发株QM9414△Ku70，2：利用yzF和yzR验证转化子，3：利用mapk1和yzin R验证出发株QM9414△Ku70，4：利用mapk1和yzin R验证转化子；

图4是实施例3得到的转化子Southern blotting验证图。

其中：M：2kb Plus Marker，1：转化子条带，2：出发株QM9414△Ku70；

图5是实施例4转化子与出发株固态发酵胞外酶液中β-葡萄糖苷酶比活力图。

其中：T.reesei△tmk3表示转化株β-葡萄糖苷酶比活力，T.reesei表示出发株β-葡萄糖苷酶比活力；

图6是实施例4转化子与出发株固态发酵胞外酶液中外切酶比活力图。

其中：T.reesei△tmk3表示转化株外切酶比活力图，T.reesei表示出发株外切酶比活力图；

具体实施方式

下面结合说明书附图及实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。

培养基

麸皮培养基组分如下，均为重量百分比：10wt%麸皮浸出液，2wt%琼脂，余量水。

基本培养基组分如下，每升组分如下：

葡萄糖20g，（NH₄）SO₄5g，KH₂PO₄15g，MgSO₄0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O0.0014g，CoCl₂0.002g，胰蛋白胨10g，pH5.5。

下层培养基组分如下，每升组分如下：

葡糖糖20g,KH₂PO₄15g,Sorbitol182.1g,琼脂糖10g,1μg/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。

上层培养基组分如下，每升组分如下：

葡萄糖20g，（NH₄）SO₄5g，KH₂PO₄15g，MgSO₄0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O0.0014g，CoCl₂0.002g，胰蛋白胨10g，Sorbitol182.1g，1μg/ml的抗硫胺素，1.5%琼脂糖。

选择培养基组分如下，每升组分如下：

葡萄糖20g，（NH₄）SO₄5g，KH₂PO₄15g，MgSO₄0.6g，CaCl₂0.6g，FeSO₄·7H₂O0.005g，MnSO₄·H₂O0.0016g，ZnSO₄·7H₂O0.0014g，CoCl₂0.002g，胰蛋白胨10g，1.5%琼脂糖。

所述固体培养基组分如下，每十五克组分如下：

麸皮2g，（NH₄）SO₄0.5g，KH₂PO₄1.5g，MgSO₄0.06g，CaCl₂0.06g，微晶纤维素2g，余量水。

生理盐水组分如下，均为重量百分比：0.9wt%NaCl，0.5wt%吐温80。

抽提缓冲液组分如下，组分如下：200mM Tris-HCl，250mmol/L NaCl，25mmol/L EDTA，2%十二烷基硫酸钠，pH8.5。

菌株

里氏木霉（Trichodermareesei）QM9414△Ku70菌株，菌种保藏编号：26921，购自美国菌种保藏中心（ATCC）。

实施例1

真菌纤维素酶酶活调控基因敲除盒的获得：

（1）将里氏木霉（Trichodermareesei）QM9414△Ku70菌株在麸皮培养基上培养三天，然后用生理盐水将孢子洗脱下来，按照1×10⁸比例接入基本培养基中，200rpm，30℃生长两天，4000rpm离心，收集菌体，收集于1.5ml离心管中；

（2）向离心管中加入500μl抽提缓冲液和0.1g石英砂，漩涡剧烈振荡1min，使菌体分散于抽提缓冲液中，65℃，放置20min；加入500μl苯酚/氯仿（体积比1：1），漩涡剧烈振荡30s，12000rpm室温离心10min，收集上清；

将上清液转至另一无菌的1.5ml离心管中，加入0.1倍体积的3M NaAc溶液（pH4.8）和0.6倍体积异丙醇，颠倒混匀，-20℃放置15min；12000rpm，4℃，10min，弃上清，加浓度为0.1μg/μl RNAase的ddH₂O200μl，37℃，静置1h；加入200μl苯酚/氯仿（体积比1：1）抽提一次，12000rpm，10min；上清转移至另一1.5ml离心管中，加0.1倍体积3M NaAc（pH4.8）和0.6倍体积异丙醇，-20℃放置20min，12000rpm，4℃，10min，收集沉淀；加700μl70％乙醇（V/V），洗涤一次（12000rpm，2min）；待乙醇挥发完全，用50μl ddH₂O溶解里氏木霉基因组DNA，制得里氏木霉基因组DNA；

（3）以里氏木霉基因组DNA为模板，利用引物：

上游引物mapk1：GGCCGAGCTCAGACATAGGAGG和

下游引物mapk2：GATTGTACCCCAGCTGCGGGAGACGGGAAGTGAGGGG，

进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min；94℃30S，60℃30s,72℃1.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段1。

（4）以里氏木霉基因组DNA为模板，利用引物：

上游引物mapk3：CGCAGCTGGGGTACAATC，和

下游引物mapk4：CGTCTCCCTCATTACCCTC，

进行PCR扩增，PCR条件为：94℃5min；94℃30S，65℃30s,72℃2min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段2。

（5）以里氏木霉基因组DNA为模板，利用引物：

上游引物mapk5：GAGGGTAGTAATGAGGGAGACGGCCGTCGATTCTCCCTGGTC，和

下游引物mapk6：GGGGTTGTGGCTCTGGAGAG，

PCR扩增，PCR条件为：94℃5min；94℃30s，59℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存，制得片段3。

（6）将上述PCR扩增的三个片段用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，其中片段1、片段3大约在1400bp，片段2大约在2000bp。利用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收三个片段；

将片段1、片段2、片段3按照1：3：1的摩尔比例混合，制得混合液。

采用的PCR条件为：94℃5min；94℃30s，58℃10min，72℃3min，12个循环；72℃，10min，4℃保存。

（7）取出1μl混合液，稀释10倍做为模板，利用引物：

上游引物mapk7：CCCTGTTCTCTGCCCGCTATCG，和

下游引物mapk8：CGTGTTCGTGCTGCCGTACG，

PCR扩增条件：94℃5min；94℃30smin，58℃45s，72℃5min，30个循环；72℃,10min，制得敲除盒，序列如SEQ ID NO.3所示，命名为MAPK，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测条带大小，约4600bp，如图1所示。

实施例2

转化里氏木霉QM9414△Ku70菌株

（1）将里氏木霉QM9414△Ku70菌株在麸皮培养基上培养三天，利用生理盐水，洗脱下孢子，在麸皮麸皮培养基上盖一玻璃纸，并在其上面加入100μl孢子悬液，涂布均匀，30℃培养约15h，制得带有萌发孢子的玻璃纸。

（2）加0.1g裂解酶（购自sigma公司，商品名称sigma#L-1412）到20ml溶液1（1.2M山梨醇，0.1M KH₂PO₄）中，轻轻摇均；吸取2～3ml酶液到无菌培养皿中，加一层带有萌发孢子的玻璃纸，再加2～3ml酶液，依次叠放10层。放置培养皿于30℃培养箱中。酶解90min后，用镊子（无菌）挑取玻璃纸，用移液枪吸取溶液冲掉玻璃纸上残留的菌丝体，用玻璃棉漏斗过滤原生质体悬液到置于冰上的50ml离心管中，然后用数毫升溶液1冲洗玻璃棉，然后2000rpm，4℃离心10min，去除上清液并用4ml溶液2（1M山梨醇，50mmol/L CaCl₂，10mmol/L TrisHCl）重悬原生质体，2000rpm，4℃离心10min，去除上清液，用0.5～1.0ml溶液2（4℃）重悬原生质体，放置原生质体在冰上，制得原生质体悬液。

（3）将转化体系（200μl原生质体悬液，10μl敲除盒，50μl聚乙二醇）在冰上放置20min，后加2ml PEG(室温)，轻轻混匀，20℃放置5min，加入4ml溶液2，混匀；吸取0.2～1ml到4ml预保温的上层培养基中，轻轻混匀，倒在铺有下层培养基的平板上，凝固后，置于30℃培养，待长出转化子，挑取转化子，在筛选培养基上培养3～4d后，用接种针挑取转化子到选择培养基，培养生孢，制得孢子。

（4）将孢子转入基本培养基中，提取染色体进行验证。

实施例3

转化株的验证

（1）设计引物验证转化株

利用引物：

上游引物mapk1：GGCCGAGCTCAGACATAGGAGG，和

下游引物yzinR：TCATCGACTGGGCGCACATTG，

进行PCR扩增(分别以QM9414△Ku70和转化子基因组为模板)，PCR条件为：94℃5min；94℃30S，59℃45s，72℃2.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存。

用1wt%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳，结果发现转化子有一条2400bp的条带，而QM9414△Ku70未有此条带，如图2所示。

利用引物：

上游引物yz F:TATCGCCCCATCACAACCCC，和

下游引物yz R:CCGAAGCTACAGAGGAGCTG，

进行PCR扩增(分别以QM9414△Ku70和转化子基因组为模板)，采用PCR条件为：94℃5min；94℃30s，60℃45s，72℃2.5min，30cycle；72℃，10min，4℃保存。

用1wt%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳，结果发现转化子有一条2500bp的条带，而QM9414△Ku70扩增出一条3500bp的条带，如图2所示。

（2）southern验证转化子

1、以提取的里氏木霉QM9414基因组DNA为模版，利用引物

上游引物SB F：CAGCCCAGCACCAAAAGG，和

下游引物SB R：AGTCCCTGCTCGCCTCTT，

采用PCR条件为：94℃5min；94℃30S，59℃30s，72℃0.5min，30个循环；72℃，10min，4℃保存。

用1%的琼脂糖凝胶电泳检测电泳结果，结果发现有一条500bp条带，制得探针模板；

2、取16μl的探针模板（10ng～3ug），沸水浴中煮沸10min，迅速插入冰中，制得变性模板；将DIG-High Prime（购自Roche公司）充分混匀，取4μl加入上述变性模板中，混匀后离心，37℃，孵育20h，65℃水浴10min，终止反应。用HindIII内切酶（购自Fermentas公司）酶切基因组DNA，酶切反应体系为：

60μl10×酶切缓冲液，3U内切酶/μg DNA，30μg基因组DNA，无菌ddH₂O补足至600μl；

37℃酶切过夜，65℃加热，10min终止酶切反应。

（3）将酶切后的基因组DNA用氯仿/异戊醇（混合比例1:1）抽提一次，无水乙醇-20℃沉淀过夜，70%乙醇洗涤2次，三蒸水重溶，体积控制在20μl左右；

0.8wt%琼脂糖凝胶电泳分离，缓冲液为1×TBE，电泳电压40v，按照需要待指示剂溴酚蓝迁移至合适位置时停止电泳；然后将凝胶经变性液（0.5M NaoH,1.5M Nacl）处理20min，重复一次，再用去离子水漂洗两次，将凝胶浸泡于中和液(0.5M Tris-HCl(pH7.5),3M NaCl)中和20min，并重复一次。将DNA从胶中转移到尼龙膜上，转移时间14小时，然后用2*SSC漂洗膜，121烘干半小时。

（4）将烘干后的尼龙膜放入杂交杯中，加入杂交液3mL到杂交杯中，68℃预杂交2h。预杂交结束后，弃预杂交液，加入含探针杂交液。杂交温度45度，杂交过夜。50mL洗涤液Ⅰ（5ml20×SSC，44.5mL水，0.5ml10%十二烷基硫酸钠。）洗膜5min×2次，然后用50mL洗涤液Ⅱ（1.25ml20×SSC，47.25ml水+0.5ml10%SDS。）洗膜于杂交炉中，68℃洗15min×2次，然后加入马来酸缓冲液10ml，室温洗涤5分钟。加入20ml的1×封堵液（18ml马来酸缓冲液，2ml10×封堵缓冲液），室温放置30min。加入稀释10000倍的抗体20ml（1.6ml10×抗体溶液，14.4ml马来酸缓冲液，1.6ul抗体）室温放置30min。加入80ml洗液（80ml马来酸缓冲液+240ul Tween20）室温放置15min，重复一次。加入16ml检测液室温放置5min。加入10ml底物显色液（10ml检测液+200ul BCIP），黑暗放置3小时。然后膜于无菌水中冲洗，晾干后扫描，见图4。

实施例4

转化子及出发菌株在固态培养发酵液中，蛋白浓度，滤纸酶活，内切酶酶活，ATP，β-葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活测定：

将实施例2制得的转化子、出发菌株，在麸皮培养基上培养3天后，用生理盐水洗脱下孢子，按照1×10⁷的孢子量接入固态产酶培养基，在30℃下静置培养，从第三天起测酶活。

固态培养下酶液的获取方法：将带有菌体的固态培养基在20ml柠檬酸缓冲液（0.05mol/L，pH4.8）中室温浸泡2h，然后经12000rpm离心10min，取上清液，即可。

利用Lowery测定蛋白浓度，以pNPG和pNPC为底物测定β-葡萄糖苷酶酶活，外切酶酶活。选用DNS法测定内切酶酶活，以whatman滤纸为底物测定滤纸酶活。将β-葡萄糖苷酶和外切酶换算成酶的比活力，结果见图5,6。

分析

本发明将SEQ ID NO.3中核苷酸序列转化入里氏木霉中，取代了含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因片段，经PCR和Southernblotting验证正确，利用固态发酵，敲除株相对出发株，β-葡萄糖苷酶比活力提高3倍，外切葡聚糖甘酶比活力提高2.5倍，内切葡聚糖甘酶酶活大约降低20%。

Claims (2)

1.一种核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的真菌纤维素酶酶活调控基因在制备高活性真菌纤维素酶系中的应用，将里氏木霉中的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段敲除后，插入尿苷筛选标记，然后经固态发酵后，制得高活性真菌纤维素酶系；具体步骤如下：

将核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示基因片段转化入里氏木霉中，转化的同时敲除了里氏木霉中核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，制得转基因里氏木霉，然后在固体培养基中，28～32℃培养4～6天，用pH4.8、浓度为0.05 mol/L柠檬酸缓冲液浸泡菌体2～3h，经离心分离，取上清，制得高活性真菌纤维素酶系；

所述里氏木霉为里氏木霉QM9414△Ku70菌株，菌种保藏编号：26921，购自美国菌种保藏中心。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述固体培养基组分如下，每十五克组分如下：

麸皮2g，（NH₄）₂SO₄ 0.5g，KH₂PO₄ 1.5g，MgSO₄ 0.06g，CaCl₂ 0.06g，微晶纤维素 2g，余量水。

3. 如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的离心，条件为12000rpm离心10min。