CZ20004564A3 - Způsob vytváření knihovny nukleových kyselin - Google Patents

Abstract

Je popsán způsob vytváření knihovny nukleových kyselin, který obsahuje: a) zajištění populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž každá z matric obsahuje kódující sekvenci a operativně vázanou sekvenci promotoru; b) hybridizaci směsi substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin k populaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž fragmenty mají kratší délku než matrice nukleových kysen; c) kontaktování každého z produktů hybridizace kroku b) jak s DNA polymerasou, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce tak s DNA ligasou za podmínek, při nichž se fragmenty chovají jako primery pro kompletaci druhého řetězce nukleové kyseliny, který je substanciálně komplementární k matrici nukleové kyseliny a d) kontaktování produktů kroku c) s RNA polymerasou za účelem vytvoření knihovny RNA, přičemž tato knihovna je přepsána z druhého řetězce nukleové kyseliny.

Description

Oblast techniky

Obecně se tento vynález týká způsobů vytváření a pozměňování rekombinantních knihoven.

Dosavadní stav techniky

Schopnost izolovat požadované sekvence nukleových kvselin nebo amipnokyselin vyžaduje dostupnost rekombinantních knihoven dostatečného počtu a rozmanitosti tak, že zvláštní druh je zastoupen v knihovně a může být identifikován jednou nebo více screeningovými technikami. Takové knihovny usnadňují izolaci užitečných sloučenin včetně terapeutik, výzkumných diagnostik a zemědělských činidel, stejně jako jejich kódujících sekvencí.

Navíc mohou být požadované knihovny specificky tvořeny tak, aby obsahovaly rozsáhlé množství možných variant jednotlivých sloučenin. Tento typ knihoven může být použit k výběru zlepšené verze sloučeniny například varianta sloučeniny, která má optimalizovaný léčebný účinek.

Pro tato a kterákoli jiná použití jsou velmi užitečné obecné přístupy zaměřené na zvýšení rozmanitosti knihovny a představují důležitou oblast průmyslu projektování bílkovin.

Podstata vynálezu

Obecně tento vynález charakterizuje způsob a vytváření knihovny nukleových kyselin zahrnující:

a) zajištění populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž každá z matric obsahuje kódující sekvenci a operativně vázanou sekvenci promotoru,

b) hybridizací k populaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin a směs substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcové kyseliny, tyto fragmenty mají kratší délku než matrice nukleové kyseliny,

c) kontaktování každého z produktů hybridizace kroku b) jak s DNA polymerasou, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce, tak i s DNA ligasou za podmínek, při nichž se fragmenty chovají jako primery pro » · · · ' • · · · · · · · kompletování druhého řetězce nukleové kyseliny, který je substanciálně komplementární vůči matrici nukleové kyseliny a

d) kontaktování produktů kroku c) sRNA polymerasou za účelem vytvoření knihovny RNA, přičemž knihovna je přepsána z druhého řetězce nukleové kyseliny.

V preferovaných provedeních je způsob použit k vložení jedné nebo více mutací do knihovny, směs substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcové nukleové kyseliny je vytvořena štěpením molekuly dvouřetězcové nukleové kyseliny, směs substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcové nukleové kyseliny je vytvořena syntézou náhodných oligonukleotidů, matrice jednořetězcové nukleové kyseliny je vytvořena za použití Ml3 fágu nesoucího nukleovou kyselinu, enzymatickým štěpením jednoho z řetězců matrice dvouřetězcové nukleové kyseliny za použití genu VI exonukleasy nebo lambda exonukleasy, zachycením jednoduchého biotinylovaného řetězce nukleové kyseliny za použití streptavidinu nebo reverzní transkripcí RNA; směs substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin obsahuje alespoň přibližně 100 různých druhů fragmentů nukleových kyselin, krok b) je proveden za použití přibližně 1 až 1000 fragmentů na jednořetězcovou matrici nukleové kyseliny; jeden řetězec produktu c) je použit jako matrice nukleové kyseliny a kroky b) a c) jsou zopakovány použitím v každém, produkt kroku c) jako matrice nukleové kyseliny; způsob dále obsahuje zajištění jednoho nebo více fragmentů jednořetězcové nukleové kyseliny, které tvoří homoduplex s matricí jednořetězcové nukleové kyseliny a provedení kroku b) v přítomnosti fragmentů tvořících homoduplex; promotorem je T7 promotor, DNA polymerasou je T4 DNA polymerasa, způsob dále obsahuje zesílení produktu kroku c) před uvedeným kontaktním krokem d) způsob dále zahrnuje v kroku e) translaci RNA knihovny za účelem vytvoření knihovny proteinů; způsob dále zahrnuje v kroku: e) navázání molekuly akceptoru aminokyselin ke 3’konci kódující sekvence v podstatě každého člena knihovny RNA; a způsob dále obsahuje krok f) translaci RNA knihovny za účelem vytvoření RNAproteinové fúzní knihovny.

Ve druhém aspektu se vynález zaměřuje na způsob snížení sekvenčních změn v populaci molekul nukleových kyselin, způsob zahrnuje: a) zajištění první populace matricí jednořetězcové nukleové kyseliny s proměnlivými sekvencemi, v podstatě každá ze všech matricí • · φ · ···· ···· · • · · · · · * • φ · · φ φ φ · « · • · · · φ · ·«· ·· ·· ···· ·· obsahuje kódující sekvenci a operativně navázanou sekvenci promotoru;

b) hybridizaci ke členům první a druhé populace substanciálně komplementárních fragmentů j ednořetězcových nukleových kyselin, fragmenty mají kratší délku než nukleová kyselina matrice a mají substanciálně identickou sekvenci; c) způsob obsahuje kontaktování produktů hybridizace kroku b) s oběma enzymy, jak DNA polymerasou, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce a DNA ligasou za podmínek, při nichž se fragmenty chovají jako primery pro kompletaci druhého řetězce nukleové kyseliny, který je substanciálně komplementární k matrici nukleové kyseliny a d) kontaktování produktů kroku c) s RNA polymerasou za účelem vytvoření populace molekul RNA, tzn. populace molekul RNA, které jsou přepsány z druhého řetězce nukleové kyseliny a mají snížený počet sekvenčních změn vzhledem k první populaci matricí j ednořetězcových nukleových kyselin.

V preferovaných uspořádáních je způsob použit k odstranění jedné nebo více mutací z první populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin; krok b) obsahuje hybridizaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin ke dvěma nebo více různým populacím substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin, druhá populace substanciálně komplementárních fragmentů nukleových kyselin je vytvořena štěpením molekuly dvouřetězcové nukleové kyseliny; druhá populace substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin je vytvořena syntézou náhodných oligonukleotidů; matrice jednořetězcových nukleových kyselin je vytvořena za použití Ml 3 fágu nesoucího nukleovou kyselinu, pomocí enzymatického rozkladu jednoho z řetězců matrice dvouřetězcové nukleové kyseliny použitím genu VI exonukleasy nebo lambda exonukleasy, zachycením jednoduchého biotinylovaného řetězce nukleové kyseliny za použití streptavidinu nebo reverzní transkripcí RNA; krok b) je proveden použitím přibližně 1 až 1000 fragmentů jednořetězcové nukleové kyseliny připadající na 1 matrici jednořetězcové nukleové kyseliny; jednoduchý řetězec produktu kroku c) je použit jako matrice nukleové kyseliny a kroky b) a c) jsou zopakovány; kroky b) a c) jsou zopakovány, přičemž v každém kole je použit produkt kroku c) jako matrice nukleové kyseliny, promotorem je T7 promotr, DNA polymerasou je T4 DNA polymerasa, způsob dále zahrnuje zesílení produktu kroku c) před uvedeným kontaktním krokem d), způsob dále zahrnuje krok e) tranlace populace molekul RNA za účelem vytvoření • · · · knihovny proteinů, způsob dále obsahuje krok e) navázání molekuly akceptoru aminokyseliny ke 3’ konci kódující sekvence v podstatě každého ze všech členů populace molekul RNA; způsob dále obsahuje krok f) translaci populace molekul RNA za účelem vytvoření RNAproteinové fůzní knihovny.

Třetím aspektem je zaměření vynálezu na způsob pro vytvoření knihovny nukleových kyselin, způsob obsahuje: a) zajištění populace matric jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž každá z matric obsahuje kódující sekvenci; b) zajištění populace molekul jednořetězcových nukleových kyselin proměnlivých sekvencí, přičemž populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin a populace molekul jednořetězcových nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi jsou substanciálně komplementární; c) hybridizace populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin s populací molekul jednořetězcových nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi za podmínek postačujících k vytvoření dvojitých šroubovic a

d) kontaktování dvojité šroubovice s jedním nebo více excizními/ opravnými enzymy za podmínek, které umožňují enzymům opravit chybné páry bází ve dvoušroubovicích.

V preferovaném uspořádání způsob dále obsahuje zajištění populace jednořetězcových matricí odvozených od produktu kroku d) a opakování kroku c) a d); přičemž kroky c) a d) jsou opakovány tak, že je v každém cyklu použita populace jednořetězcových matricí odvozená z produktu kroku d).

Ve čtvrtém aspektu se vynález zaměřuje na způsob pro vytvoření knihovny nukleových kyselin, přičemž způsob obsahuje: a) zajištění populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin, každá z matric obsahuje kódující sekvenci; b) hybridizaci směsi substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin k populaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž fragmenty mají kratší délku než nukleová kyselina matrice;

c) kontaktování každého z produktů hybridizace kroku b) s oběma enzymy, jak s DNA polymerasou, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce a DNA ligasou, za podmínek, při nichž se fragmenty chovají jako primery pro kompletaci druhého řetězce nukleové kyseliny, který je substanciálně komplementární k matrici nukleové kyseliny a d) kontaktování produktů kroku c) s jedním nebo více • · · · « · • · • · · ♦ · · · · · · · • · · · · 4 4

4 44 ·4 4494 9 4 excizními/opravnými enzymy za podmínek umožňujících enzymům opravit chybné páry baží v produktech.

V preferovaných uspořádáních způsob dále obsahuje zajištění populace jednořetězcových matricí odvozených od produktu kroku d) a opakování kroků b) a d) přičemž kroky b) až d) jsou opakovány v každém cyklu za použití populace jednořetězcových matricí odvozených od produktu kroku d).

V preferovaných uspořádáních třetího a čtvrtého aspektu vynálezu je provedeno kontaktování s excizními/opravnými enzymy in vivo (například v bakteriální buňce); spojení s excizními/opravnými enzymy je provedeno in vitro, matrice jednořetězcové nukleové kyseliny je vytvořena použití Ml3 fágu nesoucího nukleovou kyselinu, pomocí enzymového štěpení jednoho řetězce dvouřetězové matrice nukleové kyseliny za použití genu VI exonukleasy nebo lambda exonukleasy, zachycením jednoduchého biotinylovaného řetězce nukleové kyseliny použitím streptavidinu nebo reverzní transkripcí RNA; krok b) je proveden za použití přibližně 1 až 1000 molekul jednořetězcových nukleových kyselin s proměnnými sekvencemi nebo fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin na matrici jednořetězcových nukleových kyselin; způsob dále obsahuje krok e) zesílení produktu kroku d), každá z kódujících sekvencí je operativně vázána k sekvenci promotoru; způsob dále obsahuje krok e) transkripci produktů kroku d) za účelem vytvoření RNA knihovny; způsob dále obsahuje krok í) translaci RNA knihovny za účelem vytvoření knihovny proteinů; způsob dále obsahuje krok í) navázání molekuly akceptonu aminokyseliny ke 3’ konci kódující sekvence v podstatě každého ze všech členů knihovny RNA a způsob dále obsahuje krok g) translaci knihovny RNA za účelem vytvoření RNA-proteinové fuzní knihovny.

Výraz „knihovna“ je zde užit ve významu alespoň 10^s, raději alespoň 10^1θ, ještě lépe alespoň 10¹² a nejraději alespoň 10¹⁴ molekul, jež mají nukleokyselinovou a/nebo aminokyselinovou složku.

„Směs“ fragmentů nukleových kyselin znamená alespoň 100 raději alespoň 500, ještě lépe alespoň 1000 a nejlépe alespoň 1500 fragmentů nukleových kyselin.

„Sekvencí promotoru“ se rozumí jakákoli sekvence nukleových kyselin, která zajišťuje funkční vazebné místo RNA polymerasy a je dostačující k umožnění transkripce nejbližší kódující sekvence.

Výrazem „substanciálně komplementární“ se rozumí takový řetězec nukleových kyselin, v němž je rozmístěn dostatečný počet nukleotidů, které jsou schopny tvořit s druhým řetězcem nukleové kyseliny vhodné Watson-Crickovy páry baží za účelem vytvoření jedné nebo více oblastí dvojitého řetězení mezi těmito dvěma nukleovými kyselinami.

Je zřejmé, že každý nukleotid v molekule nukleové kyseliny nemusí tvořit odpovídající Watson-Crickův pár baží s nukleotidem v protilehlém řetězci, aby byl substanciálně komplementární a že ve „směsi fragmentů substanciálně komplementárních jednořetězových nukleových kyselin“ významný podíl fragmentů bude obsahovat jeden nebo více nukleotidů, které tvoří chybné párování s „matricí jednořetězcové nukleové kyseliny“.

Pojmem „aktivita vytěsnění řetězce“ je míněna schopnost polymerasy nebo její doprovodné helicasy rozrušit párování baží mezi dvěma řetězci nukleových kyselin.

Pojem „mutace“ znamená jakoukoli změnu nukleotidu a zahrnuje alterace sekvencí, jejichž výsledkem jsou fenotypické rozdíly, stejně jako změny, které se navenek neprojevují.

Pojem „dvoušroubovice (duplex)“ znamená strukturu vytvořenou mezi dvěma tepelně hybridizovanými řetězci nukleových kyselin, v nichž existuje mezi řetězci komplmentarita sekvencí dostačující k tomu, aby byl vytvořen stabilní hybridizační komplex. Dvojitá šroubovice může být buď „homoduplex“, v němž všechny z nukleotidů v prvním řetězci vhodně spárují baze se všemi z nukleotidů ve druhém protilehlém řetězci nebo „heteroduplex“. „Heteroduplexem“ je míněna struktura, která se vytvoří mezi dvěma tepelně hybridizovanými řetězci nukleových kyselin, v nichž jeden nebo více nukleotidů v prvním řetězci netvoří nebo nemůže tvořit vhodný pár baží s jedním nebo více nukleotidy ve druhém protilehlém komplementárním řetězci z důvodu jednoho ěi více chybných párování. Příklady různých typů heteroduplexů zahrnují ty, které představují změnu jednoho nebo několika nukleotidů a inzerční nebo deleění mutace.

Termín „náhodné oligonukleotidy“ znamená směs oligonukleotidů, které mají sekvenční změny na jedné nebo více pozicích nukleotidu.

Náhodné oligonukleotidy mohou být produkovány použitím úplně nebo částečně náhodných syntetických přístupů nebo záměrným pozměňováním olinukleotidů v řízeném utváření.

• ·

Termín „molekula akeeptoru aminokyselin“ značí kteroukoli molekulu schopnou býti přiřazena k C-konci proteinového řetězce rostoucího funkcí katalytické aktivity ribosomální peptidyltransferasy. Takové molekuly většinou obsahují i) nukleotidové nebo nukleotidu podobné části (například adenosin nebo analog adenosinu (di-methylace na N-6 amino pozici je přijatelná)) ii) aminokyselinová nebo aminokyselině podobná část (například kterákoli z 20 D- nebo Laminokyselin nebo kterýkoli analog těchto aminokyselin (například Omethyltyrosin nebo kterýkoli z analogů popsaných v Ellman et al., Meth. Enzymol. 202:301, 1991)), a iii) vazba mezi těmito dvěma (například ester, amid nebo keton vázané na 3’ pozici nebo méně žádané 2’ pozici), je lépe pokud tyto vazby významně neporušují záhyby kruhu z přirozené konformace ribonukleotidu. Akceptoiy aminokyselin mohou též být nukleofíl, který může být bez omezení aminokyselinová skupina hydroxylové skupina nebo SH-skupina, navíc mohou být akceptory aminokyselin složeny z napodobenin nukleotidů, napodobenin aminokyselin nebo napodobenin kombinovaných struktur nukleotid - aminokyselina.

Výrazem akceptor aminokyselin je navázán „ke 3’ konci“ kódující sekvence je míněno, že molekula akeeptoru aminokyseliny je umístěna za finálním kodonem kódující sekvence. Tento termín zahrnuje, bez omezení, molekulu akeeptoru aminokyselin, která je umístěna přesně u 3’ konce kódující sekvence, stejně tak jako jednu molekulu, která je od finálního kodonu oddělena intervenující (mezi nimi ležící) kódující nebo nekódující sekvencí (například sekvence odpovídající místu mezery „pause site“). Tento termín též zahrnuje konstrukty, v nichž kódující nebo nekódující sekvence následují (to je jsou u 3’ ) molekulu akeeptoru aminokyselin. Navíc tento termín zahrnuje, bez omezení, molekulu akeeptoru aminokyseliny, která je vázána kovalentně (buď přímo nebo nepřímo prostřednictvím intervenující sekvence nukleových kyselin) ke kódující sekvenci stejně tak jako molekulu, která je připojena ke kódující sekvenci nějakým nekovalentním způsobem, například prostřednictvím hybridizačního použití druhé sekvence nukleových kyselin, která váže na nebo blízko 3’ konce kódující sekvence a sama je vázána k molekule akeeptoru aminokyselin.

Pojmem „RNA-protem“ fuze se rozumí kterákoli molekula, jež obsahuje ribonukleovou kyselinu kovalentně vázanou prostřednictvím • · · · · * · · · · · • · · · · · · ··· ·· ·» ···· *· · amidové vazby k proteinu. Tato kovalentní vazba je odolná ke štěpení ribosony.

Termín „protein“ znamená kterákoli dvě nebo více přirozeně se vyskytujících nebo modifikovaných aminokyselin spojených jednou nebo více peptidovými vazbami. „Protein“, „peptid“ a „polypeptid“ jsou zde používány zaměnitelně.

Termín „populace jednořetězcových matricí proměnlivé sekvence“ znamená, že druhy nukleových kyselin populace umístěné v sekvencích, které se mění na jedné nebo více pozicích nukleotidu.

Termín „excizní/opravné enzymy“ znamená kteroukoli kombinaci enzymů dostačující k nahrazení chybně párované baze nebo smyčky standardním párem baží (např. A:T nebo G:C).

Tento vynález obsahuje mnoho nových a příbuzných způsobů pro náhodnou rekombinaci sekvencí nukleových kyselin usnadňujících vytváření knihoven DNA; RNA a proteinů, do nichž mají být zavedeny genetické alterace jak je podrobněji popsáno níže v jednom z preferovaných uspořádání, tato technika je prováděna in vitro a je používána k vytváření tradičních knihoven proteinů nebo fúzních knihoven RNA-proteinů, které mohou být pak použity v kombinaci s kterýmkoli ze způsobů pro selekci požadovaných proteinů nebo peptidů (nebo jejich odpovídajících kódujících sekvencí) z knihovny populací. Tento obecný přístup zabezpečuje prostředky pro zavedení mutací do knihoven proteinů v bezchybné podobě a rovněž zajišťuje techniku, s jejíž pomocí mohou být odstměny nežádoucí mutace z knihovny nebo vybrané rezervy nebo „zpětné kříženy“ („backcrossed“) z populace molekul během následujících cyklů selekce. Rekombinace fragmentů

Podle preferovaného způsobu je knihovna tvořena produkcí mutantních fragmentů a náhodných rekombinaci těchto fragmentů s nemutovanými (nejčastěji divokými typy) sekvencemi. Jeden z příkladů tohoto obecného přístupu je ukázán na obrázku 1. Jak je znázorněno na tomto obrázku, jsou mutace nejprve náhodně vloženy do počáteční sekvence dvouřetězcové DNA (označena „dsDNA(init)“). Tato produkuje populaci mutantních sekvencí dvouřetězcové DNA, která je na obrázku 1 označena ,,dsDNA(mut) “ Tyto mutace mohou být vloženy kteroukoli technikou včetně PCR mutageneze (mutageneze ····· « · 4 9 · • · » · · · ·· · · · · · 9 pomocí polymerované řetězcové reakce) (která opírá o mechanismus zkoušení vzácných chyb pomocí Tag polymerasy), místně směrovaná mutageneze, mutageneze směrovaná vůči matici (například jak je popsáno v Joyce and Inoue, Nucl. Aeids Res. 17:171, 1989). DNA v této populaci obsahující mutace je následně rozdělena na fragmenty použitím kterékoli varianty standartních metod. Například DNA může být částečně rozložena za použití jedné nebo více nukleas (jako DNasa I, mikrokokální (micrococcal) nukleasa, restrikční endonukleasy nebo Pl nukleasa), nebo může být rozštěpena na fragmenty chemickým působením například Fe-EDTA. Jiným způsobem mohou být fragmenty obsahující mutace vytvořeny pomocí limitované spotřeby nukleotidu během polymerace (například během PCR zesílení (zesílení pomocí polymerasové řetězové reakce) nebo pomocí fyzikálního stříhání (například sonikací). Preferovaný rozsah velikostí fragmentů je od 25 do 1000 párů baží, nejvhodněji v rozsahu 50- 150 párů baží.

Fragmenty DNA jsou pak zahřívány a následně tepelně hybridizovány k matrici jednořetězcové DNA úplné délky, která je identická k počáteční DNA v sekvenci a která je nekódujícím (nebo minusovým) řetězcem této DNA. Navíc je v této hybridizační směsi obsažen druhý typ fragmentu, někdy nazývaný „fragment terminátor“ (Joyce and Inoue, Nucl. Acids Res. 17:171, 1989). Tento fragment terminátor je komplementární k 3’ konci jednořetězcové matrice a zajišťuje polymerací primerů, kteiý se váže k matrici způsobem, jenž je relativně nezávislý na počtu nebo povaze náhodně tepelně hybridizovaných fragmentů obsahujících mutace.

Jednořetězcové matrice mohou být vytvořeny kteroukoli standardní technikou například použitím Ml3 fágu nesoucího DNA sekvenci, enzymovým rozkladem kódujícího řetězce dsDNA(init) molekuly za použití genu VI exnukleasy (Nikiforov et al, PCR Methods Appl. 3:285, 1994) nebo lambda exonukleasy (Higuchi and Ochman, Nucl. Acids Res 17:5865, 1989), zachycením biotinylovaného řetězce DNA použitím immobilizovaného streptavidinu (Joyce and Inoue, Nucl. Acids Res. 17:171, 1989) nebo reverzní transkripcí RNA. Za účelem provedení hybridizace matrice - fragment jsou matrice smíchány s fragmenty v poměru ne méně než jedna molekula fragmentu k jedné molekule matrice a ne více než přibližně 1000 molekul fragmentů na molekulu matrice. Nízký poměr fragmentů k matricím produkuje řetězce progenů, které se věrně podobají matricím, zatímco vyšší poměr produkuje « · • · » ·

• 9 progeny, které se věrněji podobají fragmentům. Podmínky hybridizace jsou určeny standardními způsoby a jsou navrhovány tak, aby umžňovaly vytvoření heteroduplexů mezi matridcí a fragmenty. Příkladné hybridizační techniky jsou popsány například v Stemmer. U.S. Patent No.5,605,793.

Fragmenty jednou tepelně hybridizované k matrici jsou spojeny dohromady pomocí působení obou jak DNA polymerasy, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce a DNA ligasy. DNA polymerasy užitečné pro tento účel zahrnují bez omezení též T4 DNA polymerasu a rekonstituovanou DNA pol II z E. coli (viz například Hughes et al., J. Biol. Chem. 266:4568, 1991). Může být též využita jakákoli DNA ligasa (například T4 DNA ligasa). V tomto kroku mohou být dvoušroubovice DNA ošetřeny nejprve pomocí DNA polymerasy a pak DNA ligasou nebo oběma enzymy současně a krok může být proveden například způsobem popsaným vJoyce and Inoue (Nucl. Acids Res. 17:711, 1989). Jak je ukázáno na obrázku 1, vytváří tento krok populaci dvoušroubovic DNA (označené dsDNA(lib)), z nichž každý člen obsahuje charakteristicky jednu nebo více vložených mutací. Jelikož obojí, jak na počátku vložená mutace, tak i počet a povaha tepelně hybridizo váných fragmentů jsou náhodné obsahují různé dvoušroubovice DNA v populaci i rozdílné mutace sekvencí.

Jinou alternativu k tomuto obecnému postupu vytváření knihovny dvoušroubovicové DNA ukazuje obrázek 2. Podle tohoto možného postupu jsou syntetizovány jednořetězcové fragmenty oligonukleotidů, které odpovídají částem kódujícího řetězce počáteční molekuly dvoušroubovicové DNA. Tyto fragmenty oligonukleotidů obsahují od 5 do 2000 nukleotidů nejlépe v rozsahu od 20 do 100 nukleotidů a jsou vytvářeny, například, použitím kterékoli standardní techniky syntézy nukleových kyselin. Tyto oligonukieotidy mohou být syntetizovány buď úplně náhodnými nebo polonáhodnými mutacemi použitím standardních technik. Je vhodné, aby takové oligonukieotidy obsahovaly až do 3 vložených chybných párování na 20 mukleotidových segmentů a postrádají v základní struktuře terminační kodony. Navíc, v určitých případech může být žádoucí nebo nutné zvýšit hybridizační potenciál oliginukleotidu prostřednictvím vložených nepřírodních afinitu zvyšujících párů baží jako je C-5 propinuridin nebo C-5 propincytidin. Tyto techniky jsou popsány například vWagner et al., Science 260:1510, 1993.

Tyto fragmenty oligosacharidů obsahující mutace jsou pak tepelně hybridizovány kjednořetězcovým matricím, kterými jsou, jak je uvedeno výše, řetězce plné délky identické v sekvenci k nekódujícímu (nebo minusovému) řetězci počáteční DNA. Fragmenty jsou ksobě spojeny za použití DNA polymerasy, jak je též popsáno výše, za účelem vytvoření DNA knihovny (ds DNA(lib)). Jak již bylo uvedeno, tato knihovna obsahuje populaci molekul dvoušroubovic DNA obsahujících seskupení různých kódujících řetězců majících mutace, které se odlišují počtem, umístěním a identitou.

Je-li to požadováno, mohou být uvedené kroky opakovány buď pro postup s fragmenty nebo oligonukleotidy za účelem vložení proměnlivého počtu mutací do molekuly DNA. Zejména mutované řetězce se stanou počátečními jednořetězcovými matricemi a mutantní fragmenty nebo oligonukleotidy jsou tepelně hybridizovány k řetězcům , polymerizovány a podrobeny ligaci.

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek 1 je schematickým znázorněním příkladu rekombinace fragmentů jako způsobu pro vytváření vysoce rozmanitých fúzních knihoven RNA-proteinů. V tomto způsobu jsou fragmenty odvozeny od molekuly dvouřetězcové DNA (dsDNA), do níž byla vložena změněná sekvence.

Obrázek 2 je schematickým znáýzoměním počátečních kroků druhého příkladu způsobu rekombinace fragmentů. Při tomto způsobu jsou fragmenty syntetické oligonukleotidy, do nichž byla vložena změněná sekvence.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Způsoby pro „zpětné křížení“ („Backerossing“)

Jak je obecně popsáno výše, způsoby podle tohoto vynálezu jsou používány k vložení mutací do počáteční sekvence DNA. Navíc mohou být tyto techniky využity k odstranění nebo ke snížení frekvence nežádoucích mutací z DNA knihovny. V souladu s tímto postupem

následuje rozdělení na fragmenty dsDNA(mut), oligonukleotidů sekvencí tzv. divokého typu nebo mohou být přidány zvláštní fragmenty nemutovaného nebo divokého typu DNA(wtDNA) k jednořetězcové matrici spolu s dsDNA(mut) fragmenty nebo oligonukleotidy. Fragmenty jsou oddělené řetězce (je-li to nutné), tepelně hybridizované k jednořetězcové matrici úplné délky a spojené dohromady za použití DNA polymerasy a DNA ligasy jak je výše uvedeno. Použití vysoké koncentrace nemutovaných oligonukleotidů nebo fragmentů vzhledem k odpovídajícím mutantním fragmentům umožňuje vytváření knihoven, v nichž jsou nežádoucí mutace minimalizovány nebo eliminovány.

Navíc může být tento postup použit u již existujících knihoven obsahujících mutace za účelem podobného snížení nebo eliminování nežádoucích sekvencí. Tento postup obsahuje počáteční knihovnu, která má mutantní sekvence a tepelnou hybridizaci, polymerizaci a ligaci fragmentů nebo oligonukleotidů sekvence divokého typu, jak je obecně uvedeno výše.

Příklad 2: Knihovny RNA, proteinů a RNA-proteinů

V jednom z preferovaných ztělesnění tohoto vynálezu knihovny DNA popsané výše obsahují vazebné místo pro RNA polymerasu, například pro T7 nebo SP6 polymerasu. Taková vazebná místa jsou popsána například vMilligan et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87:696, 1990. Toto místo je umístěno proti směru exprese genu kódující sekvence v poloze, která umožňuje transkripcí sekvence. Typicky jsou taková místa lokalizována mezi 5 až 2000 páry baží proti směru exprese kódující sekvence.

Knihovny obsahující vazebná místa pro RNA polymerasu mohou být upravovány jak je uvedeno výše. Následující polymerizace a ligace dsDNA(lib) může být přímo přepisována například použitím transkripčních a tanslaěních systémů in vitro za účelem vytvoření knihovny proteinů. Příkladné transkripční systémy in vitro a translační systémy in vitro obsahují T7 transkripční systémy a translační systémy králičích retikulocytů, pšeničných klíčků, kvasinek a E.coli.

Je-li zapotřebí, může být počet kopií každé RNA nebo proteinu v knihovně zvýšen zavedením řetězcově specifického zesilovacího kroku před transkripcí. Například PCR zesílení může být provedeno včleněním samostatných příměrových vazebných sekvencí, které jsou včleněny do mutantního řetězce během polymerizačních a ligačních kroků. Tyto sekvence mohou být včleněny buď jako chybná párování nebo sekvenční prodloužení na jednom nebo obou koncích DNA umožňující zesílení nově syntetizovaného řetězce bez zesílení řetězce matrice. Alternativně může být dosaženo lineárního zesílení násobnými cykly tepelné hybridizace a prodloužení jednoduchého primerů oligonukleotidu, který je komplementární ke 3’ konci nově syntetizovaného řetězce. Následné PCR a transkripční kroky produkují nadbytek RNA odpovídající mutantním sekvencím pouze malého podílu od matrice odvozených sekvencí.

Jeden preferovaný postup zvýše uvedených způsobů vkládání mutací nebo zpětného křížení (backcrossing out) nežádoucích mutací může být použit k přípravě vysoce rozmanitých knihoven RNA-proteinů. Takové knihovny mohou být konstruovány ligací spojovníků obsahujících nehydrolyzovatelné molekuly akceptorů aminokyselin jako puromycin ke 3’ konci RNA v knihovně (například připravené jak je uvedeno výše).

Příklad technik pro vytváření RNA-proteinových fůzí jsou popsány například vSzostak et al., U.S.S.N. 09/007,005; a Roberts et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 94:12297, 1997. Následná translace těchto RNA vytváří knihovnu RNA-protein fuzních molekul, které mohou být následně použity v selekčních pokusech in vitro.

Navíc, je-li třeba, RNA nebo RNA-protein fuzní molekuly jednou takto vybrané mohou být použity jako matrice ve standardních PCR reakcích za účelem získání odpovídající kódující sekvence. Tudíž tento způsob zajišťuje způsoby pro provádění rekombinace fragmentů, zpětné křížení molekul (molecular backcrossing), selekci proteinů a/nebo peptidů a výběr jejich odpovídajících kódujících sekvencí, vše v systému in vitro.

Příklad 3: Excize/oprava

Navíc, k postupům rekombinace fragmentů může být k úpravě sekvencí knihovny použita excize/oprava. Tento postup může být použit k vytvoření knihoven DNA, RNA a RNA-protein fuzních knihoven. Tato technika se opírá o fakt, že dsDNA(lib) produkované za použití kteréhokoli výše uvedeného způsobu, podle své povahy obsahují určitý počet chybných párů baží. Za účelem vytvoření rozmanitosti • · ·· · · ** ♦ : : : : : *ϊ

v sekvencích knihovny jsou tyto chybné páiy opraveny in vitro pomocí excizních/opravných enzymů. Toto může být provedeno za použití kteréhokoli excizního/opravného systému (například jak je popsáno vJaiswal et al., Nucl. Acids Res. 26:2184, 1998; nebo Fortini et al., Biochemistry 37:3575, 1998.

Alternativně může být krok excize/oprava proveden pomocí transformování dsDNA(lib) do bakteriálního nebo kvasničného kmene a využití bakteriálních nebo kvasničných opravných systémů in vivo. Shrnuto, tento krok může být proveden transformováním do kteréhokoli excizního/opravného systému in vivo. Ukázkové systémy jsou popsány bez omezení v Campbell et al., Mutat. Res. 211:181, 1989; Bishop and Kolodner, Mol. Cell Biol.6:3401, 1986;; Fishel et al., J. Mol. Biol. 188:147, 1986; a Westmoreland et al., Genetics 145:29, 1997.

Protože výše uvedené procesy jsou náhodné, je někdy výsledkem těchto excizních/opravných způsobů zanesení mutací do sekvencí knihovny, jindy způsobují zpětné křížení (backcrossing) divokého typu sekvence přeměny kódujícího řetězce.

Jinou možností nežli jsou výše uvedené postupy excise/opravy in vitro nebo in vivo, která může být též použita přímo k vytvoření rozmanitých knihoven, je použije-li se jako substrát směs dsDNA(mut) (například připravené výše uvedeným způsobem) a ds DNA(init) nebo wtDNA. Při této technice je směs rozdělena na řetězce a tepelně rehybridizována a pak je inkubována buď in vitro s excizními/opravnými enzymy nebo transformována do bakterie za účelem využití bakteriálního excizního/opravného systému (například jak je výše uvedeno). Tímto způsobem mohou být mutace náhodně včleněny do sekvence a divoký typ sekvencí může být zpětné křížení (backcrossed) do molekul dsDNA(mut).

Claims (26)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob vytváření knihovny nukleových kyselin, vyznačující se tím, že obsahuje:

   a) zajištění populace matrice jednořetězcových nukleových kvsehn, přičemž každá z uvedených matric obsahuje kódující sekvenci a operativně vázanou sekvenci promoloi/riv

   b) hybridizaci směsi substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcové nukleové kyseliny k uvedené populaci matric jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž uvedené fragmenty mají mít kratší délku než uv edené matrice nukleových kyselin;

   c ) kontaktování každého z produktů hybridizace kroku b) s oběma jak DNA polymerasou, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce tak i s DNA ligasou za podmínek, při nichž, se uvedené fragmenty chovají jako primery pro kompletaci druhých řetězců nukleových kyselin, které jsou substanciálně komplementární k uvedeným matricím nukleových kvsehn a

   d) kontaktování produktů kroku c) s RNA polymerasou za účelem . vytvoření RNA knihovny, přičemž uvedená knihovna bude přepsána z uvedených druhých řetězců nukleových ky selin.
2. 2. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že uvedený způsob je použit k vložení jedné nebo více mutací do uvedené knihovny.
3. 3. Způsob pro snížení sekvenčních změn v populaci molekul nukleových kyselin vyznačující se tím, že zahrnuje:

   a) zajištění první populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi, v podstatě každá z uvedených matric obsahuje kódující sekvenci a operativně vázanou sekvenci promotoru;

   b) hybridizaci. ke členům uvedené první populace, druhé nebo následujících populací fragmentů jednořetězcových nukleových kyselili, přičemž, tyto fragmenty mají kratší délku než uvedené matrice nukleových kyselin a tyto fragmenty jsou substanciálně komplementární . k uvedeným matricím nukleových kyselin, v nichž subpopulace uvedených druhých nebo následujících populací obsahuje substanciálně identické'sekvence a hybridizuje se k oblasti proměnlivé sekvence.

   • · ♦ ♦ • t φ φ ··

   c) kontaktování produktů hybridizace kroku b) sDNA polymerasou, která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce a tak i DNA ligasou za podmínek při nichž se uvedené fragmenty chovají jako primery pro kompletaci druhých řetězců nukleových kyselin, které jsou substanciálně komplementární k uvedeným matricím nukleových kyselin a

   d) komtaktování produktů kroku c) sRNA polymerasou za účelem vytvoření třetí populace molekul RNA, přičemž uvedená třetí populace molekul RNA je přepsána z uvedených druhých řetězců nukleových kyselin a má snížený počet sekvenčních změn vůči uvedené populaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin.
4. 4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že uvedený způsob je používán k odstranění jedné nebo více mutací z uvedené první populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin.
5. 5. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že uvedená směs substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin je vytvořena štěpením molekul dvouřetězcových nukleových kyselin nebo syntézou náhodných oligonukleotidů.
6. 6. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že uvedená směs substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin obsahuje alespoň kolem 100 rozdílných druhů fragmentů nukleových kyselin.
7. 7. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že dále obsahuje vytváření komplementárních řetězců z uvedených druhých řetězců nukleových kyselin, zajištění uvedených komplementárních řetězců jako uvedené první populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin a opakování kroků b) a c) v jednom nebo více cyklech a pak opakování kroku d).
8. 8. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále obsahuje zajištění jednoho nebo více fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin, které tvoří homoduplex s uvedenými matricemi jednořetězcových nukleových kyselin a provedení kroku b) v přítomnosti uvedených fragmentů tvořících homoduplex.
9. 9. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že uvedeným promotorem je T7 promotor.
10. 10. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že uvedenou DNA polymerasou je T4 DNA polymerasa.
11. 11. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje zesílení uvedeného produktu kroku c) a to před kontaktním krokem d).
12. 12. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje krok e) translaci uvedené knihovny RNA na vytvářenou knihovnu proteinů.
13. 13. Způsob podle nároku 1 nebo 3 vyznačující se tím, že uvedený způsob dále obsahuje krok

    e) navázání molekuly akceptoru aminokyselin ke 3’ konci uvedené kódující sekvence v podstatě každého z členů uvedené knihovny RNA a případně

    f) translaci uvedené knihovny RNA na tvořenou fúzní knihovnu RNAproteinů.
14. 14. Způsob pro vytváření knihovny nukleových kyselin vyznačující se tím, že uvedený způsob obsahuje:

    a) zajištění první populace matricí jednořetězcovýeh nukleových kyselin, přičmž každá z uvedených matric obsahuje kódující sekvenci,

    b) zajištění druhé poppulace molekul jednořetězcovýeh nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi, přičemž uvedená první populace matricí jednořetězcovýeh nukleových kyselin a uvedená druhá populace molekul jednořetězcovýeh nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi jsou substanciálně komplementární

    c) hybridizací uvedené první populace matricí jednořetězcovýeh nukleových kyselin s uvedenou druhou populací molekul jednořetězcovýeh nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi za podmínek postačujících k tvorbě dvojitých šroubovic DNA a

    d) kontaktování uvedených dvojitých šroubovic DNA s jedním nebo více excizními/opravnými enzymy za podmínek, které umožňují uvedeným enzymům opravit chybné párování párů baží v uvedených dvojitých šroubovicí ch DNA.

    • 4 • · ·· ····
15. 15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že uvedený způsob dále obsahuje po kroku d) zabezpečení nové populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin obsahujících kódující sekvenci, přičemž uvedené matrice jsou odvozeny z produktu kroku d) a nahrazující uvedenou novou populací matricí místo uvedené první populace matricí a opakování kroků c) a d) po jednom nebo více cyklech.
16. 16. Způsob pro vytváření knihovny nukleových kyselin vyznačující se tím, že uvedený způsob obsahuje:

    a) zajištění populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž každá z uvedených matricí obsahuje kódující sekvenci;

    b) hybridizaci směsi substanciálně komplementárních fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin k uvedené populaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin, přičemž uvedené fragmenty mají kratší délku než uvedené matrice nukleových kyselin;

    c) kontaktování každého z produktů hybridizace kroku b), jak s DNA polymerasou která postrádá aktivitu vytěsnění řetězce tak s DNA ligasou za podmínek, při kterých se uvedené fragmenty chovají jako primery pro kompletování druhého řetězce nukleové kyseliny, který je substanciálně komplementární k uvedeným matricím nukleových kyselin a

    d) kontaktování produktů kroku c) s jedním nebo více excizními/opravnými enzymy za podmínek, které umožňují uvedeným enzymům upravit chybné párování párů baží v uvedených produktech.
17. 17. Způsob podle nároku 16 vyznačující se tím, že uvedený nárok dále obsahuje kroky: zajištění nové populace matricí jednořetězcových nukleových kyselin obsahujících kódující sekvenci a odvozených od produktu kroku d), nahrazující uvedenou novou populaci matricí za uvedenou populaci matricí jednořetězcových nukleových kyselin a opakování kroků b) až d) v jednom nebo více cyklech.
18. 18. Způsob podle nároku 14 nebo 16 vyznačující se tím, že uvedené kontaktování s uvedenými excizními/opravnými enzymy je provedeno in vivo nebo in vitro.
19. 19. Způsob podle nároku 18, vyznačujícíc se tím, že kontaktování s uvedenými excizními/opravnými enzymy je provedeno v bakteriální buňce.

    «4 ·· ·· *·
20. 20. Způsob podle nároku 1,3, 14 nebo 16 vyznačující se tím, že uvedené matrice jednořetězcových nukleových kyselin jsou vytvořeny s použitím Ml 3 fágu nesoucího uvedené matrice nukleových kyselin, pomocí enzymového štěpení jednoho řetězce matricí dvouřetězcových nukleových kyselin za použití genu VI exonukleasy nebo lambda exonukleasy, zachycením biotinylovaných jednoduchých řetězců nukleových kyselin použitím streptavidinu nebo pomocí reverzní transkripce RNA.
21. 21. Způsob podle nároku 1,3, 14 nebo 16 vyznačující se tím, že krok b) je proveden za použití přibližně 1 až 1000 molekul jednořetězcových nukleových kyselin s proměnlivými sekvencemi nebo fragmentů jednořetězcových nukleových kyselin na každou matrici z uvedených matric jednořetězcových nukleových kyselin.
22. 22. Způsob podle nároku 14 nebo 16 vyznačující se tím, že uvedený způsob dále obsahuje krok:

    e) zesílení uvedeného produktu kroku d).
23. 23. Způsob podle nároku 14 nebo 16 vyznačující se tím, že každá z kódujících sekvencí je operativně vázána na sekvenci promotoru.
24. 24. Způsob podle nároku 23 vyznačující se tím, že uvedený způsob dále obsahuje krok:

    e) transkripci produktů kroku d) na vytvářenou knihovnu RNA.
25. 25. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že způsob dále obsahuje krok:

    f) translaci uvedené knihovny RNA na vytvářenou knihovnu proteinů.
26. 26. Způsob podle nároku 24 vyznačující se tím, že uvedený způsob dále • ·· ·· ·· ·· • · « · · ·· · · ♦ · • · · · · · · · · · · • · · · · · · ··· tt ·· ···· ·· · obsahuje krok:

    f) navázání molekuly akceptoru aminokyselin k 3’ konci uvedené kódující sekvence v podstatě každého ze všech členů uvedené knihovny RNA a případně

    g) translaci uvedené knihovny RNA na vytvářenou fuzní knihovnu RNA-proteinů.