CN104450758B - 耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法，其序列如SEQ ID NO.1，在1140个碱基中，具有270个点突变，本发明在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。

Description

耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法。

背景技术

现今木聚糖酶的应用领域不断扩大，已成功应用于食品、医药、造纸等工业中。在造纸工业中有制浆这一工艺，在这步工艺中需要去除木质素达到漂白的目地，传统去除的方法就是加强酸强碱，这对环境产生很大的污染。而用木聚糖酶进行辅助漂白，不仅可以提高纸浆的白度，还可减少后续化学漂白剂的添加量，这样明显的降低漂白废水中有机污染物氯代的产生；本研究发明涉及的耐热碱性木聚糖酶在纸浆造纸行业有很好的运用前景。

在食品行业中，木聚糖酶不仅可以作为面包改良剂，可改善面团的稳定性和对过度发酵的耐受性，聚糖酶还能够降解果汁和啤酒中的多糖，因而有利于饮料的澄清，木聚糖酶可降解多糖来生产低聚木糖，低聚木糖是一种具有低热量和低糖度易吸收特性的重要的食品添加剂。木聚糖酶在其它方面也具有很大的潜在价值，例如在果蔬制品的生产中，木聚糖酶不仅能提高果蔬的汁浸出率及压榨能力，也可以降低了生产成本；在饲料中添加木聚糖酶可消除或降低低阿拉伯木聚糖抗营养作用；在制药工业中，木聚糖酶可用来制作缓释药物的原料。

鉴于木聚糖酶具有重要的实际应用价值，人们希望能够将木聚糖酶投入实际应用，现阶段必须克服的问题是怎样降低它的生产成本提高它的产量。为解决这个问题，人们尝试通过诱变野生菌选育高产菌、利用基因工程手段构建重组工程菌、培养条件的优化等等一些列手段来提高木聚糖酶的产量。

在高产菌选育方面，人们一般通过过紫外(UV)，亚硝基胍(NTG)来诱变处理野生菌以期得到产木聚糖酶最高的最佳突变菌株，该方法经济且快速。为了寻找适合工业应用的木聚糖酶，人们从嗜极性生物中寻找能产木聚糖酶的微生物，目前在嗜碱性微生物中发现了一些微生物可产生木聚糖酶，但大多数是细菌；在嗜热性微生物中发现细菌，真菌和放线菌中都能产生木聚糖酶，这些酶在极端温度和pH下仍然有很高的活性，因此更具有广阔的应用前景；在基因克隆方面，目前已发现的木聚糖酶基因有xynA,xynB,xynC,xynZ等，最初是将它们克隆转到宿主大肠杆菌中，发现这些基因在大肠杆菌中虽然能够表达但表达的蛋白不能分泌到胞外，必须破碎细胞才能检测到蛋白。人们将嗜热细菌的木聚糖酶基因克隆到毕氏酵母分泌表达载体中，转化入宿主毕赤酵母中，将有活性的木聚糖酶分泌到胞外来，便于后期分离纯化。

在选择巴氏毕赤酵母为外源基因表达系统时，必须要考虑的问题就是该用什么样的方法实现外源目的蛋白在该系统的高效表达，从一些报道可总结出大致从以下方面来进行改进：1)首先从基因水平对其改造。外源基因必须重组到巴氏毕赤酵母的染色体上才能在甲醇的诱导下表达出来，因此它自身的结构性质在很大程度上影响其在系统中的高效表达。一般来说外源基因AT与GC的含量都要适宜，AT太高会直接导致提前终止基因的翻译表达，有报道称AT含量在30％-55％之间最有利于外源基因在毕赤酵母中的高效表达；如果外源基因的GC含量过高则容易造成翻译能障过高，翻译过程很难进行下去，不利于外源基因在毕赤酵母中的高效表达。另外在构建外源基因时要充分考虑到巴氏毕赤酵母密码子的偏爱。所谓密码子偏爱性就是某物种高表达的基因会使用特定的同义密码子，这些密码子则是该物种的优越密码子。研究发现毕赤酵母的优越密码子大约有25个，因此为了增加外源蛋白的表达量，在构建外源基因的时候要尽量用到这25个密码子且尽量避免用稀有密码子。2)适当增加目的基因拷贝数。研究表明适当增加拷贝数可以提高外源基因表达量。但是,过多的外源基因的拷贝数也可能导致重组DNA不稳定造成外源目的蛋白表达量的降低。外源基因拷贝数与对G418或zeocin的抗性成正比，因此可利用不同浓度的G418或zeocin来鉴别拷贝数的多少。3)外源基因整合到酵母染色体上的方式。在将重组载体整合到酵母染色体之前，一般会选着不同的酶切位点把重组载体线性化，选择不同的酶将有不同的整合方式，挑选最有利于外源基因表达的整合方式。4)优化培养条件。一种微生物能否正常代谢生长产酶，需要合适的外界培养条件。不同的培养条件对于巴氏毕赤酵母表达系统高效表达外源蛋白有着举足轻重的影响例如温度、pH、溶氧等，这些培养条件一方面作用于菌体的生长状况，另一方面也影响着外源蛋白的活性，最有利于菌体生长的条件并不意味这是最有利于产酶的条件，在探究最优条件时要综合考虑这两方面。例如毕赤酵母的最佳生长温度是30℃，但有研究表明15℃的诱导温度可以显著提高外源蛋白的表达；毕赤酵母的最佳生长pH是3-7，假如培养基的pH不在这个范围，菌体的生长量没多大变化但是对产生的蛋白质有很大影响。另外，培养基中的碳氮比以及诱导剂的添加量也对蛋白的表达起到至关重要的作用，在优化培养条件时要充分考虑这两点。

发明内容

为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供耐热碱性木聚糖酶基因xylGT优化序列及其高效表达方法，使用DNAworks软件以及mRNA的稳定性分析软件RNAStructure 4.3，将来源于Geobacillus thermoleovorans的xylGT基因(GenBank登录号：JN680872)，按照毕赤酵母的密码子偏爱性,对出发菌株的木聚糖酶基因进行优化改良，将优化后的xylGT基因序列进行优化而来。在其引物5’端添加了EcoRI限制性酶切位点，引物3’端引入了NotI限制性酶切位点,经PCR扩增，连接转化，测序验证，得到碱性木聚糖酶xylGT的优化基因序列。将优化后的木聚糖酶基因克隆到毕赤酵母GS115的表达载体pPIC9K上，得到重组表达载体pPIC9K-xylGT，再将重组表达载体电转化到宿主毕赤酵母中，通过在不含组氨酸的基础培养基(MD)以及菌落PCR初步筛选出阳性克隆，结合G418抗性和含木聚糖的平板上水解圈大小筛选高拷贝菌株，并从中成功地筛选了一株高产木聚糖酶的重组菌P.pastoris GS115/xyl。在此基础上，采用单因子实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡实验、响应面设计相结合的方法，对重组菌株产xylanase在摇瓶水平上的发酵条件进行优化，找到最优发酵条件以期提高xylanase的表达量，降低xylanase的生产成本。在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。

为达到上述目的，本发明的技术方案为：

一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列，其序列如SEQ ID NO.1

一种耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列的高效表达方法，包括如下步骤：

步骤一、根据毕赤酵母密码子偏爱将原始基因进行优化，PCR扩增合成全长木聚糖酶基因xylGT；

步骤二、将优化的木聚糖酶基因xylGT与表达载体pPIC9K分别用酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，经连接得到重组质粒pPIC9K-xylGT；

步骤三、将经SalⅠ酶切线性化后的pPIC9K-xylGT重组质粒电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中，在基本培养基(MD)平板上初步筛选到阳性菌落，通过PCR进一步鉴定筛选得到重组工程菌GS115/xyl；根据G418抗性筛选出高拷贝的阳性转化子，再将高拷贝的阳性转化子转移到含有0.05％木聚糖的缓冲甲醇培养基(BMMY)平板上,挑选产水解圈大的阳性转化子作为高产木聚糖酶的出发菌开展研究；

步骤四、对筛选到的产酶高的重组菌产的木聚糖酶进行了酶学性质的研究。该木聚糖酶最适反应pH为8.8，最适反应温度为78℃；为了研究该木聚糖酶的温度稳定性和pH稳定性将酶放在在高温或者强碱条件下一个小时后测定残留酶活性率较低，说明木聚糖酶在强碱或者高温下不稳定；

步骤五、在摇瓶培养基础上采用单因子实验确定了初始最优发酵产酶条件为：pH＝6.9、大豆蛋白胨为1.5％、酵母浸膏为1.5％、甲醇为1％、硫酸镁为0.1％、硫酸钙0.05％、硫酸铵为0.45％、28℃培养5天；利用Plackett-Burman设计筛选出影响产酶的三个显著因素：甲醇、酵母浸膏、硫酸钙；用最陡爬坡路径逼近最大响应区域后，再结合Box-Behnken设计和响应面分析法对筛选到的显著因素进行优化，得出显著因素的最优条件为：甲醇12ml/L，酵母浸膏15g/L，硫酸钙1.049g/L。

相对于现有技术，本发明的有益效果为：

本发明提高xylanase的表达量，降低xylanase的生产成本。在最优条件下，木聚糖酶活达到82.24U/ml，比优化前菌株发酵产量提高了1.25倍。并在发酵罐上对产酶条件进行了试验，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，比改良前酶活提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。

附图说明

图1是本发明根据密码子偏好优化后的序列与原始序列的比较图；在1140个碱基中，显示270个点突变的位置。

图2为本发明RNA二级结果分析energy＝-338.3。

图3为木糖标准曲线。

图4为木聚糖酶酶活性与pH关系图。

图5为木聚糖酶酶活性与温度关系图。

图6为优化前后菌株在发酵培养基中的生长曲线。

图7为6天取15μL电泳检测每天木聚糖酶的表达情况。

图8为不同时间段木聚糖酶的活性性。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施方式对本发明技术方案做进一步详细描述：

试验例：

一 利用overlap PCR合成全基因

根据毕赤酵母密码子偏爱性以及通过RNA structure 4.3软件预测mRNA的稳定性来设计优化的木聚糖酶基因，在此基础上设计32条引物，通过overlap PCR合成全长木聚糖酶基因：

(1)在50μL PCR反应体系中对全长木聚糖酶基因序列的5’上游部分序列进行克隆

其中：

P1

5’-GAATCTGCTGACTCCTACGCTAACAAGCCATCCATTTCTGCTTTGCACGCTCC-3’

P2

5’-CCGATAGTGAAGGAGTTCTTGTATCTCTGGTCCAATTGTGGAGCGTGCAAAGCAGA-3’

P3

5’-ACAAGAACTCCTTCACTATCGGTGCTGCTGTTGAGCCATACCAGTTGTTGAATCAA-3’

P4

5’-AGTTGAAGTGTCTCTTCAACATCTGAGCGTCCTTTTGATTCAACAACTGGTATGGC-3’

P5

5’-GATGTTGAAGAGACACTTCAACTCCATCGTTGCTGAGAACGTTATGAAGCCAATCA-3’

P6

5’-TCGAAGTTGAACTTTCCCTCTTCTGGCTGGATGTTGATTGGCTTCATAACGTTCT-3’C

P7

5’-AGAGGGAAAGTTCAACTTCGAGCAAGCTGACAAGATCGTTCAGTTCGCTAAGAAAA-3’

P8

5’-AAACCAAAGTGTGGAATCTGATGTCCATACCGTTTTTCTTAGCGAACTGAACGATC-3’

P9

5’-CATCAGATTCCACACTTTGGTTTGGCACTCCCAAGTTCCAGAGTGGTTCTTCTTGG-3’

P10

5’-GTCAGTCTCGTTAACCATTGGTCTACCCTCTTTGTCCAAGAAGAACCACTCTGGAA-3’

P11

5’-ACCAATGGTTAACGAGACTGACCCAGTTAAGAGAGGTCAGAACAAGCAGTTGTTGT-3’

P12

5’-AACGATAGTCTTGATGTGAGTCTCTGGTCTTTTCAACAACAACTGCTTGTTCTGAC-3’

P13

5’-AGACTCACATCAAGACTATCGTTGAAAGATACAAAAACGACATCGAGTACTGGGAC-3’

P14

5’-CAACTTTCCGTCGTCACCAACAACCTCGTTAACAACGTCCCAGTACTCGATGTCGT-3’

P15

5’-TGGTGACGACGGAAAGTTGAGAAACTCCCCATGGTATCAGATCGCTGGTGTTGACT-3’

P16

5’-CCGTACTTTCTAGCAGTCTGGAAAGCAACCTTGATGTAGTCAACACCAGCGATCTG-3’；

PCR反应条件为：95℃5min；95℃1min，62℃1min，72℃1min，此程序需15个循环；95℃1min，58℃1min，72℃1min，此程序需15个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，取3-5μL反应产物，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分析。按照凝胶回收的方法回收PCR产物标记为片段①，其序列如SEQ ID NO.2

(2)在50μL PCR反应体系中对全长木聚糖酶基因序列的3’下游部分序列进行克隆

其中：

P17

5’-CCAGACTGCTAGAAAGTACGGTGGTAACAAGATCAAGTTGTACATCAACGACTACA-3’

P18

5’-ACAAAGCGGATCTCTTTGGCTCAACCTCAGTGTTGTAGTCGTTGATGTACAACTTG-3’

P19

5’-GCCAAAGAGATCCGCTTTGTACAATTTGGTTAAGCAGTTGAAAGAAGAGGGAGTTC-3’

P20

5’-TGAATGTGGGATTGGTGACCAATACCGTCGATTGGAACTCCCTCTTCTTTCAACTG-3’

P21

5’-GGTCACCAATCCCACATTCAGATTGGTTGGCCATCTGAGGCTGAGATCGAAAAGAC-3’

P22

5’-GGTTGTCCAAACCCAAAGCAGCGAACATGTTGATAGTCTTTTCGATCTCAGCCTCA-3’

P23

5’-GCTTTGGGTTTGGACAACCAGATCACTGAATTGGACGTTTCCATGTACGGTTGGCC-3’

P24

5’-CTTAGGGATAGCATCGTAAGTTGGGTAAGCTCTTGGTGGCCAACCGTACATGGAAA-3’

P25

5’-CAACTTACGATGCTATCCCTAAGCAGAAGTTCTTGGACCAGGCTGCTAGATACGAC-3’

P26

5’-TCTTGTCGGACAACTTCTCGTACAACTTAAACAATCTGTCGTATCTAGCAGCCTGG-3’

P27

5’-CGAGAAGTTGTCCGACAAGATCTCCAACGTTACTTTCTGGGGTATCGCTGACAACC-3’

P28

5’-GTCGTAGTAAACGTCAGCTCTAGAATCCAACCAAGTGTGGTTGTCAGCGATACCCC-3’

P29

5’-AGAGCTGACGTTTACTACGACGCTAACGGTAACGTTGTTGTTGACCCAAACGCTCC-3’

P30

5’-AGCATCCTTTCCCTTACCCTTTTCAACCTTAGCGTATGGAGCGTTTGGGTCAACAA-3’

P31

5’-AGGGTAAGGGAAAGGATGCTCCATTCGTTTTCGGTCCAGACTACAAGGTTAAGCCT-3’

P32

5’-TTACTACTTGTGGTCGATGATAGCCCAGTAAGCAGGCTTAACCTTGTAGTCTGG-3’

PCR反应条件为：95℃5min；95℃1min，62℃1min，72℃1min，此程序需15个循环；95℃1min，58℃1min，72℃1min，此程序需15个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，取3-5μL的反应产物，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分析。按照凝胶回收的方法回收PCR产物标记为片段②，其序列如SEQ ID NO.3

(3)将木聚糖酶基因的5’上游部分片段①和3’下游部分片段②分别稀释10倍后作为模板来扩增全长木聚糖酶基因：

PCR反应条件为：95℃5min；95℃1min，64℃1min，72℃1min，此程序需15个循环；95℃1min，59℃1min，72℃1min，此程序需15个循环；72℃10min。

反应结束后，取3-5μL反应产物与一定量的10×Loading Buffer混合后，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分析。按照凝胶回收的方法回收PCR产物标记为片段xyl。

(4)为了让木聚糖基因克隆到表达载体pPIC9K上，重新设计引物M1，M2，在引物两端添加酶切位点EcoRⅠ和NotⅠ，以xyl为模板扩增

其中，

M1：5’-AGAATTCGAATCTGCTGACTCCTAC-3’

M2:5’-TGCGGCCGCTTACTACTTGTGGTCGAT-3’；

PCR反应条件为：95℃5min；95℃1min，65℃1min，72℃1min，此程序需30个循环；72℃10min。

反应结束后，取3-5μL反应产物与一定量的10×Loading Buffer混合后，经0.7％琼脂糖凝胶电泳分析。按照凝胶回收的方法回收PCR产物标记为最终全长。

(5)将全长木聚糖酶基因与pGEM-T连接，4℃连接过夜，连接体系如下：

(6)将最终全长与pGEM-T的连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后均匀的涂布到含有氨苄青霉素LB平板上，放到37℃恒温培养箱中过夜培养。

(7)从该平板中随机挑取几个单菌落，分别接种到装有3-4ml含有氨苄青霉素的LB液体培养基的试管中，将试管放到设定条件为37℃，200r/min的摇床中培养，12h取出试管，离心一定量的菌液获得合适量的菌体，按质粒提取试剂盒方法来提取大肠杆菌中转化的质粒。将抽得的质粒用EcoRⅠ酶切鉴定木聚糖基因是否与pGEM-T成功连接，37℃酶切1.5h,酶切体系如下：

将鉴定为木聚糖基因与pGEM-T成功连接的重组质粒命名为pTGMT-xylGT，重组菌命名为DH 5α/pTGMT-xylGT

2 产木聚糖酶工程菌的构建

(1)木聚糖酶基因与表达载体pPIC9K连接:

1)将大肠杆菌DH 5α/pGEMT-xylGT在有氨苄青霉素的3ml LB培养基中培养过夜，提取质粒pTGMT-xylGT，用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，37℃水浴酶切3h，凝胶回收xylanase目的片段

2)将大肠杆菌DH 5α/pPIC9K在含有氨苄青霉素3ml的LB培养基中培养过夜，提取大肠杆菌中的质粒pPIC9K

3)将pPIC9K质粒用EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，37℃水浴酶切3h，酶切采用20μL反应体系平行切三管：

3)酶切反应结束后，将反应液进行0.7％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段。

4)将回收的木聚糖酶基因和pPIC9K质粒片段用T4 DNAligase进行连接，4℃反应过夜，连接采用10μL反应体系

5)吸取一定量的过夜连接的产物，加到感受态的大肠杆菌DH 5α中，用无菌的枪头轻轻搅匀，然后均匀的涂布到含有氨苄青霉素的LB固体平板上，37℃培养过夜，获得转化子。

6)随机挑取平板上的3个单菌落，且分别接种到有氨苄青霉素3ml LB液体培养基中，在37℃，180r/min的摇床中培养过夜，待培养基浑浊后抽质粒，抽提到的质粒电泳检测后用EcoR Ⅰ和Not Ⅰ进行双酶切，电泳检测。得到的重组质粒名为pPIC9K-xyl，重组菌命名为DH 5α/pPIC9K-xyl。

(2)电转化与阳性克隆的筛选:

1)从大肠杆DH 5α/pPIC9K-xyl中提取质粒pPIC9K-xyl。

2)将pPIC9K-xyl质粒用Sal Ⅰ进行酶切线性化，37℃水浴2h，酶切采用20μL反应体系,酶切5管。

(3)酶切反应结束后，用酚-氯仿的方法回收纯化酶切产物，步骤如下：

1)将所有的酶切反应液转至新的无菌的1.5ml离心管中，在向其中加入一定的灭菌三蒸水使总体积达到200μL

2)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(苯酚：氯仿：异戊醇＝25：24：1)，先单独加入一定体积的苯酚充分混匀，12000rpm离心10min，吸取上层溶液至新的1.5ml离心管中，弃去苯酚，再加入氯仿和异戊醇的混合物，混匀两相，12000rpm离心10min，小心收集上层水相，弃去两相界面和有机相

3)同时加入3mol/L醋酸钠和纯乙醇，醋酸钠加的量是收集到的水相体积的1/10的，纯乙醇加的量是水相体积的2.5倍，将混合液充分混合均匀，在4℃沉淀1个小时也可沉淀过夜

4)4℃，12000rpm离心10min，吸上清至另一无菌的1.5ml离心管中。

5)加入800μL70％的乙醇冲洗DNA的沉淀物，轻弹管底让沉淀物漂浮起来，然后4℃，12000rpm离心10min，小心吸取上清至新的1.5ml无菌离心管中。

6)将步骤(5)再重复一次

7)打开收集到DNA的离心管的盖子，在室温下让管中的乙醇慢慢的挥发完全

8)待离心管底成透明状表示已经晾干，此时往离心管中加入10μL灭菌三蒸水溶解DNA沉淀，可以立即使用或储存于-20℃中待用。

(4)制备毕赤酵母GS115感受态的细胞:

1)在YPD平板上活化酵母GS115，约30h左右

2)挑取平板上的毕氏酵母GS115单菌落接种于装有3mLYPD液体培养基的试管中，28℃，200r/min培养16h

3)取40μL过夜培养的酵母菌液接种于装有50mLYPD培养基的250mL三角瓶中，28℃，200r/min过夜培养至OD600为1.3～1.5

4)将250mL三角瓶放在冰上5分钟，50ml的离心管也先冰置5分钟，在4℃,3000rpm离心5min，收集酵母细胞，在冰上用50ml预冷的灭菌水悬浮细胞

5)4℃,3000rpm离心5min，收集酵母细胞，在冰上用25ml预冷的灭菌水悬浮细胞

6)4℃,6000rpm离心5min，收集酵母细胞，在冰上用5ml1mol/L的预冷的山梨醇(sorbitol)悬浮细胞

7)4℃,6000rpm离心5min，收集酵母细胞，在冰上用1ml 1mol/L的预冷的sorbitol悬浮细胞，用移液器轻轻将菌体完全吹散，然后每80μL一管分装。

8)酵母感受态细胞最好现做现用，放在-80℃储存效率也会大大降低

(5)毕氏酵母的电转化:

1)电转前在无菌操作台上将浸泡在酒精中的电转杯倒扣在无菌的滤纸上，将酒精挥发完全

2)取5μL要转化的质粒与80μL的毕氏酵母感受态细胞轻轻混匀，转移至预冷的0.2cm电转杯中，冰浴5min

3)设置电转仪电压为1.5kV，电击时间大约为45ms

4)电击完毕后，将电转杯快速放到冰上，在无菌台中立即向电转杯中加入1mL冰冷的1mol/L sorbitol，用移液器轻轻吹打，将细胞充分悬浮后，用移液器将溶液转移至1.5mL离心管中

5)3000rpm室温离心3分钟，弃去一部分上清留下大约80μL的上清即可，充分悬浮细胞，将其直接均匀的涂布在MD平板上，在28℃恒温培养箱中培养，3天后MD平板上会出现单菌落

(6)阳性克隆的筛选

1)随机挑取上述平板上长出的单菌落转移到画有方格的新的MD平板上28℃恒温培养箱中培养2天

2)以新鲜的单菌落为模板，用5’-AOX1和3’-AOX1为引物进行PCR鉴定筛选阳性克隆，采用20μL PCR反应体系:

5’-AOX1：GACTGGTTCCAATTGACAAGC

3’-AOX1:GCAAATGGCATTCTGACATCC

PCR反应条件为：94℃5min；94℃1min，55℃1min，72℃2min，需35个循环；72℃10min。反应结束后，取3-5μL反应产物与一定量的10×Loading Buffer混合后，用0.7％琼脂糖凝胶电泳分析是否转化成功。

3)将鉴定含有目的基因的所有转化子点到含有不同浓度的G418的MD平板上，可筛选到目的基因拷贝数多的重组毕赤酵母工程菌株。

4)再将筛选到的目的基因拷贝数多的重组毕赤酵母工程菌株接种到含有0.05％木聚糖的BMMY平板上，倒置的平板中放一张灭过菌的滤纸，每天在滤纸上均匀的加50μL的甲醇进行诱导表达。每天观察水解圈产生情况，最后挑选出水解圈大且产生水解圈的时间比其他菌株都要早的的重组工程菌株保存起来，进行后续发酵实验。

3 木聚糖酶活测定方法

取1.00mL经过适当稀释的酶液加入到刻度试管中，将试管放在78℃水浴锅中平衡后，加入2.5mLDNS试剂摇匀。然后加入1.0mL木聚糖溶液(10.0mg/ml)，78℃水浴30min，在沸水浴加热5min。将刻度管放在自来水中让其缓慢冷却至室温，再加入一定量的蒸馏水定容至12.5mL，用移液器将溶液充分摇匀。在540nm处以标准空白样调零，测定吸光度AB。

取1.00mL经过适当稀释的酶液加入到刻度试管中，将试管放在78℃水浴锅中平衡后。然后加入1.0mL木聚糖溶液(10.0mg/ml)，78℃水浴30min，每隔5分钟要摇动试管让酶与底物反应完全。反应结束后在加入2.5mLDNS试剂摇匀，使酶解反应停止。沸水加热5min，刻度管放在自来水中让其缓慢冷却至室温，再加入一定量的蒸馏水定容至12.5mL，用移液器将溶液充分摇匀。立即在540nm处以标准空白样调零，测定吸光度AE。AE值必须应在0.2～0.4之间，如果偏离0.2～0.4区间，需要重新调整酶液稀释倍数，再次进行反应。

4 木聚糖酶活力的计算公式

X—待测样品木聚糖酶的活力，单位U/mL；

AE—木聚糖酶反应液的吸光度；

AB—酶空白液的吸光度；

K—木糖标准曲线的斜率；

CO—木糖标准曲线的截距；

M—木糖的摩尔质量，M＝150.2g/mol；

m—样品量g或mL；

t—木聚糖酶的反应时间，单位是min；

1000—转化因子，1mmol＝1000(mol；

Df—酶的总稀释倍数。

5 木聚糖酶耐碱实验方法

分别取1.00mL经过pH为9.4、10.0、10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，于78℃恒温水浴锅水浴1小时，然后按照木聚糖酶活力测定的方法测酶活。

6 木聚糖酶耐温实验方法

取1.00mL经过pH为9.4的甘氨酸-氢氧化钠的缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，分别于80℃、85℃、90℃水浴锅水浴1h，然后按照木聚糖酶活力测定方法测酶活。

7 测定酶活残留率的计算公式

其中，X——酶活残留率(％)；

E——残余酶活力；

E0——原酶活力。

8 木聚糖酶最适反应pH

分别取1.00mL经过pH为7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液以及pH为8.8、9.4、10.0、10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，在78℃下进行酶解反应，然后按照木聚糖酶活力测定方法测各个pH下的酶活，确定最适反应pH。

9 木聚糖酶最适反应温度

取1.00mL经过最适pH缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，分别于70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃反应，然后按照木聚糖酶活力测定方法测各个温度下的酶活，找到最适反应温度。

10 酵母发酵产木聚糖酶

(1)酵母培养

从YPD固体平板上挑取活化的重组工程菌株的单菌落接入装有3mLBMGY的试管中，28℃，180r/min培养18-20h，取50μl菌液接种到装有25ml BMGY的250ml三角锥形瓶中培养18-20h，在600nm波长下测菌体的吸光值在2-6之间。

(2)甲醇诱导表达木聚糖酶

将细胞生长培养基BMGY换成甲醇作为唯一碳源的BMMY诱导培养基。将在细胞生长培养基BMGY中培养的细胞，取一定体积的培养液室温3000rpm，离心5min，去尽上清后，加入5ml的无菌水洗一遍彻底去除BMGY，将收集到的菌体转入装有50ml BMMY诱导培养基的500ml的锥形瓶中，此时诱导培养基中菌液在600nm处的吸光度值应为1。在28℃180r/min的摇床中诱导培养，每天加甲醇，诱导5天，取上清测酶活。

(3)菌体生物量测定

在波长600nm，测光吸收值(OD600)，以空白培养基做空白调零，在比色皿中先加入3ml的空白培养基，向空白培养基中加入一定量的菌液将菌液稀释，测稀释后的菌液吸光度，再根据稀释倍数计算出实际菌体生物量。

(4)检测木聚糖酶表达量

取诱导发酵培养基的菌液1mL，于4℃，8000rpm离心5min，小心吸取上清，将上清液与一定量的5×Loding Buffer混合均匀，煮沸5分钟，按照SDS-PAGE的方法检测上清中蛋白的表达情况。

(5)木聚糖酶活性的检测

取1ml诱导培养的菌液于4℃，12000rpm离心5min，取上清，根据木聚糖酶活测定方法测其酶活。

11 响应面设计优化发酵条件

(1)单因素优化实验设计

单因素实验就是固定其余所有因素只改变其中一项，从而来考察该因素对于实验结果又怎样的影响，为接下来的Plackett-Burman实验设计奠定基础。

(2)Plackett-Burman实验设计

Plackett-Burman实验设计就是一种考察因素两水平的试验设计方法，它可以用最少试验估计各因素对实验影响的效应，从而能快速的从众多考察的因素中筛选出最为重要的几个影响因素，将这几个主要的影响因素进一步考察优化。在设计这个实验的时候，首先要确定各个因素的高低水平，低水平就是前一步单因素实验中确定的最佳值，高水平一般取低水平的1.25-1.5倍,但具体实验具体分析，根据自己的单因素实验来考察分析确定高水平取值。高低水平取值不当会造成模型无意义。对实验结果进行分析可得知各因素的t-值和可信度水平。一般认为当因素的可信度大于90％时，可以将其作为主要的影响因素。

(3)最陡爬坡实验设计：最陡爬坡实验的目的就是要找到响应面实验的中心点，在这个范围类响应面拟合方程才充分近似真实值，否则被近似的函数方程几乎无意义。最陡爬坡法是以实验值变化梯度方向做为由Plackett-Burman筛选出来的主要影响因素的爬坡的方向，根据它们效应值的大小比例来确定各自变化的步长。通过爬坡实验能快速地逼近最佳区域找到响应面实验的中心点

(4)响应面实验设计：响应面方法是一种考察多因素三水平的分析方法，通过建立数学模型，评价不同因素的效应和找到最优的实验条件。本实验采用的是Box-Behnken试验设计，对挑选出来的三个显著因素分析找到最佳条件。结合Plackett-Burman实验结果和最陡爬坡实验确定的中心点，确定主要影响因素的高、中、低三个水平，进行Box-Behnken实验及结果分析。Box-Behnken试验设计有17个实验点，每组实验要做一个平行，发酵结束后测酶活。Design—Expert7.0软件对试验结果进行响应面分析，可以得到一个多元二次回归方程，这个方程可以描述三个显著因素与木聚糖酶活的关系，对该多元二次回归方程求导进而可得到最佳培养条件以及预测最大酶活。

(5)结果验证按照响应面实验得到的最佳培养条件培养发酵，验证所建立的模型的可信度

12.重组工程菌产木聚糖酶条件的优化：1 木糖标准曲线的制作

如图3所示，以木糖的浓度作为X轴、540nm处的吸光度A值为Y轴，绘制木糖的标准曲线，可得到线形回归方程为Y＝0.1342X-0.1539,线性回归系数的平方为0.9983，截距是0.1539。

2 重组木聚糖酶的酶学性质

酶的最适反应pH及pH稳定性：分别取1.00mL经过pH为7.0、7.5、8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠的缓冲液以及pH为8.8、9.4、10.0、10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，在78℃下进行酶解反应，然后按照木聚糖酶活力测定方法测各个pH下的酶活，从图4可以初步确定木聚糖酶最适反应pH在8.8左右。

分别取1.00mL经过pH为9.4、10.0、10.6的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，于78℃恒温水浴锅水浴1小时，然后按照木聚糖酶活力测定的方法测酶活，并按照酶活残留率计算公式得到不同pH下的酶活残留率见表1，从该表可知我们诱导表达的木聚糖酶耐碱性不强，随着碱性则增强酶活残留率逐渐降低。

表1 不同pH下木聚糖酶的酶活残留率

3 酶的最适反应温度及热稳定性：取1.00mL经过最适pH缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，分别于70℃、75℃、80℃、85℃、90℃，95℃反应，然后按照木聚糖酶活力测定方法测各个温度下的酶活，从图5可以初步确定木聚糖酶最适反应温度是78℃。

取1.00mL经过pH为9.4的甘氨酸-氢氧化钠的缓冲液适当稀释的酶液加入到刻度试管中，分别于80℃、85℃、90℃水浴锅水浴1h，然后按照木聚糖酶活力测定方法测酶活并按照酶活残留率计算公式得到不同pH下的酶活残留率见表2，从该表可知我们诱导表达的木聚糖酶耐温性不强，随着温度的升高酶活残留率降低。

表2 不同温度下木聚糖酶的酶活残留率

4 工程菌株在优化前及优化后的发酵培养基中生长对比

为了详细了解工程菌在优化前及优化后发酵培养基中生长差异，将菌株分别接种到优化前及优化后发酵培养基中，每天取样测菌体量，具体结果见图6。由图6知，菌株在优化后的发酵培养基中菌体生长量远远大于优化前初始发酵培养基中的菌体量，说明优化后的培养基更能适应菌株的生长，同时从曲线1可以看出在第5天菌体基本停止生长，进入了生长稳定期

5 优化发酵培养基表达木聚糖酶

将筛选所得的工程菌株在优化的发酵培养基中诱导表达木聚糖酶，每天取样测酶活连续取6天，得到不同时间段木聚糖酶的活性见图8，有该图可以看出1到5天酶活上升很快，第5天后酶活趋于稳定。在取样测酶活的同时，每天也取800μL上清液与200μL的5×上样缓冲液，充分混合均匀，沸水煮沸5min，暂且储存－20℃，第6天的时候将每天的样品取15μL一起电泳检测每天木聚糖酶的表达情况，结果见图7，木聚糖酶基因的全长为1140pb，则理论上它所表达的蛋白质分子量在41KDa左右，由于对照并未检测到内源蛋白条带，由此只能初步判断条带1或者条带2有可能为木聚糖酶。由此只能初步判断条带1或者条带2有可能为木聚糖酶。分子量较大的可能发生糖基化的木聚糖酶，分子量较小的是非糖基化木聚糖酶。

由图7分析得出：优化的木聚糖酶基因在毕赤酵母中成功表达。酶活实验结果表明优化后的木聚糖酶基因在毕赤酵母中实现了活性表达。

6 发酵罐实验

表3 培养基

6.2、发酵结果：对改良前后碱性木聚糖酶产酶做对比看到改良后产酶速率明显加快，最大生产率为4.779U/(mL·h)，酶活为454U/mL，与改良前酶活相比较提高了1.36倍，同时产酶时间延长了14h。而根据湿重绘制的生长曲线，也看出改良后的碱性木聚糖酶代谢甲醇的能力明显增强，最高湿重提高了0.9％，为30.5％。改良碱性木聚糖酶再生产时，126～138h间放罐比较合适，这时的单位体积里酶活基本不变，甲醇和氨水的流加量减少(氨水由30.6mL降至25.1mL；甲醇136h开始也快速下降以大约每小时减少20mL的量)，而且这期间的菌体变形较多，开始出现自溶。

通过新、旧两罐碱性木聚糖酶上罐情况的比较发现，改良后的碱性木聚糖酶菌种活力增强产酶速率加快，时间延长，对实际生产具有积极作用。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限定的保护范围为准。

Claims (1)

1.一种高效表达耐热碱性木聚糖酶的方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列插入到表达载体pPIC9K的表达位点，经连接得到重组质粒pPIC9K-xylGT，所述耐热碱性木聚糖酶基因xylGT核苷酸优化序列如SEQ ID NO.1所示；

步骤二、将经SalⅠ酶切线性化后的pPIC9K-xylGT重组质粒电转化到毕赤酵母宿主菌GS115中，在基本培养基平板上初步筛选到阳性菌落，通过PCR进一步鉴定筛选得到重组工程菌GS115/xyl；根据G418抗性筛选出高拷贝的阳性转化子，再将高拷贝的阳性转化子转移到含有0.05％木聚糖的缓冲甲醇培养基平板上,挑选产水解圈大的阳性转化子作为高产木聚糖酶的出发菌；

步骤三、在摇瓶培养基础上进行发酵产酶，发酵产酶条件为：pH＝6.9、大豆蛋白胨为1.5％、酵母浸膏为15g/L、甲醇为12mL/L、硫酸镁为0.1％、硫酸钙1.049g/L、硫酸铵为0.45％，于28℃培养5天；

步骤四、确定发酵产生的酶的最适作用条件：pH为8.8，反应温度为78℃。