CN101466843B - 由纤维素、热纤梭菌细胞以及由这些细胞表达的纤维素酶形成的三元复合物介导的水解纤维素的方法 - Google Patents

Abstract

本文公开了利用降低的纤维素酶负荷水解纤维素底物的方法。该方法包括确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需的纯化的纤维素酶的量；将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而确定降低的纤维素酶负荷；以及将(1)表达与所述降低的纤维素酶负荷浓度相同的细胞结合纤维素酶的微生物或(2)将已设计为表达与所述降低的纤维素酶负荷浓度相同的发酵剂结合纤维素酶的发酵剂在合适的条件下以及足以使所述纤维素底物接近完全水解的一段时间引入所述纤维素底物。

Description

由纤维素、热纤梭菌细胞以及由这些细胞表达的纤维素酶形成的三元复合物介导的水解纤维素的方法

相关申请

本申请要求2006年5月1日提交的美国临时专利申请第60/796,635号的优先权的权益，通过引用将其并入本文。

政府权益

美国政府在本发明中可享有一定的权利，因为与其开发有关的研究是由国家标准与技术研究院(NIST)60NANB1D0064号合同以及能源部DE-FG02-02ER15350号合同资助的。

发明背景

纤维素类生物质代表廉价且易得的资源，其可发酵以产生乙醇或其它产品。在生物转化产品中，因为乙醇可作为能够在可持续性、安全和农村经济发展方面提供益处的可再生民用燃料而产生，因此乙醇得到很高的关注。

在生物转化法力争变得与石油燃料工艺有经济竞争性时，其面临与纤维素水解为单糖有关的挑战。与克服纤维素类生物质的顽拗性相关的工序通常是成本最高的，并且对于R&D驱动的改善具有最大的潜力。通常通过酸的预处理然后由纤维素酶对预处理的纤维素进行酶性变质来克服纤维素的顽拗性。目前纤维素酶的成本估计为$0.30至$0.50/加仑乙醇。由于酶的成本作为由纤维素类生物质产生乙醇的限制因素，降低产生乙醇所需纤维素酶的量的任何方法仍然是重要的商业目标。因此，在过去已努力去了解多组分纤维素酶体系的作用方式并努力改善其效力。

能够通过在细胞不存在的情况下起作用的纤维素酶、通过在细胞存在但没有细胞酶的附着材料的情况下起作用的纤维素酶、或通过附着于细胞的纤维素酶来介导酶的水解。在较后的情况下，由三元的纤维素-酶-微生物(CEM)复合物介导水解，而不是二元纤维素-酶(CE)复合物。

已知好氧性微生物的细胞并不附着(或仅很弱地附着)于纤维素。因此，在好氧性体系中纤维素水解的主要试剂是与纤维素结合以形成二元CE复合物的纤维素酶。这些CE复合物的特征是分别起作用的、功能独特的蛋白。相反，大部分厌氧性微生物与纤维素附着，并且纤维素水解的主要试剂为三元CEM复合物，在很多但不是所有情况下涉及“纤维小体”，其中多种功能独特的蛋白协同作用。

在文献中已观察到并评价了CE复合物组分之间的协同现象，其中由两种或多种组分组合实现的速率高于当组分分别起作用时观察到的速率的总和。然而，先前并未评价和量化CEM复合物的“酶-微生物”的协同作用。

发明概述

本文报导的手段通过提供降低完成给定量生物质的水解所需酶的量的方法、或者增加可通过给定量的酶而水解的生物质的量的方法而发展了该技术。

在一实施方案中，使用降低的纤维素酶负荷以水解纤维素底物的方法包括：确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需的纯化的纤维素酶的量；将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而确定降低的纤维素酶负荷；以及在合适的条件下以及足以使所述纤维素底物接近完全水解的一段时间将表达与所述降低的纤维素酶负荷浓度相同的细胞结合纤维素酶的微生物引入所述纤维素底物。

在一实施方案中，使用降低的纤维素酶负荷以水解纤维素底物的方法包括：确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需的纯化的纤维素酶的量；将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而确定降低的纤维素酶负荷；以及将已设计为表达发酵剂结合纤维素酶的发酵剂在合适的条件下以及足以使所述纤维素底物接近完全水解和发酵的一段时间引入所述纤维素底物，其中所述细胞结合纤维素酶与所述降低的纤维素酶负荷的浓度相同。

附图的简要说明

图1示出纤维素被微生物利用，其中水解是由CEM和CE两种复合物介导的。

图2示出在涉及CE复合物的同步糖化和发酵(SSF)反应期间纤维素的酶水解。

图3表示图1所示的试验中经过一段时间后的pH与产物浓度的变化。

图4表示图2所示的试验中经过一段时间后的pH与产物浓度的变化。

图5示出图1和图2中所示的微生物和SSF试验以及对照试验的纤维素浓度曲线。

图6示出不含细胞的对照1的纤维素水解和产物积累。

图7示出在0.064g/L纯化的热纤梭菌(C.thermocellum)纤维小体存在下通过热解糖热厌氧杆菌(T.thermosaccharolyticum)的微晶纤维素(Avicel)的连续SSF的纤维素水解和产物积累。

图8示出在0.052g/L纯化的热纤梭菌纤维小体存在下由热解糖热厌氧杆菌的Avicel的连续SSF的纤维素水解和产物积累。

发明详述

本文公开了涉及与纤维素酶不是细胞结合的情况相比较，根据在微生物细胞的表面上的表达而增强纤维素酶效力的协同作用。这样的“酶-微生物”协同作用被定量地评价，并显示引起纤维素酶的效力大幅度增加。

在热纤梭菌(Clostridium thermocellum)上进行本研究，该菌是厌氧性的嗜热菌，其在所述微生物中表现出最高的纤维素利用率(水解和发酵)。在大多数培养条件下，热纤梭菌产生纤维素酶复合物或“纤维小体”，大部分纤维小体与细胞表面结合。对以下两个体系分批和连续培养以分析微晶纤维素(Avicel)的水解：

(a)涉及不添加纤维素酶时热纤梭菌培养物生长的微生物水解，其中水解是由CEM和CE复合物介导的。

(b)纯化的热纤梭菌纤维小体的酶水解以及由不分解纤维素的嗜热厌氧菌热解糖热厌氧杆菌(Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum)对水解产物的发酵。在该SSF过程中，水解仅由CE复合物介导。

发现热纤梭菌的生长培养物中纤维素水解的比速率高于来自相同有机体的纯化的纤维素酶制备物约2至5倍。因此，相对于热纤梭菌纤维素酶在没有细胞附着的情况下起作用，当热纤梭菌纤维素酶存在于纤维素附着的细胞上时出现加速的反应。

由应用科学的观点，在降低酶水解成本的策略的上下文中，该2倍至5倍协同效用是显著的。特别地，酶-微生物协同作用的量化表明在由附着的纤维素分解微生物水解纤维素的过程中获得的水解率可高于在不存在纤维素分解微生物的情况下由纤维素酶进行水解的过程中获得的水解率。

附着纤维素的纤维素分解微生物的存在可通过经发酵而降低抑制性水解产物的局部浓度而增加水解率。例如，纤维二糖，以及更小范围的葡萄糖，其抑制热纤梭菌纤维小体是公知的。此外，附着的微生物可由进化的观点得到益处，这是由于据推测，改善底物进入(对大量培养基，细胞表面较高浓度底物和/或较少损失的底物)的有机体将生长较快并因此具有选择性优势。

主要通过CEM复合物介导纤维素水解的纤维素分解厌氧菌的列表如表1所示。

表1.纤维素分解厌氧菌

Clostridium straminosolvens

解纤维素醋弧菌(Acetivibrio cellulolyticus)

解纤维素梭菌(Clostridium cellulolyticum)

粪堆梭菌(Clostridium stercorarium subs.Stercorarium)

热乳粪堆梭菌(Clostridium stercorarium subs.Thermolacticum)

Clostridium stercorarium subs.leptospartum

亨氏梭菌(Clostridium hungatei)

Caldicellulosiruptor kristjanssonii

Clostridium phytofermentans

热纤梭菌(Clostridium thermocellum)

白色瘤胃球菌(Ruminococcus albus)

生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)

溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)

解糖热解纤维素菌(Caldicellulosiruptor saccharolyticum)

溶纤维真杆菌(Eubacterium cellulosolvens)

溶纤维闪烁杆菌(Fervidobacterium cellulosolvens)

产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)

嗜热螺旋菌(Spirochaeta thermophila)

新阿波罗栖热袍菌(Thermotoga neapolitana)

Neocallimastix sp.(厌氧性纤维素分解真菌)

Pyromyces sp.(厌氧性纤维素分解真菌)

酶-微生物协同作用的益处可通过利用如表1中所示的任何厌氧性宿主水解纤维素底物而得以开发。此外，在保持酶-微生物协同作用下改变表1中的宿主(例如，通过进化挑战后的基因工程或基因选择)以具有改善的产品生产性能(例如，效价、收率)可能是有利的。

或者，非天然分解纤维素的发酵剂可设计为由表1中的有机体之一表达纤维素酶。这样的重组有机体可在细胞表面表达纤维小体，并且所得有机体可形成CEM复合物并由于酶-微生物协同作用而得到较高的纤维素水解率。例如美国专利申请第60/867,018号公开了表达限定的纤维素酶的重组有机体以及产生这样的有机体的方法，将该专利申请通过引用特别并入本文。可设计为表达纤维素酶的示例性发酵剂如表2所示。

表2.可设计为表达纤维素酶的发酵剂

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiea)

运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)

大肠杆菌(Escherichia coli)

产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)

丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)

粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)

白色念珠菌(Candida albicans)

产乳糖酶酵母(Kluyveromyces lactis)

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)

木糖发酵酵母(Pichia stipitis)

解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)

多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)

红发夫酵母(Phaffia rhodozyma)

产朊假丝酵母(Candida utilis)

Arxula adeninivorans

汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)

多形德巴利酵母(Debaryomyces polymorphus)

西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)

可根据本发明手段水解的纤维素底物包括但不限于：草，例如柳枝稷、绳草、黑麦草、草芦、芒属或其组合；制糖残余物，例如但不限于甘蔗渣；农业废弃物，例如但不限于稻秆、稻壳、大麦秆、玉米棒子、麦秆、油菜秆、燕麦秆、燕麦壳和玉米纤维；干草，例如但不限于大豆秸秆、玉米秸秆；以及林业废弃物，例如但不限于回收的木浆纤维、锯屑、硬木、软木或其任意组合；反刍动物消化产物；城市废物；造纸厂废水；报纸；纸板；以及上述底物的任意组合。被考虑用于乙醇生产的硬木的实例可包括柳树、枫树、橡树、胡桃树、桉树、榆树、桦树、七叶树、山毛榉以及白腊树。被考虑用于乙醇生产的软木的实例可包括南方黄松、冷杉、雪松、柏树、铁杉、落叶松、松树和云杉或其组合。

实施例1

微生物介导的与分离的酶介导的纤维素水解的比较

在热解糖热厌氧杆菌(能够利用纤维素水解的可溶产物不分解纤维素的嗜热生物)的存在与不存在下，将通过热纤梭菌的微生物介导的纤维素水解与由纯化的热纤梭菌纤维小体进行的酶介导的水解进行系统地比较。三元CEM复合物存在于微生物介导的水解的情况，而在酶介导的水解的情况下纤维素水解的产生全部是由于二元CE复合物的作用。

热纤梭菌的分批培养和相应的对照。在N₂气氛下将5ml热纤梭菌(ATCC 27405)储存培养物经注射器接种到在三份200ml密封血清瓶中的、含有2g/L Avicel PH105(FMC Corp.，Philadelphia，PA)和10g/L MOPs缓冲液(初始pH 7.6)的100ml MTC培养基中。在带有200rpm旋转搅拌的控温水浴中、60℃下孵育培养物。一旦消耗掉2g/L的Avicel，其通过肉眼检查来确定，以40g/L的灭菌混悬剂经注射器追加Avicel至浓度为2g/L，通过加入4M NaOH调节pH至7.6，并且通过用过滤灭菌的N₂的冲刷以取代气相。

以刚追加Avicel后的起始(时间零点)数据点采集微生物纤维素应用数据。除了将灭菌的1M叠氮化钠溶液与追加的Avicel添加物一起加入至38.5mM的最终浓度以外，如上进行微生物的对照1。加入上述的叠氮化物导致发酵的终止，该终止由发酵产物经过一段时间恒定的浓度来指示，所述浓度通过HPLC检测。

纤维小体的制备和纯化。由在200ml烧瓶中的MTC培养基中生长的热纤梭菌和具有初始浓度为4g/L的作为生长底物的Avicel的分批培养获得用于分批SSF试验的纤维小体。用于连续SSF试验的纤维小体是由以0.052hr^-1的稀释速率(流速/发酵罐工作容积)和4g/L的进料纤维素浓度在MTC培养基中生长的热纤梭菌的稳态连续培养物获得。通过亲和消化由培养物肉汤的上清液纯化纤维小体。用于分批和连续SSF试验的纯化的纤维小体制备物含有约1.2g/L纤维素酶，该纤维素酶在Tris缓冲液(50mM，含有10mM CaCl₂，pH 6.8)中的比活为2.8IU/mg纤维素酶。通过HPLC验证在纯化的纤维小体制剂中的可溶水解产物的浓度为足够小(＜0.002g/L)，以便不使SSF试验的解释复杂化。

分批SSF和相应的酶对照。在N₂气氛下将5ml热解糖热厌氧杆菌(ATCC 31960)储存培养物接种到在三份200ml血清瓶中的、含有2g/LAvicel PH105和2g/L纤维二糖的100ml MTC培养基中。在带有200rpm旋转搅拌的控温水浴中、60℃下孵育培养物。一旦消耗掉纤维二糖，其通过HPLC确定，调节pH至7.6，并将纯化的纤维小体制剂(上述的)过滤灭菌(Millex-GV，0.22um孔径，Millipore，Billerica，MA)，然后经注射器将其加至培养物至最终浓度为100mg/L。SSF数据以刚添加纤维素酶后的起始(时间零点)数据点采集SSF数据。除了不存在发酵有机体以外，如上述在2g/L Avicel和100mg/L纯化的纤维小体存在下进行不含细胞的对照1。除了将灭菌的1M叠氮化钠溶液加至38.5mM的最终浓度，与不含细胞的对照1相同地进行不含细胞的对照2。

连续培养。对于由热纤梭菌的微生物发酵和以连续模式进行的SSF均使用具有溢出侧臂(i.d.0.38″)和0.5L工作容积的1L改良发酵罐(Applikon，Dependable Instruments，Foster City，CA，由NDS改良)。通过添加4M NaOH由ΔV过程控制系统(New England Controls Inc.，Mansfield，MA)控制pH为6.8，以250rpm搅拌发酵罐，并通过使热水经发酵罐夹套循环而将温度控制在60℃。通过蠕动泵使含有4g/L Avicel PH105的MTC培养基进料以获得所需停留时间。对于SSF试验，使用另一蠕动泵以递送纯化的纤维小体，其储存在4℃下、50mM Tris缓冲液(pH 6.8)中。调整用于SSF试验的MTC培养基组成和Avicel的浓度以提供与用于热纤梭菌发酵试验相同的浓度(例如，4g/L Avicel的最终浓度)。通过将50ml热解糖热厌氧杆菌的延迟对数生长期培养物接种至含有4g/L Avicel的、追加2g/L纤维二糖的MTC培养基中而开始SSF试验。一旦明显开始生长，则开始添加纤维素酶。以至少一次停留的时间间隔收集用于计算连续发酵的稳态值的样本。

残余纤维素和发酵产品的测量。通过量化糖化作用测定残余的纤维素。通过HPLC、使用0.01％(v/v)H₂SO₄作为流出液、在55℃下运行的Bio-Rad HPX-87H柱以及折光率检测器分析糖(纤维二糖、葡萄糖)和发酵产物(乳酸、乙酸和乙醇)的浓度。根据由Ehrman，C.I.，M.E.Himmel.Biotechnology Techniques，8(2)：99(1994)报导的改良NREL后水解方法分析低聚糖。

蛋白、纤维小体和纤维素酶活性的测量。根据Bradford蛋白测定法(Bradford，M.M.Anal.Biochem.72，24(1976))用牛血清白蛋白作为标准测定上清液样本中的蛋白含量。使用先前由Zhang等描述的沉淀蛋白测定(Zhang，Y.-H.P，L.R.Lynd.J.Bacteriol.187，99(2005))测量沉淀中的蛋白含量。通过由Dubois，M.，K.Gilles，J.K.Hamilton，P.A.Rebers，F.Smith.Nature.168，167(1951)报导的ELISA方法测定上清液和沉淀中的纤维小体浓度。在60℃下、使用Zhang(2005)的方法测量上清液和沉淀的样本的微晶纤维素酶的活性，其基于由Dubois(1951)的苯酚-硫酸法确定的可溶糖的生产。以国际单位(IU)＝1μmol葡萄糖当量/L/min表达结果。

分批结果。在受控条件下的分批培养中，微生物水解需要16小时以完成2g纤维素/L的水解，在此期间，纤维小体和细胞蛋白的浓度分别由48mg/L和125mg/L大致翻倍为98mg/L和264mg/L(图1)。如图2所示，在热解糖热厌氧杆菌(酶水解)存在下使用纯化的纤维小体的SSF需要32小时以完成水解，在此期间，纤维小体的浓度为100mg/L而细胞蛋白的浓度由160mg/L增加至260mg/L。

产生微生物水解和SSF的条件是相似的。图3和图4分别示出图1和图2的反应的产物浓度和pH与时间的关系。检测到产物是乙醇(Eth)、乙酸盐(Act)、纤维二糖(CB)和葡萄糖等价物(Glu Eqv)。对于微生物水解和SSF，在生长培养基中的水解产物(全部可溶的葡聚糖或葡萄糖等价物)均始终＜0.02g/L，其低于通常观察到的50％抑制浓度两个数量级。如表3所示，微生物水解和酶水解中的纤维小体的比活非常相近且在试验期间基本上保持恒定。

表3.在热纤梭菌分批培养、SSF和相应的酶对照中酶活性的比较

^*热纤梭菌分批培养和SSF的阶段2(图1和图2，0hr至48hr)的开始是指0hr。

^#阶段2(图1和图2，0hr至48hr)的结束，对于热纤梭菌分批是指16hr，而对SSF和酶对照是指32hr。

在图5中对于微生物水解(来自图1)、SSF(来自图2)以及如下的对照将纤维素浓度对时间作图：微生物对照1，含38.5mM叠氮化钠的热纤梭菌培养物(100mg/L纤维小体，264mg/L细胞蛋白)；不含细胞的对照1，不含发酵有机体的100mg/L纯化的纤维小体；不含细胞的对照2，如含38.5mM叠氮化钠的不含细胞的对照1。虽然事实上微生物水解的大部分试验过程中的纤维小体的浓度(见图1)低于微生物对照1(100mg/L纤维小体)，但是对于生长细胞的水解率(微生物水解)基本上高于无代谢活性细胞(微生物对照1)。无代谢活性细胞的较低的水解率并非主要归因于叠氮化物对纤维小体的影响，这是因为在叠氮化物存在与不存在下观察到的不含细胞的水解率是相近的。

图6示出不含细胞的对照1的纤维素水解和产物积累。能够观察到，虽然不含细胞的对照1的水解产物的浓度高于SSF一个数量级(图6与图2比较)，但其水解率是相近的。因此，在大量发酵肉汤中水解产物的积累对于微生物水解和SSF之间显著的不同并非可信的解释。

分批结果支持一定程度的酶-微生物协同作用，该程度等于酶体系中观察到的纤维小体标准化的水解率与微生物体系中观察到的纤维小体标准化的水解率的比值，该比值为2.8至4.7(表4)。对于酶-微生物的协同作用的量化的进一步描述参见实施例2。

连续培养结果。微生物水解和SSF还在稳态连续培养物中进行比较。四个或更多稳态数据点的平均值在表4中列出，在表5中列出纤维素酶比活。在6.8小时和9.8小时的停留时间(τ＝发酵罐容积/进料流速)分别获得微生物稳态1和2。对于微生物稳态1，在总浓度为39mg/L的纤维小体存在下，65.3％的进料纤维素被水解，而对于微生物稳态2，在纤维小体为63mg/L时获得76.8％的水解。在以下条件下进行由纯化的热纤梭菌纤维小体介导的稳态连续SSF以及由热解糖热厌氧杆菌的发酵：选择这样的条件是为了获得与在微生物纤维素利用中观察到的相近的转化率和纤维小体浓度。对于SSF稳态1，与微生物稳态1比较，在τ＝24.4hr且添加的纤维小体为52mg/L时观察到67％的纤维素水解。对于SSF稳态2，在τ＝19.23hr且纤维小体为63mg/L时观察到75.3％的纤维素水解。对于微生物稳态和SSF稳态，纤维素水解产物的浓度均在检出限(2.5mg/L)以下。SSF的时间进程数据如图7(SSF稳态1)和图8(SSF稳态2)所示。在第168小时将该试验由连续的转换为分批的以防止纤维二糖的进一步积累；在第184小时再次启动连续进料。微生物稳态和SSF稳态的纤维素酶比活相近(表5)。

表4.连续培养数据和协同作用程度的计算

^a(C₀-C)/C₀所有纤维素浓度均以葡萄糖当量报导。

表5.热纤梭菌的连续培养和SSF

X-纤维素转化率

E_T-全部纤维小体

E_ads-吸附的纤维小体

连续培养的数据支持一定程度的酶-微生物协同作用，该程度等于酶体系中观察到的纤维小体标准化的水解率与微生物体系中观察到的纤维小体标准化的水解率的比值，该比值为2.8至4.8(表4)。对于酶-微生物的协同作用的量化的进一步描述参见实施例2。

在研究的条件下，对于分批和连续培养试验，微生物水解期间的热纤梭菌纤维素酶复合物均比SSF基本上更有效。这样的酶-微生物协同作用需要代谢活性的纤维素分解微生物的存在，并且不能通过从大量发酵肉汤中除去水解产物来解释。微生物水解和SSF之间的关键性显著不同看起来在于CEM复合物存在于微生物水解期间，而对于SSF的情况则不存在。

实施例2

酶-微生物协同作用的量化

可使用下式计算基于纤维小体的纤维小体特异性水解率(

g纤维素·g纤维小体^-1·hr^-1)：

$r_C^E=\frac{(C_0-C)/\mathrm{\τ}}{E}---\left(1\right)$

其中C₀是起始时(对于分批反应)或进料时(对于稳态连续反应)以g/L为单位的纤维素浓度，C是在时间t后(分批)或稳态时(连续)以g/L为单位的发酵罐纤维素浓度，τ是逝去时间(分批)或停留时间(连续)，以及E是经过逝去的时间(分批)或多个稳态点(连续)后以g/L为单位的平均纤维小体浓度。酶-微生物协同作用的程度，D_SEM，可使用下式由微生物水解和SSF中观察到的纤维小体特异性水解率计算：

通过使用式(1)中的全部纤维小体浓度，E_T，得到基于全部纤维小体的协同作用的程度，

或者，如果使用沉淀纤维素酶浓度(E_P，可能包括CE和CEM复合物)，则得到基于沉淀纤维小体的协同作用的程度，

由分批和连续数据计算出的

值如表4所示。基于分批数据的

在8小时后为4.69。如果

是在获得完全纤维素水解后计算的，得到2.78的值。在连续培养中，基于微生物和SSF稳态2得到的

值为2.80，其中进料的纤维素约75％水解。对于其中获得约66％水解的微生物和SSF稳态1，

等于4.81。基于沉淀纤维素酶的酶-微生物协同作用的值，

与在连续培养中观察到的值非常接近：对于微生物和SSF稳态2为2.84，对于微生物和SSF稳态1为4.77。对于分批和连续培养，发现随着纤维素水解程度的增加以及底物与酶的比值的降低，协同作用均降低。

可对上述方法和体系做出改变而不偏离本文的范围。因此，应当注意，包含在以上说明书中的或如附图中所示的物质应当理解为示例性的而非限制性的含义。以下权利要求旨在覆盖本文所述的所有一般特征和具体特征以及本方法的范围的说明，根据语言的特点，可以说落在其间。

Claims (6)

1.利用降低的纤维素酶负荷来水解纤维素底物的方法，该方法包括：

确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需的纯化的纤维素酶的量；

将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而确定降低的纤维素酶负荷；以及

将表达与所述降低的纤维素酶负荷浓度相同的细胞结合纤维素酶的微生物在基本上无氧的气氛下以及足以使所述纤维素底物接近完全水解的所述一段时间引入所述纤维素底物，其中所述微生物为热纤梭菌(Clostridium thermocellum)。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述倍数为2.8至4.8。

3.如权利要求1所述的方法，其中所述纤维素底物选自草、制糖残余物、农业废弃物、干草、林业废弃物、反刍动物消化产物、城市废物、造纸厂废水、报纸、纸板或其组合。

4.利用降低的纤维素酶负荷来水解纤维素底物的方法，包括：

确定在一段时间内接近完全地水解一定量纤维素底物所需的纯化的纤维素酶的量；

将纯化的纤维素酶的量降低2至5倍，从而确定降低的纤维素酶负荷；和

将已设计为表达发酵剂结合纤维素酶的发酵剂在合适的条件下以及足以使所述纤维素底物接近完全水解和发酵的一段时间引入所述纤维素底物，

其中所述发酵剂结合纤维素酶与所述降低的纤维素酶负荷的浓度相同，并且其中所述发酵剂选自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiea)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、产酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)、丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、产乳糖酶酵母(Kluyveromyces lactis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、木糖发酵酵母(Pichia stipitis)、解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、红发夫酵母(Phaffiarhodozyma)、产朊假丝酵母(Candida utilis)、Arxula adeninivorans、汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、多形德巴利酵母(Debaryomycespolymorphus)和西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)，

其中所述发酵剂被设计为表达纤维素酶或在细胞表面表达纤维小体，并能形成纤维素-酶-微生物复合物。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述倍数为2.8至4.8。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述纤维素底物选自草、制糖残余物、农业废弃物、干草、林业废弃物、反刍动物消化产物、城市废物、造纸厂废水、报纸、纸板或其组合。

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