CN108949860B - 一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及低聚木糖的制备技术领域，尤其涉及一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法。其包括以下步骤：制备木聚糖，制备粗酶液后水解木聚糖并以超滤得到的截留液为碳源制备木聚糖酶，将木聚糖酶负载于介孔硅载体后对木聚糖进行酶解以得到低聚木糖。该法能够高效制得纯度较高的低聚木糖。

Description

一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法
技术领域
本发明涉及低聚木糖的制备技术领域，尤其涉及一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法。
背景技术
低聚糖或称寡糖，是由2-8个单糖通过糖苷键连接形成的具有直链或支链的低度聚合糖类的总称，分子量约300-2000。功能性低聚糖，是指具有特殊的生物学功能，有益于人体健康的一类低聚糖。
功能性低聚糖附加值高，市场前景良好，有着极大的开发价值和推广潜力。目前在国外，尤其是日本研制开发低聚糖的努力和竞争已趋于白热化程度，开发出的低聚糖产品多达十几种，其中，低聚木糖是最受人瞩目的一种低聚糖。它不仅具有极好的双歧杆菌增殖活性，选择利用性最高，而且附加值和售价也最高。我国具有十分丰富的玉米芯、甘蔗渣及农作物秸秆等富含半纤维素类自然资源的农作废弃物，长期以来一直未能得到充分的重视和开发利用。如能利用生物酶解技术将其中的半纤维素类自然资源制备成高附加值的低聚木糖等产品，不仅将促进我国低聚糖工业向一个新的方向发展，而且还可以处理农林废料，变废为宝，消除公害，保护环境，具有十分重大的经济效益和社会效益。目前在饮食方面要求保健的呼声日益增高，能促进双歧杆菌增殖的低聚木糖的介入，将是关系到人类健康极为重要的因素，因而新型低聚糖源的开发研究极为重要。
发明内容
本发明要解决上述问题，提供一种能够高效制备纯度较高的低聚木糖的酶解制备工艺方法。
本发明解决问题的技术方案是，提供一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，包括以下步骤：
（1）制备木聚糖：以富含木聚糖植物为原料制得木聚糖；
（2）制备粗酶液：以富含木聚糖植物培养基作为产酶培养基，于25-30℃下固体发酵60-70h后加水搅拌，浸泡12-18h后过滤得滤液；
（3）制备木聚糖酶剂：将步骤（1）制得的木聚糖通过步骤（2）制得的滤液酶解，超滤分离得到透过液和截留液；以截留液为碳源，尿素、硫酸铵和蛋白质为氮源按碳氮比3:1-5:1的比例混合制成液体培养基，灭菌冷却后接入里式木霉菌丝悬浮液，于28-30℃、150-170r/min下摇瓶培养60-80h后，在1500-2000r/min转速下离心10-15min，收集上清液得到木聚糖酶。
（4）酶解：将步骤（3）制得的木聚糖酶负载到介孔硅载体后，进行木聚糖的酶解，经过超滤将木聚糖酶和制得的低聚木糖分离，截留的木聚糖酶可循环使用。
优选地，所述富含木聚糖植物为玉米芯、蔗渣、棉籽壳、稻、麦、竹和麸皮中的一种或几种。
优选地，所述步骤（1）包括以下步骤：将富含木聚糖植物与浓度为5-10%碱液以固液比1:10混合后于80-100℃下浸泡1-4h，真空抽滤得滤液，滤液经无水乙醇沉淀后将沉淀于50-60℃干燥即得木聚糖。
优选地，所述富含木聚糖植物培养基制备方法：将富含木聚糖植物与营养盐溶液以固液比1:1混合并搅拌，并于120-140℃灭菌30-60min；所述营养盐溶液按照质量份包括1.3-1.6份硫酸铵、0.9-1.2份氯化钙以及1-1.5份磷酸二氢钾。
优选地，所述介孔硅载体的制备方法：将CTAB、1mol/L硅酸钠溶液与去离子水以体积比1:3:500 -1:4:500混合后加热至80-90℃，加0.7-1wt%TEOS搅拌2-3h后以12000-15000r/min的转速离心4-7min，取沉淀并醇洗2-3次；将沉淀浸渍于固液比为0.6:100-1:100的硝酸铵、乙醇混合液，并于60-70℃下回流1-2ｈ后取沉淀醇洗、水洗2-3次后过滤干燥。
优选地，将木聚糖酶负载到介孔硅载体的方法为：将介孔硅载体分散于浓度为40-50%乙醇溶液中，加入1-1.2wt%APTES搅拌40-42h，以无水乙醇洗涤3-5次后向其中加入溶于硼酸盐缓冲液的木聚糖酶，并于35-40℃搅拌3-5h后用硼酸缓冲液冲洗3-4遍。
本发明的有益效果：
1.以低分子质量组分较多的粗酶解截留液为碳源，有利于促进内切-β-木聚糖酶的合成，用该酶酶解木聚糖，酶解产物中低聚木糖的含量较高。
2.以介孔硅为载体负载木聚糖酶后进行酶解，以提高酶活性和酶解效率。
具体实施方式
以下是本发明的具体实施方式，对本发明的技术方案作进一步的描述，但本发明并不限于这些实施例。
实施例1
一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，包括以下步骤：
（1）制备木聚糖：将风干的玉米芯粉碎成1cm左右的颗粒，并将其与浓度为5%的氢氧化钠溶液以1g:10mL的比例混合后于80℃下浸泡1h，真空抽滤得滤液，滤液经无水乙醇沉淀后将沉淀置于50℃干燥即得木聚糖。
（2）制备粗酶液：
a.制备产酶培养基：将风干的玉米芯与营养盐溶液以固液比1:1（g/mL）混合并搅拌，并于120℃灭菌30min。其中，营养盐溶液包括1.3份硫酸铵、0.9份氯化钙以及1份磷酸二氢钾。
b.将产酶培养基置于25℃下固体发酵60h后加水搅拌，浸泡12h后过滤得滤液即得粗酶液。
（3）制备木聚糖酶剂：
a.将步骤（1）制得的木聚糖通过步骤（2）制得的滤液酶解，超滤分离得到透过液和截留液。
b.以截留液为碳源，尿素、硫酸铵和蛋白质为氮源，并按碳氮比3:1的比例混合制成液体培养基，灭菌冷却后接入里式木霉菌丝悬浮液，于28℃、150r/min下摇瓶培养60h后，在1500/min转速下离心10min，收集上清液得到木聚糖酶。
（4）酶解：
a.制备介孔硅载体：将CTAB、1mol/L硅酸钠溶液与去离子水以体积比1:3:500混合后加热至80℃，加0.7wt%TEOS搅拌2h后以12000r/min的转速离心4min，取沉淀并醇洗2次；将沉淀浸渍于比例为0.6:100（g/mL）的硝酸铵、乙醇混合液，并于60℃下回流1h后取沉淀醇洗、水洗2次后过滤干燥即得介孔硅载体。
b. 将木聚糖酶负载到介孔硅载体：将介孔硅载体分散于40%乙醇溶液中，加入1wt%APTES搅拌40h，以无水乙醇洗涤3次后向其中加入溶于硼酸盐缓冲液的木聚糖酶，并于35℃搅拌3h后用硼酸缓冲液冲洗3遍。
c.进行木聚糖的酶解，酶解后经过超滤将木聚糖酶和制得的低聚木糖分离，截留的木聚糖酶可循环使用。
将制备得到的低聚木糖加去离子水制成溶液，注入高效液相色谱仪，经色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量分析，证明制备得到的为低聚木糖，低聚木糖的纯度为71%。
实施例2
一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，包括以下步骤：
（1）制备木聚糖：将风干的蔗渣粉碎成1cm左右的颗粒，并将其与浓度为8%的氢氧化钠溶液以1g:10mL的比例混合后于90℃下浸泡2h，真空抽滤得滤液，滤液经无水乙醇沉淀后将沉淀置于55℃干燥即得木聚糖。
（2）制备粗酶液：
a.制备产酶培养基：将风干的蔗渣与营养盐溶液以固液比1:1（g/mL）混合并搅拌，并于130℃灭菌45min。其中，营养盐溶液按照质量份包括1.4份硫酸铵、1.1份氯化钙以及1.2份磷酸二氢钾。
b.将产酶培养基置于27℃下固体发酵65h后加水搅拌，浸泡15h后过滤得滤液即得粗酶液。
（3）制备木聚糖酶剂：
a.将步骤（1）制得的木聚糖通过步骤（2）制得的滤液酶解，超滤分离得到透过液和截留液。
b.以截留液为碳源，尿素、硫酸铵和蛋白质为氮源，并按碳氮比4:1的比例混合制成液体培养基，灭菌冷却后接入里式木霉菌丝悬浮液，于29℃、160r/min下摇瓶培养70h后，在1750/min转速下离心12min，收集上清液得到木聚糖酶。
（4）酶解：
a.制备介孔硅载体：将CTAB、1mol/L硅酸钠溶液与去离子水以体积比1:3.5:500混合后加热至85℃，加0.8wt%TEOS搅拌2.5h后以13000r/min的转速离心5min，取沉淀并醇洗2次；将沉淀浸渍于比例为0.8:100（g/mL）的硝酸铵、乙醇混合液，并于65℃下回流1.5h后取沉淀醇洗、水洗2次后过滤干燥即得介孔硅载体。
b. 将木聚糖酶负载到介孔硅载体：将介孔硅载体分散于45%乙醇溶液中，加入1.1wt%APTES搅拌41h，以无水乙醇洗涤4次后向其中加入溶于硼酸盐缓冲液的木聚糖酶，并于37℃搅拌4h后用硼酸缓冲液冲洗3遍。
c.进行木聚糖的酶解，酶解后经过超滤将木聚糖酶和制得的低聚木糖分离，截留的木聚糖酶可循环使用。
将制备得到的低聚木糖加去离子水制成溶液，注入高效液相色谱仪，经色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量分析，证明制备得到的为低聚木糖，低聚木糖的纯度为79%。
实施例3
一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，包括以下步骤：
（1）制备木聚糖：将风干的玉米芯、蔗渣混合物粉碎成1cm左右的颗粒，并将其与浓度为10%的氢氧化钠溶液以1g:10mL的比例混合后于100℃下浸泡4h，真空抽滤得滤液，滤液经无水乙醇沉淀后将沉淀置于50℃干燥即得木聚糖。
（2）制备粗酶液：
a.制备产酶培养基：将风干的玉米芯、蔗渣混合物与营养盐溶液以固液比1:1（g/mL）混合并搅拌，并于140℃灭菌60min。其中，营养盐溶液按照质量份包括1.6份硫酸铵、1.2份氯化钙以及1.5份磷酸二氢钾。
b.将产酶培养基置于30℃下固体发酵70h后加水搅拌，浸泡18h后过滤得滤液即得粗酶液。
（3）制备木聚糖酶剂：
a.将步骤（1）制得的木聚糖通过步骤（2）制得的滤液酶解，超滤分离得到透过液和截留液。
b.以截留液为碳源，尿素、硫酸铵和蛋白质为氮源，并按碳氮比5:1的比例混合制成液体培养基，灭菌冷却后接入里式木霉菌丝悬浮液，于30℃、170r/min下摇瓶培养80h后，在2000/min转速下离心15min，收集上清液得到木聚糖酶。
（4）酶解：
a.制备介孔硅载体：将CTAB、1mol/L硅酸钠溶液与去离子水以体积比1:4:500混合后加热至90℃，加1wt%TEOS搅拌3h后以15000r/min的转速离心7min，取沉淀并醇洗3次；将沉淀浸渍于比例为1:100（g/mL）的硝酸铵、乙醇混合液，并于70℃下回流2h后取沉淀醇洗、水洗3次后过滤干燥即得介孔硅载体。
b. 将木聚糖酶负载到介孔硅载体：将介孔硅载体分散于50%乙醇溶液中，加入1.2wt%APTES搅拌42h，以无水乙醇洗涤5次后向其中加入溶于硼酸盐缓冲液的木聚糖酶，并于40℃搅拌5h后用硼酸缓冲液冲洗4遍。
c.进行木聚糖的酶解，酶解后经过超滤将木聚糖酶和制得的低聚木糖分离，截留的木聚糖酶可循环使用。
将制备得到的低聚木糖加去离子水制成溶液，注入高效液相色谱仪，经色谱分离，根据保留时间定性和与峰面积比较进行定量分析，证明制备得到的为低聚木糖，低聚木糖的纯度为88%。
本文中所描述的具体实施例仅仅是对本发明精神作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或者超越所附权利要求书所定义的范围。

Claims (6)

1.一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，其特征在于：包括以下步骤：
（1）制备木聚糖：以富含木聚糖植物为原料制得木聚糖；
（2）制备粗酶液：以富含木聚糖植物培养基作为产酶培养基，于25-30℃下固体发酵60-70h后加水搅拌，浸泡12-18h后过滤得滤液；
（3）制备木聚糖酶剂：将步骤（1）制得的木聚糖通过步骤（2）制得的滤液酶解，超滤分离得到透过液和截留液；以截留液为碳源，尿素、硫酸铵和蛋白质为氮源，并按碳氮比3:1-5:1的比例混合制成液体培养基，灭菌冷却后接入里式木霉菌丝悬浮液，于28-30℃、150-170r/min下摇瓶培养60-80h后，在1500-2000r/min转速下离心10-15min，收集上清液得到木聚糖酶；
（4）酶解：将步骤（3）制得的木聚糖酶负载到介孔硅载体后，进行木聚糖的酶解，经过超滤将木聚糖酶和制得的低聚木糖分离，截留的木聚糖酶可循环使用。
2.根据权利要求1所述的一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，其特征在于：所述富含木聚糖植物为玉米芯、蔗渣、棉籽壳、稻、麦、竹和麸皮中的一种或几种。
3.根据权利要求1所述的一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，其特征在于：所述步骤（1）包括以下步骤：将富含木聚糖植物与浓度为5-10%碱液以固液比1:10混合后于80-100℃下浸泡1-4h，真空抽滤得滤液，滤液经无水乙醇沉淀后将沉淀于50-60℃干燥即得木聚糖。
4.根据权利要求1所述的一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，其特征在于：所述富含木聚糖植物培养基制备方法：将富含木聚糖植物与营养盐溶液以固液比1:1混合并搅拌，并于120-140℃灭菌30-60min；所述营养盐溶液按照质量份包括1.3-1.6份硫酸铵、0.9-1.2份氯化钙以及1-1.5份磷酸二氢钾。
5.根据权利要求1所述的一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，其特征在于：所述介孔硅载体的制备方法：将CTAB、1mol/L硅酸钠溶液与去离子水以体积比1:3:500 -1:4:500混合后加热至80-90℃，加0.7-1wt% TEOS搅拌2-3h后以12000-15000r/min的转速离心4-7min，取沉淀并醇洗2-3次；将沉淀浸渍于固液比为0.6:100-1:100的硝酸铵、乙醇混合液，并于60-70℃下回流1-2ｈ后取沉淀醇洗、水洗2-3次后过滤干燥。
6.根据权利要求1所述的一种功能性低聚木糖的酶解高效制备工艺方法，其特征在于：将木聚糖酶负载到介孔硅载体的方法为：将介孔硅载体分散于浓度为40-50%乙醇溶液中，加入1-1.2wt% APTES搅拌40-42h，以无水乙醇洗涤3-5次后向其中加入溶于硼酸盐缓冲液的木聚糖酶，并于35-40℃搅拌3-5h后用硼酸缓冲液冲洗3-4遍。
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