JPH01502639A - ヒトインターロイキン―２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ―１Ｌ２―１９、その工学的作出方法及びそれを含有するヒトインターロイキン―２産生細菌大腸菌ＶＮ２ジェネティカＶＬ９０３（ｐＰＲ―１Ｌ２―１９）株 - Google Patents

Abstract

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Description

【発明の詳細な説明】 ヒトインターロイキン−２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮＡ　 ＰＨ−ＩＬ２−１９、その工学的作出方法及びそれを含有するヒトインターロイ キン−２産生細菌大腸菌ＶＮｎジエネテイカＶＬ９０３（ＰＲ−ＩＬ２−１９） 株 発明の分野 本発明は遺伝子工学技術に関し、更に詳しくは、ヒトインターロイキン−２の合 成についてコードする新規組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ−ＩＬ２−１９、その 工学的作出方法及びそのＤＮＡを含有するヒトインターロイキン−２産生細菌大 腸菌（Ｅｓｅｈｅｒｌｃｈｉａ　ｃｏｌｌ）　Ｖ　Ｎ　ＩＩジェネｆ４力ＶＬ９ ０３ｃ　ＰＲ−ＩＬ−２−１９）株に関する。

従来技術 天然ヒトインターロイキン−２、即ちＴ細胞増殖因子は、分子質量的１５，００ ０ダルトンのポリペプチド鎖をもつ糖タンパク質であって、それはレブチン又は 対応抗原での活性化によりＴ細胞から産生される。インターロイキン−２は複合 作用イムノモジュレータ（ｌｓｓｕｎｏｍ−ｏｄｕｌａｔｏｒ）であって、特に それは１９２８球の活性化に基づき免疫応答を促進し、胸腺細胞の有糸分裂誘発 を高め、Ｔ細胞等の細胞毒性活性を誘導する。したがって、インターロイキン− ２は悪性変性、細菌もしくはウィルス感染、免疫不全関連疾患、自己免疫疾患等 のような免疫障害の治療に際して非常に有効である。ヒト血清から又はニアカッ ト（Ｙｕｒｋａｔ）糸細胞培地から直接回収される天然インターロイキン−２は 、その性質及び−床的有効性を研究するには不十分な非常に限られた量で得られ るにすぎない。別のインターロイキン−２供給源は、遺伝子工学の方法によって 得られてインターロイキン−２遺伝子含有組換えプラスミドを有しかつこの遺伝 子の効果的発現を確保した微生物株で代表される。

組換えプラスミドＤＮＡ　ＰＬｃＭｕＢｉｌ　２０１のようなヒトインターロイ キン−２についてコードする組換えプラミスドＤＮＡ及びそれを含む大腸菌に１ ２ΔＨ１Δｔ　ｒｐ　（ＰＬｃＭｕＨｉ　１　２０１）株は当業界で公知である 〔デボス・アール、ブレチンク・ジー、ケルトレ・エッチ、サイモンズ・ジー、 デグレーブφダブル、タバニア・ジェイ、レモウト争イー、フィアーズ・ダブル 、１９８３年、ヌクレイツク・アシッド・リサーチ、第１１巻、第４３０７−４ ３２３頁（Ｄｅｖｏｓ　Ｒ，、Ｐｌａｅｔｌｎｃｋ　Ｇ、＋Ｃｈｅｒｏｕｔｒｅ 　Ｈ，＋Ｓ１ｍｏｎｓ　Ｇ、＋Ｄｅｇｒａｖｅ　Ｖ、、Ｔａｖｅｒｎｌｅｒ　Ｊ 、、Ｒｅ５ａｕｔ　Ｅ、、Ｆｌｅｒｓ　Ｗ、１ｔ９８ｓｌＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ １ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、１１．４：１０７−４３２３）　）。

この組換えＤＮＡ分子において、インターロイキン−２遺伝子の転写はバクテリ オファージλの調節単位Ｐ　Ｌ　ＯＬによりコントロールされ、遺伝子のタンパ ク質産物の翻訳開始はファージＭｕのＳＤ配列に基づき結合リポソームのハイブ リッド領域を工学的に作出することによって確保される。大腸菌に１２Δ）ＩＩ Δｔｒｐ（ＰＬｃＭｕＨｉｌ　２０１）産生株の培養により確保されるヒトイン ターロイキン−２の最大収率は、細胞タンパク質全量の５〜１０％である。

上記組換えプラスミドＤＮＡ及びそれを含む株は、ＰＬプロモーターで確保され るコントロール下での遺伝子ＩＬ２の発現のために、温度感受性ｃＩリプレッサ ーの遺伝子（ｃｌｔｓ８５７）を有する常在性プラスミドを更に必要とするか又 は受容体として突然変異対立遺伝子ｃｌを有する欠陥プロファージを含んだ株の 使用を必要とするといった、いくつかの欠点を有している。その結果必然的に株 受容体の範囲が限られてしまい、しかもインターロイキン−２遺伝子含有プラス ミドと適合プラスミド又は欠陥プロファージの対応領域との再ＣＡ依存性組換え に起因して大規模産生用培養条件下において組換えプラスミドが不安定になって しまう。

更に、リポソーム結合ハイブリッド領域の編成のために比較的短いＳＤ配列を用 いた場合には、大腸菌の翻訳装置の潜在力を極限まで引き出すことができず、ひ いては産生株細胞中におけるヒトインターロイキン−２合成レベルを比較的低い ものにしてしまう。

その結果必然的に大規模培養時の産生株バイオマス中におけるインターロイキン −２含有量を著しく低下させてしまい、結局純粋タンパク質の継続的回収を困難 にして所望産物の収率を低下させてしまう。

発明の開示 ヒトインターロイキン−２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮＡ　 ＰＲ−ＩＬ−２−１９、その工学的作出方法及びそれを含有する細菌大腸菌ＶＮ ｎジエネティカＶＬ９０３　（ＰＲ−ＩＬ２−１９）株は新規であって、これま で文献で非公知である。

本発明は、ヒトインターロイキン−２の合成についてコードする新規組換えプラ スミドＤＮＡ、その工学的作出方法、確実に高収率でインターロイキン−２を産 生ずるそれを含有したインターロイキン−２高産生株に関する。

この目的は、ヒトインターロイキン−２の合成についてコードする組換えプラス ミドＤＮＡ　ＰＲ−ＩＬ２−１９が、３８５０ｂｐの大きさを有しかつ下記ユニ ットニー　ＰＨ１０及び　ＭＬ２４を基礎にして作られるべｐ　ｐ クターブラミスド　ＰＲ１２４Ｂの大きさ３４００ｂｐの　ＢａｍＨＩ−Ｂｇｌ ＩＩ断片； −プラスミド　ＢＲ−３２２を基礎にして工学的に作出され、Ｃｏ１Ｅ１−レプ リコン、アンピシリンに対して安定な（耐性の）遺伝子並びに発現が大腸菌トリ プトファンオペロンのプロモーター及びＳＤ配列により確保されているヒトイン ターロイキン−２遺伝子のｋＤＮＡコピーを有する大きさ５４００ｂｐのプラス ミド　ＡＡ１２１３−２３において、５ｔｕｌの制限領域をＢｇｌ■制限領域で 置換えることにより作られるプラスミドｐＡＡ１２１３−２３Ｂの大きさ４５０ ｂｐのＣｆｒ１３−ＢｇｌＩＩ断片； からなり、しかも下記特徴を有することによって達成されるニ ー　Ｃｏ　Ｉ　Ｅ　Ｉ−レプリコンの複製開始領域、ファージλの温度感受性リ プレッサーｃ　Ｉ　ｔ　５８５７の遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ファージ ｆｄのρ非依存性転写ターミネーターのタンデム（ｔａｎｄｅ厘）、成熟ヒトイ ンターロイキン−２の配列についてコードするファージλのｃｒｏ遺伝子の調節 領域ＰＲＯＲ１ＳＤ配列及びＡＴＧ開始コドンを有する； −ｃ　ｒ　ｏ遺伝子の調節領域ＰＲＯＲ及びＡＴＧコドンとインターロイキン− ２の遺伝子配列及びｆｄ転写ターミネータ−との組合せは、次のヌクレオチド配 列：５′−・・・ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＡＴＧＧＣＣ・・・−３′（ＴＡＡ ＧＧＡＧＧＴ及びＡＴＧ−各々、ｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列及び開始コドン、ＣＣ Ｃ−インターロイキン−２の最初のＡｌａコドン）を有するリポソーム結合ハイ ブリッド領域が形成され、インターロイキン−２遺伝子の終結コドンの後にｆｄ ρ非依存性転写ターミネータ−のタンデムが位置するように行われるニー制限酵 素Ｃ１ａｌ　（その位置がカウント（０）の開始箇所である）、Ｘｂａｌ（約９ ９０）、ＢｇｌＩＩ　（約１２５０）　、Ｐｓ　ｔ　１　（約３０７０）の独特 な認識領域を有する； −コレクシジン・オブ・カルチャーズ・オブ◆マイクロオルガニズムズ番オブΦ ジ・オールユニオンのリサーチ・インスティテユート・オブ拳アンタイバイオテ ィックス（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　ｏｆ　Ｍｌｃｒｏ ｏｒｇａｎｌｓｓｓ　ｏｒｔｈｅ　Ａ１１−Ｕｎｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｉ ｎ５ｔｉｔｕｔｅ　ｏｆ　Ａｎｔｌｂｌｏｔｌｅｓ）に１９８７年１月１２日付 で寄託され、第１８６９号として登録されている。

本発明による組換えプラスミドＤＮＡの工学的作出方法は、以下の通りであるニ ブラスミドｐＢＲ−３２２を基礎にして工学的に作出されかつＣｏ　Ｉ　Ｅ　Ｉ −レプリコン、アンピシリン耐性遺伝子並びに発現が大腸菌トリプトファンオペ ロンのプロモーター及びＳＤ配列により確保されているヒトインターロイキン− ２遺伝子のｋＤＮＡコピーを有する大きさ５４００ｂｐのプラスミド　ＡＡ１２ １３−２３を５ｊｕｌの制限領域をＢａ１ｐ ■制限領域で置換えることにより修正し：得られたプラスミド　ＡＡ１２１３− ２３Ｂを制限酵素Ｃｆ　ｒ１３で処理し、得られたＤＮＡ分子の１本鎖末端を大 腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片で後補完し、しかる後インターロイキ ン−２遺伝子を含むプラスミド　ＡＡ１２１３−２３ＢのＣｆ　ｒ１３断片をア ガロ−スゲル中でのプレバラティブ電気泳動により回収し、ファージＴ４のＤＮ Ａリガーゼにより、ブラ・スミドｐＰＲ４０及び　ＭＬ２４を基礎にしぞ工学的 に作出されたベクター分子　ＰＨ１２４Ｂ　（制限酵素ＢａｍＨ１で予め開裂さ れ、制限領域におけるＤＮＡの１本鎖末端がＳＩエンドヌクレアーゼにより削除 されている）中に組込み、しかる後得られた混合体を制限酵素Ｂｇ１ｍで処理し 、ＤＮＡ分子をＴ４ＤＮＡリガーゼにより環状型に結合せしめ：大腸菌Ｃ６００ 細胞を得られた混合体により形質転換し；形質転換株をアンピシリン含有培地に 接種し、２８℃の温度で培養し、しかる後４２℃の温度で増殖速度が低下するも のについて選択し、選択されたクローンからプラスミド　ＰＲ−ＩＬ２−１９を 回収する；その場合に断片組合せの正確性は、ＤＮＡ開始領域の結合部分におけ る以前には不存在の制限酵素ＢｓｐＲＩ認識配列の復元によって確認される。

本発明のプラスミドは、バクテリオファージλの転写開始レギニレーター遺伝子 ｃ　Ｉ　ｔ　５８５７がその分子中に存在しかつインターロイキン−２遺伝子の 発現がＰＲプロモーターのコントロール下にあることで特徴付けられる。この環 境が、インターロイキン−２遺伝子についてコードするプラスミドと適合常在性 プラスミド又は欠陥プロファージと間の潜在的なｒｅｃＡ依存性組換えを回避す ることを可能にしている。バクテリオファージλのｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列及び ＡＵＧコドンがヒトインターロイキン−２遺伝子のコード領域と結合している組 換えプラスミド　ＰＲ−ＩＬ２−１９の工学的作出方法は、マトリックスＲＮＡ ５’末端領域の最適−次及び立体構造を有するインターロイキン−２遺伝子の結 合リポソームのハイブリッド領域の産生を確実化している。

本発明はヒトインターロイキンを産生じかつ組換えプラスミドＤＮＡ　ＰＲ−Ｉ Ｌ２−１９を含む大腸菌ＶＮ■ジェネｆイカＶＬ９０３ｃ　ＰＲ−ＩＬ２−１９ ）株にも関するが、これは本発明によると大腸菌中への組換転子工学的作出方法 によって得られる。本発明の株はコレクション・オブΦカルチャーズ・オブ・マ イクロオルガニズムズ・オブージ番オールユニオン参リサーチ・インスティテユ ート争オブ・アンタイバイオティックスに１９８７年１月１２日付で寄託され、 第１８６９号として登録された。本発明の株によれば、大規模培養条件下でヒト インターロイキン−２の安定的蓄積を確保し、かつ細胞タンパク質全量の８〜１ ２％に相当する（８〜１０）Ｘ１０ツ きる。

発明を実施するための最良の形態 本発明による組換えプラスミドＤＮＡ　ＰＲ−ＩＬ２−１９の工学的作出方法は 数段階で行われる。

プラスミド　ＢＲ−３２２を基礎にして工学的に作出され、Ｃｏ１ＥＩ−レブリ フン、アンピシリン耐性遺伝子並びに発現が大腸菌トリプトファンオペロンのプ ロモーター及びＳＤ配列により確保されているヒトインターロイキン−２遺伝子 の，ＤＮＡコピーを有する大きさ５４００ｂｐのプラスミド　ＡＡ１２１３−２ ３を、５ｔｕｌ制限領域をＢｇｌＩ［制限領域で置換えることにより修正してプ ラスミド　ＡＡ１２１２−２３Ｂを生成し、これを制限酵素Ｃｆ　ｒ１３で処理 し、得られたＤＮＡ分子の１本鎖末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ 断片で補完する。しかる後低融点アガロースゲルでのプレバラティブ電気泳動に よつてインターロイキン−２遺伝子を含むプラスミド　ＡＡ１２１３−２３Ｂの Ｃｆｒ１３断片を単離する。

次いで、ベクタープラスミド　ＰＨ１２４Ｂを工学的に作出する。そのためには 、プラスミド　ＰＨ１０のＤＮＡ中制限酵素ＢｇｌＩＩの認識領域において削除 をエキソヌクレアーゼＢａ１３１により行ない、ＢａｍＨＩ認識領域がファージ λのリポソーム結合領域直後に位置するプラスミド　ＰＲｌｏｏを得、その結果 開始ＡＵＧコドン領域において下記配列： ＡＵＧＧＡＴＣＣ ａｍＨＩ を形成させる。

次いで、慣用的遺伝子工学操作により、プラスミドｐＰＲ１００の最小ＰｓｔＩ −ＢａｍＨＩ断片をプラスせしめてプラスミド　ＰＨ１２４を生成し、その中に オリボヌクレオチドリンカ−によってＸｂａＩＯ代わりに制限酵素ＢｇｌＩＩ認 識領域を導入して、プラスミドｐＰＲ１２４Ｂを得る。

次いで、インターロイキン−２遺伝子をもつプラスミド　ＡＡ１２１３−２３８ のＣｆ　ｒ１３断片を、制限酵素ＢａｍＨＩで開裂されかつＳＩエンドヌクレア ーゼでスペースが設けられた１本鎖ＤＮＡ末端をもつベクター分子　ＰＨ１２４ Ｂ中にファージＴ４ＤＮＡリガーゼによって組込み、ＤＮＡ直鎖分子の環化をＤ ＮＡリガーゼＴ４により行う。かくして得られた混合体を大腸菌Ｃ６００細胞を 形質転換するために用い、形質転換株をアンピシリン含有培地に接種し、２８℃ の温度で培養し、しかる後４２℃の温度で増殖速度が低下するものについて選択 を行う。こうして選択されたクローンからｐＰＲ−ＩＬ２−１９と命名されたプ ラスミドＤＮＡを回収するが、ここにおいて断片配置の正確性はＤＮＡ開始領域 の結合部分における以前には不存在の制限酵素ＢｓｐＲＩ認識配列の復元によっ て確認される。

本発明の大腸菌ＶＮＩＩジエネテイカＶＬ９０３（ＰＲ−ＩＬ２−１９）株は、 組換えプラスミドＤＮＡ　ＰＲ−ＩＬ２−１９による大腸菌受容株の形質転換に よって産生される。受容株としては、大腸菌Ｃ６００、大腸菌ＶＮｎジエネテイ カｖＬ−９０３〔オールユニオン・コレクシシン・オブ拳インダストリアル・マ イクロオルガニズムズ・オブ・ジ・オールユニオン・リサーチφインステイテユ ート・オブ・ジエネテイツクス・アンド・セレクション伊オブ・インダストリア ル・マイクロオルガニズムズ（Ａｌｌ−Ｕｎｉｏｎ　Ｃｏ１１ｅｅｔ１ｏｎ　ｏ ｆＩｎｄｕｓｔｒｉａｌ　ＭｉｃｒｏｏｒｇａｎＩｓｓ＋ｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ａ １１−Ｕｎｉｏｎ　Ｒｅ５ｅａｒ−ｃｈ　Ｉｎ５ｔ１ｔｕｔｅ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ ｔｉｃｓ　ａｎｄ　５ｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｏｒ　Ｉｎｄｕｓｔｒ−Ｉａｌ　Ｍ１ ｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｓ＋ｓ）に寄託され１第ＢＫＩ［ＭＢ３５４６号として登 録されている〕及び他の大Ｂ菌に１２誘導体株が使用可能である。形質転換後、 組換えクローンは温度２８℃のアンピシリン含有培地上で選択される。

本発明による株、ＰＲプロモーター抑制条件下でのヒトインターロイキン−２の 合成、アンピシリン耐性及び温度４２℃での細胞培養時における低い増殖速度に よって特徴付けられる。

本発明による株は、大規模培養条件下においてヒトインターロイキン−２の安定 的蓄積を確実化することができ、しかも大腸菌ＶＮＩ［ジエネティカＶＬ９０３ （ＰＲ−ＩＬ２−１９）細胞中において細胞タンパク質全量の８〜１２％に相当 する（８〜１０）×１０７ｕ　ｎ　／　１まで合成能を高めている。

大腸菌ＶＮＩＩジェネティカｖＬ９０３（ｐＰＲ−■Ｌ２−１９）株は下記の特 徴を有している。

形態特性：まっすぐな桿状、遅い動作性、糸状体形成が可能、グラム陰性、非胞 子形成、各細胞の大きさ３〜５μｍの細胞。

培養特性：細胞は濃厚な液体の通常の合成、半合成及び複合培地上でよく増殖す る。寒天ホツチンガー（Ｈｏｔ−ｔｉｎｇｅｒ）ブロス又はＬブロス上で増殖さ せた場合、それらは平坦円形で若干粗粒性の粘液被覆コロニーを形成する。カサ ミン酸含有Ｍ９又はＬブロスのような液体培地中で増殖させた場合には、それら は均一な懸濁液を形成する。

生理学−生化学上の特性：細胞は５〜４０℃（最適−３７℃）範囲内の温度、６ ．７〜７．５のｐＨで増殖することができる。炭素源としては、炭水化物（例え ば、サッカロース）及びアミノ酸が使用される。それらはメチオニンに関して栄 養要求性を示す。窒素源としては、アンモニウム型の無機塩並びにペプトン、ト リプトン、酵母エキス及びアミノ酸の形の有機化合物が使用可能である。

抗生物質耐性：本株は、液体培地及び寒天栄養培地で増殖させた場合に１００ｍ ｇ／１以内の濃度でアンピシリンに耐性である。

プラスミドの安定性：寒天培地上で細胞貯蔵中、継続的再播種中及び抗生物質含 有液体培地で深栄養中に、プラスミドの消失又は再形成は生じない。

本発明は、本発明によるプラスミドの工学的作出方法、株の産生方法、その培養 方法の具体的態様によって更に説明されるが、それは添付図面によっても説明さ れる：図面中、 第１図−組換えプラスミド　ＰＲ−ＩＬ２−１９の物理的遺伝子地図； 第２図一本発明による組換えプラスミド　ＰＲ−ＩＬ２−１９の作成経路を示し た図。

例　１ 本発明による組換えプラスミドの工学的作出は、３段階で行われる。最初にベク タープラスミド　ＢＲ１２４Ｂが工学的に作出される。

プラスミド　ＰＨ１０のＤＮＡ３μｇをトリスＨＣＩ（ｐＨ８，０）１０ｍＭ、 ＭｇＣ１２６ｍＭ、２−メルカプトエタノール６ｍＭ％ＮａＣ１１５０ｍＭ含有 の制限−１緩衝液６０μｌ中制限酵素ＢｇｌＩＩにより開裂させる。ＤＮＡを２ 倍容量のエタノールで再沈降させる。沈降物をＨ２Ｏ２０μｌに溶解する。エキ ソヌク−レアーゼＢａ１３１でのＤＮＡ処理をＮａＣ１３Ｍ。

ＣａＧ１２６０ｍＭ、ＭｇＣｌ２６０ｍＭ、ｐＨ８，０トリスＨＣＩ　１００ｍ Ｍ、エチレンジアミン四酢酸０．５ｍＭ含有緩衝液３０μｌ中温度３０℃で３分 間行う。ＤＮＡを２倍容量のエタノールで再沈降させる。

沈降物をＨ２Ｏ１０μｌに溶解する。制限酵素ＢａｍＨＩでの処理を上記制限− １緩衝液含有３０μｌ容量サンプル中で行う。ＤＮＡの１本鎖３′末端領域の補 完をトリスＨＣ１（ｐＨ８，０）１０ｍＭ、ＭｇＣ１２１０ｍＭ、ＤＮＡ調製物 ２．ｕｇ含有サンプル２０ｕ　ｌ中容デオキシリボヌクレオシド三リン酸３０μ ｌ、ＤＮＡ酵素５単位で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌのフレノウ断片を用いて行 い、反応混合物からエタノールで沈降させ、Ｈ２Ｏ１００μｌに溶解する。直鎖 プラスミドＤＮＡの結合を結合用緩衝液（トリスＨＣＩ　（ｐＨ７，６）６０ｍ Ｍ、ＭｇＣ１１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール１０　ｍ　Ｍ　ｓアデノシン 三リン酸０．４ｍＭ）及びＤＮＡ１μｇ含有サンプル中ファージＴ４ＤＮＡリガ ーゼにより温度１６℃で１２時間行う。得られた混合体を大腸菌Ｃ６００細胞の 形質転換用に使う。形質転換能力／ｍｌ）耐性コロニーを選択する。それらから プラスミドＤＮＡをバーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｌｍ）及びドリー（Ｄｏｌｉ） により示された修正法で単離し、しかる後それを制限分析用に使う。その結果、 特有の開裂ＢａｍＨＩ領域を組込んだプラスミド　ＰＲｌｏｏが得られる。次い でプラスミド　ＰＲ１２４を作成する。そのために、プラスミド　ＭＬ２４ＤＮ Ａ２μｇを制限−１緩衝液４０μｍ中制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔＩで一緒に 開裂させる。

温度０℃でファージＴ４のＤＮＡリガーゼにより制限酵素ＢａｍＨＩ及びＰｓｔ Ｉでのプラスミド　ＰＲ１００ＤＮＡ加水分解から得られた断片と結合させる。

得られたＤＮＡ調製物を大腸菌Ｃ６００細胞の形質転換用に使い、アンピシリン 含有培地で形質転換株を選択し、しかる後温度４２℃で細胞培養時にクロラムフ ェニコール３００μｇ／ｍｌ含有培地でＣｍ’クローンを選択する。

こうして選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを単離し、制限分析により試 験する。その結果、制限酵素ＢａｍＨＩ開裂領域を組込んだプラスミド　ＰＲ１ ２４が得られる。

次いで、プラスミド　ＰＲ１２４ＤＮＡ３μｇをトリスＨＣＩ　（ｐＨ７，９） １０ｍＭ、ＭｇＣ１２６ｍＭ。

２−メルカプトエタノール６ｍＭ５ＮａＣ１１５０ｍＭ含有制限−１緩衝液７０ μｌ中制限酵素Ｘｂａｌにより開裂し、ＤＮＡを２倍容量のエタノールで再沈降 させる。沈降物をＨ２Ｏ１５μｌに溶解する。ＤＮＡの１本鎖３′末端領域の補 完をトリスＨＣＩ　（ｐＨ８，０）１０ｍＭ、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、ＤＮＡ調製 物２ｕｇ含有サンプル２０μｌ中各デオキシリボヌクレオシド三リン酸３０μ１ １酵素５単位で大腸菌ＤＮＡポリメラーゼｌのフレノウ断片との処理により行う 。反応混合物からＤＮＡをエタノールで再沈降させ、Ｈ２Ｏ１００μｌに溶解す る。直鎖プラスミドＤＮＡと８ｇｌリンカ−との結合は、結合用緩衝液（ｐＨ７ ，６トリスＨＣｌ６０ｍＭ、ＭｇＣ１２１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール１ ０ｍＭ、アデノシン三リン酸０．４ｍＭ）　、プラスミドＤＮＡ２μｇ及びリン カ−０，５μｇ含有サンプル中１６℃で１２時間ファージＴ４のＤＮＡリガーゼ により行う。結合後、反応混合物からＤＮＡをエタノールで沈降させ、制限−２ 緩衝液（ｐＨ７，６）リスＨＣＩ　６ｍＭ、２−メルカプトエタノール６ｍＭ。

ＮａＣ１５０μｌ）含有サンプル４０μｌ中に溶解し、制限酵素ＢｇｌＩＩでの 酵素加水分解゛に供する。ＤＮＡを再度エタノールで沈降させ、溶解し、環化さ せるが、そのためには結合用緩衝液２４０μｌ中プラスミドＤＮＡ調製物１μｇ をファージＴ４ＤＮＡリガーゼで処理する。

得られた混合体を用いて、大腸菌Ｃ６００細胞を形質転換させる。

（１００μｇ／ｍｌ）耐性コロニーを選択し、それらからプラスミドＤＮＡ査回 収し、制限分析用に使う。その結果、出発ベクター分子　ＰＲ１２４と比べ最初 のＸｂａｌＩ認識配列の代わりに独特なりｇｌＩＩ開裂領域を有するプラスミド 　ＰＲ１２４Ｂが得られる（第２図）。

次いで、プラスミド　ＰＲ１２４ＢのＤＮＡ３μｇを制限−１緩衝液含有サンプ ル１２ｍ中で制限酵素ＢａｍＥｌにより開裂する。反応をＤＮＡのフェノール性 腺タンパク質及びエタノールでの核酸前沈降により停止させる。沈降物をＨ２Ｏ ２０μｍに溶解する。制限酵素によるＤＮＡ開裂で形成される１本鎖末端の除去 をＳｌエンドヌクレアーゼにより行う。そのためには、ＤＮＡをｐＨ４，４ＣＨ ＣＯＯＮｇＣｏｏＮ、ＺｎＳＯ４４，５ｍＭ、ＮａＣ１２５０ｍＭ含有サンプル ５０μｍ中温度２０℃で２０分間Ｓｌエンドヌクレアーゼ３０単位で加水分解す る。反応をフェノール処理により停止させ、ＤＮＡをエタノールで再沈降させる 。沈降物をＨ２Ｏ１５μｌに溶解する。

しかる後、プラスミド　ＡＡ１２１３−２３Ｂを作成する。そのためには、プラ スミド　ＢＲ−３２２から工学的に作出されかつＣｏ１ＥＩ−レプリコン、アン ピシリン耐性遺伝子並びに発現が大腸菌トリプトファンオペロンのプロモーター 及びＳＤ配列により確保されているヒトインターロイキン−２遺伝子のＤＮＡコ ピーを有する大きさ５４００ｂｐのプラスミド　ＡＡ１２１３−２ＢＤＮＡ３μ ｇを、制限−１緩衝液（ｐＨ７，９トリスＨＣ１１０ｍＭＳＭｇＣ１２６ｍＭ、 ２−メルカプトエタノール６ｍＭ、ＮａＣ１１５０ｍＭ）含有サンプル３０μｌ 中制限酵素５ｔｕｌｌＯ単位で開裂し、しかる後ＤＮＡをエタノール添加により 反応混合物から沈降させる。沈降物をＨ２Ｏ２０μｌ中遠心分離により分離する 。直鎖化プラスミドＤＮＡと８ｇｌｎリンカ−との結合を結合用緩衝液（ｐ）１ ７．６）リスＭＣｌ６０ｍＭ、ＭｇＣｌ２１０ｍＭ、２−メルカプトエタノール １０　ｍ　Ｍ　ｓアデノシン三リン酸０．４ｍＭ）、プラスミドＤＮＡ２μｇ及 びリンカ−０，５μｇ含有サンプル３０μｌ中Ｔ４ＤＮＡリガーゼ２０単位によ り行う。

結合後、反応混合物からＤＡＮをエタノールで沈降させ、制限−２緩衝液（ｐＨ ７，７）リスＭＣＩ　６ｍＭ。

Ｍ　ｇ　Ｃ１２６ｍ　Ｍ１２−メルカプトエタノール６ｍＭ５ＮａＣ１５０ｍＭ ）含有サンプル４０μｍに溶解して制限酵素Ｂｇ１ｍによる酵素加水分解に供す る。ＤＮＡを再度エタノールで沈降させ、溶解し、ＤＮＡ分子の環化を行うが、 そのためには結合用緩衝液２４０μｌ中プラスミドＤＮＡ調製物１μｇを７４Ｄ ＮＡリガ一ゼ２単位で処理する。得られた混合体を用いて、大腸菌Ｃ６００細胞 を形質転換させる。形質転換能力は、初期プラスミドｐＡＡ１２１３−２３　１ μｇにっき５Ｘ１０６コロニ一以内である。アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ） 耐性クローンを選択し、プラスミドＤＮＡをバーンボイム及びドリーの修正法に 従いそれらから回収し、制限分析用に使う。こうして得られたプラスミド　ＡＡ １２１３−２３Ｂは、　ＡＡ１２１３−２３の出発組換え分子と比較した場合、 以前の５ｔｕｌ認識配列の代わりに独特なりｇ１ｍ開裂領域を有している（第２ 図）。

プラスミドｐＡＡ１２１３−２３８　ＤＮＡ３０ｕｇを制限−１緩衝液含有サン プル１００μｌ中で制限酵素Ｃｆ　ｒ１３　（２００単位活性）により開裂する 。酵素加水分解産物を電界強度５　Ｖ　／　ｃ　ｍでトリス酢酸緩衝液系中低融 点アガロース１．１％ゲルの電気泳動に付す。鎖長７５０ｂｐのインターロイキ ン−２遺伝子含有ＤＮＡ断片を含むゲルゾーンを切出し、ＤＮＡ溶出を行う。大 腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウ断片によりＤＮＡの１本鎖末端を補完する ために、ゲルから単離された断片をｐＨ８，０）リスＨＣ１１０ｍＭｌＭ　ｇ　 Ｃ１２１０ｍＭ含有サンプル２０μｌ中各デオキシリボヌクレオシド三リン酸′ ３：０μｍで処理する。反応を加熱停止し、混合物からＤＮＡをエタノールで沈 降させ、Ｈ２Ｏ２０μｌに溶解する。

次いで、先に得た直鎖化プラスミド　ＢＲ１２４Ｂ調製物を　ＡＡ１２１３−２ ３Ｂ断片と結合させる。そのために、プラスミドＤＮＡＩμｇ及び断片２μｇを 結合用緩衝液中ファージＴ４ＤＮＡリガーゼで処理するが、反応混合物容量は３ ０μｍである。ＤＮＡの沈降と沈降物のＨ２Ｏ２０μｍ中への溶解との後に、沈 降物を前記のように制限酵素Ｂａ１ＩＩで処理し、ＤＮＡを再度エタノールで沈 降させ、溶解し、ＤＮＡ直鎖分子の結合を容ｆｆ１３００μ１以内の反応混合物 中ファージＴ４ＤＮＡリガーゼによる酵゛素調製物処理で行い、環状型とする。

得られた調製物を大腸菌Ｃ６００細胞の形質転換用に使い、しかる後温度２８℃ で１日間細胞を培養しながらアンピシリン含有培地中で形質転換株を選択する。

得られた形質転換株の中から、温度４２℃で増殖能の低下を示すものを選択する 。これらのクローンからプラスミドＤＮＡを前記のように単離し、制限分析に供 する。得られたプラスミド　ＰＲ−ＩＬ２−１９．（第２図）中、ファージλｃ ｒｏ遺伝子の第一コトン及びヒトインターロイキン−２のＡＩＪＬコドンについ てコードするＤＮＡの結合領域部分において、制限エンドヌクレアーゼＢｓｐＲ １の開裂領域が形成される。

例　２ ヒトインターロイキン−２の産生株である大腸菌ＶＮ■ジエネｆイｆｙＶＬ９０ ３（ＰＲ−ＩＬ２−１９）株の産生を下記方法で行う。ヒトインターロイキン− ２の合成についてコードするプラスミド　ＰＲ−ＩＬ２−１９を大腸菌ＶＮＩｒ ジェネティカＶＬ９０３受容株細胞中に形質転換により導入するが、この受容法 はオールユニオン・コレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオルガニ ズムズ・オブ・ジ・オールユニオン・リサーチ・インスティテユート・オブ・ジ エネティックス・アンド・セレクション・オブ・インダストリアル・マイクロオ ルガニズムズに寄託され、第ＢＫｎＭ　Ｂ−３５４６号として登録されている。

大腸菌ＶＮｎジエネテイカＶＬ９０３細胞の形質転換能力は１．初期プラスミド 　ＰＲ−ＩＬ２−１９　１μｇにつき約１０６クローンである。形質転換株を温 度２８℃で１日間の細胞培養後アンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）含有培地上で 選択する。選択されたクローンからプラスミドＤＮＡを回収し、その　ＰＲ−Ｉ Ｌ２−１９調製物との同一性を制限分析により確認する。ヒトインターロイキン −２の産生株である大腸菌ＶＬ９０３（ＰＲ−ＩＬ２−１９）株を得る。

例　３ 大ＩＭｌｌｉｌＶＬ９０Ｂ（ＰＲ−ＩＬ２−１９）株をアンピシリン５０μｇ／ ｍｌ含有傾斜寒天ホッチンガー培地上温度２８℃で１４時間増殖させる。傾斜培 地上で増殖されたバイオマスを播種物質産生用に使う。そのため、細胞をアンピ シリン１００μｇ／ｍｌ含有ホッチンガー培ｉｔｔ１１００ｍｌと共、に７５０ ｍ１エルレンマイヤーフラスコ内に移し、シェーカー上温度２８℃２４Ｏｒｐｍ で６時間増殖させる。播種培地の光学濃度は１．５〜２．５単位である。

発酵をｐＨ，温度、撹拌速度及び曝気のコントロール系装備発酵器中で行う。発 酵のために、アンピシリン１００μｇ／ｍｌ及びグルコース１０ｇ／ｌ含有ホッ チンガー培地を用いる。播種培養物を全部で５〜１０％の量で導入する。アンモ ニア水の供給によりこのレベルを維持しながら、ｐＨ６，６〜６．８で培養を行 う。最初の発酵を温度２８℃で５５０ｎｍの光学濃度３．５まで導き、しかる後 温度を４２〜４５℃まで５分間かけて上昇させることにより熱誘導を行い、次い で発酵を更に２時間続ける。

そのプロセスの終了後、ヒトインターロイキン−２の活性を調べるために、培養 液１ｍｌから細胞を遠心分離により沈降させ、沈降物を温度２０℃で４０分間塩 化グアニジン８Ｍ溶液１ｍｌに再懸濁しておく。しかる後、残渣を遠心除去し、 上澄液中に含まれるインターロイキン−２両分の活性を調べる。こうして得られ たインターロイキン−２の生物学的活性は（８〜１０）×１０７ＭＵ／１である 。

全細胞タンパク質中に占める合成ヒトインターロイキン−２の割合を調べるため に、培養液１ｍｌから細胞を遠心分離により沈降させ、前記方法に従い処理する 。調製物を０．１％ドデシル硫酸ナトリウムの存在下１５％アクリルアミドゲル での電気泳動により分析する。ゲル中で分離したタンパク質を常法に従いクマシ ーＲ−２５０′サーバ’　（ＫｕｍａｓｓＩ　Ｒ−２５０“５ｅｒｖａ　”　） 溶液（西独）で染色する。ゾーン内のタンパク質量を濃度計で染色ゲルの走査後 に調べる。細胞内で合成された成熟ヒトインターロイキン−２に相当するゾーン の確認は、マーカータンパク質の電気泳動活性との比較に基づき及びニトロセル ロースフィルター上への分離されたタンパク質のプロットにより行い、しかる後 インターロイキン−２に対するマウスモノクローナル抗体及び西洋ワサビペルオ キシダーゼで複合化された抗マウスウサギ抗体含有溶液中での処理によりインタ ーロイキンゾーンを展開させる。適切な染色操作後、インターロイキンゾーンを ニトロセルロースフィルターの非染色バックグラウンドに対する褐色バンドとし て展開させる。細胞中で合成されるインターロイキン−２遺伝子タンパク質産物 の占有率は、全細胞タンパク質量の１２％以内である。

産業上の利用可能性 ヒトインターロイキン−２の合成についてコードする本発明の組換えプラスミド ＤＮＡ　ＰＲ−ＩＬ２−１９は、高活性のヒトインターロイキン−２産生株の作 成に際して有用である。ヒトインターロイキン−２産生株大腸菌ＶＮＩＩジェネ ｆ４力ＶＬ９０３　（ＰＲ−ＩＬ２−１９）は、医薬に適用可能なヒトインター ロイキン−２る。

浄書（内容に変更なし） 手続補正書坊式）

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. １．ヒトインターロイキン−２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮ ＡｐＰＲ−ＩＬ２−１９であって、 ３８５０ｂｐの大きさを有し、かつ下記ユニット：−ｐＰＲ４０及びｐＭＬ２４ を基礎にして作られるベクタープラミスドｐＰＲ１２４Ｂの大きさ３４００ｂｐ のＢａｍＨＩ−ＢｇｌＩＩ断片； −プラスミドｐＢＲ−３２２を基礎にして工学的に作出され、ＣｏｌＥＩ−レプ リコン、アンピシリン耐性遺伝子並びに発現が大腸菌トリプトファンオペロンの プロモーター及びＳＤ配列により確保されているヒトインターロイキン−２遺伝 子のｋＤＮＡコピーを有する大きさ５４００ｂｐのプラスミドｐＡＡ１２１３− ２３において、ＳｔｕＩの制限領域をＢｇｌＩＩ制限領域で置換えることにより 作られるプラスミドｐＡＡ１２１３−２３Ｂの大きさ４５０ｂｐのＣｆｒ１３− ＢｇｌＩＩ断片；からなり、しかも下記特性： −ＣｏｌＥＩ−レプリコンの複製開始領域、ファージλの温度感受性リブレッサ ーｃＩｔｓ８５７の遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子、ファージｆｄのρ非依存 性転写ターミネーターのタンデム、成熟ヒトインターロイキン−２の配列につい てコードするファージλのｃｒｏ遺伝子の調節領域ＰＲＯＲ、ＳＤ配列及びＡＴ Ｇ開始コドンを有する； −ｃｒｏ遺伝子の調節領域ＰＲＯＲ及びＡＴＧコドンとインターロイキン−２の 遺伝子配列及びｆｄ転写ターミネーターとの結合は、次のヌクレオチド配列：５ ′−…ＴＡＡＧＧＡＧＧＴＴＧＴＡＴＧＧＣＣ…−３′（ＴＡＡＧＧＡＧＧＴ及 びＡＴＧ−各々、ｃｒｏ遺伝子のＳＤ配列及び開始コドン；ＧＣＣ−インターロ イキン−２の最初のＡｌａコドン）を有するリボソーム結合ハイブリッド領域が 形成され、その一方でインターロイキン−２遺伝子の終結コドンの後にｆｄρ非 依存性転写ターミネ−ターのタンデムが位置するように行われる；−制限酵素Ｃ ｌａＩ（その位置がカウント（０）の開始箇所である）、ＸｂａＩ（約９９０） 、ＢｇｌＩＩ（約１２５０）、ＰｓｔＩ（約３０７０）の独特な認識領域を有す る； −コレクション・オブ・カルチャーズ・オブ・マイクロオルガニズムズ・オブ・ ジ・オールユニオン・リサーチ・インスティテュート・オブ・アンタイバイオテ ィックスに１９８７年１月１２日付で寄託され、第１８６９号として登録されて いる； を有することを特徴とする組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ−ＩＬ２−１９。
2. ２．組換えプラスミドＤＡＮｐＰＲ−ＩＬ２−１９の工学的作出方法であって、 プラスミドｐＢＲ−３２２を基礎にして工学的に作出されかつＣｏｌＥＩ−レプ リコン、アンピシリン耐性遺伝子並びに発現が大腸菌トリブトファンオペロンの プロモーター及びＳＤ配列により確保されているヒトインターロイキン−２遺伝 子のｋＤＮＡコピーを有する大きさ５４００ｂｐのプラスミドｐＡＡ１２１３− ２３をＳｔｕＩの制限領域をＢａｌＩＩ制限領域で置換えることにより修正し； 得られたプラスミドｐＡＡ１２１３−２３Ｂを制限酵素Ｃｆｒ１３で処理し、得 られたＤＮＡ分子の１本鎖末端を大腸菌ＤＮＡポリメラーゼ１のクレノウ断片で 補完し、しかる後得られたヒトインターロイキン−２遺伝子を含むプラスミドｐ ＡＡ１２１３−２３ＢのＣｆｒ１３断片をアガロースゲル中でのプレパラティブ 電気泳動により単離し、ファージＴ４のＤＮＡリガーゼにより、プラスミドｐＰ Ｒ４０及びｐＭＬ２４を基礎にして工学的に作出されたベクター分子ｐＰＲ１２ ４Ｂ（ＢａｍＨＩで予め開裂され、制限領域におけるＤＮＡの１本鎖末端がＳＩ エンドヌクレアーゼにより削除されている）中に組込み、しかる後得られた混合 体を制限酵素ＢｇｌＩＩで処理し、ＤＮＡ分子をＴ４ＤＮＡリガーゼにより環状 型に結合せしめ；こうして得られた混合体を大腸菌Ｃ６００細胞を形質転換する ために用い；形質転換株をアンピシリン含有培地に接種し、２８℃の温度で培養 し、しかる後４２℃の温度で増殖速度が低下するものについて選択し、選択され たクローンからプラスミドｐＰＲ−ＩＬ２−１９を回収する；その場合に断片結 合の正確性は、ＤＮＡ開始領域の結合部分における以前には不存在の制限酵素Ｂ ｓｐＲ１認識配列の復元によって確認される；ことを特徴とする方法。
3. ３．大腸菌中への組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ−ＩＬ２−１９の導入による遺 伝子工学の方法によって作られ、かつコレクション・オブ・カルチャーズ・オブ ・マイクロオルガニズムズ・オブ・ジ・オールユニオン・リサーチ・インスティ テュート・オブ・アンタイバイオティックスに１９８７年１月１２日付で寄託さ れ第１８６９号として登録された請求項１に記載の組換えプラスミドＤＮＡｐＰ Ｒ−ＩＬ２−１９を含有したヒトインターロイキン−２産生株大腸菌ＶＮＩＩジ ェネティカＶＬ９０３（ｐＰＲ−ＩＬ２−１９）。