JPH07135977A - プラスミドベクターｐＳＭ１４３及びその調製法 - Google Patents

プラスミドベクターｐＳＭ１４３及びその調製法

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JPH07135977A
JPH07135977A JP6136678A JP13667894A JPH07135977A JP H07135977 A JPH07135977 A JP H07135977A JP 6136678 A JP6136678 A JP 6136678A JP 13667894 A JP13667894 A JP 13667894A JP H07135977 A JPH07135977 A JP H07135977A
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plasmid
psm143
escherichia coli
phage
bamhi
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JP6136678A
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Guido Grandi
ギド・グランディ
Antonio Mele
アントニオ・メーレ
Elisabetta Colletti
エリザベッタ・コレッチ
Susanna Campagnoli
スザンナ・カンパニョーリ
Renzo Nogarotto
レンゾ・ノガロット
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Eniricerche SpA
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Abstract

(57)【要約】 【目的】 大腸菌及び枯草菌において発現できると共
に、新規なプラスミドベクターの調製における原料とし
て使用されるプラスミドベクター pSM143を提供する。 【構成】 プロモーターがpE194のエリスロマイシンの
ものであり、ターミネーティング配列が大腸菌のファー
ジ fd のものである。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】本発明は、エシェリキア・コリ（Escheric
hia coli)(大腸菌）及び／又はバシラス・サチリス（Ba
cillus subtilis)(枯草菌）において形質を発現する新
規なプラスミドベクターを調製する際の原料として使用
される新規なプラスミドベクター pSM143及びその調製
法に係る。
【０００２】発明者らは、同一出願人に係る他の出願
（特願昭61−59652号）において、調節配列の制御下に
異種タンパク質をコードする遺伝子が配置されている大
腸菌及び／又は枯草菌において形質を発現する新規なプ
ラスミドベクターであって、かかるプラスミドによって
形質転換された微生物は異種タンパク質を高収率で産生
できるものとなるようなプラスミドベクターを提供して
いる。詳述すれば、このようなプラスミドベクターは、
異種タンパク質をコードする遺伝子が、大腸菌のファー
ジ fd のターミネーティング配列、及び合成DNAセグメ
ントによりその−35領域を置き換えることによって変性
したpE194のエリスロマイシンプロモーターの制御下に
配置されてなる大腸菌において形質を発現できるプラス
ミドベクター（pSM146及びpSM147）を提供している。
【０００３】本発明は、このようなプラスミドベクター
pSM146及びpSM147の調製に使用されると共に、大腸菌
及び枯草菌で形質を発現できるプラスミドベクター pSM
143及びその調製法に係る。
【０００４】遺伝子工学の分野における最近の発達によ
り、特殊なタンパク質をコードする異種の遺伝子を含有
するプラスミドベクターを調製し、このベクターを宿主
微生物に導入し、かかる形質転換された微生物を単離
し、異種遺伝子によるコードタンパク質の発現に適する
培養基中でかかる微生物を培養することからなる方法を
介して特殊なタンパク質を製造することが可能になっ
た。
【０００５】「異種遺伝子」とは、使用する宿主によっ
ては一般に産生されないタンパク質（かかるタンパク質
を「異種タンパク質」という）をコードするDNAを意味
する。
【０００６】「産生」とは、タンパク質が微生物によっ
て合成される操作を意味する。
【０００７】この操作は２段階で行われる。第１段階は
転写であり、遺伝子情報がDNAからメッセンジャーRNA
（mRNA）に移される。第２段階は翻訳であり、情報がmR
NAからタンパク質に移される。
【０００８】DNAからmRNAへの転写は、酵素RNAポリメラ
ーゼによって行われ、プロモーターと呼ばれる配列の付
近に配置されたDNAの特殊な部位で開始され、ターミネ
ーターと定義されるDNAの領域付近の他の特定された部
位で終了する。
【０００９】特殊な異種タンパク質が宿主細胞内で合成
されるためには、かかるタンパク質の構造遺伝子は、特
殊な配列［すなわちプロモーター、ターミネーター及び
リボソーム結合部位（RBS)(これらは宿主微生物によっ
て認識され、mRNAポリメラーゼがDNAをmRNAへ転写する
のを可能にし、リボソーム及び関連する酵素がmRNAをタ
ンパク質へ翻訳するのを可能にする)］の制御下に配置
されなければならない。
【００１０】「強力」プロモーターの制御下にタンパク
質の構造遺伝子を配置することによって異種タンパク質
の産生を高めることができることも公知である。
【００１１】強力プロモーターとは、ヌクレオチド塩基
の特殊な配列を有するプロモーターと理解される。
【００１２】M．Rosemberg及びD．Court，Am．Rev．Gen
et.，13,（1979），319〜353によれば、最適であると考
えられる強力プロモーターは、−35領域の塩基TTGACA及
び−10領域の塩基TATAATと、これら２つの間の17〜18個
のヌクレオチドでなるスペーサーとで形成される。
【００１３】さらに、プラスミドベクター上における強
力プロモーターの維持は、併存するターミネーターに左
右されることも公知である（R．Genkoら，PNAS，78，(1
981），4936〜4940）。
【００１４】実際、ターミネーターは、DNA分子からのR
NAポリメラーゼの脱離を決定し、このようにして、DNA
分子がプラスミド DNAの複製操作を妨害するのを阻止す
る。ターミネーターが存在しない場合には、細胞に対す
るプラスミドのコピーの数が減少し、その結果、細胞後
代からプラスミドが失われることになる。プロモーター
と正に同じく、ターミネーターも、その配列に応じて
「より強力」又は「若干強力」と定義され、RNAポリメ
ラーゼの離脱を「より効果的」に又は「多少効果的」に
行う能力を有するものと定義される。
【００１５】このように、良好なプラスミド安定性、細
胞に対するプラスミドのコピーの数が多いこと及び従っ
て異種タンパク質の効果的な産生を達成するためには、
強力なプロモーターを同等に強力なターミネーターと協
働させることが必要である。文献（杉本ら，Nucleic Ac
ids Res.，(1978)，５，4495〜4503）には、大腸菌のフ
ァージ fd のターミネーターが特に強力なターミネータ
ーである旨記載されている。
【００１６】発明者等は、pE194のエリスロマイシンプ
ロモーター（バシラス・サチリス BGSC 1E ７中に存在
するプラスミドである）を、その−35領域を好適に設計
された合成DNAセグメントで置き換えることによって変
性させる場合には、もとのものよりも強力なプロモータ
ーが得られることを見出し、本発明に至った。
【００１７】かかるプロモーターは、大腸菌のファージ
fd のターミネーティング配列の併存によってプラスミ
ドレベルで適当な状態に維持され、このようなプロモー
ターを含有するプラスミドベクターによって形質転換さ
れた微生物は異種タンパク質を高収率で産生できる。
【００１８】このように、調節配列（プラスミドにより
形質転換された微生物が異種タンパク質を高収率で産生
できるようにする）の制御下に異種タンパク質をコード
する遺伝子が配置されてなる大腸菌及び／又は枯草菌で
の形質発現可能な新規プラスミドベクターを提供され
る。
【００１９】特に、このようなプラスミド（pSM146及び
pSM147）では、大腸菌のファージ fd のターミネーティ
ング配列、及びその−35領域を合成DNAセグメントで置
き換えることによって変性したpE194 エリスロマイシン
プロモーターの制御下に特殊なタンパク質をコードする
異種の遺伝子が配置されており、大腸菌で形質を発現で
きる。
【００２０】本発明の目的は、それ自体、大腸菌及び枯
草菌で形質発現可能であると共に、プラスミドベクター
pSM146及びpSM147の調製に使用されるプラスミドベク
ターpSM143を提供することにある。
【００２１】プラスミドベクター pSM143は、プロモー
ター及びターミネーターの領域を、他のプロモーター及
びターミネーターをコードする新規な合成DNAセグメン
トで置き換えることによって形質発現用の他のプラスミ
ドベクターの調製にも使用される。
【００２２】上記pSM146及びpSM147における合成DNAセ
グメントは、それぞれ下記の配列を有する。塩基配列（I） 塩基配列（II）
【００２３】上記セグメントは、公知の方法（J．H．Va
n Boom，J．Biol．Chem.，250,（1975)，4592；R．L．L
etsingerら，J．Amer．Chem．Soc.，97,（1975)，32）
に従って合成される。
【００２４】エシェリキア・コリ HBIOIの細胞内に導入
されたプラスミドベクター pSM146及びpSM147は適当な
状態に維持され、このようにして形質転換された細胞に
アンピシリン及びカナマイシンの両者に対する耐性（そ
れぞれ濃度100μｇ／ml及び15μｇ／mlまで上昇）を付
与する。
【００２５】形質転換され、適切な培養基で培養された
大腸菌の細胞は、高収率で異種タンパク質を産生し得
る。本発明によれば、pSM143において使用されているプ
ロモーター−ターミネーター配列の制御下に配置される
遺伝子は大腸菌のpBR322のβ−ラクタマーゼのものであ
る（J．G．Sutcliffe，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，7
5,（1978)，3737参照）。
【００２６】しかしながら、クローン化される遺伝子の
選択は発明との関連においては重要ではなく、たとえば
ヒト及び動物のホルモン、食品用タンパク質、酵素等の
他のタンパク質をコードする異種遺伝子を使用すること
ができる。
【００２７】上記プラスミドベクター pSM146及びpSM14
7は、プラスミドベクター pSM143のSstI−XbaI領域（74
0bp（塩基対）を有する）を上述の塩基配列によって定
義される合成DNAセグメントで置き換えることによって
得られる。
【００２８】pSM143のプロモーター配列は、−35領域と
−10領域との間に唯１つのSstI制限部位及び−35領域の
上流側に唯１つのXbaI制限部位を有する。
【００２９】このように、特殊な制限酵素SstI及びXbaI
によるpSM143の消化後、プロモーターを有する小さいフ
ラグメント（740bp）の置き換えが可能である。
【００３０】本発明によれば、下記の工程を包含する方
法によりプラスミド pSM143が得られる。 ａ．プラスミド pSM110から、PvuII制限部位の代わりに
BamHI制限部位を有するプラスミド pSM116を調製するこ
と。 ｂ．プラスミド pSM116から、複製開始部位の下流側に
クローン化に有用な２つの制限酵素XhoI及びBglIIの制
限部位を有するプラスミド pSM131を調製すること。 ｃ．大腸菌のファージ fd のターミネーターを含有する
HindIIIフラグメントをプラスミド pUCBに挿入し、プラ
スミド pSM138を単離すること。 ｄ．制限酵素BamHIによる消化後、プラスミド pSM138か
らファージ fd のターミネーターを単離すること。 ｅ．ファージ fd のターミネーターを含有するBamHIフ
ラグメントをプラスミドpSM131のBalII制限部位に挿入
し、得られたプラスミド pSM137を単離すること。 ｆ．プラスミド pSM116のインビトロ突然変異によりβ
−ラクタマーゼの構造遺伝子の下流側にHindIII制限部
位を導入して得られたプラスミド pSM141を単離するこ
と。 ｇ．プラスミド pSM141及びプラスミド pSM137をHindII
Iで消化した後、β−ラクタマーゼの遺伝子を含有するp
SM141のHindIIIフラグメントを、プラスミド pSM137の3
500bpのHindIIIフラグメントと連結し、得られたプラス
ミド pSM142を単離すること。 ｈ．プラスミド pSM142及びプラスミド pSM112を制限酵
素BamHI及びEcoRIで消化した後、プラスミド pSM142のB
amHI−EcoRIフラグメントをプラスミド pSM112と連結
し、得られたプラスミド pSM143を単離すること。
【００３１】本発明によれば、プラスミド pSM143内で
クローン化された遺伝子は、大腸菌のpBR322のβ−ラク
タマーゼのものである。しかしながら、β−ラクタマー
ゼ遺伝子を含有するEcoRI−HindIIIフラグメント（850b
p）を削除することにより、調節配列（プロモーター、
ターミネーター及びRBS）の制御下に大腸菌及び枯草菌
によって認識される他のタンパク質をコードする遺伝子
をベクターに挿入することが可能である。
【００３２】本発明によれば、プラスミド pSM143の調
製法では、プラスミド pSM110（イタリー国特許出願第2
3,992Ａ／84号の記載に従って調製され、図１に示す制
限酵素開裂地図を有する）を原材料として中間プラスミ
ドが調製される。プラスミド pSM110は、大腸菌のpBR32
2のβ−ラクタマーゼ遺伝子のATGの上流側に配置された
EcoRI制限部位を有する。
【００３３】このようにして得られたプラスミド pSM14
3は、β−ラクタマーゼ遺伝子の端部に大腸菌ファージ
fd のターミネーターを有し、かかるファージ fd の上
流側にpE194のエリスロマイシンプロモーター（その−1
0領域における配列はM．Rosembergらによって報告され
たものと一致するが、−35領域は配列TTCATAの２つの塩
基によって異なる）を有する。
【００３４】さらに、プラスミド pSM143は大腸菌及び
枯草菌において安定な状態で維持され、これら菌におい
て濃度100μｇ／mlまでのアンピシリン耐性及び濃度15
μｇ／mlまでのカナマイシン耐性を提供する。
【００３５】プラスミド pSM143は図２に示す制限酵素
開裂地図により特徴づけられる。
【００３６】本発明によれば、プラスミドベクター pSM
143、pSM146及びpSM147の調製は公知の方法に従って行
われる。
【００３７】特に、プラスミドベクターの消化は、Tris
・HCl（pH8.1）50mM、NaCl 50mM及びMgCl2 10mMを含有
する溶液中、目的に適した制限酵素の存在下、かかる制
限酵素に適する条件下でDNAプラスミドを懸濁化させる
ことにより行われる。
【００３８】本発明で使用する制限酵素は、BRL社及びB
IOLABS社より供給されたものである。
【００３９】消化によって得られたフラグメントの連結
反応（連結酵素による）は、Tris・HCl 50mM、MgCl2 10
mM、ジチオトレイトール（DTT）10mM及びATP １mMを含
有する溶液に、酵素DNA T4リガーゼの存在下、これらの
フラグメントを懸濁化させることにより行われる。
【００４０】「インビトロ突然変異」反応（制御した状
態でDNAの特殊な領域の塩基配列を変化させることを目
的とする）は、M．I．ZollerらがNucleic Acids Reserc
h，10,（1982)，6487〜6500に報告している方法を使用
することによって行われる。
【００４１】pBR322のβ−ラクタマーゼ遺伝子の生産に
関する各種のプロモーター及びターミネーターの効果を
確認するため、本発明のプラスミドをエシェリキア・コ
リ HBIOI及びバシラス・サチリス BGSC 1A246細胞に導
入する。このようにして形質転換した細胞を、グリコー
ス 0.5％、トリプトファン 50μｇ／ml及び微量元素を
添加したLB（バクト・トリプトン 10ｇ、酵母エキス ５
ｇ及びNaCl 10ｇ)(DIFCO社）及びSMS（Spitizen最小
塩）の各液体培地において37℃で撹拌しながら６時間培
養する。
【００４２】この時間の経過後、大腸菌については細胞
内のβ−ラクタマーゼ活性及び枯草菌については細胞内
及び培養基内のβ−ラクタマーゼ活性を測定し、イタリ
ー国特許出願第23,992Ａ／84号に報告の如くして得られ
たプラスミド pSM119を含有するバシラス・サチリス NR
RL B 15896の細胞を培養することにより得られたものと
比較する。得られた結果から、プラスミド pSM143は枯
草菌及び大腸菌内で安定であり、枯草菌に導入された場
合及び大腸菌に導入された場合のいずれの場合にも、pS
M119のものの２倍のβ−ラクタマーゼ活性を示す。
【００４３】一方、プラスミド pSM146及びpSM147は大
腸菌内でのみ安定であり、pSM119を含有する大腸菌の菌
株で測定されるものの６ないし65倍のβ−ラクタマーゼ
活性を示す。
【００４４】プラスミド pSM143、pSM138、pSM146及びp
SM147を含有するエシェリキア・コリ HBIOIの各菌株
は、「アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
（ATCC)」のカルチャーセンターに、それぞれATCC5303
8、ATCC53037、ATCC53039及びATCC53040として寄託され
ている。
【００４５】下記の実施例は本発明を説明するためのも
のであり、本発明を限定するものではない。
【００４６】
【実施例１】プラスミド pSM143の調製 （ｉ）プラスミド pSM116の調製 プラスミド pSM110 １μｇを、50mM Tris−HCl（pH8.
1）、50mM NaCl及び10mMMgCl2を含有する溶液（溶液
Ａ）中に懸濁させ、制限酵素PvuII（BIOLABS）１単位
（Ｕ）で37℃において１時間消化させた。
【００４７】この反応の終わりに制限酵素を65℃で10分
間処理して不活性化させた。
【００４８】このようにして得た反応混合物とリン酸エ
ステル化BamHIリンカー（BIOLABS）50ngとを、66mM Tri
s−HCl（pH7.6）、６mM MgCl2、10mMジチオトレイトー
ル及び１mM ATPを含有する溶液（溶液Ｂ）19μｌに加え
た後、酵素T4リガーゼ １Ｕの存在下で連結させた。
【００４９】このリガーゼ反応を14℃において14時間で
行った。
【００５０】ついで、リガーゼ混合物全体を使用して、
Mandel及びHigaの方法（J．Mol．Biol.，53,（1970)，1
59〜162）によってCaCl2でコンピテントとしたエシェリ
キア・コリ HBIOIの細胞を形質転換させた。形質転換し
た細胞の選択を、アンピシリン 100μｇ／mlを含むＬ寒
天培地（H2O １リットル当たり、バクトトリプトン 10ｇ、Y
E ５ｇ、NaCl 10ｇ、DIFCO寒天16ｇ）上に塗抹すること
により行った。このようにしてアンピシリン耐性遺伝子
を有するプラスミドを含む細胞（AmpR）だけを単離する
ことが可能であった。
【００５１】このAmpRのクローンから、周知方法（Rodr
iguezら著、Addison−Wesley Publishing Company発
行，Recombinant DNA Techniques,（1983）参照）によ
ってプラスミド pSM116を抽出、純化した。このプラス
ミドの制限酵素開裂地図を図５に示した。
【００５２】アガロースゲル上での電気泳動により、こ
のプラスミド pSM116をプラスミドpSM110と較べたとこ
ろ、プラスミド pSM116はPvuII制限部位の所にBamHI制
限部位が存在する点でプラスミド pSM110と異なってい
た。
【００５３】（ii）プラスミド pSM131の調製 前記工程（ｉ）で得られたプラスミド pSM116 ２μｇを
溶液Ａ 50μｌで希釈し、制限酵素PstI（BIOLABS）２Ｕ
で消化させた。
【００５４】この消化反応の終わりにH2O 50μｌとフェ
ノール 100μｌとを混合物に加えた。
【００５５】ついで、フェノールを等量のエーテルで水
相から抽出し、酢酸ナトリウム３Ｍ溶液（pH5.5）１／1
0容量と95％エタノール 2.5容量とを加えて、温度−70
℃で10分間処理してDNAを沈殿させた。
【００５６】このようにして沈殿したDNAを10,000rpmで
10分間遠心分離して溶液から分離し、ついで酵素Bal 31
0.6Ｕの存在下、溶液Ａ 30μｌ中に再懸濁させた。
【００５７】消化反応を23℃で６分間行った。このよう
にしてリニアライズした（linearized）DNAを上述のよ
うにして反応混合物から沈殿、分離させた。
【００５８】このプラスミド DNAをH2O 20μｌに再懸濁
させ、該水性液１μｌ（DNA 50ng）を、T4リガーゼ 0.1
Ｕの存在下、XhoIリンカー（Wortington）のDNA 50ng
（前記工程（ｉ）において述べたように溶液Ｂ 10μｌ
中に懸濁させた）に連結させた。
【００５９】XhoIリンカーは、Molecular Cloning，A l
aboratory manual（T．Maniatis，E．F．Fritsch，J．S
ambrook編，Cold Spring Harbor Laboratory刊）に従っ
て５′末端部位で前以てリン酸エステル化してある。
【００６０】XhoIリンカーのDNA（その塩基配列は TCTCGAGA AGAGCTCT である）は、重合化する際、酵素BglIIのための認識部
位を生ずる。
【００６１】ついで、少なくとも２つのXhoIリンカーを
プラスミド pSM116のDNAに連結し、PstIで切断し、Bal
31で処理する場合には、その結果として２つの新しい制
限部位XhoI及びBglIIを呈する構造が形成されることと
なる。リガーゼ混合物10μｌを使用して、前記工程
（ｉ）のようにしてコンピテントとしたエシェリキア・
コリ HBIOIの細胞を形質転換する。この細胞はテトラサ
イクリン 20μｇ／mlを含むＬ寒天培地上に塗抹するこ
とにより、テトラサイクリン耐性、アンピシリン感受性
について選別される。
【００６２】急速法により44TcR及びAmpSクローンから
プラスミドを抽出した。
【００６３】このようにして得たプラスミド DNAを溶液
Ａ 20μｌに懸濁させた後、酵素XhoI １Ｕで消化してリ
ンカーの挿入の完成を証明する。
【００６４】アガロースゲル（７％）での分析の後、Xh
oIでリニアライズし、pSM116と比べて低減された長さを
有するプラスミドを、BglII制限部位の存在を証明する
ことを目的として分析した。BglII制限部位とXhoI制限
部位との両方を包含し、pSM116と比べて低減された長さ
を有するプラスミドをpSM131と命名した。
【００６５】プラスミド pSM131のBglII−BamHIフラグ
メントのBglII制限部位の近くの領域の配列をMaxam及び
Gilbertの方法（Methods in Enzymology，Vol．65，p．
499〜560,（1980)）によって決定した。
【００６６】図６はプラスミド pSM131の制限酵素開裂
地図であって、２つのXhoIリンカーの正確な配置を示し
ている。これらのリンカーは、β−ラクタマーゼの終止
コドン（TAA）から数えて69番目の塩基の位置（pBR322
の位置3224）及びその開始コドン（ATG）から数えて532
番目の塩基の位置（pBR322の位置3618）にあり、このよ
うにして、酵素Bal31がPstI部位から複製開始部位に向
かって大略390bp及びPstI制限部位からEcoRI制限部位に
向かってわずかに５bp削除されたことを示す。従って、
プラスミド pSM131は期待した特性を呈するものであっ
て、pBR322の複製開始部位の下流の短い距離にXhoI制限
部位及びBglII制限部位を有するものであった。
【００６７】（iii）pUC８中のファージ fd のターミネ
ーターのクローニング及びプラスミドpSM138の調製 プラスミド pUC８（Boehringer−Mannheim）１μｇ及び
エシェリキア・コリのプラスミド pLUB3 １μｇを、そ
れぞれ溶液Ａ 20μｌ中に懸濁した後、制限酵素HindIII
（BIOLABS）１Ｕで消化した。
【００６８】pUC８はHindIIIで切断されてリニアライズ
されるが、pLUB３は２つのフラグメントに切断される。
これらフラグメントのうち小さい方は大略352bpであっ
て、ファージ fd のターミネーティング配列を包含して
いた。
【００６９】プラスミド DNAを前述のようにして反応混
合物から沈殿、分離した。
【００７０】pLUB３−HindIII 60ng及びpUC８−HindIII
15ngを溶液Ｂ 10μｌに懸濁させ、T4リガーゼ 0.1Ｕの
存在の下で連結させた。
【００７１】リガーゼ混合物２μｌをエシェリキア・コ
リ JM83（BRL）の適当な細胞の形質転換に用いた。
【００７２】形質転換した細胞を、J．Messingによって
記載された如くして（Methods in Enz.，Vol．101,（19
83)，p．20〜78）アンピシリン 100μｇ／ml及びインジ
ケータＸ−galを含有するＬ寒天培地（DIFCO）上に塗抹
することによってアンピシリン耐性について選別した。
【００７３】このようにして12個の白色コロニーが得ら
れ、これらから急速法によりプラスミドを抽出した。こ
れらのプラスミドの８個は、pUC８のDNAと、ファージ f
d のターミネーターを含有するpLUB３のHindIIIフラグ
メントとから構成されていた。
【００７４】ターミネーターのHindIIIフラグメントに
おいて、BamHI制限部位はHindIII端部の一方からわずか
４塩基の距離に位置していた。BamHI制限部位もpUC８上
にHindIII制限部位から数塩基の距離に存在するので、p
UC８中におけるターミネーターのHindIIIフラグメント
のオリエンテーションが２つのBamHI制限部位が遠い位
置にあるかの如くであるとすれば、上述の如くして得ら
れたハイブリッドプラスミドのターミネーターを酵素Ba
mHIでの消化によって単離することが可能である。
【００７５】このハイブリッドプラスミドをBamHIで消
化し、DNAを7.5％アクリルアミドゲルで分離した。エチ
ジウムブロマイドで着色し、UV光線の下でDNAを可視化
すると、分析に使った８個のプラスミドのうちの２個に
ついて、BamHIでの切断後にDNAの２つのフラグメントが
認められ、そのうちの一方は大略350bpであり、他方はp
UC８の長さを有していた。
【００７６】pSM138と命名したこれらのプラスミドの１
つの制限酵素開裂地図を図７に示した。
【００７７】（iv）プラスミド pSM131へのターミネー
ターの組み込み及びプラスミド pSM137の調製 前記工程（ii）及び（iii）に記述したようにして得たp
SM131 １μｇ及びpSM138 3.5μｇをそれぞれ溶液Ａ 20
μｌ中に懸濁させた後、酵素BglII １Ｕ及びBamHI 3.5
Ｕで消化した。
【００７８】この消化反応の後、酵素を65℃で10分間不
活性化処理した。
【００７９】反応混合物２μｌを溶液Ｂ 20μｌに加え
て、T4リガーゼ 0.1Ｕと結合させた。
【００８０】酵素BamHI及びBglIIは、DNAの切断後、互
いに結合できる粘着末端を生ずるため、pSM131から及び
ファージ fd のターミネーターを含有するpSM138の小さ
なBamHIフラグメントから形成されたハイブリッド分子
を得ることが可能である。
【００８１】リガーゼ混合物２μｌを使用して、エシェ
リキア・コリ HBIOIの適当な細胞を形質転換させた。
【００８２】ついで、この形質転換した細胞を、テトラ
サイクリン 20μｇ／mlを含むＬ寒天培地プレート上で
選別した。
【００８３】このようにして得たTcRクローン中に、ハ
イブリッドプラスミド pSM137を有するもの１個が単離
された。その制限酵素開裂地図を図８に示す。
【００８４】このプラスミドは、複製の開始（反時計方
向）に先立って位置するファージ fd のターミネーター
を含むpSM138の小さなBamHIフラグメント及びpSM131か
ら構成されている。
【００８５】（ｖ）β−ラクタマーゼの構造遺伝子の後
へのHindIII制限部位の導入及びプラスミド pSM141の調
製 二重ら旋（RF）を有するファージ M13mp9 １μｇ及び前
記工程（ｉ）に関して述べたようにして得たpSM116 １
μｇを、それぞれBIOLABS社のすすめる条件下で反応混
合物Ａ 20μｌ中に懸濁させた後、酵素EcoRI １Ｕ及び
酵素BamHI １Ｕで消化させた。65℃で10分間不活性化処
理した後、これら２つの混合物のそれぞれ１μｇずつを
反応混合物Ｂ 20μｌ中に懸濁させ、T4リガーゼ 0.1Ｕ
の存在下で結合させた。
【００８６】ついで、リガーゼ混合物５μｌをエシェリ
キア・コリ JM83の適宜な細胞の形質転換に用いた。選
別はアンピシリン耐性によって行った。
【００８７】M．Zoller及びM．Smithの方法（Nucl．A
c．Res.，10,（1982)，6487〜6500）により、このよう
にして得た白色プラーク12個からファージのDNA（RF）
を調製した。
【００８８】これらのDNAを、ついで、前述のようにし
て酵素BamHI及びEcoRIで消化し、試料を0.8％アガロー
スゲル上で分離した。
【００８９】このようにして得たハイブリッド分子のう
ち２つがファージ M13のDNAとβ−ラクタマーゼの遺伝
子を有するプラスミド pSM116の2000bpのフラグメント
によって形成されていることがわかった。
【００９０】２つのプラークの一方から、ついで組換フ
ァージ DNAの単一ら旋体を得た。これをZoller及びSmit
hの方法（Nucl．Ac．Res.，10,（1982)，6487〜6500）
に従って精製した。
【００９１】ついで、塩基18個の合成オリゴヌクレオチ
ドをこのDNA領域を補足すべく設計した。これはβ−ラ
クタマーゼの遺伝子の末端に塩基１つだけ離れて続くも
のであり、その配列は次のとおりである。
【００９２】組換ファージの単一ら旋DNA、ユニバーサ
ルプライマー（BIOLABS社） TCCCAGTCACGACGT 及び合成オリゴヌクレオチド（米国カリフォルニア州サ
ンフランシスコのCreative Biomolecules社により合成
されたもの）を、β−ラクタマーゼの遺伝子の末端の後
にHindIII制限部位を配置する目的で、K．Norrisらによ
って開示された（Nucl．Ac．Res.，II,（1983)，5103〜
5112）ようにインビトロ突然変異の実験的調査に用い
た。
【００９３】インビトロ重合化及び連結反応のため、反
応混合物をBIOLABS社によりすすめられた条件下でEcoRI
３Ｕ及びBamHI ３Ｕで処理した。ついで、DNAを0.8％
アガロースゲル上で分離し、エチジウムブロマイドによ
る染色後、UV光線で可視化される2000bpのEcoRI−BamHI
フラグメントを、Molecular Cloning，A LaboratoryMan
ual（T．Maniatis，E．F．Fritsch，J，Sanbrook編，(1
982），Cold SpringHardor Laboratory発行）に開示さ
れた如くして抽出した。
【００９４】このようにして抽出したDNAセグメント 10
0ng及び7.5％アクリルアミドゲルから回収した（Maxam
及びGilbert，Enzymology，Vol．65,（1980)，526〜527
に開示された方法による）プラスミド pSM116のEcoRI−
BamHIフラグメント（大略350bp）50ngを反応混合物Ｂ 5
0μｌ中に懸濁させた後、T4リガーゼ 0.1Ｕの存在下で
結合させた。リガーゼ混合物10μｌを使用して、エシェ
リキア・コリ HBIOIの適宜の細胞を形質転換させ、アン
ピシリン（100μｇ／ml）耐性の形質転換細胞を選別し
た。
【００９５】プラスミド DNAを急速法によって４つのAm
pRクローンから調製した。
【００９６】このDNA調製物を、ついで反応混合物Ａ 30
μｌ中、酵素HindIII １Ｕで処理した。
【００９７】完全な変異の場合には、この酵素での切断
により２つのDNAフラグメント（すなわち、一方は860b
p、他方は1600bpのDNAフラグメント）を生ずるものと期
待される。
【００９８】上述のようにして得た４つのサンプルを１
％アガロースゲル上で分析した結果、これらのうち２つ
が期待どおりの特性を示した。
【００９９】これらのプラスミドの１つをpSM141と命名
した。
【０１００】その制限酵素開裂地図及びその調製に要し
た工程を図９に示した。
【０１０１】（vi）プラスミド pSM142の調製 プラスミド pSM141 １μｇ及びプラスミド pSM137（こ
れは前記工程（iv）で述べたようにして得た）１μｇを
溶液Ａ 20μｌ中に懸濁させた後、それぞれ酵素HindIII
１Ｕで消化させた。
【０１０２】この酵素HindIIIはプラスミド pSM141を２
点で切断し、２つのフラグメント（すなわち、一方は83
0bpであり、他方は1600bpである）を生ずる。pSM137も
２つのHindIII制限部位を示し、その消化により550bpの
フラグメント及び3500bpのフラグメントを生成する（図
８）。
【０１０３】各反応混合物１μｌを、酵素T4リガーゼ
0.1Ｕを含む溶液Ｂ 18μｌに加えた。リガーゼ反応を14
℃において14時間で行った。
【０１０４】65℃で10分間処理して酵素を不活性化した
後、リガーゼ混合物５μｌを用いてエシェリキア・コリ
HBIOIの適宜な細胞の形質転換を行った。
【０１０５】形質転換した細胞を、アンピシリン 100μ
ｇ／ml、テトラサイクリン 20μｇ／mlを含有するＬ寒
天培地上に塗抹することによりアンピシリン耐性、テト
ラサイクリン耐性について選別した。
【０１０６】TcRクローン及びAmpRクローンから急速法
によりpSM141の大略830bpのフラグメント及びpSM137の
大略3500bpのフラグメントにより形成されたプラスミド
が単離された。
【０１０７】図10にその制限酵素開裂地図を示す。この
プラスミドをpSM142と命名した。
【０１０８】（vii）プラスミド pSM143の調製 プラスミド pSM142 １μｇ及びイタリア国特許出願第Ａ
／82 23992号に記載のようにして得た図11に示すプラス
ミド pSM112 １μｇを溶液Ａ 20μｌ中に懸濁させ、酵
素BamHI １Ｕ及び酵素EcoRI １Ｕで温度37℃において１
時間同時に処理して切断した。
【０１０９】65℃、10分間で処理して酵素を不活性化さ
せた後、反応混合物１μｌを前述のようにしてT4リガー
ゼの存在下での連結反応に供した。
【０１１０】このようにして得たリガーゼ混合物全体
を、ついで、エシェリキア・コリ HBIOIの適当な細胞の
形質転換に用いた。アンピシリン 100μｇ／ml及びカナ
マイシン 15μｇ／mlを含有するＬ寒天板上でアンピシ
リン耐性及びカナマイシン耐性を選択することにより形
質転換体の選別を行った。
【０１１１】AmpR及びKmRクローンから急速法によりプ
ラスミド pSM143を単離した。その制限酵素開裂地図を
図２に示す。
【０１１２】pSM143は、pSM112の4950bpフラグメント及
びpSM142の2400bpフラグメントからなるものであった。
【０１１３】ついで、このプラスミド pSM143をバシラ
ス・サチリス SMS003 NRLL B 15897の細胞［Contente及
びDubnauによって開示された方法（Mol．Gen．Genet.，
167,（1979)，251〜258）によりコンピテントとしたも
の］の形質転換に用いた。
【０１１４】形質転換された細胞の選別を、カナマイシ
ン ５μｇ／mlを含有するDIFCO社のトリプトース・ブラ
ッド寒天ベース（TBAB）培地上に塗抹することで行っ
た。
【０１１５】pSM143と同じプラスミドをKmRクローンか
ら単離でき、このプラスミドはこの枯草菌の細胞内で安
定した条件下で維持せしめられることを示した。
【０１１６】次に、本発明によるプラスミドベクター p
SM143を使用する新規なプラスミドベクターの調製例を
参考例として例示する。
【０１１７】
【参考例１】プラスミド pSM146の調製 本発明によるプラスミド pSM143 １μｇを、酵素SstI
１Ｕ及び酵素XbaI １Ｕにより同時に溶液Ａ 20μｌ中、
37℃、１時間で消化させた。
【０１１８】65℃、10分間で酵素を不活性化した後、反
応混合物１μｌをT4リガーゼ 0.1Ｕ及び合成DNAセグメ
ント（その塩基配列を図３に示す）50ngを含有する溶液
Ｂ 19μｌに加えた。
【０１１９】リガーゼ反応を14℃において14時間行っ
た。
【０１２０】酵素を65℃、10分間での処理により不活性
化した後、リガーゼ混合物５μｌを用いてエシェリキア
・コリ HBIOIの適当な細胞の形質転換を行った。
【０１２１】ついで、形質転換した細胞の選別をアンピ
シリン 100μｇ／mlを含有するＬ寒天プレート上で行っ
た。AmpRから急速法によって、pSM143の740bpのフラグ
メント SstI−XbaIフラグメントが15bp＋８孤立塩基の
合成DNAセグメントと置き換えられたプラスミドが単離
された。この新しいプラスミドをpSM146と命名した。そ
の制限酵素開裂地図は図３に示すとおりである。
【０１２２】
【参考例２】プラスミド pSM147の調製 図４に示す塩基配列を有する合成DNAセグメント 50ngを
リガーゼ反応に用いて、上述の参考例１と同じようにし
てプラスミドの調製を行った。
【０１２３】AmpRクローンから単離されたプラスミド p
SM147は、pSM143と比較すると、SstI−XbaIフラグメン
トが24bp＋８孤立塩基の合成セグメントで置換えられて
いることを示した。このプラスミド pSM147の制限酵素
開裂地図を図８に示す。
【０１２４】
【参考例３】pSM143、pSM146及びpSM147のβ−ラクタマーゼ活性の決
定 プラスミド pSM143、pSM146、pSM147及びpSM119（対
照）を含有するエシェリキア・コリ HBIOI及びバシラス
・サチリス BGSC 1A246の細胞を容積250mlの三角フラス
コ内で培養した。それぞれの三角フラスコには120℃で1
5分間殺菌した培地25mlが入れてある。
【０１２５】バシラス・サチリスについては、SMS培地
にグルコース（0.5％）、トリプトファン（50μｇ／m
l）及び微量元素を加えたものの中で培養した。
【０１２６】エシェリキア・コリについては、LB（DIFC
O）培地で培養した。
【０１２７】これら三角フラスコに接種し、37℃で６時
間振とう培養した。
【０１２８】β−ラクタマーゼの生産を、エシェリキア
・コリについては A．Nicolaidisらによって記述された
（J．Bacteriol.，135,（1978)，178）ようにして得た
ペリプラスム標本中で、またバシラス・サチリスについ
ては上澄液中と超音波で破砕処理した細胞中との両方で
測定した。この超音波破砕処理細胞を調製するために、
バシラス・サチリスの培養液５mlを5000rpmで10分間遠
心分離処理した。このようにして得た細胞を30mM Tris
・HCl（pH7.5）及び50mM NaClを含有する溶液５ml中に
懸濁し、再び5000rpmで10分間遠心分離処理した。つい
で、この細胞を100mMリン酸塩緩衝液（pH7.0）５ml中に
懸濁させ、MSE超音波処理器（Soniprep社モデル150）を
最大出力で働かせ、３回（１回１分間）処理した。
【０１２９】β−ラクタマーゼ活性をO′Callaghanらに
よって記載された（Antimicrob．Ag．Chemother：I,(19
72)，283〜288）ようにしてニトロセフィン（Nitrocefi
n）で測定した。
【０１３０】β−ラクタマーゼ１単位は、37℃において
毎分１ナノモルの基質を加水分解するに要する酵素の量であ
る。
【０１３１】表１はバシラス・サチリス BGSC 1A246及
びエシェリキア・コリ HBIOIの各培養基中で測定したβ
−ラクタマーゼ活性を示す。
【０１３２】
【表１】 β−ラクタマーゼ活性（Ｕ／ml） プラスミド エシェリキア・コリ バシラス・サチリス HB 101 BGSC 1A246 pSM119 1300 U／ml ＊ 380 U／ml pSM143 2000 U／ml ＊ 700 U／ml pSM146 12000 U／ml -- pSM147 85000 U／ml -- ＊上澄み液中及び超音波処理した細胞中で測定した活性の総和
【図面の簡単な説明】
【図１】プラスミド pSM110の制限酵素開裂地図を示す
図である。
【図２】プラスミド pSM143の制限酵素開裂地図を示す
図である。
【図３】プラスミド pSM146の制限酵素開裂地図及びプ
ロモーターの−35領域に存在する合成DNAセグメントの
塩基配列を示す図である。
【図４】プラスミド pSM147の制限酵素開裂地図及びプ
ロモーターの−35領域に存在する合成DNAセグメントの
塩基配列を示す図である。
【図５】プラスミド pSM116の制限酵素開裂地図を示す
図である。
【図６】プラスミド pSM131の制限酵素開裂地図及び２
つのXhoIリンカーの正確な配置を示す図である。
【図７】プラスミド pSM138の制限酵素開裂地図及び大
腸菌ファージ fd のターミネーターを含有するHindIII
フラグメントの正確なオリエンテーションを示す図であ
る。
【図８】プラスミド pSM137の制限酵素開裂地図及びプ
ラスミドの複製（反時計回り方向）の開始前のファージ
fd のターミネーターの配置を示す図である。
【図９】プラスミド pSM141の制限酵素開裂地図及びそ
の調製の各段階（インビトロ突然変異）を示す図であ
る。
【図１０】プラスミド pSM142の制限酵素開裂地図を示
す図である。
【図１１】プラスミド pSM112の制限酵素開裂地図を示
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:125） (72)発明者 アントニオ・メーレ イタリー国パビア市ビア・ラルディラーゴ ５ (72)発明者 エリザベッタ・コレッチ イタリー国ミラノ市ビア・カターニア３ (72)発明者 スザンナ・カンパニョーリ イタリー国コドーニョ市ビア・チ・カッタ ネオ43ア (72)発明者 レンゾ・ノガロット イタリー国モッタ・ディ・リベンザ市リビ エラ・モルメンチ42

Claims (2)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】プロモーターがpE194のエリスロマイシン
    のものであり、ターミネーティング配列が大腸菌のファ
    ージ fd のものであることを特徴とする、プラスミドベ
    クター pSM143。
  2. 【請求項２】プロモーターがpE194のエリスロマイシン
    のものであり、ターミネーティング配列が大腸菌のファ
    ージ fd のものであるプラスミドベクター pSM143を調
    製する方法において、ａ）PvuII制限部位をBamHI制限部
    位で置換えることによってプラスミド pSM110を変性し
    て得られたプラスミド pSM116を単離し、ｂ）該プラス
    ミド pSM116の複製開始部位の下流側に、クローン化に
    使用される２つの制限酵素XhoI及びBglIIの制限部位を
    配置して得られたプラスミド pSM131を単離し、ｃ）大
    腸菌のファージ fd のターミネーターを有するHindIII
    フラグメントをプラスミド pUC８に挿入して得られたプ
    ラスミド pSM138を単離し、ｄ）該プラスミド pSM138の
    ファージ fd のターミネーターを制限酵素BamHIによる
    消化後に単離し、ｅ）ファージ fd のターミネーターを
    含有するBamHIフラグメントをプラスミド pSM131のBglI
    I制限部位に挿入して得られたプラスミド pSH137を単離
    し、ｆ）プラスミド pSM116のインビトロ突然変異処理
    によってタンパク質の構造遺伝子の下流側にHindIII制
    限部位を挿入して得られたプラスミド pSM141を単離
    し、ｇ）２つのプラスミド pSM141及びpSM137の消化後
    に得られたβ−ラクタマーゼとプラスミド pSM137の350
    0bpのHindIIIフラグメントとをDNA T4リガーゼの存在下
    で連結させ、得られたプラスミド pSM142を単離し、
    ｈ）制限酵素BamHI及びEcoRIでプラスミド pSM142及びp
    SM112を消化した後、DNA T4リガーゼの存在下で前記プ
    ラスミド pSM142のBamHI−EcoRIフラグメントとプラス
    ミド pSM112とを結合させ、得られたプラスミド pSM143
    を単離することを特徴とする、プラスミドベクター pSM
    143の調製法。
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