CN102131517B - 可溶性杂合Fc γ受体和相关的方法 - Google Patents

Abstract

公开了可溶性杂合Fcγ受体(FcγR)多肽组合物和使用这类多肽治疗IgG介导的和免疫复合物介导的炎症的方法。还公开了相关的组合物和生产所述可溶性杂合FcγR多肽的方法。

Description

可溶性杂合Fc γ受体和相关的方法

背景技术

免疫系统疾病是重大的卫生保健问题，其几近泛滥地增长。因此，它们需要新型强有力的方法来开发新的治疗剂。自身免疫疾病的标准疗法一直是大剂量、长期全身性的皮质类固醇和免疫抑制剂。所使用的药物分为三大类：(1)糖皮质激素，例如泼尼松(prednisone)和泼尼松龙(prednisolone)；(2)神经钙蛋白(calcineurin)抑制剂，例如环孢菌素(cyclosporine)和他克莫司(tacrolimus)；和(3)抗增殖剂/抗代谢剂例如硫唑嘌呤、西罗莫司(sirolimus)和麦考酚酸莫酯(mycophenolatemofetil)。尽管这些药物在治疗许多自身免疫病症中取得了很大的临床成功，但这类疗法需要终身使用并且以非特异性的方式作用会抑制整个免疫系统。因此使患者暴露于显著较高的感染和患癌风险之中。所述神经钙蛋白抑制剂和类固醇还是肾毒的和致糖尿病的，这限制了它们的临床应用(Haynes and Fauci in Harrison′s Principles of Internal Medicine，16^th edition，Kasper et al.，eds(2005)，pp 1907-2066)。

对于自身免疫疾病，除了常规疗法外，以细胞因子及其受体为靶的单克隆抗体和可溶受体在多种自身免疫疾病和炎性疾病——例如类风湿性关节炎、器官移植和克罗恩病中已经显示出效力。一些试剂包括以肿瘤坏死因子(TNF)为靶的英夫利昔单抗(infliximab)(REMICADE)和依那西普(etanercept)(ENBREL)、以T细胞抗原CD3为靶的莫罗单抗CD3(muromonab-CD3)(ORTHOCLONE OKT3)和结合活化的T细胞上的CD25并通过该通路抑制信号传递的达克珠单抗(daclizumab)(ZENAPAX)。尽管在治疗某些炎性病症中有效，但包括“细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome)”和感染风险增加的副作用限制了这些药物的使用(Krensky et al.，in Goodman andGilman′s The Pharmacological Basis of Therapeutics，10^th edition，Hardman and Limbird，eds，(2001)，pp 1463-1484)。

1981年美国批准了采用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的被动免疫，其在原发性抗体缺乏(primary antibody deficiencies)患者中用作替代疗法。随后的研究表明，IVIG对改善川崎病和免疫性血小板减少性紫癜的自身免疫症状也是有效的(Lemieux et al.，Mol.Immunol.，42：839-848，2005；Ibanez and Montoro-Ronsano Curr.Pharm.Biotech.，4：239-247，2003；Clynes，J.Clin.Invest.，115：25-27，2005)。IVIG已显示可减少成人皮肌炎、格-巴综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病变(chronicinflammatory demyelinating polyneuropathies)、多发性硬化、血管炎、葡萄膜炎、重症肌无力和朗-伊综合征中的炎症(Lemieux(Lemieux et al.，见上文；Ibanez and Montoro-Ronsano，见上文)。

通过冷乙醇分级分离从大量(10,000-20,000)健康供体的血浆中得到IVIG。常规使用的IVIG制剂包括Sandoglobulin、Flebogamma、Gammagard、Octagam和Vigam S。通常只有将大量IVIG注入患者内时才能看到效力，并且在自身免疫疾病中使用的平均剂量为2g/kg/月。IVIG治疗的常见(1-10％的患者)副作用包括面红、发热、肌痛、背痛、头痛、恶心、呕吐、关节痛和眩晕。罕见(0.1-1％的患者)副作用包括过敏反应、无菌性脑膜炎、急性肾衰竭、溶血性贫血和湿疹。尽管IVIG一般被认为是安全的，但混合的人血浆源被认为是传递传染物质的危险因素。因此，IVIG的使用受限于其可用性、高成本(($100/gm，包括输注费用)和严重不良反应的可能性(Lemieux et al.，见上文；Ibanez andMontoro-Ronsano，见上文；Clynes，J.Clin.Invest.，115：25-27，2005)。

已经提出许多机制来解释IVIG的作用模式，包括Fcγ受体表达的调节、由于新生Fc受体FcRn的饱和导致的致病抗体的清除增加、补体介导的损伤衰减以及T细胞和B细胞或网状内皮系统的调节(Clynes，见上文)。由于由IVIG纯化的Fc区在很多体外和体内炎症模型中都与完整IgG活性相同，公认的是IVIG的抗炎性质存在于IgG的Fc区(Debre et al.，Lancet，342：945-949，1993)或唾液酸化的亚片段(Kanekoet al.，Science，313：670-673，2006)。

IgG的Fc受体(FcγR)通过在先天性免疫系统和获得性免疫系统之间起到桥梁的作用而在哺乳动物生物学中起到独特的作用((Dijstelbloem et al.，Trends Immunol.22：510-516，2001；Takai，Nature 2：580-592，2002；Nimmerjahn and Ravetch，Immunity 24：19-28，2006)。由于FcγR结合IgG的Fc区(Woof and Burton，Nature Rev.Immunol.，4：1-11，2004)，它调节ADCC、补体介导的细胞裂解、III型超敏反应、耐受、吞噬作用、抗原呈递和免疫复合物的加工和清除中的多种效应子功能(Dijstelbloem et al.，见上文；Takai，见上文；Nimmerjahn andRavetch，见上文)。

在人中，FcγR包括3个主要的基因家族：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD 16)(Dijstelbloem et al.，见上文；Takai，见上文)。FcγRI是单体IgG的高亲和力(10⁸-10⁹M^-1)受体，而FcγRII和FcγRIII对单体IgG表现出低亲和力(10⁷M^-1)，但以大大增加的亲合力结合于IgG免疫复合物。所述FcγRII亚家族由2类基因组成：FcγRIIa和FcγRIIb，它们在结合IgG后向细胞内传递相反的信号。FcγRIIa在其短的胞质尾区包含免疫受体酪氨酸活化基序(ITAM)，而FcγRIIb通过在其胞质区内的免疫受体酪氨酸抑制基序(ITIM)传递抑制性信号。FcγRIII亚家族也包含2个不同的受体基因：FcγRIIIa和FcγRIIIb。FcγRIIIa是异源二聚体信号传递受体，它在结合IgG免疫复合物后通过其关联的含有ITAM的共有的γ链传递活化信号。FcγRIIIb通过GPI连接子(GPI linker)结合于细胞膜，并且缺乏内在的信号传递能力。FcγRI也缺乏内在的信号传递能力，但是与FcγRIIIa相似，它一旦与Fc结合即与共有的γ链关联以传递活化信号。通过FcγR的信号传递包括在ITAM/ITIM序列中的激酶介导的磷酸化/去磷酸化事件(Daeron，Intern.Rev.Immunol.，16：1-27，1997)。

与其在免疫生物学中被报道的功能一致，人FcγR对单体IgG亚类表现出不同亲和性：FcγRI结合IgG1≥IgG3＞IgG4＞＞IgG2；FcγRIIa结合IgG3≥IgG1，IgG2＞＞IgG4；FcγRIIb结合IgG3≥IgG1＞IgG4＞IgG2；FcγRIIIa和FcγRIIIb结合IgG1，IgG3＞＞IgG2，IgG4(Dijstelbloem et al.，见上文；Takai，见上文)。

除了结构和信号传递能力方面的差异之外，所述FcγR还表现出细胞表达模式的差异。在人中，FcγRI主要在巨噬细胞、单核细胞和中性粒细胞上表达，但还可出现在嗜酸性粒细胞和树突状细胞上。FcγRIIa是人中最广泛表达的FcγR，在血小板、巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞上表达。FcγRIIb是唯一在B细胞上表达的FcγR，但还被肥大细胞、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、中性粒细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞表达。FcγRIIIa是唯一在人NK细胞上表达的FcγR，并且被广泛表达，出现在巨噬细胞、单核细胞、肥大细胞、嗜酸性粒细胞、树突状细胞和朗格汉斯细胞上。在另一方面，FcγRIIIb的表达极大程度地局限于中性粒细胞和嗜酸性粒细胞(Dijstelbloem et al.，见上文；Takai，见上文)。

小鼠表达与人的受体功能类似的FcγR，所述人的受体例如人高亲和力FcγRI和FcγRI抑制性受体FcγRIIb的直向同源物(ortholog)(Nimmerjahn and Ravetch，Immunity，24：19-28，2006)。人FcγRIIa和IIIa的鼠直向同源物被认为分别是FcγRIII和FcγRIV。小鼠似乎不表达FcγRIIIb(Nimmerjahn and Ravetch，见上文)。尽管已经注意到在细胞表达模式上有一些差异，但人中FcγR基因表达及其在小鼠中的直向同源物的基因表达通常是相似的。

小鼠中的基因靶向已表明FcγR在哺乳动物免疫系统中的重要性(总体上可参见Dijstelbloem et al.，见上文；Takai，见上文；Nimmerjahn andRavetch，见上文)。共有的γ链——FcγRI、FcγRIII和FcγRIV的信号传递亚单位——的缺失会破坏所有通过活化的FcγR的信号传递，并且使小鼠可抵抗多种自身免疫病症和炎性病症。γ-链缺陷小鼠表现出免疫复合物肺泡炎、血管炎、肾小球肾炎、阿尔图斯反应和自身免疫溶血性贫血的减弱。对于FcγRIII和FcγRI的α-链的缺失也描述了类似的数据。FcγRIII-/-小鼠表现出免疫复合物诱导的肺泡炎减弱、对自身免疫溶血性贫血的敏感性降低以及阿尔图斯反应衰减。FcγRI-/-小鼠表现出巨噬细胞吞噬功能受损、细胞因子释放减少、ADCC和抗原呈递衰减、关节炎减轻、抗体反应增强和超敏性受损。相反，抑制性受体FcγRIIb的缺失会导致炎性反应和自身免疫反应增强。FcγRIIb-/-小鼠显示胶原诱导的关节炎增强、在C57BL/6背景下的自发形成肾小球肾炎、阿尔图斯反应增强、肺泡炎增强、IgG诱导的全身过敏反应增强和抗-GBM诱导的肾小球肾炎增强。因此，所述FcγR在免疫系统内稳态中起到关键作用。

需要有可用于治疗多种自身免疫疾病的Fc受体拮抗剂，包括FcγRI拮抗剂。具体而言，这类拮抗剂将起到调节免疫和造血系统的功能，因为这类调节的紊乱可涉及与炎症、止血、关节炎、免疫缺陷和其他免疫和造血系统异常相关的病症。因此，需要鉴定并表征这类可用于预防、改善或矫正这些病症的拮抗剂。

发明内容

本发明在一方面提供了一种可溶性杂合Fcγ受体(FcγR)多肽，所述多肽包含与以下氨基酸残基具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列，所述氨基酸残基为SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286，其中所述分离的多肽能与IgG(例如，人IgG，例如人IgG1)的Fc区特异地结合。如本文所描述，本发明的可溶性杂合FcγR多肽能够中和免疫细胞中的IgG介导的或免疫复合物介导的信号传递。在一些实施方案中，所述杂合FcγR多肽包含SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301、39-301、1-301、35-311、36-311、39-311或1-311；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310、48-310、1-310、43-320、48-320或1-320；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286、24-286、1-286、18-296、21-296、24-296或1-296；或SEQ IDNO：46的氨基酸残基18-286、21-286、24-286、1-286、18-296、21-296、24-296或1-296。

本发明在另一方面提供了一种编码本文描述的可溶性杂合FcγR多肽的分离的多核苷酸。一般而言，本发明的分离的多核苷酸编码包含与以下氨基酸残基具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列的可溶性FcγR多肽，所述氨基酸残基为SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286，其中所述编码的多肽能与IgG(例如，人IgG，例如人IgG1)的Fc区特异地结合。在一些实施方案中，所述编码的多肽包含SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301、39-301、1-301、35-311、36-311、39-311或1-311；SEQID NO：42的氨基酸残基43-310、48-310、1-310、43-320、48-320或1-320；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286、24-286、1-286、18-296、21-296、24-296或1-296；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286、24-286、1-286、18-296、21-296、24-296或1-296。在具体的变化方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：39的核苷酸残基103-903、106-903、115-903、1-903、103-933、106-933、115-933或1-933；SEQ ID NO：41的核苷酸残基127-930、142-930、1-930、127-960、142-960或1-960；SEQ ID NO：43的核苷酸残基52-858、61-858、70-858、1-858、52-888、61-888、70-888或1-888；或SEQ ID NO：45的核苷酸残基52-858、61-858、70-858、1-858、52-888、61-888、70-888或1-888。

本发明在另一方面提供了一种表达载体，所述载体包含下列有效连接元件：(a)转录启动子；编码可溶性FcγR多肽的第一DNA区段，所述多肽包含与以下氨基酸残基具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列，所述氨基酸残基为SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286，其中所述分离的多肽能与IgG(例如，人IgG，例如人IgG1)的Fc区特异地结合；和转录终止子。在一些实施方案中，上文公开的所述表达载体还包含与所述第一DNA区段有效连接的分泌信号序列(例如编码以下氨基酸残基的DNA序列：SEQ ID NO：40的氨基酸残基1-34或1-35；SEQ ID NO：42的氨基酸残基1-42；SEQ ID NO：44的氨基酸残基1-17或1-20；SEQ ID NO：46的氨基酸残基1-17或1-20；SEQ ID NO：60的氨基酸残基1-35；SEQ ID NO：62的氨基酸残基的1-16；SEQ ID NO：64的氨基酸残基1-19；或SEQ IDNO：66氨基酸残基的1-23)。在一些实施方案中，所述编码的多肽包含SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301、39-301、1-301、35-311、36-311、39-311或1-311；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310、48-310、1-310、43-320、48-320或1-320；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286、24-286、1-286、18-296、21-296、24-296或1-296；SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286、24-286、1-286、18-296、21-296、24-296或1-296；SEQ ID NO：60的氨基酸残基36-301或1-301；或SEQ ID NO：66的氨基酸残基24-289或1-289。在具体的变化方案中，编码所述多肽的DNA区段包含SEQ ID NO：39的核苷酸残基103-903、106-903、115-903、1-903、103-933、106-933、115-933或1-933；SEQ ID NO：41的核苷酸残基127-930、142-930、1-930、127-960、142-960或1-960；SEQ ID NO：43的核苷酸残基52-858、61-858、70-858、1-858、52-888、61-888、70-888或1-888；SEQ ID NO：45的核苷酸残基52-858、61-858、70-858、1-858、52-888、61-888、70-888或1-888；SEQ ID NO：59的核苷酸残基106-903或1-903；或SEQ ID NO：65的核苷酸残基70-867或l-867。

本发明在另一方面提供了一种培养的细胞，包含上文公开的表达载体，其中所述细胞表达由所述DNA区段编码的可溶性FcγR多肽。在另一个实施方案中，所述培养的细胞如上文所公开，其中所述细胞分泌可溶性FcγR多肽。在另一个实施方案中，所述培养的细胞如上所公开，其中所述细胞分泌结合IgG或拮抗IgG活性的可溶性FcγR多肽，其中所述IgG以单体形式或作为多体免疫复合物存在。在具体的变化方案中，所述培养的细胞是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

本发明在另一个方面提供了一种制备可溶性杂合FcγR多肽的方法，所述方法包括以下步骤：(a)培养上文公开的细胞；并且(b)分离由所述细胞产生的可溶性FcγR多肽。在一些实施方案中，所述方法包括培养上述表达载体已经被导入其中的细胞，其中所述细胞表达由所述DNA区段编码的多肽，并回收所表达的多肽。在一些变化方案中，所述表达载体还包括与所述DNA区段有效连接的分泌信号序列，其中所述细胞表达由所述DNA区段编码的多肽，并且其中所述多肽由所述细胞分泌并被回收。

本发明在另一个方面提供了包含可药用的载体和本发明的可溶性杂合FcγR多肽的药物组合物。

本发明在另一个方面还提供了包含可溶性杂合FcγR多肽和异源多肽区段的融合蛋白。特别合适的异源多肽区段包括免疫球蛋白部分。在一些变化方案中，所述免疫球蛋白部分是免疫球蛋白重链恒定区，例如人Fc区段。本发明还包括编码这类融合蛋白的分离的核酸分子。

本发明在另一个方面提供了一种抑制IgG诱导的或免疫复合物诱导的造血细胞和造血细胞祖细胞增殖的方法，所述方法包括用包含可溶性FcγR的组合物培养骨髓或外周血细胞，其中所述可溶性FcγR的量与不存在可溶性受体时培养的骨髓或外周血细胞相比足以降低骨髓或外周血细胞中的造血细胞的增殖。在一个实施方案中，所述方法如上文所公开，其中所述造血细胞和造血祖细胞是淋巴样细胞。在一个实施方案中，所述方法如上文所公开，其中所述淋巴样细胞是巨噬细胞、B细胞或T细胞。本发明在另一个方面提供了一种用包含可溶性FcγR的组合物来抑制通过例如巨噬细胞或单核细胞等骨髓谱系细胞的抗原呈递的方法，其中所述可溶性FcγR的量足以降低髓源细胞(myeloid-derived cell)的抗原呈递。在另一个实施方案中，所述方法如所公开，其中所述细胞是B细胞。

本发明在另一方面提供了一种减轻IgG介导的或免疫复合物介导的炎症的方法，所述方法包括向有炎症的哺乳动物给予其量足以减轻炎症的可溶性FcγR的组合物。

本发明在另一方面提供了一种抑制哺乳动物的免疫反应的方法，所述方法包括给予包含在可药用载体中的可溶性FcγR多肽的组合物。

此外，阻断细胞表面FcγR和免疫复合物的IgG Fc区的相互作用将减弱对免疫复合物的细胞反应并因此减轻炎症。因此，本发明的可溶性FcγR多肽——它们如本文所示可有效阻断IgG介导的和免疫复合物介导的免疫反应——可用于治疗炎性疾病，例如关节炎(例如类风湿性关节炎或银屑病性关节炎)、成人呼吸系统疾病(ARD)、内毒素血症、感染性休克、多器官功能衰竭、炎性肺损伤(inflammatory lung injury)(例如哮喘或支气管炎)、细菌性肺炎、银屑病、湿疹、特应性皮炎、接触性皮炎、炎性肠病(IBD)(例如溃疡性结肠炎或克罗恩病)和对细菌或病毒感染的异常免疫反应。

通过参考以下的具体描述将会明白本发明的这些方面和其他方面。此外，本文中标出的多篇参考文献都以引用的方式全文纳入本文。

定义

除非另作定义，否则本文使用的所有科技术语与所述方法和组合物相关领域的技术人员通常理解的含义相同。如本文所用，除非另作说明，以下术语和短语具有对其描述的含义。

本文所使用的“核酸”或”核酸分子”指多核苷酸，例如脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)、寡核苷酸、通过聚合酶链式反应(PCR)生成的片段，和通过任何连接反应、裂解反应、内切核酸酶作用和外切核酸酶作用中的任一作用生成的片段。核酸分子可由天然存在的核苷酸单体构成(例如DNA和RNA)，或者可由天然存在的核苷酸的类似物构成(例如天然存在的核苷酸的α对映体形式)，或由它们的组合构成。经修饰的核苷酸可以在其糖部分和/或嘧啶碱基或嘌呤碱基部分被修饰。糖修饰包括例如用卤素、烷基、胺基和叠氮基取代一个或多个羟基，或者将糖官能化为醚或酯。此外，整个糖部分都可以被立体结构上或电子学上相似的结构所取代，例如氮杂糖和碳环糖类似物。碱基部分的修饰的实例包括烷基化的嘌呤和嘧啶、酰基化的嘌呤或嘧啶或其他公知的杂环取代物。核酸单体可以通过磷酸二酯键相连接或者通过这类键的类似物相连接。磷酸二酯键的类似物包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸硒酰酯(phosphoroselenoate)、磷酸二硒酰酯(phosphorodiselenoate)、硫代苯胺磷酸酯(phosphoroanilothioate)、酰苯胺磷酸酯(phosphoranilidate)，氨基磷酸酯等等。术语“核酸分子”还包括所谓的“肽核酸”，所述肽核酸包括与聚酰胺主链相连的天然存在的或经修饰的核酸碱基。核酸可为单链核酸或双链核酸。

术语“核酸分子的互补体”指的是具有与参照核苷酸序列反向互补的核苷酸序列的核酸分子。

术语“简并核苷酸序列”指的是与编码一种多肽的参照核酸分子相比具有一个或多个简并密码子的核苷酸序列。简并密码子具有不同的核苷酸三联体，但是却编码相同的氨基酸残基(即GAU和GAC三联体均编码Asp)。

术语“结构基因”指的是这样一种核酸分子，它会被转录为信使RNA(mRNA)，该信使RNA随后被翻译为具体多肽的特征性氨基酸序列。

“分离的核酸分子”为未整合在生物体基因组DNA中的核酸分子。例如，从细胞的基因组DNA中分离出来的编码生长因子的DNA分子就是一种分离的DNA分子。分离的核酸分子的另一个实例为未整合在生物体基因组中的化学合成的核酸分子。从具体物种中分离的核酸分子要小于该物种染色体的完整DNA分子。

“核酸分子构建体”为一种单链或双链的核酸分子，它经过人类干预而被修饰，从而含有以自然界中不存在的排列方式组合和并置的核酸区段。

“线性DNA”是指具有游离的5’和3’末端的非环状DNA分子。线性DNA可以从例如质粒的闭合环状DNA分子通过酶消化或物理破坏来制备。

“互补DNA(cDNA)”为从mRNA模板通过反转录酶制备生成的单链DNA分子。一般而言，使用与mRNA的一部分互补的引物来启动反转录。本领域技术人员还使用术语“cDNA”来指由这种单链DNA分子及其互补DNA链组成的双链DNA分子。术语“cDNA”还指从RNA模板合成的cDNA分子的克隆。

“启动子”为指导结构基因的转录的核苷酸序列。一般而言，启动子位于基因的5’非编码区，接近结构基因的转录起始位点。具有启动转录功能的启动子中的序列元件通常以共有核苷酸序列为特征。这些启动子元件包括：RNA聚合酶结合位点、TATA序列、CAAT序列、分化特异性元件(DSE；McGehee et al.，Mol.Endocrinol.7：551(1993))、环AMP应答元件(CRE)、血清应答元件(SRE；Treisman，Seminars in Cancer Biol.1：47(1990))、糖皮质激素应答元件(GRE)，以及其他转录因子的结合位点，例如CRE/ATF(O′Reilly et al.，J.Biol.Chem.267：19938(1992))、AP2(Ye et al.，J.Biol.Chem.269：25728(1994))、SP1、cAMP应答元件结合蛋白(CREB；Loeken，Gene Expr.3：253(1993))和八聚体因子(综述可参见Watson et al.，eds.，Molecular Biology of the Gene，4th ed.(TheBenjamin/Cummings Publishing Company，Inc.1987)和Lemaigre和Rousseau，Biochem.J.303：1(1994))。如果启动子为一种诱导型启动子，那么转录的水平会响应于诱导剂而提高。与此不同的是，如果启动子为组成型启动子，那么其转录水平就不受诱导剂的调节。抑制型启动子也是已知的。

“核心启动子”包括启动子功能所必需的核苷酸序列，包括TATA盒和转录起点。根据这一定义，核心启动子在缺少可增强活性或赋予组织特异性活性的具体序列时可能具有或不具有可检测的活性。

“调控元件”为调节核心启动子活性的核苷酸序列。例如，调控元件可包括能与下述的细胞因子结合的核苷酸序列，所述细胞因子可以使转录专一地或优先地在具体细胞、组织或细胞器中进行。这些类型的调控元件通常与以“细胞特异性”、“组织特异性”或“细胞器特异性”方式表达的基因相关联。

“增强子”是一类能提高转录效率的调控元件，所述转录效率的提高与增强子相对于转录起始位点的距离或方向没有关系。

“异源DNA”指的是并不天然存在于给定宿主细胞中的一种DNA分子或一群DNA分子。对于具体宿主细胞而言异源的DNA分子可以含有来源于宿主细胞物种的DNA(即内源DNA)，前提是宿主DNA与非宿主DNA(即外源DNA)相组合。例如，含有与包括转录启动子的宿主DNA区段有效连接的编码多肽的非宿主DNA区段的DNA分子就被认为是异源DNA分子。反过来，异源DNA分子可以包括与外源启动子有效连接的内源基因。作为另一实例，如果一种包括来源于野生型细胞的基因的DNA分子被引入缺少该野生型基因的突变体细胞中，则这种DNA分子也被认为是异源DNA。

“多肽”为氨基酸残基通过肽键连接形成的聚合物，包括天然形成的多肽和合成多肽。少于约10个氨基酸残基的多肽一般被称为“肽”。

在多肽情况下，术语“片段”为多肽的一部分，一般具有所述多肽的至少20个连续的或至少50个连续的氨基酸。“变体”包括相对于另一多肽具有氨基酸置换(例如，保守氨基酸置换)的多肽或其片段；或者通过共价连接另一分子修饰的多肽或其片段，例如通过连接异源多肽，或者通过糖基化、乙酰化、磷酸化等。“多肽”的定义还包括例如包含一个或多个氨基酸类似物(例如，非天然氨基酸等)的多肽、具有非取代键以及本领域已知的其他修饰的天然或非天然存在的多肽。

“蛋白质”是包括一个或多个多肽链的大分子。蛋白质也可能含有非肽组分例如糖类基团。产生蛋白质的细胞可能将糖类取代基和其他非肽类取代基引入到所述蛋白质中，并且所述取代基会因细胞类型而异。本文中定义的蛋白质是根据它们的氨基酸主链结构定义的；通常并不特别指明例如糖类基团等取代基，但是它们可以存在。

由非宿主DNA分子编码的肽或多肽为“异源”肽或多肽。

“克隆载体”为能够在宿主细胞中自主复制的核酸分子，例如质粒、粘粒或噬菌体。克隆载体通常含有一个或少数几个限制性内切核酸酶识别位点，从而可以以确定性方式插入核酸分子而不丧失载体基本的生物学功能，也可以插入编码标记基因的核苷酸序列，所述标记基因适用于识别和筛选被所述克隆载体转化的细胞。标记基因一般包括提供四环素抗性或氨苄青霉素抗性的基因。

“表达载体”为编码在宿主细胞中表达的基因的核酸分子。一般而言，表达载体包括一个转录启动子、一个基因和一个转录终止子。基因的表达通常处于启动子的控制之下，这样的基因被称为与启动子“有效连接”。类似地，如果一个调控元件调节一个核心启动子的活性，则该调节元件与该核心启动子有效连接。

“重组宿主”为含有异源核酸分子例如克隆载体或表达载体的细胞。在本文中，重组宿主的一个实例为通过表达载体产生可溶性杂合FcγR的细胞。

“整合转化体”为异源DNA被整合到细胞的基因组DNA中的重组宿主细胞。

“融合蛋白”为由包括至少两个基因的核苷酸序列的核酸分子所表达的杂合蛋白。例如，融合蛋白可以包括与一种可结合亲和基质的多肽相融合的FcγR多肽的至少一部分。这样的融合蛋白为使用亲和色谱分离大量FcγRIA提供了一种手段。

术语“受体”指的是与被称为“配体”的生物活性分子相结合的细胞相关蛋白。这种相互作用介导了配体对细胞的作用。受体可为膜结合受体、细胞溶质受体或核受体；单体受体(例如促甲状腺激素受体、β-肾上腺素能受体)或多聚体受体(例如PDGF受体、生长激素受体、IL-3受体、GM-CSF受体、G-CSF受体、红细胞生成素受体和IL-6受体)。膜结合受体的特征在于具有多结构域结构，包括胞外配体结合结构域和通常参与信号转导的胞内效应结构域。在某些膜结合受体中，胞外配体结合结构域和胞内效应结构域位于构成完整功能性受体的不同多肽中。

一般而言，配体与受体的结合会导致受体的构象变化，所述构象变化会引起效应结构域和细胞内其他分子之间的相互作用，这又会导致细胞代谢的变化。通常与受体-配体相互作用相关的代谢事件包括：基因转录、磷酸化、去磷酸化、环AMP产量提高、细胞钙动员、膜脂质动员、细胞粘附、肌醇脂质的水解和磷脂的水解。

“可溶性受体”是不与细胞膜结合的受体多肽。可溶性受体为最常见的结合配体的受体多肽，其没有跨膜结构域和细胞质结构域，也没有其他连接方式例如通过糖基磷脂酰肌醇(gpi)与细胞膜相连。可溶性受体可包括附加的氨基酸残基，例如提供用于纯化多肽的亲和标签，或者提供用于连接多肽与底物的位点的亲和标签，或免疫球蛋白恒定区序列。许多细胞表面受体具有天然存在的可溶性对应物，它们是由蛋白水解产生的或由以其他方式剪接的mRNA翻译产生。可溶性受体可为单体、同二聚体、异二聚体或多聚体的形式，多聚体受体通常包括不多于9个亚基、优选地包括不多于6个亚基、最优选地包括不多于3个亚基。当受体多肽没有足够的跨膜和胞内多肽区段部分来分别提供膜锚定或信号转导时，就称所述受体多肽基本上没有跨膜和胞内多肽区段。此外，本领域技术人员通过遗传密码子可以容易地确定编码这类可溶性受体多肽的多核苷酸。

术语“分泌信号序列”指的是编码这样一种肽(“分泌肽”)的DNA序列，所述肽作为一种较大多肽的一个组成，指引所述较大多肽通过合成该多肽的细胞的分泌途径。所述较大多肽通常在移行通过所述分泌途径中被切割以除去所述分泌肽。

“分离的多肽”为基本上不含夹杂的细胞组分的多肽，所述夹杂的细胞组分例如天然状态下与所述多肽共存的糖类、脂类或其他蛋白质性质的杂质。一般而言，分离的多肽制品所含有的所述多肽的纯度很高，即至少约80％纯度，至少约90％纯度、至少约95％纯度、高于95％纯度，例如96％、97％或98％或更高的纯度，或高于99％的纯度。显示某种具体蛋白制品含有分离的多肽的一种方法是对所述蛋白质制品进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳并对所述凝胶进行考马斯亮蓝染色之后，出现单一条带。然而，术语“分离的”并不排除同一种多肽以不同物理形式存在，例如以二聚体形式、糖基化或衍生化形式存在。

本文中使用的术语“氨基末端”和“羧基末端”指的是多肽中的位置。在上下文允许的情况下，在提及多肽的某一具体序列或部分时使用这些术语，用于表示相近或相关的位置。例如，某一序列位于多肽内一参照序列的羧基末端是指其位置接近所述参照序列的羧基末端，但并不一定是位于整个多肽的羧基末端。

术语“表达”指的是基因产物的生物合成。例如，对于结构基因而言，表达包括将所述结构基因转录为mRNA和所述mRNA翻译为一个或多个多肽。

本文中使用的术语“剪接变体”指的是从一个基因转录而得的RNA的可变形式。在天然情况下，剪接变异通过利用转录的RNA分子内的可变剪接位点而产生，或者，在少数情况下，剪接变异通过利用独立转录的RNA分子之间的可变剪接位点产生，并且可从同一基因转录出几种mRNA。剪接变体可能编码氨基酸序列被改变的多肽。本文中还使用术语剪接变体表示由基因转录而来的mRNA剪接变体所编码的多肽。

本文所使用的术语“免疫调节剂”包括细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、共刺激分子、造血因子等，还包括上述分子的合成类似物。

本文所使用的“治疗剂”为与抗体部分相缀合而产生可用于治疗的缀合物的分子或原子。治疗剂的实例包括药物、毒素、免疫调节剂、螯合剂、硼化合物、光活化剂或染料以及放射性同位素。

“可检测标记”为与抗体部分缀合而产生可用于诊断的分子的分子或原子。可检测标记的实例包括螯合剂、光活化剂、放射性同位素、荧光试剂、顺磁性离子或其他标记部分。

本文使用的术语“亲和标签”指的是这样一种多肽区段，它可以与另一多肽连接，从而使得可以纯化或检测所述另一多肽或者提供使所述另一多肽与底物连接的位点。原则上可以使用其抗体或其他特异性结合物可获得的任何肽或蛋白作为亲和标签。亲和标签包括多组氨酸链、蛋白A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smith and Johnson，Gene 67：31(1988))、Glu-Glu亲和标签(Grussenmeyer et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA82：7952(1985))、P物质、FLAG肽(Hopp et al.，Biotechnology 6：1204(1988))、链亲和素结合肽或其他抗原性表位或结合结构域。总体上可参见Ford et al.，Protein Expession andPurification 2：95(1991)。编码亲和标签的DNA分子是可从供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)处购买的。

在Fcγ受体多肽或Fcγ受体多肽区域的上下文中，与另一序列(例如，区域、片段、核苷酸或氨基酸位置等)“对应”是基于下述惯例：根据核苷酸或氨基酸位置序号进行编号，然后以使序列同一性百分比最大化的方式将所述序列比对。由于并不是给定“对应区域”内的所有位点都必须相同，在对应区域中的不匹配位置可看作是“对应位置”。因此，如本文所用，提及与具体Fcγ受体蛋白的“氨基酸位置[X]对应的氨基酸位置”是表示，除了提及所述具体Fcγ受体蛋白的氨基酸位置之外，还提及在其他公认的Fcγ受体蛋白和结构同源物和家族中的等价位置的集合。

在两个或多个核酸或者多肽序列的上下文中，术语“同一的”或“同一性百分数”是指在比较窗口或指定区域进行最大对应的比较和比对时，两条或多条序列或亚序列相同或具有述及百分比的相同核苷酸或氨基酸残基(例如，在述及区域有至少60％的同一性，可选地至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％或至少95％的同一性)，所述同一性使用以下的序列比较算法或通过人工比对和肉眼检查来测量。若序列具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的同一性，那么所述序列彼此是“基本同一的”。这些定义同样指测试序列的互补序列。可选地，所述同一性存在于长度为至少约50个核苷酸的区域，或者更一般存在于长度为100个至500个或1000个或更多个核苷酸的区域。

序列比较可以使用标准软件程序进行，例如由DNASTAR(Madison，Wisconsin)生产的LASERGENE生物信息学软件包中所含有的软件。其他通过确定最优比对而比较两个核苷酸或氨基酸序列的方法是本领域技术人员公知的(参见，例如，Peruski and Peruski，The Internet and the NewBiology：Tools for Genomic and Molecular Research(ASM Press，Inc.1997)，Wu et al.(编著)，“Information Superhighway and ComputerDatabases of Nucleic Acids and Proteins”见于Methods in GeneBiotechnology第123-151页(CRC Press，Inc.1997)和Bishop(编著)，Guide to Human Genome Computing，第2版(Academic Press，Inc.1998))。如果两个核苷酸或氨基酸序列互相之间具有至少80％、至少90％或至少95％序列同一性，则认为所述两个序列具有“基本相似的序列同一性”或“序列基本相同”。

序列同一性百分数可通过常规方法测定。参见例如，Altschul et al.，Bull.Math.Bio.48：603(1986)和Henikoff and Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1992)。例如，使用空位开放罚分为10，空位延伸罚分为1，并使用表1(用标准单字母编码表示氨基酸)所示的Henikoff和Henikoff(见上文)的“BLOSUM62”评分矩阵，将两个氨基酸序列进行比对以优化比对分数。然后将同一性百分数按下式计算：([一致匹配的总数]/[较长序列的长度+为比对两序列而在较长序列中引入的空位数])(100)。

表1：BLOSUM62评分矩阵

本领域技术人员了解有多种业已确定的算法可以用于比对两个氨基酸序列。Pearson和Lipman的“FASTA”相似性搜索算法就是一种合适的蛋白质比对方法，可用于检测本文公开的氨基酸序列和另外的氨基酸序列共有的同一性水平。FASTA算法描述于Pearson and Lipman，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)和Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)。简而言之，FASTA首先在不考虑保守性氨基酸置换、插入或缺失的条件下，识别查询序列(例如SEQ ID NO：40的残基39-301、SEQ IDNO：42的残基48-310、SEQ ID NO：44的残基24-286或SEQ ID NO：46的残基24-286)和测试序列共有的、具有最高密度同一性(highest densityof identities)(在ktup变量＝1时)或同一性对(pairs of identities)(在ktup＝2时)的区域，从而表征序列相似性。然后通过使用氨基酸置换矩阵比较所有配对的氨基酸的相似性，对具有最高密度同一性的十个区域进行再评分，并将各区域的末端“修剪”为仅包括那些对最高评分有贡献的残基。如果有一些区域的得分高于“阈(cutoff)”值(通过预定的公式基于序列长度和ktup值计算得出)，则检测修剪后的初始区域以确定这些区域是否参与形成有空位的近似比对。最后，使用改进的Needleman-Wunsch-Sellers算法(Needleman and Wunsch，J.Mol.Biol.48：444(1970)；Sellers，SIAM J.Appl.Math.26：787(1974))比对所述两个氨基酸序列的得分最高的区域，该算法中考虑了氨基酸插入和缺失。FASTA分析的示例性参数为：ktup＝1、空位开放罚分＝10、空位延伸罚分＝1以及置换矩阵＝BLOSUM62。可以如Pearson，Meth.Enzymol.183：63(1990)的附录2所述，通过修改评分矩阵文件(“SMATRIX”)，将上述参数引入FASTA程序中。

也可以使用上文公开的比值，将FASTA用于测定核酸分子的序列同一性。对于核苷酸序列比对而言，ktup值可为1至6、优选地为3至6、最优选地为3，其他参数的设置同上所述。

“保守性氨基酸置换”通常指的是BLOSUM62值大于-1的氨基酸置换。BLOSUM62表(表1，见上文)为来源于蛋白质序列区段的约2000次局部多重比对的氨基酸置换矩阵，代表了多于500组相关蛋白质的高度保守区域(Henikoff and Henikoff，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA89：10915(1992))。因此，可以使用BLOSUM62置换频率来确定可被引入到具体氨基酸序列中的保守性氨基酸置换。例如，如果一氨基酸置换的特征是BLOSUM62值为0、1、2或3，则该置换是保守的。根据这一体系，优选的保守性氨基酸置换的特征是BLOSUM62值至少为1(例如1、2或3)，而更优选的保守性氨基酸置换的特征是BLOSUM62值至少为2(例如2或3)。

当“对应于”一词用于提及核苷酸或氨基酸序列时，表示当对两个序列最优比对时与参照位置对齐的另一序列中的位置。

对于本文描述的FcγR多肽，提及与通过SEQ ID NO指定的氨基酸残基对应的氨基酸残基时，包括这些残基的翻译后修饰。例如，提及与SEQ ID NO：2的位置16对应的位置处的谷氨酰胺时，包括该谷氨酰胺翻译后修饰成的焦谷氨酸。

本文所使用的“免疫复合物”是指IgG抗体与其同族抗原(cognateantigen)结合形成的复合物。本文使用的术语“免疫复合物”包括所有化学计量(stoichiometric)的抗原：抗体复合物。例如，免疫复合体可包括结合于抗原的单个IgG抗体(单体IgG)或者可包括结合于抗原的多个IgG抗体(多聚体免疫复合物)。

本文所使用的“IgG介导的炎症”是指至少部分由免疫复合物通过所述免疫复合物内包含的IgG抗体的Fc区与Fcγ受体结合所介导的炎性反应。“IgG介导的炎症”还包括IgG免疫复合物对补体途径的活化。

本文所使用的“免疫复合物介导的炎症”是指至少部分以免疫复合物在一个或多个组织中沉淀为特征的IgG介导的炎症。

本文所使用的“IgG介导的疾病”或“IgG介导的炎性疾病”是指至少部分由免疫复合物通过所述免疫复合物内包含的IgG抗体的Fc区与Fcγ受体结合所介导的炎性疾病。“IgG介导的疾病”或“IgG介导的炎性疾病”还包括部分以IgG免疫复合物活化补体途径为特征的疾病。

本文所使用的“自身免疫疾病”是指至少部分以存在IgG自身抗体——即对一种或多种自身抗原特异的IgG抗体——为特征的IgG介导的炎性疾病。自身免疫疾病包括，例如与自身抗体产生相关并与免疫复合物在一个或多个组织中沉淀相关的疾病；这类疾病包括，例如系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和混合型结缔组织病。自身免疫疾病还包括与自身抗体产生相关但与免疫复合物沉淀不明显相关的疾病，例如特发性血小板减少性紫癜(ITP)、斯耶格伦氏综合征、抗磷脂抗体综合征(antiphospholipid antibody syndrome)、皮肌炎、格-巴综合征和古德帕斯彻综合征。其他自身免疫疾病包括，例如炎性肠病(IBD)、银屑病、特应性皮炎、重症肌无力、I型糖尿病和多发性硬化。

本文使用的“免疫复合物介导的疾病”是指至少部分以免疫复合物在一个或多个组织中沉淀为特征的IgG介导的炎性疾病。免疫复合物介导的疾病包括，例如混合型冷球蛋白血症、系统性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)、混合型结缔组织病；以及与外源性抗原相关的疾病例如HBV相关结节性多动脉炎(hepatitis-B-associated polyarteritisnodosa)。

由于标准分析方法不精确，聚合物的分子量和长度应理解为近似值。当这样的数值用“约”X或“近似”X表示时，所述X值应理解为精确至±10％。

附图说明

图1描述了在体外用FcγRIA-CH6阻断免疫复合物沉淀。如下文实施例9所述进行抗-OVA/OVA免疫复合物沉淀分析。每个点代表一式二份地进行的3个独立实验的平均值。圆圈：抗-OVA+OVA；三角：抗-OVA+OVA+500nM FcγRIA-CH6；正方形：抗-OVA+OVA+1500nMFcγRIA-CH6。

图2A-2D描述了用FcγRIA-CH6抑制肥大细胞中免疫复合物介导的炎性细胞因子的产生。在存在逐渐增量的FcγRIA-CH6(“pFCGRIACH6”)下将鼠MC/9肥大细胞与抗-OVA/OVA免疫复合物孵育，并如下文实施例9所描述测定炎性细胞因子的分泌。每个点代表两次检测的平均值并代表两次独立实验。

图3A-3C描述了用FcγRIA-CH6抑制在鼠阿尔图斯反应中免疫复合物介导的水肿和中性粒细胞浸润。使用皮内送递兔抗-卵白蛋白和尾静脉注射卵白蛋白在小鼠中建立皮肤逆转被动阿尔图斯反应(参见下文实施例9)。动物仅接受抗-OVA或接受抗-OVA和标明量的FcγRIA-CH6(“pFCGRIA CH6”)，评估FcγRIA-CH6对免疫复合物介导的水肿和中性粒细胞浸润的效应(参见同上)。每个柱表示每组n＝8只动物的平均值±SD。0.1×、1.0×和7.0×pFCGRIA-CH6表示相对于注射的抗-OVA的量加入摩尔过量的FcγRIA-CH6，分别等价于1.3μg、13.0μg和91.0μg的FcγRIA-CH6。

图4描述了用全身送递FcγRIA-CH6抑制小鼠阿尔图斯反应中的炎症。在启动阿尔图斯反应前1小时，对小鼠仅注射标明量的运载体或者注射含有标明量FcγRIA-CH6(“pFCGRIA CH6”)的运载体(参见下文实施例9)。通过静脉内注射进行FcγRIA-CH6的全身给药，用皮内送递兔抗-卵白蛋白进行皮肤逆转被动阿尔图斯反应，如实施例9所述。通过抗-OVA诱导的伊文思蓝(Evan′s Blue dye)染料外渗测量水肿。每个柱代表n＝8只小鼠(静脉内注射FcγRIA-CH6)或n＝4只小鼠(皮内注射FcγRIA-CH6)的平均值±SD。使用的缩写为：iv＝静脉内；id＝皮内。

图5描述了用全身送递FcγRIA-CH6抑制小鼠阿尔图斯反应中的水肿。在启动阿尔图斯反应前1小时向小鼠仅注射标明量的运载体或者注射含有标明量FcγRIA-CH6(“pFCGRIA CH6”)的运载体(参见下文实施例9)。通过静脉内注射进行FcγRIA-CH6的全身给药，用皮内送递兔抗-卵白蛋白进行皮肤逆转被动阿尔图斯反应，如实施例9所述。通过抗-OVA诱导的损伤部位组织重量增加测量水肿。每个柱代表n＝8只小鼠(静脉内注射FcγRIA-CH6)或n＝4只小鼠(皮内注射FcγRIA-CH6)的平均值±SD。数据表示为注射非免疫性IgG情况下的相对值。使用的缩写为：iv＝静脉内；id＝皮内。

图6A-6D描述了FcγRI序列。图6A显示了编码FcγRIA(FcγRI同种型a)的多核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。图6B显示了FcγRIA的多肽序列(SEQ ID NO：2)。图6C显示了FcγRIA胞外结构域的多肽序列(SEQ ID NO：3)。图6D显示了FcγRIA多肽序列与FcγR1同种型b1多肽序列(SEQ ID NO：4)和c多肽序列(SEQ ID NO：5)的比较。图6D中的竖线指示在相应基因中内含子所处的位置；三角形指示可溶性FcγRIA的一个具体实施方案的C末端氨基酸或者，可选地，可溶性FcγRIA的某些标记的变体(例如，His6-标记的FcγRIA)的C末端融合位点。图6D中氨基酸位置16处的谷氨酰胺(Q)上方的“16”表示成熟FcγRIA蛋白的氨基末端起始位点。

图7描述了用FcγRIA-CH6降低胶原抗体诱导的关节炎小鼠模型中的爪评分。如下文在实施例11中所述描述，通过用Arthrogen-CIA抗体混合物处理在小鼠中建立胶原抗体诱导的关节炎。小鼠还隔天接受皮下注射仅运载体(PBS)或含有标明浓度FcγRIA-CH6(“pFCGR1ACH6”)的运载体，持续共5剂。每个点代表每组n＝8只小鼠的平均值±SEM。重复测量ANOVA表明组间差异显著。

图8描述了用FcγRIA-CH6降低胶原抗体诱导的关节炎小鼠模型中的爪厚度。如下文在实施例11中所述描述，通过用Arthrogen-CIA抗体混合物处理在小鼠中建立胶原抗体诱导的关节炎。小鼠还隔天接受皮下注射仅运载体(PBS)或含有标明浓度FcγRIA-CH6(“pFCGR1ACH6”)的运载体，持续共5剂。每个点代表每组n＝8只小鼠的平均值±SEM。重复测量ANOVA表明组间差异显著。

图9A-9C描述了FcγRIA-CH6而非FcγRIIA-CH6或FcγRIIIA-CH6减少阿尔图斯反应中的炎症。实验如下文实施例9和10所描述进行。数据表示为从每个点减去非免疫性IgG的值后在仅存在抗-OVA下观察到的数据的相对值。每个点FcγRIA(●)、FcγRIIA(▲)、FcγRIIIA(■)代表来自6次独立实验的n＝8-16个损伤部位的平均值±SEM(图9A和9B)和n＝5-13个损伤部位的平均值±SEM(图9C)。差异显著，全部剂量均＊p＜0.0001(通过ANOVA)。

图10描述了通过以FcγRIA处理降低关节炎疾病评分。如下文实施例13所描述，在小鼠中建立胶原诱导的关节炎(CIA)。一旦既定疾病(established disease)出现，将小鼠用仅运载体(PBS)(○)或含有0.22mg或2.0mg的FcγRIA-CH6(“FCGR1A”)的运载体处理(参见下文实施例13)。每个点代表每组7-13只动物的平均值±SE。差异显著，＊p＜0.0001(通过重复测量ANOVA)。

图11描述了用延长的FcγRIA剂量方案降低关节炎评分。如下文实施例13所描述，在小鼠中建立胶原诱导的关节炎(CIA)。将小鼠仅用运载体(○)或用含有2.0mg的FcγRIA的运载体每2天(■)或每4天(▲)处理(参见下文实施例13)。每个点代表每组7-13只动物的平均值±SE。差异显著，^＊p＝0.0125，^＊＊p＝0.001(通过重复测量ANOVA)。每4天给药持续共11天。

图12描述了用FcγRIA处理减少关节炎爪数量。如下文实施例13所描述，在小鼠中建立胶原诱导的关节炎(CIA)。将小鼠用仅运载体(PBS)(○)或含有0.22mg FcγRIA(▲)或2.0mg的FcγRIA的运载体每2天处理(参见下文实施例13)。每个点代表每组7-13只动物的平均值。

图13A-13D描述了通过与可溶性天然FcγRIA和可溶性杂合FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA受体孵育在培养的肥大细胞中抑制免疫复合体介导的细胞因子产生。在存在逐渐增量的可溶性天然FcγRIA(“天然FCGR1A”)或2种可溶性杂合受体——FcγRIIA/IA-CH6(“FCGR2A1A”)和FcγRIIIA/IA-CH6(“FCGR3A1A”)——之一的情况下，将鼠MC/9肥大细胞与抗-OVA/OVA免疫复合物孵育，并如下文实施例22所描述检测炎性细胞因子IL-6(图13A)、IL-13(图13B)、TNFα(图13C)和MCP-1(图13D)的分泌。

图14A和14B描述了用可溶性天然FcγRIA和可溶性杂合受体FcγRIIA/IA抑制鼠阿尔图斯反应中免疫复合物介导的水肿。使用皮内送递送兔抗-卵白蛋白和尾静脉注射卵白蛋白在小鼠中建立皮肤逆转被动阿尔图斯反应(参见下文实施例22)。动物仅接受抗-OVA或者接受抗-OVA和标明量的可溶性天然FcγRIA(“天然FCGR1A”)或可溶性杂合受体FcγRIIA/IA-CH6(“FCGR2A1A”)，通过测量伊文思蓝面积的减少(图14A)或损伤部位组织重量的减轻(图14B)评估每种可溶性受体对免疫复合物介导的水肿的效应(参见同上)。每个点代表每组n＝6只动物的平均值±SD。相对于仅抗-OVA，差异显著，^＊p＜0.001(通过ANOVA)。

图15A和15B描述了用可溶性天然FcγRIA和可溶性杂合受体FcγRIIIA/IA抑制小鼠皮肤阿尔斯图反应中免疫复合物介导的水肿。使用皮内送递兔抗-卵白蛋白和尾静脉注射卵白蛋白在小鼠中建立皮肤逆转被动阿尔图斯反应(参见下文实施例22)。动物仅接受抗-OVA或者接受抗-OVA和标明量的可溶性天然FcγRIA(“天然FCGR1A”)或可溶性杂合受体FcγRIIIA/IA-CH6(“FCGR3A1A”)，通过测量伊文思蓝面积的减少(图15A)或损伤部位组织重量的减轻(图15B)评估每种可溶性受体对免疫复合物介导的水肿的效应(参见同上)。每个点代表每组n＝6只动物的平均值±SD。差异显著，^＊p＜0.001(通过ANOVA)。

图16A和16B描述了用可溶性天然FcγRIA和可溶性杂合受体FcγRIIA/IA-CH6和FcγRIIIA/IA-CH6抑制小鼠皮肤阿尔图斯反应中的中性粒细胞浸润。使用皮内送递兔抗-卵白蛋白和尾静脉注射卵白蛋白在小鼠中建立皮肤逆转被动阿尔图斯反应(参见下文实施例22)。动物仅接受抗-OVA或者接受抗-OVA和标明量的可溶性天然FcγRIA(“FCGR1A”；图16A和16B)或可溶性杂合受体FcγRIIA/IA-CH6(“FCGR2A 1A”；图16A)和FcγRIIIA/IA-CH6(“FCGR3A 1A”；图16B)的一种，通过测量穿孔活检样本的髓过氧化物酶活性评估中性粒细胞浸润。每个点代表每组n＝6只动物的平均值±SD。差异显著，通过ANOVA^＊p＜0.001，通过Mann-Whitney检验^＊＊p＜0.001。

具体实施方式

I.总论

本发明通过提供Fcγ受体拮抗剂满足了对用于治疗IgG介导的和免疫复合物介导的疾病的新型疗法的需要。具体而言，本发明的Fcγ受体拮抗剂是包含修饰的FcγRIA胞外结构域的可溶性杂合受体，所述FcγRIA中的第一Ig结构域(D1)被FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第一Ig结构域代替。这类杂合受体保持天然FcγRIA的高亲和力结合，并且可用于减轻IgG介导的炎症——包括由免疫复合物沉淀介导的炎性过程——的方法。

已发现，可溶性FcγRIA——而非可溶性FcγRIIA或FcγRIIIA——可阻断皮肤阿尔图斯反应中的炎症(参见实施例9和10)。此外已发现，可溶性FcγRIA还可阻断经细胞FcγR的免疫复合物的结合和信号传导(在下文实施例中详述)。可溶性FcγRIA在小鼠中阻断皮肤阿尔图斯反应、胶原抗体诱导的关节炎模型和胶原诱导的关节炎中的炎症，这些发现是意料之外的，因为FcγRIA作为IgG Fc的高亲和力受体，被认为被循环单体IgG饱和，因此一般不能结合免疫复合物。这些发现表明可溶性FcγRIA是一种可用于治疗自身免疫疾病和炎症的强效治疗剂。此外，这些结果支持将Fcγ的其他可溶性高亲和力受体——包括本文所描述的杂合Fcγ受体——用于治疗这类病症。

因此，本文描述的可溶性Fcγ受体多肽可用于拮抗或阻断免疫细胞(例如，淋巴细胞、单核细胞、白细胞、巨噬细胞和NK细胞)中的IgG和免疫复合物的信号传递，用于治疗IgG介导的和免疫复合物介导的疾病，例如自身免疫性糖尿病、多发性硬化(MS)、系统性红斑狼疮(SLE)、重症肌无力、韦格纳肉芽肿病、丘-施综合征(Churg-Strauss syndrome)、乙型肝炎相关结节性多动脉炎、显微镜下多血管炎(microscopicpolyangitis)、亨诺-许兰二氏紫癜(Henoch-Schonlein purpura)、类风湿性关节炎(RA)、朗-伊综合征、炎性肠病(IBD)、原发性混合型冷球蛋白血症、丙型肝炎相关冷球蛋白血症、混合型结缔组织病、自身免疫性血小板减少症(ITP和TTP)、成人皮肌炎、格-巴综合征、斯耶格伦氏综合征、古德帕斯彻综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病变、抗磷脂抗体综合征、血管炎、葡萄膜炎、血清病、天疱疮(例如寻常天疱疮)和与外源抗原相关的疾病例如病毒和细菌感染。还可以用本发明的可溶性Fcγ受体多肽治疗哮喘、变态反应和其他特应性疾病以抑制免疫反应或消除不良细胞。利用本发明的可溶性Fcγ受体多肽阻断或抑制IgG和免疫复合物经Fcγ受体的信号传递还可有益于胰腺、肾、垂体和神经细胞的疾病。本发明的可溶性Fcγ受体多肽可用作IgG和免疫复合物的拮抗剂。这类拮抗效应可以通过直接中和或结合IgG和免疫复合物的Fc区实现。

II.可溶性杂合Fcγ受体及其制备方法和材料

因此，本发明在一个方面提供了能够中和免疫细胞中IgG介导的或免疫复合物介导的信号传递的分离的可溶性杂合Fcγ受体(FcγR)多肽。所述杂合Fcγ受体通常包含与至少2个不同的Fcγ受体亚家族的胞外Ig结构域对应的多肽区域，并且基本上不含跨膜和胞内多肽区段。具体而言，本发明的可溶性杂合Fcγ受体通常包含修饰的人FcγRIA胞外结构域，所述FcγRIA中的第1个Ig结构域(D1)被与人FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第1个Ig结构域对应的多肽区域代替。

SEQ ID NO：1提供了编码人FcγRIA(FcγRI的同种型a)的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO：1包含编码374个氨基酸(SEQ ID NO：2)的开放阅读框，所述374个氨基酸中包含约277个氨基酸残基(SEQ IDNO：2的残基16-292；SEQ ID NO：3)的胞外Fcγ-结合结构域。FcγRI还包括同种型b1和c，两者作为与FcγRIA(SEQ ID NO：2)进行比较在图6D中都有描述。与包含3个Ig结构域的同种型a不同，同种型b1和c的胞外结构域仅包含2个Ig结构域。FcγRIA的第1个、第2个和第3个Ig结构域分别大致对应于SEQ ID NO：2的氨基酸残基22-101、104-184和190-250。

SEQ ID NO：6提供了编码人FcγRIIA(FcγRII的同种型a)胞外结构域的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO：6包含编码211个氨基酸(SEQ IDNO：7)的开放阅读框，所述211个氨基酸中包含约34或35个氨基酸残基(SEQ ID NO：7的残基1-34或1-35)的分泌信号序列和约177或176个氨基酸残基(SEQ ID NO：7的残基35-211或36-211)的胞外Fcγ-结合结构域。FcγRIIA的胞外结构域包含2个Ig结构域，分别大致对应于SEQID NO：7的氨基酸残基39-119和122-204。

SEQ ID NO：8提供了编码人FcγRIIB(FcγRII的同种型b)胞外结构域的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO：8包含编码216个氨基酸(SEQID NO：9)的开放阅读框，所述216个氨基酸中包含约42个氨基酸残基(SEQ ID NO：9的残基1-42)的分泌信号序列和约174个氨基酸残基(SEQ ID NO：9的残基43-216)的胞外Fcγ结合结构域。FcγRIIB的胞外结构域包含2个Ig结构域，分别大致对应于SEQ ID NO：9的氨基酸残基48-129和132-213。

SEQ ID NO：10提供编码了人FcγRIIIA(FcγRIII的同种型a)胞外结构域的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO：10包含编码195个氨基酸(SEQ ID NO：11)的开放阅读框，所述195个氨基酸中包含约17或20个氨基酸残基(SEQ ID NO：11的残基1-17或1-20)的分泌信号序列和约178或175个氨基酸残基(SEQ ID NO：11的残基18-195或21-195)的胞外Fcγ结合结构域。FcγRIIIA的胞外结构域包含2个Ig结构域，分别大致对应于SEQ ID NO：11的氨基酸残基24-105和108-189。

SEQ ID NO：12提供了编码人FcγRIIIB(FcγRIII的同种型b)胞外结构域的示例性核苷酸序列。SEQ ID NO：12包含编码195个氨基酸(SEQ ID NO：13)的开放阅读框，所述195个氨基酸中包含约17或20个氨基酸残基(SEQ ID NO：13的残基1-17或1-20)的分泌信号序列和约178或175个氨基酸残基(SEQ ID NO：13的残基18-195或21-195)的胞外Fcγ-结合结构域。FcγRIIIB的胞外结构域包含2个Ig结构域，分别大致对应于SEQ ID NO：13的氨基酸残基24-105和108-189。

在某些实施方案中，本发明的可溶性FcγR多肽包含与以下氨基酸残基具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列，所述氨基酸残基为SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ IDNO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286，其中所述分离的多肽能与IgG(例如人IgG，例如人IgG1)的Fc区特异性结合。若本发明的可溶性FcγR多肽与单体人IgG(例如人IgG1)以至少10⁶M^-1、优选至少10⁷M^-1、更优选至少10⁸M^-1、最优选10⁹M^-1的结合亲和力(K_a)结合，则所述可溶性FcγR多肽特异性结合。在某些实施方案中，本发明的可溶性FcγR多肽以10⁸M^-1至10⁹M^-1的结合亲和力(K_a)与单体人IgG结合。本领域普通技术人员可容易地测定可溶性FcγR多肽的结合亲和力，例如通过Scatchard分析(Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660，1949)。除测定亲和常数(K_a)外，测定亲和力的另外一种方法是平衡常数(K_d)，它随着亲和力增加将出现减小。在某些实施方案中，本发明的可溶性FcγR多肽以小于10^-8M、优选小于10^-9M、更优选小于10^-10M的解离平衡常数(K_d)与人IgG1结合。在一个具体的变化方案中，本发明的可溶性FcγR多肽以约1.7×10^-10M的解离平衡常数(K_d)与人IgG1结合。在一些实施方案中，本发明的可溶性FcγR多肽包含SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286。在另外的实施方案中，本发明的可溶性FcγR多肽包含选自以下的氨基酸序列：(i)如在SEQ ID NO：40所示的从氨基酸x到氨基酸301的氨基酸序列，其中所述x是35至39之间的一个整数，包括35和39；(ii)如在SEQ ID NO：42所示的从氨基酸x到氨基酸310的氨基酸序列，其中所述x是43至48之间的一个整数，包括43和48；(iii)如在SEQ ID NO：44所示的从氨基酸x到氨基酸286的氨基酸序列，其中所述x是18至24之间的一个整数，包括18和24；和(iv)如在SEQ ID NO：46所示的从氨基酸x到氨基酸286的氨基酸序列，其中所述x是18至24之间的一个整数，包括18和24。

在这样的一些实施方案中，即其中所述可溶性杂合FcγRI多肽的氨基酸序列具有与以下氨基酸残基至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性，所述氨基酸残基为SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286，所述FcγR多肽的氨基酸序列与SEQ IDNO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44或SEQ ID NO：46的对应氨基酸序列之间的任何差异均由一个或多个保守氨基酸置换造成。

相对于如SEQ ID NO：40、42、44或46所示的参照多肽序列基本相同的多肽通常被表征为相对参照多肽具有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加。这些改变优选较小，为保守氨基酸置换(参见例如下文表2，其中列出一些示例性保守氨基酸置换)和其他不显著影响蛋白或多肽折叠或活性的置换；为一般为1至约30个氨基酸的小缺失；以及小的氨基端或羧基端延长，例如氨基端的甲硫氨酸残基，最多达约20-25个残基的较小的连接肽，或者便于纯化的较小延伸物(亲和标签)——例如多组氨酸链、蛋白A(Nilsson et al.，EMBO J.4：1075(1985)；Nilsson et al.，Methods Enzymol.198：3(1991))、谷胱甘肽S转移酶(Smith and Johnson，Gene 67：31(1988))或其他抗原性表位或结合结构域(总体上可参见Ford et al.，Protein Expession and Purification 2：95(1991))。编码亲和标签的DNA可从供应商(例如Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)处购买。

表2

可以根据下述本领域已知的方法识别本发明受体多肽中的关键氨基酸，所述方法例如定点诱变或丙氨酸扫描(alanine-scanning)诱变(Cunningham and Wells，Science 244：1081(1989)；Bass et al.，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 88：44981991)。在丙氨酸扫描诱变技术中，对分子中的每个残基位置都引入单个的丙氨酸突变，并测试所得的突变体分子的生物学活性(例如，配体结合和信号转导)，从而识别对分子活性而言关键的氨基酸残基。还可以通过晶体结构分析确定配体-受体相互作用位点，所述晶体结构可通过诸如核磁共振、晶体学、或光亲和标记这类技术确定(参见de Vos et al.，Science 255：306-312，1992；Smith et al.，J.Mol.Biol.224：899-904，1992；Wlodaver et al.，FEBS Lett.309：59-64，1992)。还可以通过分析与相关受体的同源性来推断关键氨基酸的性质。

可以用已知的诱变方法和筛选方法制备多个氨基酸置换并对其进行测试，所述方法例如Reidhaar-Olson和Sauer Science 241：53，1988或Bowie和Sauer Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：2152，1989中公开的方法。简而言之，以上著者公开的方法包括同时随机化多肽中的两个或多个位置、筛选功能性多肽，并随后对诱变的多肽测序以确定在每一位置上可以置换的图谱。其他可以使用的方法包括噬菌体展示，例如Lowman et al.Biochem.30：10832，1991；Ladner等人的美国专利No.5,223,409；Huse的国际申请公布WO 92/06204和区域定向诱变(Derbyshire et al.，Gene46：145，1986和Ner et al.，DNA 7：127，1988)。

上文公开的诱变方法可以与高通量筛选方法相结合，以检测宿主细胞中克隆的诱变受体的活性。优选的这方面的检测包括细胞增殖检测和基于生物传感器的配体结合检测，这些将在下文描述。可从宿主细胞中回收编码活性受体或其部分(例如配体结合片段)的诱变的DNA分子并且使用现代仪器迅速对其测序。上述方法能够迅速确定目的多肽的各个氨基酸残基的重要性，并且可用于结构未知的多肽。

使用上文详述的方法，本领域普通技术人员可制备多种包含可溶性FcγR多肽的多肽，上述可溶性FcγR多肽与参照多肽基本相同，并且保持所述参照多肽的配体结合性质(例如，IgG结合性质)，上述参照多肽具有SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ IDNO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286。检测受体多肽的配体结合性质的检测体系通常为本领域公知并且易于修改用于检测本文所描述的可溶性杂合FcγR的Fcγ结合性质。本文将进一步描述示例性的检测。

例如，一个优选的检测体系使用市售的生物传感器装置(BIAcore^TM，Pharmacia Biosensor，Piscataway，NJ)，其中将受体多肽固定于受体芯片的表面。这种装置的使用由Karlsson(J.Immunol.Methods145：229-40，1991)以及Cunningham和Wells(J.Mol.Biol.234：554-63，1993)公开。对于本发明的应用，使用胺或巯基化学品，将可溶性杂合FcγR多肽共价连接至葡聚糖纤维上，所述葡聚糖纤维连接在流通池中的金膜上。使测试样本经过该池。如果在样本中存在配体(例如，IgG)，它就会与固定的杂合FcγR相结合，导致介质的折射率发生改变，这可通过金膜的表面等离子共振(plasmonresonance)的变化而进行检测。这一体系使得可以测定结合速率和解离速率，由此可以计算结合亲和力并评估结合的化学计量。

所述可溶性杂合FcγR多肽还可以用于本领域已知的其他检测体系。这些体系包括用于测定结合亲和力的Scatchard分析(参见Scatchard，Ann.NY Acad.Sci.51：660-72，1949)和测热法测定(参见Cunningham etal.，Science 253：545-48，1991；Cunningham et al.，Science 245：821-25，1991)。

本发明的可溶性杂合FcγR多肽还可包括一个或多个非源于天然FcγR的附加多肽区段。因此，在一些实施方案中，可溶性杂合FcγR多肽是还包含与Fcγ受体异源的多肽区段的融合蛋白。特别合适的异源多肽是如美国专利No.5,155,027和5,567,584所公开的二聚化蛋白。在这方面优选的二聚化蛋白包括免疫球蛋白恒定区结构域，例如IgGγ1，和人κ轻链。可以在经过基因工程改造的细胞中表达免疫球蛋白-可溶性FcγR多肽融合体，以产生多种这类受体类似物。在某些变化方案中，所述二聚化蛋白是免疫球蛋白重链恒定区，一般是Fc片段，它含有两个恒定区结构域和一个铰链区域，但是不含可变区(参见Sledziewski et al.，USPatent No.6,018,026和5,750,375)。这类融合体一般以多体分子的形式分泌，其中所述二聚化蛋白相互键合在一起(例如通过二硫键合)并且两个多肽在排布上彼此接近。

可将可溶性杂合FcγR多肽与辅助结构域融合以使所述多肽靶向特定的细胞、组织或大分子(例如，胶原或表达其他Fc受体的细胞)。在一些实施方案中，将亲和标签(例如麦芽糖蛋白、免疫球蛋白结构域或如在SEQ ID NO：18中所示的多组氨酸标签)与可溶性杂合FcγR多肽融合以便于纯化。在一些变化方案中，可溶性杂合FcγR多肽与两个或多个部分相融合，例如用于纯化的亲和标签，以及靶向结构域。多肽融合体还可以包括一个或多个切割位点，特别是在结构域之间的切割位点。参见，Tuan et al.，Connective Tissue Research 34：1-9，1996。

本发明还提供编码本文公开的所述可溶性杂合FcγR受体多肽的多核苷酸分子，包括DNA和RNA分子。本发明的多核苷酸包括单链和双链分子。本文公开了编码可溶性杂合FcγR受体的示例性的DNA序列。本领域普通技术人员可基于遗传密码容易生成编码本发明的可溶性杂合FcγR受体的其他DNA序列。通过用U替换T可产生相应RNA序列。本发明的技术人员容易理解，由于遗传密码的简并性，编码给定多肽的多核苷酸分子中可能出现相当多的序列变体。

因此，本发明在另一方面提供了一种编码本文所述的可溶性杂合FcγR多肽的分离的多核苷酸。本发明的分离的多核苷酸通常编码这样的可溶性杂合FcγR多肽，即该可溶性杂合FcγR多肽包含与以下氨基酸残基具有至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或更高同一性的氨基酸序列，所述氨基酸残基为SEQ ID NO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ IDNO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286，其中所述编码的多肽能与IgG(例如，人IgG，例如人IgG1)的Fc区特异性结合。在一些实施方案中，所述编码的多肽包含SEQ IDNO：40的氨基酸残基35-301、36-301或39-301；SEQ ID NO：42的氨基酸残基43-310或48-310；SEQ ID NO：44的氨基酸残基18-286、21-286或24-286；或SEQ ID NO：46的氨基酸残基18-286、21-286或24-286。在其他实施方案中，所述编码的多肽包含选自以下的氨基酸序列：(i)如在SEQ ID NO：40所示的从氨基酸x到氨基酸301的氨基酸序列，其中所述x是35至39之间的一个整数，包括35和39；(ii)如在SEQ ID NO：42所示的从氨基酸x到氨基酸310的氨基酸序列，其中所述x是43至48之间的一个整数，包括43和48；(iii)如在SEQ ID NO：44所示的从氨基酸x到氨基酸286的氨基酸序列，其中所述x是18至24之间的一个整数，包括18和24；和(iv)如在SEQ ID NO：46所示的从氨基酸x到氨基酸286的氨基酸序列，其中所述x是18至24之间的一个整数，包括18和24。在具体的变化方案中，所述核酸包含SEQ ID NO：39的核苷酸残基103-903、106-903或115-903；SEQ ID NO：41的核苷酸残基127-930或142-930；SEQ ID NO：43的核苷酸残基52-858、61-858或70-858；或SEQID NO：45的核苷酸残基52-858、61-858或70-858。

本发明的可溶性杂合Fcγ受体和核酸优选为重组型(除合成制备之外)。重组DNA的方法是本领域已知的并且可容易地用于生成本文所述的FcγR多肽。如上文所述，本发明的杂合受体源自人FcγRIA的胞外结构域，所述FcγRIA的第1个Ig结构域(D1)被不同亚类的Fcγ受体(例如FcγRIIA、FcγRIIA、FcγRIIA或FcγRIIA)的第1个Ig结构域置换。因此，重组DNA方法可用于例如克隆编码杂合受体的不同多肽区域的具体核酸区段(例如编码FcγRIA的第2个和第3个Ig结构域的一个核酸区段，以及编码FcγRIIA、FcγRIIA、FcγRIIA或FcγRIIA的第1个Ig结构域的另一区段)，例如可通过使用源自表达天然Fcγ受体的合适组织或细胞的RNA或DNA对各个核酸区域进行PCR扩增。然后，可使用标准技术例如连接或重叠PCR将编码杂合受体各个区域的核酸区段连接在一起。

可依照本领域公知的方法制备编码一种或多种天然Fcγ受体的DNA或RNA，从所述DNA或RNA可产生本发明的可溶性杂合FcγR。互补DNA(cDNA)克隆可从分离自产生大量的编码目的多肽的RNA的组织或细胞中的RNA制备。总RNA可使用盐酸胍提取并随后在CsCl梯度中离心分离制备(Chirgwin et al.，Biochemistry 18：52-94，1979)。Poly(A)+RNA使用Aviv和Leder的方法(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 69：1408-1412，1972)从总RNA制备。互补DNA使用已知的方法从poly(A)+RNA制备。在可选实施方案中，可分离基因组DNA。对于一些应用(例如在转基因动物中表达)，使用基因组克隆或者改进cDNA克隆以包含至少一个基因组内含子是有利的。识别和分离cDNA和基因组克隆的方法是本领域熟知的并在本领域普通技术人员能力范围内的，并且包括将本文公开的序列及其部分用于探测文库或者使之就绪(priming)。编码目的多肽的多核苷酸通过例如杂交或聚合酶链式反应(“PCR”，Mullis，美国专利4,683,202)识别和分离。表达文库可使用目的多肽的抗体、受体片段或其他特异结合配偶体(specific binding partner)探测。

可通过已知技术制备具体的杂合Fcγ受体的变体。相对于参照序列有一个或多个氨基酸置换、缺失或添加的变体可通过例如以下的方法制备：使用盒式或PCR诱变或本领域已知的其他技术在编码相应杂合Fcγ受体蛋白的DNA中进行核苷酸定点诱变以产生编码所述变体的DNA，并且随后在重组细胞培养物中表达所述DNA。如上文所述，本发明的Fcγ受体变体一般表现出与天然FcγRIA类似的Fcγ结合性，但也可以选择具有其他变体特征的变体。可在目标密码子或区域进行随机诱变，并且就所需活性的最优结合筛选所表达的变体杂合FcγR蛋白。在序列已知的DNA的预定位点进行置换突变的技术是公知的，例如M13引物诱变和PCR诱变。

氨基酸置换可以是单个氨基酸残基或多个氨基酸残基(例如可置换2、3、4个或更多氨基酸)。插入一般为约1-20个氨基酸的规模，但有可能容忍大得多的插入。缺失的范围是约1个至约20个残基，或约1个至30个残基，但在一些情况下可以缺失可以大得多。置换、缺失、插入、或其任意组合可用于实现最终变体杂合受体。在某些变化方案中，相对于参照序列就相对少的氨基酸进行修饰以使分子的改变最小化。但是，在某些情况下可容忍较大的改变。

也可以通过自动合成来制备本发明的多核苷酸。制备短的双链区段(60至80bp)在技术上很简单，并且可通过合成互补链然后使其退火来完成。较长的区段(一般＞300bp)从长度为20至100个核苷酸的单链片段以模块的形式组装。多核苷酸的自动合成在本领域普通技术人员的能力范围内，合适的装置和试剂可从供应商购得。总体上可参见GlickandPasternak，Molecular Biotechnology，Principles & Applications ofRecombinant DNA(ASM Press，Washington，D.C，1994)；Itakura et al.，Ann.Rev.Biochem.53：323-356，1984；和Climie et al.，Proc.Natl.A cad.Sci.USA 87：633-637，1990。

依照常规技术，可以在经过基因工程改造的细胞中生产本发明的可溶性杂合Fcγ受体多肽。合适的宿主细胞是那些可被外源DNA转化或转染并在培养基中生长的细胞类型，包括细菌、真菌细胞和培养的高等真核细胞(包括多细胞生物的培养的细胞)，特别是培养的哺乳动物细胞。用于操作克隆的DNA分子并将外源DNA引入各种宿主细胞的技术由Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2nd ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，1989)；和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(Green andWiley and Sons，NY，1993)公开。

一般而言，为了表达可溶性杂合Fcγ受体多肽，将编码所述多肽的DNA序列与该序列在表达载体中表达所需的其他遗传元件有效地连接，所述遗传元件通常包括转录启动子和终止子。所述载体通常还将包含一种或多种筛选标记和一个或多个复制起点，但是本领域技术人员应认识到在某些体系中筛选标记可由另外的载体提供，并且外源DNA的复制可通过整合进入宿主细胞的基因组内实现。对启动子、终止子、筛选标记、载体和其他元件的选择是关乎本领域普通技术人员能力范围内的常规设计的问题。许多的这类元件在文献有描述，并且可从供应商处购得。

为指导多肽融合体进入宿主细胞的分泌途径，在表达载体中提供了分泌信号序列。所述分泌信号序列可以是天然Fcγ受体(例如，所述杂合受体可来源的天然FcγRIA、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB)的分泌信号序列，或者可以源自其他分泌蛋白(例如t-PA；参见美国专利No.5,641,655)或者从头合成。在所述分泌肽和所述多肽融合体剩余部分之间的接头部分可包括基因工程化的切割位点，以优化宿主细胞中的蛋白水解过程。将所述分泌信号序列与编码所述多肽融合体的DNA序列有效地连接，即将所述两个序列在正确的读码框内连接，并且它们的位置使得可以指导新合成的多肽融合体进入宿主细胞的分泌途径。分泌信号序列通常位于编码目的多肽的DNA序列的5’端，但某些分泌信号序列可以位于目的DNA序列的其他位置)参见例如，Welch等人，美国专利No.5,037,743；Holland等人，美国专利No.5,143,830)。可用于本发明的示例性分泌信号序列包括：例如编码SEQ ID NO：40的氨基酸残基1-38的DNA序列、编码SEQ ID NO：42的氨基酸残基1-47的DNA序列、编码SEQ ID NO：44的氨基酸残基1-17或1-20的DNA序列、编码SEQ ID NO：46的氨基酸残基1-17或1-20的DNA序列、编码SEQ ID NO：60的氨基酸残基1-35的DNA序列、编码SEQ ID NO：62的氨基酸残基1-16的DNA序列、编码SEQ ID NO：64的氨基酸残基1-19的DNA序列或者编码SEQ ID NO：66的氨基酸残基1-23的DNA序列。

培养的哺乳动物细胞是用于本发明的合适宿主细胞。用于将外源DNA导入哺乳动物宿主细胞的方法包括磷酸钙介导的转染(Wigler et al.，Cell 14：725，1978；Corsaro and Pearson，Somatic Cell Genetics 7：603，1981：Graham and Van der Eb，Virology 52：456，1973)、电穿孔法(Neumann etal.，EMBO J.1：841-845，1982)、DEAE-葡聚糖介导的转染(Ausubel et al.，见上文)和脂质体介导的转染(Hawley-Nelson et al.，Focus 15：73，1993；Ciccarone et al.，Focus 15：80，1993)。在培养的哺乳动物细胞中生产重组多肽由以下专利公开：例如，Levinson等的美国专利No.4,713,339；Hagen等的美国专利No.4,784,950；Palmiter等的美国专利No.4,579,821；和Ringold的美国专利No.4,656,134。合适的培养的哺乳动物细胞包括COS-1(ATCC No.CRL 1650)、COS-7(ATCC No.CRL 1651)、BHK(ATCC No.CRL 1632)、BHK 570(ATCC No.CRL 10314)、293(ATCCNo.CRL 1573；Graham et al.，J.Gen.Virol.36：59-72，1977)和中国仓鼠卵巢(例如，CHO-K1，ATCC No.CCL 61；CHO-DG44，Urlaub et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，1980)细胞系。其他合适细胞系是本领域已知的并且可从公共保藏中心获得，例如弗吉尼亚的马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)。可使用强转录启动子，例如来自SV-40、巨细胞病毒或骨髓组织增殖肉瘤病毒(myeloproliferative sarcoma virus)的启动子。参见，例如美国专利No.4,956,288和美国专利申请出版物No.20030103986。其他合适的启动子包括来自金属硫蛋白基因的启动子(美国专利No.4,579,821和4,601,978)和腺病毒主要晚期启动子。用于哺乳动物细胞的表达载体包括pZP-1、pZP-9和pZMP21及这些载体的衍生物，所述载体以登录号分别98669、98668和PTA-5266保藏于美国典型培养物保藏中心(10801University Blvd.，Manassas，VA USA)。

药物筛选通常用于筛选外源DNA已插入其中的培养的哺乳动物细胞。这类细胞通常被称作“转染体”。将已经在存在筛选试剂的条件下培养并且能将目的基因传递给后代的细胞称作“稳定的转染体”。示例性筛选标记是编码新霉素抗生素抗性的基因。筛选在存在新霉素类药物——例如G-418等——的条件下进行。还可以使用筛选体系来提高目的基因的表达水平，这一过程被称为“扩增”。扩增通过下述步骤进行：在存在低水平筛选剂的条件下培养转染体，然后增加筛选剂的量，以筛选产生高水平的所引入基因的产物的细胞。一种示例性的可扩增的筛选标记为二氢叶酸还原酶，它赋予甲氨喋呤抗性。也可以使用其他药物抗性基因(例如潮霉素抗性、多药物抗性、嘌呤霉素乙酰转移酶)。也可以用细胞表面标记和其他表型筛选标记以便于识别转染细胞(例如通过荧光激活的细胞分选)，所述标记包括例如CD8、CD4、神经生长因子受体、绿色荧光蛋白等。

也可以将其他高等真核细胞用作宿主，包括昆虫细胞、植物细胞和鸟类细胞。将毛根农杆菌(Agrobacterium rhizogenes)作为在植物细胞中表达基因的载体已经由Sinkar et al.，J.Biosci.(Bangalore)11：47-58，1987进行综述。Guarino等的美国专利No.5,162,222和国际申请公布WO 94/06463中公开了对昆虫细胞的转化以及外源多肽在其中的生产。

可用通常来自苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)核型多角体病毒(AcNPV)的重组杆状病毒感染昆虫细胞。参见King和Possee，TheBaculovirus Expression System：A Laboratory Guide(Chapman & Hall，London)；O′Reilly et al.，Baculovirus Expression Vectors：A LaboratoryManual(Oxford University Press.，New York，1994)；和Richardson，Ed.，Baculovirus Expression Protocols，Methods in Molecular Biology(HumanaPress，Totowa，NJ，1995)。还可以通过使用Luckow等(J.Virol.67：4566-4579，1993)所述的基于转座子的体系制备重组杆状病毒。该体系利用转运载体，以试剂盒的形式(BAC-TO-BAC试剂盒，LifeTechnologies，Rockville，MD)购得。所述转运载体(例如，PFASTBAC1；Life Technologies)含有Tn7转座子，以将编码目的多肽的DNA转移至保持于大肠杆菌(E.coli)中的被称为“bacmid”的大质粒形式的杆状病毒基因组中。参见，Hill-Perkins and Possee，J.Gen.Virol.：971(1990)、Bonning，et al.，J.Gen.Virol.75：1551，1994和Chazenbalk，and Rapoport，J.Biol.Chem.270：1543，1995。使用本领域已知的技术，将编码多肽融合体的转运载体转化至大肠杆菌宿主细胞中，并针对bacmid筛选细胞，含有被中断的lacZ基因的即表明为重组杆状病毒。使用常规技术分离含有重组杆状病毒基因组的bacmid DNA，并将其用于转染草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，如Sf9细胞。然后制备表达所述多肽融合体的重组病毒。使用本领域常规方法制备重组病毒储液。

对于蛋白质制备，用所述重组病毒感染宿主细胞，一般是来自草地夜贪蛾的细胞系(例如，Sf9或Sf21细胞)或来自粉纹夜蛾(Trichoplusiani)的细胞系(例如，HIGH FIVE细胞；Invitrogen，Carlsbad，CA)。总体上可参见Glick和Pasternak，见上文。还参见美国专利No.5,300,435。可以使用无血清培养基来培养和维持细胞。合适的的培养基配方是本领域已知的并且可从供应商处购得。细胞由接种密度为约2-5×105个细胞生长至密度为1-2×10⁶个细胞，此时加入重组病毒储液，感染复数(MOI)为0.1至10，更一般接近3。使用的方法通常在可获得的实验室手册中有描述(例如，King and Possee，见上文；O′Reilly et al.，见上文；Richardson，见上文)。

在本发明中还可以使用真菌细胞，包括酵母细胞。在这方面特别感兴趣的酵母种包括：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)和甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)。用外源DNA转化酿酒酵母(S.cerevisiae)细胞并由此生产重组多肽的方法公开于例如下列文献中：Kawasaki的美国专利No.4,599,311、Kawasaki等人的美国专利No.4,931,373、Brake的美国专利No.4,870,008、Welch等人的美国专利No.5,037,743和Murray等人的美国专利No.4,845,075。转化的细胞通过由筛选标记确定的表型进行筛选，所述筛选标记通常为药物抗性或能够在缺少特定营养物(例如亮氨酸)的条件下生长的能力。用于酿酒酵母中的一种示例性载体体系为由Kawasaki等人(美国专利No.4,931,373)公开的POT1载体体系，该体系使得可以通过在含葡萄糖的培养基中的生长来筛选转化的细胞。可用于酵母中的合适的启动子和终止子包括来源于糖酵解酶基因的启动子和终止子(参见例如Kawasaki的美国专利No.4,599,311、Kingsman等人的美国专利No.4,615,974和Bitter的美国专利No.4,977,092)和醇脱氢酶基因的启动子和终止子。还参见美国专利No.4,990,446、5,063,154、5,139,936和4,661,454。用于其它酵母的转化体系也是本领域已知的，所述其它酵母包括：多形汉森酵母(Hansenula polymorpha)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、脆壁克鲁维酵母(Kluyveromycesfragilis)、玉蜀黍黑粉菌(Ustilago maydis)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、季也蒙毕赤酵母(Pichiaguillermondit)和麦芽糖假丝酵母(Candida maltosa)。参见例如Gleeson etal.，J.Gen.Microbiol.132：3459，1986和Cregg的美国专利No.4,882,279；以及Raymond et al.，Yeast 14：11-23，1998。可以根据McKnight等人的美国专利No.4,935,349的方法使用曲霉(Aspergillus)细胞。Sumino等人的美国专利No.5,162,228中公开了转化产黄顶孢霉(Acremoniumchrysogenum)的方法。Lambowitz的美国专利No.4,486,533中公开了转化链孢霉(Neurospora)的方法。美国专利No.5,716,808、5,736,383、5,854,039和5,888,768公开了在甲醇毕赤酵母中生产重组蛋白质。

原核宿主细胞，包括大肠杆菌、芽孢杆菌属和其他属的菌株，也是可在本发明中使用的宿主细胞。本领域已知转化这些宿主细胞并表达克隆于其中的外源DNA序列的技术(参见，例如Sambrook等，见上文)。当在例如大肠杆菌的细菌中表达多肽融合体时，该多肽通常以不可溶性颗粒的形式可以保留在细胞质中，或者可通过细菌分泌序列定向至周质空间。对于前一种情况，将细胞裂解、回收颗粒并且使用例如盐酸胍或尿素使其变性。然后通过稀释变性剂(例如，用尿素与还原型和氧化型谷胱甘肽的结合物的溶液进行透析，然后再用缓冲盐溶液进行透析)使变性的多肽重新折叠。在可选的方案中，可以可溶的形式从细胞质回收所述蛋白而不需要使用变性剂。将所述蛋白作为在例如磷酸盐缓冲盐水中的水性提取物从细胞回收。为捕获目的蛋白，将所述提取物直接应用于色谱介质中，例如固定的抗体或肝素-Sepharose柱。可以通过破碎细胞(例如通过超声或渗透压休克)并回收蛋白以可溶且有功能的形式从周质空间中回收分泌的多肽，从而避免对变性和重新折叠的需求。参见，例如Lu et al.，J.Immunol.Meth.267：213-226，2002。

依照常规方法在含有所选宿主细胞生长所需的营养物和其他组分的培养基中培养转化或转染的宿主细胞。本领域已知各种合适的培养基，包括已知成分的培养基和复合培养基，所述培养基通常包括碳源、氮源、必需氨基酸、维生素和矿物质。培养基还可以根据需要包含如生长因子或血清这样的组分。生长培养基一般通过例如药物筛选或必需营养物缺乏(其被表达载体上携带的或共转染进入宿主细胞的筛选标记补偿)来筛选含有外源加入DNA的细胞。

本发明的蛋白质可通过常规的蛋白纯化方法纯化——一般通过色谱技术的组合。总体上可参见Affinity Chromatography：Principles &Methods(Pharmacia LKB Biotechnology，Uppsala，Sweden，1988)；和Scopes，Protein Purification：Principles and Practice(Springer-Verlag，New York，1994)。可通过在固定的蛋白质A上的亲和色谱来纯化含有免疫球蛋白重链多肽的蛋白质。其他纯化步骤，例如凝胶过滤可用于得到所需纯度水平或者用于进行脱盐、缓冲物交换等。

相对于杂质大分子，特别是其他蛋白质和核酸，本发明的多肽可被纯化至至少约80％的纯度、至少约90％的纯度、至少约95％的纯度、或大于95％、例如96％、97％、98％或大于99％的纯度，并且不含感染性物质和致热原。本发明的多肽还可被纯化至药用级纯度，即大于99.9％的纯度。在某些制品中，纯化的多肽基本上不含其他多肽，特别是不含动物来源的其他多肽。

通常，可以使用硫酸铵沉淀法和酸或离液剂萃取法来对样本进行分级分离。示例性的纯化步骤可包括羟基磷灰石、尺寸排阻、FPLC和反相高效液相色谱。合适的色谱介质包括衍生化的葡聚糖、琼脂糖、纤维素、聚丙烯酰胺、特种二氧化硅(specialty silica)等等。PEI、DEAE、QAE和Q衍生物也是合适的。示例性色谱介质包括苯基、丁基或辛基基团衍生化的介质，例如苯基-Sepharose FF(Pharmacia)、Toyopearl丁基650(Toso Haas，Montgomeryville，PA)、辛基-Sepharose(Pharmacia)等；或者聚丙烯酸树脂例如Amberchrom CG 71(Toso Haas)等。合适的固相支持物包括玻璃珠、硅基树脂(silica-based resin)、纤维素树脂、琼脂糖微球、交联琼脂糖微球、聚苯乙烯微球、交联聚丙烯酰胺树脂等在其使用条件下不可溶的支持物。可以用反应性基团对这些支持物进行修饰，所述反应性基团使得蛋白质可以通过氨基基团、羧基基团、巯基基团、羟基基团和/或糖部分与所述支持物连接。

偶联化学的实例包括溴化氰活化、N-羟基琥珀酰亚胺活化、环氧化物活化、巯基活化、酰肼活化和用于碳二亚胺偶联化学的羧基和氨基衍生物。上述和其他固体介质都是本领域公知并广泛使用的，均可从供应商处购得。用于多肽分离和纯化的具体方法的选择是关乎常规设计的问题，并且部分地取决于所选择支持物的性质。参见例如，AffinityChromatography：Principles & Methods(Pharmacia LKB Biotechnology1988)和Doonan，Protein Purification Protocols(The Humana Press1996)。

可溶性FcγR分离和纯化的其他变化方法可由本领域技术人员设计得出。例如，抗-FcγR抗体可用于通过免疫亲和纯化来分离大量蛋白质。

还可以利用特定的性质分离本发明的多肽。例如，可以使用固定的金属离子吸附色谱(IMAC)色谱来纯化富含组氨酸的蛋白质，包括那些带有多组氨酸标签的蛋白质。简而言之，首先使凝胶负载二价金属离子以形成螯合物(Sulkowski，Trends in Biochem.3：1(1985))。基于所使用的金属离子，富含组氨酸的蛋白质将以不同的亲和力吸附在这一基质上，并可用竞争性洗脱、降低pH或使用强螯合剂将它们洗脱下来。其他纯化方法包括使用凝集素亲和色谱和离子交换色谱纯化糖基化蛋白(M.Deutscher，(ed.)，Meth.Enzymol.182：529(1990))。在本发明的另外的实施方案中，可以构建目的多肽和亲和标签(例如麦芽糖结合蛋白，免疫球蛋白结构域、P物质、Flag^TM肽、或其抗体或其他特异结合剂可获得的其他多肽或蛋白)的融合体以便于纯化。

如上所述，也可以通过化学合成方法制备可溶性杂合FcγR多肽或其片段。所述FcγR多肽可为单体或多聚体(例如同型二聚体)形式；糖基化或非糖基化形式；聚乙二醇化或非聚乙二醇化形式；并且可以含有或不含起始的甲硫氨酸氨基酸残基。

在一些变化方案中，可通过将可溶性杂合FcγR多肽与聚合物连接而对其进行化学修饰。一般而言，所述聚合物为水溶性的，因而使得所述杂合FcγR多肽缀合物不会在水性环境例如生理环境中沉淀。合适的聚合物的实例为经过修饰而具有单个反应性基团的聚合物，所述反应性基团例如用于酰基化反应的活性酯或用于烷基化反应的醛。这样就可以控制聚合度。所述聚合物可为有分枝的或者没有分枝的。杂合FcγR多肽缀合物还可以包含这类水溶性聚合物的混合物。本领域公知制备包含多肽和水溶性聚合物部分的缀合物的一般方法(参见，例如Karasiewicz等人的美国专利No.5,382,657，Greenwald等人的美国专利No.5,738,846，Nieforth et al.，Clin.Pharmacol.Ther.59：636，1996；Monkarsh et al.，Anal.Biochem.247：434，1997)。这类方法可应用于制备包含杂合FcγR的同型二聚体、异型二聚体或多聚体的可溶性受体缀合物。

可溶性杂合FcγR多肽缀合物的一个实例包含连接到该杂合FcγR多肽的N端的聚烷基氧化物(polyalkyl oxide)部分。PEG是一种合适的聚烷基氧化物。例如，可溶性杂合FcγR可被PEG修饰，该过程被称为“聚乙二醇化”。可通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应来进行可溶性杂合FcγR的聚乙二醇化(参见例如，EP 0 154 316、Delgado et al.，Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems 9：249，1992、Duncanand Spreafico，Clin.Pharmacokinet.27：290，1994；Francis et al.，Int JHematol 68：1，1998)。例如，可通过采用反应性聚乙二醇分子所进行的酰基化反应或烷基化反应来进行聚乙二醇化。在另一种方法中，通过缩合活化的PEG而形成杂合FcγR缀合物，在活化的PEG中，PEG的末端羟基或氨基基团被活化的连接物所代替(参见例如，Karasiewicz等人的美国专利No.5,382,657)。对于聚乙二醇化反应而言，聚合物分子的分子量一般为约2kDa至约100kDa、约5kDa至约50kDa、或约12kDa至约25kDa。水溶性聚合物与可溶性杂合FcγR的摩尔比通常为1∶1至100∶1。一般而言，水溶性聚合物与可溶性杂合FcγR的摩尔比，对于多聚乙二醇化为1∶1至20∶1；对于单聚乙二醇化为1∶1至5∶1。

III.使用可溶性杂合Fcγ受体的方法和组合物

本发明的可溶性杂合FcγR多肽特异地对抗IgG，并且可以抑制IgG与Fcγ受体结合，因此可用于抑制IgG和Fcγ活性。因此，在本发明的另一方面中，本文描述的可溶性杂合FcγR多肽可用于抑制IgG和Fc受体之间的相互作用，还可以在体内或体外抑制与这类IgG-Fc受体相互作用相关的生理机能(例如，抗原-抗体免疫复合物的沉淀、信号转导和具有细胞表面Fc受体的免疫细胞中的细胞因子分泌)。例如，可在IgG存在的条件下在增殖、萤光素酶或结合测试中、以及在本文所述的或本领域已知的用于评估IgG和FcγR之间的相互作用的其他生物学或生物化学测试中检测本发明的可溶性FcγR多肽的活性。

如本文所示，可溶性FcγRIA多肽完全阻断了免疫复合物沉淀并且还可阻断免疫复合物的结合和信号传递(在下文实施例中详述)。此外，可溶性FcγRIA阻断了皮肤阿尔图斯反应中的炎症，以及胶原抗体诱导的和胶原诱导的关节炎模型中的炎症。这些发现表明，可溶性FcγRIA是一种可用于治疗自身免疫疾病和炎症的强效治疗剂，并且还支持使用Fcγ的其他可溶性高亲和力受体——包括本文所述的杂合Fcγ受体——用于治疗这类病症。

因此，本发明的可溶性杂合FcγR多肽对于通过结合IgG和抑制IgG与内源Fcγ受体的结合来调节免疫反应特别有用。因此，本发明包括可溶性杂合FcγR多肽用于治疗有炎症或患有免疫疾病或病症的受试者的用途。合适的受试者包括哺乳动物，如人。本发明的可溶性杂合FcγR多肽可用于在体内抑制IgG和/或免疫复合物的炎性效应，可用于治疗SLE、冷球蛋白血症、自身免疫性血小板减少症(ITP和TTP)、成人皮肌炎、丙型肝炎相关冷球蛋白血症、乙型肝炎相关结节性多动脉炎、格-巴综合征、古德帕斯彻综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病变、抗磷脂抗体综合征、血管炎、葡萄膜炎、血清病、天疱疮(例如寻常型天疱疮)、与外源抗原相关的疾病、银屑病、特应性皮炎、炎性皮肤病症、内毒素血症、关节炎、哮喘、IBD、结肠炎、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎或其他IgG介导的或免疫复合物介导的炎性病症。

在某些变化方案中，将可溶性杂合FcγR多肽用于治疗IgG介导的炎性病症，例如系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮(包括狼疮性(nephritis)肾炎、非肾(non-renal)狼疮、盘状(discoid)狼疮、秃头狼疮(alopecia))、冷球蛋白血症、混合型结缔组织病、自身免疫性血小板减少症(特发性血小板减少性紫癜(ITP)，血栓形成性血小板减少性紫癜(TTP))、斯耶格伦氏综合征、成人皮肌炎、丙型肝炎相关的冷球蛋白血症、乙型肝炎相关的结节性多动脉炎、格-巴综合征、古德帕斯彻综合征、慢性炎性脱髓鞘性多神经病变、抗磷脂抗体综合征、血管炎、葡萄膜炎、血清病、与外源抗原相关的疾病、关节炎(类风湿性关节炎，幼年类风湿性关节炎，银屑病性关节炎)、银屑病、特应性皮炎、炎性皮肤病症、与炎性肠病(IBD)(克罗恩病、溃疡性结肠炎)相关的反应、憩室病、哮喘、胰腺炎、I型(幼年发病)糖尿病(IDDM)、胰腺癌、胰腺炎、格雷夫斯病、慢性自身免疫性荨麻疹、多肌炎/皮肌炎、中毒性表皮坏死松解、系统性硬皮病和硬化、呼吸窘迫综合征、成人呼吸窘迫综合征(ARDS)、脑膜炎、变应性鼻炎、脑炎、结肠炎、肾小球肾炎、IgG介导的变应性病症、动脉粥样硬化、自身免疫性心肌炎、多发性硬化、变应性脑脊髓炎、结节病、包括韦格纳肉芽肿病的肉芽肿病、粒细胞缺乏症、再生障碍性贫血、库氏试验阳性贫血(Coombs positive anemia)、戴-布贫血、包括自身免疫性溶血性贫血(AIHA)的免疫性溶血性贫血、恶性贫血、纯红细胞再生障碍(PRCA)、第VIII因子缺陷(Factor VIIIdeficiency)、血友病A、自身免疫性中性粒细胞减少症、全血细胞减少症、白细胞减少症、涉及白细胞渗出的疾病、CNS炎性病症、多器官损伤综合征、重症肌无力、抗肾小球基膜病(anti-glomerular basementmembrane disease)、白塞氏病、Castleman综合征、朗-爱肌无力综合征(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome)、雷诺综合征、史-约综合征、骨髓移植排斥、实体器官移植排斥(包括高群体反应抗体滴度(highpanel reactive antibody titer)的预处理)、移植物抗宿主病(GVHD)、大疱型类天疱疮(pemphigoid bullous)、天疱疮(包括寻常天疱疮、叶状天疱疮(pemphigus foliaceus))、自身免疫性多内分泌腺病、莱特病、僵体综合征、免疫复合物肾炎、睾丸或卵巢的自身免疫疾病例如自身免疫性睾丸炎或自身免疫性卵巢炎、原发性甲状腺机能减退、自身免疫性内分泌疾病(例如自身免疫性甲状腺炎、慢性甲状腺炎(桥本甲状腺炎)、亚急性甲状腺炎、特发性甲状腺机能减退、阿狄森病、或自身免疫多腺性综合征(或多腺体性内分泌腺病综合征(polyglandular endocrinopathysyndrome)))、自身免疫性肝炎、淋巴细胞间质性肺炎(HIV)、闭塞性细支气管炎(非移植性的)与NSIP、大血管血管炎(包括类风湿性多肌炎和巨细胞性(高安)动脉炎)、中血管血管炎(包括川崎病和结节性多动脉炎)、强直性脊柱炎、急进性肾小球肾炎、原发性胆汁性肝硬变、口炎性腹泻(麸质肠病)、ALS、冠状动脉疾病或者是需要抑制IgG或免疫复合物的其他实例。

本发明的可溶性杂合FcγR多肽还可以用于治疗与免疫复合物在脑脉络丛中的沉积相关的心理障碍。例如，这类沉积可能是例如系统性红斑狼疮的疾病的中央和周围神经系统表现的原因。在一些患者中，这些表现是发病和死亡的主要原因，并且包括认知官能障碍，特别是记忆和推理困难；精神病；头痛；以及癫痫发作。作为另一实例，免疫复合物在脉络丛中的沉积可能是在原发性混合型冷球蛋白血症中所见的外周神经病变的原因(参见Harrison′s Principles of Internal Medicine(Kasper etal.eds.，McGraw-Hill，New York 2005))。

在本文中描述的治疗方法的每个实施方案中，将可溶性杂合FcγR多肽以与常规方法一致的方式送递，所述常规方法与对需要治疗的疾病或病症的处理相关。根据本文公开的内容，在足以预防或治疗所述疾病或病症的时间里和条件下，将有效量的制剂给予需要这类治疗的受试者。

被给予本文描述的可溶性杂合FcγR多肽的受试者不仅包括表现出存在IgG介导的炎性病症的患者，而且包括发生具体IgG介导的炎性病症的高风险患者。在某些实施方案中，受试者已被诊断为患有需要治疗的疾病或病症。此外，可在治疗过程中监测所述受试者的所述病症或疾病的任何变化(例如所述疾病或病症的临床症状的增加或减少)。同时，在一些变化方案中，受试者未患需要涉及抑制IgG和Fcγ受体相互作用的治疗的另一疾病或病症。

在预防性应用中，将药物组合物或药物以这样的量给予对具体疾病敏感的或处于患有具体疾病风险中的患者，即该量足以消除或降低所述疾病的风险或延迟所述疾病发病。在治疗应用中，将组合物或药物以这样的量给予疑似患有所述疾病或已经患有所述疾病的患者，即该量足以治疗或至少部分地阻止所述疾病的症状及其并发症。将足以实现这一点的量称为治疗有效的或药物有效的剂量或量。在预防性和治疗性方案中，本发明的可溶性杂合FcγR多肽通常被以多个剂量给予，直至达到足够的反应(例如抑制与IgG和FcγR相互作用或者与IC沉积相关的炎性介体)。通常，监测所述反应，并且如果所需反应开始消退，则给予重复剂量。

为识别本发明的方法治疗的受试患者，可以采用被认可的筛选方法以确定与具体IgG介导的炎性病症相关的风险因素，或者以确定在受试者中被识别的已有病症的状态。这类方法包括，例如确定个体是否有被诊断患有一种具体疾病的亲戚。筛选方法还可以包括，例如常规诊断检查(work-up)，以确定已知具有遗传组分的具体疾病的家族状态。对于该目的，可以常规地使用核苷酸探针来识别携带与具体目的疾病相关的遗传标记的个体。此外，本领域已知大量免疫学方法可用于识别具体疾病的标记。例如，在本领域中有且公知多种采用单克隆抗体探针来检测与具体炎性疾病相关的抗原或自身抗体的ELISA免疫测定方法。可按照已知的患者症状、年龄因子、相关风险因子等的指示进行筛选。这些方法使得临床医生可以常规地选择需要本文所述方法进行治疗的患者。依照这些方法，对IgG介导的炎症的抑制可作为独立治疗程序进行，或者作为其他治疗的后续、附属或并列的治疗方案进行。

为了给药，可将可溶性杂合FcγR多肽配制为药物组合物。可以根据已知的制备可药用组合物的方法配制含有可溶性杂合FcγR多肽的药物组合物，由此将治疗性分子和可药用载体组合形成混合物。如果一种组合物的给药可被接受该组合物的患者耐受，那么该组合物被认为是“可药用载体”。可药用载体可以是适合于待治疗的病症和送递模式的水性载体、油性载体、半固体载体或固体载体。可药用水性载体包括，但不局限于盐水、缓冲盐水(例如磷酸盐缓冲盐水)、5％右旋糖水溶液等。其他合适的载体是本领域技术人员公知的。(参见例如，Gennaro(ed.)，Remington′s Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，19^th ed.1995)。制剂还可包括一种或多种赋形剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂或者防止容器表面上蛋白质损失的白蛋白等。

含有本发明的可溶性杂合FcγR多肽的药物组合物以有效量给予受试者。因此，所述组合物通常以能够产生统计学显著的有益效果——例如统计学显著地减轻或逆转疾病的进程或严重程度——的量给药。根据公认的标准并考虑待治疗的病症的性质和严重度、患者特点等，临床医生可确定精确的剂量。剂量确定在本领域技术人员的能力范围之内。根据本发明的方法，所述多肽可以通过多种给药模式给予受试者，包括例如通过肌内给药、皮下给药、静脉内给药、心房内给药、关节内给药、肠胃外给药、鼻内给药、肺内给药、经皮给药、胸膜内给药、鞘内给药和口腔给药。为了进行预防和治疗，根据给药的途径和方法，可将所述可溶性杂合FcγR多肽以单次推注送递方式、经延长时间的连续送递(例如，连续经皮送递或以延长输注方式)、或者以重复给药方案(例如每小时、每天或每周)的方式给予受试者。静脉内给药将通过推注或用时一般1至数小时的输注。可使用持续释放制剂。

有效剂量的确定通常基于随后进行人临床实验的动物模型研究，并且受以下事件的指导：确定在模型受试者中显著减少受试者疾病或病症的发生或严重度的有效剂量和给药方案。本发明的组合物的有效剂量取决于许多不同因素，所述因素包括给药途径、靶部位、患者的生理状态、患者是人还是动物、服用的其他药物、治疗是预防性的还是治疗性的，以及所述组合物本身的具体活性及其在所述个体中诱发所需反应的能力。通常患者是人，但在一些疾病中，患者可以是非人的哺乳动物。通常调整给药方案，以提供最优治疗反应，即以优化安全性和有效性。因此，治疗或预防有效量还为抑制IgG介导的炎症的有益效果超过任何不良副作用的量。对于可溶性杂合FcγR多肽的给药，剂量通常为约0.1μg至100mg/kg或1μg/kg至约50mg/kg受试者体重，并且更通常是10μg至5mg/kg受试者体重。在更具体的实施方案中，所述药剂的有效量是约1μg/kg至约20mg/kg，约10Pg/kg至约10mg/kg，或约0.1mg/kg至约5mg/kg。在上述范围内的剂量可通过单次给药或多次给药达到，所述多次给药包括例如每天或每日给药、每周给药、隔周给药或每月给药。例如，在某些变化方案中，一种方案包括初次给药以及随后以周或隔周间隔的多次后续给药。另一种方案包括初次给药以及随后以每月或隔月间隔的多次后续给药。或者，可根据监视IgG介导的炎症和/或上述疾病或病症的临床症状的指示无规律地给药。

主治医生可以改变药物组合物的剂量，以在靶部位维持所需的浓度。例如，若选择静脉内送递模式，那么所述药剂在靶组织处的血流中的局部浓度可为约1-50纳摩组合物/升，有时为约1.0纳摩/升至10、15或25纳摩/升，这取决于受试者的状态和目标的测量反应。可以基于送递模式(例如，经表皮送递相对于向粘膜表面的送递)选择较高或较低浓度。剂量还应基于给药制剂(例如鼻喷剂相对于粉剂、持续释放的口服或注射颗粒、经皮制剂等)的释放速率进行调整。例如，为达到相同的血清浓度水平，(在标准情况下)释放速率为5纳摩的缓释颗粒应以约2倍于释放速率为10纳摩的颗粒的剂量给药。

含有可溶性杂合FcγR多肽的药物组合物可以以液体形式、气雾剂形式或固体形式提供。液体形式的实例为可注射溶液、气雾剂、滴剂、局部应用溶液和口服悬液。示例性的固体形式包括胶囊、片剂和控释形式。控释形式的实例为微量渗透泵和植入物(参见例如，Bremer et al.，Pharm.Biotechnol.10：239，1997；Ranade，″Implants in Drug Delivery，″in Drug Delivery Systems 95-123(Ranade and Hollinger，eds.，CRC Press1995)；Bremer et al.，″Protein Delivery with Infusion Pumps，″in ProteinDelivery：Physical Systems 239-254(Sanders and Hendren，eds.，PlenumPress 1997)；Yewey et al.，″Delivery of Proteins from a Controlled ReleaseInjectable Implant，″in Protein Delivery：Physical Systems 93-117(Sandersand Hendren，eds.，Plenum Press 1997))。其他固体形式包括乳剂、糊剂、其他局部应用形式等。

脂质体提供了一种通过以下给药途径将治疗性多肽送递至受试者的方法：静脉内、腹膜内、鞘内、肌内、皮下，或口服、吸入或鼻内给药。脂质体是由一个或者多个脂质双层包围的水性区室组成的微囊(总体上可参见Bakker-Woudenberg et al.，Eur.J.Clin.Microbiol.Infect.Dis.12(Suppl 1)：S61，1993；Kim，Drugs 46：618，1993；Ranade，″Site-SpecificDrug Delivery Using Liposomes as Carriers，″in Drug Delivery Systems3-24(Ranade and Hollinger，eds.，CRC Press 1995))。脂质体在组成上与细胞膜类似，因此脂质体可以安全地给药并且是可生物降解的。根据制备方法的不同，脂质体可为单层的或多层的，脂质体的大小可以不同，并且直径为0.02μm至大于10μm。脂质体中可包封多种药剂：分配于脂双层中的疏水性药剂和分配于内部水性空间中的亲水性药剂(参见，例如Machy et al.，Liposomes In Cell Biology And Pharmacology(JohnLibbey 1987)；Ostro et al.，American J.Hosp.Pharm.46：1576，1989.)。此外，通过改变脂质体的大小、脂质双层的数目、脂质组成以及改变脂质体的荷电特征和表面特性，还可以控制被包封药剂的治疗利用度。

脂质体可吸附在基本所有类型的细胞上，并缓慢释放所包封的药剂。或者，被吸附的脂质体可被吞噬性细胞内吞。内吞作用之后脂质体脂质会在溶酶体内被降解而释放所包封的药剂(参见Scherphof et al.，Ann.N.Y. Acad.Sci. 446：368，1985)。在静脉内给药之后，小脂质体(0.1至1.0μm)通常被主要位于肝脏和脾的网状内皮系统的细胞摄取，而大于3.0μm的脂质体会在肺部沉积。这种利用网状内皮系统的细胞优先摄取较小脂质体的特性已经被用来将化学治疗剂送递到巨噬细胞和肝脏肿瘤中。

可以通过一些方法来绕过所述网状内皮系统，所述方法包括用大剂量的脂质体颗粒饱和或用药理学手段选择性地使巨噬细胞失活(参见Claassen et al，Biochim.Biophys.Acta 802：428，1984)。此外，在脂质体膜中掺入糖脂衍生磷脂或聚乙二醇衍生磷脂已经被证明显著地降低了网状内皮系统的摄取(参见Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1068：133，1991；Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1150：9，1993)。

还可以通过改变磷脂组分或在脂质体中插入受体或反受体(counter-receptor)，从而制备靶向特定细胞或器官的脂质体。例如，已有人使用用高含量的非离子型表面活性剂制备的脂质体来靶向肝脏(参见例如，Hayakawa等人的日本专利04-244,018；Kato et al.，Biol.Pharm.Bull.16：960，1993)。这些制剂通过下述过程制备：将大豆磷脂酰胆碱、α-生育酚和乙氧基化氢化蓖麻油(HCO-60)在甲醇中混合；将混合物在真空中浓缩；然后将混合物在水中复溶。已显示使用二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)与大豆源甾醇糖苷(soybean-derived sterylglucoside)混合物(SG)和胆固醇(Ch)制备的脂质体制剂可以靶向肝脏(参见Shimizu etal.，Biol.Pharm.Bull.20：881，1997)。

或者，可以在脂质体表面结合各种靶向反受体，例如抗体、抗体片段、糖类、维生素类和转运蛋白。例如，为了靶向肝脏，可以用支链型半乳糖苷脂质衍生物修饰脂质体，以使其靶向于脱唾液酸糖蛋白(半乳糖)受体，该受体仅在肝脏细胞的表面表达(参见Kato and Sugiyama，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.14：287，1997；Murahashi et al.，Biol.Pharm.Bull.20：259，1997)。在一种更常用的组织靶向手段中，用特异性针对靶细胞表达的反受体的生物素化抗体对靶细胞进行预标记(参见Harasym etal.，Adv.Drug Deliv.Rev.32：99，1998)。在游离抗体被从血浆中清除之后，给予链亲和素缀合的脂质体。在另一种方法中，直接将靶向抗体连接到脂质体上(参见Harasym et al.，见上文)。

可以使用标准的蛋白质微包封技术将本发明的多肽包封在脂质体内(参见例如Anderson et al.，Infect.Immun.31：1099，1981；Anderson et al.，Cancer Res.50：1853，1990；Cohen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1063：95，1991；Alving et al.″Preparation and Use of Liposomes in ImmunologicalStudies，″in Liposome Technology(Vol.Ill)317(Gregoriadis，ed.，CRCPress，2nd ed.1993)；Wassef et al.，Meth.Enzymol 149：124，1987)。如上所述，可用于治疗的脂质体可含有多种组分。例如，脂质体可含有聚乙二醇的脂质衍生物(参见Allen et al.，Biochim.Biophys.Acta 1150：9，1993)。

已经设计出可降解的聚合物微球来保持治疗性蛋白较高的全身水平。使用例如下述的可降解聚合物来制备微球：聚(丙交酯-共-乙交酯)(PLG)、聚酸酐、聚原酸酯、不可生物降解的乙酸乙基乙烯酯聚合物，其中蛋白质被捕获在聚合物中(参见例如，Gombotz and Pettit，Bioconjugate Chem.6：332，1995；Ranade，″Role of Polymers in DrugDelivery，″in Drug Delivery Systems 51-93(Ranade and Hollinger，eds.，CRC Press 1995)；Roskos and Maskiewicz，″Degradable ControlledRelease Systems Useful for Protein Delivery，″in Protein Delivery：Physical Systems 45-92(Sanders and Hendren，eds.，Plenum Press 1997)；Bartus et al.，Science 281：1161，1998；Putney and Burke，NatureBiotechnology 16：153，1998；Putney，Curr.Opin.Chem.Biol.2：548，1998)。聚乙二醇(PEG)包被的纳米颗粒还可以作为用于静脉内送递治疗性蛋白的载体(参见例如，Gref et al.，Pharm.Biotechnol.10：167，1997)。

本领域技术人员可以如下述文献所述设计其他剂型，所述文献例如，Ansel and Popovich，Pharmaceutical Dosage Forms and Drug DeliverySystems(Lea & Febiger，5th ed.1990)；Gennaro(ed.)，Remington′sPharmaceutical Sciences(Mack Publishing Company，19th ed.1995)，andRanade and Hollinger，Drug Delivery Systems(CRC Press 1996)。

药物组合物可以以试剂盒的形式提供，所述试剂盒包含装有本发明的可溶性FcγR多肽的容器。本发明的FcγR多肽可以以用于单次剂量或多次剂量的可注射溶液的形式提供，或者以可在注射前复溶的无菌粉剂的形式提供。或者，这类试剂盒可包括一个用于给予治疗性多肽的干粉分散器、液体气雾发生器或喷雾器。这类试剂盒还可包括关于所述药物组合物的适应症和用法的文字信息。此外，这类信息可以包括如下声明，即含有所述可溶性杂合FcγR多肽的组合物禁用于已知对FcγR过敏的患者。

如上所讨论，本发明的可溶性杂合FcγR多肽对多种IgG介导的炎性疾病有治疗潜力。炎症作为生物体防御侵入物质的一种保护性反应，是一种涉及多种细胞介体和体液介体的级联事件。一方面，抑制炎性反应可使宿主成为免疫妥协宿主；然而，如果听之任之，则炎症可导致一些严重的并发症，例如慢性炎性疾病。重要的是，这些不同的疾病状态都共有相同的炎性介体。这些具有炎症特征的集体疾病对于人类的发病率和致死率有很大的影响。除此之外，本文描述的研究还显示了可溶性FcγR阻断免疫复合物的结合和信号传递的能力，以及可溶性FcγR治疗IgG介导的疾病的能力。因此，本发明的可溶性杂合FcγR多肽对很多人和动物的疾病有治疗潜力，所述疾病例如本文所讨论的IgG介导的和免疫复合物介导的疾病。在下文IH(A)和IH(B)部分进一步描述可用可溶性杂合FcγR治疗的示例性疾病。

A.免疫复合物介导的疾病

抗原与其同族抗体(cognate angitbody)的结合会产生免疫复合物，并且这些免疫复合物在组织中的沉淀是许多自身免疫疾病的致病机制(参见Jancar and Crespo，Trends Immunol.26：48-55，2005)。这些疾病包括结缔组织自身免疫疾病例如系统性红斑狼疮(SLE)、皮肌炎、类风湿性关节炎、斯耶格伦氏综合征和混合型结缔组织病；不同病因学的疾病例如冷球蛋白血症、结节性多动脉炎和抗磷脂综合征；以及与包括细菌、病毒和寄生物感染的外源抗原相关的疾病、与有机粉尘有关的疾病以及血清病型疾病，包括对感染、毒蛇咬伤和药物超敏的被动免疫疗法。尽管这其中的每一种病症都是由特定的抗原-抗体对引起并表现出特定的抗原-抗体对，但组织损伤的机制是类似的：形成循环系统免疫复合物，然后他们在组织中沉淀(参见Jancar and Crespo，见上文)。抗原-抗体复合物通过触发炎症而损伤组织，炎症是一个部分地通过免疫复合物与细胞表面的Fcγ受体结合并通过免疫复合物固定补体的能力介导的过程。

在正常情况下，免疫复合物被网状内皮系统的吞噬细胞清除。但是在某些情况下，免疫复合物在组织中积累并沉淀，引起III型超敏反应(参见Jancar and Crespo，见上文)。当免疫复合物在血液中形成时，沉淀可出现在非抗原进入部位的部位。复合物沉淀通常可在出现血浆滤过的部位观察到，例如血管壁上、关节的滑膜中、肾脏肾小球基底膜上和脑的脉络丛上(参见Jancar and Crespo，见上文)。这是在免疫复合物介导的疾病例如冷球蛋白血症中观察到关节炎、血管炎和肾小球肾炎高发生率的原因。

免疫复合物在组织中沉淀后，它们通过IgG的Fc区结合细胞表面FcγR。如前文指出的，FcγR作为免疫系统的体液免疫和细胞免疫方面之间的连接起到至关重要的作用(参见Cohen-Solal et al.，Immunol.Lett.92：199-205，2004；Hogarth et al.，Curr.Opin.Immunol.14：798-802，2002；Nakamura et al.，Expert Opin.Ther.Targets 9：169-190，2005；Nimmerjahn，Springer Semin.Immunopathol.28：305-319，2006)。通过IgG的Fc部分连接这些细胞表面受体，能触发多种免疫效应物功能，例如抗原呈递、依赖抗体的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用和炎性介体的释放。Fcγ受体的3个主要种类——FcγRI、FcγRII和FcγRII——在人免疫系统部分重叠的特定细胞亚群表达，表达模式可解释它们在免疫内稳态中的不同功能(参见Nakamura et al.，见上文)。除FcγRI表现出对单体IgG的高亲和力外，其他FcγR亚类是低亲和力的IgG受体(参见Cohen-Solal et al.，见上文；Hogarth et al.，见上文)。然而，这些细胞受体通过多重Fc:FcγR相互作用以高亲和力结合抗原-抗体免疫复合物(IC)。这种性质被认为可使表达FcγRII和/或FcγRIII的细胞对其细胞外环境取样并且在面对饱和量的单体IgG时对IC作出合适的反应(参见Hogarth et al.，见上文)。

作为识别表现该能力的可溶性受体的筛选工作的一部分，将每种天然人FcγR的可溶性细胞外结构域在CHO细胞中表达并从它们的条件培养基中纯化至同质。尽管每种rh-FcγR在数种体外系统中均减少了免疫复合物介导的炎性事件，但是仅高亲和力受体FcγRIA在小鼠皮肤逆转被动阿尔图斯反应中稳定地减少炎症。此结果是意料之外的，因为FcγRIA作为单体IgG的高亲和力受体，通常被认为在体内被循环单体IgG所饱和并因此不能结合IC。FcγRIA的全身送递还能消除胶原抗体诱导的鼠关节炎模型中的炎症，这一观察结果表明FcγRIA可能是一种用于治疗免疫复合物介导的疾病的新型治疗剂。此外，这些结果支持使用Fcγ的其他可溶性高亲和力受体——包括本文所述的杂合Fcγ受体——用于治疗这类病症。

因此，通过阻断免疫复合物与细胞表面Fcγ受体的结合，本发明的可溶性杂合FcγR多肽可减少炎性细胞因子分泌并减少炎性细胞类型例如中性粒细胞的浸润。如本文描述的研究所表明，可溶性FcγRIA阻断了抗原-抗体免疫复合物的沉淀并抑制了免疫复合物介导的细胞因子从肥大细胞中的分泌(参见下文的实施例9和10)。此外，在对小鼠的研究中，可溶性FcγRIA减少了皮肤逆转被动阿尔图斯反应中的水肿和中性粒细胞浸润并减少了胶原抗体诱导的关节炎模型中以及还有胶原诱导的小鼠关节炎中的爪炎症(参见下文的实施例9-11和13)。因此，可溶性FcγRIA及本文描述的其杂合形式可用于治疗人或其他非人物种的多种免疫复合物介导的疾病。

1.冷球蛋白血症

术语冷球蛋白血症是指在血清中存在一种(单克隆冷球蛋白血症)和多种(混合型冷球蛋白血症)在低于37℃的温度下发生可逆沉淀的免疫球蛋白(参见Meltzer and Franklin，Am.J.Med.40：828-836，1996；Dammacco et al.，Eur.J.Clin.Invest.31：628-638，2001；Sansonno et al.，Rheumatology(Oxford)46：572-578，2007)。低温沉淀的机制尚不清楚，但可能涉及Ig结构、Ig Fc区的自缔合和/或IgM类风湿因子活性的变化(参见Sansonno and Dammacco，Lancet Infect.Dis.5：227-236，2005)。冷球蛋白血症分为三个亚类(参见Dammacco et al.，见上文)：I型由单个单克隆Ig组成；II型由单克隆IgM和多克隆IgG的混合物组成；III型是多克隆IgM/IgG的混合物。I、II和III型冷球蛋白血症在所有具有血清低温沉淀物的人群中分别占约10-15％、50-60％和30-40％(参见Dammacco et al.，见上文；Sansonno et al.，见上文)。

冷球蛋白血症患者最常表现出紫癜、虚弱和关节痛的临床三联征，还表现出肾小球肾炎、血管炎、外周神经病变、关节炎及/或咯血和呼吸困难的肺部症状(参见Dammacco et al.，见上文；Sansonno et al，见上文；Ferri et al.，Cleve.Clin.J.Med.69 Suppl 2：SII20-23，2002(″Ferri et al.I″)；Ferri et al.，J.Clin.Pathol.55：4-13，2002(″Ferri et al.II″))。可观察到冷球蛋白血症与多种病症相关，所述病症包括多发性骨髓瘤、淋巴组织增生病症、结缔组织病、感染和肝病(Ferri et al.I，见上文；Ferri et al.II，见上文)。在发现丙型肝炎病毒(HCV)前和开发出检测抗HCV抗体的方法以前，无可识别的潜在疾病的患者被认为有特发性或“原发性”混合型冷球蛋白血症。现已知“原发性”混合型冷球蛋白血症与HCV感染强相关，并包括患有II型和III型冷球蛋白血症的大部分患者(参见Sansonno et al.，见上文)。目前的证据表明，原发性混合型冷球蛋白血症发生在对丙型肝炎感染的异常免疫反应导致形成由丙型肝炎抗原、多克隆丙型肝炎特异性IgG和单克隆IgM类风湿因子组成的免疫复合物时。这些免疫复合物在敏感组织部位的沉积触发导致原发性混合型冷球蛋白血症临床症状的炎症级联反应(Dammacco et al.，见上文；Sansonnoet al.，见上文)。

冷球蛋白血症还与除HCV之外的其他多种感染有关(参见Ferri etal.II，见上文)，包括病毒来源的感染，所述病毒例如巨细胞病毒(CMV)、非洲淋巴细胞瘤病毒(Epsterin-Bar virus，EBV)、人免疫缺陷病毒(HIV-1)和乙型肝炎病毒(HBV)；细菌来源的感染，所述细菌包括肺炎支原体(Mycoplasma pneuymoniae)、梅毒螺旋体(Treponemapallidum)(syphilis)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、立克次氏体Q热(Coxiella Burnetti Q fever)、布鲁氏菌(Brucella)；以及寄生物例如鼠弓形体(Toxoplasma gondii)和内脏利什曼原虫(Visceral leishmaniasis)的感染。

原发性混合型冷球蛋白血症被认为是原发性血管炎病症。教堂山命名共识会议(The Chapel Hill Consensus Conference)(CHCC)对血管炎的分类是基于受损的血管的大小，将所述疾病分为影响大血管、中血管或小血管的疾病(参见Jennette et al.，Cleve.Clin.J.Med.69Suppl2：SII33-38，2002；Fiorentino，J.Am.Acad.Dermatol.48：311-340，2003)。重要的是，两种血管炎综合征与免疫复合物的沉积有关：亨诺-许兰二氏紫癜与含有IgA的免疫复合物的沉淀有关；而原发性冷球蛋白血症性血管炎与IgG/IgM免疫复合物的沉积有关(参见Fiorentino，见上文)。

在已报道的病例中，原发性混合型冷球蛋白血症中HCV感染的发生率取决于地域，为40-100％。全世界大约有2亿人被HCV长期感染，每年报道有350万例新感染(参见Sy and Jamal，Int.J.Med.Sci.3：41-46，2006)。美国的发生率和流行率为每年30,000例新感染和390万例慢性感染(参见Sy and Jamal，见上文)。大约50-60％的慢性HCV感染患者在其血清中有冷球蛋白，并且在约5％的病例中有明显的冷球蛋白血症综合征(参见Sansonno et al.，见上文；Sansonno and Dammacco，见上文)。乙型肝炎病毒已经被描述为5％的混合型冷球蛋白血症患者的病原体(参见Ferri et al.I，见上文)。

目前对冷球蛋白血症的疗法包括对中度疾病采用低剂量类固醇，而类固醇的结合物、环磷酰胺或血浆置换用于更严重的疾病形式。患有活性HCV介导的肝炎的患者经常用干扰素-α和利巴韦林的结合物进行治疗。

可在动物疾病模型中体内测试本发明的FcγRIA多肽的效力。用于评估可溶性FcγRIA对抗免疫复合物介导的疾病包括冷球蛋白血症的效力的特别合适的动物模型是过表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)的小鼠，所述TSLP是有促B细胞性质的白细胞介素-7(IL-7)样细胞因子。TSLP小鼠产生大量混合的IgG-IgM组合物的循环冷球蛋白(参见Taneda et al.，Am.J.Pathol.159：2355-2369，2001)。由于免疫复合物在肾、肝、肺、脾和皮肤中沉积，混合型冷球蛋白血症在这些动物中的形成与涉及上述组织的系统性炎性疾病有关(参见Taneda et al.，见上文)。这些动物中的肾病非常类似于在有HCV感染的患者中所见的人冷球蛋白血症性肾小球肾炎。在去除抑制性受体Fcγ受体IIb后，肾脏损伤加重，并且发病率和死亡率加速，这证明了Fcγ受体在疾病进程中的作用(参见Muhlfeld et al.，Am.J.Pathol.163：1127-1136，2003)。在下文实施例12中将进一步描述用本发明的重组可溶性FcγR治疗TSLP转基因小鼠。

2.系统性红斑狼疮

系统性红斑狼疮(SLE)是一种复杂的多器官(系统性)自身免疫病症，其特征为致病的自身抗体的产生以及随后的免疫复合物沉积，这会导致广泛的组织损伤。尽管SLE的病因未知，但多种遗传因素、环境因素和激素因素被认为在该疾病中起作用(参见Hahn，″Systemic LupusErythematosus″in Harrison′s Principles of Internal Medicine Medicine(Kasper et al.eds.，McGraw-Hill，New York 2005))。SLE的临床特征是过程时好时坏，并涉及包括皮肤、肾和中枢神经系统的多个器官(Lupus：Molecular and Cellular Pathogenesis(Kammer and Tsokos eds.，HumanPress，N.J.，1st ed.1999)；Systemic Lupus Erythromatosus(Lahita ed.，Academic Press，Amsterdam，3rd ed.1999))。因此，该疾病表现出各种各样的症状和临床特点，包括全身性的、皮肤的、肾的、肌肉骨骼的和血液的。

SLE的总患病率为约2000分之一，700名高加索妇女中有约1人在其生命中会发生SLE(Lahita，Curr.Opin.Rheumatol.11：352-6，1999)。仅在美国，超过50万人患有SLE，并且绝大部分是育龄女性(Hardin，J.Exp.Med.185：1101-1111， 2003)。

对于诊断SLE没有单一标准。美国风湿病学学院(The AmericanCollege of Rheumatology)已制定了11条诊断SLE的标准，所述标准跨越皮肤测试、全身测试和实验室测试方面的SLE的临床表现。这些标准包括面颊疹、盘状疹、对日光敏感、口腔溃疡、关节炎、浆膜炎、肾脏和中枢神经系统炎症、血液变化和抗核抗体的存在情况。患者必须符合这其中的四条标准才能被分类为SLE患者(Tan et al.，ArthritisRheumatol.25：1271-1277，1982)。通常通过以下测试确认SLE，所述测试包括但不局限于：检测抗核抗体的血液测试、评估肾功能的血液和尿液测试、检测通常与SLE相关的低水平补体的存在情况的补体测试、测量炎症水平的沉降速率(ESR)或C反应蛋白(CRP)、评估肺损伤的X射线检查和评估心脏损伤的EKG。

SLE的标准疗法是给予类固醇糖皮质激素——一种全身性免疫反应抑制剂。可将它用于减轻症状；但是，对于SLE目前没有治愈的方法。通常给予低于每天0.5mg/kg水平的低剂量口服泼尼松。遗憾的是，这种疗法不足以维持患者的好转，所述疾病的突然加剧频繁出现。突然加剧可以通过连续3天以静脉内脉冲每天30mg甲基泼尼松龙/kg/的高剂量糖皮质激素进行控制。然而，高剂量类固醇治疗会对患者带来严重的副作用。

这些标准疗法通常是非特异性的，经常与严重的副作用有关，不会显著影响所述疾病的进程或向危及生命的肾脏并发症(狼疮肾炎，LN)的过渡。因此，本领域长期需要开发用于治疗SLE的新方法。

3.类风湿性关节炎

类风湿性关节炎(RA)以慢性关节炎症为特征，所述炎症一般会导致组织损伤和关节变形。尽管确切的病因不清楚，但通常认为它是免疫复合物、多种淋巴样细胞类型(T细胞、B细胞、中性粒细胞、巨噬细胞)、多种促炎细胞因子例如TNF-α和IL-1β起作用的自身免疫疾病(参见Harrison′s Principles of Internal Medicine(Kasper et al.eds.，McGraw-Hill，New York 2005)；Olsen and Stein，N.Engl.J.Med.350：2167-2179，2004)。

类风湿性关节炎(RA)是影响全身的系统性疾病，并且是关节炎的最常见形式之一。RA是免疫介导的，具体特征是炎症和后续的组织损害，从而导致严重的残疾和死亡率的增加。具体而言，以关节内膜的炎症为特征，所述炎症可导致疼痛、僵硬、温热、发红和肿胀。炎性细胞释放可消化骨和软骨的酶。由于类风湿性关节炎，发炎的关节内膜，即滑膜，可侵入并破坏骨和软骨，导致关节损害和剧烈疼痛以及其他生理效应。所涉及到的关节可能变形和弯曲，导致疼痛和运动能力的丧失。

多种细胞因子在类风湿性关节中局部地产生。多项研究已证明，两种原型促炎细胞因子IL-1和TNF-α在涉及滑膜炎症和进行性关节破坏的机理中起重要作用。实际上，在RA患者中给予TNF-α和IL-1抑制剂已使炎症的临床征兆和生物学征兆得到巨大改善，并且减少了使骨侵蚀和软骨破坏的放射学征兆。然而，尽管有这些令人鼓舞的结果，但是很大百分比的患者对这些药剂无反应，表明其他介体也参与关节炎的发病机制(Gabay，Expert.Opin.Biol.Ther.2：135-149，2002)。由于RA以存在抗II型胶原(关节软骨的一种主要细胞外基质组分)的抗体为特征，这些抗体被认为通过它们与滑膜细胞或位于关节空间内的其他炎性细胞相互作用介导炎性细胞因子(例如上文所述的炎性细胞因子)的释放。

在RA的发病机理中可能重要的免疫异常还包括在关节液细胞和在血管炎中发现的免疫复合物。促成这些复合物的是浸润滑膜组织并可以产生促炎细胞因子的T辅助细胞和浆细胞产生的抗体(例如RF7)。在病变滑膜中还有大量的巨噬细胞及其细胞因子(例如TNF、GMCS-F)。黏着分子的水平增加有助于炎性细胞的迁出和在滑膜组织中的停留。巨噬细胞来源的内膜细胞和一些淋巴细胞的增加也是显著的。

被认可的RA治疗包括改良疾病的抗风湿药(DMARD)，例如羟氯喹、柳氮磺胺吡啶、甲氨喋呤、来氟米特(leflunomide)、利妥昔单抗(rituximab)、英夫利昔单抗(infliximab)、硫唑嘌呤、D青霉胺、Gold(口服或肌内给药)、二甲胺四环素和环孢菌素，皮质类固醇例如泼尼松与非类固醇抗炎药物(NSAIDS)。这些治疗一般是非特异性的，经常与严重的副作用相关，并且不显著影响关节破坏的进程。因此，本领域长期需要开发用于治疗RA的新方法。

本发明的可溶性FcγRIA多肽能够阻断免疫复合物和滑膜中的炎性细胞类型的相互作用，并防止炎症。因此，本发明的FcγRIA多肽可作为减少类风湿性关节炎和其他关节炎疾病中的炎症的有价值的治疗剂。

本领域已知数种类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发生与人类风湿性关节炎非常相似的慢性炎性关节炎。由于CIA具有与RA相似的免疫学特征和病理学特征，这使得它成为用于筛选潜在的人用抗炎化合物的理想模型。CIA模型是一种广为人知的依赖免疫反应和炎性反应而出现的小鼠模型。所述免疫反应包括B细胞和CD4+T细胞响应作为抗原给予的胶原而出现的相互作用，并导致抗胶原抗体的产生。炎性期是组织对炎症介体发生反应造成的，而炎症是这其中的一些抗体与小鼠天然胶原发生交叉反应并激活细胞Fc受体和/或补体级联反应所致。使用CIA模型的一个优点是其发病的基本机理是已知的。已经识别了II型胶原上与T细胞和B细胞相关的表位，并且已确定了与免疫介导的关节炎相关的多种免疫学参数(例如延迟型超敏和抗胶原抗体)和炎性参数(例如细胞因子、趋化因子和基质降解酶)，因此可将这些参数用于评价测试化合物在CIA模型中的效力(Wooley，Curr.Opin.Rheum.3：407-20，1999；Williams et al.，Immunol.89：9784-788，1992；Myers et al.，Life Sci.57：1861-78，1997；和Wang efal.，Immunol.92：8955-959，1995)。

向这些CIA模型小鼠给予本发明的可溶性杂合FcγR多肽可用于评估可溶性FcγR用于缓解疾病症状和改变疾病进程的用途。例如但非限制，给每只小鼠注射0.1mg至2.0mg本发明的可溶性杂合FcγR多肽(通过皮下、腹膜内或肌内给药途径每周1至7次，长达但不限于4周)，能够显著降低疾病评分(爪评分、炎症或疾病发生)。本发明的拮抗剂可有效地预防类风湿性关节炎和防止其进程，这依赖于给药的开始时间(例如在胶原免疫之前或之时，或在第二次胶原免疫之后的任何时间点，包括已经发病的时间点)。如本文描述的研究所示，给予可溶性FcγRIA多肽(SEQ ID NO：2的残基16-282)在小鼠CIA模型中缓解了症状并改变了疾病进程(参见下文实施例13)。

免疫复合物介导的风湿性疾病的另外一个模型是胶原抗体诱导的小鼠关节炎模型(参见Terato et al.，J.Immunol.48：2103-2108，1992)。通过静脉内注射四种单克隆抗体(例如来自Chemicon的抗II型胶原的Arthrogen-CIA)的混合物在这个模型中诱导了关节疾病。用于在小鼠中诱导关节炎的Arthrogen-CIA是四种克隆的混合物，所示四种克隆识别II型胶原的CB11结构域内的83个氨基酸的多肽中的各个表位(Chemicon International technical brochure)。来自人、小鼠、牛、鸡、猴和大鼠的II型胶原中的这些表位是相似的。抗体定位至小鼠的关节，它们在关节处与软骨特异性II型胶原形成免疫复合物。抗原-抗体免疫复合物被认为通过它们与位于关节内的炎性细胞类型表面的Fcγ受体相互作用诱发疾病。一般而言，在第0天，通过静脉内给药将2-4mg的Arthrogen-CIA混合物注入小鼠中。3天后跟进的是腹膜内注射50-100μg的LPS(参见Terato et al.，Autoimmunity22：137-147，1995)。呈现红肿爪的关节炎在1-2天形成。在一项典型的实验中，通过以溶于合适运载体(vehicle)中的可溶性FcγRIA(100-2000μg蛋白质)进行注射，在第0天或第3天处理小鼠。例如，可从第0天或第3天开始隔天进行可溶性杂合FcγR的给药。每只动物的关节炎评分可以评估为每天的关节肿胀和关节厚度。在一项典型实验中，可溶性杂合FcγR降低了关节炎评分。

4.混合型结缔组织病

混合型结缔组织病是一种罕见的病症，以SLE、系统性硬化、多肌炎或皮肌炎以及RA的临床特征为特征，并以极高效价的针对核糖核蛋白(RNP)抗原的循环抗核抗体为特征(参见Harrison′s Principles ofInternal Medicine，见上文；Kim and Grossman，Rheum.Dis.Clin.NorthAm.31：549-565，2005；Venables，Lupus 15：132-137，2006)。这种高效价的抗体现在被称为抗U1RNP，已经成为将MCTD认为是不同的临床实体的判据。认为MCTD是SLE或硬皮病的亚类的人一直都质疑将MCTD作为不同的病症。其他人更愿意将MCTD归为未分化的结缔组织病。手肿胀、雷诺现象(Raynaud′s phenomenon)、多关节痛(polyarthralgia)、炎性肌病、食道运动不足和肺功能障碍是常见的。诊断通过结合临床特征、RNP的抗体和缺乏其他自身免疫疾病特异性抗体进行。在一些患者中，该病症可发展成经典的系统性硬化或SLE。

雷诺现象可能比其他表现早几年出现。首个表现常常类似于早期SLE、硬皮病、多肌炎或皮肌炎或者RA。无论最初的表现是什么，有限的疾病倾向于发展并变得分布广泛，并且临床模式随时间发生变化。最常见的是手肿胀，最终产生手指的香肠样表象。皮肤的观察结果包括狼疮或皮肌炎样疹。弥散性硬皮病样皮肤变化和手指的缺血性坏死或溃疡在MCTD中频率低得多。几乎所有的患者都有多关节痛，并且75％有frank关节炎。关节炎一般是非变形的，但是会出现与RA中的类似的侵蚀性变化和畸形。有触痛或无触痛的近端肌无力是常见的。肾病出现在约10％的患者中，并且常常较轻，但偶尔会发病或引起死亡。三叉神经感觉性神经病在MCTD中比在其他结缔组织病中频率更高。类风湿因子常为阳性，并且效价经常较高。ESR经常升高。

当在疑似患有SLE、硬皮病、多肌炎或RA的患者中存在另外的部分重叠特征时，一般怀疑是MCTD。首先检测患者的抗核抗体(ANA)和可提取性核抗原的抗体(ENA)以及RNP抗原。如果这些测试的结果与MCTD一致(例如，RNP抗体很高)，就检测γ-球蛋白水平、血清补体水平、类风湿因子、抗Jo-1(抗组胺酰t-RNA合成酶)和ENA的核酸核糖酶抗性Smith(Sm)组分的抗体，以及双链DNA，以排除其他可能的诊断。进一步的检查取决于症状和征兆；肌炎的表现、这些器官的肾累及(renal involvment)或肺累及的快速检测(例如，CPK、MRI、肌电图或为诊断肌炎进行的肌肉活组织检查)。

总的10年存活率为80％，但是预后很大程度上取决于是哪种临床表现占优势。死亡的原因包括肺动脉高压、肾衰竭、MI、结肠穿孔、播散性感染和脑出血。有些患者保持好转达多年而无需治疗。

混合型结缔组织病(MCTD)出现于全球和所有种族中，在十多岁和二十多岁的人群中发生率最高，但是MCTD也会出现于儿童和老年人中。发病者主要是女性。发生率和流行率尚未被清楚地建立。在多数研究中，有MCTD的临床特征和血清学特征的患者数目是有SLE的患者的约4分之一，表明总流行率为约10/100,000(参见Harrison′s Principlesof Internal Medicine，见上文；Venables，见上文)。

目前对MCTD的治疗类似于对SLE的治疗，如果疾病为中度或重度则使用皮质类固醇。多数中度或重度疾病的患者对皮质类固醇有响应，特别是如果及早进行治疗。轻度疾病经常用水杨酸盐、其他NSAID、抗疟药或有时用低剂量的皮质类固醇进行控制。严重的主要器官累及通常需要较高剂量的皮质类固醇。

5.HBV相关的结节性多动脉炎

Kussmaul和Maier最初在1866年描述，典型的结节性多动脉炎(PAN)是以各不相同的症状为特征的多系统病症(参见Fiorentino，J.Am.Acad.Dermatol.48：311-340，2003；Harrison′s Principles of InternalMedicine，见上文)。PAN是小肌肉动脉和中肌肉动脉的坏死性血管炎，具有累及肾脏和内脏动脉的特征。损伤是有节段性的，并且倾向于参与动脉的分叉和分枝。在该疾病的急性期，中性粒细胞浸润血管壁的所有层和血管周围区域，导致血管壁的内膜增殖和变性。随着损伤发展，单核细胞浸润所述区域，导致危及内腔的血管纤维蛋白样坏死、血栓形成、所述血管供养的组织梗死以及出血(参见Fiorentino，见上文)。

患有系统性血管炎、尤其是PAN型系统性血管炎并且被分离出由乙型肝炎病毒抗原组成的循环免疫复合物的患者10-30％出现乙型肝炎抗原血症，表明免疫在该疾病的发病机理中的作用。上述观点受到这样的发现的支持，即发现乙型肝炎抗原、IgM和补体沉积在患有该病的患者的血管壁中(参见Fiorentino，见上文)。

患者通常出现发热、体重减轻、关节痛和身体不适。肌肉萎缩、腹痛、单神经炎并发症(mononeutitis complex)、高血压、睾丸炎和充血性心力衰竭是证明各个器官系统的血管受累及的主要症状。如果是继发自乙型肝炎感染，那么临床发现是相同的。对未经治疗的PAN的预后很差，据报道为5年存活率为10-20％(参见Harrison′s Principles of InternalMedicine，见上文)。死亡通常是由胃肠道并发症(特别是肠梗塞和肠穿孔)和心血管诱因引起的。

难以建立准确的PAN发生率，因为以前的报道混合了PAN与显微镜下多血管炎和相关的血管炎病症的发生率。然而，估计PAN的发生率为每一百万5-9例(参见Fiorentino，见上文)，并且估计约6％的病例是由于HBV感染，但已报道了10-54％的频率范围(26，27)。

目前用类固醇和环磷酰胺或者单独使用类固醇来治疗PAN患者(参见Fiorentino，见上文)。对于具有HBV的患者，当与血浆置换组合使用时，使用干扰素-α与阿糖腺苷(vidarabine)和拉米夫定(lamivudine)或者单独使用干扰素-α的抗病毒治疗是有效的(参见Fiorentino，见上文；Harrison′s Principles of Internal Medicine，见上文)。

6.寻常天疱疮

寻常天疱疮(PV)是最常见于年老患者的发疱性皮肤疾病。该病以皮肤表皮细胞之间失去内聚力并导致表皮内水疱形成为特征。对受损的或者完好的患者皮肤的直接免疫荧光分析显示IgG在角质形成细胞表面沉积。这类沉积物源自抗桥粒芯蛋白(desmoglein)(Ca²⁺依赖型钙黏着蛋白(cadherin)家族的跨膜糖蛋白)的循环IgG自身抗体。PV可能危及生命。目前的主要治疗是全身类固醇，如泼尼松。还可使用其他免疫抑制剂，如硫唑嘌呤和麦考酚酸莫酯(参见Harrison′s Principles ofInternal Medicine，见上文)。

7.外源抗原相关的疾病

外源抗原引起大量的免疫复合物疾病，包括由病毒、细菌或寄生物引起的那些免疫复合物疾病，以及由暴露于外来蛋白或药物引起的血清病(参见Jancar and Crespo，见上文；Harrison′s Principles of InternalMedicine，见上文；Knowles and Shear，Dermatol.Clin.25：245-253，2007；Wolf et al.，Ciin.Dermatol. 23：171-181，2005)。与组织免疫复合物沉积相关的细菌感染包括：链球菌感染、葡萄球菌感染和脑膜炎球菌感染；巴尔通体病、疏螺旋体病、麻风病、梅毒和钩端螺旋体病。病毒感染包括：乙肝病毒感染(结节性多动脉炎)、丙型肝炎病毒感染(冷球蛋白血症)、HIV相关的免疫复合物肾病、人细小病毒B19感染、CMV感染、传染性单核细胞增多症和登革出血热。寄生物疾病包括：锥虫病、疟原虫病、弓浆虫病和血吸虫病。

目前，最常见的血清病样反应是由于暴露于非蛋白质药物所致。引起血清病样反应的药物包括：别嘌呤醇、砷和汞的衍生物、巴比妥酸盐、丁胺苯丙酮、头孢菌素、呋喃唑酮、金盐、灰黄霉素、肼苯哒嗪、英夫利昔单抗、碘化物、甲基多巴、青霉素、苯妥英、哌嗪、普鲁卡因酰胺、链激酶和磺氨类药物。血清病样反应的其他诱因包括暴露于异源血清、变应原提取物、血液制品、激素、膜翅目昆虫毒液和疫苗。

B.涉及抗体产生的其他疾病

1.特发性血小板减少性紫癜(ITP)

特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种系统性自身免疫疾病，以存在导致血小板破坏(导致血小板减少)的抗特定血小板膜糖蛋白的自身抗体(IgG＞IgM)为特征，其还以大范围的瘀斑和粘膜出血、贫血和极度虚弱为特征(参见Harrison′s Principles of Internal Medicine，见上文；Cines and McMillan，Annu.Rev.Med.56：425-442，2005；Stasi and Provan，Mayo Clin.Proc.79：504-522，2004)。

血小板计数变得极少，并且可以观察到自发性牙龈出血、胃肠道出血和鼻出血。紫癜是指皮肤和粘膜(例如口腔内膜)的紫色样区域，这些区域由于血小板减少而出现出血。身体检查可能显示脾脏变大。典型的疹由于皮肤中的小血管的显微镜下出血而出现。低于10,000的血小板计数可导致自发出血至脑内，导致死亡。也被称作免疫性血小板减少性紫癜、出血性紫癜、血小板减少性紫癜和韦尔霍夫病。尽管多数病例是无症状的，但是很低的血小板计数可能导致出血素质和紫癜。有两类ITP，影响儿童的急性ITP(在男性和女性中的发生率类似)和影响成人的慢性ITP(更常见于女性；2.6比1；72％的大于10岁的ITP患者是女性)。多数儿童无需治疗即可康复。儿童中的流行率峰值出现在2-4岁，而成人为20-50岁；所有ITP患者中大约40％小于10岁。

ITP的发生率：每年每100,000儿童有4-8例，每一百万成人有66例，每一百万儿童有50例。慢性顽固性ITP的新病例包括每年每一百万人约10例。估计美国患有ITP的个体数为大约200,000。每年每一百万人有大约100例总的新ITP病例。大约一半新病例出现在儿童中。

轻度ITP不需要治疗。当血小板计数降低到低于每微升10,000，或者出现出血时(例如，在消化道中或严重的鼻出血)低于50,000，通常开始用类固醇治疗(参见Cines and McMillan，见上文)。将静脉内免疫球蛋白(IVIg)用于危及生命的病例。随后可使用所谓的类固醇减量剂(steroid-sparing agent)(或称作DMARD)。如果这些策略都不起作用，则经常进行脾切除术，因为被靶向破坏的血小板会在脾脏中死亡。一种相对较新的策略是用抗-D治疗，所述抗-D是常用于由Rh+婴儿导致的对恒河猴抗原过敏的母亲的一种药剂。其他化学治疗药物如长春新碱、硫唑嘌呤(Imuran)、达那唑、环磷酰胺和环孢菌素仅在其他治疗没有益处的严重情况下才开给患者，因为这些药物有潜在的有害副作用。IVIg尽管有效，但是它价格昂贵并且改善是暂时的(通常持续不到1个月)。然而，对于具有危险的低血小板计数且对其他治疗响应差的脾切除术前ITP患者，IVIg治疗能增加血小板计数，降低脾切除术的危险。

2.斯耶格伦氏综合征

斯耶格伦氏综合征(SS)是一种慢性自身免疫病症，以淋巴细胞浸润唾液腺和泪腺、导致眼干和口干为特征。它被分类为原发性(无潜在的结缔组织病症的自身免疫干燥综合征)或继发性(在患有例如RA、SLE或SSc的结缔组织病症的患者中的自身免疫介导的干燥综合征)(参见Harrison′s Principles of Internal Medicine，见上文)。SS的女性与男性比例为9∶1，诊断时的平均年龄为60岁。一种发病机理模型假定在合适的遗传/激素背景下病毒或环境创伤(insult)可导致唾液腺和泪腺的上皮炎。所产生的单核细胞浸润物(约70％的CD4+T细胞、25％的CD8+T细胞、20-30％的B细胞)释放细胞因子(IFNγ)，其又接着激活释放促炎细胞因子TNFα、IL-1β和IL-6的巨噬细胞。然后，这些细胞因子引起MMP从腺泡细胞的释放，这会降解基底膜胶原。过一段时间，腺组织被瘢痕组织和脂肪所代替(参见Harrison′s Principles ofInternal Medicine，见上文)。

除了口干/眼干症状外，其他症状可包括：食道运动不足、外周神经病变关节痛和纤维肌痛。60％的患者存在自身抗体(类风湿因子、ANA、Ro/SS-A和La/SS-B)，并且经受极度疲劳。据报道，SS患者形成淋巴瘤的风险达44倍。

已将多种治疗用于SS，包括NSAID、类固醇、羟氯喹和甲氨喋呤。一些抗细胞因子疗法也在使用，但不推荐作为首要疗法。这些包括：REMICADE、ENBREL、IFN-α、抗-IFN-γ、RITUXAN、环孢菌素、他克莫司(tacrolimus)和各种局部眼用制剂。

3.抗磷脂抗体综合征

抗磷脂抗体综合征是一种常见的自身免疫血栓前(prothrombotic)病症，以动脉和/或静脉血栓形成以及与持续阳性的抗心磷脂抗体和/或狼疮抗凝剂相关的妊娠发病为特征(参见Harrison′s Principles of InternalMedicine，见上文；Blume and Miller，Cutis 78：409-415，2006；Fischer etal.，Semin.Nephrol.27：35-46，2007)。最近证明，这其中的一些抗体(IgG和IgM)直接抗磷脂结合蛋白(B2-糖蛋白1、凝血酶原、蛋白C、蛋白S、TPA和膜联蛋白V(annexin V)而非带负电的磷脂本身)。APS还可以与其他自身免疫疾病(最常见与SLE)关联出现(继发性APS)，或作为独立的病症出现(原发性APS)。

APS影响身体的任何大小的血管和任一器官。临床特征包括外周静脉和动脉血栓形成(深部静脉血栓形成)、流产、皮肤病、心脏和肺表现、肾累及和神经病症(中风)。血栓形成并发症是SLE患者死亡的主要诱因。

APS是获得性血栓形成倾向的常见诱因，估计美国每年有35,000例APS相关的静脉血栓形成新病例和5000例动脉血栓形成新病例。有APS抗体的患者血栓形成复发的可能性是无这些抗体的患者的3-10倍。在美国，大约2％的总人口测试为抗磷脂抗体(AA)阳性，所述抗磷脂抗体包括狼疮抗凝剂、抗心磷脂抗体或前述两者。在46％的年龄小于50岁的中风或短暂性缺血发作的患者中以及在21％的年轻的心肌梗塞幸存者(年龄＜45岁)中检测到了AA。SLE患者的AA流行率非常高(30-50％)。在公开的文献中，透析患者中升高的AA的流行率在0.7％至69％之间变化。在APS患者中，女性与男性的比例对于原发性形式为约2比1，对于与SLE相关的病例为9比l。

目前对于患有APS但还没有经历血栓形成事件或皮肤变化的患者的疗法是用低剂量阿司匹林终身治疗。有中度至高度AA效价或者血栓形成的患者需要用抗凝剂例如肝素立即进行治疗。长期疗法是用华法林(warfarin)抗凝。有一些临床试验活动对患有危及生命的APS的患者使用环磷酰胺和使用类固醇来控制APS相关的妊娠丢失。没有多少使用抗B细胞疗法来控制AA水平的先例。

4.皮肌炎

皮肌炎是一种进行性病症，以有肌肉酶水平升高的对称性近端肌无力和皮疹(一般是面部紫红)以及眼睑和眶周组织水肿为特征(参见Dalakas，Curr.Opin.Pharmacol.1：300-306，2001；Dalakas，Nat.Clin.Pract.Rheumatol.2：219-227，2006)。病变肌肉组织出现带有慢性炎性反应的纤维变性，出现在儿童和成人中，并且在成人中可能与内脏癌症有关。PM/DM的诱因尚不清楚。尽管它很少出现在多个家庭成员中，但它可能与某些HLA型(例如DR3、DR5或DR7)相关。传染剂，包括病毒以及弓形体的种和疏螺旋体的种，已被提出作为该疾病的可能引发物。药物诱发疾病的一些病例已被报道(例如羟基脲、青霉胺、抑制素、奎尼定和苯基丁氮酮(phenylbutazone))。免疫异常和体液异常是常见的(例如，肌肉中TNF-α增加、循环肌炎特异性自身抗体、异常T细胞和B细胞活性以及其他自身免疫疾病的家族史)。B细胞是血管周围部位最丰富的炎性细胞。

皮肌炎与皮肤问题(一般是面部紫红色疹、眼睑和眶周组织水肿)相关，并且由于最高达50％的患者出现关节、心脏、肺和胃肠道表现，该疾病可能与严重发病相关。它经常与其他结缔组织自身免疫疾病例如SLE、硬皮病和RA相关。与RA不同，专门与DM/PM相关的关节炎不是侵蚀性或变形性的。与和其他自身免疫性结缔组织疾病(例如SLE)相关的皮肤变化一致，在皮肤中有血管周围炎性浸润物。PM/DM通常没有生命危险，但是患者常常会形成虚弱、残疾和生活质量下降后遗症。PM/DM由于严重的肌肉无力和/或心肺累及可导致死亡。恶化风险在患有DM的患者中非常高(发生率＝26％)，但在患有PM的患者中不高；恶化更常出现在超过60岁的成人中。皮肤或肌肉的钙质沉着症(表现为坚硬的黄色或肉色结)在成人中不常见，但是出现在最高达40％的患有DM的儿童或青少年中；它有非常强的致虚弱作用。它们可从皮肤表面挤出，在这样情形下可能出现继发感染。

炎性肌病——仅多肌炎、以及多肌炎和皮肌炎组合——的发生率估计分别为每100,000人中有0.1人和1人(无人种偏向)，并且似乎正在增加。仅PM和PM/DM组合的流行率分别为每100,000人中有1人和6人。女性比男性更易患病(约2∶1)。PM/DM可出现在任何年龄的人中。存在两个发作年龄峰。在成人中，发作年龄峰为大约50岁，在儿童中发作年龄峰为大约5-10岁。

主要的治疗是类固醇(参见Dalakas，Jama 291：2367-2375，2004；Dalakas，Pharmacol.Ther.102：177-193，2004)。也使用用甲氨喋呤、硫唑嘌呤和麦考酚酸莫酯的免疫抑制剂疗法。在顽固性患者中，将IVIg用于短期疗法。该病症的新疗法包括Rituxan。尽管有些担心TNF拮抗剂可能会增加一些与DM相关的风险(感染、恶化、其他自身免疫疾病的诱发)，但在正进行的对该病症的临床试验中，正在对REMICADE和ENBREL进行研究。

5.格-巴综合征

格-巴综合征是一种严重的传染后神经病症。在GBS患者中观察到的神经损伤据推测由可交叉反应的抗神经节苷脂抗体引起。在GBS中产生可交叉反应抗体的细胞免疫学背景基本上是未知的。有人推测，树突细胞对GBS中最频繁的先期感染(空肠弯曲杆菌(Campylobacterjejuni))的差别应答导致B细胞增殖增强并且分化为自身反应性浆细胞。宿主相关因子和致病因子可能与此相关(参见Harrison′s Principles ofInternal Medicine，见上文；Lewis，Neurol.Clin.25：71-87，2007；Said，Neurol.Clin.25：115-137，2007；Yuki，Muscle Nerve 35：691-711，2007。

GBS是一种破坏性的病症，死亡率为5-15％。IVIg是这些患者的首选治疗(参见Harrison′s Principles of Internal Medicine，见上文)。然而，约50％的患者在6个月后仍不能独立行走。GBS由至少4种急性周围神经病变亚型组成。急性炎性脱髓鞘多神经根神经瘤(AIDP)亚型的组织学外观与实验性自身免疫神经炎相似，主要是由针对来自髓磷脂蛋白P0、P2和PMP22的肽的T细胞引起的。T细胞介导的免疫性在AIDP中的作用仍不清楚，有证据表明抗体和补体的参与。目前有力证据表明，GBS轴突亚型，急性运动轴突神经病变(AMAN)和急性运动和感觉轴突神经病变(AMSAN)，是由靶向巨噬细胞以入侵郎维耶结的轴突的针对轴膜上神经节苷脂的抗体引起的。大约1/4的GBS患者近期有空肠弯曲杆菌感染，并且该疾病的轴突形式在这些人中特别常见。来自空肠弯曲杆菌细菌壁的脂低聚糖包含神经节苷脂样结构，并且将其注射给兔诱发了与急性运动轴突神经病变相似的神经病变。针对GM1、GM1b、GD1a和GalNac-GD1a的抗体特别地引起了急性运动轴突神经病变，并且，除了针对GalNac-GD1a的抗体之外的其它抗体均特别地引起了急性运动和感觉轴突神经病变。费希尔综合征亚型与针对GQ1b的抗体尤其相关，并且已发现了与空肠弯曲杆菌的壁中的神经节苷脂的相似的交叉反应性。抗-GQ1b抗体已显示在体外通过补体介导的机制破坏运动神经末端。

GBS是一种罕见的病症，并且在美国，男性和女性患病相当(NIH，The National Women′s Health Centre，2004)。在美国，每100,000人口中有1人患GBS(NIH，The National Women′s Health Centre，2004)。包括GBS在内的所有慢性炎性脱髓鞘多神经病变(CIDP)在美国的流行率是约每100,000人中有约1至7.7人(在美国为2000-15,000例)。然而，这可能是一个低估值，假设CIDP占所有神经病变(1000万例)的5％，那么人们可能预测实际上共有约300,000(活跃型)-500,000例。

目前用IVIg和血浆置换来作为GBS疗法。由于GBS是自身免疫神经病变，预计指向T细胞、B细胞和/或补体的疗法可用于这些疾病。

6.古德帕斯彻综合征

术语“古德帕斯彻综合征”(GPS)是按人名命名的，来自于欧内斯特古德帕斯彻1919年的一份报告，此人描述了与流感病毒感染相关的肺出血的临床综合征和急性新月体性肾小球肾炎的组织学结果。许多年来，该术语已被不同人以不同的方式使用，一些人将有肾功能不全的所有肺出血诱因作为GPS纳入其中。其他人将术语GPS局限于患有与抗肾小球基膜(抗GBM)抗体相关的肺出血患者，这区分于有抗-GBM抗体但无肺出血的肾小球肾炎。还另外有人支持抗IV型胶原病这一概念，而非GPS。

用于诊断GPS的必要条件是证明抗GBM抗体结合在肾脏肾小球中。循环的抗GBM抗体存在于超过90％的患有抗GBM疾病的患者中。未经治疗的甚至是经治疗的GPS的临床进程令人沮丧；该疾病的预后极差。

GPS是一种罕见的疾病，发生率为每一百万人中有约0.1例。该病在白人中比在非裔美国人中更常见，并且可能在某些其他种族群中更常见，例如新西兰的毛利人。GPS全年都可出现，但其发生率似乎在春季和初夏增加。

目前对GPS的疗法包括类固醇、免疫抑制剂和血浆置换。既然肾脏病状看来是由于抗GBM抗体在肾脏肾小球中积累所致，那么可将指向B细胞的疗法用于该病。

从前文所述，应理解的是，尽管为了举例说明的目的本文描述了本发明的具体实施方案，但在不偏离本发明的主旨和范围的情况下可以进行多种修改。因此，通过以下的非限制性实施例进一步说明本发明，并且本发明不被除所附的权利要求书之外的内容限定。

实施例1

表达FcγRIA-CEE、FcγRIA-CHIS和FcγRIA-CFLAG标记蛋白的哺乳动物可溶性FcγRIA表达构建体的构建

使用编码FcγRIA(SEQ ID NO：14)的DNA片段和表达载体pZMP20通过PCR和同源重组构建带有C末端标签——Glu-Glu(CEE)、六组氨酸(CHIS)或FLAG(CFLAG)——的包含人FcγRIA胞外结构域的表达构建体。

编码FcγRIA-CEE的PCR片段包含与pZMP20载体序列的5’非翻译区域部分重叠的5’端、SEQ ID NO：14的FcγRIA胞外结构域编码区域部分(核苷酸1-846)、Glu-Glu标签(Glu Glu Tyr Met Pro Met Glu；SEQ ID NO：15)编码序列和与pZMP20载体的脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入位点区域部分重叠的3’端。PCR扩增反应使用5’寡核苷酸“100”(ACAGGTGTCCAGGGAATTCATATAGGCCGGCCACCATGTGGTTCTTGACAACTCTG；SEQID NO：16)、3’寡核苷酸“200”(CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTATTCCATGGGCATGTATTCTTCCACTTGAAGCTCCAACTCAGG；SEQ ID NO：17)，和在以前产生的作为模板的FcγRIA的DNA克隆(SEQ ID NO：14)。

PCR扩增反应条件如下：94℃5分钟，一个循环；(94℃1分钟、之后55℃2分钟、之后72℃3分钟)，35个循环；以及72℃10分钟，一个循环。将PCR反应混合物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，并使用QIAquick^TM Gel Extraction试剂盒(Qiagen，货号28704)从凝胶上提取对应于预计大小的DNA片段。

质粒pZMP20为一种哺乳动物表达载体，该载体中含有：表达盒，具有嵌合CMV增强子/MPSV启动子、在酵母重组之前进行线性化的BglII位点、来自脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入元件、在跨膜结构域的C端截短的CD8胞外结构域；大肠杆菌复制起点；哺乳动物筛选标记表达单元，包含SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因和SV40终止子；以及在酿酒酵母中进行筛选和复制所需的URA3和CEN-ARS序列。

将质粒pZMP20用BglII消化，然后在酵母中与凝胶提取的FcγRIA-CEE的PCR片段进行重组。将100μl的感受态酵母(酿酒酵母)细胞与10μl的FcγRIA-CEE插入DNA和100ng的BglII消化的pZMP20载体相混合，并将所述混合物转移至0.2cm电穿孔杯中。对酵母/DNA混合物施加电脉冲，使用的电源(BioRad Laboratories，Hercules，CA)设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF。向杯中加入600μl的1.2M山梨糖醇，将所述酵母以100μl和300μl的等分铺于两个URA-D板上并在30℃孵育。在约72小时后，将来自一块板上的Ura+酵母转化体重悬于1ml H₂O中，短暂离心以沉淀酵母细胞。细胞沉淀重悬于0.5ml的裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris(DH 8.0)、1mM EDTA)中。向装有250μl经酸洗涤的玻璃珠和300μl苯酚-氯仿的Eppendorf管中加入500μl裂解混合物，涡漩3分钟，在Eppendorf离心机上以最大速度离心5分钟。取300μl水相转移至一个新管中，以600μl乙醇沉淀DNA，然后以最大速度离心30分钟。倾去上清液并用1ml的70％乙醇洗涤沉淀。倾去管中的上清液并将DNA沉淀重悬于30μl含1mM EDTA的10mM Tris(pH 8.0)中。

使用5μl酵母DNA制品和50μl大肠杆菌细胞进行电转感受态大肠杆菌宿主细胞(DH12S)的转化。以2.0kV、25μF和400欧姆对细胞施加电脉冲。在电穿孔之后，加入1ml SOC(2％Bacto^TM胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mM KCl、10mMMgCl₂、10mM MgSO₄、20mM葡萄糖)，然后将细胞以50μl和200μl的等分铺于两块LB AMP板(LB肉汤(Lennox)、1.8％Bacto^TM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。

对用于构建体的三个DNA克隆的插入物进行序列分析并选择含有正确序列的那个克隆。使用市售的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega试剂盒，Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商的说明大规模分离质粒DNA。

使用相同的方法制备带有C末端组氨酸标签(组成为Gly Ser GlyGly His His His His His His(SEQ ID NO：18)(FcγRIA-CHIS))或C末端FLAG标签(组成为Gly SerAsp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys(SEQID NO：19)(FcγRIA-CFLAG))的FcγRIA。为制备这些构建体，使用3’寡核苷酸“300”(CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCCACCAGATCCCACTTGAAGCTCCAACTCAGG；SEQ ID NO：20)代替3’寡核苷酸“200”生成FcγRIA-CHIS  ，或使用3’寡核苷酸“400”(CAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTACTTATCATCATCATCCTTATAATCGGATCCCACTTGAAGCTCCAACTCAGG；SEQ ID NO：21)代替3’寡核苷酸“200”生成FcγRIA-CFLAG。

实施例2

表达FcγRIA-CEE、FcγRIA-CHIS和FcγRIA-CFLAG C末端标记的蛋白的可溶性FcγRIA受体表达构建体的转染和表达

将3组每种有标签的可溶性FcγRIA表达构建体各200μg在37℃下分别以200单位的PvuI消化3小时，用异丙醇沉淀并在1.5mL的微型离心管中离心。将上清液从沉淀上倾去，将沉淀用1mL的70％乙醇洗涤并在室温下孵育5分钟。将管在微型离心机中以14,000RPM离心10分钟，将上清液从沉淀上倾去。然后在无菌环境下将沉淀重悬于750μl的CHO细胞组织培养基中，使之在60℃下孵育30分钟，并使之冷却至室温。三个管中的每个管均有大约5×10⁶个CHO细胞沉淀，然后使用DNA培养基溶液重悬所述细胞。将DNA/细胞混合物置于0.4cm间距(gap))的杯中，使用如下参数进行电穿孔：950μF高电容、300V。然后将杯中内含物取出，合并，并用CHO细胞组织培养基稀释至25mL，置于125mL摇瓶中。将摇瓶在振荡器上置于培养箱中，在37℃、6％CO₂条件下以120RPM摇晃。

先以200nM的甲氨蝶呤(MTX)，然后以1μM的MTX，对CHO细胞进行营养筛选和之后的分步扩增。通过蛋白质印迹确认具有标签的蛋白的表达，然后将CHO细胞合并物扩大培养，收获物用于蛋白纯化。

实施例3

FcγRIA-CH6的纯化

如上文实施例1所述，构建包含具有C末端六组氨酸(CHIS)标签的人FcγRIA胞外结构域的表达构建体。如上文实施例2所述，用此构建体转染CHO细胞并使之在其中表达。在上文实施例中被称为“FcγRIA-CHIS”的编码的组氨酸标记的FcγRIA在本文中还被称为“FcγRIA-CH6”或“pFCGRIA CH6”。FcγRIA-CH6的核苷酸编码序列在SEQ ID NO：22中显示，对应的FcγRIA-CH6氨基酸序列在SEQ IDNO：23中显示。表达的FcγRIA-CH6如下述进行纯化。

结合使用Ni IMAC捕捉、Q Sepharose色谱和Superdex 200尺寸排阻色谱，从CHO条件培养基纯化FcγRIA-CH6。Ni IMAC捕捉：将CHO条件培养基过滤(0.22μm)除菌，并用装有10kD MWCO 0.1m²膜的蠕动泵系统浓缩10倍。将浓缩培养基用至少5CV的50mM NaPO₄、500mM NaCl(pH 7.5)进行缓冲液更换，并调节至咪唑的最终浓度为25mM。如需要，使用浓NaOH或HCl调节pH为7.5。用结合于Ni-NTAHis Bind Superflow树脂的IMAC捕捉组氨酸标记的FcγRIA蛋白。在加入培养基之前，将所述树脂用50mM NaPO₄、500mM NaCl、25mM咪唑(pH 7.5)进行平衡。在4℃下过夜使结合得以进行，所述结合可以以使用合适尺寸的滚瓶的批量模式进行，或者以使用色谱工作台的柱模式进行。在上样后，将所述树脂以至少10CV的50mM NaPO₄、500mMNaCl和25mM咪唑(pH 7.5)进行洗涤。使用咪唑于50mM NaPO₄、500mM NaCl(pH 7.5)中的浓度逐渐增加的步骤或梯度来进行结合蛋白的洗脱，在洗脱的最后使用500mM的咪唑。将级分收集并用蛋白质印迹、SDS-PAGE和RP-HPLC进行分析，并混合含有FcγRIA-CH6的级分。

Q Sepharose被动色谱：通过使用装有3×10kD MWCO 0.1cm²膜的Labscale TFF系统，将含FcγRIA-CH6的IMAC合并物以15CV的50mM NaPO₄、150mM NaCl(pH 7.5)进行缓冲液更换。用至少10CV的50mM NaPO₄、2M NaCl(pH 7.5)注入每7.5mg FcγRIA-CH61.0mLQ Sepharose树脂样本，然后以10CV的50mM NaPO₄、150mM NaCl(pH 7.5)进行平衡。将树脂和调整过的IMAC合并物混合，并在4℃下轻微摇晃孵育过夜。将所得浆体转移至重力流动柱中，收集流过物并以至少5CV的平衡缓冲液洗涤所述柱。混合所述流过物和洗涤级分，并通过RP-HPLC和SDS-PAGE评估FcγRIA-CH6的存在情况。

尺寸排阻色谱：将Q Sepharose流过物和洗涤级分浓缩至少10倍至20倍，取决于级分体积，所述浓缩可使用装有10kD MWCO 0.1cm²膜的TFF Labscale系统、装有合适直径的YM30膜的stirred cell系统或30kD MWCO Ultracel离心膜。将浓缩的FcγRIA-CH6级分注于尺寸适合注入体积和质量的Superdex 200柱上。将所述柱在含有50mMNaPO₄、109mM NaCl(pH 7.3)或者35mM NaPO₄、120mM NaCl(pH7.2)的配制缓冲液中进行平衡。将所述柱以不超过45cm/hr的流速进行等度(isocratically)洗脱，收集各级分并通过SDS-PAGE和RP-HPLC分析FcγRIA-CH6的存在情况。将含有FcγRIA-CH6的级分混合，并使用装有YM30膜(30kD MWCO)的stirred cell装置浓缩至所需浓度。将终FcγRIA-CH6浓缩物过滤通过0.22μm的无菌过滤器，并在-80℃下保存备用。

实施例4

可溶性FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6的构建、表达和纯化

除了如上文实施例1、2和3所述，构建、表达和纯化具有C末端His6标签的可溶性单体形式的FcγRIA之外，还使用相似的方法生成可溶性单体形式的FcγRIIA和FcγRIIIA。

简而言之，使用编码FcγRIIA和FcγRIIIA的天然信号序列、胞外结构域和C末端His6标签(GSGGHHHHHH；SEQ ID NO：18)的DNA序列生成编码可溶性单体形式的FcγRIIA和FcγRIIIA的表达构建体。所述DNA序列编码FcγRIIA的氨基酸1-212(SEQ ID NO：25的氨基酸1-212)和FcγRIIIA的氨基酸1-195(SEQ ID NO：27的氨基酸1-195)。从源自中国仓鼠卵巢(CHO)DXB-11细胞((Larry Chasin，ColumbiaUniversity，New York，NY)的上清液纯化受体。将CHO条件培养基过滤除菌，浓缩并进行缓冲液更换，更换成50mM NaPO₄、500mM NaCl、25mM咪唑(pH 7.5)(缓冲液A)。使用在缓冲液A中平衡的Ni-NTA HisBind Superflow树脂(Novagen，Madison，WI)捕获带组氨酸标签的FcγR蛋白(FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6)。用50mM NaPO₄、500mM NaCl(pH 7.5)中的咪唑梯度(0-500mM)进行结合蛋白的洗脱。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析各级分的可溶性FcγR(抗-6×组氨酸HRP小鼠IgG1，R&D Systems，Minneapolis，MN)。

将含有可溶性FcγR的Ni-NTA级分进行缓冲液更换，更换成50mMNaPO₄、150mM NaCl(pH 7.5)(缓冲液B)，并在4℃下与用缓冲液B预平衡的Q Sepharose 4FF树脂孵育过夜。将所述浆体转移至重力流动柱，混合流过物和洗涤级分，并如上所述评估可溶性FcγR的存在情况。将混合的级分浓缩并注入用50mM NaPO₄、109mM NaCl(pH 7.3)(缓冲液C)平衡的Superdex 200Hiload(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)柱上。在缓冲液C中洗脱所述柱，并且将含有可溶性FcγR的级分混合、浓缩、过滤除菌并在-80℃下保存。通过SDS-PAGE、蛋白质印迹、N末端测序和尺寸排阻多角度光散射分析FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6。对于以约20mg/mL配制的每种受体制品，毒素水平＜1.0内毒素单位/mL。

FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6的核苷酸编码序列分别在SEQ IDNO：24和SEQ ID NO：26中显示。编码的FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6的多肽序列分别在SEQ ID NO：25和SEQ ID NO：27中显示。N末端序列分析显示Gln-34是成熟FcγRIIA-CH6的起始位点，Met-18和GIu-21都是成熟FcγRIIIA-CH6的起始位点。因此，没有信号序列的成熟形式的FcγRIIA-CH6多肽对应于SEQ ID NO：25的氨基酸残基34-222，而成熟形式的FcγRIIIA-CH6对应于SEQ ID NO：27的氨基酸残基18-205和21-205。

实施例5

有组氨酸标签的可溶性FcγR(FcγRIA-CH6、FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6)与固定的人IgG1的结合

使用Biacore 3000装置(Piscataway，NJ)进行测量。使用0.2M的N-乙基-N′-(3-二乙氨基-丙基)碳二亚氨和0.05M的N-羟基琥珀酰胺和Biacore Control Software活化传感器芯片表面并且共价固定IgG1抗体(Lambda from human myeloma plasma，Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)。将在10mM醋酸钠(pH 5.0)中稀释至11μg/mL的人IgG1抗体并将其固定，以制备特异性结合流动池；将另一个流动池活化，但不暴露于IgG1，以制备参照流动池。用1M的盐酸乙醇胺封闭特异性结合流动池和参照流动池上的未反应酯位点。

为进行可溶性FcγRIA结合的动力学分析，将IgG1抗体以458共振单位(RU)的水平固定。将FcγRIA-CH6连续注射至活化流动池和参照流动池上。为进行FcγRIA-CH6结合的动力学分析，使用HBS-EP(Biacore)测定缓冲液(10mM Hepes，pH 7.4，0.15M NaCl，3.5mMEDTA，0.005％聚山梨醇酯20(polysorbate 20))中浓度范围为0.16至10.3×10^-9M的FcγRIA-CH6。将FcγRIA-CH6以40μL/min的流速注入3分钟。随后，将FcγRIA-CH6溶液换为HBS-EP缓冲液，并测量解离3分钟。将每个FcγRIA-CH6浓度一式两份随机检测。每次测量后都以50μL/min单次注入10mM甘氨酸-HCl(pH 1.8)30秒，以再生IgG1表面。

为进行可溶性FcγRIIA和FcγRIIIA结合的平衡分析，将IgG1抗体以1013RU的水平固定。使用浓度范围为0.03-24×10^-6M的可溶性FcγR。以10μL/min的流速注入每种可溶性FcγR(FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6)5分钟。每种FcγR的解离时间为5分钟。每个FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6浓度一式两份随机检测。每次测量后都以30μL/min单次注入HBS-EP 30秒，以再生IgG1表面。

将所有3种可溶性FcγR的结合曲线进行如下处理：从特异性结合表面曲线中减去参照表面曲线，并减去缓冲液注射曲线。将处理的结合曲线全局拟合至1∶1结合模型，并且使用Biacore软件评估所产生的动力学常数和平衡常数。

所述可溶性FcγR与固定的人IgG1以1∶1结合相互作用最佳拟合的方式结合。IgG1在共价固定后表现出一定程度的结合活性丧失，并且表面活性为理论最大值的26-81％。FcγRIA-CH6结合IgG1的缔合相和解离相可在超过200秒的时间里测量，使得能够进行结合曲线的动力学分析。FcγRIA-CH6结合于IgG1，缔合(k_a)速率常数和解离(k_d)速率常数分别为2.8×10⁶M^-1s^-1和4.6×10^-4s^-1，得出的平衡解离常数(K_D)为1.7×10^-10M。FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6的缔合/解离速度太快以至于不能准确测量，因此所述平衡解离常数在稳定状态下进行测定。FcγRIIIA-CH6和FcγRIIA-CH6与IgG1的结合是可饱和的并且是低亲和力的，估计K_Ds分别为0.63×10^-6M和1.9×10^-6M。每种可溶性FcγR与固定的兔抗OVA IgG结合的速率和亲和力与以人IgG1观察到的速率和亲和力相似。

实施例6

表达可溶性单体无标签FcγRIA蛋白的哺乳动物可溶性FcγRIA表达构建体的构建

使用编码短式FcγRIA(SEQ ID NO：2的氨基酸1-282)和长式FcγRIA(在C末端有附加的10个氨基酸)(SEQ ID NO：2的氨基酸1-292)的胞外结构域的DNA片段以及表达载体pZMP31，通过PCR和同源重组构建包含人FcγRIA胞外结构域的两种表达载体。

将编码短式和长式FcγRIA的PCR片段构建为含有与pZMP31载体序列的5′非翻译区域部分重叠的5′端、分别对应于SEQ ID NO：2氨基酸残基1-282或1-292的FcγRIA胞外结构域编码区域、以及与pZMP31载体的脊髓灰质炎病毒内部核糖体进入位点区域部分重叠的3′端。短式和长式的PCR扩增反应都使用5′寡核苷酸“zc57709”(ACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGTGTCCAGGGAATTCATATAGGCCGGCCACCATGTGGTTCTTGACAACT；SEQ ID NO：28)。将3′寡核苷酸“zc57710”(TGGGGTGGGTACAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTTTAGCCAAGCACTTGAAGCTCCA；SEQ ID NO：29)用于短式，3′寡核苷酸“zc57712”(TGGGGTGGGTACAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTTTAATGAAACCAGACAGGAGT；SEQ ID NO：30)用于长式。FcγRIA模板来自以前生成的FcγRIA的cDNA。

PCR扩增反应条件如下：95℃ 2分钟，一个循环；(95℃ 15秒，之后55℃ 30秒，之后68℃ 1分钟)，30个循环。将PCR反应混合物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，并使用GE Healthcare illustra GFX^TMPCR DNA和Gel Band Purification试剂盒从凝胶上提取对应于预计大小的DNA片段。

质粒pZMP31为一种哺乳动物表达载体，该载体中含有：表达盒，具有嵌合CMV增强子/MPSV启动子、在酵母重组之前进行线性化的EcoRI位点、来自脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入元件；大肠杆菌复制起点和氨苄青霉素筛选标记；哺乳动物筛选标记表达单元，包含SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因和SV40终止子；以及在酿酒酵母中进行筛选和复制所需的URA3和CEN-ARS序列。

将质粒pZMP31用EcoRI消化，然后在酵母中与凝胶提取的每种短式和长式的FcγRIA PCR片段进行重组。将100μl的感受态酵母(酿酒酵母)细胞与20μl FcγRIA短式或长式插入DNA和约100ng的EcoRI消化的pZMP31载体相混合。将所述混合物转移至0.2cm电穿孔杯中。对酵母/DNA混合物施加电脉冲，使用的电源(BioRad Laboratories，Hercules，CA)设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF。向杯中加入600μl的1.2M山梨糖醇，将所述酵母以两个300μl的等分铺于两个URA-D板上，并在30℃下孵育。在约72小时后，将来自一块板上的Ura+酵母转化体重悬于800μl H₂O中，短暂离心以沉淀酵母细胞。细胞沉淀重悬于0.5ml的裂解缓冲液(2％Triton X-100、1％SDS、100mM NaCl、10mM Tris(pH 8.0)、1mM EDTA)中。向装有250μl经酸洗涤的玻璃珠和300μl苯酚-氯仿的Eppendorf管中加入500μl裂解混合物，涡漩3分钟，在Eppendorf离心机上以最大速度离心5分钟。取300μl水相转移至一个新管中，以600μl乙醇沉淀DNA，然后以最大速度离心10分钟。倾去上清液并用1ml的70％乙醇洗涤沉淀。倾去管中的上清液并将DNA沉淀重悬于10μl H₂O中。

使用1μl酵母DNA制品和20μl大肠杆菌细胞进行电转感受态大肠杆菌宿主细胞(DH10B)的转化。以2.0kV、25μF和400欧姆对细胞施加电脉冲。在电穿孔之后，加入600μl SOC(2％BactoTM胰蛋白胨(Difco，Detroit，MI)、0.5％酵母提取物(Difco)、10mM NaCl、2.5mMKCl、10mM MgCl₂、10mM MgSO₄、20mM葡萄糖)，然后将细胞以50μl和550μl等分铺于两个LB AMP板(LB肉汤(Lennox)、1.8％BactoTM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。

通过菌落PCR筛选菌落，并且对来自每种构建体的5个DNA克隆的插入物进行测序分析。选出含有正确序列的那个克隆。使用ABIPRISM BigDye Terminator v3.1Cycle Sequencing试剂盒(AppliedBiosystems，Foster City，CA)进行DNA测序。将测序反应物用EdgeBioSystems Preforma Centriflex Gel Filtration Cartridges(Gaithersburg，MD)纯化，并在Applied Biosystems 3730DNA Analyzer(Applied Biosystems，Foster City，CA)上分析。使用Sequencher v4.6软件(GeneCodes Corporation，Ann Arbor，MI)收集和编校所得序列数据。选出含有正确序列的那个克隆，并且使用市售的试剂盒(QIAGENPlasmid Mega试剂盒，Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商的说明大规模分离质粒DNA。

短式和长式插入DNA的序列分别在SEQ ID NO：31和SEQ IDNO：33中显示。相应的编码的短式和长式无标签FcγRIA的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：32和SEQ ID NO：34中显示。FcγRIA的信号序列对应于SEQ ID NO：2的氨基酸1-15(SEQ ID NO 40和42的残基1-15)，从而在SEQ ID NO 32和34的位置16得到了成熟的无标签FcγRIA蛋白质的起始位点。

实施例7

表达无标签的FcγRIA蛋白质的可溶性FcγRIA受体表达构建体的转染和表达

将200μg短式和长式可溶性FcγRIA表达构建体在37℃下用200单位BstB1消化8小时(过夜)，用苯酚/氯仿/异戊醇洗涤，用乙醇沉淀，并在1.5mL的微型离心管中离心。将上清液从沉淀上倾去，将沉淀用1mL的70％乙醇洗涤并在室温下孵育5分钟。将管在微型离心机中以14,000RPM离心10分钟，将上清液从沉淀上倾去。然后在无菌环境下将沉淀重悬于200μl的CHO细胞组织培养基中，使之在37℃下孵育30分钟。大约1×10⁷个CHO细胞沉淀，然后使用DNA培养基溶液重悬所述细胞。将DNA/细胞混合物置于0.4cm间距的杯中，使用如下参数进行电穿孔：950μF高电容、300V。然后将杯中内含物取出，合并，并用CHO细胞组织培养基稀释至25mL，置于125mL摇瓶中。将摇瓶在振荡器上置于培养箱中，在37℃、5％CO₂条件下以120RPM摇晃。

以200nM的甲氨喋呤(MTX)对CHO细胞进行营养筛选和扩增。通过蛋白质印迹确认有标签的蛋白的表达，然后将CHO细胞合并物扩大培养，收获物用于蛋白纯化。

实施例8

无标签的FcγRIA的纯化

将以下方法应用于从CHO DXB11细胞条件培养基中纯化无标签的FcγRIA。

A.IgG亲和色谱

收获未稀释的(1×)培养基，并以15cm/h的流速上样至含有IgGSepharose 6Fast Flow树脂(GE Healthcare)的柱中。对于10L条件培养基，使用含有150mL填充树脂的直径为5cm的柱。在将培养基上样后，将柱以1.6mM柠檬酸、23mM磷酸氢二钠(dibasic NaPO₄)、150mMNaCl(pH 7.0)以100cm/h洗涤，直至215nm和A280nm的吸光度回归到基线达至少2个柱体积(CV)。通过使用10CV pH梯度递减的20mM柠檬酸、5mM磷酸氢二钠、0.05％Tween 20(pH 3.0)以61cm/h的流速洗脱结合的蛋白质。将含有FcγRIA的级分通过SDS-PAGE和蛋白质印迹进行识别，通过加入2M Tris(pH 7.0)至终浓度为0.2M进行中和，并通过加入4M NaCl使NaCl达到100mM。

B.阳离子交换色谱

通过HS50色谱从FcγRIA混合物中除去Tween-20。使用固体MES和HCl将FcγRIA洗脱合并物调节至10mM MES(pH 6.0)，并使用10mM MES(pH 6.0)稀释至＜5mS/cm。将含有FcγRIA的混合物以141cm/h的流速上样至HS50柱以实现定量捕获，并以10mM MES(pH 6.0)将所述树脂以382cm/h洗涤，直至A215和A280nm UV信号回归到基线达至少5CV。使用5CV至最多达60％的洗脱缓冲液(由10mM MES、2M NaCl组成，pH 6.0)，以NaCl浓度逐渐增加的梯度将结合的FcγRIA以382cm/hr洗脱。收集级分，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定FcγRIA。

C.尺寸排阻色谱

由280nm下的吸光度评估蛋白的量，根据FcγRIA的存在量，使用30kD分子量截留(MWCO)Ultracel离心浓缩器或YM3063.5mmstirred cell膜，将缓冲液更换的HS50洗脱合并物的含FcγRIA级分浓缩。浓缩物的最终体积不超过所使用的凝胶过滤柱体积的3％。将浓缩的FcγRIA合并物注入至Superdex 75柱(对于＜1mg FcγRIA，柱尺寸为10/300mm；对于1-10mg，柱尺寸为16/60mm；对于＞10mg，柱尺寸为26/60mm)上，并将所述蛋白以34-76cm/h的流速进行等度洗脱。使用的流动相是35mM NaPO₄、120mM NaCl(pH 7.2)。收集各级分，并且通过SDS-PAGE和蛋白质印迹鉴定FcγRIA。如上所述将含有FcγRIA的级分浓缩至终浓度为20mg/mL，使其通过0.22μm无菌滤膜，并在-80℃保存。用N末端测序和氨基酸分析确认FcγRIA的特征。N末端序列分析表明，成熟蛋白质以焦谷氨酸开始，该焦谷氨酸是从氨基酸位置16的谷氨酰胺残基翻译后转化而来的。

实施例9

可溶性FcγRIA的抗炎活性

A.免疫复合物沉淀

将鸡卵卵白蛋白(OVA)溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至终浓度为15.0μg/mL，并且在存在和不存在标明浓度的可溶性FcγRIA的情况下在200μL的终体积中与300μg/mL的兔多克隆抗OVA抗体混合。之后立即在37℃借助分光光度计在350nm每30秒监测反应混合物的浊度，持续5-10分钟。用线性回归来计算浊度曲线线性部分的斜率，FcγR介导的对免疫复合物沉淀的抑制表示为仅含抗-OVA和OVA的孵育情况下的相对值。

B.细胞因子从肥大细胞中的分泌

通过在终体积为5.0mL的PBS中将300μL兔多克隆抗OVA与75.0μL的1mg/mL的OVA的PBS溶液混合，制备出免疫复合物。将混合物在37℃孵育30-60′，然后在4℃放置18-20h。通过在12,000rpm离心5.0分钟收集所述免疫复合物，将上清级分取出并丢弃，并将免疫复合物沉淀重悬于1.0mL的冰冷PBS中。再次洗涤后，将免疫复合物重悬于终体积为1.0mL的冰冷PBS中。使用BCA测定蛋白浓度。

将MC/9细胞在培养基A(含有10％胎牛血清、50.0μM B-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、36.0μg/mL L-天冬酰胺、1.0ng/mL rmIL-3、5.0ng/mL rmIL-4、25.0ng/mL rmSCF的DMEM)中传代培养至密度为0.5-3×10⁶细胞/mL。通过以1500rpm离心5.0分钟收集细胞，在培养基A(无细胞因子)中洗涤细胞沉淀并将其以2.0×10⁶细胞/mL重悬于培养基A中。在96孔微量滴定板中，在终体积为200μL的缓冲液A中将细胞等分(2.0×10⁵个细胞)与10.0μg/孔的OVA/抗OVA免疫复合物(IC)孵育。在37℃ 4.0h后，移出培养基并在1500rpm离心5.0分钟。收集无细胞的上清液级分，并使用Luminex细胞因子测定试剂盒分析等分试样的IL-6、IL-13、TNFα和MCP-1细胞因子释放的存在情况。

C.补体介导的SRBC裂解

制备了抗体致敏的SRBC(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)，并将其与不同浓度的可溶性FcγRIA孵育。在4℃ 15分钟后，加入25μL的1∶50稀释的大鼠血清(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)样本，并通过如制造商所述监测混合物在540nm的吸光度测量溶血。

D.FcγRIA-CH6对人IgG1的亲和力的测量

将IgG1抗体固定在单个流动池上，将另外的非衍生化的池用作空白参照。使用胺偶联试剂盒(amine coupling kit)(Biacore)和由BiacoreControl Software操控的标准Wizard Template for Surface Preparation进行IgG1抗体的固定。基于pH探测研究的Wizard结果，将IgG1抗体溶液在乙酸钠(pH 5.0)中稀释至11μg/mL。将用于胺偶联的WizardTemplate用于将抗体固定至单个流动池。然后，通过注入含有0.2M N-乙基-N′-(3-二乙胺-丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液活化传感器表面的羧基基团。然后将抗体溶液注入至所述活化的表面上，目标水平是150-200RU。通过用1M盐酸乙醇胺封闭羧甲基葡聚糖表面的剩余酯位点来完成固定步骤。

使用用于动力学分析的Biacore Wizard Template输入用于注入分析物溶液(FcγRIA-CH6)的方法。在25℃进行所述方法，并且在环境温度将样本保存在自动采样器中。可注意到，在使用Wizard Template时，动力学最优的某些参数，例如注入模式，由Wizard程序预先设定。

将分析FcγRIA的方法优化，用于测定动力学速率常数k_a和k_d。将受体连续注入两个流动池中(即1和2，分别为空白的和抗体衍生化的)，使得能够对FcγRIA和人IgG1抗体的结合与FcγRIA和未修饰对照表面的结合(未检测与兔抗-OVA IgG的结合)进行比较分析。将分析物以40μL/min的流速注入3分钟(缔合时间)。每一分析物注入的解离时间为3分钟。所述分析物的剂量反应曲线区间为0.16-10.3nM。对于剂量反应曲线的每个点，进行N＝2的重复注入。在顺序中包括注入缓冲液，用于减去装置噪音和偏移。以随机模式注入剂量反应曲线样本。对于FcγRIA的动力学分析，在每个剂量反应曲线循环之后进行单次30秒的50μL/分钟的甘氨酸(pH 1.75)注入，以再生IgG抗体表面。

使用Biacore Control，Evaluation and Simulation软件进行数据分析。首先评估基线稳定性，以确保所述再生步骤在整组注射中都提供一致的结合表面。检查并确认FcγRIA分析物与对照表面的非特异性结合水平为最小。从特异性结合表面曲线(即流动池2)减去对照表面曲线(即流动池1)并减去使用缓冲液注入曲线的装置噪声和偏移，对结合曲线进行处理。就分析物注入的重复性检查数据，然后将所得的校正的结合曲线全局拟合至结合模型，并且评估所得拟合常数和平衡常数。

E.小鼠的皮肤逆转被动阿尔图斯反应

将10周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组n＝8只小鼠)用异氟烷麻醉，剃除其背部毛，用70％乙醇擦拭每只小鼠的背部。每只小鼠接受两次皮内注射，每次0.02mL，在其背部皮肤的不同部位。注射溶液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)和仅40.0μg兔抗-卵白蛋白(抗-OVA，在56℃孵育30-40分钟热灭活)，或者包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及40.0μg抗-OVA和标明量的FcγRIA-CH6。对照组的小鼠接受两次40.0μg非免疫性兔IgG(如上所述热灭活的)的皮内注射。在注射前将抗体制品在14,000rmp离心10分钟以除去颗粒。皮内注射后立即在每只鼠尾静脉注射100.0μL含有10.0mg/mL OVA和10.0mg/mL伊文思蓝的溶液。在一些情况下，尾静脉注射溶液还包含剂量为1.0mg/kg的地塞米松(dexamethazone)。在注射后4小时，用CO₂气体将小鼠安乐处死。通过测量伊文思蓝染料的血管渗漏面积(mm²)以及通过测量取自于损伤部位打孔活组织检查的组织重量(mg)评估皮肤水肿。然后将所述组织样本在液氮中迅速冻结并在-80℃保存。

如(Bradley et al.，J.Invest.Dermatol.78：206-209，1982)所述，通过使用来自Cytostore的髓过氧化物酶分析试剂盒(Calgary，AlbertaCanada)测量打孔活组织检查样本中的髓过氧化物酶活性来评估中性粒细胞浸润。

通过静脉内注射仅运载体或含有标明浓度的FcγRIA-CH6的运载体对小鼠进行FcγRIA-CH6全身给药。在开始阿尔图斯反应1.0h前，每只小鼠均接受了终体积为0.1mL的制剂缓冲液(35mM磷酸钠、120mMNaCl，pH 7.2)中的标明剂量的FcγRIA-CH6。完全如上所述对小鼠进行皮肤阿尔图斯反应。

F.结果和讨论

为评估FcγRIA-CH6是否能够阻断免疫复合物沉淀，基于(Immunology 38：631-640，1979)和Gavin等(Clin.Exp.Immunol.102：620-625，1995)的方法建立了抗OVA/OVA免疫复合物沉淀测定。在37℃孵育抗-OVA和OVA产生了所述溶液混合物光密度的时间依赖性增加(图1，圆圈)，这一观察结果与不溶性抗-OVA/OVA免疫复合物的形成一致。在测定开始时加入FcγRIA-CH6产生了免疫复合物沉淀的剂量依赖性减少(图1，三角和正方形)。1500nM FcγRIA-CH6完全消除了免疫复合物沉淀。使用无标签的重组可溶性FcγRIA时得到了同样的数据。由于抗原：抗体免疫复合物的沉淀似乎依赖于抗体Fc重链(Immunology 38：631-640)和结合于抗体Fc部分的Fcγ受体(DijstelbloemHM et al.，Trends Immunol.22：510-516，2001)之间的非共价相互作用，这些数据表明可溶性FcγRIA通过结合抗-OVA抗体的Fc部分破坏免疫复合物沉淀。

为直接评估FcγRIA-CH6与抗体Fc的相互作用，通过表面等离子体共振分析评估了FcγRIA-CH6与固定的人IgG1的结合。以485的RU(共振单位)水平(FcγRIA-CH6的动力学分析最佳水平中的密度水平)将单克隆人IgG1抗体固定于单个流动池中的传感器表面，假定结合化学计量为1个FcγRIA分子与1个IgG1分子(Woof and Burton，Nature Rev.Immunol.4：1-11，2004)。FcγRIA快速地与固定的IgG1结合，缔合速率和解离速率分别为2.8×10⁶M^-1s^-1和4.6×10^-4s^-1，这两个数值可得出计算出的平衡解离常数为1.7×10^-10M。这些数据与之前报道的数据(Paetz A etal.，Biochem.Biophys.Res.Commun.338：1811-1817，2005)类似，并且证明FcγRIA-CH6与人IgG1以高亲和力结合。

肥大细胞被认为在多种免疫病症例如III型超敏反应中介导免疫复合物介导的炎症(Ravetch，J.Clin.Invest.110：1759-1761，2002；Sylvestreand Ravetch，Immunity 5：387-390，1996；Jancar and Crespo，TrendsImmunology 26：48-55，2005)。免疫复合物与肥大细胞Fcγ受体的结合被认为可诱导促炎细胞因子例如IL-6和TNFα的分泌(Ravetch，见上文；Jancar and Crespo，见上文)，这随后可导致中性粒细胞浸润和组织损伤。为评估细胞因子从肥大细胞中分泌是否受免疫复合物刺激，在存在和不存在预先形成的兔抗-OVA/OVA免疫复合物的情况下孵育鼠肥大细胞系MC/9。与抗-OVA/OVA免疫复合物孵育在MC/9细胞条件培养基中产生了时间和浓度依赖的炎性细胞因子IL-6、IL-13、TNFα和MCP-1的积累增加。相反，当MC/9细胞仅与相等浓度的兔抗OVA IgG孵育时，细胞因子产生并没有变化。这些数据证明MC/9细胞通过产生炎性细胞因子对免疫复合物作出反应。

在逐渐增量的FcγRIA-CH6存在下，将MC/9细胞与抗-OVA/OVA免疫复合物孵育产生了剂量依赖的IL-6(图2A)、IL-13(图2B)、TNFα(图2C)和MCP-1(图2D)的积累减少。使用无标签的重组可溶性FcγRIA时得到了同样的数据。这些数据证明可溶性FcγRIA可阻断免疫复合物在小鼠肥大细胞中的结合和信号传递。

还评估了可溶性FcγRIA对补体介导的抗体致敏SRBC的裂解的作用。在37℃，将抗体致敏SRBC与大鼠血清孵育导致了补体活化和SRBC裂解。向孵育混合物加入FcγRIA-CH6以剂量依赖方式阻断了SRBC裂解。相反，以无关的对照蛋白TACI-Ig观察到极少的溶血抑制或无溶血抑制。

上述结果证明FcγRIA-CH6可以阻断免疫复合物在体外形成，可以抑制肥大细胞中免疫复合物介导的信号传递，还可以阻断IgG介导的补体活性。这些数据表明FcγRIA-CH6可在体内环境下可有效阻断IgG介导的或免疫复合物介导的炎症。为测试这一点，在小鼠中建立了皮肤逆转被动阿尔图斯反应，并评估了FcγRIA-CH6对免疫复合物介导的水肿和中性粒细胞浸润的效应。

相对于皮内注射相等浓度的非免疫性IgG，注射抗-OVA抗体在处理小鼠的皮肤中产生了时间和浓度依赖的水肿增加。水肿表现为伊文思蓝染料渗出面积(图3A)和组织重量(图3B)都增加。这些效应是免疫复合物特异的，因为在不进行尾静脉注射OVA时未观察到水肿。由髓过氧化物酶的可提取活性测量的中性粒细胞在损害部位中的积累同样有增加(图3C)。

皮内送递抗-OVA抗体和逐渐增量的FcγRIA-CH6产生了依赖浓度的水肿减少，这通过伊文思蓝面积的减小(图3A)或损害部位组织重量的减少(图3B)进行测量。损害活组织检查中的髓过氧化物酶活性也被FcγRIA-CH6显著降低(图3C)。这些数据证明FcγRIA-CH6是小鼠阿尔图斯反应中免疫复合物诱导的炎症的有效抑制剂。

这些数据证明，局部送递FcγRIA-CH6可阻断小鼠阿尔图斯反应中免疫复合物介导的皮肤炎症。

为评估全身送递FcγRIA-CH6是否可以减少皮肤炎症，在起始阿尔图斯反应之前1.0h通过尾静脉对小鼠注射FcγRIA-CH6。与仅注射运载体相比，注射FcγRIA-CH6产生了依赖于剂量的水肿减少，这通过抗-OVA介导的伊文思蓝染液渗出(图4)或抗-OVA诱导的损害部位组织重量增加(图5)进行测量。使用最大剂量的FcγRIA-CH6时，水肿完全消失(图4和5)。与上述数据相似，皮内送递13.0μg的FcγRIA-CH6还减少了该模式中的水肿(图4和5)。以静脉内途径给予最大剂量FcγRIA-CH6所见的水肿减少与以皮内送递13.0μg的FcγRIA-CH6观察到的情况相似(图4和5)。通过可提取的髓过氧化物酶活性测量的中性粒细胞在损害部位的积累在以FcγRIA-CH6治疗的动物中也被消除。

实施例10

重组人FcγRIA、FcγRIIA和FcγRIIIA的抗炎活性的比较

除评估单体FcγRIA-CH6的抗炎活性(参见上文实施例9)之外，还使用与实施例9所描述的相同的体外和体内测定测试了单体FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6(如上文实施例4所述制备)。与FcγRIA-CH6平行地检测了可溶性FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6对免疫复合物沉淀、细胞因子从肥大细胞中分泌和IgG介导的补体活性的效应。与FcγRIA-CH6类似，FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6都减少了免疫复合物沉淀，阻断了补体介导的抗体致敏的红细胞的裂解，并且抑制了免疫复合物介导的IL-6、IL-13、MCP-1和TNF-α在肥大细胞条件培养基中的积累。在减少免疫复合物沉淀方面的效力的相对顺序是FcγRIIIA＞FcγRIA＞FcγRIIA，对于每种可溶性FcγR使用1-1.5μM观察到最大抑制，FcγR∶OVA抗体的摩尔比是约1∶1。阻断补体介导的裂解和抑制肥大细胞细胞因子分泌的效力的相对顺序为FcγRIA＞FcγRIIIA＞FcγRIIA。在抑制细胞因子分泌方面，对于所检测的每种细胞因子，每种可溶性FcγR的IC₅₀是相似的。

还与FcγRIA-CH6平行地检测FcγRIIA-CH6和FcγRIIIA-CH6在体内对小鼠皮肤阿尔图斯反应中的水肿和中性粒细胞浸润的效应。与以可溶性FcγRIA-CH6观察到的炎症减少相反，以相似的浓度范围使用FcγRIIIA-CH6和FcγRIIA-CH6都没有减少抗OVA诱导的伊文思蓝染料渗透、组织重量或组织MPO活性(参见图6A-C)。

还制备并在如上所述的测定中测试了二聚体Fc5融合蛋白形式的FcγRIIA和FcγRIIIA，所述每种融合蛋白都包含两分子的与人Fc(Fc5)的效应物阴性形式相融合的FcγRIIA或FcγRIIIA的胞外结构域。FcγRIIA-Fc5的核苷酸序列和编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：35和SEQ ID NO：36中显示，而FcγRIIIA-Fc5的核苷酸序列和编码的氨基酸序列分别在SEQ ID NO：37和SEQ ID NO：38中显示。N末端序列分析表明，成熟FcγRIIA-Fc5的起始位点是Gln-34，成熟FcγRIIIA-Fc5的起始位点为Met-18和Glu-21。在所有上所述的体外测定中，每种二聚体Fc5融合蛋白具有与单体形式的每种蛋白相似的活性。与其单体对应物相似而同时不同于FcγRIA-CH6，FcγRIIA-Fc5和FcγRIIIA-Fc5均未减少小鼠逆转被动阿尔图斯反应中的炎症和中性粒细胞浸润。

实施例11

胶原抗体诱导的关节炎模型

在第0天经尾静脉内注射向雄性DBA/1J小鼠(8周龄，每组n＝8只小鼠)给予2mg(在200uL中)抗II型胶原抗体混合物(ChemiconIntl.Arthrogen-CIA)。所注射的mAb混合物的量是基于文献值和来自初步研究的数据——其中2.0mg剂量的Arthrogen-CIA在雄性DBA/1小鼠中得到了清晰且一致的关节炎症状。在3天后，小鼠接受皮下注射仅运载体(PBS)或含有标明浓度(0、0.67或2.0mg)的FcγRIA-CH6的运载体。3.5小时后，所有的小鼠都接受腹膜内注射溶于终体积为50uL的PBS的50ug LPS，这些在Arthrogen试剂盒中提供。用运载体或标明浓度的FcγRIA-CH6隔天处理小鼠，持续共5剂。

从第0天注射Arthrogen-CIA抗体混合物前开始每天对小鼠的关节炎评分(视觉评分和测径器爪测量)。第1l天处死小鼠。收集血清并保存于-80℃。将爪集中置于10％NBF中并处理用于组织学分析。

用Arthrogen-CIA抗体混合物处理小鼠产生了时间依赖的爪炎症增加，这通过视觉爪评分(图7，PBS处理的)和爪厚度(图8，PBS处理的)进行测量。在以仅运载体(PBS)处理的动物中容易观察到关节炎评分增加。以FcγRIA-CH6处理动物产生了浓度依赖的爪炎症减少。给予最大剂量FcγRIA-CH6完全消除了以视觉爪评分(图7)和爪厚度(图8)表现的抗体诱导的炎症。给予0.67mg剂量的FcγRIA-CH6观察到这些参数稍弱的降低。这些数据证明FcγRIA-CH6在关节炎情况下具有强效抗炎特性。

实施例12

可溶性杂合FcγR对TSLP转基因小鼠的冷球蛋白血症的治疗

过表达胸腺基质淋巴细胞生成素(TSLP)——一种具有促B细胞性质的白细胞介素-7样细胞因子——的小鼠产生大量混合的IgG-IgM组合物的循环冷球蛋白(参见Taneda et al.，Am.J.Pathol.159：2355-2369，2001)。由于免疫复合物在肾、肝、肺、脾和皮肤中沉积，混合型冷球蛋白血症在这些动物中的形成与涉及上述组织的系统性炎性疾病相关(参见同上文)。这些动物中的肾病与在有HCV感染的患者中所见的人冷球蛋白血症性肾小球肾炎非常相似。在去除抑制性受体Fcγ受体IIb后，肾脏损伤加重，并且发病率和死亡率加速，这证明了Fcγ受体在疾病进程中的作用(参见Muhlfeld et al.，Am.J.Pathol.163：1127-1136，2003)从这些数据看来，本文描述的研究证明了可溶性FcγRIA对抗免疫复合物介导的炎症的效力，表明TSLP转基因小鼠是用于评估可溶性FcγRIA或本文描述的可溶性杂合FcγR治疗冷球蛋白血症的效力的合适模型。

通过皮下注射以仅运载体或含有0.1、0.3、0.9或2.0mg可溶性杂合Fcγ受体的运载体处理各组10只TSLP转基因小鼠(3至6周龄)。使用多种给药方案(例如隔天持续21天或者每4天持续21天)向动物给予运载体或者运载体和可溶性杂合FcγR。

在给药后第21天，收集尿样本用于测量蛋白尿，用氟烷将小鼠麻醉，并通过心脏穿刺取血液。将脾、肾、肝、耳和肺取出并进行常规处理以进行组织学研究。对于所有的器官，依照常规方法将来自福尔马林固定和石蜡包埋的组织的4μm切片用苏木精和曙红(H&E)染色。将来自肾的2μm切片用H&E、高碘酸希夫试剂(PAS)和过碘酸环六亚甲基四胺银(periodic acid methenamine silver)染料进行染色。

用标准临床化学分析仪检测血液尿素氮，并且通过目测评定保存于4℃下的血清中冷球蛋白的存在情况。通过标准方法计算尿白蛋白与肌酐的比以评估蛋白尿。

用H&E染色和银染的切片进行形态测定，并通过测量H&E染色的切片上的肾小球的细胞核数目和肾小球丛(glomerular tuft)面积、银染的切片上的肾小球基质面积和肾小球丛面积以及肾小球巨噬细胞MAC-2染色阳性面积和肾小球丛面积来评估肾脏损伤。

可溶性杂合FcγR的效力被测量为肾小球丛面积、被巨噬细胞占据的平均肾小球面积和每个肾小球的平均细胞数量的减少，并且还被测量为与野生型对照相比基质面积的减少。

实施例13

FcγRIA降低小鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型的疾病发生和进展

A.小鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型

CIA关节炎模型是评估药物治疗人关节炎的治疗潜力的合适且广受重视的模型。关节炎是一种以关节处有炎症和/或不适当的免疫复合物形成为特征的疾病。所述免疫复合物常常由抗II胶原的抗体组成，II胶原是一种重要的透明软骨基质蛋白。在关节内形成免疫复合物可导致募集免疫细胞至关节腔，并且生成导致受影响的关节内软骨和骨破坏的炎性细胞因子。因此，小鼠的胶原诱导关节炎与人类风湿性关节炎有许多生物化学、细胞和结构方面的相似之处。

在这些研究中使用8至10周龄的雄性DBA/1J小鼠(25-30g)。在第-21天，对动物进行尾部皮内注射0.1mL在弗氏完全佐剂(由ChondrexInc.，Redmond，WA制备)中配制的1mg/ml鸡II型胶原。三周后，在第0天，除在弗氏不完全佐剂中制备之外，对小鼠进行同样的注射。在第二次胶原注射后，动物开始显现出关节炎症状，并且大多数动物在1-2周内出现炎症。通过使用测径器测量爪厚度以及通过对每只爪打出一个临床评分(0-3)(疾病评分参见下文的描述)，对每只爪评估疾病程度。

B.监测疾病：

该模型中的疾病发生率为95-100％，仅有很少(0-2)不响应者(观察6周后确定)。只有在形成显著、持续的爪肿胀后才认为动物患有既定疾病(established disease)。每天观察所有动物以评定其爪中的疾病状态，这通过对每只爪打出一个定性临床评分来进行。每天，根据每只动物的临床疾病的状态对其四只爪进行评分。为确定临床评分，认为爪具有3个区域：趾、爪本身(前掌或后掌)以及腕或踝关节。与这些区域有关的炎症的程度和严重度被观察到，包括：每趾肿胀情况；趾甲撕裂或趾发红；任一爪出现任何水肿或发红的迹象；腱或骨的任何细微解剖学分界消失的迹象；评估腕或踝的任何水肿或发红；以及炎症上延到最接近的腿的迹象。爪评分1、2或3首先基于严重度的总体印象，其次基于几个区域受累及。用于临床评分的评分表如下：

临床评分：

0＝正常

0.5＝累及一或多个趾，但只有这些趾发炎

1＝累及爪(1个区域)的轻微炎症，并可包括一个或者多个趾

2＝爪的中度炎症，可包括一些趾和/或腕/踝(2个区域)

3＝爪、腕/踝以及一些或全部趾的严重炎症(3个区域)

C.治疗

既定疾病被定义为爪炎症的定性分值排在1或1之上。一旦出现既定疾病，就记录下日期并将其指定为动物患“既定疾病”的第一天，并开始治疗。将小鼠隔天以PBS或一个如下剂量的人FcγRIA(hFcγRIA；在PBS中稀释至所需浓度)进行皮下处理，持续共6剂，所述剂量为：2mg、0.667mg和0.22mg；或者将小鼠每4天以一个如下剂量的hFcγRIA(在PBS中稀释至所需浓度)进行皮下处理，持续共3剂，所述剂量为2mg和0.667mg。

在所述实验期结束时收集血液，以监测抗胶原抗体的血清水平以及血清免疫球蛋白和细胞因子水平。在最后一次治疗48小时后，将动物安乐处死。收集血液以获取血清，将所有的爪和所选的组织集中至10％的NBF中，用于组织学研究。收集血清并冻结在-80℃，用于免疫球蛋白和细胞因子测定。

用II型胶原注射并用运载体处理的的小鼠在随机选择后数天出现爪肿胀，这一点可以从较高的疾病评分(爪评分)看出(参见图10，空心圆圈)。隔天用FcγRIA治疗12天产生了统计学显著的剂量依赖的临床评分降低(参见图10，实心符号)。用0.22mg剂量进行治疗使疾病进展降低50％，而2.0mg剂量使疾病严重度降低90％。当以延长的给药间隔给予FcγRIA时也观察到了爪评分下降(参见图11)。与仅使用运载体(PBS)处理相比，每4天以2.0mg的FcγRIA治疗9天使临床评分降低50％，而当隔天给予FcγRI时则可见下降90％(参见图11)。以hFcγRIA治疗的小鼠在受影响的爪的数目方面也有剂量依赖的减少(参见图12)。

总之，这些结果表明在鼠胶原诱导关节炎中，给予重组人FcγRIA可降低疾病发生和进展。这些数据支持将FcγRIA用作治疗人的关节炎和其他IgG介导的和免疫复合物介导的疾病的新型有效的治疗剂。

实施例14

FcγRIA降低小鼠胶原诱导关节炎(CIA)模型中的IL-6和抗II型胶原抗体的水平

除通过评估爪炎症的程度和严重度监测小鼠CIA模型中的疾病进展外，还对上文所述用于CIA研究的小鼠(参见实施例13)评估IL-6和抗II型胶原抗体的水平，概述如下。

A.方法

通过Luminex测定定量血清细胞因子

使用来自Upstate Biotechnology的Luminex细胞因子测定试剂盒定量小鼠血清中的细胞因子水平。用0.2mL的Assay Buffer将每个平板封闭10分钟，除去缓冲液并吸干平板。向合适的孔中加入0.025mL的标准样本、对照样本、空白样本和测试样本的每一种，然后再加入0.025mL的Serum Matrix样本。向每个样本孔加入0.025mL体积的Assay Buffer，然后加入0.025mL经超声处理悬浮的捕捉微球。将每个板均密封，盖以箔，并在4℃在摇床上孵育。18-24h后，吸走孔中内容物并吸干平板。然后，用0.2mL的洗涤缓冲液将每个板洗涤2-3次，向每个孔中加入0.025mL的检测抗体混合物并将平板密封，盖以箔，并在室温下在摇床上孵育60分钟。向每孔加入0.025mL的Streptavidin-Phycoerythrin样本，将每个板均密封，盖以箔，并在室温下在摇床上孵育30分钟。吸走每个孔中的内容物，将每个板吸干，并用0.2ml/孔的洗涤缓冲液洗涤2-3次。向每个孔中加入0.1ml鞘缓冲液(Sheath Buffer)样本，并在Luminex仪器上读出所有样本的吸光度。

定量II型胶原抗体

使用来自Chondrex的小鼠IgG抗-II型胶原抗体试剂盒定量小鼠血清中抗II型胶原抗体的水平。用0.1mL的封闭缓冲液将每个平板在室温下封闭60分钟。将平板用洗涤缓冲液洗涤3次，并且向合适的孔中加入终体积0.1mL的标准物、样本或空白物。将平板盖住，并在4℃孵育过夜。次日用洗涤缓冲液将每个平板洗涤6次，并向每个孔中加入0.1mL体积的二抗。然后，将所述平板在室温下孵育。在2.0h后，洗涤每个平板，向每个孔中加入0.1mL的OPD溶液，并在室温下孵育30分钟。通过向每个孔中加入0.05mL的2N硫酸终止反应，并测定每孔在490nm的吸光度。

B.结果

与没有接受II型胶原注射的非关节炎小鼠相比，注射II型胶原的小鼠在第15天被处死时IL-6的血清水平升高。正常小鼠的IL-6水平低于检测水平，而出现胶原诱导的关节炎并仅用运载体处理的小鼠的IL-6水平增加至320pg/mL。用可溶性人FcγRIA(隔天给予2.0mg，持续2周)治疗使IL-6的血清水平在第15天下降70％，下降至95pg/mL。

除降低IL-6水平外，用可溶性人FcγRIA治疗还使关节炎小鼠血清中的抗II型胶原抗体水平下降。隔天给予2.0mg的FcγRIA使第15天小鼠被处死时的抗II型胶原抗体的量相对于在仅用载体治疗的关节炎小鼠中观察到的水平下降40-50％。

实施例15

构建杂合可溶性C末端六组氨酸FcγRIA表达质粒以表达FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第1个Ig结构域和其后的FcγRIA的第2个和第3个Ig结构域

生成了具有C末端标签——六组氨酸(c6xH)——的表达构建体，所述构建体包含FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第1个胞外Ig结构域和其后的FcγRIA的第2个和第3个胞外Ig结构域。这些杂合FcγR构建体也被分别称作FcγRIIA/RIA-CH6、FcγRIIB/RIA-CH6、FcγRIIIA/RIA-CH6和FcγRIIIB/RIA-CH6。利用编码FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第1个Ig结构域的DNA片段、编码FcγRIA的第2个和第3个Ig结构域的DNA片段和表达载体pZMP31，经PCR和同源重组生成这些构建体。

生成了4个PCR片段，它们编码与pZMP31载体序列的5’非翻译区部分重叠的5’端、FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第1个Ig结构域和与FcγRIA的第2个Ig结构域部分重叠的3’端。PCR扩增反应使用5′寡聚核苷酸：TCCACAGGTGTCCAGGGAATTCATATAGGCCGGCCATGGCTATGGAGACCCAAATGTCT(SEQ ID NO：47；FcγRIIA前导序列特异的正向引物)，TCCACAGGTGTCCAGGGAATTCATATAGGCCGGCCATGGGAATCCTGTCATTCTTACC(SEQ ID NO：48；FcγRIIB前导序列特异的正向引物)或TCCACAGGTGTCCAGGGAATTCATATAGGCCGGCCATGTGGCAGCTGCTCCTCCCAACT(SEQ ID NO：49；FcγRIIIA和FcγRIIIB前导序列特异的正向引物)。所进行的4个PCR反应使用3’寡聚核苷酸CGTGAAGACTCTGCTGGAGACCTGCAGTAGTAGCCATTCGGAAAGCACAGTCAGATGCAC(SEQ ID NO：50；包含与FcγRIA的结构域2(第2个Ig结构域)部分重叠的序列且FcγRIIA和FcγRIIB的结构域1(第1个Ig结构域)特异的反向引物)、CGTGAAGACTCTGCTGGAGACCTGCAGTAGTAGCCAGCCGATATGGACTTCTAGCTGCAC(SEQ ID NO：51；包含与FcγRIA的结构域2(第2个Ig结构域)部分重叠的序列且FcγRIIIA的结构域1(第1个Ig结构域)特异的反向引物)或CGTGAAGACTCTGCTGGAGACCTGCAGTAGTAGCCAGCCGACATGGACTTCTAGCTGCAC(SEQ ID NO：52；包含与FcγRIA的结构域2(第2个Ig结构域)部分重叠的序列且FcγRIIIB的结构域1(第1个Ig结构域)特异的反向引物)，将之前制备的可溶性FcγRIIA(MPET构建体#1202)、FcγRIIB(MPET构建体#1204)、FcγRIIIA(MPET构建体#1205)或FcγRIIIB(MPET构建体#1207)的DNA克隆用作模板。

生成了另外3个编码具有CH6(C末端六组氨酸)标签的FcγRIA的第2个和第3个Ig结构域的PCR片段；这些片段包含(i)与编码FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA或FcγRIIIB的第1个Ig结构域的PCR片段部分重叠的5’端；(ii)FcγRIA的胞外结构域编码区(Ig结构域2和3)；(iii)六组氨酸标签编码序列；和(iv)与pZMP31载体的MCS下游部分重叠的3’端。PCR扩增反应使用以下5’寡核苷酸：CTCAGCGACCCTGTGCATCTGA  CTGTGCTTTCCGAATGGCTACTACTGCAGGTCTCCAGC(SEQ ID NO：53；包含与FcγRIIA和FcγRIIB的第1个Ig结构域部分重叠的序列且FcγRIA的结构域2(第2个Ig结构域)特异的正向引物)，CTCAGTGACCCGGTGCAGCTAGAAGTCCATATCGG  CTGGCTACTACTGCAGGTCTCCAGC(SEQ ID NO：54；包含与FcγRIIIA的第1个Ig结构域部分重叠的序列且FcγRIA的结构域2(第2个Ig结构域)特异的正向引物)，或CTCAGTGACCCGGTGCAGCTAGAAGTCCATGTCGGCTGGCTACTACTGCAG  GTCTCCAGC(SEQ ID NO：55；包含与FcγRIIIB的第1个Ig结构域部分重叠的序列且FcγRIA的结构域2(第2个Ig结构域)特异的正向引物)。进行这3个PCR反应中的每一个PCR反应均使用3′寡聚核苷酸TACAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTC TAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCC(SEQ ID NO：56；包含一个6组氨酸标签和终止密码子序列且FcγRIA胞外结构域的C末端特异的反向引物)，并将以前生成的FcγRIA的DNA克隆作为模板(MPET构建体#1198)。

PCR扩增反应条件如下：95℃5分钟，一个循环；(95℃30秒，之后55℃30秒，之后68℃1分钟)，25个循环；以及72℃7分钟，一个循环。将PCR反应产物混合物用1％的琼脂糖凝胶进行分离，并使用QIAquick^TM Gel Extraction试剂盒(Qiagen，Cat.No.28704)从凝胶上提取对应于预计大小的DNA片段。

质粒pZMP31为一种哺乳动物表达载体，该载体中含有：表达盒，具有嵌合CMV增强子/MPSV启动子、在酵母重组之前进行线性化的FseI、NarI和BglII位点、大肠杆菌复制起点；哺乳动物筛选标记表达单元，包含SV40启动子、增强子和复制起点、DHFR基因和SV40终止子；以及在酿酒酵母中进行筛选和复制所需的URA3和CEN-ARS序列。

将质粒pZMP31用FseI、NarI和BglII消化，然后在酵母中与上文提及的凝胶提取的PCR片段的如下相应组合进行重组，其中所述组合为：FcγRIIA和FcγRIA、FcγRIIB和FcγRIA、FcγRIIIA和FcγRIA或者FcγRIIIB和FcγRIA。将50μl的感受态酵母(酿酒酵母)细胞与3μl的每种PCR片段插入DNA和30ng的经FseI、NarI和BglII消化的pZMP31载体相混合。将所得混合物转移至0.2cm电穿孔杯中。对酵母/DNA混合物施加电脉冲，使用的电源(BioRadLaboratories，Hercules，CA)设置为0.75kV(5kV/cm)、∞欧姆和25μF。向杯中加入300μl的1.2M山梨糖醇，将所述酵母以75μl和200μl的等分铺于两个URA-D板上，并在30℃孵育。在约72小时后，将来自一块板上的Ura⁺酵母转化体重悬于100ul酵母裂解缓冲液(0.1M NaCl、0.0062M Tris HCl、0.0038M Tris Base、0.001M EDTA、2％(v/v)聚山梨醇酯20、1％(w/v)SDS)和100μl每100μl含有10U酶解酶(Zymolyase)的Qiagen MiniPrep试剂盒缓冲液P1中。然后，将此混合物在37℃孵育大约15分钟，接下来依照制造商的说明书进行其余Qiagen miniprep试剂盒步骤。

使用4μl酵母DNA制品和50μl大肠杆菌细胞进行电转感受态大肠杆菌宿主细胞(DH12S)的转化。以1.75kV、25μF和400欧姆对细胞施加电脉冲。在电穿孔之后，加入0.5ml LB，然后将细胞以10μl和30μl的等分铺于两块LB AMP板(LB肉汤(Lennox)、1.8％Bacto^TM琼脂(Difco)、100mg/L氨苄青霉素)上。

对每种构建体的5个DNA克隆的插入物进行测序分析。选择含有正确序列的那个克隆。使用市售的试剂盒(QIAGEN Plasmid Mega试剂盒，Qiagen，Valencia，CA)，根据制造商的说明书大规模分离质粒DNA。FcγRIIA/RIA-CH6、FcγRIIB/RIA-CH6、FcγRIIIA/RIA-CH6和FcγRIIIB/RIA-CH6杂合构建体的核苷酸序列分别在SEQ ID NO39、41、43和45中显示。相应的编码的FcγRIIA/RIA-CH6、FcγRIIB/RIA-CH6、FcγRIIIA/RIA-CH6和FcγRIIIB/RIA-CH6的氨基酸序列分别在SEQ ID NO 40、42、44和46中显示。

使用相同的方法制备具有C末端组氨酸标签(组成为Gly Ser GlyGly His His His His His His)的天然可溶性FcγRIA序列(其包括天然Ig结构域1、2和3序列)(FcγRIA-CHIS)。为制备该构建体，使用寡核苷酸引物TCCACAGGTGTCCAGGGAATTCATATAGGCCGGCCATGTGGTTCTTGACAACTCTGCTC(SEQ ID NO：57；FcγRIA前导序列特异的正向引物)、寡核苷酸引物TACAACCCCAGAGCTGTTTTAAGGCGCGCCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGTCC(SEQ ID NO：58；包含一个6组氨酸标签和终止密码子序列且FcγRIA胞外结构域C末端特异的反向引物)和作为模板的以前生成的FcγRIA的DNA克隆(MPET构建体#1198)，生成了编码具有C末端组氨酸标签的天然可溶性FcγRIA序列(包含天然Ig结构域1、2和3序列)的PCR片段。

为进行后续的表达和聚集水平分析，将Mega Prep质粒DNA用于对293F细胞进行短暂转染。对于每个构建体，将25μg的质粒DNA稀释于300μl预热至37℃的Optimem培养基(Invitrogen)，并将其在室温下孵育5分钟。在另外一个管中，将32ul的Lipofectamine2000(Invitrogen)稀释于300μl预热的Optimem培养基，并将其在室温下孵育5分钟。将两管中的内容物合并在一起，混合，并且将其在室温下孵育30分钟，孵育期间不时进行缓和的混合。形成DNA/lipofectamine复合物后，将其加入至25ml的以1×10⁶细胞/ml培养在Invitrogen Freestyle培养基中的293F细胞。继续培养96小时，通过低速离心5分钟来沉淀细胞收获培养基。保存培养基并将其用于表达和聚集水平分析(参见下文实施例16)。

实施例16

对来自短暂转染的293F条件培养基的可溶性杂合FcγR构建体的分析

可溶性FcγRIA蛋白质在正常细胞培养温度下有形成自缔合复合物和聚集物的倾向。其他可溶性形式的Fcγ受体家族成员(FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA和FcγRIIIB)似乎不表现FcγRIA所表现的自缔合水平。

生成了可溶性杂合FcγR构建体，其中FcγRIA的第1个Ig结构域被其他家族成员(FcγRIIA、FcγRIIB、FcγRIIIA、FcγRIIIB)的第1个Ig结构域所代替，如上文所述(参见实施例15)。将这些杂合构建体(FcγRIIA/RIA-CH6、FcγRIIB/RIA-CH6、FcγRIIIA/RIA-CH6和FcγRIIIB/RIA-CH6)短暂转染至293F细胞系中，并且在Ig-Sepharose Resin(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上对来自这些细胞的条件培养基评估表达和捕捉。还以同样的方式表达和分析了可溶性天然类型的其他家族成员。

已通过实验表明，IgG Sepharose仅与非聚集的单体FcγRIA结合。因此，多种FcγR构建体与IgG Sepharose结合的能力被用作每种构建体自聚集倾向的一个量度(其中对IgG Sepharose结合的增加表示自聚集倾向的降低)。

以批量处理方式使表达天然和杂合构建体的条件培养基结合IgG Sepharose。将300uL的填充树脂使用19.9mM柠檬酸(EMD，Darnstadt，Germany)、5.1mM磷酸氢二钠、150mM NaCl和0.05％Tween 20(EM Science，Darnstadt，Germany)(pH 3.0)进行预洗脱，然后在1.61mM柠檬酸、23.4mM磷酸氢二钠、150mM NaCl(pH 7.0)中平衡。

将经平衡的树脂与10-25mL的条件培养基混合，并在4℃孵育1小时，同时缓慢转动。在1小时后，将所得混合物转移至BioRADEcono-柱(Hercules，CA)，通过重力流动将流过物收集至另外的管中。然后使用平衡缓冲液以80柱体积洗涤树脂。用4mL洗脱缓冲液洗脱结合的蛋白质，在收集洗脱级分之前将树脂孵育约5分钟。用另外1mL洗脱缓冲液追加至树脂，将得到的追加体积收集在洗脱级分的容器中。使用0.5mL 2M Tris(pH 8.0)中和洗脱级分。

在非还原条件下通过蛋白质印迹进一步分析上样物、流过物和洗脱级分，其中准备好的样本也不经任何方式被加热。将样本上样至使用MES电泳缓冲液(Invitrogen，Carlsbad，CA)的4-12％Bis-Tris凝胶，对所有样本进行体积归一化，并在150V恒压下进行凝胶电泳。然后通过I-Blot系统(Invitrogen)将SDS-PAGE凝胶转移至0.2μm硝酸纤维素。然后用溶于Western A缓冲液(0.097％(w/w)TRIS碱、0.661％(w/w)Tris HCl、0.18612％(w/w)EDTA、0.05％(v/w)Igepal、0.877％(w/w)NaCl、0.25％明胶)的2.5％脱脂奶粉(NFDM)封闭印迹物上的非特异位点。用在溶于Western A缓冲液的2.5％的NFDM中稀释至1∶1000的抗FcγR1/CD64单克隆抗体(R&D，Minneapolis，MN)探测所述印迹物，然后再用抗鼠IgG-HRP(Santa Cruz Biotech，Santa Cruz，CA)探测所述印迹物，每次均在室温下孵育1小时，两次孵育之间用Western A缓冲液洗涤。如所准备，相对于上样物中的总表达量(聚集物和单体)，就流过物中的目标百分比(聚集物的量)和洗脱合并物中的目标百分比(单体的量)对样本进行分析。该分析在运行ImageQuant TL v2005软件的ImageQuant RT ECL成像仪(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)上进行。

当与天然可溶性FcγRIA相比较时，两种FcγR杂合构建体在表达的聚集物和单体的量方面出现改善(即，聚集物的量减少，单体的量增加)。天然可溶性FcγRIA显示，其平均聚集物量为总表达量的66％，从IgG树脂回收总表达量的21％(总表达量的13％未计入)。FcγRIIA/RIA杂合体显示，其平均聚集物量为14.2％，IgG回收的量为40％(48％未计入)。FcγRIIIA/RIA杂合体显示，其平均聚合体量为36％，从IgG树脂中回收的为82％。这些结果代表n＝2。

实施例17

可溶性杂合FcγR在CHO细胞中的表达

对于具有可表达FcγRIIA或FcγRIIIA的第1个Ig结构域和其后的FcγRIA的第2个和第3个结构域的可溶性C末端六组氨酸FcγRIA的序列的杂合构建体(参见实施例15)，将600μg的每种表达构建体(mega prep质粒)在37℃用720单位的BstB1限制酶消化2.5小时，以苯酚/氯仿/异戊醇洗涤，接着以氯仿/异戊醇洗涤，然后以乙醇沉淀过夜，并在1.5mL的微型离心管中离心。倾去上清液，将沉淀用1mL的70％乙醇洗涤，并在室温下孵育5分钟。在离心机中将管以14,000RPM离心10分钟，弃去上清液得到沉淀。在组织培养超净台上的无菌环境中，将沉淀在空气中干燥约5分钟，然后重悬于1.2ml 37℃预热的CHO细胞组织培养基中，并使之在37℃下孵育10分钟。在溶解DNA沉淀的同时，沉淀出大约5.6×10⁷个CHO细胞并将其重悬于2.4ml CHO细胞组织培养基中。将每种溶解的质粒制品分为3份400μl体积，然后加入400μl的CHO细胞悬浮液，终体积为800μl。将DNA/细胞混合物置于0.4cm间距的杯中，使用如下参数进行电穿孔：950μF高电容、300V。对于每个质粒电穿孔系列，将杯中内含物取出，合并，并用CHO细胞组织培养基稀释至25mL，并置于125mL摇瓶中。将摇瓶在振荡器上置于培养箱中，在37℃、5％CO₂条件下以120RPM摇晃。

以500nM甲氨蝶呤(MTX)对CHO细胞进行营养筛选和扩增。选出的CHO细胞系命名为MECL 1308(FcγRIIA/IA杂合体)和1309(FcγRIIIA/IA杂合体)。

为检测表达情况，使用第7代电穿孔后合并物建立培养物。将细胞离心并以0.6×10⁶细胞/ml重悬于体积为50ml的新鲜培养基中，并如上描述继续96小时。通过蛋白质印迹确认有标签的蛋白的表达。

实施例18

在Wave反应器中，FcγRIIA/IA-CH6蛋白在CHO DXB11细胞中的表达

在10L的Wavebag反应器(Wave Biotech)中在以ZG构建体1892转染的CHO DXB11细胞中表达了FcγRIIA/IA-CH6蛋白。使用加有5mM L-谷氨酰胺(来自200mM L-谷氨酰胺，Gibco货号25030-081)、1mM丙酮酸钠(来自100mM丙酮酸钠，Gibco货号11360-070)和500nM甲氨蝶呤的ZM2培养基(SAFC BiosciencesEx-CELL货号68041)，在摇瓶中扩大培养所述细胞。通过将500mL对数期的摇瓶培养物接种至含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠但不含甲氨蝶呤的4.5L ZM2培养基，开始反应器运行。这得到了5L的终工作体积，密度为3.5×10⁵细胞/mL。

将CO₂水平保持在3％-6％，并且将其以0.2LPM不断地泵入反应器顶部空间。通过在平台上以设置为9.5的角度、以每分钟25转的速率摇晃培养物来满足细胞的溶解氧需求。不控制pH，但将pH保持在6.6至7.0。将温度保持在37℃，直至密度达到2.0×10⁶细胞/mL，然后将温度降至34℃进行剩余的运行。将葡萄糖水平保持在高于2g/L，L-谷氨酰胺高于2mM。

接种后11天收获培养物，密度为7.5×10⁶细胞/mL，存活率为96％。将上清液以3500×g离心15分钟，使澄清的条件培养基通过0.22μm滤器(Millipore Opticap货号KWSSL4HB3)并用于进行蛋白纯化。

实施例19

在Wave反应器中，FcγRIIIA/IA-CH6蛋白在CHO DXB11细胞中的表达

在10L的Wavebag反应器(Wave Biotech)中在以ZG构建体1894转染的CHO DXB11细胞中表达了FcγRIIIA/IA-CH6蛋白。使用加有5mM L-谷氨酰胺(来自200mM L-谷氨酰胺，Gibco货号25030-081)、1mM丙酮酸钠(来自100mM丙酮酸钠，Gibco货号11360-070)和500nM甲氨蝶呤的ZM2培养基(SAFC BiosciencesEx-CELL货号68041)，在摇瓶中扩大培养所述细胞。通过将500mL对数期的摇瓶培养物接种至含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠但不含甲氨蝶呤的4.5L ZM2培养基，开始反应器运行。这得到了5L的终工作体积，密度为3.1×10⁵细胞/mL。

将CO₂水平保持在3％-6％，并且将其以0.2LPM不断地泵入反应器顶部空间。通过在平台上以设置为9.5的角度、以每分钟25转的速率摇晃培养物来满足细胞的溶解氧需求。不控制pH，但将pH保持在6.6至7.0。将温度保持在37℃，直至密度达到1.4×10⁶细胞/mL，然后将温度降至34℃进行剩余的运行。将葡萄糖水平保持在高于2g/L，L-谷氨酰胺高于2mM。

接种后11天收获培养物，密度为6.3×10⁶细胞/mL，存活率为97％。将上清液以3500×g离心15分钟，使澄清的条件培养基通过0.22μm滤器(Millipore Opticap货号KWSSL4HB3)并用于进行蛋白纯化。

实施例20

可溶性FcγRIA和FcγRIIIA/IA-CH6的纯化

用10L的Wavebag反应器(Wave Biotech)进行rh-FcγRIA和FcγRIIIA/IA-CH6的大规模生产。使用加有5mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和500nM甲氨蝶呤的ZM2培养基(SAFC BiosciencesEx-CELL)，在摇瓶中扩大培养细胞。通过将500mL对数期的摇瓶培养物接种至含有L-谷氨酰胺和丙酮酸钠但不含甲氨蝶呤的4.5LZM2培养基，开始反应器运行。这得到了5L的终工作体积，密度为3.1×10⁵细胞/mL。将CO₂水平保持在3％-6％，并将其以0.2LPM不断地泵入反应器顶部空间。通过在平台上以设置为9.5的角度、以每分钟25转的速率摇晃培养物来满足细胞的溶解氧需求。不控制pH，但将pH保持在6.6至7.0。将温度保持在37℃，直至密度达到1.4×10⁶细胞/mL，然后将温度降至34℃进行剩余的运行。将葡萄糖水平保持在高于2g/L，L-谷氨酰胺高于2mM。接种后11天收获培养物，密度为6.3×10⁶细胞/mL，存活率为97％。将上清液以3500×g离心15分钟，使澄清的条件培养基通过0.22μm滤器(Millipore Opticap)，然后进行蛋白纯化。

如上文实施例8所述，通过在IgG-Sepharose、Poros HS-50和Superdex 75上进行的顺序色谱(sequential chromatography)来纯化无标签的rh-FcγRIA。

通过在Ni-NTA Superflow树脂、Q-Sepharose和Superdex 200上进行的顺序色谱来纯化有组氨酸标签的FcγRIIIA/IA。简而言之，将CHO条件培养基过滤除菌、浓缩并进行缓冲液更换，更换为50mM NaPO₄、500mM NaCl、25mM咪唑(pH 7.5)(缓冲液A)。使用在缓冲液A中平衡的Ni-NTA His Bind Superflow树脂(Novagen，Madison，WI)捕获有组氨酸标签的FcγRIIIA/IA蛋白。用50mM NaPO₄、500mM NaCl(pH7.5)中的梯度咪唑(0-500mM)进行结合蛋白的洗脱。通过SDS-PAGE和蛋白质印迹分析各级分的FcγRIIIA/IA(抗-6×组氨酸HRP小鼠IgG1，R&D Systems，Minneapolis，MN)。

将含有FcγRIIIA/IA-CH6的Ni-NTA级分进行缓冲液更换，更换为50mM NaPO₄、150mM NaCl(pH 7.5)(缓冲液B)，并在4℃与在缓冲液B中预平衡的Q Sepharose 4FF树脂(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)孵育过夜。将所得浆体转移至重力流动柱，合并流过物和洗涤级分，并如上所述评估rh-FcgR的存在情况。将合并的级分浓缩并注入在50mM NaPO₄、109mM NaCl(pH 7.3)(缓冲液C)中平衡的Superdex200Hiload(GE Healthcare，Uppsala，Sweden)柱上。在缓冲液C中洗脱所述柱，并且将含有FcγRIIIA/IA-CH6的级分合并、浓缩、过滤除菌并在-80℃保存。通过用SDS-PAGE、蛋白质印迹、N末端测序和尺寸排阻多角度光散射分析FcγRIIIA/IA-CH6。

实施例21

聚集研究

可溶性天然FcγRIA的聚集

由哺乳细胞大批量生产可溶性重组人FcγRIA(CD64A)在历史上一直以来都困难重重(参见Berntzen et al.，J.Immunol.Methods 298：93-104，2005；Sondermann and Oosthuizen，Biochem.Soc.Trans.30：481-486，2002；Paetz et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.338：1811-1817，2005；Bruhns et al.，Blood DOI 10.1182，2008/blood-2008-09-179754)。本发明人已发现，293f或CHO DXB-11细胞中生产可溶性重组人FcγRIA的产率低很大程度上归因于所述蛋白质的温度依赖性非共价自缔合，所述自缔合导致大量可溶性聚集物。此外，FcγRIA聚集物的形成限制了从细胞培养条件培养基中回收蛋白质。为了更详细地研究聚集过程，如上文所述从CHO DXB-11细胞的条件培养基中纯化出了FcγRIA。将高度纯化的FcγRIA蛋白质在4℃、25℃和37℃孵育不同的时间，并通过在Superdex 75柱上进行尺寸排阻色谱监测聚集物的形成。

在4℃或25℃孵育最长达48h后，FcγRIA的洗脱谱与刚解冻(freshly-thawed)的FcγRIA样本的洗脱谱相同，即该蛋白作为同质单峰从柱中洗脱出，洗脱时间为10.3分钟。相反，在37℃将FcγRIA孵育0、2、5、20或48h，产生了时间依赖的作为单体FcγRIA洗脱的材料的量减少，并且在7.8分钟时洗脱的材料的量增加，该洗脱谱与大量FcγRIA聚集物形成一致。对于在37℃孵育0、2、5、20或48h的样本，作为聚集物回收的材料的量分别为加入至柱的总FcγRIA的0％、17％、43％、83％和93％。

为评估聚集的FcγRIA是否有生物活性，对在37℃孵育20h(83％聚集)的材料如以前所述(参见Ellsworth et al.，J.Immunol.180，580-589，2008)测试其对免疫复合物沉淀的抑制。将卵白蛋白和抗卵白蛋白的混合物与逐渐增加量的未孵育(单体)FcγRIA孵育产生了对免疫复合物沉淀的剂量依赖的抑制，以5.0μM FcγRIA观察到最大抑制。相反，以相同浓度的聚集FcγRIA观察到极少抑制或者未观察到抑制。在IgG-Sepharose洗脱测定中得到了类似的结果，其中将细胞条件培养基或纯化的FcγRIA蛋白质加至IgG-Sepharose的小型柱。在该测定中，将FcγRIA样本加至所述柱，将所述柱以PBS洗涤，并以低pH缓冲液洗脱结合的FcγRIA。收集洗涤级分和低pH缓冲液洗脱物，使用抗FcγRIA特异性抗体通过蛋白质印迹评估了上样物、洗涤级分和洗脱级分中的FcγRIA的量。对于在37℃孵育48h的FcγRIA，96％的总FcγRIA出现在未结合的洗涤级分，4％在结合的级分中。相反，对于在4℃孵育的FcγRIA，整个样本出现在结合的级分中。这些数据证明，聚集的FcγRIA不结合IgG-Sepharose。总之，这些数据证明，聚集的FcγRIA没有生物学活性。

FcγRIA的温度依赖聚集似乎是不可逆的，这是因为在4℃或25℃进行另外的孵育或者加入过量人IgG1，均未改变之前聚集的材料的Superdex 75洗脱谱。

温度诱导的FcγRIA解折叠的进一步证据来自在37℃在磷酸盐缓冲液中将FcγRIA孵育0、5、10、15或20h后对FcγRIA的圆二色谱(circulardichroism)(CD)谱的测量。对于未孵育的FcγRIA(0h)，在被约285nm处的一个波谷隔开的大约270nm和290nm处观察到2个CD信号峰。对于在37℃孵育不同时间的FcγRIA，在这些波长中观察到CD信号强度的时间依赖性降低，表明时间和温度依赖的FcγRIA结构的丧失。

通过动态光散射法(DLS)评估FcγRIA在溶液中的稳定性进一步证实了这些数据。在DLS实验中，测量了由于分子在溶液中扩散导致的光散射强度的时间依赖的波动。光散射的变化与分子的大小和构象有关。测量了扩散系数，然后将其用于计算FcγRIA的流体动力学半径(Rh)。在25℃和37℃将FcγRIA在磷酸盐缓冲液(pH 7.3)中孵育不同时间，并评估Rh。未孵育的FcγRIA(0h)的Rh是约3.4nm。将FcγRIA在25℃孵育不同时长未发现其Rh有变化(对于所有时长，Rh都为约3.2nm)。相反，FcγRIA的Rh随在37℃的孵育时间的增加而增加，对于孵育1.0h、2.0h、3.0h和48h的样本，其Rh分别增加至4.1nm、5.2nm、6.4nm和12.8nm。这些数据表明，在37℃，FcγRIA在该制剂中随时间聚合化或解折叠。

以上所述的数据证明，高度纯化的FcγRIA不稳定，在37℃在中性pH的磷酸盐缓冲液中孵育时形成了无活性的自缔合聚集物。为评估聚集是否还发生在表达FcγRIA的CHO细胞的条件培养基中，使用上述的IgG-Sepharose结合测定评估了来自维持在37℃的细胞的未稀释条件培养基。对于在37℃培养的表达FcγRIA的CHO细胞，收集1天的条件培养基并加到IgG-Sepharose柱上。80％回收的FcγRIA存在于未结合的级分(聚集的蛋白)，剩余部分(20％)作为单体FcγRIA从柱中洗脱出来。这些数据表明，FcγRIA在CHO细胞的条件培养基中聚集，并且可能用于解释其他人报道的重组可溶性FcγRIA极低的产量/回收率(参见Berntzen et al.，见上文；Sondermann and Oosthuizen，见上文；Paetz etal.，见上文；Bruhns et al.，见上文)。

杂合受体FcγRIIIA/IA的稳定性研究

为避免天然重组可溶性FcγRIA的温度诱导聚集，使用结构域交换方法制备了杂合FcγR分子，其中使用上文所述的方法用天然FcγRIA的膜远端Ig结构域代替天然FcγRIIIA(CD 16A)的膜远端Ig结构域。如上文指出的，杂合受体FcγRIIIA/IA的体外和体内生物学活性与天然FcγRIA的生物学活性相同。为评估杂合受体FcγRIIIA/IA是否对温度诱导的聚集敏感，在37℃将天然FcγRIA和杂合受体FcγRIIIA/IA分别在磷酸盐缓冲液(pH 7.3)中孵育不同时长。如上文所述通过尺寸排阻色谱监测每种FcγR的聚集，并计算以聚集物存在的总FcγR的百分比。在37℃孵育0h、2h、4h、20h、24h或48h的天然FcγRIA的聚集百分比分别为0、14％、40％、81％、84％和95％。相反，在相同条件下孵育的FcγRIIIA/IA的聚集百分比为0、2％、6％、30％、34％和51％。天然FcγRIA和FcγRIIIA/IA之间的聚集差异在0.1M琥珀酸盐缓冲液(pH 6.0)中甚至更为明显：孵育0h、2h、4h、20h、24h或48h的天然FcγRIA的聚集百分比分别为0、5％、13％、52％、55％和77％。在这些条件下FcγRIIIA/IA的聚集百分比分别为0％、0％、0％、5％、8％和16％。这些数据表明，杂合受体FcγRIIIA/IA比天然FcγRIA对温度诱导的聚集敏感度小得多。

通过在与上文所述对于FcγRIA的相同条件下对FcγRIIIA/IA进行动态光散射(DLS)分析得到了类似的数据。天然FcγRIA在37℃孵育后其Rh增加，与此相反，在37℃孵育长达3.0h后未发现FcγRIIIA/IA的流体力学半径(Rh)有变化(在此期间Rh＝3.6-3.8)。将FcγRIIIA/IA在37℃孵育48h，观察到Rh略微增加，至5.1nm。如上文所述，此Rh增加与在相同条件下孵育的天然FcγRIA的Rh增加——Rh增加至12.8nm——相比要小得多。这些数据再次证明，杂合受体FcγRIIIA/IA比天然FcγRIA对温度诱导的聚集敏感度小。

为了评估在CHO条件培养基中的单体FcγRIIIA/IA的回收率是否相对于天然FcγRIA的回收率有增加，比较了表达这其中的每一种受体的CHO细胞的24小时培养物中的单体和聚集FCGR的量。通过使用如上文所述的IgG-Sepharose结合测定和蛋白质印迹检测来监测聚集。以加至柱的总FcγR的百分比计，53％的FcγRIIIA/IA是单体，因为它结合于IgG-Sepharose并在低pH洗涤步骤中被洗脱出来；而47％的蛋白在洗涤中作为聚集物质被洗脱出来。相反，对于天然FcγRIA，仅有14％的蛋白结合于IgG-Sepharose，86％的蛋白在洗涤中作为聚集物质被洗脱出来。同纯蛋白质一样，这些数据表明，与天然FcγRIA相比，FcγRIIIA/IA在CHO条件培养基中对温度诱导的聚集敏感度较小并且被回收的量更多。

实施例22

可溶性FcγRIA、FcγRIIA/RIA和FcγRIIIA/IA的抗炎活性的比较

方法

1.免疫复合物沉淀

将鸡卵卵白蛋白(OVA)溶于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中至终浓度为15.0μg/mL，并且在存在和不存在标明浓度的天然可溶性FcγRIA受体或一种杂合可溶性受体FcγRIIA/IA-CH6或FcγRIIIA/IA-CH6(在本实施例中也分别称为“FcγRIIA/IA”(或FCGR2A1A)和“FcγRIIIA/IA”(或“FCGR3A1A”))的情况下在200μL的终体积中与300μg/mL兔多克隆抗-OVA抗体混合。之后立即在37℃借助分光光度计在350nm每30秒监测反应混合物的浊度，持续5-10分钟。用线性回归来计算浊度曲线线性部分的斜率，FcγR介导的对免疫复合物沉淀的抑制表示为与仅含抗-OVA和OVA的孵育情况下的相对值。

2.细胞因子从肥大细胞中的分泌

通过在终体积为5.0mL的PBS中将300μL兔多克隆抗OVA与75.0μL的1mg/mL的OVA的PBS溶液混合，制备出免疫复合物。将混合物在37℃孵育30-60分钟，然后在4℃放置18-20h。通过在12,000rpm离心5.0分钟收集所述免疫复合物，将上清级分取出并丢弃，并将免疫复合物沉淀重悬于1.0mL的冰冷PBS中。再次洗涤后，将免疫复合物重悬于终体积为1.0mL的冰冷PBS中。使用BCA测定蛋白浓度。

将MC/9细胞在培养基A(含有10％胎牛血清、50.0μM B-巯基乙醇、0.1mM非必需氨基酸、1.0mM丙酮酸钠、36.0μg/mL L-天冬酰胺、1.0ng/mL rmIL-3、5.0ng/mL rmIL-4、25.0ng/mL rmSCF的DMEM)中传代培养至密度为0.5-3×10⁶细胞/mL。通过以1500rpm离心5.0分钟收集细胞；在培养基A(无细胞因子)中洗涤细胞沉淀并将其以2.0×10⁶细胞/mL重悬于培养基A中。在96孔微量滴定板中，在存在和不存在标明浓度的天然FcγRIA可溶性受体或一种杂合可溶性受体FcgRIIA/IA-CH6或FcgRIIIA/IA-CH6的情况下，在终体积为200μL的缓冲液A中孵育细胞等分(2.0×10⁵个细胞)和10.0μg/孔的OVA/抗OVA免疫复合物(IC)。在37℃4.0h后，移出培养基并在1500rpm离心5.0分钟。收集无细胞的上清液级分，并使用Luminex细胞因子测定试剂盒分析等分试样的IL-6、1L-13、TNFα和MCP-1细胞因子释放的存在情况。

3.FcγR对人IgG1的亲和力的测量

将IgG1抗体固定在单个流动池上，将另外的非衍生化的池用作空白参照。使用胺偶联试剂盒(Biacore)和由Biacore Control Software操控的标准Wizard Template for Surface Preparation进行IgG1抗体的固定。基于pH探测研究的Wizard结果，将IgG1抗体溶液在乙酸钠(pH 5.0)中稀释至11μg/mL。将用于胺偶联的Wizard Template用于将抗体固定至单个流动池。然后，通过注入含有0.2M N-乙基-N′-(3-二乙胺-丙基)碳二亚胺(EDC)和0.05M N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液来活化传感器表面的羧基基团。然后将抗体溶液注入至所述活化的表面上，目标水平是150-200RU。通过用1M盐酸乙醇胺封闭羧甲基葡聚糖表面的剩余酯位点来完成固定步骤。

使用用于动力学分析的Biacore Wizard Template输入用于注入分析物溶液(可溶性天然FcγRIA或可溶性杂合受体FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA)的方法。在25℃下进行所述方法，并且在环境温度下将样本保存在自动采样器中。可注意到，在使用WizardTemplate时，对动力学最优的某些参数，例如注入模式，由Wizard程序预先设定。

将分析可溶性FcγRIA的方法优化，用于测定动力学速率常数k_a和k_d。将受体连续注入两个流动池中(即1和2，分别为空白的和抗体衍生化的)，使得能够对FcγR和人IgG1抗体的结合与FcγR和未修饰对照表面的结合(未检测与兔抗-OVA IgG的结合)进行比较分析。将分析物以40μL/min的流速注入3分钟(缔合时间)。每个分析物注入的解离时间为3分钟。所述分析物的剂量反应曲线区间为0.16-10.3nM。对于剂量反应曲线的每个点，进行N＝2的重复注入。在顺序中包括注入缓冲液，用于减去装置噪音和偏移。以随机模式注入剂量反应曲线样本。对于FcγR的动力学分析，在每个剂量反应曲线循环之后进行单次30秒的50μL/分钟的甘氨酸(pH 1.75)注入，以再生IgG抗体表面。

使用Biacore Control，Evaluation and Simulation软件进行数据分析。首先评估基线稳定性，以确保所述再生步骤在整组注射中都提供一致的结合表面。检查并确认FcγR分析物与对照表面的非特异性结合水平为最小。从特异性结合表面曲线(即流动池2)减去对照表面曲线(即流动池1)并减去使用缓冲液注入曲线的装置噪声和偏移，对结合曲线进行处理。就分析物注入的重复性检查数据，然后将所得的校正的结合曲线全局拟合至结合模型，并且评估所得拟合常数和平衡常数。

4.小鼠的皮肤逆转被动阿尔图斯反应

将10周龄的雌性C57BL/6小鼠(每组n＝8只小鼠)用异氟烷麻醉，剃除其背部毛，用70％乙醇擦拭每只小鼠的背部。每只小鼠接受两次皮内注射，每次0.02mL，在其背部皮肤的不同部位。注射溶液包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)和仅40.0μg兔抗-卵白蛋白(抗-OVA，在56℃孵育30-40分钟热灭活)，或者包含磷酸盐缓冲盐水(PBS)以及40.0μg抗OVA和标明量的可溶性天然FcγRIA或一种可溶性杂合受体FcγRIIA/IA或FcγRIIIA/IA。对照组的小鼠接受两次40.0μg非免疫性兔IgG(如上所述热灭活的)的皮内注射。在注射前将抗体制品在14,000rmp离心10分钟以除去颗粒。皮内注射后立即在每只鼠尾静脉注射100.0μL含有10.0mg/mL OVA和10.0mg/mL伊文思蓝的溶液。在一些情况下，尾静脉注射溶液还包含剂量为1.0mg/kg的地塞米松。在注射后4小时，用CO₂气体将小鼠安乐处死。通过测量伊文思蓝染料的血管渗漏面积(mm²)以及通过测量取自于损伤部位打孔活组织检查的组织重量(mg)评估皮肤水肿。然后将所述组织样本在液氮中迅速冻结并在-80℃保存。

如(Bradley et al.，J.Invest.Dermatol.78：206-209，1982)所述，通过使用来自Cytostore的髓过氧化物酶分析试剂盒(Calgary，AlbertaCanada)测量打孔活组织检查样本中的髓过氧化物酶活性来评估中性粒细胞浸润。

结果和讨论

为评估天然FcγRIA可溶性受体和杂合FcγR可溶性受体——FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA——对免疫复合物沉淀的相对效力，基于(Immunology 38：631-640，1979)和Gavin等(Clin.Exp.Immunol.102：620-625，1995)的方法建立了抗-OVA/OVA免疫复合物沉淀测定。在37℃孵育抗-OVA和OVA产生了所述溶液混合物光密度的时间依赖性增加，这一观察结果与形成不溶性抗-OVA/OVA免疫复合物一致。在测定开始时加入可溶性天然FcγRIA产生了所述混合物光密度的剂量依赖性减少，表明对免疫复合物的抑制。1500nM可溶性FcγRIA完全消除了免疫复合物沉淀。同样，两种可溶性杂合受体FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA也都阻断了OVA-抗-OVA免疫复合物的沉淀。所有三种FcγR的剂量反应曲线相似，表明所述受体具有相等的效力。由于抗原-抗体免疫复合物的沉淀似乎依赖于抗体Fc重链(Immunology38：631-640)和结合于抗体Fc部分的Fcγ受体(Dijstelbloem HM et al，Trends Immunol.22：510-516，2001)之间的非共价相互作用，这些数据表明可溶性天然FcγRIA和可溶性杂合受体FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA通过结合抗-OVA抗体的Fc部分破坏免疫复合物沉淀。

为直接评估天然FcγRIA和每种杂合受体与抗体Fc的相互作用，通过表面等离子体共振分析评估了FcγR与固定的人IgG1的结合。以485的RU(共振单位)水平(FcγR的动力学分析最佳水平中的密度水平)将单克隆人IgG1抗体固定于单个流动池中的传感器表面，假定结合化学计量为1个FcγR分子与1个IgG1分子(Woof and Burton，Nature Rev.Immunol.4：1-11，2004)。天然FcγRIA可溶性受体快速地与固定的IgG1结合，缔合速率和解离速率分别为2.8×10⁶M^-1s^-1和4.6×10^-4s^-1，这两个数值可得出计算出的平衡解离常数为1.7×10^-10M。这些数据与之前报道的数据(Paetz A et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.338：1811-1817，2005)类似，并且证明可溶性天然FcγR与人IgG1以高亲和力结合。可溶性杂合受体FcγRII/IA和FcγRIIIA/IA快速地与固定的IgG1结合，缔合速率和解离速率与天然FcγRIA的相似。这些数据表明所述杂合受体与固定的人IgG1以高亲和力结合。

肥大细胞被认为在多种免疫病症例如III型超敏反应中介导免疫复合物介导的炎症(Ravetch，J.Clin.Invest.110：1759-1761，2002；Sylvestreand Ravetch，Immunity 5：387-390，1996；Jancar and Crespo，TrendsImmunology 26：48-55，2005)。免疫复合物与肥大细胞Fcγ受体的结合被认为可诱导促炎细胞因子例如IL-6和TNFα的分泌(Ravetch，见上文；Jancar and Crespo，见上文)，这随后可导致中性粒细胞浸润和组织损伤。为评估细胞因子从肥大细胞中的分泌是否受免疫复合物刺激，在存在和不存在预先形成的兔抗-OVA/OVA免疫复合物的情况下孵育鼠肥大细胞系MC/9。与抗-OVA/OVA免疫复合物孵育在MC/9细胞条件培养基中产生了时间和浓度依赖的炎性细胞因子IL-6、IL-13、TNFα和MCP-1的积累增加。相反，当MC/9细胞仅与相等浓度的兔抗OVA IgG孵育时，细胞因子产生无变化。这些数据证明MC/9细胞通过产生炎性细胞因子对免疫复合物作出反应。

在逐渐增量的天然FcγRIA可溶性受体或一种杂合可溶性受体FcγRIIA/IA或FcγRIIIA/IA的存在下，将MC/9细胞与抗-OVA/OVA免疫复合物孵育产生了剂量依赖的IL-6、IL-13、TNFα和MCP-1的积累减少。发现每种受体的剂量依赖曲线有很小的差异或没有差异，表明这其中的每种受体有相同的效力。这些数据证明天然FcγRIA和杂合可溶性受体可阻断免疫复合物在小鼠肥大细胞中的结合和信号传递。

上述结果证明可溶性天然FcγRIA和可溶性杂合受体FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA可以阻断免疫复合物在体外形成，可以抑制肥大细胞中免疫复合物介导的信号传递。这些数据表明FcγR在体内环境下可有效阻断免疫复合物介导的炎症。为测试这一点，在小鼠中建立了皮肤逆转被动阿尔图斯反应，并评估了每种FcγR对免疫复合物介导的水肿和中性粒细胞浸润的效应。

相对于皮内注射相等浓度的非免疫性IgG，注射抗-OVA抗体在处理小鼠的皮肤中产生了时间和浓度依赖的水肿增加。水肿表现为伊文思蓝染料渗出面积和组织重量都增加。这些效应是免疫复合物来特异的，因为在不进行尾静脉注射OVA时未观察到水肿。由髓过氧化物酶的可提取活性测量的中性粒细胞在损害部位中的积累同样有增加。

皮内送递抗OVA抗体和逐渐增量的可溶性天然FcγRIA产生了依赖浓度的水肿减少，这通过伊文思蓝面积的减小(图14A和15A)或损害部位组织重量的减少(图14B和15B)进行测量。使用可溶性杂合受体FcγRIIA/IA(图14A和14B)和FcγRIIIA/IA(图15A和15B)得到了类似的结果。

两种杂合受体都降低了水肿的测量值，与天然FcγRIA是等效的。由损伤活组织检查中的髓过氧化物酶活性测量的中性粒细胞浸润也被可溶性天然FcγRIA和每种可溶性杂合受体以相同的效力显著降低(图16A和16B)。这些结果表明，可溶性天然FcγRIA和每种杂合受体FcγRIIA/IA和FcγRIIIA/IA均可阻断小鼠逆转被动阿尔图斯反应中的水肿和中性粒细胞浸润。

尽管已经为了清楚理解之目的详细地描述了前述的发明，但应理解的是，在所附权利要求书范围内一些修改是可实施的。本文所引用的所有出版物和专利文件都为了所有目的而通过引用的方式全文纳入本文，其范围如同单独指出每一篇一样。

Claims (12)

1.一种分离的可溶性多肽，所述多肽的氨基酸序列为：

SEQ ID NO:40；或

SEQ ID NO:44。

2.一种分离的核酸分子，编码如权利要求1的多肽。

3.权利要求2的核酸分子，其中所述核酸分子的序列为

SEQ ID NO:39；或

SEQ ID NO:43。

4.一种表达载体，包含以下有效连接的元件：

a)转录启动子；

b)编码如权利要求1的多肽的DNA区段；和

c)转录终止子。

5.权利要求4的表达载体，其中所述DNA区段的序列为

SEQ ID NO:39；或

SEQ ID NO:43。

6.一种培养的细胞，包含权利要求4或5的表达载体，其中所述细胞表达由所述DNA区段编码的多肽。

7.权利要求6的细胞，其中所述多肽从所述细胞中分泌出来。

8.一种生产多肽的方法，包括：

培养其中已导入权利要求4或5的表达载体的细胞，其中所述细胞表达由所述DNA区段编码的多肽；并且

回收所表达的多肽。

9.权利要求8的方法，其中在表达后所述多肽从所述细胞中分泌出来。

10.一种通过权利要求8或9的方法生产的分离的多肽。

11.一种组合物，包含：

如权利要求1或10中的分离的多肽；以及

可药用载体。

12.权利要求1或10的多肽在制备用于减少阿尔图斯反应的药物中的用途。