NL8820102A

NL8820102A - Recombinant plasmide-dna ppr-il2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, werkwijze voor de bereiding daarvan en bacteriestam escherichia coli vniigenetika vl 903 (ppr-il2-19) die menselijk interleukine-2 produceert en het plasmide-dna bevat.

Info

Publication number: NL8820102A
Application number: NL8820102A
Authority: NL
Original assignee: Vnii Genetiki Selektsii Promy
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-08
Publication date: 1989-01-02
Also published as: SE8803566L; GB2210373A; FI884557A; JPH01502639A; FI884557A0; SE8803566D0; WO1988005818A1; GB8823729D0; HUT50873A; SU1703693A1; DE3890052T1; CH676997A5

Description

«•V· ^ /¾ , 88 20 1 0 2-

Recombinant plasmide—DNA pPR—IL2—19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, werkwijze voor de bereiding daarvan en bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk interleukine-2 produceert en het plasmide-DNA bevat» 5

Aanvraagsters noemen als uitvinders: I. Vladimir Georgievich Debabov, 10 2. Elmar Yanovich Gren, 3. Jury Ivanovich Kozlov, 4. Sergei Vladimirovich Mashko, 5. Alexandr Yakovlevich Strongin, 6. Viktor Emilievich Sterkin, 15 7. Vitaly Lvovich Jurin, 8. Sergei Viktorovich Kostrov, 9. Alexandr Jurievich Tsimanis, 10. Andris Yanovich Avot, II. Nadezhda Viktotovna Romanchikova, 20 12. Alexandr Ivanovich Kosikov, 13. Maxim Eduardovich Trukhan, 14. Andrei Vladimirovich Mochulsky, 15. Tatyana Veniaminovna Chernovskaya, 16. Elena Alexeevna Nosovskaya, 25 17. Marina Alexeevna Skvortsova 18. Svetlana Mendeleevna Mazel.

Gebied van de uitvinding 30 De uitvinding ligt op het gebied van de genetische techniek en heeft in het bijzonder betrekking op een nieuw recombinant plasmide-DNA pPR-IL2-19 dat de synthese van menselijke interleukine-2 codeert, op een werkwijze voor de bereiding daarvan en op een bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk inter-35 leukine-2 produceert en het DNA bevat.

Stand van de techniek

Het natuurlijke menselijke interleukine-2 ofwel een factor voor de groei van T-cellen is een glycoproteine met een molecuulmassa van de 40 polypeptideketen van ongeveer 15.000 Dalton en het wordt door T-cellen .8820102 2 geproduceerd wanneer zij met leptine of een overeenkomstig antigeen worden geactiveerd. Interleukine-2 is een complex werkende immunomodu— lator en in het bijzonder stimuleert het een afweerreactie als gevolg van activering van T-lymfocyten waarbij het de mitogenese van thymocy-5 ten versterkt, de aanzet geeft tot een cytotoxische werking van T-cel-len en dergelijke. Interleukine-2 heeft derhalve een grote betekenis voor de behandeling van immunologische verstoringen zoals kwaadaardige degeneraties, bacteriële en virale infecties, ziekten die verband houden met afweerdeficientie, autoimmuunziekten en dergelijke. Recht-10 streeks uit menselijk serum of uit een celcultuur van de Yurkat-lijn gewonnen natuurlijk interleukine-2 is slechts in zeer beperkte hoeveelheden beschikbaar die onvoldoende zijn voor het bestuderen van de eigenschappen en de klinische mogelijkheden daarvan. Een alternatieve bron van interleukine-2 kan worden gevormd door stammen van microörga-15 nismen die worden verkregen door middel van genetische technieken en die recombinante plasmiden dragen met het gen van interleukine-2 en een doeltreffende expressie van dit gen bewerkstelligen.

Bekend zijn recombinante plasmide-DNA’s die menselijk interleukine-2 coderen zoals een recombinant plasmide-DNA pPLcMuHil 201 en de 20 stam E. coli Κ12Δ ΗΙΔ trp (pPLcMuHil 201) die dit bevatten (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J.,

Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Res·, 11, 4307-4323).

In dit recombinante DNA-molecuul wordt de transcriptie van het gen van interleukine-2 gestuurd door middel van een regeleenheid P^O^ 25 van een bacteriofaag λ en de start van de vertaling van het eiwitpro-dukt van het gen komt tot stand door constructie van een hybride gebied voor het binden van ribosomen op basis van een SD-sequentie van de faag Mu. De maximale opbrengst van menselijk interleukine-2 die wordt verkregen door het kweken van de producentstam E. coli K12 Δ Hl Δ trp 30 (pPLcMuHil 201) is 5 tot 10% van de totale hoeveelheid celeiwit.

De hierboven genoemde recombinante plasmide-DNA’s en de stam die deze bevatten hebben een aantal nadelen die het gevolg zijn van het feit dat de gestuurde expressie van het gen IL2 door de P^promotor hetzij een extra aanwezig plasmide met het gen van een temperatuurge-35 voelige cl repressor (clts857), hetzij het gebruik van een stam die een defectieve profaag met een mutantallel cl als recipient, vereist. Dit resulteert in een beperkt gebied van stammen van ontvangers en in een potentiële instabiliteit van recombinante plasmiden onder kweekomstan-digheden bij massaproduktie als gevolg van een re-CA-afhankelijke re-40 combinatie tussen het plasmide dat een gen van interleukine-2 bevat met . 882 0102 3 een verenigbaar plasmide of met overeenkomstige gebieden van een defectieve profaag.

Bovendien wordt door het gebruik van de betrekkelijk korte SD-sequentie voor het tot stand brengen van een hybride gebied voor het 5 binden van ribosomen het potentiële vermogen van het translatieapparaat van E. coli niet volledig benut, met als gevolg een betrekkelijk laag niveau van de synthese van menselijk interleukine-2 in cellen van de producentstam.

Dit alles kan leiden tot een aanzienlijke verlaging van de hoe-10 veelheid interleukine-2 in een biomassa van de producentstam bij kweken daarvan op grote schaal, wat uiteindelijk het winnen van een zuiver eiwit compliceert en de opbrengst aan gewenst produkt verlaagt.

Openbaring van de uitvinding 15 Het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 dat de synthese van men selijk interleukine-2 codeert, een werkwijze voor de bereiding daarvan en de bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-l9) dat dit DNA bevat zijn nieuw en uit de literatuur tot nu toe onbekend.

De uitvinding is gericht op het verschaffen van een nieuw recombi-20 nant plasmide-DNA dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, op een werkwijze voor het bereiden daarvan en op een zeer productieve stam voor interleukine-2 die dit DNA bevat en die interleukine-2 in hoge opbrengst produceert.

Dit doel wordt bereikt doordat het recombinante plasmide-DNA 25 pPR-IL2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, een omvang van 3850 baseparen heeft en bestaat uit de volgende eenheden: - een BamHI - Bgl II-fragment van 3400 b.p. van het vectorplasmi-de pPRI124B dat wordt geproduceerd op basis van pPR40 en pML24; - een Cfrl3 - Bgl II-fragment van 450 b.p. van het plasmide PAA-30 1213-23B dat wordt geproduceerd door vervanging van het restrictiege- bied voor Stul door het restrictiegebied voor Bgl II in het plasmide pAAl213-23 ter grootte van 5400 b.p., dat is geconstrueerd op basis van de plasmide pBR-322 en dat het ColEI-replicon, een stabiliteitsgen (resistentiegen) voor ampicilline en een ^DuA-copie van het gen van 35 menselijk interleukine-2 bevat, waarvan de expressie wordt bewerkstelligd door een promotor en een SD-sequentie van het tryptofaan-operon van E. coli en dat de volgende kenmerken heeft: - het bevat een startgebied voor de replicatie van ColEI-repli-con, een gen van een temperatuurgevoelige repressor clts857 van de faag 40 A, een resistentiegen voor ampicilline, een span van P~onafhankelij- .8820102 4 ke terminators van de transcriptie van de faag fd, een regelgebied PR0R» SD-sequentie en ATG-startcodon van een cro-gen van de faag X dat de sequentie van rijp menselijk interleukine-2 codeert; - combinatie van het regelgebied %°R en ATG-codon van het 5 cro-gen met een sequentie van het gen van interleukine-2 en terminator van fd-transcriptie wordt zo tot stand gebracht dat een hybride gebied voor het binden van de ribosomen wordt gevormd dat de volgende nucleo-tidenvolgorde heeft: 5..TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3', waarin resp. TAAGGAGGT en ATG-SD-sequentie en het startcodon van het cro-gen; GCC -10 eerste Ala-codon van interleukine-2, waarbij achter het stopcodon van het gen van interleukine-2 een span van p -onafhankelijke terminators van de fd-transcriptie aanwezig is; - het heeft unieke herkenningsgebieden voor de restrictasen Clal, waarvan de coördinaat het beginpunt voor het tellen is (0), Xbal (onge- 15 veer 990), BglII (ongeveer 1250), PstI (ongeveer 3070); gedeponeerd op 12.01.87 in de verzameling van culturen van microörganismen van de All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1869.

De werkwijze voor de constructie van het recombinante plasmide-DNA 20 volgens de uitvinding omvat modificatie van het plasmide pAAl213-23 ter grootte van 5400 b.p. dat is geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322 en dat het ColEI-replicon, een resistentiegen voor ampicilline en een ^DNA-copie van menselijk interleukine-2 bevat, waarvan de expressie wordt bewerkstelligd door de promotor en SD-sequentie van het 25 tryptofaan-operon van E. coli, door middel van vervanging van een res-trictiegebied voor Stu I door een restrictiegebied voor Bgl II; het resulterende plasmide pAA1213-23B wordt met het restrictase Cfrl3 behandeld en de daarbij verkregen enkelstrengs einden van DNA moleculen worden opgevuld met het Klenov-fragment van het DNA-polymerase I van 30 E. coli, waarna het Cfrl3-fragment van het plasmide pAA1213-238 met het gen van interleukine-2 wordt gewonnen door middel van preparatieve elektroforese in een agarosegel en door middel van het DNA-ligase van de faag T4 wordt opgenomen in het vectormolecuul pPR124B dat is geconstrueerd op basis van plasmiden pPR40 en pML24 dat vooraf is gesplitst 35 door middel van het restrictase BamHI, en enkelstrengs eindpunten van het DNA in het restrictiegebied worden verwijderd door middel van SI-endonuclease, waarna het verkregen mengsel wordt behandeld met restrictase Bgl II en DNA moleculen worden gecombineerd tot ringen door middel van T4 DNA-ligase; cellen van E. coli C600 worden met het verkregen 40 mengsel omgezet; de transformanten worden op een medium met ampicilline 8820102 5 geënt en bij 28°C gekweekt, waarna wordt geselecteerd op een verlaagde groeisnelheid bij een temperatuur van 42°C, uit de geselecteerde klonen het plasmide pPR-112-19 wordt gewonnen, waarin de juiste combinatie van de fragmenten wordt nagegaan door herstel op de voegpunten van de uit-5 gangsgebieden van het DNA, van de vooraf afwezige herkenningssequentie van het restrictase Bsp RI.

Het plasmide volgens de uitvinding heeft als kenmerk dat het gen clts857 - regulator van de start van de transcriptie van de bacterio-faag A ~ in het molecuul gelegen is en de expressie van het gen van 10 interleukine-2 wordt gestuurd door de Pg~promotor. Deze omstandigheid maakt het mogelijk een eventuele recA-afhankelijke recombinatie tussen het voor het gen van interleukine-2 coderende plasmide en een verenigbaar ingebouwd plasmide of een defectieve profaag te vermijden. De wijze van bereiding van het recombinante plasmide pPR-IL2-19 waarin de 15 SD-sequentie en het AUG-codon van het cro-gen van de bacteriofaag Λ zijn gecombineerd met het coderende gebied van het gen van menselijk interleukine-2, leidt tot de produktie van een hybride gebied voor het binden van ribosomen van het gen van interleukine-2 met een optimale primaire en ruimtelijke structuur van het 5’-terminale gebied van het 20 matrix-RNA.

De uitvinding heeft eveneens betrekking op de stam E. coli VNIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk interleukine produceert en het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 bevat, dat volgens de uitvinding wordt verkregen door genetische inbouw van het recombinante 25 plasmide-DNA pPR-IL2-19 in Escherichia coli. De stam volgens de uitvinding werd op 12.01.87 gedeponeerd in de verzameling van culturen van microörganismen van het All-Union Research Institute of Antibiotics en onder nr. 1869 geregistreerd. De stam volgens de uitvinding maakt het mogelijk een stabiele produktie van menselijk interleukine-2 onder om-30 standigheden van een kweek op grote schaal te bewerkstelligen en een opbrengst van het gewenste produkt van (8-10) x 10^ Mü/1 te bereiken, wat overeenkomt met 8-12% van de totale hoeveelheid celeiwit.

Beste wijze voor het uitvoeren van de uitvinding 35 De constructie van het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 vol gens de uitvinding geschiedt in een aantal stappen.

Het plasmide pAA1213-23 ter grootte van 5400 b.p. dat is geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322 en het ColEI-replicon bevat, een resistentiegen voor ampicilline en een ^DuA-copie van een gen van 40 menselijk interleukine-2 bevat waarvan de expressie wordt bewerkstel- .8820102 6 ligd door een promotor en een SD-sequentie van het tryptofaan-operon van E. coli, wordt gemodificeerd door vervanging van een restrictieger-bied voor Stu I door een restrictiegebied voor Bgl II onder vorming van het plasmide pAA1213-23B dat met het restrictase Cfrl3 wordt behandeld, 5 en de daarbij verkregen enkelstrengsuiteinden van DNA-moleculen worden aangevuld door middel van een Klenov-fragment van DNA-polymerase I van E. coli. Vervolgens wordt door middel van preparatieve elèktroforese in een gel van laagsmeltende agarose een Cfr-fragment van het plasmide pAA1213-23B met daarin een gen van interleukine-2 geïsoleerd.

10 Daarna wordt een vectorplasmide pPR124B geconstrueerd. Hiertoe wordt in het DNA van het plasmide pPR40 in het herkenningsgebied van het restrictase Bgl II een deletie aangebracht door middel van het exo-nuclease Bal31 waarbij het plasmide pPRIOO wordt verkregen, waarin het herkenningsgebied voor BamHI direct na het bindingsgebied van ribosomen 15 van de faag X is gelegen, zodat in het gebied van het startcodon AUG de sequentie:

AUGGATCC

BamHI

wordt gevormd.

20 Later wordt via conventionele genetische technieken het kleinste

Pstl-BamHI fragment van het plasmide pPRIOO gecombineerd met het grootste Pstl-BamHI-fragment van het plasmide pML24 onder vorming van het plasmide pPRI24, waarin door middel van een oligonucleotide-koppelaar het herkenningsgebied van het restrictase Bgl II is ingevoerd in plaats 25 van Xbal onder vorming van het plasmide pPRI24B.

Vervolgens wordt het Cfrl3-fragment van het plasmide pAA1213-23B met het gen van interleukine-2 door middel van een DNA-ligase van de faag T4 ingebouwd in een vectormolecuul van pPR124B dat is gesplitst door middel van het restrictase BamHI, en met door middel van het SI-30 endonuclease verschoven enkelstrengs DNA-eindstukken, en ringsluiting van lineaire DNA-moleculen wordt tot stand gebracht door middel van het DNA-ligase T4. Het aldus verkregen mengsel wordt gebruikt om cellen van E. coli C600 te transformeren, waarna de transformanten op een medium met ampicilline worden geënt en bij een temperatuur van 28°C worden ge-35 kweekt, waarna wordt geselecteerd op een verlaagde groeisnelheid bij een temperatuur van 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt een plasmide-DNA gewonnen dat aangeduid wordt als pPR-IL2-19, waarin de juiste rangschikking van de fragmenten wordt nagegaan door herstel, aan de verbindingspunten van de startgebieden van het DNA, van een vooraf 40 afwezige sequentie voor de herkenning van het restrictase Bsp RI.

- 882 0102 7

De stam E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) volgens de uitvinding wordt geproduceerd door transformatie van een ontvangende bacteriestam van Escherichia coli door middel van een recombinant plas-mide-DNA pPR-IL2-19. Als ontvangende stam kan gebruik worden gemaakt 5 van de stammen E. coli C600, E. Coli VNIGenetika VL-903 (gedeponeerd bij All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms en geregistreerd onder nr. BK t"jMB-3546) en andere derivaten van E. coli KI2. Na de transformatie worden recombinante klonen gese-10 lecteerd op een medium met ampicilline bij een temperatuur van 28°C.

De stam volgens de uitvinding wordt gekenmerkt door de synthese van menselijk interleukine-2 onder omstandigheden waarbij de P^**pro-motor wordt onderdrukt, resistentie voor ampicilline en een lagere groeisnelheid bij kweek van de cellen bij een temperatuur van 42°C.

15 Met de stam volgens de uitvinding kan een stabiele produktie van menselijk interleukine-2 bij kweek op grote schaal worden verkregen en wordt een verhoogde synthese aan cellen van E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) verkregen die tot (8-10) x 10^ un/1 vormt dat overeenkomt met 8-12% van de totale hoeveelheid celeiwit.

20 De stam E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-lL2-19) heeft de volgende eigenschappen:

Morfologische eigenschappen: De cellen zijn recht, staafvormig, langzaam bewegelijk, in staat draadachtige structuren te vormen, gram-negatief, niet sporevormend met een afmeting per cel van 3-5 pm.

25 Kweekeigenschappen: De cellen groeien goed op dichte en vloeibare gewone kunstmatige, half-kunstmatige en complexe voedingsbodems. Wanneer zij op een van agar voorziene Hottinger’s voedingsbodem of in L-kweekmedium worden gekweekt, vormen ze gladde, ronde, enigszins samengeklitte met slijm beklede koloniën. Wanneer zij in een vloeibaar 30 medium zoals L-medium of M9 met casaminezuren worden gekweekt vormen ze een uniforme suspensie.

Fysiologische en biochemische eigenschappen: De cellen kunnen groeien bij een temperatuur tussen 5 en 40°C (optimum: 37°C) bij een pH van 6,7 tot 7,5. Als koolstofbron worden koolhydraten (zoals sucrose) 35 en aminozuren gebruikt. De cellen vertonen auxotrofie ten aanzien van methionine. Als stikstofbron kunnen anorganische zouten in de ammonium-vorm ofwel organische verbindingen in de vorm van pepton, trypton, gistextract en aminozuren worden gebruikt.

Resistentie voor antibiotica: De stam is resistent voor ampicilli-40 ne in een concentratie tot 100 mg/1 indien gekweekt op vloeibare voe- .8820102 8 dingsbodems en op van agar voorziene voedingsbodems.

Stabiliteit van het plasmide: Bij opslag van cellen op een agar-medium treedt in een reeds achtereenvolgende overentingen en bij een diepe kweek in een vloeibaar medium met een antibioticum geen verlies 5 of omlegging van het plasmide.

De uitvinding wordt verder geïllustreerd door bijzondere uitvoeringsvormen van de bereidingswijze van de plasmide volgens de uitvinding, de bereidingswijze van de stam, en de kweek daarvan, en wordt ook geïllustreerd met de bijgaande figuren, waarvan: 10 fig. 1 een genetische kaart van het recombinante plasmide pPR-IL2-19 weergeeft; fig. 2 het schema van de bereiding van het recombinante plasmide pPR-IL2-l9 volgens de uitvinding weergeeft.

15 Voorbeeld 1

De constructie van het recombinante plasmide volgens de uitvinding geschiedt in een aantal stappen. Eerst wordt het vectorplasmide pBRI24B opgebouwd.

3 yg DNA van het plasmide pPR40 wordt door middel van het restric-20 tase Bgl II in 60 μΐ van een buffer voor restrictie-I die 10 mM tris-HC1 (pH 8,0), 6 mM MgC^j 5 mM 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl bevat, gesplitst. Het DNA wordt nogmaals met 2 volumes ethanol neergeslagen. Het neerslag wordt opgelost in 20 yl H2O· De behandeling van het DNA met exonuclease Bal 31 vindt plaats gedurende 3 min bij 30°C in 30 yl 25 van een buffer die 3 mM NaCl, 60 mM CaCl2> 60 mM MgCl2> 100 mM

tris-HCl, pH = 8,0, en 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur bevat· Het DNA wordt opnieuw met 2 volumina ethanol neergeslagen. Het neerslag wordt opgelost in 10 yl ^0. Behandeling met het restrictase BamHI geschiedt in een monster van 30 yl dat de bovengenoemde buffer voor 30 restrictie I bevat. Het aanvullen van de enkelstrengs 3'-eindstandige gebieden van het DNA geschiedt door middel van een Klenov-fragment van DNA-polymerase I. E. coli in een monster van 20 yl dat 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2> 2 yg van het preparaat van DNA, 30 yl van elk van de desoxyribonucleocide-trifosfaten bevat. 5 eenheden van het DNA-35 enzym uit het reactiemengsel worden neergeslagen door middel van ethanol en in 100 yl H2O opgelost. De koppeling van het gestrekte plas-mide-DNA geschiedt bij een temperatuur van 16°C gedurende 12 uur door middel van het DNA-ligase van de faag T4 in een monster dat een liga-tiebuffer (60 ml tris-HCl, pH 7,6), 10 mM MgCl2» 10 mM 2-mercapto-40 ethanol, 0,4 mM adenosine-trifosfaat) en 1 yg DNA bevat. Het verkregen .8820102 9 mengsel wordt gebruikt voor de transformatie van cellen van E. coli C600; het transformatierendement bedraagt ten hoogste 5 x 10^ kolonie per 1 yg van het natieve plasmide pPR40. De voor ampicilline (100 yg/ml) resistente klonen worden geselecteerd; daaruit wordt het plasmide DNA 5 geïsoleerd volgens een aangepaste methode voorgesteld door Birnboim en Doli en dit wordt vervolgens voor de restrictie-analyse gebruikt. Verkregen wordt het plasmide pPRIOO dat een uniek splitsingsgebied voor BamHI omvat. Vervolgens wordt het plasmide pPRl24 opgebouwd. Daartoe wordt 2 yg van het DNA van het plasmide pML24 tegelijk met de restric-10 tases BamHI en PstI in 40 yl van een buffer voor restrictie-I gesplitst. Deze worden gecombineerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4 bij 0°C met de fragmenten die zijn verkregen bij hydrolyse van het DNA van het plasmide pPRIOO door middel van de restrictasen BamHI en PstI. Het verkregen DNA-preparaat wordt gebruikt voor transformatie 15 van cellen van E. coli C600 met selectie van de transformanten op een medium met ampicilline, gevolgd door selectie van de Cmr-klonen op een medium met 300 yg/ml chlooramfenicol bij kweek van de cellen bij 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide-DNA geiso-leerd en getest door middel van restrictie-analyse. Daarbij wordt het 20 plasmide pPRI24 verkregen dat een splitsingsgebied met het restrictase BamHI omvat.

Vervolgens wordt 3 yg van DNA van het plasmide pPRI24 gesplitst door middel van het restrictase Xbal in 70 yl van een buffer voor restrictie I dat 10 mM tris-HCl (pH 7,9), 6mM MgC^» 6 mil 2-mercapto-25 ethanol en 150 mM NaCl bevat; het DNA wordt opnieuw neergeslagen met 2 volumina ethanol. Het neerslag wordt opgelost in 15 yl H20. De aanvulling van enkelstrengs 3’-eindstandige gebieden van het DNA geschiedt door middel van behandeling met een Klenov-fragment van het DNA-polyme-rase I van E. coli in een monster van 20 yl dat 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 30 10 mM MgCl2, 2 yg van het DNA-preparat bevat, met 30 yl van elk van de desoxyribonucleoside-trifosfaten, en 5 eenheden van het enzym. Het DNA uit het reactiemengsel wordt met ethanol neergeslagen en opgelost in 100 yl water. De combinatie van het gestrekte plasmide-DNA met Bgl-koppelaars geschiedt bij 16°C in 12 uur door middel van het DNA-ligase 35 van de faag T4 in een monster dat buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH = 7,6, 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,4 mM adenosine-tri-fosfaat), 2 yg van het plasmide-DNA en 0,5 yg koppelaars bevat. Na ligatie wordt het DNA met ethanol uit het reactiemengsel neergeslagen, weer opgelost en aan een enzymatische hydrolyse onderworpen met het 40 restrictase Bgl II in een monster van 40 yl dat een buffer voor res- . 882 0102.

10 trictie-II (6 mM HC1, pH 7,6, MgC^j 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 yl NaCl) bevat. Het DNA wordt weer neergeslagen met ethanol, opgelost en de cyclisatie wordt uitgevoerd; hiertoe wordt 1 yg van het preparaat van het plasmide-DNA in 240 yl buffer voor ligatie behandeld met DNA-5 ligase van de faag T4. Het verkregen mengsel wordt gebruikt voor transformering van de cellen van E. coli C600.

Het rendement van de transformatie is ten hoogste 5 x 10^ koloniën per 1 yg van het natieve plasmide pPRI24. Voor ampicilline (100 yg/ml) resistente koloniën worden geselecteerd en daaruit wordt 10 het plasmide-DNA gewonnen en gebruikt voor restrictie-analyse. Daarbij wordt het plasmide pPRl24B verkregen dat in tegenstelling tot het uit-gangs-vectormolecuul pPRl24, een uniek splitsingsgebied voor Bgl II bevat in plaats van de eerder aanwezige herkenningssequentie voor Xbal (fig. 2).

15 Vervolgens wordt 3 yg van het DNA van het plasmide pPR!24B openge knipt door middel van het restrictase BamHI in een 12 m monster dat een buffer voor restrictie I bevat. De reactie wordt onderbroken door ont-eiwitting met fenol van het DNA en neerslag van het nucleinezuur met ethanol. Het neerslag wordt opgelost in 20 yl water. De verwijdering 20 van de enkelstrengs uiteinden die bij het knippen van het DNA met restrictase zijn gevormd geschiedt door middel van een SI-endonuclease. Hiertoe wordt het DNA met 30 eenheden SI-endonuclease gehydrolyseerd in een monster van 50 yl dat 10 mM natriumacetaat, (pH 4,4), 4,5 mM ZnSO^, 250 mM NaCl bevat gedurende 20 min bij 20°C. De reactie wordt 25 beëindigd door behandeling met fenol en het DNA wordt neergeslagen met ethanol. Het neerslag wordt opgelost in 15 yl water.

Daarna wordt het plasmide pAA1213-23B geproduceerd. Daartoe wordt 3 yg van het DNA-plasmide pAA1213-23 ter grootte van 5400 b.p., geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322, en met daarin het ColEI-30 replicon, een resistentiegen voor ampicilline en de DNA-copie van een gen van menselijk interleukine-2 waarvan de expressie wordt bewerkstelligd door de promotor en de SD-sequentie van het tryptofaan-operon E. coli, in 10 eenheden van het restrictase Stu I in een monster van 30 yl dat een buffer voor restrictie I (10 mM tris-HCl, pH 7,9, MgCl2» 6 mM 35 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl) bevat, gesplitst; daarna wordt het DNA uit het reactiemengsel neergeslagen door toevoeging van ethanol. Het neerslag wordt afgescheiden door centrifugeren in 20 yl water. Het li-geren van het gestrekte plasmide-DNA met Bgl II koppelaars geschiedt door middel van 20 eenheden van het DNA-ligase van T4 in een monster 40 van 30 yl dat een buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH 7,6, 10 mM

.8820102 11

MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol en 0,4 mM adenosine-trifosfaat), 2 yg van het plasmide-DNA en 0,5 yg van de koppelaars bevat. Na ligatie wordt het DNA uit het reactiemengsel neergeslagen met ethanol, opgelost en aan enzymatische hydrolyse onderworpen door middel van restrictase 5 Bgl II in een monster van 40 yl dat een buffer voor restrictie-2 (6 mM tris-HCl, pH 7,7, 6 mM MgCl2> 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl) bevat. Het DNA wordt nogmaals neergeslagen met ethanol en weer opgelost, waarna de DNA-moleculen worden gecycliseerd; hiertoe wordt 1 yg van het preparaat van het plasmide-DNA in 240 yl ligatiebuffer behan-10 deld met 2 eenheden van het DNA-ligase van T4. Het verkregen mengsel wordt gebruikt voor het transformeren van cellen van E. coli C600. Het f.

rendement van de transformatie is ten hoogste 5 x 10° koloniën per 1 yg van het natieve plasmide pAAl212-23. De voor ampicilline (100 yg/ml) resistente klonen worden geselecteerd, het plasmide-DNA 15 wordt daaruit gewonnen met behulp van een aangepaste procedure volgens Birnboim en Doli en gebruikt voor restrictie-analyse. Het aldus bereide plasmide pAA1213-23B bevat, in tegenstelling tot het aanvankelijke recombinante molecuul van pAA1213-23, een uniek splistingsgebied van Bgl II in plaats van de vooraf beschikbare herkenningssequentie voor 20 Stu I (fig. 2).

30 yg van het DNA van het plasmide pAA1213-23B wordt gesplitst door middel van restrictase Cfrl3 (activiteit 200 eenheden) in een monster van 100 yl dat een buffer voor restrictie I bevat. De produkten van de enzymatische hydrolyse worden onderworpen aan elektroforese in 25 een 1,1%'s gel van een laagsmeltende agarose in een tris-acetaat buf-fersysteem bij een veldsterkte van 5 V/cm. Het gelgebied dat het DNA fragment met het gen van interleukine-2 van 750 b.p. bevat wordt uitgesneden en het DNA wordt geëlueerd. Ter aanvulling van enkelstrengs eindstukken van het DNA door middel van een Klenov-fragment van de DNA-30 polymerase I van E. coli wordt het uit het gel geisoleerde fragment behandeld in een monster van 20 yl dat 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2 bevat met 30 yl van elk van de desoxyribonucleoside-trifosfa-ten. De reactie wordt beëindigd door verwarmen, het DNA uit het mengsel wordt met een ethanol neergeslagen en opgelost in 20 yl water.

35 Vervolgens wordt het eerder verkregen preparaat van het gestrekte plasmide pBRI24B geligeerd met het fragment van het plasmide pAA1213-23B. Hiertoe wordt 1 yg van het plasmide-DNA en 2 yg van het fragment behandeld met het DNA-ligase van de faag T4 in een ligatiebuffer, terwijl het voltime van het reactiemengsel 30 yl is. Na neerslag 40 van het DNA en oplossen van het neerslag in 20 yl water wordt het pre- . 8820102 12 paraat behandeld met het restrictase Bgl II zoals hierboven beschreven, wordt het DNA. weer neergeslagen met ethanol, opgelost en worden de gestrekte DNA-moleculen tot ringen geligeerd door middel van DNA-ligase van de faag T4 bij behandeling van het enzympreparaat in een volume van 5 het reactiemengsel tot 300 yl. Het verkregen preparaat wordt gebruikt voor transformatie van cellen van E. coli C600 waarna de transformanten in medium met ampicilline worden geselecteerd terwijl de cellen 1 dag bij 28°C worden gekweekt. Van de verkregen transformanten worden de variëteiten die een verminderd groeivermogen bij 42°C vertonen uitgeko-10 zen. Uit deze klonen wordt het plasmide-DNA geisoleerd zoals hierboven beschreven en aan restrictie-analyse onderworpen. In het resulterende plasmide pPR-IL2-19 (fig. 2) op het voegpunt van de geligeerde gebieden van het DNA dat het eerste codon van het cro-gen van de faag λ en het ala-codon van menselijk interleukine-2 codeert wordt een knipplaats 15 voor het restrictie-endonuclease BspRI gevormd.

Voorbeeld 2

De bereiding van de stam E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-l9) die menselijk interleukine-2 produceert geschiedt op de volgende wijze. 20 Het plasmide pPR-IL2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert wordt door middel van transformatie in cellen van de ontvangende stam E. coli VNIIGenetika VL-903, die bij de All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms is gedeponeerd en 25 is geregistreerd onder nr. BK Γ) Β-3546 ingevoerd. Het rendement van de transformatie van cellen van E. coli VNIIGenetika VL 903 bedraagt ongeveer 10^ klonen per 1 yg van het natieve plasmide pPR-IL2-19. De transformanten worden geselecteerd op een medium dat ampicilline (100 yg/ml) bevat na kweek van de cellen gedurende 1 dag bij 28°C. Uit 30 de geselecteerde klonen wordt het plasmide-DNA gewonnen en de identiteit met het preparaat pPR-IL2-l9 wordt vastgesteld door middel van restrictie-analyse. De stam E. coli VL 903 (pPR-IL2-19) wordt verkregen en deze produceert menselijk interleukine-2.

35 Voorbeeld 3

De stam E. coli VL 903 (pPR-IL2-19) wordt bij 28°C gedurende 14 uur gekweekt op een schuine agarbodem volgens Hottinger die 50 yg/ml ampicilline bevat. De op de voedingsbodem gekweekte biomassa wordt gebruikt voor de bereiding van entmateriaal. Hiertoe worden de cellen 40 overgebracht in 750 ml Erlenmeyer-kolven met 100 ml Hottinger medium . 8820102 13 dat 100 yg/ml ampicilline bevat en bij 28°C op een schudapparaat met 240 dpm gedurende 6 uur gekweekt. De optische dichtheid van de entcul-tuur bedraagt 1,5-2,5 eenheden.

Het kweken geschiedt in een fermentor die is voorzien van inrich-5 tingen voor de controle van de pH, de temperatuur, de roersnelheid en de beluchting. Voor de fermentatie wordt het Hottinger-medium gebruikt dat 100 yg/ml ampicilline en 10 g/1 glucose bevat. De entcultuur wordt in een hoeveelheid van 5-10 gew.% toegevoegd. Het kweken geschiedt bij pH 6,6-6,8 welke pH wordt gehandhaafd door toevoeging van verdunde 10 ammonia. Het eerste gedeelte van de fermentatie geschiedt tot een optische dichtheid van 3,5 bij 550 nm bij een temperatuur van 28°C, waarna thermoinductie plaats vindt door verhoging van de temperatuur tot 42-45°C gedurende 5 min, en daarna wordt de fermentatie nog 2 uur voortgezet.

15 Bij beëindiging van het proces worden voor het bepalen van de activiteit van menselijk interleukine-2, uit 1 ml van de kweekvloeistof de cellen neergeslagen door centrifugeren en wordt het neerslag in 1 ml van een 8 ml oplossing van guanidinechloride bij 20°C gedurende 40 min gesuspendeerd. Daarna wordt het residu door centrifugeren afgescheiden 20 en de activiteit van de interleukine-2-fractie in de bovenstaande vloeistof wordt bepaald. De biologische activiteit van het aldus bereide interleukine-2 bedraagt (8-10) x 10^ Mü/1.

Voor het bepalen van het aandeel van het gesynthetiseerde menselijke interleukine-2 in het totale celeiwit worden de cellen uit 1 ml 25 cultuurvloeistof door centrifugeren neergeslagen en op de boven beschreven wijze behandeld. Het preparaat wordt geanalyseerd door middel van elektroforese in een 15%’s polyacrylamidegel in aanwezigheid van 0,1% natriumdodecylsulfaat. De in het gel afgescheiden eiwitten worden volgens een standaardprocedure gekleurd in de oplossing Coomassi R-250 30 "Serva" (BRD). De hoeveelheid eiwit in de gebieden wordt bepaald na het doorlopen van de gekleurde gel in een densitometer. Identificatie van het gebied dat overeenkomt met het in de cellen gesynthetiseerde rijpe menselijke interleukine-2 geschiedt op basis van vergelijking met de elektroforetische activiteit van merkeiwitten, alsmede door vlekvorming 35 van de afzonderlijke eiwitten op nitrocellulosefilters gevolgd door ontwikkeling van de gebieden met interleukine door middel van behandeling in oplossingen die monoclonale antilichamen van muizen tegen interleukine-2 en anti-muisantilichamen van konijnen geconjugeerd met mierikswortelperoxydase bevatten. Na een geschikte procedure voor het 40 kleuren wordt het gebied van interleukine ontwikkeld als een bruine .8820102 14 band tegen een niet gekleurde achtergrond van het nitrocellulosefilter. Het aandeel van het gen van interleukine-2, gesynthetiseerd in de cellen, van het eiwitprodukt bedraagt 12% van de totale hoeveelheid cel-eiwit.

5

Toepasbaarheid in de nijverheid

De recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 volgens de uitvinding dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert is bruikbaar voor de bereiding van stammen die met hoge activiteit menselijk interleukine-2 10 produceren. De E. colistam VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk interleukine-2 produceert is bruikbaar in de microbiologische en farmaceutische industrie voor de bereiding van menselijk interleukine-2 dat in de geneeskunde bruikbaar is.

.8820102

Claims

1. Recombinant plasmide-DNA pPR-IL2-19 dat de synthese van mense-5 lijk interleukine-2 codeert, met het kenmerk, dat het een omvang van 3850 baseparen heeft en uit de volgende eenheden bestaat: — een BamHI - Bgl II-fragment van 34.00 b.p. van het vectorplas-mide pPRI124B dat wordt geproduceerd op basis van pPR40 en pML24; — een Cfrl3 - Bgl II-fragment van 450 b.p. van het plasmide PAA- 10 1213-23B dat wordt geproduceerd door vervanging van het restrictiege- bied voor Stu door een restrictiegebied voor Bgl II in het plasmide pAA1213-23 ter grootte van 5400 b.p., dat is geconstrueerd op basis van de plasmide pBR-322 en dat een ColEI-replicon, een resistentiegen voor ampicilline en een ^DNA-copie van het gen voor menselijk interleu-15 kine-2 bevat, waarvan de expressie tot stand komt door een promotor en een SD-sequentie van het tryptofaan-operon van E. coli en wordt gekarakteriseerd door de volgende eigenschappen: — het omvat een replicatie-startgebied ColEI-replicon, een gen van een voor temperatuur gevoelige repressor clts857 van de faag λ , 20 een resistentiegen voor ampicilline, een span van p-onafhankelijke transcriptieterminators van de faag fd, een regelgebied PR0R, een SD-sequentie en een ATG-startcodon van het cro-gen van de faag λ dat de sequentie van rijp menselijk interleukine-2 codeert; — de ligatie van het regelgebied PR0R en ATG-codon van het 25 cro-gen met een sequentie van het gen van interleukine-2 en de trans-criptieterminator fd geschiedt zodanig dat een hybridegebied voor het binden van ribosomen wordt gevormd dat de nucleotidesequentie:

5. TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3’ heeft, waarin TAAGGAGGT en ATG-SD-sequentie en het startcodon van het cro-gen resp. GCC - het eerste Ala-30 codon van interleukine-2, terwijl voorbij het stopcodon van het gen van interleukine-2 een span van P-onafhankelijke terminators van de transcriptie fd is gelegen; — het heeft unieke herkenningsgebieden voor restrictasen Clal, waarvan de coördinaat het beginpunt voor de telling is (0), Xbal (onge- 35 veer 990), BglII (ongeveer 1250), Pst (ongeveer 3070); gedeponeerd op 12.01.87 bij de verzameling van culturen en microörganismen van het All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1869.

2. Werkwijze voor het bereiden van een recombinant plasmide-DNA 40 pPR-ILl2-19, met het kenmerk, dat het plasmide pAA1213-23 ter grootte .8820102 van 5400 b.p., dat is geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322 en dat ColEI-replicon, een resistentiegen voor ampicilline en een j^NA-copie van een gen van menselijk interleukine-2 bevat, waarvan de expressie tot stand wordt gebracht door een promotor en een SD-sequen-5 tie van het tryptofaan-operon van E. coli, wordt gemodificeerd door vervanging van het restrictiegebied voor Stu I door een restrictiege-bied voor Bgl II, het resulterende plasmide pAA1213-23B wordt behandeld met het restrictase Cfrl3 en de gevormde enkelstrengs uiteinden van DNA-moleculen worden aangevuld door middel van een Klenov-fragment van 10 het DNA-polymerase I E. coli, waarna het verkregen Cfrl3 fragment van het plasmide pAA1213-23b met het gen van menselijk interleukine-2 wordt geïsoleerd door middel van preparatieve elektroforese in een agarosegel en door middel van het DNA-ligase van de faag T4 wordt ingebouwd in het vectormolecuul pPRl24B dat is geconstrueerd op basis van de plasmiden 15 pPR40 en pML24 en dat vooraf is gesplitst met BamHI, en de enkelstrengs uiteinden van het DNA van het restrictiegebied worden verwijderd door middel van SI-endonuclease waarna het verkregen mengsel wordt behandeld met het restrictase Bgl II en de DNA-moleculen tot ringachtige vormen worden geligeerd door middel van DNA-ligase van T4; het aldus gevormde 20 mengsel wordt gebruikt voor het transformeren van cellen van E. coli C6Q0; de transformanten worden geënt op een medium met ampicilline en bij 28°C gekweekt, gevolgd door selectie op een verlaagde groeisnelheid bij een temperatuur van 42°C; uit de geselecteerde klonen wordt het plasmide pPR-112-19 gewonnen, waarin de precizie ligatie van de frag-25 menten wordt nagegaan door herstel bij de verbindingsplaatsen van de startgebieden van het DNA, van de eerder afwezige sequentie voor de herkenning van het restrictase BspRT.

3. E. colistam VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-l9) die menselijk interleukine-2 produceert en het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 30 volgens conclusie 1 bevat, bereid door genetische manipulatie door middel van invoering van het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 in Escherichia coli-bacteriën, die op 12.01.87 zijn gedeponeerd bij de verzameling van culturen van microörganismen van het All-Union Research Institute of Antibiotics en onder nr. 1869 zijn geregistreerd. 35 ------ .8820102