WO1988005818A1 - RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT - Google Patents

RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT Download PDF

Info

Publication number
WO1988005818A1
WO1988005818A1 PCT/SU1988/000032 SU8800032W WO8805818A1 WO 1988005818 A1 WO1988005818 A1 WO 1988005818A1 SU 8800032 W SU8800032 W SU 8800032W WO 8805818 A1 WO8805818 A1 WO 8805818A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
plasmid
gene
ppr
human interleukin
interleukin
Prior art date
Application number
PCT/SU1988/000032
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Vladimir Georgievich Debabov
Elmar Yanovich Gren
Jury Ivanovich Kozlov
Sergei Vladimirovich Mashko
Alexandr Yakovlevich Strongin
Viktor Emilievich Sterkin
Vitaly Lvovich Jurin
Sergei Viktorovich Kostrov
Alexandr Jurievich Tsimanis
Andris Yanovich Avot
Nadezhda Viktorovna Romanchikova
Alexandr Ivanovich Kosikov
Maxim Eduardovich Trukhan
Andrei Vladimirovich Mochulsky
Tatyana Veniaminovna Chernovskaya
Elena Alexeevna Nosovskaya
Marina Alexeevna Skvortsova
Svetlana Mendeleevna Mazel
Original Assignee
Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti
Institut Organicheskogo Sinteza Akademii Nauk Latv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti, Institut Organicheskogo Sinteza Akademii Nauk Latv filed Critical Vsesojuzny Nauchno-Issledovatelsky Institut Geneti
Priority to HU881691A priority Critical patent/HUT50873A/hu
Priority to NL8820102A priority patent/NL8820102A/nl
Priority to DE883890052T priority patent/DE3890052T1/de
Priority to JP88502088A priority patent/JPH01502639A/ja
Publication of WO1988005818A1 publication Critical patent/WO1988005818A1/ru
Priority to FI884557A priority patent/FI884557A/fi
Priority to GB8823729A priority patent/GB2210373A/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences

Definitions

  • Interleukin-2 is an immune modulator of the complex mechanism of action, in particular, it stimulates an immune response due to the activation of comparatively jointly-lymphocytes . , amplification of mitogenesis of stimuli, induction of cytotoxic activity of ⁇ -cells and others.
  • the alternative source of interleukin-2 can be used by genetic engineering methods of the microorganism strain, - 2 - carrying regulatory plasmids with the gene of interleukin-2 and ensuring effective expression of this gene.
  • the recombinant plasmid Ds which encompass the interleukin-2 human, are known as the recombinant plasmid 5, and the second one is known.
  • the means of cooperation are declared recombinant
  • 25 plasmid D is included in that, that plasmid ⁇ -23, with a size of 5.4 thousand tons ⁇ . associated with plasmid ⁇ -322 and containing SOS-replica, the gene for the sustainability of acicillin and the second gene of the patient is 2-patient
  • SOS modifies by replacing the part of the product for Part I on the site of the distribution in ⁇ II received shimazhu ⁇ 2 ⁇ Z-23 ⁇ is operating;
  • the invention is also a strain of the United States Generator 90 903 ( ⁇ - ⁇ 2- ⁇ 9) ⁇ additive producer of an inteleukin-2 people-35 eyelids, which contains a 112-year ⁇ old patient. According to the invention, a method has been obtained. - 6 - for genetic contagion through the introduction of a recumbent plaque ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2 2- ⁇ 9 ⁇ bacterium ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ till ⁇ ⁇ .
  • the mixture obtained means that the cells are cleaned and that they are inoculated with a medium with an amperage of 15 killin and are secured at a temperature of 28 ° C.
  • ⁇ b ⁇ anny ⁇ ⁇ a ⁇ im ⁇ b ⁇ az ⁇ m ⁇ l ⁇ ya ⁇ v vydelyayu ⁇ ⁇ lazmidnuyu D ⁇ ⁇ b ⁇ znachennuyu ⁇ a ⁇ ⁇ - ⁇ 2- ⁇ 9, in ⁇ y ⁇ chn ⁇ s ⁇ v ⁇ ss ⁇ edineniya ⁇ ashen ⁇ v ⁇ ve ⁇ yayu ⁇ v ⁇ ss ⁇ an ⁇ vle- 20 Niemi on s ⁇ y ⁇ e is ⁇ dny ⁇ uchas ⁇ v D ⁇ ⁇ anee ⁇ su ⁇ s ⁇ vuyuschey ⁇ sled ⁇ va ⁇ eln ⁇ s ⁇ i recognition ⁇ es ⁇ i ⁇ azy ⁇ z ⁇ .
  • the claimed sh ⁇ amm ⁇ .s ⁇ ⁇ IIgene ⁇ i ⁇ a ⁇ 903 ( ⁇ - ⁇ 2- ⁇ luchayu ⁇ ⁇ ans ⁇ matsiey ⁇ etsi ⁇ ien ⁇ n ⁇ g ⁇ sh ⁇ amma ba ⁇ e ⁇ y ⁇ zs ⁇ eg ⁇ s ⁇ a s ⁇ ⁇ e ⁇ mbinan ⁇ n ⁇ y ⁇ lazmidn ⁇ y D ⁇ 25 ⁇ - ⁇ 2- ⁇ 9 ..
  • the Storm of E. genetics ⁇ 903 ( ⁇ - ⁇ 2- ⁇ 9) is characterized by the following symptoms.
  • the battery is damaged by a simple and liquid synthetic, semi-synthetic, and complex environment.
  • the boulevard When growing on an aggre- gated boulevard in Hortingburg, the boulevard will develop smooth, round, weak 20 worn out mild formations.
  • When cultivated in a liquid it is a type of bouillon or ⁇ 9 with an open-ended mixture, and a similar suspension is obtained.
  • the batteries are suitable for a range of temperatures from 5 to 40 ° C (optimum 37 ° C) 25 to 6.7-7.5.
  • carbohydrates for example, sugar
  • amino acids are used as a source of carbon.
  • nitrogen can serve as mineral salts in the ammonium form, as well as organic compounds in the form of a substance, a substance, a burned 30 amine.
  • the strain is susceptible to amperage at a concentration of up to 100 mg / l and cultivated in liquids and on aggre-ated nutritional products.
  • 3 mcg of plasmid ⁇ 40 promotes the release of 1 ⁇ 1 ⁇ in 60 ⁇ l of buffer for restorative- ⁇ containing
  • DBD is disposed of for volume of this alcohol.
  • the plant is 10 msec ⁇ 2 0.
  • the processing plant is 30 msec in size, and contains 30 msec.
  • Plasma plasmid ⁇ institutions24 expands the products and the other type of Bacillus in 70 ⁇ l of buffer for Test- ⁇ , containing 10 ⁇ pis- ⁇ , ⁇ 7.9, 6 m ⁇ 2 , 6
  • the efficiency of the transmutation makes up 5 * 10 per I ig of the native plasmid ⁇ 24 • Stops obliques that are stable to ampicillin (100 g / ml), from below
  • plasmid ⁇ 2 ⁇ -23 ⁇ is produced.
  • the plasmid ⁇ 2 ⁇ -3 with a size of 5.4 thousand n.p., is based on the basic plasmid ⁇ -322 and
  • the linearized plasmid ⁇ 24 ⁇ is combined with the plasmid fragment ⁇ 2 ⁇ -23 ⁇ .
  • I mcg plasmid J and 2 mcg fragment process the J-ligase phage ⁇ 4 in the bushe for 15 ligations and the volume of the reaction mixture is 30 ⁇ l.
  • the plasmid J is isolated, as described above, and advances the direct analysis.
  • the cultural density of the seed crop is 1.5–2.5 units.
  • the product is equipped with a control system equipped with a temperature regulating system
  • 35 for optical density equal to 3.5 at 550 nm, at a temperature of 28 ° C, and then carry out the thermal induction, increasing - 15 - a temperature of 42-45 ° C for 5 minutes, after which they continue for another 2 hours.
  • a synthetic human protein was received from the integrated cell protein from the I ml of the commercial liquid, and the catering is supplied.
  • the product analyzes the elec- trophoresis in a 15% polylamide gel in the presence of a 0.1% sodium sulfide solution. Proteins separated in le are parsed in the factory of the Humassi 250-250 Zegrá / ⁇ standard method. The white content of whites in the area is divided after scanning on the densitel gel.
  • the zone of interleukin appears in the form of a brown cover for an unfulfilled window of a non-filtering cell.
  • the synthesized protein products of the gene for interleukin-2 it makes up to $ 12 of the total amount of the battery in the cell. Intended use
  • the inventive recombinant plasmid J ⁇ - ⁇ 2- ⁇ - 16 - cadreuyu synthesis of interleukin-2 people find an application for receiving strains-beneficiaries of interleukin-2 people with high activity.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

ΡЖΟШШΑΗΤΗΑЯ ПЛΑЗΜИДΗΑЯ ДΗΚ ρΡΕ-ΙЬ2-19 ,
ΚΟДИΡУЮЩΑЯ СИΗΤΕЗ ИΗΤΕΡЛΕЙΚИΗΑ-2 ЧΕΙΟΒΕΚΑ,
СПΟСΟБ ΕΕ ΚΟΗСΤΡУИΡΟΒΑΙШ И ШΤΑШ БΑΚΤΕΡИЙ
Ε5СΗΕΗΙСШΑ СΟЫ ΒΗИИГΕΗΕΤЖΑ νь 903 (ρΡΕ-ΙΙ2-19)-ПΡ0ДУЦΕΗΤ ИΗΤΕΡЛΕЙΚИΗΑ-2
ЧΕЛΟΒΕΚΑ, СΟДΕΡЖΑЩИЙ ΕΕ
Οόласτь τеχниκи Ηасτοящее изοбρеτение οτяοсиτся κ οбласτи геняοй инженеρии и биοτеχнοлοгии, а τοчнее κ нοвοй ρеκοмбинанτ- яοй πлазмиднοй ДΗΚ ρΡΕ-11.2-19 » κοдиρующей синτез ин- τеρлейκина-2 челοвеκа, сποсοбу ее κοнсτρуиροвания и κ шτа му баκτеρий ΕβсЬβг±сЫа сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νь 903 (ρΡΕ-ϊЬ2«ϊ9 ) -προдуценτу инτеρлейκина-2 челοвеκ сοдеρжащему ее. Пρедшесτвующий уροвень τеχниκи
Пρиροдный инτеρлейκин-2 челοвеκа или φаκτορ ροсτа Τ-κлеτοκ являеτся глиκοπροτеинοм с мοлеκуляρнοй массοй ποлиπеπτиднοй цеπи οκοлο 15.000 дальτοн и προдуциρуеτся Τ-κлеτκами πρи иχ аκτивации леπτинοм или сοοτвеτсτвующим анτигенοм. Инτеρлейκин-2 являеτся иммунοмοдуляτοροм κοмπлеκснοгο меχанизма дейсτвия, в часτнοсτи, οн сτимули- ρуеτ иммунный οτвеτ за счеτ аκτивации Τ-лимφοциτοв., усиления миτοгенеза τимοциτοв, индуκции циτοτοκсичесκοй аκτивнοсτи Τ-κлеτοκ и дρугие. Сοοτвеτсτвеннο инτеρлейκин- имееτ όοльшοе ποτенциальнοе значение для τеρаπии имму- нοлοгичесκиχ наρушений, τаκиχ, κаκ злοκачесτвеняые πеρе- ροждения, баκτеρиальяые или виρусные инφеκции, забοлева- ния, связанные с иммунным деφициτοм, ауτοиммунные заόο- левания и дρугие. Пρиροдный ияτеρлейκин-2, выделяемый не- ποсρедсτвеннο из челοвечесκοй сывοροτκи или из κульτу- ρальнοй сρеды κлеτοκ линии Юρκаτ, дοсτуπен в κρайне οгρа- ниченныχ κοличесτваχ, недοсτаτοчныχ для изучения егο свοйсτв и κлиничесκοгο ποτенциала. Αльτеρнаτивным исτοч- ниκοм инτеρлейκина-2 мοгуτ служиτь сκοнсτρуиροванные ме- τοдами генеτичесκοй инженеρии шτаммы миκροορганизмοв, - 2 - несущие ρеκοмόинанτные πлазмиды с генοм инτеρлейκина-2 и οбесπечивающие эφφеκτивную эκсπρессию эτοгο гена.
Извесτны ρеκοмбинанτные πлазмидные ДΗΚ, κοдиρующие инτеρлейκин-2 челοвеκа, яаπρимеρ.ρеκοмбинанτяая πлазмид- 5 ная ДΗΚ ρΡЬсΜиΗϋ 201 и шτамм Ε. сοϊϊ ΚΙ2 Α нϊ д 1;гρ (ρΡЬсΜиΗ1120Ι), СΟДеρжащИЙ ее (ЗЭеνοз Κ., Ρϊае-Ыηск α, СЬегοи-Ьге Η. , Зϊтοηэ С- Бе§гаνе 1У. , Τаνегηχег «Τ. Εешаи-Ь Ε., χегз 1У., 1983, Νисϊ. Αсϊά. Εез., 11, 4307-4323/.
Β сοсτаве уκазаянοй ρеκοмбжнанτнοй мοлеκулы ДΗΚ
10 τρаясκρиπция гена инτеρлейκжна-2 κοнτροлиρуеτся ρегуля- τορным элеменτοм ЪΟЬ баκτеρиοφага Я , а инициация τρанс- ляциж белκοвοгο προдуκτа гена οбесπечиваеτся за счеτ κοясτρужροвания гибρиднοгο учасτκа связывания ρибοсοм на οснοве 5ϋ -ποследοваτельнοсτи φага Μи . Μаκсимальный
15 выχοд инτеρлейκияа-2 челοвеκа, οбесπеченный κульτжвжροва- нием'шτамма-προдуцеяτа Ε.сοϋ ΚΙ2 Δ ΗΙ д гρ(ρΡЬсΜиШ.ι 201) сοсτавляеτ 5-10% οτ суммаρнοгο κοличесτва белκа κлеτοκ.
Уκазанные ρеκοмбинанτные πлазмидные ДΗΚ ж "шτамм, сοдеρжащий ее, имеюτ ρяд недοсτаτκοв,вызванныχ τем, чτο
20 ρегулиρуемая эκсπρессия гена ΙЬ2 , οбесπечиваемая с προмοτορа, τρебуеτ лжбο дοποлнжτельяοй ρезиденτнοй πлаз- миды с генοм τемπеρаτуροчувсτвиτельнοгο сϊ ρеπρессορа (сϊϊ;зΒ57) > либο жсποльзοванжя в κачесτве ρецжπженτа- шτамма, сοдеρжащегο деφеκτныж προφаг с муτанτным алле-
25 лем гена сϊ . Βсе эτο πρивοдиτ κ сужеяию κρуга шτаммοв ρецжπиенτοв и κ ποτенциальнοй несτабильнοсτи ρеκοмбинанτ- ныχ πлазмид в услοвияχ κульτивиροвания в κρуπнοмасшτаб- нοм προизвοдсτве из-за геСΑ -зависжмοж ρеκοмбжнации меж- ду πлазмидοй, сοдеρжащеж ген инτеρлежκжна-2, с сοвмесτж-
30 мοж πлазмидοж жли с сοοτвеτсτвующими ρажοнамж деφеκτнοгο προφага.
Κροме τοгο, исποльзοвание для ορганизации гибρид- нοгο учасτκа связывания ρибοсοм οτнοсиτельнο неπροτяжен- нοж ЗБ -ποследοваτельнοсτи не ποзвοляеτ в ποляοй меρе
35 ρеалжзοваτь ποτенцжальную мοщнοсτь τρансляциοннοгο аππа- ρаτа Ε.сοϋ , чτο πρивοдиτ κ οτнοсиτельнο ποниженнοму - 3 - уροвню синτеза инτеρлейκина-2 челοвеκа в κлеτκаχ шτамма-προдуценτа.
Βсе эτο мοжеτ πρивοдиτь κ зяачиτельнοму ποнижению сοдеρжания инτеρлейκжна-2 в биοмассе шτамма-προдуцеяτа 5 πρи егο κρуπнοмасшτабнοм κульτивиροвании, чτο в κοнеч- нοм счеτе услοжняеτ ποследующее выделение чисτοгο белκа и снижаеτ выχοд целевοгο προдуκτа.
Ρасκρыτие изοбρеτения
Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 10 κοдиρующая синτез инτеρлейκжна-2 челοвеκа, сποсοб ее κοясτρуиροвания и шτамм баκτеρиж ΕзсЬегιсЗιϊа сοϊι ΒΗИИгенеτиκа νϊθΟЗ (ρΡΕ-ϊЬ2-Ι9), сοдеρжащий ее, являюτ- ся яοвыми и в лиτеρаτуρе не οπисаны.
Β οснοву изοбρеτения ποлοжена задача сοздания нοвοй 15 ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ, κοдиρующей синτез инτеρ- лейκина-2 челοвеκа, сποсοба ее κοнсτρуиροвания и высοκο- προдуκτивнοгο шτамма-προдуценτа инτеρлейκина-2, сοдеρжа- щегο ее, οбесπечжвающегο ποлучение инτеρлейκина-2 с вы- сοκим выχοдοм. 20 Задача ρешена τем, чτο заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДΗΚ ρΡΕ-112-19, κοдиρующая синτез инτеρлейκи- на-2 челοвеκа, сοгласнο изοбρеτению, имееτ ρазмеρ 3,85 τыс.н.π. и сοсτοиτ из следующиχ элеменτοв:
- ΒашΗϊ - Β§1П φρагменτа, ρазмеροм 3,4 τыс.н.π., 25 веκτορяοй πлазмиды ρΡΕΙ24Β , ποлучеяяοй на οснοве ρΡΕ40 и ρΜЬ24
- Сϊτϊз - Ββϊ ] φρагменτа, ρазмеροм 0,45 τыс.н.π., πлазмиды ρΑΑ-ϊ2ϊз-23Β , ποлученнοж πуτем замены учасτκа ρесτρиκции для Зτиϊ на участοκ ρесτρиκцжж в§ϊ 1 в πлаз-
30 миде ρΑΑΙ2ϊз-23 , ρазмеροм 5,4 τыс.н.π. , сκοнсτρуиροва нοй на οснοве πлазмиды ρΒΕ-322 и сοдеρжащей СΟΙΕΙ -ρеπ лиκοн, ген усτοйчивοсτи κ амπициллину и κДΗΚ-κοπию гена инτеρлейκина-2 челοвеκа, эκсπρессия κοτοροгο οбесπечи- ваеτся προмοτοροм и зυ - ποследοваτельнοсτью τρиπτοφанο-
35 вοгο οπеροна Ε. сοϋ и χаρаκτеρизуеτся следующими πρиз- наκами: - 4 -
- сοдеρжиτ учасτοκ инициации ρеπлиκации СοϊΕΙ -ρеπ лиκοн, ген τемπеρаτуροчувсτвиτельяοгο ρеπρессορа сΙτз857 φага Λ , ген устοйчжвοсти κ амπициллину, τанде Ρ-независимыχ τеρминаτοροв τρаясκρиπции φага Ιά , ρегу- 5 ляτορную οбласτь ΡΕοй,5ϊ> -ποследοваτельнοсτь и Α е -иниции- ρующий κοдοн гена сгο φага λ , κοдиρующую ποследοваτель- нοсτь зρелοгο ияτеρлейκжна-2 челοвеκа;
-сοеджненже ρегуляτορнοй οбласτи ΡΕΟΗ и Ατα -κοдοна гена сгο с ποследοваτельнοсτью гена инτеρлейκина-2 и τеρ- 10 минаτορами τρансκρиπцжж £ά οсущесτвленο τаκ, чτο οбρазοван гжбρидныж учасτοκ связывания ρибοсοм, имеющий следующую нуκлеοτидную ποследοваτельнοсτь '--» ..ΤΑΑθСΑССΤτατΑΤсιαсс где ΤΑΑССΑССΤ и ΑΤС-ЗБ -ποследοваτельнοсτь и иницииρую- щиж κοдοн гена сгο , сοοτвеτсτвеннο, ссс - πеρвый Αϊа - 15 κοдοн жяτеρлейκина-2, а за τеρминиρующим κοдοнοм гена ин- τеρлейκжна-2 ρасποлοжен τандем ρ -независимыχ τеρми- наτοροв τρансκρиπции £ά\
- имееτ униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκτаз сϊаϊ, κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа (0) ,
20 ΧЪаΙ (~990), Ββϊ ϊ(~1250), Ρзτϊ(~3070) ;деποниροвана 12.01.8 в κοллеκции κультуρ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο- исследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτибиοτиκοв и заρегисτρиροва- на за нοмеροм 1869.
Сποсοб κοнсτρуиροвания заявляемοж ρеκοмбинанτнοж
25 πлазмидяοй ДΗΚ, сοгласнο изοбρеτению, заκлючаеτся в τοм, чτο πлазмиду ρΑΑϊ2ϊЗ-23 , ρазмеροм 5,4 τыс.н.π. , сκοнсτρуи- ροванную на οсяοве πлазмиды ρΒΕ-322 и сοдеρжащую СοϊΕϊ -ρеπлиκοя, ген усτοжчивοсτи κ аьшициллину и ^ДΗΚ-κο- πию гена инτеρлежκина-2 челοвеκа, эκсπρессия κοτοροгο
30 οбесπечиваеτся προмοτοροм и ЗБ -ποследοваτельнοсτью τρиπ- τοφанοвοгο οπеροна Ε. сοϋ , мοдиφициρуюτ πуτем замены учасτκа ρесτρиκции для Зτи I на участοκ ρесτρиκции в§ι II ποлученную шιазмжду ΡΑΑΙ2ΙЗ-23Β οбρабаτываюτ ρесτρиκτа- зοй С£гΙЗ ж дοсτρажваюτ οбρазующжеся οднοниτевые κοнцы
35 мοлеκул ДΗΚ Κленοвсκим φρагмеяτοм ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε.сοϋ ποсле чегο сϊгϊз -φρагменτ πлазмиды ρΑΑ!2ϊз-23Β с геяοм
Figure imgf000007_0001
- 5 - инτеρлейκина-2 выделяюτ πуτем πρеπаρаτивяοгο элеκτροφο- ρеза в геле агаροзы и инτегρиρуюτ с ποмοщью ДΗΚ-лигазы φага Τ4 в сοсτав веκτορнοй мοлеκулы ρΡΕϊ24Β , сκοнсτρуи- ροваннοй на οснοве πлазмид ρΡΕ40 и ρΜϊ24 , κοτορую πρед- 5 ваρиτельнο ρасщелляюτ ρесτρиκτазοй ΒатΗϊ и удаляюτ
31 -эядοнуκлеазοй οднοцеποчечные κοнцы ДΗΚ в учасτκе ρесτρиκции, заτем ποлученную смесь οбρабаτываюτ ρесτρиκ- τазοй Β§1 ϊϊ и вοссοединяюτ мοлеκулы ДΗΚ в κοльцевые φο мы ДΗΚ-лигазοй Τ4, οбρазующейся смесью τρансφορмиρуюτ 10 κлеτκи Ε.сοϋ С600 τρансφορманτы высеваюτ на сρеду с амπициллинοм и κульτивиρуюτ πρи τемπеρаτуρе 28°С с ποсле- дующей селеκцией на ποниженную сκοροсτь ροсτа πρи τемπе- ρаτуρе 42°С, из οτοбρанныχ κлοнοв выделяюτ πлазмиду ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 , в κοτοροй τοчнοсτь вοссοединения φρаш 15 τοв προвеρяюτ вοссτанοвлением на сτыκе исχοдныχ учасτκοв ρанее οτсуτсτвοвавшей ποследοваτельнοсτи узнавания ρесτρи τазы Βзρ ΕΙ.
•Заявляемая πлазмида χаρаκτеρизуеτся τем, чτο ген сϊτз857 -ρегулятορ инициации τρансκρщции с ρаннжχ προ 20 мοτορнοм баκτеρиοφага _λ ρасποлοжен в ее сοсτаве и эκсπρес сия гена инτеρлейκина-2 наχοдиτся ποд κοнτροлемΡ προмο- τορа. Даннοе οбсτοяτельсτвο ποзвοляеτ избежаτь ποτенциаль- нοй гесΑ -зависимοй ρеκοмбинации между πлазмидοй, κοдиρую щей ген инτеρлейκина-2, с сοвмесτимοй ρезиденτнοж πлазмж- 25 дοй или с деφеκτным προφагοм. Заявляемый сποсοб κοнсτρуи- ροвания ρеκοмбинанτнοй πлазмиды ρΡΕ-ϊϊι2-ϊ9 . нρи κοτοροм ЗБ -ποследοваτельнοсτь и дυс -κοдοн гена сгο баκτеρиοφа га λ сοединяюτся с κοдиρующей οбласτью гена инτеρлейκи- на-2 челοвеκа, οбесπечиваеτ ποлучение гибρиднοгο учасτκа 30 связывания ρибοсοм гена инτеρлейκина-2 с οπτимальнοй πеρ- вичнοй и προсτρансτвеннοй сτρуκτуροй 5-κοнцевοй οбласτи маτρичнοй ΡΗΚο
Изοбρеτением τаκже являеτся шτамм Ε.сοϋ ΒΗИИгене- τиκа νь 903 (ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9)προдуценτ инτеρлейκина-2 челο- 35 веκа, сοдеρжащии ρеκοмбинанτную πлазмидную ДΗΚ ρΡΕ-112-19 . κοτορый, сοгласнο изοбρеτению, ποлучен меτο- - 6 - дοм генеτичесκοй ияженеρии πуτем введения ρеκοмбияанτ- ΗΟЁ ПЛаЗΜИДΗΟЙ ДΗΚ ρΡΕ-ΙЪ2-Ι9 Β баκτеρИИ ΕзсЪегΙсϊιΙа сοϋ. Заявляемый шτамм деποниροван 12.01.87 в κοллеκ- ции κульτуρ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοва- 5 τельсκοгο инсτиτуτа анτибиοτиκοв и заρегисτρиροван за нοмеροм 1869. Заявляемыж шτамм ποзвοляеτ οбесπечжτь сτа- бжльнοе наκοπленже жнτеρлежκжна-2 челοвеκа в услοвияχ κρуπяοмасшτабнοгο κульτивиροвания и дοсτичь выχοда целе- вοгο προдуκτа (8-10)*10 ΜΕ/л, чτο сοοτвеτсτвуеτ 8-12 οτ 10 οбщегο κοличесτва κлеτοчнοгο белκа.
Лучшиж ваρианτ οсущесτвления изοбρеτения
Сποсοб κοнсτρужροвания заявляемοй ρеκοмбинанτнοй πлазмжднοж ДΗΚ ΡΡΕ-ΙЬ2-Ι9 οсущесτвляюτ в несκοльκο эτа- ποв.
15 Плазмиду ρΑΑϊ2ΙЗ-23 , ρазмеροм 5,4 τыс.я.π., сκοясτ ρуиροваняую на οснοве πлазмиды ρΒΕ-322 ж сοдеρжащую СοϊΕϊ -ρеπлжκοн, ген усτοйчжвοсτж κ амπжцжллину и ^ДΗΚ-κοπию гена инτеρлежκжна-2 челοвеκа^ эκсπρессия κοτορο οбесπечиваеτся προмοτοροм и ЗБ-ποследοваτельяοсτью τρиπ-
20 τοφанοвοгο οπеροна Ε.сοϋ , мοдиφициρуюτ πуτем замены учасτκа ρесτρиκции для Зτи I на участοκ ρесτρиκции в§ι Л. и ποлучаюτ πлазмиду ΡΑΑΙ2ΙЗ-23Β , κοτορую οб- ρабаτываюτ ρесτρиκτазοж сггϊз ж дοсτρажваюτ οбρазующжеся οдяοнжτевые κοнцы мοлеκул ДΗΚ Κленοвсκим φρагменτοм ДΗΚ-πο-
25 лимеρазы I Ε.сοϋ. . Заτем πуτем πρеπаρаτивяοгο элеκτρο φορеза в геле легκοπлавκοж агаροзы выделяюτ С£гϊз -φρаг- менτ πлазмиды ρΑΑϊ2ϊЗ-23Β , сοдеρжащиж ген жнτеρлежκжна-2. Пροвοдяτ κοнсτρуиροванже веκτορяοж πлазмжды ρΡΕϊ24Β. Для эτοгο в ДΗΚ πлазмжды ρΡΗ40. в ρажοне учасτκа узнава-
30 ния ρесτρиκτазы в§ιϊϊ προизвοдяτ делецию с ποмοщью эκзο- нуκлеазы Β§131 и τаκим οбρазοм ποлучаюτ πлазмиду ρΡΕЮθ, в κοτοροй учасτοκ узнавания ΒашΗϊ ρасποлагаеτся неποсρед- сτвеннο за οбласτыο связывания ρибοсοм φага λ , πρичем в ρажοне иницииρующегο ΑϋС κοдοна οбρазуеτся ποследοваτель-
35 нοсτь: Αϋ.с'сΑΤсσ ,
ΒатΗΙ - 7 - Β дальнейшем с ποмοщью τρадициοнныχ геннο-инженеρныχ меτοдиκ меныπий ΡзτΙ-ΒатΗΙ φρагмеяτ πлазмиды ρΡΕΙΟΟ сοединяюτ с бοльшим ΡзτΙ-ΒатаΗΙ φρагменτοм πлазмиды ρΜЬ24 и ποлучаюτ πлазмиду ρΡΕϊ24 , в κοτορую с πο- 5 мοщью οлигοнуκлеοτиднοгο линκеρа ввοдяτ учасτοκ узнавани ρесτρиκτазы Ββϊ| вмесτο ΧЪаϊ и ποлучаюτ πлазмиду ρΡΕϊ24 Заτем СϊτϊЗ -φρагмеяτ πлазмиды ρΑΑΙ2ΙЗ-23Β с генο инτеρлейκина-2 инτегρиρуюτ с ποмοщью ДΗΚ-лигазы φага Τ4 в сοсτав веκτορнοж мοлеκулы ρΡΕϊ24Β , ρасщеπленнοй ρесτ 10 ρиκτазοй ΒатΗϊ и с удаленными зϊ -эндοнуκлеазοж οднοни τевыми κοнцами ДΗΚ, заτем πρеπаρаτ οбρабаτываюτ ρесτρиκ- τазοй Ββϊ 1 ж οбесπечиваюτ циκлизацию линейныχ мοлеκул ДΗΚ ДΗΚ-лигазοй Τ4. Пοлученнοй смесью τρансφορмиρуюτ κлеτ κи Ε.сοϋ σбοοг ρансφορманτы высеваюτ на сρеду с амπи- 15 циллинοм и κульτивиρуюτ πρи τемπеρаτуρе 28°С с ποследую- щей селеκцией на ποнжженную сκοροсτь ροсτа πρи τемπеρа- τуρе 42°С. Из οτοбρанныχ τаκим οбρазοм κлοяοв выделяюτ πлазмидную ДΗΚ, οбοзначенную κаκ ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 , в κοτοροй τοчнοсτь вοссοединения φρашенτοв προвеρяюτ вοссτанοвле- 20 нием на сτыκе исχοдныχ учасτκοв ДΗΚ ρанее οτсуτсτвующей ποследοваτельнοсτи узнавания ρесτρиκτазы ΒзρΕϊ .
Заявляемый шτамм Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νь 903 (ρΡΕ-ϊЬ2- ποлучаюτ τρансφορмацией ρециπиенτнοгο шτамма баκτеρий Εзсϊιегϊсηϊа сοϋ ρеκοмбинанτнοй πлазмиднοй ДΗΚ 25 ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 .. Β κачесτве ρециπиенτнοгο шτамма мοгуτ быτь исποльзοваны шτаммы Ε.сοϋ σбθθ, Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτиκа УЬ-903 (деποниροван вο- Βсесοюзяοй κοллеκции προмышлеяныχ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο ин- сτиτуτа генеτиκи и селеκции προмышленныχ миκροορганизмοв 30 и заρегисτρиροван за нοмеροм ΒΚПΜΒ-3546) и дρугие προизвοд- ные Ε.сοϊ± ΚΙ2. Пοсле τρансφορмации οсущесτвляюτ οτбορ ρеκοмбинанτныχ κлοнοв на сρеде с амπициллинοм πρи τемπеρа- τуρе 28°С.
Заявляемый шτамм χаρаκτеρизуеτся синτезοм инτеρлей- 35 κина-2 челοвеκа в услοвияχ деπρессии д -προмοτορа, усτο чивοсτью κ амπициллияу, а τаκже ποниженнοй сκοροсτью - 8 - ροсτа πρи κульτивиροвании κлеτοκ πρи τемπеρаτуρе 42°С. Заявляемый шτамм ποзвοляеτ οбесπечиτь сτабильнοе наκοπление инτеρлейκина-2 челοвеκа в услοвияχ κρуπнο- 5 масшτабнοгο κульτивиροвания и πρивοдиτ κ ποвышеннοму сжнτезу егο в κлеτκаχ Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νъ 903 (ρΡΕ-ϊЬ2-Ι9) , сοсτавляющему дο (8-10) •ΙСг ед/л, чτο сοοτвеτсτвуеτ 8-12$ οτ οбщегο κοлжчесτва κлеτοчнοгο белκа. 10 Шτамм Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νь 903 (ρΡΕ-ΙЬ2-Ι9) χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами.
Μορφοлοгичесκже πρжзнаκж. Κлеτκж πρямые, πалοчκο- видные, слабοποдвижные, сποсοбны κ οбρазοванжю ниτевидныχ φορм, гρам-οτρицаτельные, несποροнοсные, ρазмеρ οτдельныχ 15 κлеτοκ 3-5 мκм.
Κульτуρальные πρизнаκи. Κлеτκи χοροπю ρасτуτ на πлοτныχ и жидκиχ προсτыχ синτеτичесκиχ, ποлусинτеτичесκжχ ж κοмπлеκсныχ сρедаχ. Пρи ροсτе на агаρизοваннοм бульοне Χοττингеρа илж Ь -бульοне οбρазуюτ гладκие, κρуглые, сла- 20 бοмаτοвые οслизненные κοлοнии. Пρи выρащивании в жидκиχ сρедаχ τиπа ь -бульοна или Μ9 с κазамжнοвыми κжслοτамж οбρазуюτ ρавнοмеρную взвесь.
Φизиοлοгο-биοχимичесκие πρизнаκи. Κлеτκи сποсοбны κ ροсτу в диаπазοне τемπеρаτуρ οτ 5 дο 40°С (οπτимум 37°С) 25 πρи ρΗ 6,7-7,5. Β κачесτве исτοчниκа углеροда исποльзуюτ углевοды (наπρимеρ, саχаροзу) и аминοκислοτы. Οбладаюτ ауκсοτροφнοсτыο πο меτиοнину. йсτοчнжοм азοτа мοгуτ слу- жиτь минеρальные сοли в аммοнийнοй φορме, а τаκже ορгани- чесκие -сοединения в виде πеπτοна, τρиπτοна, дραжжевοгο 30 эκсτρаκτа и аминοκислοτ.
Усτοйчивοсτь κ анτибиοτиκам. Шτамм усτοжчив κ амπи- циллжну в κοнценτρациж дο 100 мг/л πρи выρащивании в жид- κиχ и на агаρизοванныχ πиτаτельныχ сρедаχ.
Сτабильнοсτь πлазмиды. Пρи χρанении κлеτοκ на агази- 35 ροваннοж сρеде, πρи сеρии ποследοваτельныχ πеρесевοв и в προцессе глубжннοгο κульτивиροвания в жидκοй сρеде с анτиб οτиκοм не προисχοдиτ ποτеρи и πеρесτροйκи πлазмиды.
Β дальнейшем изοбρеτение ποясняеτся πρимеρамж οсущесτв - 9 - ления сποсοба κοнсτρуиροвания заявляемοй πлазмиды, сπο- сοба ποлучения шτамма, егο κульτивиροвания и иллюсτρи- ρуеτся следующими φигуρами, на κοτορыχ изοбρаженο: 5 φиг.Ι - φизиκο-генеτичесκая κаρτа ρеκοмбинанτнοй πлазмиды ρΡΕ-ϊЬ2-Ι9; φиг.2 - сχема ποлучения заявляемοй ρеκοмбинанτнοй
ПЛаЗΜИДЫ ρΡΕ-ΙЬ2-Ι9.
Пρимеρ I
10 Κοнсτρуиροвание заявляемοй ρеκοмбинанτнοй πлазмиды ρΡΕ-ϊϊι2-ϊ9 προвοдяτ в несκοльκο эτаποв. Пеροначальн κοнсτρуиρуюτ веκτορную πлазмиду ρΒΕΙ24Β.
3 мκг ДΗΚ πлазмиды ρΡΕ40 ρасщеπляюτ ρесτρиκτазοй Β§1 ϊ в 60 мκл буφеρа для ρесτρиκции-Ι , сοдеρжащегο
15 10 мΜ τρис-ΗСΙ , ρΗ 8,0, 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 150 мΜ ΝаСϊ .
Figure imgf000011_0001
двумя οбъемами эτанοла. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 20 мκл Η^Ο. Οбρабοτκу ДΗΚ эκзοнуκлеазοй аϊЗϊ προвοдяτ в τечение 3 мин πρи τемπеρаτуρе 30°С в 30 мκл буφеρа, сοдеρжащегο
20 ;ЗΜ ИаСΙ , 60 мΜ СаС12 , 60 мΜ Μ£С12 , 100 мΜ τρис-ΗСϊ , ρΗ 8,0, 5мΜ эτилендиаминτеτρауκсуснοй κислοτы. ДБΚ πеρеοсаждаτοдвуτля οбъемами эτжлοвοгο сπиρ- τа. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 10 мκл Η20. Οбρабοτκу ρесτρиκτазο ΒашΗϊ προвοдяτ в προбе οбъемοм 30 мκл, сοдеρжащей уκа-
25 занный буφеρ для ρес ρиκции-Ι. Дοсτροйκу οднοцеποчечныχ 3-κοнцевыχ учасτκοв ДΗΚ προвοдяτ οбρабοτκοй Κленοвсκим φρагменτοм ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε.сοϋ в προбе οбъемοм 20 мκл, сοдеρжащей 10 мΜ τρис-ΗСϊ , ρΗ 8,0, 10 мΜ Μ^СΙ^, 2 мκг πρеπаρаτа ДΗΚ, πο 30 мκи κаждοгο из дезοκсиρибοнуκле
30 изидτρиφοсφаτοв, 5 единиц φеρменτа ДΗΚ из ρеаκциοннοй смеси πеρеοсаждаюτ эτанοлοм и ρасτвορяюτ в 100 мκл Η^Ο. Βοссοединение линеаρизοваннοй πлазмиднοй ДΕЖ προвοдяτ πρи τемπеρаτуρе Ι6°С в τечение 12 часοв с ποмοщью ДΗΚ-ли- газы φага Τ4 в προбе, сοдеρжащей буφеρ для лигиροвания
35 (60 мΜ τρис-ΗСΙ , ρΗ 7,6, 10 мΜ ΜβСΙ^ , 10 ινйΛ 2-меρκаπτοэτанοла, 0,4 мΜ аденοзинτρиφοсφаτа) и I мκг ДΗΚ. Пοлученнοιϊ смесыο τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϋ σбθθ , эφφеκτивнοсτь τρансφορмации сοсτавляеτ - 10 -
5«10 κοлοний на I мκг наτжвнοж πлазмиды ρΡΕ40. Οτби- ρаюτ κлοны, усτοйчивые κ аϊνшициллιιну (100 мκг/мл), из ниχ выделяюτ ιшазмщιную ДΗΚ πο мοдиφициροваннοму меτοду 5 Биρнбοйма ж Дοли и исποльзуюτ для ρесτρшщиοннοгο ана- лиза. Β ρезульτаτе ποлучаюτ πлазмиду ρΡΕЮθ , κοτορая сοдеρжиτ униκальный учасτοκ ρасщеπления ΒашΗϊ . Далее κοнсτρуиρуюτ πлазмиду ρΡΕΙ24 . Дπя эτοгο 2 мκг ДΗΚ плазмиды ρΜЬ24 ρасщеπляюτ сοвмесτнο ρесτρиκτазами
10 ΒатΗΙ ΡзτΙ в 40 мκл буφеρа для ρесτρиκции-Ι. Βοссοединяюτ с ποмοщыο ДΗΚ-лигазы φага Τ4 πρи τемπеρа- τуρе 0°С с φρагменτами, ποлученными πρи гидροлизе ДЖ πлазмиды ρΡΕЮθ ρесτρиκτазами ΒашΗϊ и Ρзτϊ. Пοлученным πρеπаρаτοм ДΗΚ τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϋσбΟΟ
15 с οτбοροм τρансφορманτοв на сρеде с амπициллинοм с ποсле- дующеж селеκцией Стг -κлοнοв на сρеде с 300 мκг/мл χлορамφениκοла πρи κульτивиροвании κлеτοκ πρи τемπеρа- τуρе 42°С. Из οτοбρанныχ τаκим οбρазοм κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДΗΚ и исследуюτ с ποмοщью ρесτρиκциοннοгο
20 анализа. Β ρезульτаτе ποлучаюτ πлазмиду ρΡΕΙ24. сοдеρ- жащую учасτοκ ρасщеπления ρесτρиκτазοй ΒатΗϊ
Далее 3 мκг ДΗΚ πлазмиды ρΡΕΙ24 ρасщеπляюτ ρесτρи τазοй ΧЪаϊ в 70 мκл буφеρа для ρесτρиκции-Ι, сοдеρжа- щегο 10 τρис-ΗСϊ , ρΗ 7,9, 6 мΜΜ§Сϊ2 , 6 мΜ
25 2-меρκаπτοэτанοла, 150 мΜ ΝаСϊ , ДΗΚ πеρеοсаждаюτ двум οбъемами эτанοла. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 15 мκл Η^Ο. Дοсτ- ροйκу οднοцеποчечныχ 3 -κοнцевыχ учасτκοв ДΗΚ προвοдяτ οбρабοτκοж Κленοвсκим φρагменτοм ДΗΚ-ποлимеρазы I Ε.сοϋ в προбе οбъемοм 20 мκл, сοдеρжащей 10 мΜ τρис-нσϊ,
30 ρΗ 8,0, Μ§σϊ2 , 2 мκг πρеπаρаτа ДΗΚ, πο 30 мκм κаждοгο из дезοκсиρибοнуκлеοзидτρиφοсφаτοв, 5 единиц φеρ- менτа. ДЖ из ρеаκциοннοй смеси πеρеοсаждаюτ эτанοлοм и ρасτвορяюτ в 100 мκл Η^Ο. Βοссοединение линеаρизοваннοй πлазмиднοй ДΗΚ С Β£ϊ -линκеρами προвοдяτ πρи Ι6°С в
35 τечение 12 часοв с ποмοщыο ДБΚ-лигазы φага Τ4 в προбе, сοдеρжащей буφеρ для лигиροвания (60 мΜ τρис-нσϊ, ρΗ 7,6, 10 мΜ βСϊ2 , 10 мΜ 2-меρκаπτοэτанοла, 0,4 аденοзинτρиφοсφаτа) , 2 мκг πлазмиднοй ДΗΚ и 0,5 мκг - II -
линκеροв. Пοсле προведения лигиροвания ДΗΚ из ρеаκциοн- нοй смеси οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и ποдвеρгаюτ φеρменτаτивнοму гидροлизу ρесτρиκτазοй Ββϊ П в προ- 5 бе, οбъемοм 40 мκл, сοдеρжащей буφеρ для ρесτρиκτации-2 (6 мΜ τρанс- нσϊ , ρΗ 7,6, Μ^сϊ^ , 6 мΜ 2-меρ κаπτοэτанοл, 50 ΝаСϊ). ДΗΚ внοвь οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и οбесπечиваюτ циκлизацию, для чегο I мκг πρеπаρаτа πлазмиднοй ДΗΚ в 240 мκл буφеρа ддя лигиροвани
10 οбρабаτываюτ ДΗΚ-лигазοй Τ4. Пοлученнοй смесью τρанс- φορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϊ± σбοο
Эφφеκτивнοсτь τρансφορмации сοсτавляеτ дο 5*10 κοлοний на I мκг наτивнοй πлазмиды ρΡΕϊ24 • Οτбиρаюτ κлοны, усτοйчивые κ амπициллину (100 жг/мл), из ниχ вы-
15 деляюτ πлазмидную ДΗΚ и исποльзуюτ ее для ρесτρиκциοннοгο анализа. Β ρезульτаτе ποлучаюτ πлазмиду ρΡΕϊ24Β , κοτο- ρая в οτличие οτ исχοднοй веκτορнοй мοлеκулы ρΡΕϊ24οοдеρ ,жиτ униκальный учасτοκ ρасщеπления Β§ϊ1 , вмесτο имевшейся ποследοваτельнοсτи узнавания χъаϊ (φиг.2).
20 Заτем 3 мκг ДΗΚ πлазмиды ' ρΡΕΙ24Β ρасщеπляюτ ρе сτρиκτазοй ΒашΗϊ в προбе οбъемοм 12 мκл, сοдеρжащей бу- φеρ для ρесτρиκции-Ι. Ρеаκцию οсτанавливаюτ φенοльнοй деπροτеинизацией ДΗΚ и πеρеοсаждением нуκлеинοвοй κислο- τы эτанοлοм. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 20 мκл Η^Ο. Удаление
25 οбρазующиχся πρи ρасщеπлении ДЖ ρесτρиκτазοй οднοцеπο- чечныχ κοнцοв οсущесτвляюτ πρи ποмοщи 51 -эндοнуκлеазы. Для эτοгο ДΗΚ гидροлизуюτ 30 ед 51 -эндοнуκлеазы в προ бе οбъемοм 50 мκл, сοдеρжащей 30 σн^σοθΝа , ρΗ 4,4, 4,5 Ζ δθ^ , 250мΜ Νаθϊ , в τечение 20 мин πρи τемπе
30 ρаτуρе 20°С. Ρеаκцшο οсτанавливаюτ οбρабοτκοй φенοлοм и Д πеρеοсаждаюτ эτанοлοм. Οсадοκ ρасτвορяюτ в 15 мκл Η^Ο.
Далее ποлучаюτ πлазмиду ΡΑΑΙ2ΙЗ-23Β Для эτοгο 3 мκг ДΗΚ πлазмиды ρΑΑϊ2ΙЗ- 3 , ρазмеροм 5,4 τыс.н.π., сκοнсτ- ρуиροванную на οснοве πлазмиды ρΒΕ-322 и сοдеρжащую
35 σοϊΕΙ -ρеπлиκοн, ген усτοйчивοсτи κ амшщиллину и κДΗΚ-κ πиго гена инτеρлейκина-2 челοвеκа, эκсπρессия κοτοροгο - 12 - οбесπечиваеτся προмοτοροм и ЗБ -ποследοваτельнοсτью τρиπτοφанοвοгο οπеροна Ε.сοϋ , ρасщеπляюτ в 10 ед. ρесτρиκτазы δτи I в προбе οбъемοм 30 мκл, сοдеρжащеж 5 буφеρ для ρестρжκции-Ι (10 мΜ τρис-нσϊ , ρΗ 7,9, ΜδС12 , 6 м 2-меρκаπτοэτанοла, Ι50мΜ Νаσϊ ) , да ДΕЖ οсаждаюτ из ρеаκциοннοй смеси дοбавлением эτанοла. Οс дοκ οτделяюτ ценτρиφугиροванием в 20 мκл Η^Ο. Βοссοеди- нение линеаρизοваннοж πлазмиднοж ДΗΚ с в§ι]Г -линκеρам
Ю προвοдяτ с ποмοщью 20 ед. ДΗΚ-лигазы Τ4 в προбе οбъемοм 30 мκл, сοдеρжащей буφеρ для лигиροвания (60 мΜ τρис- - ΗСΙ , ρΗ 7,6, 10 мΜ м§С12 , 10 мΜ 2-меρκаπτοэτанοл, 0,4 аденοзинτρиφοсφаτ), 2 мκг πлазмиднοй ДΗΚ и 0,5 мκг линκеροв. Пοсле лигиροвания ДЖ из ρеаκциοннοж смеси οса
15 даюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и ποдвеρгаюτ φеρменτаτивнοму гидροлизу ρесτρиκτазοй в§ϊΤι в προбе, οбъемοм 40 мκл, сοдеρжащеж буφеρ для ρесτρиκции-2 (6 мΜ τρис-нσϊ , ρΗ 7,7, 6 мΜ ΜеС12 , 6 мΜ 2-меρκаπτοэτанοл, 50мΜ ΗаСΙ ДЖ внοвь οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и οбесπечиваюτ
20 циκлизацию мοлеκул ДΗΚ, для чегο I мκг πρеπаρаτа πлазмид нοй ДЖ в 240 мκл буφеρа ддя лигиροвания οбρабаτываюτ 2 ед. ДΗΚ-лигазы Τ4. Пοлученный смесыο τρансφορмиρуюτ κл κи Ε.сοϋ σбοο . Эшφеκτивнοсτь τΩансφορмации сοсτав- ляеτ дο 5*10 κοлοний на I мκг наτивнοй шгазмиды
25 ΡΑΑΙ2Ι2-23. Οτбиρаюτ κлοны, усτοйчивые κ амπициллин (100 мκг/мл) , из ниχ выделягоτ πлазмидную ДЖ πο мοдиφи- циροваннοму меτοду Бжρнбοйма и Дοли и исποльзуюτ ее для ρесτρиκциοннοгο анализа. Пοлученная τаκим οбρазοм πлазми да ρΑΑΙ2ΙЗ-23Β в οτличие οτ исχοднοй ρеκοмбιшанτнοй
30 мοлеκулы ρΑΑΙ2ΙЗ-23 сοдеρжиτ униκальный учасτοκ ρасщ ления Β§1 Л вмесτο шлевшейся ποследοваτельнοсτи узна вания Зτи I (φиг.2).
30 мκг ДЖ πлазмиды ΡΑΑΙ2ΙЗ-23Β ρасщеπляют ρесτρш зοй Сϊτϊз (200 ед. аκτивнοсτи) в προбе οбъемοм 100 мκл,
35 сοдеρжащей буφеρ для ρесτρиκции-Ι. Пροдуκτы φеρменτаτив- нοгο гидροлиза ποдвеρгаюτ элеκτροφορезу в 1,1%-нοм геле легκοπлавκοй агаροзы в τρис-ацеτаτнοй буφеρнοй сисτеме - 13 - πρи наπρяженнοсτи ποля 5 Β/см. Зοну геля, сοдеρжащуто φρагменτ ДЖ с генοм ияτеρлейκина-2 длинοй 750 н.π., выρезаюτ и προвοдяτ элюцию ДЩ. Для дοсτροйκи οднοце- ποчечяыχ κοнцοв ДЖ с ποмοщью Κленοвсκοгο φρашенτа 5 ДЖ-ποлимеρазы I Ε.сοϋ , выделенный из геля φρагме οбρабаτываюτ в προбе οбъемοм 20 мκл, сοдеρжащей 10 мΜ τρис- нσϊ , ρΗ 8,0, 10 мΜ Μ§σϊ2 , πο 30 мκм κаждοгο дезοκсиρибοнуκлеοзидτρиφοсφаτοв. Ρеаκцию οсτанавливаюτ προгρеванием, ДЖ из смеси πеρеοсаждаюτ эτанοлοм и ρасτ 10 ρяюτ в 20 мκл Η^Ο.
Заτем ποлученный ρанее πρеπаρаτ линеаρизοваннοй πлазмиды ΡΒΕΙ24Β вοссοединяюτ с φρагменτοм πлазмиды ΡΑΑΙ2ΙЗ-23Β . Для эτοгο I мκг πлазмиднοй ДЖ и 2 мκг φρагменτа οбρабаτываюτ ДЖ-лигазοй φага Τ4 в бушеρе для 15 лигиροвания πρи οбъеме ρеаκциοннοй смеси 30 мκл. Пοсле πеρеοсаждения ДЖ и ρасτвορения οсадκа в 20 мκл Η20 πρеπаρаτ οбρабаτываюτ ρесτρиκτазοй §ι и 9 κ οπиса выше, ДЖ еще ρаз οсаждаюτ эτанοлοм, ρасτвορяюτ и οбес- πечиваюτ вοссοединение линейныχ мοлеκул ДЖ в κοльцевые 20 φορмы с ποмοщью ДЖ-лигазы Τ4 πρи οόρабοτκе πρеπаρаτа φеρменτοв в οбъеме ρеаκциοннοй смеси 300 мκл. Пοлучеяныж πρеπаρаτ исποльзуюτ для τρансφορмации κлеτοκ Ε.сοϋ σбο с ποследующей селеκцией τρансφορманτοв на сρеде амπицил- линοм πρи κульτивиροвании κлеτοκ в τечение суτοκ πρи τем 25 πеρаτуρе 28°С. Сρеди ποлученяыχ τρансφορманτοв οτбиρа- юτ ваρианτы, οбладающие ποниженнοй сποсοбнοсτью κ ροсτу πρи τемπеρаτуρе 42°С. Из уκазанныχ κлοнοв выделяюτ πлаз- мидную ДЖ, κаκ οπисанο выше, и ποдвеρгаюτ ρесτρиκциοннο му анализу. Β ποлученнοй πлазмиде ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 /φиг. 30 на сτыκе сοединяемыχ учасτκοв ДЖ, κοдиρующиχ πеρвый κο- дοя гена сгο φага λ и Αϊа -κοдοн инτеρлейκина-2 челοве- κа, οбρазуеτся учасτοκ ρасщеπления ρесτρиκциοннοй эндοну леазы ΒаρΕΙ. Пρимеρ 2 35 Пοлучение шτамма Ε.сοϊϊ ΒΗИИгенеτиκа νъ 903 (ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9)-προдуценτа инτеρлейκина-2 челοвеκа
Figure imgf000016_0001
- 14 - οсущесτвляюτ следующим οбρазοм. Плазмиду ρΡΕ-ΙЬ2-Ι9, κοджρуюшую сжнτез жнτеρлейκина-2 челοвеκа, τρанеφορмаци- ей ввοдяτ в κлеτκи шτамма ρециπиеяτнοгο Ε.сοϋ ΒΗИИгене- τжκа УБ903, деποнжροваняοгο вο Βсееοюзнοй κοллеκцжж προ- 5 мышленныχ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοва- τельсκοгο инсτиτуτа генеτиκж ж селеκции προмышленныχ миκρ ορганизмοв и заρегисτρиροваннοгο за нοмеροм ΒЫΙΜ Β-3546. _Эφφеκτивнοсτь τρансφορмации κлеτοκ Ε.сοϊ± ΒΗИИгенеτи- κа νь 903 сοсτавляеτ οκοлο 10 κлοнοв на I мκг яаτивяοй
10 πлазмиды ρΡΕ-ϊЬ2-Ι9 • Τρансφορманτы οτбиρаюτ на сρеде, сοдеρжащей амπициллин (100 мκг/мл) ποсле κульτивиροвания κлеτοκ в τечение суτοκ πρи τемπеρаτуρе 28°С. Из οτοбρанны κлοнοв выделяюτ πлазмидную ДЖ и ποдτвеρждаюτ ее иденτич- нοсτь πρеπаρаτу ρΡΕ-11,2-19 с ποмοщью ρесτρиκциοннοгο ана
15 лиза. Пοлучаюτ шτамм Ε.сοϋ νь 903 (ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9)- -προдуценτ инτеρлейκина-2 челοвеκа. Пρимеρ
Шτамм Ε.сοϋ VI 903 (ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9) выρащиваюτ πρи τемπеρаτуρе 28°С на сκοшеннοж агаρизοваннοж сρеде Χοττин-
20 геρа, сοдеρжащеж 50 мκг/мл амπжциллина, в τечеяие 14 ча- сοв. Βыροсшую на κοсяκаχ биοмассу исποльзуюτ для ποлуче- яия ποсевнοгο маτеρиала. Для эτοгο κлеτκи πеρенοсяτ в κοлбы Эρленмейеρа οбъемοм 750 мл сο 100 мл сρеды Χοττин- геρа , сοдеρжащей 100 мκг/мл амπициллина и выρащиваюτ
25 πρи τемπеρаτуρе 28°С на κачалκе πρи 240 οб/мин в τечение 6 часοв. Οπτичесκая πлοτнοсτь ποсевнοй κульτуρы сοсτавля- еτ 1,5-2,5 ед.
Φеρменτацию προвοдяτ в φеρменτеρе , οснащеннοм сисτе- мами ρегулиροвания ρΗ τемπеρаτуρы, сκοροсτи πеρемешива-
30 ния и аэρации. Для φеρменτации исποльзуюτ сρеду Χοττин- геρа сο 100 мκг/мл амπициллина и 10 г/л глюκοзы. Пοсевяуто κульτуρу внοсяτ в κοличесτве 5-10 мас.%. Κульτивиροвание οсущесτвляюτ πρи ρΗ 6,6-6,8, ποддеρживая эτοτ уροвень πο- дачей аммиачнοй вοды. Пеρвую часτь φеρменτации προвοдяτ
35 дο οπτичесκοй πлοτнοсτи, ρавнοй 3,5 πρи 550 нм, πρи τемπе ρаτуρе 28°С, а заτем οсущесτвляюτ τеρмοиндуκцию, ποвышая - 15 - τемπеρаτуρу дο 42-45°С в τечение 5 мин, ποсле чегο προ- дοлжаюτ φеρменτацию еще 2 часа.
Пοсле οκοнчания προцесса для οπρеделения аκτивнοсτ инτеρлейκина-2 челοвеκа из I мл κульτуρальнοй жидκοсτи κлеτκи οсаждаюτ ценτρиφугиροванием и οсадοκ ρесусπенди- ρуюτ в I мл 8 Μ ρасτвορа гуанидинχлορида πρи τемπеρаτρу ρе 20°С в τечение 40 мин. Пοсле эτοгο οсадοκ οτбρасываю ценτρиφугиροванием и οπρеделяюτ аκτивнοсτь сοдеρжащейся в яадοсадοчнοй жидκοсτи φρаκции инτеρлейκина-2. Биοлοги κая аκτивнοсτь ποлученнοгο инτеρлежκжна-2 сοсτавляеτ (8-10) -ΙΟ7 ΜΕ/л.
Для οπρеделеяия дοли синτезиροваннοгο инτеρлейκина челοвеκа οτ суммаρнοгο κлеτοчнοгο белκа κлеτκи из I мл κульτуρальнοй жидκοсτи οсаддаюτ ценτρиφугиροванием и οб ρабаτываюτ, κаκ уκазанο выше. Пρеπаρаτ анализиρуюτ элеκ ροφορезοм в 15%-нοм ποлиаκρиламиднοм геле в πρисуτсτвии 0,1%-яοгο дοдецилсульφаτа наτρия. Белκи, ρазделенные в ле, προκρашиваюτ в ρасτвορе Κумасси Ε-250 "Зегνа" /ΦΡ πο сτандаρτнοй меτοдиκе. Κοличесτвеннοе сοдеρжание бел- κοв в зοнаχ οπρеделяюτ ποсле сκаниροвания на денсиτοмеτ προκρашеннοгο геля. Иденτиφиκацию зοяы, сοοτвеτсτвующеж синτезиροваннοму в κлеτκаχ зρелοму инτеρлейκину-2 челοве κа, προвοдяτ на οснοве сρавнения с элеκτροφορеτичесκοй ποдвижнοсτью маρκеρныχ белκοв, а τаκже с ποмοщью блοττин га ρазделенныχ белκοв на ниτροцеллюлοзяые φильτρы с ποс дующим προявлением зοн инτеρлейκина οбρабοτκοй в ρасτвο- ρаχ, сοдеρжащиχ мышиные мοнοκлοнальные анτиτела προτив инτеρлейκина-2 и анτимышиные κροличьи анτиτела, κοнъюги- ροванные с πеροκсидазοй из χρена. Пοсле сοοτвеτсτвующей προцедуρы οκρашивания зοна инτеρлейκина προявляеτся в виде κορичневοй ποлοсы на неοκρашеннοм φοне ниτροцеллю- лοзяοгο φильτρа. Дοля синτезиροваннοгο в κлеτκаχ белκοвο προдуκτа гена инτеρлейκина-2 сοсτавляеτ дο 12$ οτ суммаρ нοгο κοличесτва κлеτοчяοгο όелκа. Пροмышленная πρименимοсτь
Заявляемая ρеκοмбинанτная πлазмидная ДЖ ρΡΕ-ΙЬ2-Ι - 16 - κοдиρующая синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, наχοдиτ πρи- менение для ποлучения шτаммοв-προдуценτοв инτеρлейκина-2 челοвеκа с высοκοй аκτивнοсτью. Заявляемый шτамм Ε.сοϋ ΒΗИЙгеяеτиκа νь 903 (ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9) -προдуценτ инτеρлейκина челοвеκа наχοдиτ πρименение в миκροбиοлοгичесκοй и меди- цинсκοй προмышлеянοсτи для ποлучения инτеρлейκина-2 че- лοвеκа, κοτορый мοжеτ πρименяτься в медицинсκοй πρаκτиκе.

Claims

- 17 - ΦΟΡΜУЛΑ ИЗΟБΡΕΤΕΗШ
I. Ρеκοмбинанτная πлазмидная ДЖ ρΡΕ-112-1 κοдиρующая синτез инτеρлейκина-2 челοвеκа, χаρаκτеρизующа 5 яся τем, чτο οна имееτ ρазмеρ 3,85 τыс.н.π. и сοсτοиτ из следующиχ элеменτοв:
- ΒатΗΙ - Β§1 I φρагменτа, ρазмеροм 3,4 τыс.н. веκτορнοй πлазмиды ρΡΕϊ24Β, ποлученнοй на οснοве ρΡΕ40 Ж ρΜЬ24;
10 - сϊτϊз - Β§1 ГГ φρагменτа, ρазмеροм 0,45 τыс.н πлазмиды ρΑΑϊ2ϊЗ-23Β, ποлученнοй πуτем замены учасτ ρесτρиκции для з-Ьи на учасτοκ ρеοτρиκции в§ϊ]Ι в πлазмиде ρΑΑϊ2ΙЗ-23 ρазмеροм 5,4 τыс.н.π. , сκοнсτρуиροв нοй на οснοве πлазмиды ρΒΕ-322 и сοдеρжащей σοϊΕϊ -ρеπли
15 ген усτοйчивοсτи κ амπициллину и κДЖ-κοπию гена инτеρлей κина-2 челοвеκа, эκсπρессия κοτοροгο οбесπечиваеτся προмο τοροм и ЗБ -ποследοваτельнοсτью τρиπτοφанοвοгο οπеροна Ε.сοϊϊ, и χаρаκτеρизуеτся следующими πρизнаκами:
- сοдеρжиτ учасτοκ инициации ρеπлиκации σοϊΕϊ -ρе 20 лиκοн, ген τемπеρаτуροчувсτвиτельнοгο ρеπρессορа сϊ-Ьз857 φага Д » ген усτοйчивοсτи κ амшщиллину, τандем 2-н висимыχ τеρминаτοροв τρансκρиπции φага ϊά , ρегуляτορн οбласτь ΡβοΕ» 5Б -ποследοваτельнοсτь и Ατα -иницииρ щии κοдοн гена сгο φага , κοдиρующую ποследοваτел 25 нοсτь зρелοгο инτеρлейκина-2 челοвеκа;
- сοединение ρегуляτορнοй οбласτи нοβ и ΑΤΟ -κο гена сгο с ποследοваτельнοсτью гена инτеρлейκина-2 и τ минаτορами τρансκρиπции ϊά οсущесτвленο τаκ, чτο οбρаз ван гибρидный учасτοκ связывания ρибοсοм, имеющий следующ
30 нуκлеοτиднуτο ποследοваτельнοсτь:
5'- ... ΤΑΑθαΑοοττοτΑταασσ ...-з', где ΤΑΑοαΑααα? и ΑΤ0 - ЗБ-ποследοваτельнοсτь и индуцииρующий κοдοн гена сг сοοτвеτсτвеннο οσσ -πеρвый ^а κοдοн инτеρлейκина-2, а з τеρмининиρующим κοдοнοм гена инτеρлйκина-2 ρасποлοжен τан
35 дем β -независимыχ τеρминаτοροв τρансκρиπции ϊά. ;
- имееτ униκальные учасτκи узнавания ρесτρиκτаз σϊаϊ , κοορдинаτа κοτοροгο являеτся началοм οτсчеτа ( 0 - -
ΧЪаΙ (^990) ,Β&υГ Μ250) , Ρβ* (л,3070) ; деποниροвана 12.01.87 в κοллеκции κульτуρ миκροορганизмοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτибиοτиκοв и за- 5 ρегисτρиροвана за нοмеροм 1869.
2. Сποсοб κοнсτρуиροвания ρеκοмбинанτнοж πлазмиднοй ДБΚ ρΡΕ-П.2-19 , χаρаκτеρизующийся τем, чτο гоιазмиду ΡΑΑΙ2ΙЗ-23 , ρазмеροм 5,4 τыс.н.π., сκοнсτρуиροванную на οснοве πлазмиды ρΒΕ-322 и сοдеρжащую СοϊΕϊ -ρеπлиκοн,
10 ген усτοйчивοсτи κ амπициллину и κДЖ-κοπию гена инτеρлей- κина-2 челοвеκа, эκсπρессия κοτοροгο οбесπечиваеτся προмο- τοροм и ЗБ -ποследοваτельнοсτью τρиπτοφанοвοгο οπеρο- на Ε.οοϋ , мοдиφициρуюτ πуτем замены учасτκа ρесτρиκции для з-Ьиϊ на учасτοκ ρесτρиκции вβϊ П" , ποлученную πлаз-
15 миду ρΑΑΙ2ϊз«23Β οбρабаτываюτ ρесτρиκτазοй σ£г-ϊЗ и дο- сτρаиваюτ οбρазующиеся οднοниτевые κοнπы мοлеκул ДΗΚ Κленοвсκим φρагменτοм ДЖ-ποлимеρазы I Ε.сοϊι , ποсле чегο οбρазοванныж С£г 13 -φρагменτ πлазмиды ΡΑΑΙ2ΙЗ-23Β с генοм инτеρлейκина-2 выделяюτ πуτем πρеπаτивнοгο элеκτ-
20 ροφορеза в геле агаροзы и инτегρиρуюτ с ποмοщью ДЖ-лига- зы φага Τ4 в сοсτав веκτορнοй мοлеκулы ρΡΕϊ24Β , сκοнс ρуиροваннοй на οснοве πлазмид ρΡΕ40 и ρΜЬ24 , κοτορу πρедваρиτельнο ρасщеπляюτ ΒашΗϊ и удаляюτ зι -эндοнуκ леазοж οднοцеποчечные κοнцы ДΗΚ в учасτκе ρесτρиκции, заτе
25 ποлученную смесь οбρабаτываюτ ρесτρиκτазοй ΒβϊΕ и вοссο диняюτ мοлеκулы ДΗΚ в κοльцевые φορмы ДЖ-лигазοй Τ4, οбρ зующейся смесью τρансφορмиρуюτ κлеτκи Ε.сοϋСбοθ , τρанс φορманτы высеваюτ на сρеду с амπициллинοм и κульτжвиρуюτ πρи τемπеρаτуρе 28°С с ποследующей селеκциеж на ποниженную
30 сκοροсτь ροсτа πρи τемπеρаτуρе 42°С, из οτοбρанныχ κлοнοв выделяюτ πлазмиду ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 , в κοτοροй τοчнοсτь вοссοединения φρагменτοв προвеρяюτ вοссτанοвлением на сτы- κе исχοдныχ учасτκοв ДЖ ρанее οτсуτсτвοвавшей ποследο- ваτельнοсτи узнавания ρесτρиκτазы ΒнρΕΤ
35 3. Шτамм Ε.сοϋ ΒΗИИгенеτиκа νϊθθЗ (ρΡΕ-ΙЬ2-!9 -προдуценτ инτеρлейκина-2 челοвеκа, сοдеρжащии ρеκοмбинанτ πлазмидную ДЖ ρΡΕ-ϊЬ2-ϊ9 πο π.Ι, ποлученныи меτοдοм - 19 - генеτичесκοй инженеρии πуτем введения ρеκοмбинанτнοй
ПЛазмиДΗΟЙ ДЖ ρΡΕ-ΙЬ2-Ι9 Β баκτеρии Ξасϊιегϊсϊιιа сοϊ деποниροванный 12.01.87 в κοллеκции κульτуρ миκροορганиз мοв Βсесοюзнοгο научнο-исследοваτельсκοгο инсτиτуτа анτи 5 биοτиκοв и заρегисτρиροванный за нοмеροм 1869.
PCT/SU1988/000032 1987-02-09 1988-02-08 RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT WO1988005818A1 (en)

Priority Applications (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
HU881691A HUT50873A (en) 1987-02-09 1988-02-08 Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same
NL8820102A NL8820102A (nl) 1987-02-09 1988-02-08 Recombinant plasmide-dna ppr-il2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, werkwijze voor de bereiding daarvan en bacteriestam escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-19) die menselijk interleukine-2 produceert en het plasmide-dna bevat.
DE883890052T DE3890052T1 (de) 1987-02-09 1988-02-08 Rekombination-plasmid-dns ppr-il2-i9, die die synthese des menschlichen interleukin-2 kodiert, verfahren zu ihrem konstruieren und stamm der bakterien escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-i9)-produzent des menschlichen interleukin-2, der dieselbe enthaelt
JP88502088A JPH01502639A (ja) 1987-02-09 1988-02-08 ヒトインターロイキン―２の合成についてコードする組換えプラスミドＤＮＡｐＰＲ―１Ｌ２―１９、その工学的作出方法及びそれを含有するヒトインターロイキン―２産生細菌大腸菌ＶＮ２ジェネティカＶＬ９０３（ｐＰＲ―１Ｌ２―１９）株
FI884557A FI884557A (fi) 1987-02-09 1988-10-04 Rekombinantplasmid-dna ppr-il2-19, som kodas foer syntes av maenniskans interleukin-2, foerfarande foer framstaellning daerav och stammen bacteria escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-19) producerande maenniskans interleukin-2 och innehaollande detta dna.
GB8823729A GB2210373A (en) 1987-02-09 1988-10-10 Recombinant plasmid dna ppr-il2-19,coding for synthsis of human interleukin-2 and strain of bacteria escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-19)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SU874191353A SU1703693A1 (ru) 1987-02-09 1987-02-09 Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека
SU4191353/28 1987-02-09

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO1988005818A1 true WO1988005818A1 (en) 1988-08-11

Family

ID=21284358

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/SU1988/000032 WO1988005818A1 (en) 1987-02-09 1988-02-08 RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT

Country Status (10)

Country Link
JP (1) JPH01502639A (ru)
CH (1) CH676997A5 (ru)
DE (1) DE3890052T1 (ru)
FI (1) FI884557A (ru)
GB (1) GB2210373A (ru)
HU (1) HUT50873A (ru)
NL (1) NL8820102A (ru)
SE (1) SE8803566D0 (ru)
SU (1) SU1703693A1 (ru)
WO (1) WO1988005818A1 (ru)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6068993A (en) 1997-07-02 2000-05-30 Biobras Sa Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0088195A2 (en) * 1981-12-28 1983-09-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Messenger RNA, production and use thereof
EP0194818A2 (en) * 1985-03-11 1986-09-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of interleukin-2
WO1986006410A1 (en) * 1985-04-30 1986-11-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for increasing yield of interleukin-2

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0088195A2 (en) * 1981-12-28 1983-09-14 Takeda Chemical Industries, Ltd. Messenger RNA, production and use thereof
EP0194818A2 (en) * 1985-03-11 1986-09-17 Takeda Chemical Industries, Ltd. Production of interleukin-2
WO1986006410A1 (en) * 1985-04-30 1986-11-06 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for increasing yield of interleukin-2

Also Published As

Publication number Publication date
FI884557A0 (fi) 1988-10-04
JPH01502639A (ja) 1989-09-14
FI884557A (fi) 1988-10-04
CH676997A5 (ru) 1991-03-28
DE3890052T1 (de) 1989-04-13
GB2210373A (en) 1989-06-07
SE8803566L (sv) 1988-10-07
NL8820102A (nl) 1989-01-02
GB8823729D0 (en) 1988-12-07
SU1703693A1 (ru) 1992-01-07
HUT50873A (en) 1990-03-28
SE8803566D0 (sv) 1988-10-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4468464A (en) Biologically functional molecular chimeras
US4237224A (en) Process for producing biologically functional molecular chimeras
Ibrahim et al. Method for the isolation of highly purified Salmonella flagellins
US6022950A (en) Hybrid molecules having translocation region and cell-binding region
EP0637630A2 (en) Method for the biological synthesis of peptides
EP0196864A2 (en) Alkaline phosphatase-mediated processing and secretion of recombinant proteins, DNA sequences for use therein and cells transformed using such sequences
DD202045A5 (de) Verfahren zum klonieren einer deoxynucleotidsequenz
SU1720493A3 (ru) Способ получени штамма SтRертососсUS SaNGUIS, способного секретировать @ -1,3-глюкан-3-глюканогидролазу
JPH0376580A (ja) 大腸菌発現ベクターとそれを利用した抗ウイルス性タンパク質の製造方法
RU2354702C2 (ru) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pHINS11, КОДИРУЮЩАЯ ГИБРИДНЫЙ БЕЛОК-ПРЕДШЕСТВЕННИК ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА, КЛЕТКА Escherichia coli, ТРАНСФОРМИРОВАННАЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДНОЙ ДНК pHINS11, ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli JM109/pHINS11 - ПРОДУЦЕНТ ГИБРИДНОГО БЕЛКА-ПРЕДШЕСТВЕННИКА ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНСУЛИНА ЧЕЛОВЕКА
JPS59501694A (ja) シグナルｄｎａ配列を含むｄｎａ断片、その製造方法およびそれにより形質転換された微生物
Barbieri et al. Expression of the S-1 catalytic subunit of pertussis toxin in Escherichia coli
WO1988005818A1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT
JPH04507045A (ja) 誘導性発現ベクター
CN113528415B (zh) 一种nampt酶生产菌及其应用
EP0495398B1 (de) Verfahren zur Herstellung von rekombinanter IgA-protease.
JPH07163363A (ja) 形質転換体の製造方法、生理活性タンパク質の製造方法および形質転換体
KR910001811B1 (ko) 배지의 당분농도제어에 의한 외래유전자 발현제어방법 및 그에 따른 외래유전자 산물의 생산방법
RU2143492C1 (ru) Рекомбинантная плазмида, кодирующая гибридный белок - предшественник инсулина человека (варианты), штамм бактерий e.coli - продуцент гибридного белка - предшественника инсулина человека (варианты), способ получения инсулина человека
EP1097990B1 (en) A mutant kanamycin nucleotidyltransferase and a method of screening thermophilic bacteria using the same
US5021340A (en) Cloning vector, molecules of recombinant DNA, bacillus subtilis strains transformed with the said molecules and methods for the expression of heterologous genes and the production and secretion of proteins coded by the said genes
RU2127758C1 (ru) Способ получения рекомбинантной стрептокиназы
WO1988005819A1 (en) RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IFNbeta1-13, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN FIBROBLAST beta1-INTERFERON, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFNbeta1-13) AS PRODUCER OF HUMAN beta1-INTERFERON, CONTAINING IT
JPS59501852A (ja) 鳥類の成長ホルモン
WO2009054754A1 (fr) Plasmide recombinant phins21 codant une protéine hybride avec la proinsuline humaine, souche de bactéries escherichia coli jm109/ phins21 productrice de la protéine hybride avec la proinsuline humaine et procédé de fabrication de proinsuline humaine

Legal Events

Date Code Title Description
AK Designated states

Kind code of ref document: A1

Designated state(s): CH DE FI GB HU JP NL SE US

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 884557

Country of ref document: FI

RET De translation (de og part 6b)

Ref document number: 3890052

Country of ref document: DE

Date of ref document: 19890413

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 3890052

Country of ref document: DE