HUT50873A - Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same - Google Patents
Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same Download PDFInfo
- Publication number
- HUT50873A HUT50873A HU881691A HU169188A HUT50873A HU T50873 A HUT50873 A HU T50873A HU 881691 A HU881691 A HU 881691A HU 169188 A HU169188 A HU 169188A HU T50873 A HUT50873 A HU T50873A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- plasmid
- dna
- ppr
- coli
- human interleukin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Virology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
A találmány szerinti eljárással előállított, az emberi interleukin-2 szintézisét kódoló pPR-II.2-19 rekombináns plazmid 3,85 kb méretű, és a következő elemekből áll:
- egy, a pPR40 és pMI.24 plazmidokból alkotott pPR124B plazmid •3i
3,4 kb méretű BamHI-BglII fragmense,
- a pBR322 plazmidból alkotott és az interleukin-2 génjének cDNS kópiáját tartalmazó, a pAA1213-23 plazmid módosításával?
i előállított pAA1213-23B plazmid 0,45 kb méretű Cfr-BglII1 fragmense.J
A rekombináns plazmiddal E.coli VNIIGENETIKA VL903| (pPR-IL2-19) törzset állítanak elő, amely az emberi inter- leukin-2-t jó kitermeléssel termeli.í í
• · · · ·
GlX U fa
Képviselő:
DANUBIA SZABADALMI IRODA
KÖZZÉTÉTELI PÉLDÁNY
--50873
ELJÁRÁS EMBERI INTERLEUKIN-2-T KÓDOLÓ REKOMBINÁNS PLAZMID-DNS
ÉS EZT TARTALMAZÓ ESCHERICHIA COLI ELŐÁLLÍTÁSÁRA
Vszeszojuznij Naucfano-Isszledovatyelszkij Insztitut Genetiki i Szelekcii Promislennih Mikroorganizmov (VNIIGENETIKA) , s u c£cöVö'AzA /VctGtíx
Moszkva. Szovjetunió
O < <\ C L C- S k ΟΛ-Ο
Lviteleák- SS Λ
Feltalálók:
DEBABOV Vladimír Georgievics, Moszkva
GREN Elmar Janovics, Moszkva KOZLOV Jurij Ivanovics, Moszkva
MASKO Szergej Vladimirovics, Moszkva SZTRONGIN Alekszandr Jakovlevics, Moszkva SZTERKIN Viktor Emiljevics, Moszkva
JURIN Vitalij Lvovics, Moszkva
KOSZTROV Szergej Viktorovics, Moszkva CIMANISZ Alekszandr Jurievics, Riga
AVOR Andrisz janovics, Riga ROMANCSIKOVA Nagyezsda Viktorovna, Riga KOSZIKOV Alekszandr Ivanovics, Moszkva TRUHAN Makszim Eduardovics, Moszkva MOCSULSZKIJ Andrej Vladimirovics, Moszkva CSERNOVSZKAJA Tatyana Veniaminovna, Moszkva NOSZOVSZKAJA Elena Alekszejevna, Moszkva KOLEVATIH Marina Alekszejevna, Moszkva MAZEL Szvetlána Mendelejevna, Moszkva
A bejelentés napja. 1988. 02. 08.
Elsőbbsége: 1987. 02. 09. (4191353/28) Szovjetunió
A nemzetközi bejelentés száma: PCT/SU88/00032 vj o <?« / esf/f
64819-1582-GI • ·
- 2 A találmány tárgya eljárás emberi interleukin-2 szintézisét kódoló pPR-IL2-19 rekombináns plazmid DNS, valamint ezt hordozó, emberi interleukin-2-t termelő Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 CpPR-IL2-19) előállítására .
A természetes emberi interleukin-2 vagy a T-sejtek növekedési faktora glikoprotein kb. 15 000 dalton molekulatömegű polipeptidlánccal, amelyet a T-sejtek leptinnel, illetve egy megfelelő antigénnel történő aktiváláskor termelnek. Az interleukin-2 komplex hatásmechanizmust mutató immunmodulátor, különösen a T-limfociták aktiválása, a timociták mitogenezise erősítése, a T-sejtek citotoxikus aktivitása indukálása stb. rovására stimulálja az immunválaszt. Ennek megfelelően az interlukin-2 nagy jelentőséggel bír immunológiai zavarok terápiájában, mint például rosszindulatú elváltozások, baktériumos vagy vírusos fertőzések, immunhiánnyal kapcsolatos megbetegedések, autoimmun betegségek, stb. esetén. Az emberi szérumból közvetlenül, illetve a Ourkat-vonal sejttenyészetének tápközegéből kiválasztott természetes interleukin-2 igen csekély mennyiségben áll rendelkezésre, ami tulajdonságainak és klinikai használhatóságának vizsgálatához nem elegendő. Interleukin-2 forrásként szolgálhatnak genetikailag konstruált mikroorganizmus törzsek, amelyek interleukin-2 gént tartalmazó rekombináns plazmidokat hordoznak, és amelyek ennek a génnek hatásos kifejezésére képesek.
Ismeretesek rekombináns plazmid-DNS-k, amelyek az emberi interleukin-2-t kódolják, így például a rekombináns
- 3 plazmid-DNS pPLcMuHil 201 és az ezt tartalmazó E.coli K12AHi&trp (pPLcMuHil 201) (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J., Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Rés., 11, 4307-4323).
Az említett rekombináns DNS molekulában az interleukin-2 génje transzkripcióját a lambda-bakteriofág P|_Ol rs9ulátor-eleme szabályozza, és a gén fehérjeterméke transzlációja bevezetését a Mu-fág SD-szekvenciája alapján konstruált riboszóma kötőhely hibridszakaszának konstruálása eredményezi. Az E.coli Κ12ΔΗΐΔΐΓρ (pPLcMuHil 201) termelő törzs tenyésztésével elért emberi interleukin-2 mennyisége mindössze 5-10 % a teljes sejtfehérje tömegére számítva.
Az említett rekombináns plazmid-DNS és az ezt tartalmazó törzs számos hátránnyal rendelkezik, amelyek arra vezethetők vissza, hogy az IL-2 gén szabályozható expressziójához, amelyet a P^ promoter eredményez, vagy egy hőmérsékletérzékeny cl-represszor (clts857) gént tartalmazó jelenlevő plazmidra, vagy egy olyan befogadó törzsre van szükség, amely egy, a cl-gén mutáns allélját tartalmazó hiányos profágot tartalmaz. Mindez a befogadó törzsek körének szűkülését és a rekombináns plazmidok instabilitását eredményezi nagyobb léptékű termeléshez szükséges tenyésztés körülményei között, mivel az interleukin-2 gént tartalmazó plazmid és egy kompatibilis plazmid vagy a hiányos profág megfelelő területe között reCa-függő rekombináció következhet be.
Egy viszonylag nem hosszú SD-szekvencia alkalmazása a riboszóma kötőhely hibridszakaszának megalkotásához ezenkívül
• ·
- 4 nem teszi teljes mértékben lehetővé, hogy az E.coli transzlációs apparátusának potenciális teljesítménye realizálódjék, ami a termelősejtekben az emberi interleukin-2 viszonylag alacsonyabb szinten történő szintéziséhez vezet.
Mindez ipari méretekben történő tenyésztéskor a termelő törzs biomasszájában az interleukin-2-tartalom jelentős csökkenését eredményezheti, ami végül a fehérje kiválasztást megnehezíti és a végtermék kitermelését csökkenti .
A találmány célja egy olyan új rekombináns plazmid-DNS előállítása, amely az emberi interleukin-2 szintézisét kódolja, továbbá egy, az interleukin-2-t termelő nagy termelőképességű törzs kifejlesztése, amely az említett plazmid-DNS-t tartalmazza, és az interleukin-2-t magas kitermeléssel termeli.
A célt a pPR-IL2-19 rekombináns plazmid-DNS megalkotásával oldottuk meg, amely az interleukin-2-t kódolja, 3,85 kb hosszúságú, és a következő elemekből tevődik össze:
- egy, a pPR124B plazmidvektor BamHI-BglII fragmense, amely
3,4 kb hosszúságú, amely pPR40 és pML24 plazmidokból készült,
- egy, a pAA-1213-23B plazmid 0,45 kb hosszúságú Cfrl3-BglII fragmense, amely az 5,4 kb nagyságú pAA1213-23 plazmid Stul restrikciós helyének BglII restrikliós helyre történő cseréjével készült, amely utóbbi plazmid a pBR322 plazmidból készült, és egy ColEI-replikont, egy ampicillin rezisztencia gént és egy, az emberi interleukin-2-gén cDNS kópiáját tartalmazza, amelynek expresszióját egy promotor és az • ·
- 5 E.coli triptofán-operonjának SD-szekvenciája eredmé- nyezi, és a következő jellemzőkkel jellemezhető:
- egy replikációs bevezető szakaszt, ColEI-replikont, a lambda-fág clts857 hőmérsékletérzékeny represszor génjét, egy ampicillin rezisztencia gént, az fd-fág ^-független transzkripció-terminátorának tandemjét, egy
PpOp regulator területet, a lambda-fág cro-génje egy iniciáló ATG-kodonját és egy SD-szekvenciáját tartalmazza, amely az érett emberi interleukin-2-t kódolja,
- a PrOr regulátor terület és a cro-gén ATG kodon kapcsolása az interleukin-2 gén szekvenciával és az fd transzkripció terminátorokkal úgy történik, hogy egy,
51-. ..TAAGGAGGTTGTATGGCC...3' nukleotid-szekvenciájú riboszóma-kötőhely hibridszakaszt képezünk, amelyben TAAGGAGGT és ATG az SD szekvencia, illetve a cro-gén iniciáló kodonja, GCC az interleukin-2 első Ala-kodonja, és az interleukin-2-gén termináló kodonja után fekszik az fd-transzkripció ^-független terminátorainak tandemje,
- unikális Clal felismerőhelyet tartalmaz, ahol a Clal koordinátái a leolvasás kezdete (0), Xbal (^990), BglII (~1250), PstI (?v3070), és amelyet 1987. 01. 12-én az Összövetségi Antibiotikum Kutatóintézet Mikroorganizmusgyűjteményénél 1869 számon letétbe helyeztünk.
A rekombináns plazmid-DNS konstruálását a találmány értelmében úgy végezzük, hogy a pBR322 plazmidból alkotott,
5,4 kb nagyságú, ColEI-replikont, ampicillin rezisztencia gént, emberi interleukin-2 gén cDNS kópiáját tartalmazó « · pAA1213-23 plazmidot - amelyet az Stul restrikciós hely BglII restrikciós helyre történő cserélésével módosítottunk, és amelyben az interleukin-2 expresszióját az
E.coli triptofán-operon promotora és SD-szekvenciája eredményezi- Cfrl3 restrikciós enzimmel kezelünk, a kialakult egyszálú DNS molekula végeket E.coli DNS-polimeráz I Klenow fragmensével kiegészítjük, majd a pAA1213-23B Cfrl3 fragmensét egy interleukin-2 génnel agarőz gélen preparatív elektroforézis segítségével kiválasztjuk, és T4-fág DNS-ligáz segítségével pPR124B vektor molekulába integráljuk, amely utóbbi pPR40 és pML24 plazmidokból készült, amelyeket előzőleg BamHI restrikciós enzimmel hasítottunk, és a szakasz egyszálú végeit Sl-endonukleázzal eltávolítottuk, majd a kapott elegyet BglII restrikciós enzimmel kezeljük, és a DNS-molekulát T4 fág DNS ligázzal zárjuk, és a kapott elegygyel E.coli C6D0 sejteket transzformálunk, a transzformánsokat ampicillinnel kiegészített tápközegre oltjuk, és 28 °C-on, majd 42 °C-on csökkentett növekedési sebességgel szelektálva tenyésztjük, a kiválasztott kiónokból a pPR-IL2-19 plazmidot kiválasztjuk, amelyben a fragmensek egyesítésének helyességét úgy vizsgáljuk, hogy a DNS kiindulási szakaszának kérdéses helyén a BspRI restrikciós enzim felismerőhelyének korábban hiányzó szekvenciáját újra előállítjuk.
A találmány szerinti plazmidot az jellemzi, hogy a clts857 gén, a transzkripció bevezetésének regulátora, a lambda bakteriofág korai promoterétől kezdődően megtalálható benne, és az interleukin-2 génje expressziója a Pp-promoter kontrollja alatt található. Ez a körülmény teszi lehetővé, hogy egy, az interleukin-2-t kódoló plazmid és egy kompatibilis jelenlevő plazmid vagy egy hiányos profág potenciálisan recA-tól független rekombinációját megakadályozzuk. A találmány szerinti eljárás, amelynek során pPR-IL2-19 rekombináns plazmidot alkotunk úgy, hogy a lambda bakteriofág SD-szekvenciáját és cro-génjének AUG-kodonját az emberi interleukin-2 gén kódoló területével kapcsoljuk, lehetővé teszi, hogy az interleukin-2 gén riboszóma kötőhelyének hibridszakaszát optimális primer és térbeli szerkezettel állítsuk elő az 5'-végen.
A találmány tárgya továbbá egy, az emberi interleukin-2-t termelő törzs, E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) előállítása, amely a pPR-IL2-19 rekombináns plazmid DNS-t tartalmazza, oly módon, hogy Escherichia coli baktériumba bevezetjük a pPR-IL2-19 rekombináns plazmidot. A találmány szerinti eljárással előállított törzset 1987. 01.12-én az Összövetségi Antibiotikum Kutatóintéze Mikroorganizmusgyűjteményénél 1869 számon letétbe helyeztük. A találmány szerinti-törzs lehetővé teszi, hogy nagyipari méretek között végzett tenyésztés során az emberi interleukin-2-t stabilan termeljük, és a végtermékre nézve (8-10).107 ME/1 kitermelést érjünk el, ami a teljes sejt-fehérjére számítva 8-12 %.
A találmány értelmében előnyösen úgy járunk el, hogy a pPR-IL2-19 rekombináns plazmid-DNS-t több lépésben állítjuk elő.
Az 5,4 kb nagyságú, pBR322 plazmidból készített • *·
- 8 pAA1213-23 plazmidot, amely egy ColEI-replikont, egy ampicillin rezisztencia gént, egy, az interleukin-2 gén cDNS-kópiáját tartalmazza, amelynek expresszióját az E.coli triptofán-operonjának egy promotere és SD-szekvenciája eredményezi, úgy módosítjuk, hogy az Stul restrikciós enzim felismerőhelyet BglII felismerőhelyre cseréljük ki. így a pAA1213-23B plazmidot kapjuk, amelyet Cfrl3 restrikciós enzimmel kezelünk, és a kapott DNS-molekula egyszálú végeit E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmensével feltöltjük. Ezután a pAA1213-23B plazmid Cfrl3-fragmensét, amely az interleukin-2 egy génjét tartalmazza, könnyen olvadó agaróz gélen elektroforézissel elválasztjuk.
Ezután végrehajtjuk a pPR134B vektor plazmid konstruálását. Ehhez a pPR40 plazmid DNS-ében a BglII restrikciós enzim felismerőhelyet Bal31 exonukleázzal töröljük, így a pPRIOO plazmidot kapjuk, amelyben a BamHI felismerőhely közvetlenül a lambda-fág riboszóma kötőhelye után helyezkedik el, így az iniciáló AUG kodon területében a következő szekvenciát kapjuk:
AÜGGATCC ι______________________________ι
BamHI
Ezután a pPRIOO plazmid kisebbik Pstl-BamHI fragmensét és pML24 plazmid nagyobbik Pstl-BamHI fragmensével szokásos géntechnikai módszerekkel egyesítjük, így a pPR124 plazmidot kapjuk, amelybe egy oligonukleotid linker segítségével az Xbal felismerőhely helyére egy BglII felismerőhelyet iktatunk be, így kapjuk a pPR124B plazmidot.
·«
- 9 Ezután a pAA1213-23B plazmid Cfrl3 fragmensét egy interleukin-2 génnel T4-fág DNS-ligáz segítségével pPR124B vektor molekulába integráljuk, amelyet BamHI restrikciós enzimmel hasítottunk és a DNS egyszálu végeit Sl-endonukleázzal eltávolítottuk. Ezután a preparátumot BglII restrikciós enzimmel kezeljük, így a lineáris DNS molekula T4 DNS-ligázzal ciklizálható. Az előállított eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk, a transzformánsokat ampicillint tartalmazó tápközegre oltjuk, és 28 °C-on tenyésztjük, majd 42 °C-on tenyésztve csökkent növekedési képesség alapján szelektáljuk. Az így kiválasztott kiónokból a plazmid DNS-t, amelyet pPR-IL2-19-ként jelölünk, kiválasztjuk, amelyben a fragmensek egyesítésének helyességét úgy vizsgáljuk, hogy a DNS kiindulási területének illesztési helyénél levő BspRI felismerőhely korábban hiányzó szekvenciáját helyreállítjuk.
Az E.coli VNIIGENETIKA VL903 (pPR-IL2-19) törzset a találmány értelmében úgy állítjuk elő, hoov Escherichia coli befogadó törzset pPR-IL2-19 rekombináns plazmid-DNS-sel transzformálunk. Befogadó törzsként E.coli C600, E.coli VNIIGENETIKA VL-9O3, vagy az E.coli K12 más származéka alkalmazható. Az E.coli VNIIGENETIKA VL-903 törzset a Szövetségi Genetikai Kutatóintézet Ipari Mikroorganizmusgyűjteményénél 3546 számon letétbe helyeztük. A transzformálás után a rekombináns kiónokat ampicillint tartalmazó tápközegen 28 °C-on tenyésztve választjuk ki.
·«·
- 10 A találmány szerinti eljárással előállított törzsre jellemző, hogy az emberi interleukin-2-t P^ promoter depressziója mellett szintetizálja, ampicillin rezisztencia gént tartalmaz, és 42 °C-on csökkent növekedési sebességet mutat.
A találmány szerinti eljárással előállított törzs lehetővé teszi, hogy nagyipari körülmények között végzett tenyésztéssel az emberi interleukin-2 stabilan felhalmozódjék, és az E.coli VNIIGENETIKA VL-903 (pPR-IL2-19) sejtekben magasabb szinten szintetizálodjék, ami (8-10).107 egység/1 koncentrációt elérheti, ami a teljes sejtfehérjére számítva
8-12 %.
Az E.coli VNIIGENETIKA VL903 (pPR-IL2-19) törzs a következő tulajdonságokkal jellemezhető.
Morfológiai tulajdonságok: egyenes, pálcika formájú, gyengén mozgó sejtek, fonalas képletet képeznek, Gram-nega tívok, spórát nem tartalmaznak, méretük 3-5/um.
Tenyésztési tulajdonságok: a sejtek jól növekednek szilárd és folyékony egyszerű szintetikus, félszintetikus és komplex tápközegeken. Agárral szilárdított Hottinger-bouiIlonon és l.-bouiIlonon tenyésztve sima, kerek, gyengén matt nyálkás kolóniákat képeznek. L-bouillon vagy M9 típusú folyékony tápközegben tenyésztve kazaminsavakkal homogén szuszpenziót képeznek.
Fiziológiai-biológiai tulajdonságok: a sejtek 5-40 °C-on (optimum 37 °C) és 6,7-7,5 pH-nál növekszenek. Szénforrás ként szénhidrogéneket (például szacharózt) és aminosavakat alkalmazunk. A sejtek auxotrófiát mutatnak metioninra nézve.
• ·
• «
Nitrogénforrásként ammóniumsókat, valamint szerves anyagokat, például peptont, triptont, élesztőkivonatot és aminosavakat alkalmazhatunk.
Antibiotikum elleni rezisztencia: a törzs rezisztens ampicillin ellen, legfeljebb 100 mg/1 koncentrációban, folyékony és agar-tápközegen tenyésztve.
A plazmid stabilitása: agar táptalajon tárolva, sorozat átoltások során és folyékony tápközegen szubmerz kultúrában tenyésztve a plazmid nem vész el és nem alakul át.
A találmány szerinti megoldást a következő példákkal és ábrákkal szemléltetjük.
1. ábra: a pPR-IL2-19 rekombináns plazmid genetikai térképe.
2. ábra: a pPR-112-19 rekombináns plazmid találmány szerinti előállításának vázlata.
1. példa
A pPR-II.2-19 rekombináns plazmidot a találmány értelmében több lépésben állítjuk elő. Először a pBR124B vektor plazmidot állítjuk elő.
3,ug pPR40 plazmid-DNS-t BglII restrikciós enzimmel hasítunk 60/ul 1. restrikciós pufferoldatban, amely 10 mmól/1 tris-HCl-t (pH=8,0), 6 mmól/1 MgCl2~t, 6 mmól/1 2-merkapto-etanolt, 150 mmól/1 NaCl-t tartalmaz. A DNS-t kétszeres
feloldjuk. A DNS Bal31 exonukleázzal történő kezelését 3 perc
NaCl-t, 60 mmól/1 CaCl2-t, 60 mmól/1 MgCl2~t, 100 mmól/1 tris-HCl-t CpH=8,0) és 5 mmól/1 etilén-diamin-tetraecetsavat • · • · ·· tartalmaz. A DNS-t kétszeres térfogatú etanollal kicsapjuk. A csapadékot 10/ul vízben feloldjuk. A BamHI restrikciós enzimmel végzett kezelést 30/Ul térfogatú
1. restrikciós pufferoldatban végezzük. A DNS egyszálú 3'-végének helyreállítását E.coli polimeráz I Klenow-fragmensével 20/ul térfogatú mintában végezzük, amely 10 mmól/1 tris-HCl-t (pH=8,0), 10 mmól/1 MgC^-t, 2/Ug DNS-preparátumot, 30-30/umól/l dezoxi-ribonukleotid-trifoszfátot tartalmaz. A reakcióelegyből 5 egység DNS-fermentumot etanollal kicsapunk, és 100/Ul vízben feloldjuk. A linearizált plazmid-DNS újraegyesítését 16 °C-on 12 óra alatt T4-fág DNS ligázzal ligáló pufferoldatban végezzük, amely 60 mmól/1 tris-HCl-t (pH=7,6), 10 mmól/1 MgC^-t? 10 mmól/1 merkapto-etanolt, 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot, valamint l^ug DNS-t tartalmaz. Az előállított eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk, a transzformálás hatékonysága 5.10^ kolónia a natív pPR40 plazmid 1/ug-jára számítva. Az ampicillinnel (100 g/ml) szemben rezisztens kiónokat kiválogatjuk, és ezekből a plazid-DNS-t módosított Birnboim-Doly-módszerrel kiválasztjuk, és restrikciós analízisnek vetjük alá. Eredményül a pPRIOO plazmidot kapjuk, amely egy unikális BamHI hasítóhelyet tartalmaz. Ezután konstruáljuk a pPR124 plazmidot. Ehhez 2/ug pML24 plazmid-DNS-t BamHI és PstI restrikciós enzimekkel hasítunk 40/ul 1. restrikciós pufferoldatban, és T4-fág DNS-ligáz segítségével, 0 °C-on a pPRIOO plazmid BamHI és PstI restrikciós enzimekkel végzett hidrolízisével kapott fragmensekkel egyesítjük. A kapott DNS-preparátummal E.coli C600 ·» ·· ·· sejteket transzformálunk, a transzformánsokat ampicillint tartalmazó táptalajon végzett tenyésztéssel, majd 42 °C-on 300/ug/ml kloramfenikolt tartalmazó táptalajon a Cmr-klónok szelektálásával végezzük. Az így kiválogatott kiónokból a plazmid-DNS-t kiválasztjuk, és restrikciós analízissel vizsgáljuk. Eredményül a pPR124 plazmidot kapjuk, amely egy BamHI felismerőhelyet tartalmaz.
Ezután 3yug pPR124 plazmid-DNS-t Xbal restrikciós enzimmel 70/Ul pufferoldatban hasítunk, amely 10 mmól/1 tris-HCl-t (pH=7,9), 6 mmól/1 MgC^-t, 6 mmól/1 2-merkapto-etanolt és 150 mmól/1 NaCl-t tartalmaz. A DNS-t kétszeres mennyiségű etanollal kicsapjuk. A csapadékot 15/ul vízben feloldjuk. A DNS egyszálú 3'-végeit E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmense segítségével 20/ul térfogatú mintában végezzük, amely 10 mmól/1 tris-HCl-t (pH=8,0), 10/Umól/l MgC^-t, 2/ug DNS-preparátumot és 30-30/umól/l dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot és 5 egység fermentumot tartalmaz. A DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, és 100/Ul vízben feloldjuk. A linearizált plazmid-DNS Bgl-linkerrel végzett egyesítését 16 °C-on, 12 óra hosszat T4-fág DNS-ligáz segítségével ligáló pufferben végezzük, amely 60 mmól/1 tris-HCl-t (pH=7,6), 10 mmól/1 MgC^-t, 10 mmól/1 2-merkapto-etanolt és 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfátot, továbbá 2^ug plazmid-DNS-t és 0,5/Ug linkért tartalmaz. Ligálás után a DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, feloldjuk, és ·· ·· ·· -**- » ·· ····· • ··· .·*· ••ϊ· • · · ·· · · · · ···· ·· ·· ··
- 14 fermentatív hidrolízisnek vetjük alá BglII restrikciós enzim segítségével 40/ul térfogatú próbában, amely 2. restrikciós pufferoldatot tartalmaz (6 mmól/1 tris-HCl, pH=7,6) 6 mmól/1 MgCl^, 6 mmól/1 2-merkapto-etanol, 50 mmól/1 NaCl). A DNS-t etanollal újra kicsapjuk, feloldjuk, és ciklizáljuk, amelyhez 1/ug plazmid-DNS-preparátumot 240/Ul ligáló pufferoldatban T4-fág DNS-ligázzal kezelünk. Az előállított eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk.
A transzformáció hatékonysága legfeljebb 5.10^ kolónia a natív pPR124 plazmid l/ug-jára számítva. Azokat a kiónokat, amelyek ampicillinnel (100/ug/ml) szemben rezisztensek, kiválogatjuk, és belőlük a plazmid-DNS-t kiválasztjuk, és restrikciós analízisnek vetjük alá. Eredményül a pPR124B plazmidot kapjuk, amely a kiindulási pPR124 vektormolekulától abban különbözik, hogy egy unikális BglII hasítóhelyet tartalmaz az Xbal felismerőhely helyett (2.ábra).
Ezután 3/ug pPR124B plazmidot BamHl restrikciós enzimmel 12/U1 térfogatú 1. restrikciós puffért tartalmazó mintában hasítunk. A reakciót fenolos proteinmentesítéssel és a nukleinsavak etanolos kicsapásával leállítjuk. A csapadékot 20/Ul vízben feloldjuk. A DNS restrikciós enzimmel történt hasításakor képződött egyszálú végeket Sí endonukleázzal eltávolítjuk. Ehhez a DNS-t 30 egység Sl-endonukleázzal 50/Ul térfogatú mintában, amely 30 mmól/1 CH^COONa-t (pH=4,4), 4,5 mmól/1 ZnSO^-t, 250 mmól/1 NaCl-t tartalmaz, 20 percig 20 °C-on hídrólizáljuk. A reakciót fenollal leállít• · • · ·· .· · · · · ···· ···· ·· ·· ··
- 15 juk, és a DNS-t etanollal kicsapjuk. A csapadékot 15/U1 vízben feloldjuk.
Ezután a pAA1213-23B plazmidot kapjuk. Ehhez
3/ug 5,4 kb nagyságú pAA1213-23 plazmidot, amely a pBR322 plazmidból készült, és amely ColEI-replikont, egy ampicillin rezisztencia gént, és az emberi interleukin-2 egy génje egy cDNS kópiáját tartalmazza, amelynek expresszióját az E.coli triptofán-operon egy promotere és SD-szekvenciája eredményez, 10 egység Stul restrikciós enzimmel 30/ul mintában hasítunk, amely 1. restrikciós puffért tartalmaz (10 mmól/1 tris-HCl (pH=7,9), 6 mmól/1 MgCl2, 6 mmól/1
2-merkapto-etanol és 150 mmól/1 NaCl), ezután a DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk. A csapadékot 20/ul vízben centrifugálással elválasztjuk. A linearizált plazmid-DNS Bg 111-linkerrel történő újraegyesítését 20 egység T4-fág DNS-ligáz segítségével 30/ul térfogatú mintában végezzük, amely ligáló puffért (60 mmól/1 tris-HCl (pH=7,6), 10 mmól/1 MgCl2, 10 mmól/1 2-merkapto-etanol és 0,4 mmól/1 adenozin-trifoszfát), 2^ug plazmid-DNS-t és 0,5/ug linkért tartalmaz. Ligálás után a DNS-t a reakcióelegyből etanollal kicsapjuk, feloldjuk, és BglII-vel fermentatív hidrolízisnek vetjük alá egy 40/Ul térfogatú mintában, amely 2. restrikciós pufferoldatot (6 mmól/1 tris-HCl (pH=7,7), 6 mmól/1 MgCl2, 6 mmól/1 2-merkapto-etanol és 50 mmól/1 NaCl) tartalmaz.
A DNS-t újból kicsapjuk etanollal, feloldjuk, és a DNS-molekulát ciklizáljuk. Ehhez 1/ug plazmid-DNS preparátumot 240/Ul ligáló pufferben 2 egység T4-fág DNS-ligázzal kezelünk.
·· ·· *· ·· · a ·· · · · ♦ · * - ··· ··· ·♦ · · ·* í · ♦ · · ···* «··· ·· ·· ·· *
- 16 A kapott eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk.
A transzformálás hatékonysága 5.10^ kolónia a natív pAA1213-23 plazmid 1/ug-jára számítva. Az ampicillinnel (100/ug/ml) szemben rezisztens kiónokat kiválogatjuk, ezekből a plazmid-DNS-t módosított Birnboim-Doly-módszerrel kiválasztjuk és restrikciós analízisnek vetjük alá. Az így kapott pAA1213-23B plazmid a kiindulási pAA1213-23 rekombináns molekulához képest egy unikális BglII hasítóhelyet tartalmaz az Stul felismerőhely helyett (2. ábra).
30/ug pAA1213-23B plazmid-DNS-t Cfrl3 restrikciós enzimmel (200 aktivitásegység) hasítunk 100/Ul térfogatú mintában, amely 1. restrikciós puffért tartalmaz. A fermentatív hidrolízis termékeit 1,1 %-os könnyen olvadó agaróz gélen tris-acetát-pufférrendszerben 5 V/cm térerősség mellett elektroforézisnek vetjük alá. A 750 kb hosszú interleukin-2-gént tartalmazó DNS-fragmensek gélzónáit kivágjuk, és a DNS-t eluáljuk. A DNS egyszálú végeinek E.coli DNS-polimeráz Klenow fragmensével történő helyreállításához a gélből kiválasztott fragmenst 20/Ul mintában kezeljük, amely 10 mmól/1 tris-HCl-t (pH=8,0), 10 mmól/1 MgCl?-!, 30-30/umól/l dezoxi-ribonukleozid-trifoszfátot tartalmaz. A reakciót melegítéssel leállítjuk, a DNS-t etanollal kicsapjuk, és 20/Ul vízben feloldjuk.
Ezután az előbb készített linearizált pBR134B plazmid preparátumot a pAA1213-23B plazmid egy fragmensével egyesítjük. Ehhez 1/ug plazmid-DNS-t és 2/ug fragmenst T4-fág ··
- 17 DNS-ligázzal egy ligáié pufferoldatban 30/ul reakcióelegyben kezelünk. A DNS-t kicsapjuk, 20/Ul vízben feloldjuk, majd a preparátumot BglII restrikciós enzimmel a fenti módon kezelünk, a DNS-t ismét kicsapjuk etanollal , felold juk , és a linearizált DNS-molekulát T4-fág DNS-ligázzal ciklizáljuk 300/Ul reakcióelegyben. Az előállított preparátumot E.coli C600 sejtek transzformálására alkalmazzuk, majd a transzformánsokat ampicillint tartalmazó táptalajon 24 óra hosszat 28 °C-on tenyésztjük. A képződött transzformánsokból azokat a variánsokat válogatjuk ki, amelyek 42 °C-on csökkent növekedési képességet mutatnak. A kiónokból a plazmid-DNS-t a fenti módon kiválasztjuk, és restrikciós analízisnek vetjük alá. A kapott pPR-112-19 plazmidban (2. ábra) a DNS-szakaszok illesztési helyénél, amely a lambda-fág cro-génje első kodonját és az emberi interleukin-2 Ala-kodonját kódolják, egy BspRI endonukleáz hasítóhely képződik.
2. példa
Az emberi interleukin-2-t termelő E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) törzset a következőképpen állítjuk elő. Az emberi interleukin-2 szintézisét kódoló pPR-IL2-19 plazmidot a befogadó E.coli VNIIGENETIKA VL903 törzsbe transzformáljuk, amelyet az Osszövetségi Genetikai Kutatóintézet ipari mikroorganizmusok gyűjteményénél VKLM V-3546 számon letétbe helyeztünk. Az E.coli VNIIGENETIKA VL903 sejtek transzformációjának hatékonysága 10^ klón 1/ug pPR-II.2-19 plazmidra vonatkoztatva. A transzformánsokat 24 óra hosszat 28 °C-on ampicillint (100/ug/ml) tartalmazó táptalajon te · aa • a .· r· ··«« ·<
··· nyésztve szétválogatjuk. A kiválogatott kiónokból a plazmid-DNS-t kiválasztjuk, és pPR-II.2-19 preparátummal való azonosságát restrikciós analízissel igazoljuk.
Így az emberi interleukin-2-t termelő E.coli VNIIGENETIKA
VI.903 (pPR-II.2-19) törzset kapjuk.
3. példa
Az E.coli VNIIGENETIKA VI.903 (pPR-II_2-19) törzset óra hosszat 28 °C-on ferde agaros Hottinger-táptalajón tenyésztjük, amely 50/ug/ml ampicillint tartalmaz. A ferde felületen képződött biomasszát alkalmazzuk inokulumként.
Ehhez a sejteket egy 750 ml-es Erlenmeyer-lombikba visszük át, amely 100 ml, 100/ug/ml ampicillint tartalmazó Hottinger-tápközeget tartalmaz, és 28 °C-on, 6 óra hosszat 240 ford/perc sebességgel rázatva tenyésztjük. Az inokulum optikai sűrűsége
1.5- 2,5 egység.
A fermentálást pH-, hőmérséklet-, levegőztetés- és keverési sebesség-szabályozóval ellátott rendszerben végezzük. A fermentáláshoz 10 g/1 glükózt és 100/ug/ml ampicillint tartalmazó Hottinger-tápközeget alkalmazunk. Az inokulumot
5-10 tömeg% mennyiségben alkalmazzuk. A tenyésztést
6.6- 6,8 pH-nál végezzük, ezt az értéket ammónium-hidroxid adagolásával állandóan tartjuk. A fermentáció első részét 28 °C-on 550 nm-nél 3,5 optikai sűrűségig folytatjuk, majd termikusán indukálunk úgy, hogy a hőmérsékletet 5 percig 42 és 45 °C közé emeljük. Ezután a fermentálást 2 óra hosszat folytatjuk.
Az eljárás befejezése után az emberi interleukin-2 aktivitás megállapítására a sejteket 1 ml tenyészetből ·* ·· ·* * ♦ ·· • · ···« ·· * ·» centrifugálással kicsapjuk, a csapadékot 20 °C-on 40 perc alatt 1 ml 8 mól/l-es guanidin-klorid-oldatban újra szuszpendáljuk. Ezután a csapadékot újra centrifugáljuk, a felülűszót dekantáljuk, és aktivitását meghatározzuk. A kapott interleukin-2 biológiai aktivitása (8-10).107 ME/1.
A szintetizált emberi interleukin-2 teljes sejtfehérjére vonatkoztatott arányának megállapítására a sejteket 1 ml tenyészetből lecentrifugáljuk, és a fenti módon kezeljük. A preparátumot 15 %-os poliakrilamid gélen 0,1 % nátrium-dodecil-szulfát jelenlétében elektroforézisnek vetjük alá. A gélen elválasztott fehérjéket standard módszerrel Kumassi R-250 oldattal (Serva, NSzK) megfestjük. A zónában található fehérjék kvantitatív meghatározására a megfestett gélt denzitométerrel letapogatjuk. A sejtekben szintetizált érett emberi interleukin-2-nek megfelelő zónák azonosítását a jelző fehérjékkel az elektroforetikus mozgékonyság alapján történő összehasonlítás alapján, a fehérjék nitrocellulóz szűrő blotting útján történő elválasztásával és az interleukin-zónák olyan oldatokkal történő kifejlesztésével végezzük, amelyek torma-peroxidázzal konjugált, interleukin-2 és anti-egér-nyúl-antitest ellei monoklonális egér antitestet tartalmaznak. A megfelelő festési eljárás után az interleukin-2 zóna barna csík formájában fejlődik ki a nitrocellulóz szűrő nem-színezett háttere előtt. A sejtekben az interleukin-2 szintetikus génjének fehérjeterméke legfeljebb 12 %, a teljes sejtfehérjére számítva.
·· ·· .··. .··. í e . ··. ··: .··. :.ί· ··»· ·· - ·♦ ··
- 20 Ipari alkalmazhatóság
A találmány szerinti eljárással előállított, emberi interleukin-2-t kódoló rekombináns pPR-IL2-19 plazmid nagy aktivitású, emberi interleukin-2-t termelő törzsek előállítására alkalmazható. A találmány szerinti eljárással előállított, emberi interleukin-2-t termelő E.coli VNIIGENETIKA VL903 (pPR-IL-19) törzs a mikrobiológiai és gyógyszeriparban alkalmazható emberi interleukin-2 előállítására, amely a gyógyászatban felhasználható.
Claims (2)
- Szabadalmi igénypontok1. Eljárás emberi interleukin-2-t kódoló pPR-II.2-19 rekombináns plazmid-DNS előállítására, azzal jellemezve, hogy a pBR322 plazmidból alkotott, 5,4 kb méretű, ColEI replikont, ampicillin rezisztencia gént, és az emberi interleukin-2 génje cDNS kópiáját tartalmazó pAA1213-23 plazmidot, amely utóbbi gén expresszióját egy promoter és az E.coli triptofánoperonjának SD-szekvenciája eredményezi, az Stul restrikciós felismerőhely BglII restrikciós felismerő helyre történő cseréjével módosítjuk, a kapott pAA1213-23B plazmidot Cfr-13 restrikciós enzimmel kezeljük, a kapott DNS-molekula egyszálű végeit E.coli DNS-polimeráz I Klenow-fragmenssel feltöltjük, a pAA1213-23B plazmid kapott Cfr-13 fragmenséből az interleukin-2 gént preparatív elektroforézissel agaróz gélen kiválasztjuk, és T4-fág DNS-ligáz segítségével pPR40 és pML24 plazmidokból alkotott pPR124B vektormolekulába integráljuk, amelyet előzőleg BamHI enzimmel hasítunk és a DNS egyszálű végeit Sl-endonukleáz emésztéssel eltávolítjuk, majd a kapott reakcióelegyet BglII restrikciós enzimmel kezeljük, és a DNS molekulákat T4-fág DNS-ligázzal cirkularizáljuk, a kapott eleggyel E.coli C600 sejteket transzformálunk, a transzformánsokat ampicillint tartalmazó tápközegre oltjuk, és 28 °C-on tenyésztjük, majd 42 °C-on mutatott csökkent növekedési sebesség alapján szelektáljuk, a kiválogatott klónokból a pPR-II.2-19 plazmidot ·· ·· ·· ·· ϊ * « ··· ··· ·· * * • · · · · · ♦··· ···· ·· ·· ·· · kiválasztjuk, és a fragmensek helyes egyesítését a kiindulási DNS szakaszok kapcsolódási helyénél a korábban hiányzó BspRL restrikciós felismerőhely helyreállításával igazoljuk.
- 2. Eljárás emberi interleukin-2-t termelő E.coli VNIIGENETIKA VL903 (pPR-II.2-19) törzs előállítására, azzal jellemezve , hogy E.coli törzsbe az 1. igénypont szerinti eljárással előállított pPR-IL2-19 rekombináns plazmidot géntechnikai úton bevezetjük.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874191353A SU1703693A1 (ru) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ - @ 2-19, кодирующа синтез интерлейкина-2 человека, способ ее конструировани @ штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент интерлейкина-2 человека |
| PCT/SU1988/000032 WO1988005818A1 (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HUT50873A true HUT50873A (en) | 1990-03-28 |
Family
ID=21284358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU881691A HUT50873A (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01502639A (hu) |
| CH (1) | CH676997A5 (hu) |
| DE (1) | DE3890052T1 (hu) |
| FI (1) | FI884557A (hu) |
| GB (1) | GB2210373A (hu) |
| HU (1) | HUT50873A (hu) |
| NL (1) | NL8820102A (hu) |
| SE (1) | SE8803566D0 (hu) |
| SU (1) | SU1703693A1 (hu) |
| WO (1) | WO1988005818A1 (hu) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6068993A (en) | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58116498A (ja) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Ｉｌ‐２をコードする新規伝令ｒｎａの製造法 |
| JPH0646957B2 (ja) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | インタ−ロイキン−２の製造方法 |
| WO1986006410A1 (en) * | 1985-04-30 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for increasing yield of interleukin-2 |
-
1987
- 1987-02-09 SU SU874191353A patent/SU1703693A1/ru active
-
1988
- 1988-02-08 JP JP88502088A patent/JPH01502639A/ja active Pending
- 1988-02-08 NL NL8820102A patent/NL8820102A/nl not_active Application Discontinuation
- 1988-02-08 WO PCT/SU1988/000032 patent/WO1988005818A1/ru active Application Filing
- 1988-02-08 HU HU881691A patent/HUT50873A/hu unknown
- 1988-02-08 CH CH381688A patent/CH676997A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-08 DE DE883890052T patent/DE3890052T1/de not_active Withdrawn
- 1988-10-04 FI FI884557A patent/FI884557A/fi not_active Application Discontinuation
- 1988-10-07 SE SE8803566A patent/SE8803566D0/xx not_active Application Discontinuation
- 1988-10-10 GB GB8823729A patent/GB2210373A/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI884557A0 (fi) | 1988-10-04 |
| JPH01502639A (ja) | 1989-09-14 |
| FI884557A (fi) | 1988-10-04 |
| CH676997A5 (hu) | 1991-03-28 |
| DE3890052T1 (de) | 1989-04-13 |
| GB2210373A (en) | 1989-06-07 |
| SE8803566L (sv) | 1988-10-07 |
| NL8820102A (nl) | 1989-01-02 |
| GB8823729D0 (en) | 1988-12-07 |
| WO1988005818A1 (en) | 1988-08-11 |
| SU1703693A1 (ru) | 1992-01-07 |
| SE8803566D0 (sv) | 1988-10-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR900005776B1 (ko) | 인터페론의 제조방법 | |
| EP0136489B1 (en) | Analogs of human interleukin ii and their preparation | |
| US4758512A (en) | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields | |
| US4914027A (en) | Process for the microbiological preparation of human serum albumin | |
| NZ202190A (en) | Human immune interferon : production by recombinant dna technology | |
| JPH0838176A (ja) | 改良組換ｄｎａ分子 | |
| JPH0773499B2 (ja) | 組換えｄｎａ発現ベクタ−およびペニシリウム・クリソゲナムのイソペニシリンｎシンセタ−ゼをコ−ドしているｄｎａ化合物 | |
| HUT57263A (en) | Process for producing bacterial vectors | |
| AU743599B2 (en) | High expression (escherichia coli) expression vector | |
| US4795706A (en) | Novel expression control sequences | |
| US7868148B2 (en) | Plasmids, their derivatives and fragments, their methods of manufacture and application | |
| EP0109150B1 (en) | Plasmids with conditional uncontrolled replication behaviour | |
| SU1479005A3 (ru) | Способ получени интерлейкина-2 человека | |
| HUT50873A (en) | Process for producing recombinant plasmid dna encoding human interleukin-2 and escherichia coli comprising same | |
| JP3096469B2 (ja) | Ｄｎａおよびその用途 | |
| EP0048497A2 (en) | DNA transducing vector and microorganism containing it | |
| JP2515488B2 (ja) | ポリペプチドの製造方法 | |
| EP0121569A1 (en) | Novel vector | |
| HUT50871A (en) | Process for producing recombinant plasmid dna encoding human fibroblast-beta 1-interferon and escherichia coli comprising same | |
| SU1703690A1 (ru) | Рекомбинантна плазмидна ДНК @ 22, кодирующа синтез интерферона @ -11 человека, и штамм бактерии РSеUDомоNаS Sp. -продуцент- интерферона @ -11 человека | |
| RU2271392C1 (ru) | РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК pFGM17, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ БАКТЕРИЙ Escherichia coli BL21(DE3)/pFGM17 - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА ГРАНУЛОЦИТАРНО-МАКРОФАГАЛЬНОГО КОЛОНИЕСТИМУЛИРУЮЩЕГО ФАКТОРА ЧЕЛОВЕКА | |
| RU2045575C1 (ru) | Рекомбинатная плазмидная днк ppr - tgatg - hil - 1 beta - tsr, обеспечивающая синтез рекомбинантного интерлейкина-1 и штамм escherichia coli - продуцент рекомбинантного интерлейкина-1 бета человека | |
| Zh et al. | Design and study on characteristics of auto-and smoothly regulated genetic element O3/PlacUV5/Olac→ lacI | |
| Ruppen et al. | Efficient expression of human growth hormone in Bacillus subtilis | |
| JPH0695940B2 (ja) | 枯草菌およびその形成方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFA9 | Temporary prot. cancelled due to abandonment |