NL8820102A - RECOMBINANT PLASMIDE DNA PPR-IL2-19 CODING THE SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND BACTERIA TRIBE ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (PPR-IL2-19) PRODUCING HUMAN INTERLEUKIN-2 PLASMINE . - Google Patents
RECOMBINANT PLASMIDE DNA PPR-IL2-19 CODING THE SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND BACTERIA TRIBE ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (PPR-IL2-19) PRODUCING HUMAN INTERLEUKIN-2 PLASMINE . Download PDFInfo
- Publication number
- NL8820102A NL8820102A NL8820102A NL8820102A NL8820102A NL 8820102 A NL8820102 A NL 8820102A NL 8820102 A NL8820102 A NL 8820102A NL 8820102 A NL8820102 A NL 8820102A NL 8820102 A NL8820102 A NL 8820102A
- Authority
- NL
- Netherlands
- Prior art keywords
- dna
- plasmid
- ppr
- gene
- human interleukin
- Prior art date
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/54—Interleukins [IL]
- C07K14/55—IL-2
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
- C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
«•V· ^ /¾ , 88 20 1 0 2-«• V · ^ / ¾, 88 20 1 0 2-
Recombinant plasmide—DNA pPR—IL2—19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, werkwijze voor de bereiding daarvan en bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk interleukine-2 produceert en het plasmide-DNA bevat» 5Recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19 which encodes the synthesis of human interleukin-2, method for its preparation and bacterial strain Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) which produces human interleukin-2 and contains the plasmid DNA »5
Aanvraagsters noemen als uitvinders: I. Vladimir Georgievich Debabov, 10 2. Elmar Yanovich Gren, 3. Jury Ivanovich Kozlov, 4. Sergei Vladimirovich Mashko, 5. Alexandr Yakovlevich Strongin, 6. Viktor Emilievich Sterkin, 15 7. Vitaly Lvovich Jurin, 8. Sergei Viktorovich Kostrov, 9. Alexandr Jurievich Tsimanis, 10. Andris Yanovich Avot, II. Nadezhda Viktotovna Romanchikova, 20 12. Alexandr Ivanovich Kosikov, 13. Maxim Eduardovich Trukhan, 14. Andrei Vladimirovich Mochulsky, 15. Tatyana Veniaminovna Chernovskaya, 16. Elena Alexeevna Nosovskaya, 25 17. Marina Alexeevna Skvortsova 18. Svetlana Mendeleevna Mazel.Applicants name as inventors: I. Vladimir Georgievich Debabov, 10 2. Elmar Yanovich Gren, 3. Jury Ivanovich Kozlov, 4. Sergei Vladimirovich Mashko, 5. Alexandr Yakovlevich Strongin, 6. Viktor Emilievich Sterkin, 15 7. Vitaly Lvovich Jurin, 8 Sergei Viktorovich Kostrov, 9. Alexandr Jurievich Tsimanis, 10. Andris Yanovich Avot, II. Nadezhda Viktotovna Romanchikova, 20 12. Alexandr Ivanovich Kosikov, 13. Maxim Eduardovich Trukhan, 14. Andrei Vladimirovich Mochulsky, 15. Tatyana Veniaminovna Chernovskaya, 16. Elena Alexeevna Nosovskaya, 25 17. Marina Alexeevna Skvortsova 18. Svetlana Mendeleevna Maz.
Gebied van de uitvinding 30 De uitvinding ligt op het gebied van de genetische techniek en heeft in het bijzonder betrekking op een nieuw recombinant plasmide-DNA pPR-IL2-19 dat de synthese van menselijke interleukine-2 codeert, op een werkwijze voor de bereiding daarvan en op een bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk inter-35 leukine-2 produceert en het DNA bevat.Field of the Invention The invention is in the field of genetic engineering and relates in particular to a novel recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19 encoding the synthesis of human interleukin-2, to a method for its preparation and on a bacterial strain Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) which produces human inter-leukinin-2 and contains the DNA.
Stand van de techniekState of the art
Het natuurlijke menselijke interleukine-2 ofwel een factor voor de groei van T-cellen is een glycoproteine met een molecuulmassa van de 40 polypeptideketen van ongeveer 15.000 Dalton en het wordt door T-cellen .8820102 2 geproduceerd wanneer zij met leptine of een overeenkomstig antigeen worden geactiveerd. Interleukine-2 is een complex werkende immunomodu— lator en in het bijzonder stimuleert het een afweerreactie als gevolg van activering van T-lymfocyten waarbij het de mitogenese van thymocy-5 ten versterkt, de aanzet geeft tot een cytotoxische werking van T-cel-len en dergelijke. Interleukine-2 heeft derhalve een grote betekenis voor de behandeling van immunologische verstoringen zoals kwaadaardige degeneraties, bacteriële en virale infecties, ziekten die verband houden met afweerdeficientie, autoimmuunziekten en dergelijke. Recht-10 streeks uit menselijk serum of uit een celcultuur van de Yurkat-lijn gewonnen natuurlijk interleukine-2 is slechts in zeer beperkte hoeveelheden beschikbaar die onvoldoende zijn voor het bestuderen van de eigenschappen en de klinische mogelijkheden daarvan. Een alternatieve bron van interleukine-2 kan worden gevormd door stammen van microörga-15 nismen die worden verkregen door middel van genetische technieken en die recombinante plasmiden dragen met het gen van interleukine-2 en een doeltreffende expressie van dit gen bewerkstelligen.The natural human interleukin-2 or a factor for the growth of T cells is a glycoprotein with a molecular mass of the polypeptide chain of about 15,000 Daltons and it is produced by T cells 8820102 when they are made with leptin or a corresponding antigen. activated. Interleukin-2 is a complex-acting immunomodulator and, in particular, stimulates an immune response due to activation of T lymphocytes, enhancing the mitogenesis of thymocytes, triggering a cytotoxic action of T cells. and such. Interleukin-2 therefore has great significance for the treatment of immunological disorders such as malignant degenerations, bacterial and viral infections, diseases related to defense deficiency, autoimmune diseases and the like. Natural interleukin-2 obtained directly from human serum or from a cell culture of the Yurkat line is only available in very limited quantities that are insufficient to study its properties and clinical potential. An alternative source of interleukin-2 may be strains of microorganisms obtained by genetic engineering and carrying recombinant plasmids with the gene of interleukin-2 and effecting effective expression of this gene.
Bekend zijn recombinante plasmide-DNA’s die menselijk interleukine-2 coderen zoals een recombinant plasmide-DNA pPLcMuHil 201 en de 20 stam E. coli Κ12Δ ΗΙΔ trp (pPLcMuHil 201) die dit bevatten (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J.,Known recombinant plasmid DNAs encoding human interleukin-2 such as a recombinant plasmid DNA pPLcMuHil 201 and the E. coli Κ12Δ ΗΙΔ trp (pPLcMuHil 201) strain containing this (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J.,
Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Res·, 11, 4307-4323).Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Res, 11, 4307-4323).
In dit recombinante DNA-molecuul wordt de transcriptie van het gen van interleukine-2 gestuurd door middel van een regeleenheid P^O^ 25 van een bacteriofaag λ en de start van de vertaling van het eiwitpro-dukt van het gen komt tot stand door constructie van een hybride gebied voor het binden van ribosomen op basis van een SD-sequentie van de faag Mu. De maximale opbrengst van menselijk interleukine-2 die wordt verkregen door het kweken van de producentstam E. coli K12 Δ Hl Δ trp 30 (pPLcMuHil 201) is 5 tot 10% van de totale hoeveelheid celeiwit.In this recombinant DNA molecule, the transcription of the gene of interleukin-2 is controlled by a control unit P ^ O ^ 25 of a bacteriophage λ and the translation of the protein product of the gene is initiated by construction of a hybrid region for binding ribosomes based on an SD sequence of the phage Mu. The maximum yield of human interleukin-2 obtained by culturing the producer strain E. coli K12 Δ Hl Δ trp 30 (pPLcMuHil 201) is 5 to 10% of the total amount of cell protein.
De hierboven genoemde recombinante plasmide-DNA’s en de stam die deze bevatten hebben een aantal nadelen die het gevolg zijn van het feit dat de gestuurde expressie van het gen IL2 door de P^promotor hetzij een extra aanwezig plasmide met het gen van een temperatuurge-35 voelige cl repressor (clts857), hetzij het gebruik van een stam die een defectieve profaag met een mutantallel cl als recipient, vereist. Dit resulteert in een beperkt gebied van stammen van ontvangers en in een potentiële instabiliteit van recombinante plasmiden onder kweekomstan-digheden bij massaproduktie als gevolg van een re-CA-afhankelijke re-40 combinatie tussen het plasmide dat een gen van interleukine-2 bevat met . 882 0102 3 een verenigbaar plasmide of met overeenkomstige gebieden van een defectieve profaag.The above-mentioned recombinant plasmid DNAs and the strain containing them have a number of drawbacks due to the directed expression of the IL2 gene by the P 1 promoter or an additional plasmid containing the gene of a temperature value. sensitive cl repressor (clts857), or the use of a strain that requires a defective propage with a mutant allele cl as recipient. This results in a limited region of recipient strains and in a potential instability of recombinant plasmids under culture conditions in mass production due to a re-CA dependent re-40 combination between the plasmid containing an interleukin-2 gene with. 882 0102 3 a compatible plasmid or with corresponding regions of a defective propage.
Bovendien wordt door het gebruik van de betrekkelijk korte SD-sequentie voor het tot stand brengen van een hybride gebied voor het 5 binden van ribosomen het potentiële vermogen van het translatieapparaat van E. coli niet volledig benut, met als gevolg een betrekkelijk laag niveau van de synthese van menselijk interleukine-2 in cellen van de producentstam.In addition, using the relatively short SD sequence to create a hybrid region to bind ribosomes does not fully utilize the potential potential of the E. coli translation device, resulting in a relatively low level of synthesis of human interleukin-2 in producer stem cells.
Dit alles kan leiden tot een aanzienlijke verlaging van de hoe-10 veelheid interleukine-2 in een biomassa van de producentstam bij kweken daarvan op grote schaal, wat uiteindelijk het winnen van een zuiver eiwit compliceert en de opbrengst aan gewenst produkt verlaagt.All this can lead to a significant decrease in the amount of interleukin-2 in a biomass of the producer strain upon large scale cultivation thereof, which ultimately complicates the recovery of a pure protein and decreases the yield of desired product.
Openbaring van de uitvinding 15 Het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 dat de synthese van men selijk interleukine-2 codeert, een werkwijze voor de bereiding daarvan en de bacteriestam Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-l9) dat dit DNA bevat zijn nieuw en uit de literatuur tot nu toe onbekend.Disclosure of the Invention The recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19 encoding the synthesis of human interleukin-2, a method for its preparation and the bacterial strain Escherichia coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2 -19) containing this DNA contains his new and hitherto unknown from literature.
De uitvinding is gericht op het verschaffen van een nieuw recombi-20 nant plasmide-DNA dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, op een werkwijze voor het bereiden daarvan en op een zeer productieve stam voor interleukine-2 die dit DNA bevat en die interleukine-2 in hoge opbrengst produceert.The invention is directed to providing a novel recombinant plasmid DNA encoding the synthesis of human interleukin-2, a method for its preparation and a highly productive strain for interleukin-2 containing this DNA and which produces interleukin-2 in high yield.
Dit doel wordt bereikt doordat het recombinante plasmide-DNA 25 pPR-IL2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert, een omvang van 3850 baseparen heeft en bestaat uit de volgende eenheden: - een BamHI - Bgl II-fragment van 3400 b.p. van het vectorplasmi-de pPRI124B dat wordt geproduceerd op basis van pPR40 en pML24; - een Cfrl3 - Bgl II-fragment van 450 b.p. van het plasmide PAA-30 1213-23B dat wordt geproduceerd door vervanging van het restrictiege- bied voor Stul door het restrictiegebied voor Bgl II in het plasmide pAAl213-23 ter grootte van 5400 b.p., dat is geconstrueerd op basis van de plasmide pBR-322 en dat het ColEI-replicon, een stabiliteitsgen (resistentiegen) voor ampicilline en een ^DuA-copie van het gen van 35 menselijk interleukine-2 bevat, waarvan de expressie wordt bewerkstelligd door een promotor en een SD-sequentie van het tryptofaan-operon van E. coli en dat de volgende kenmerken heeft: - het bevat een startgebied voor de replicatie van ColEI-repli-con, een gen van een temperatuurgevoelige repressor clts857 van de faag 40 A, een resistentiegen voor ampicilline, een span van P~onafhankelij- .8820102 4 ke terminators van de transcriptie van de faag fd, een regelgebied PR0R» SD-sequentie en ATG-startcodon van een cro-gen van de faag X dat de sequentie van rijp menselijk interleukine-2 codeert; - combinatie van het regelgebied %°R en ATG-codon van het 5 cro-gen met een sequentie van het gen van interleukine-2 en terminator van fd-transcriptie wordt zo tot stand gebracht dat een hybride gebied voor het binden van de ribosomen wordt gevormd dat de volgende nucleo-tidenvolgorde heeft: 5..TAAGGAGGTTGTATGGCC...-3', waarin resp. TAAGGAGGT en ATG-SD-sequentie en het startcodon van het cro-gen; GCC -10 eerste Ala-codon van interleukine-2, waarbij achter het stopcodon van het gen van interleukine-2 een span van p -onafhankelijke terminators van de fd-transcriptie aanwezig is; - het heeft unieke herkenningsgebieden voor de restrictasen Clal, waarvan de coördinaat het beginpunt voor het tellen is (0), Xbal (onge- 15 veer 990), BglII (ongeveer 1250), PstI (ongeveer 3070); gedeponeerd op 12.01.87 in de verzameling van culturen van microörganismen van de All-Union Research Institute of Antibiotics en geregistreerd onder nr. 1869.This object is achieved in that the recombinant plasmid DNA 25 pPR-IL2-19 encoding the synthesis of human interleukin-2 has a size of 3850 base pairs and consists of the following units: a BamHI - Bgl II fragment of 3400 b.p. of the vector plasmid pPRI124B produced from pPR40 and pML24; a 450 b.p. Cfrl3 - Bgl II fragment. of the plasmid PAA-30 1213-23B produced by replacing the Stul restriction region with the Bgl II restriction region in the 5400 bp plasmid pAAl213-23 constructed from the plasmid pBR-322 and containing the ColEI replicon, a stability gene (resistance gene) for ampicillin, and a 1 DuA copy of the human interleukin-2 gene, the expression of which is mediated by a promoter and an SD sequence of the tryptophan operon of E. coli and having the following characteristics: - it contains a starting region for the replication of ColEI-replicon, a gene of a temperature-sensitive repressor clts857 of the phage 40 A, a resistance gene for ampicillin, a span of P-independent .8820102 4 phage fd transcription terminators, a control region PR0R »SD sequence and ATG start codon of a phage X cro gene encoding the sequence of mature human interleukin-2; - combination of the control region% ° R and ATG codon of the 5 cro gene with a sequence of the gene of interleukin-2 and terminator of fd transcription is effected in such a way that a hybrid region for binding of the ribosomes becomes formed which has the following nucleotide sequence: 5..AGAGGAGGTTGTATGGCC ...- 3 ', in which resp. TAAGGAGGT and ATG-SD sequence and the cro gene start codon; GCC -10 first Ala codon of interleukin-2, behind the interleukin-2 gene stop codon is a span of β-independent terminators of the fd transcription; - it has unique recognition regions for the restases Clal, the coordinate of which is the starting point for counting (0), Xbal (about 990), BglII (about 1250), PstI (about 3070); deposited on 12.01.87 in the micro-organism collection of the All-Union Research Institute of Antibiotics and registered under No. 1869.
De werkwijze voor de constructie van het recombinante plasmide-DNA 20 volgens de uitvinding omvat modificatie van het plasmide pAAl213-23 ter grootte van 5400 b.p. dat is geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322 en dat het ColEI-replicon, een resistentiegen voor ampicilline en een ^DNA-copie van menselijk interleukine-2 bevat, waarvan de expressie wordt bewerkstelligd door de promotor en SD-sequentie van het 25 tryptofaan-operon van E. coli, door middel van vervanging van een res-trictiegebied voor Stu I door een restrictiegebied voor Bgl II; het resulterende plasmide pAA1213-23B wordt met het restrictase Cfrl3 behandeld en de daarbij verkregen enkelstrengs einden van DNA moleculen worden opgevuld met het Klenov-fragment van het DNA-polymerase I van 30 E. coli, waarna het Cfrl3-fragment van het plasmide pAA1213-238 met het gen van interleukine-2 wordt gewonnen door middel van preparatieve elektroforese in een agarosegel en door middel van het DNA-ligase van de faag T4 wordt opgenomen in het vectormolecuul pPR124B dat is geconstrueerd op basis van plasmiden pPR40 en pML24 dat vooraf is gesplitst 35 door middel van het restrictase BamHI, en enkelstrengs eindpunten van het DNA in het restrictiegebied worden verwijderd door middel van SI-endonuclease, waarna het verkregen mengsel wordt behandeld met restrictase Bgl II en DNA moleculen worden gecombineerd tot ringen door middel van T4 DNA-ligase; cellen van E. coli C600 worden met het verkregen 40 mengsel omgezet; de transformanten worden op een medium met ampicilline 8820102 5 geënt en bij 28°C gekweekt, waarna wordt geselecteerd op een verlaagde groeisnelheid bij een temperatuur van 42°C, uit de geselecteerde klonen het plasmide pPR-112-19 wordt gewonnen, waarin de juiste combinatie van de fragmenten wordt nagegaan door herstel op de voegpunten van de uit-5 gangsgebieden van het DNA, van de vooraf afwezige herkenningssequentie van het restrictase Bsp RI.The method of constructing the recombinant plasmid DNA 20 of the invention comprises modification of the plasmid pAAl213-23 of 5400 b.p. constructed on the basis of the plasmid pBR-322 and containing the ColEI replicon, a resistance gene for ampicillin and a DNA copy of human interleukin-2, the expression of which is mediated by the promoter and SD sequence of the E. coli tryptophan operon, by replacing a Stu I restriction region with a Bgl II restriction region; the resulting plasmid pAA1213-23B is treated with the restrictase Cfrl3 and the resulting single-stranded ends of DNA molecules are filled with the Klenov fragment of the DNA polymerase I of 30 E. coli, after which the Cfrl3 fragment of the plasmid pAA1213- 238 with the gene of interleukin-2 is recovered by preparative electrophoresis in an agarose gel and incorporated by the DNA ligase from the phage T4 into the vector molecule pPR124B constructed from plasmids pPR40 and pML24 which has been pre-cleaved 35 by the restrictase BamHI, and single-stranded endpoints of the DNA in the restriction region are removed by SI endonuclease, after which the resulting mixture is treated with restrictase Bgl II and DNA molecules are combined into rings by T4 DNA ligase ; cells of E. coli C600 are reacted with the resulting mixture; the transformants are seeded on a medium with ampicillin 8820102 and grown at 28 ° C, after which a selection is made at a reduced growth rate at a temperature of 42 ° C, from the selected clones the plasmid pPR-112-19 is collected, in which the correct combination of the fragments is checked by repairing the pre-absent recognition sequence of the restrictase Bsp RI at the joining points of the starting regions of the DNA.
Het plasmide volgens de uitvinding heeft als kenmerk dat het gen clts857 - regulator van de start van de transcriptie van de bacterio-faag A ~ in het molecuul gelegen is en de expressie van het gen van 10 interleukine-2 wordt gestuurd door de Pg~promotor. Deze omstandigheid maakt het mogelijk een eventuele recA-afhankelijke recombinatie tussen het voor het gen van interleukine-2 coderende plasmide en een verenigbaar ingebouwd plasmide of een defectieve profaag te vermijden. De wijze van bereiding van het recombinante plasmide pPR-IL2-19 waarin de 15 SD-sequentie en het AUG-codon van het cro-gen van de bacteriofaag Λ zijn gecombineerd met het coderende gebied van het gen van menselijk interleukine-2, leidt tot de produktie van een hybride gebied voor het binden van ribosomen van het gen van interleukine-2 met een optimale primaire en ruimtelijke structuur van het 5’-terminale gebied van het 20 matrix-RNA.The plasmid according to the invention is characterized in that the gene clts857 - regulator of the transcription start of the bacteriophage A ~ is located in the molecule and the expression of the gene of interleukin-2 is driven by the Pg ~ promoter. . This circumstance makes it possible to avoid any recA-dependent recombination between the interleukin-2 gene encoding plasmid and a compatible built-in plasmid or a defective propage. The manner of preparation of the recombinant plasmid pPR-IL2-19 in which the SD sequence and the AUG codon of the cro gene of the bacteriophage Λ are combined with the coding region of the human interleukin-2 gene. the production of a hybrid region for binding ribosomes of the interleukin-2 gene with an optimal primary and spatial structure of the 5 'terminal region of the matrix RNA.
De uitvinding heeft eveneens betrekking op de stam E. coli VNIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk interleukine produceert en het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 bevat, dat volgens de uitvinding wordt verkregen door genetische inbouw van het recombinante 25 plasmide-DNA pPR-IL2-19 in Escherichia coli. De stam volgens de uitvinding werd op 12.01.87 gedeponeerd in de verzameling van culturen van microörganismen van het All-Union Research Institute of Antibiotics en onder nr. 1869 geregistreerd. De stam volgens de uitvinding maakt het mogelijk een stabiele produktie van menselijk interleukine-2 onder om-30 standigheden van een kweek op grote schaal te bewerkstelligen en een opbrengst van het gewenste produkt van (8-10) x 10^ Mü/1 te bereiken, wat overeenkomt met 8-12% van de totale hoeveelheid celeiwit.The invention also relates to the strain E. coli VNIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) which produces human interleukin and contains the recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19, which according to the invention is obtained by genetic incorporation of the recombinant Plasmid DNA pPR-IL2-19 in Escherichia coli. The strain according to the invention was deposited on 12.01.87 in the collection of microorganism cultures of the All-Union Research Institute of Antibiotics and registered under No. 1869. The strain according to the invention makes it possible to achieve a stable production of human interleukin-2 under large-scale culture conditions and to achieve a yield of the desired product of (8-10) x 10 µm / l. , which corresponds to 8-12% of the total amount of cell protein.
Beste wijze voor het uitvoeren van de uitvinding 35 De constructie van het recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 vol gens de uitvinding geschiedt in een aantal stappen.Best Mode for Carrying Out the Invention The construction of the recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19 according to the invention takes place in a number of steps.
Het plasmide pAA1213-23 ter grootte van 5400 b.p. dat is geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322 en het ColEI-replicon bevat, een resistentiegen voor ampicilline en een ^DuA-copie van een gen van 40 menselijk interleukine-2 bevat waarvan de expressie wordt bewerkstel- .8820102 6 ligd door een promotor en een SD-sequentie van het tryptofaan-operon van E. coli, wordt gemodificeerd door vervanging van een restrictieger-bied voor Stu I door een restrictiegebied voor Bgl II onder vorming van het plasmide pAA1213-23B dat met het restrictase Cfrl3 wordt behandeld, 5 en de daarbij verkregen enkelstrengsuiteinden van DNA-moleculen worden aangevuld door middel van een Klenov-fragment van DNA-polymerase I van E. coli. Vervolgens wordt door middel van preparatieve elèktroforese in een gel van laagsmeltende agarose een Cfr-fragment van het plasmide pAA1213-23B met daarin een gen van interleukine-2 geïsoleerd.The plasmid pAA1213-23 at the size of 5400 b.p. constructed on the basis of the plasmid pBR-322 and containing the ColEI replicon, a resistance gene for ampicillin and a 1 DuA copy of a gene of 40 human interleukin-2 expressed by an expression of a .8820102 6. promoter and an SD sequence of the E. coli tryptophan operon, is modified by replacing a Stu I restriction region with a Bgl II restriction region to form the plasmid pAA1213-23B treated with the restrictase Cfrl3, 5 and the single-stranded ends of DNA molecules obtained thereby are supplemented by means of a Klenov fragment of DNA polymerase I from E. coli. A Cfr fragment of the plasmid pAA1213-23B containing a gene of interleukin-2 is then isolated by preparative electrophoresis in a gel of low-melting agarose.
10 Daarna wordt een vectorplasmide pPR124B geconstrueerd. Hiertoe wordt in het DNA van het plasmide pPR40 in het herkenningsgebied van het restrictase Bgl II een deletie aangebracht door middel van het exo-nuclease Bal31 waarbij het plasmide pPRIOO wordt verkregen, waarin het herkenningsgebied voor BamHI direct na het bindingsgebied van ribosomen 15 van de faag X is gelegen, zodat in het gebied van het startcodon AUG de sequentie:Then a vector plasmid pPR124B is constructed. To this end, a deletion is made in the DNA of the plasmid pPR40 in the recognition region of the restrictase Bgl II by means of the exo-nuclease Bal31 to obtain the plasmid pPRIOO, in which the recognition region for BamHI immediately after the binding region of ribosomes of the phage X is located so that in the region of the start codon AUG the sequence:
AUGGATCCAUGGATCC
BamHIBamHI
wordt gevormd.is being formed.
20 Later wordt via conventionele genetische technieken het kleinste20 Later, the smallest is achieved via conventional genetic techniques
Pstl-BamHI fragment van het plasmide pPRIOO gecombineerd met het grootste Pstl-BamHI-fragment van het plasmide pML24 onder vorming van het plasmide pPRI24, waarin door middel van een oligonucleotide-koppelaar het herkenningsgebied van het restrictase Bgl II is ingevoerd in plaats 25 van Xbal onder vorming van het plasmide pPRI24B.Pstl-BamHI fragment of the plasmid pPRIOO combined with the largest Pstl-BamHI fragment of the plasmid pML24 to form the plasmid pPRI24, into which the recognition region of the restrictase Bgl II has been introduced in place of Xbal by means of an oligonucleotide coupler. to form the plasmid pPRI24B.
Vervolgens wordt het Cfrl3-fragment van het plasmide pAA1213-23B met het gen van interleukine-2 door middel van een DNA-ligase van de faag T4 ingebouwd in een vectormolecuul van pPR124B dat is gesplitst door middel van het restrictase BamHI, en met door middel van het SI-30 endonuclease verschoven enkelstrengs DNA-eindstukken, en ringsluiting van lineaire DNA-moleculen wordt tot stand gebracht door middel van het DNA-ligase T4. Het aldus verkregen mengsel wordt gebruikt om cellen van E. coli C600 te transformeren, waarna de transformanten op een medium met ampicilline worden geënt en bij een temperatuur van 28°C worden ge-35 kweekt, waarna wordt geselecteerd op een verlaagde groeisnelheid bij een temperatuur van 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt een plasmide-DNA gewonnen dat aangeduid wordt als pPR-IL2-19, waarin de juiste rangschikking van de fragmenten wordt nagegaan door herstel, aan de verbindingspunten van de startgebieden van het DNA, van een vooraf 40 afwezige sequentie voor de herkenning van het restrictase Bsp RI.Then, the Cfrl3 fragment of the plasmid pAA1213-23B with the gene of interleukin-2 is incorporated into a vector molecule of pPR124B cleaved by the restrictase BamHI, using a DNA ligase from the phage T4, and by of the SI-30 endonuclease shifted single-stranded DNA terminals, and cyclization of linear DNA molecules is accomplished by means of the DNA ligase T4. The mixture thus obtained is used to transform cells of E. coli C600, after which the transformants are seeded on a medium with ampicillin and grown at a temperature of 28 ° C, and then selected at a reduced growth rate at a temperature of 42 ° C. From the clones thus selected, a plasmid DNA is designated as pPR-IL2-19, in which the correct arrangement of the fragments is checked by restoration, at the junctions of the DNA start regions, of a pre-absent sequence for the recognition of the restrictase Bsp RI.
- 882 0102 7- 882 0102 7
De stam E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) volgens de uitvinding wordt geproduceerd door transformatie van een ontvangende bacteriestam van Escherichia coli door middel van een recombinant plas-mide-DNA pPR-IL2-19. Als ontvangende stam kan gebruik worden gemaakt 5 van de stammen E. coli C600, E. Coli VNIGenetika VL-903 (gedeponeerd bij All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms en geregistreerd onder nr. BK t"jMB-3546) en andere derivaten van E. coli KI2. Na de transformatie worden recombinante klonen gese-10 lecteerd op een medium met ampicilline bij een temperatuur van 28°C.The E. coli VNI1Genetika VL 903 (pPR-IL2-19) strain of the invention is produced by transformation of a recipient Escherichia coli bacterial strain by means of a recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19. As the recipient strain, use may be made of strains E. coli C600, E. Coli VNIGenetika VL-903 (deposited with All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms and registered under No. BK t "jMB-3546) and other derivatives of E. coli KI 2. After transformation, recombinant clones are selected on a medium containing ampicillin at a temperature of 28 ° C.
De stam volgens de uitvinding wordt gekenmerkt door de synthese van menselijk interleukine-2 onder omstandigheden waarbij de P^**pro-motor wordt onderdrukt, resistentie voor ampicilline en een lagere groeisnelheid bij kweek van de cellen bij een temperatuur van 42°C.The strain according to the invention is characterized by the synthesis of human interleukin-2 under conditions suppressing the P ^ ** pro-motor, resistance to ampicillin and a lower growth rate when growing the cells at a temperature of 42 ° C.
15 Met de stam volgens de uitvinding kan een stabiele produktie van menselijk interleukine-2 bij kweek op grote schaal worden verkregen en wordt een verhoogde synthese aan cellen van E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) verkregen die tot (8-10) x 10^ un/1 vormt dat overeenkomt met 8-12% van de totale hoeveelheid celeiwit.With the strain of the invention, stable production of human interleukin-2 in culture can be obtained on a large scale and an increased synthesis of cells of E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) is obtained which can lead to (8- 10) x 10 ^ un / 1 corresponding to 8-12% of the total amount of cell protein.
20 De stam E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-lL2-19) heeft de volgende eigenschappen:The strain E. coli VNIlGenetika VL 903 (pPR-11L-19) has the following properties:
Morfologische eigenschappen: De cellen zijn recht, staafvormig, langzaam bewegelijk, in staat draadachtige structuren te vormen, gram-negatief, niet sporevormend met een afmeting per cel van 3-5 pm.Morphological properties: The cells are straight, rod-shaped, slow-moving, capable of forming thread-like structures, gram-negative, non-spore-forming with a size per cell of 3-5 µm.
25 Kweekeigenschappen: De cellen groeien goed op dichte en vloeibare gewone kunstmatige, half-kunstmatige en complexe voedingsbodems. Wanneer zij op een van agar voorziene Hottinger’s voedingsbodem of in L-kweekmedium worden gekweekt, vormen ze gladde, ronde, enigszins samengeklitte met slijm beklede koloniën. Wanneer zij in een vloeibaar 30 medium zoals L-medium of M9 met casaminezuren worden gekweekt vormen ze een uniforme suspensie.25 Cultivation properties: The cells grow well on dense and liquid ordinary artificial, semi-artificial and complex culture media. When grown on an agarized Hottinger's culture medium or in L culture medium, they form smooth, round, slightly clumped mucous-lined colonies. When grown in a liquid medium such as L medium or M9 with casamic acids, they form a uniform suspension.
Fysiologische en biochemische eigenschappen: De cellen kunnen groeien bij een temperatuur tussen 5 en 40°C (optimum: 37°C) bij een pH van 6,7 tot 7,5. Als koolstofbron worden koolhydraten (zoals sucrose) 35 en aminozuren gebruikt. De cellen vertonen auxotrofie ten aanzien van methionine. Als stikstofbron kunnen anorganische zouten in de ammonium-vorm ofwel organische verbindingen in de vorm van pepton, trypton, gistextract en aminozuren worden gebruikt.Physiological and Biochemical Properties: The cells can grow at a temperature between 5 and 40 ° C (optimum: 37 ° C) at a pH of 6.7 to 7.5. As a carbon source, carbohydrates (such as sucrose) and amino acids are used. The cells show auxotrophy to methionine. Inorganic salts in the ammonium form or organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract and amino acids can be used as nitrogen source.
Resistentie voor antibiotica: De stam is resistent voor ampicilli-40 ne in een concentratie tot 100 mg/1 indien gekweekt op vloeibare voe- .8820102 8 dingsbodems en op van agar voorziene voedingsbodems.Antibiotic Resistance: The strain is resistant to ampicillin-40ne at a concentration of up to 100 mg / l when grown on liquid nutrient media and agar media.
Stabiliteit van het plasmide: Bij opslag van cellen op een agar-medium treedt in een reeds achtereenvolgende overentingen en bij een diepe kweek in een vloeibaar medium met een antibioticum geen verlies 5 of omlegging van het plasmide.Stability of the plasmid: Storage of cells on an agar medium does not result in loss or rearrangement of the plasmid in a succession of seedings and in a deep culture in a liquid medium with an antibiotic.
De uitvinding wordt verder geïllustreerd door bijzondere uitvoeringsvormen van de bereidingswijze van de plasmide volgens de uitvinding, de bereidingswijze van de stam, en de kweek daarvan, en wordt ook geïllustreerd met de bijgaande figuren, waarvan: 10 fig. 1 een genetische kaart van het recombinante plasmide pPR-IL2-19 weergeeft; fig. 2 het schema van de bereiding van het recombinante plasmide pPR-IL2-l9 volgens de uitvinding weergeeft.The invention is further illustrated by particular embodiments of the method of preparation of the plasmid according to the invention, the method of preparation of the strain, and the culture thereof, and is also illustrated by the accompanying figures, of which: Figure 1 shows a genetic map of the recombinant plasmid represents pPR-IL2-19; Figure 2 shows the scheme of preparation of the recombinant plasmid pPR-IL2 -19 according to the invention.
15 Voorbeeld 115 Example 1
De constructie van het recombinante plasmide volgens de uitvinding geschiedt in een aantal stappen. Eerst wordt het vectorplasmide pBRI24B opgebouwd.The construction of the recombinant plasmid according to the invention takes place in a number of steps. First, the vector plasmid pBRI24B is built up.
3 yg DNA van het plasmide pPR40 wordt door middel van het restric-20 tase Bgl II in 60 μΐ van een buffer voor restrictie-I die 10 mM tris-HC1 (pH 8,0), 6 mM MgC^j 5 mM 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl bevat, gesplitst. Het DNA wordt nogmaals met 2 volumes ethanol neergeslagen. Het neerslag wordt opgelost in 20 yl H2O· De behandeling van het DNA met exonuclease Bal 31 vindt plaats gedurende 3 min bij 30°C in 30 yl 25 van een buffer die 3 mM NaCl, 60 mM CaCl2> 60 mM MgCl2> 100 mM3 µg of DNA from the plasmid pPR40 is passed through the restric-20ase Bgl II in 60 μΐ of a restriction-I buffer containing 10 mM tris-HCl (pH 8.0), 6 mM MgC ^ j 5 mM 2- mercaptoethanol, containing 150 mM NaCl, split. The DNA is reprecipitated with 2 volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 20 yl H2O. The DNA is treated with exonuclease Bal 31 for 3 min at 30 ° C in 30 yl 25 of a buffer containing 3 mM NaCl, 60 mM CaCl2> 60 mM MgCl2> 100 mM
tris-HCl, pH = 8,0, en 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur bevat· Het DNA wordt opnieuw met 2 volumina ethanol neergeslagen. Het neerslag wordt opgelost in 10 yl ^0. Behandeling met het restrictase BamHI geschiedt in een monster van 30 yl dat de bovengenoemde buffer voor 30 restrictie I bevat. Het aanvullen van de enkelstrengs 3'-eindstandige gebieden van het DNA geschiedt door middel van een Klenov-fragment van DNA-polymerase I. E. coli in een monster van 20 yl dat 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2> 2 yg van het preparaat van DNA, 30 yl van elk van de desoxyribonucleocide-trifosfaten bevat. 5 eenheden van het DNA-35 enzym uit het reactiemengsel worden neergeslagen door middel van ethanol en in 100 yl H2O opgelost. De koppeling van het gestrekte plas-mide-DNA geschiedt bij een temperatuur van 16°C gedurende 12 uur door middel van het DNA-ligase van de faag T4 in een monster dat een liga-tiebuffer (60 ml tris-HCl, pH 7,6), 10 mM MgCl2» 10 mM 2-mercapto-40 ethanol, 0,4 mM adenosine-trifosfaat) en 1 yg DNA bevat. Het verkregen .8820102 9 mengsel wordt gebruikt voor de transformatie van cellen van E. coli C600; het transformatierendement bedraagt ten hoogste 5 x 10^ kolonie per 1 yg van het natieve plasmide pPR40. De voor ampicilline (100 yg/ml) resistente klonen worden geselecteerd; daaruit wordt het plasmide DNA 5 geïsoleerd volgens een aangepaste methode voorgesteld door Birnboim en Doli en dit wordt vervolgens voor de restrictie-analyse gebruikt. Verkregen wordt het plasmide pPRIOO dat een uniek splitsingsgebied voor BamHI omvat. Vervolgens wordt het plasmide pPRl24 opgebouwd. Daartoe wordt 2 yg van het DNA van het plasmide pML24 tegelijk met de restric-10 tases BamHI en PstI in 40 yl van een buffer voor restrictie-I gesplitst. Deze worden gecombineerd door middel van het DNA-ligase van de faag T4 bij 0°C met de fragmenten die zijn verkregen bij hydrolyse van het DNA van het plasmide pPRIOO door middel van de restrictasen BamHI en PstI. Het verkregen DNA-preparaat wordt gebruikt voor transformatie 15 van cellen van E. coli C600 met selectie van de transformanten op een medium met ampicilline, gevolgd door selectie van de Cmr-klonen op een medium met 300 yg/ml chlooramfenicol bij kweek van de cellen bij 42°C. Uit de aldus geselecteerde klonen wordt het plasmide-DNA geiso-leerd en getest door middel van restrictie-analyse. Daarbij wordt het 20 plasmide pPRI24 verkregen dat een splitsingsgebied met het restrictase BamHI omvat.contains tris-HCl, pH = 8.0, and 5 mM ethylenediamine tetraacetic acid · The DNA is reprecipitated with 2 volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 10 µl ^ 0. Treatment with the restrictase BamHI is in a 30 µl sample containing the above restriction I buffer. Supplementation of the single-stranded 3'-terminal regions of the DNA is by means of a Klenov fragment of DNA polymerase IE coli in a 20 µl sample containing 10 mM tris-HCl (pH 8.0), 10 mM MgCl 2> 2 µg of the DNA preparation, 30 µl of each of the deoxyribonucleocide triphosphates. 5 units of the DNA-35 enzyme from the reaction mixture are precipitated by means of ethanol and dissolved in 100 µl H 2 O. The stretched plasmid DNA is coupled at a temperature of 16 ° C for 12 hours by the DNA ligase from the phage T4 in a sample containing a ligation buffer (60 ml tris-HCl, pH 7). 6), 10 mM MgCl2 »10 mM 2-mercapto-40 ethanol, 0.4 mM adenosine triphosphate) and 1 µg DNA. The resulting .8820102 mixture is used for the transformation of cells from E. coli C600; the transformation efficiency is at most 5 x 10 4 colony per 1 µg of the native plasmid pPR40. The clones resistant to ampicillin (100 µg / ml) are selected; therefrom, the plasmid DNA 5 is isolated according to an adapted method proposed by Birnboim and Doli and is then used for the restriction analysis. The plasmid pPRI00 is obtained which comprises a unique cleavage region for BamHI. The plasmid pPR124 is then built up. To this end, 2 µg of the DNA of the plasmid pML24 is cleaved in 40 µl of a restriction I buffer simultaneously with the restric-tases BamHI and PstI. These are combined by means of the DNA ligase of the phage T4 at 0 ° C with the fragments obtained on hydrolysis of the DNA of the plasmid pPRIOO by means of the restrictases BamHI and PstI. The resulting DNA preparation is used for transformation of cells from E. coli C600 with selection of the transformants on a medium containing ampicillin, followed by selection of the Cmr clones on a medium containing 300 µg / ml chloramphenicol when growing the cells at 42 ° C. The plasmid DNA is isolated from the clones thus selected and tested by restriction analysis. Thereby, the plasmid pPRI24 is obtained which comprises a cleavage region with the restrictase BamHI.
Vervolgens wordt 3 yg van DNA van het plasmide pPRI24 gesplitst door middel van het restrictase Xbal in 70 yl van een buffer voor restrictie I dat 10 mM tris-HCl (pH 7,9), 6mM MgC^» 6 mil 2-mercapto-25 ethanol en 150 mM NaCl bevat; het DNA wordt opnieuw neergeslagen met 2 volumina ethanol. Het neerslag wordt opgelost in 15 yl H20. De aanvulling van enkelstrengs 3’-eindstandige gebieden van het DNA geschiedt door middel van behandeling met een Klenov-fragment van het DNA-polyme-rase I van E. coli in een monster van 20 yl dat 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 30 10 mM MgCl2, 2 yg van het DNA-preparat bevat, met 30 yl van elk van de desoxyribonucleoside-trifosfaten, en 5 eenheden van het enzym. Het DNA uit het reactiemengsel wordt met ethanol neergeslagen en opgelost in 100 yl water. De combinatie van het gestrekte plasmide-DNA met Bgl-koppelaars geschiedt bij 16°C in 12 uur door middel van het DNA-ligase 35 van de faag T4 in een monster dat buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH = 7,6, 10 mM MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0,4 mM adenosine-tri-fosfaat), 2 yg van het plasmide-DNA en 0,5 yg koppelaars bevat. Na ligatie wordt het DNA met ethanol uit het reactiemengsel neergeslagen, weer opgelost en aan een enzymatische hydrolyse onderworpen met het 40 restrictase Bgl II in een monster van 40 yl dat een buffer voor res- . 882 0102.Then, 3 µg of DNA from the plasmid pPRI24 is cleaved by the restrictase Xbal into 70 µl of a buffer for restriction I containing 10 mM tris-HCl (pH 7.9), 6mM MgC 6 mil 2-mercapto-25 ethanol and 150 mM NaCl; the DNA is reprecipitated with 2 volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 15 µl H 2 O. The replenishment of single-stranded 3'-terminal regions of the DNA is by treatment with a Klenov fragment of the E. coli DNA polymerase I in a 20 µl sample containing 10 mM tris-HCl (pH 8, 0), contains 10 mM MgCl2, 2 µg of the DNA preparation, with 30 µl of each of the deoxyribonucleoside triphosphates, and 5 units of the enzyme. The DNA from the reaction mixture is precipitated with ethanol and dissolved in 100 µl water. The combination of the stretched plasmid DNA with Bgl linkers is performed at 16 ° C in 12 hours by the DNA ligase 35 of the phage T4 in a sample containing buffer for ligation (60 mM tris-HCl, pH = 7, 6, 10 mM MgCl 2> 10 mM 2-mercaptoethanol, 0.4 mM adenosine triphosphate), 2 µg of the plasmid DNA and 0.5 µg couplers. After ligation, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, redissolved and subjected to enzymatic hydrolysis with the 40 restrictase Bgl II in a 40 µl sample containing a buffer for res. 882 0102.
10 trictie-II (6 mM HC1, pH 7,6, MgC^j 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 yl NaCl) bevat. Het DNA wordt weer neergeslagen met ethanol, opgelost en de cyclisatie wordt uitgevoerd; hiertoe wordt 1 yg van het preparaat van het plasmide-DNA in 240 yl buffer voor ligatie behandeld met DNA-5 ligase van de faag T4. Het verkregen mengsel wordt gebruikt voor transformering van de cellen van E. coli C600.10 contains friction II (6 mM HCl, pH 7.6, MgCl 3, 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 µl NaCl). The DNA is reprecipitated with ethanol, dissolved and the cyclization is carried out; for this, 1 µg of the plasmid DNA preparation in 240 µl ligation buffer is treated with DNA-5 ligase from the phage T4. The resulting mixture is used to transform the cells of E. coli C600.
Het rendement van de transformatie is ten hoogste 5 x 10^ koloniën per 1 yg van het natieve plasmide pPRI24. Voor ampicilline (100 yg/ml) resistente koloniën worden geselecteerd en daaruit wordt 10 het plasmide-DNA gewonnen en gebruikt voor restrictie-analyse. Daarbij wordt het plasmide pPRl24B verkregen dat in tegenstelling tot het uit-gangs-vectormolecuul pPRl24, een uniek splitsingsgebied voor Bgl II bevat in plaats van de eerder aanwezige herkenningssequentie voor Xbal (fig. 2).The transformation efficiency is at most 5 x 10 4 colonies per 1 µg of the native plasmid pPRI24. Ampicillin (100 µg / ml) resistant colonies are selected from which the plasmid DNA is collected and used for restriction analysis. Thereby, the plasmid pPR124B is obtained which, unlike the starting vector molecule pPR124, contains a unique cleavage region for Bgl II instead of the previously present recognition sequence for Xbal (Fig. 2).
15 Vervolgens wordt 3 yg van het DNA van het plasmide pPR!24B openge knipt door middel van het restrictase BamHI in een 12 m monster dat een buffer voor restrictie I bevat. De reactie wordt onderbroken door ont-eiwitting met fenol van het DNA en neerslag van het nucleinezuur met ethanol. Het neerslag wordt opgelost in 20 yl water. De verwijdering 20 van de enkelstrengs uiteinden die bij het knippen van het DNA met restrictase zijn gevormd geschiedt door middel van een SI-endonuclease. Hiertoe wordt het DNA met 30 eenheden SI-endonuclease gehydrolyseerd in een monster van 50 yl dat 10 mM natriumacetaat, (pH 4,4), 4,5 mM ZnSO^, 250 mM NaCl bevat gedurende 20 min bij 20°C. De reactie wordt 25 beëindigd door behandeling met fenol en het DNA wordt neergeslagen met ethanol. Het neerslag wordt opgelost in 15 yl water.Then 3 µg of the DNA of the plasmid pPR! 24B is cut open by means of the restrictase BamHI in a 12 m sample containing a restriction I buffer. The reaction is stopped by protein phenol protein removal and nucleic acid precipitation with ethanol. The precipitate is dissolved in 20 µl of water. The removal of the single-stranded ends formed upon restriction DNA cutting is done by an SI endonuclease. To this end, the DNA is hydrolyzed with 30 units of SI endonuclease in a 50 µl sample containing 10 mM sodium acetate, (pH 4.4), 4.5 mM ZnSO 2, 250 mM NaCl for 20 min at 20 ° C. The reaction is terminated by phenol treatment and the DNA is precipitated with ethanol. The precipitate is dissolved in 15 µl of water.
Daarna wordt het plasmide pAA1213-23B geproduceerd. Daartoe wordt 3 yg van het DNA-plasmide pAA1213-23 ter grootte van 5400 b.p., geconstrueerd op basis van het plasmide pBR-322, en met daarin het ColEI-30 replicon, een resistentiegen voor ampicilline en de DNA-copie van een gen van menselijk interleukine-2 waarvan de expressie wordt bewerkstelligd door de promotor en de SD-sequentie van het tryptofaan-operon E. coli, in 10 eenheden van het restrictase Stu I in een monster van 30 yl dat een buffer voor restrictie I (10 mM tris-HCl, pH 7,9, MgCl2» 6 mM 35 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl) bevat, gesplitst; daarna wordt het DNA uit het reactiemengsel neergeslagen door toevoeging van ethanol. Het neerslag wordt afgescheiden door centrifugeren in 20 yl water. Het li-geren van het gestrekte plasmide-DNA met Bgl II koppelaars geschiedt door middel van 20 eenheden van het DNA-ligase van T4 in een monster 40 van 30 yl dat een buffer voor ligatie (60 mM tris-HCl, pH 7,6, 10 mMThen the plasmid pAA1213-23B is produced. To this end, 3 µg of the 5400 bp DNA plasmid pAA1213-23 is constructed from the plasmid pBR-322, containing the ColEI-30 replicon, a resistance gene for ampicillin, and the DNA copy of a gene of human interleukin-2 expressed by the promoter and SD sequence of the tryptophan operon E. coli, in 10 units of the restrictase Stu I in a 30 µl sample containing a restriction I buffer (10 mM tris -HCl, pH 7.9, MgCl 2 (6 mM 35 2-mercaptoethanol, 150 mM NaCl), split; then the DNA is precipitated from the reaction mixture by addition of ethanol. The precipitate is separated by centrifugation in 20 µl water. Ligation of the stretched plasmid DNA with Bgl II linkers is done through 20 units of the T4 DNA ligase in a 30 µl sample containing a buffer for ligation (60 mM tris-HCl, pH 7.6 , 10 mM
.8820102 11.8820102 11
MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol en 0,4 mM adenosine-trifosfaat), 2 yg van het plasmide-DNA en 0,5 yg van de koppelaars bevat. Na ligatie wordt het DNA uit het reactiemengsel neergeslagen met ethanol, opgelost en aan enzymatische hydrolyse onderworpen door middel van restrictase 5 Bgl II in een monster van 40 yl dat een buffer voor restrictie-2 (6 mM tris-HCl, pH 7,7, 6 mM MgCl2> 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl) bevat. Het DNA wordt nogmaals neergeslagen met ethanol en weer opgelost, waarna de DNA-moleculen worden gecycliseerd; hiertoe wordt 1 yg van het preparaat van het plasmide-DNA in 240 yl ligatiebuffer behan-10 deld met 2 eenheden van het DNA-ligase van T4. Het verkregen mengsel wordt gebruikt voor het transformeren van cellen van E. coli C600. Het f.MgCl2> 10 mM 2-mercaptoethanol and 0.4 mM adenosine triphosphate), contains 2 µg of the plasmid DNA and 0.5 µg of the linkers. After ligation, the DNA from the reaction mixture is precipitated with ethanol, dissolved and subjected to enzymatic hydrolysis by means of restrictase 5 Bgl II in a 40 µl sample containing a restriction-2 buffer (6 mM tris-HCl, pH 7.7, 6 mM MgCl2> 6 mM 2-mercaptoethanol, 50 mM NaCl). The DNA is again precipitated with ethanol and redissolved, after which the DNA molecules are cycled; for this, 1 µg of the plasmid DNA preparation in 240 µl ligation buffer is treated with 2 units of the T4 DNA ligase. The resulting mixture is used to transform E. coli C600 cells. The F.
rendement van de transformatie is ten hoogste 5 x 10° koloniën per 1 yg van het natieve plasmide pAAl212-23. De voor ampicilline (100 yg/ml) resistente klonen worden geselecteerd, het plasmide-DNA 15 wordt daaruit gewonnen met behulp van een aangepaste procedure volgens Birnboim en Doli en gebruikt voor restrictie-analyse. Het aldus bereide plasmide pAA1213-23B bevat, in tegenstelling tot het aanvankelijke recombinante molecuul van pAA1213-23, een uniek splistingsgebied van Bgl II in plaats van de vooraf beschikbare herkenningssequentie voor 20 Stu I (fig. 2).efficiency of the transformation is at most 5 x 10 ° colonies per 1 µg of the native plasmid pAAl212-23. The clones resistant to ampicillin (100 µg / ml) are selected, the plasmid DNA 15 is recovered therefrom using a modified procedure according to Birnboim and Doli and used for restriction analysis. In contrast to the initial recombinant molecule of pAA1213-23, the plasmid pAA1213-23B thus prepared contains a unique splice region of Bgl II instead of the pre-available 20 Stu I recognition sequence (Fig. 2).
30 yg van het DNA van het plasmide pAA1213-23B wordt gesplitst door middel van restrictase Cfrl3 (activiteit 200 eenheden) in een monster van 100 yl dat een buffer voor restrictie I bevat. De produkten van de enzymatische hydrolyse worden onderworpen aan elektroforese in 25 een 1,1%'s gel van een laagsmeltende agarose in een tris-acetaat buf-fersysteem bij een veldsterkte van 5 V/cm. Het gelgebied dat het DNA fragment met het gen van interleukine-2 van 750 b.p. bevat wordt uitgesneden en het DNA wordt geëlueerd. Ter aanvulling van enkelstrengs eindstukken van het DNA door middel van een Klenov-fragment van de DNA-30 polymerase I van E. coli wordt het uit het gel geisoleerde fragment behandeld in een monster van 20 yl dat 10 mM tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2 bevat met 30 yl van elk van de desoxyribonucleoside-trifosfa-ten. De reactie wordt beëindigd door verwarmen, het DNA uit het mengsel wordt met een ethanol neergeslagen en opgelost in 20 yl water.30 µg of the DNA from the plasmid pAA1213-23B is cleaved by restrictase Cfrl3 (activity 200 units) in a 100 µl sample containing a restriction I buffer. The enzymatic hydrolysis products are subjected to electrophoresis in a 1.1% gel of a low-melting agarose in a tris-acetate buffer system at a field strength of 5 V / cm. The gel region containing the DNA fragment containing the 750 b.p. interleukin-2 gene. contains, the DNA is eluted. To supplement single-stranded ends of the DNA by means of a Klenov fragment of the E. coli DNA-30 polymerase I, the gel-isolated fragment is treated in a 20 µl sample containing 10 mM tris-HCl (pH 8, 0), contains 10 mM MgCl 2 with 30 µl of each of the deoxyribonucleoside triphosphates. The reaction is stopped by heating, the DNA from the mixture is precipitated with ethanol and dissolved in 20 µl of water.
35 Vervolgens wordt het eerder verkregen preparaat van het gestrekte plasmide pBRI24B geligeerd met het fragment van het plasmide pAA1213-23B. Hiertoe wordt 1 yg van het plasmide-DNA en 2 yg van het fragment behandeld met het DNA-ligase van de faag T4 in een ligatiebuffer, terwijl het voltime van het reactiemengsel 30 yl is. Na neerslag 40 van het DNA en oplossen van het neerslag in 20 yl water wordt het pre- . 8820102 12 paraat behandeld met het restrictase Bgl II zoals hierboven beschreven, wordt het DNA. weer neergeslagen met ethanol, opgelost en worden de gestrekte DNA-moleculen tot ringen geligeerd door middel van DNA-ligase van de faag T4 bij behandeling van het enzympreparaat in een volume van 5 het reactiemengsel tot 300 yl. Het verkregen preparaat wordt gebruikt voor transformatie van cellen van E. coli C600 waarna de transformanten in medium met ampicilline worden geselecteerd terwijl de cellen 1 dag bij 28°C worden gekweekt. Van de verkregen transformanten worden de variëteiten die een verminderd groeivermogen bij 42°C vertonen uitgeko-10 zen. Uit deze klonen wordt het plasmide-DNA geisoleerd zoals hierboven beschreven en aan restrictie-analyse onderworpen. In het resulterende plasmide pPR-IL2-19 (fig. 2) op het voegpunt van de geligeerde gebieden van het DNA dat het eerste codon van het cro-gen van de faag λ en het ala-codon van menselijk interleukine-2 codeert wordt een knipplaats 15 voor het restrictie-endonuclease BspRI gevormd.Then, the previously obtained preparation of the stretched plasmid pBRI24B is ligated with the fragment of the plasmid pAA1213-23B. To this end, 1 µg of the plasmid DNA and 2 µg of the fragment are treated with the DNA ligase of the phage T4 in a ligation buffer, while the voltage of the reaction mixture is 30 µl. After precipitation of the DNA and dissolving the precipitate in 20 µl of water, it becomes pre-. 8820102 12 treated with the restrictase Bgl II as described above, DNA is prepared. precipitated again with ethanol, dissolved and the stretched DNA molecules are ligated into rings by DNA ligase from the phage T4 upon treatment of the enzyme preparation in a volume of the reaction mixture to 300 µl. The resulting preparation is used for transformation of E. coli C600 cells after which the transformants are selected in medium with ampicillin while the cells are grown at 28 ° C for 1 day. From the transformants obtained, the varieties exhibiting reduced growth capacity at 42 ° C are selected. The plasmid DNA is isolated from these clones as described above and subjected to restriction analysis. In the resulting plasmid pPR-IL2-19 (Fig. 2) at the junction of the ligated regions of the DNA encoding the first codon of the cro gene of the phage λ and the ala codon of human interleukin-2, a Cut site 15 for the restriction endonuclease BspRI is formed.
Voorbeeld 2Example 2
De bereiding van de stam E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-l9) die menselijk interleukine-2 produceert geschiedt op de volgende wijze. 20 Het plasmide pPR-IL2-19 dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert wordt door middel van transformatie in cellen van de ontvangende stam E. coli VNIIGenetika VL-903, die bij de All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the All-Union Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms is gedeponeerd en 25 is geregistreerd onder nr. BK Γ) Β-3546 ingevoerd. Het rendement van de transformatie van cellen van E. coli VNIIGenetika VL 903 bedraagt ongeveer 10^ klonen per 1 yg van het natieve plasmide pPR-IL2-19. De transformanten worden geselecteerd op een medium dat ampicilline (100 yg/ml) bevat na kweek van de cellen gedurende 1 dag bij 28°C. Uit 30 de geselecteerde klonen wordt het plasmide-DNA gewonnen en de identiteit met het preparaat pPR-IL2-l9 wordt vastgesteld door middel van restrictie-analyse. De stam E. coli VL 903 (pPR-IL2-19) wordt verkregen en deze produceert menselijk interleukine-2.The preparation of the strain E. coli VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2 -19) which produces human interleukin-2 is done in the following manner. The plasmid pPR-IL2-19 encoding the synthesis of human interleukin-2 is transformed into cells of the recipient strain E. coli VNIIGenetika VL-903, which is part of the All-Union Collection of Industrial Microorganisms of the All- Union Research Institute of Genetics and Selection of Industrial Microorganisms has been registered and 25 has been registered under No. BK Γ) Β-3546. The efficiency of the transformation of E. coli VNIIGenetika VL 903 cells is about 10 µl clones per 1 µg of the native plasmid pPR-IL2-19. The transformants are selected on a medium containing ampicillin (100 µg / ml) after culturing the cells for 1 day at 28 ° C. The plasmid DNA is collected from the selected clones and the identity with the preparation pPR-IL2 -19 is determined by restriction analysis. The E. coli VL 903 strain (pPR-IL2-19) is obtained and it produces human interleukin-2.
35 Voorbeeld 335 Example 3
De stam E. coli VL 903 (pPR-IL2-19) wordt bij 28°C gedurende 14 uur gekweekt op een schuine agarbodem volgens Hottinger die 50 yg/ml ampicilline bevat. De op de voedingsbodem gekweekte biomassa wordt gebruikt voor de bereiding van entmateriaal. Hiertoe worden de cellen 40 overgebracht in 750 ml Erlenmeyer-kolven met 100 ml Hottinger medium . 8820102 13 dat 100 yg/ml ampicilline bevat en bij 28°C op een schudapparaat met 240 dpm gedurende 6 uur gekweekt. De optische dichtheid van de entcul-tuur bedraagt 1,5-2,5 eenheden.The E. coli VL 903 strain (pPR-IL2-19) is grown at 28 ° C for 14 hours on an oblique Hottinger agar bottom containing 50 µg / ml ampicillin. The biomass grown on the culture medium is used for the preparation of inoculum. For this, cells 40 are transferred to 750 ml Erlenmeyer flasks with 100 ml Hottinger medium. 8820102 13 containing 100 µg / ml ampicillin and grown at 28 ° C on a shaker at 240 ppm for 6 hours. The optical density of the seed culture is 1.5-2.5 units.
Het kweken geschiedt in een fermentor die is voorzien van inrich-5 tingen voor de controle van de pH, de temperatuur, de roersnelheid en de beluchting. Voor de fermentatie wordt het Hottinger-medium gebruikt dat 100 yg/ml ampicilline en 10 g/1 glucose bevat. De entcultuur wordt in een hoeveelheid van 5-10 gew.% toegevoegd. Het kweken geschiedt bij pH 6,6-6,8 welke pH wordt gehandhaafd door toevoeging van verdunde 10 ammonia. Het eerste gedeelte van de fermentatie geschiedt tot een optische dichtheid van 3,5 bij 550 nm bij een temperatuur van 28°C, waarna thermoinductie plaats vindt door verhoging van de temperatuur tot 42-45°C gedurende 5 min, en daarna wordt de fermentatie nog 2 uur voortgezet.Cultivation is carried out in a fermenter equipped with devices for controlling the pH, temperature, stirring speed and aeration. For the fermentation, the Hottinger medium containing 100 µg / ml ampicillin and 10 g / 1 glucose is used. The seed culture is added in an amount of 5-10% by weight. Cultivation takes place at pH 6.6-6.8, which pH is maintained by adding dilute ammonia. The first part of the fermentation takes place to an optical density of 3.5 at 550 nm at a temperature of 28 ° C, after which thermoinduction takes place by raising the temperature to 42-45 ° C for 5 min, and then the fermentation is continued for 2 hours.
15 Bij beëindiging van het proces worden voor het bepalen van de activiteit van menselijk interleukine-2, uit 1 ml van de kweekvloeistof de cellen neergeslagen door centrifugeren en wordt het neerslag in 1 ml van een 8 ml oplossing van guanidinechloride bij 20°C gedurende 40 min gesuspendeerd. Daarna wordt het residu door centrifugeren afgescheiden 20 en de activiteit van de interleukine-2-fractie in de bovenstaande vloeistof wordt bepaald. De biologische activiteit van het aldus bereide interleukine-2 bedraagt (8-10) x 10^ Mü/1.At the conclusion of the process, to determine the activity of human interleukin-2, the cells are precipitated from 1 ml of the broth by centrifugation and the precipitate is dissolved in 1 ml of an 8 ml solution of guanidine chloride at 20 ° C for 40 minus suspended. The residue is then separated by centrifugation and the activity of the interleukin-2 fraction in the supernatant is determined. The biological activity of the thus prepared interleukin-2 is (8-10) x 10 µm / l.
Voor het bepalen van het aandeel van het gesynthetiseerde menselijke interleukine-2 in het totale celeiwit worden de cellen uit 1 ml 25 cultuurvloeistof door centrifugeren neergeslagen en op de boven beschreven wijze behandeld. Het preparaat wordt geanalyseerd door middel van elektroforese in een 15%’s polyacrylamidegel in aanwezigheid van 0,1% natriumdodecylsulfaat. De in het gel afgescheiden eiwitten worden volgens een standaardprocedure gekleurd in de oplossing Coomassi R-250 30 "Serva" (BRD). De hoeveelheid eiwit in de gebieden wordt bepaald na het doorlopen van de gekleurde gel in een densitometer. Identificatie van het gebied dat overeenkomt met het in de cellen gesynthetiseerde rijpe menselijke interleukine-2 geschiedt op basis van vergelijking met de elektroforetische activiteit van merkeiwitten, alsmede door vlekvorming 35 van de afzonderlijke eiwitten op nitrocellulosefilters gevolgd door ontwikkeling van de gebieden met interleukine door middel van behandeling in oplossingen die monoclonale antilichamen van muizen tegen interleukine-2 en anti-muisantilichamen van konijnen geconjugeerd met mierikswortelperoxydase bevatten. Na een geschikte procedure voor het 40 kleuren wordt het gebied van interleukine ontwikkeld als een bruine .8820102 14 band tegen een niet gekleurde achtergrond van het nitrocellulosefilter. Het aandeel van het gen van interleukine-2, gesynthetiseerd in de cellen, van het eiwitprodukt bedraagt 12% van de totale hoeveelheid cel-eiwit.To determine the proportion of the synthesized human interleukin-2 in the total cell protein, the cells are precipitated from 1 ml of culture fluid by centrifugation and treated as described above. The preparation is analyzed by electrophoresis in a 15% polyacrylamide gel in the presence of 0.1% sodium dodecyl sulfate. The proteins secreted in the gel are stained in the solution Coomassi R-250 "Serva" (BRD) according to a standard procedure. The amount of protein in the areas is determined after going through the stained gel in a densitometer. The region corresponding to the mature human interleukin-2 synthesized in the cells is identified by comparison with the electrophoretic activity of marker proteins, as well as by staining the individual proteins on nitrocellulose filters followed by development of the regions with interleukin by treatment in solutions containing murine monoclonal antibodies to interleukin-2 and rabbit anti-mouse antibodies conjugated with horseradish peroxidase. After a suitable staining procedure, the region of interleukin is developed as a brown .8820102 14 band against an uncolored background of the nitrocellulose filter. The proportion of the interleukin-2 gene synthesized in the cells of the protein product is 12% of the total amount of cell protein.
55
Toepasbaarheid in de nijverheidApplicability in the industry
De recombinante plasmide-DNA pPR-IL2-19 volgens de uitvinding dat de synthese van menselijk interleukine-2 codeert is bruikbaar voor de bereiding van stammen die met hoge activiteit menselijk interleukine-2 10 produceren. De E. colistam VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) die menselijk interleukine-2 produceert is bruikbaar in de microbiologische en farmaceutische industrie voor de bereiding van menselijk interleukine-2 dat in de geneeskunde bruikbaar is.The recombinant plasmid DNA pPR-IL2-19 of the invention encoding the synthesis of human interleukin-2 is useful for the preparation of strains producing high activity human interleukin-2. The E. coli strain VNIIGenetika VL 903 (pPR-IL2-19) that produces human interleukin-2 is useful in the microbiological and pharmaceutical industry for the preparation of human interleukin-2 which is useful in medicine.
.8820102.8820102
Claims (3)
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| SU874191353A SU1703693A1 (en) | 1987-02-09 | 1987-02-09 | Dna ppr-il 2-19 recombination plasmid which codes human interleucine-2 synthesis and structure escherichia coli strain, human interleucine-2 producent |
| SU4191353 | 1987-02-09 | ||
| PCT/SU1988/000032 WO1988005818A1 (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | RECOMBINANT PLASMID DNA pPR-IL2-19, CODING FOR SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, METHOD OF ITS CONSTRUCTION AND STRAIN OF BACTERIA ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) AS PRODUCER OF HUMAN INTERLEUKIN-2, CONTAINING IT |
| SU8800032 | 1988-02-08 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NL8820102A true NL8820102A (en) | 1989-01-02 |
Family
ID=21284358
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NL8820102A NL8820102A (en) | 1987-02-09 | 1988-02-08 | RECOMBINANT PLASMIDE DNA PPR-IL2-19 CODING THE SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND BACTERIA TRIBE ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (PPR-IL2-19) PRODUCING HUMAN INTERLEUKIN-2 PLASMINE . |
Country Status (10)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH01502639A (en) |
| CH (1) | CH676997A5 (en) |
| DE (1) | DE3890052T1 (en) |
| FI (1) | FI884557A (en) |
| GB (1) | GB2210373A (en) |
| HU (1) | HUT50873A (en) |
| NL (1) | NL8820102A (en) |
| SE (1) | SE8803566D0 (en) |
| SU (1) | SU1703693A1 (en) |
| WO (1) | WO1988005818A1 (en) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6068993A (en) * | 1997-07-02 | 2000-05-30 | Biobras Sa | Vector for expression of heterologous protein and methods for extracting recombinant protein and for purifying isolated recombinant insulin |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS58116498A (en) * | 1981-12-28 | 1983-07-11 | Takeda Chem Ind Ltd | Novel messenger rna coding il-2, its preparation and preparation of il-2 using it |
| JPH0646957B2 (en) * | 1985-03-11 | 1994-06-22 | 武田薬品工業株式会社 | Method for producing interleukin-2 |
| WO1986006410A1 (en) * | 1985-04-30 | 1986-11-06 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Process for increasing yield of interleukin-2 |
-
1987
- 1987-02-09 SU SU874191353A patent/SU1703693A1/en active
-
1988
- 1988-02-08 JP JP88502088A patent/JPH01502639A/en active Pending
- 1988-02-08 HU HU881691A patent/HUT50873A/en unknown
- 1988-02-08 DE DE883890052T patent/DE3890052T1/en not_active Withdrawn
- 1988-02-08 CH CH381688A patent/CH676997A5/de not_active IP Right Cessation
- 1988-02-08 NL NL8820102A patent/NL8820102A/en not_active Application Discontinuation
- 1988-02-08 WO PCT/SU1988/000032 patent/WO1988005818A1/en active Application Filing
- 1988-10-04 FI FI884557A patent/FI884557A/en not_active Application Discontinuation
- 1988-10-07 SE SE8803566A patent/SE8803566D0/en not_active Application Discontinuation
- 1988-10-10 GB GB8823729A patent/GB2210373A/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI884557A0 (en) | 1988-10-04 |
| SU1703693A1 (en) | 1992-01-07 |
| FI884557A (en) | 1988-10-04 |
| WO1988005818A1 (en) | 1988-08-11 |
| SE8803566L (en) | 1988-10-07 |
| GB8823729D0 (en) | 1988-12-07 |
| CH676997A5 (en) | 1991-03-28 |
| SE8803566D0 (en) | 1988-10-07 |
| DE3890052T1 (en) | 1989-04-13 |
| GB2210373A (en) | 1989-06-07 |
| JPH01502639A (en) | 1989-09-14 |
| HUT50873A (en) | 1990-03-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI64813B (en) | FOERFARANDE FOER PRODUCERING AV ETT UTVALT AEGGVITEAEMNE OCH VID FOERFARANDET ANVAENDA REKOMBINANTPLASMIDVEKTORER | |
| KR900005776B1 (en) | Process for the preparation of interferon | |
| US4758512A (en) | Hosts and methods for producing recombinant products in high yields | |
| JPH0773499B2 (en) | Recombinant DNA expression vector and DNA compound encoding isopenicillin N synthase from Penicillium chrysogenum | |
| US5024943A (en) | Regulatory region cloning and analysis plasmid for bacillus | |
| JP2637328B2 (en) | Mature polypeptide | |
| JPH07135977A (en) | Plasmid vector psm143 and preparation thereof | |
| HU194316B (en) | Process for preparing alpha-l human leukocyte interferone | |
| EP0198745B1 (en) | Method for the microbiological synthesis of human serum albumin | |
| US4705750A (en) | Promoter plasmid containing the promoter and use thereof in transforming Bacillus | |
| EP0133321B1 (en) | Dna gene, process for production thereof and plasmid containing the same | |
| GB2124232A (en) | An expression vector carrying a gene coding for a phosphate-binding protein | |
| NL8820102A (en) | RECOMBINANT PLASMIDE DNA PPR-IL2-19 CODING THE SYNTHESIS OF HUMAN INTERLEUKIN-2, PROCESS FOR ITS PRODUCTION AND BACTERIA TRIBE ESCHERICHIA COLI VNIIGENETIKA VL 903 (PPR-IL2-19) PRODUCING HUMAN INTERLEUKIN-2 PLASMINE . | |
| JPS5841849A (en) | Human leukocyte interferon | |
| US5334531A (en) | Plasmid vector for expression in bacillus and used for cloning the structural gene which codes for the human growth hormone and a method of producing the hormone | |
| SU1479005A3 (en) | Method of producing human interleukin | |
| EP0105521A2 (en) | Novel DNA, microorganism transformed therewith and use thereof | |
| SU1703690A1 (en) | Recombinant plasmid dna pvn22, encoding human interferon @@@-i1 synthesis, and the strain of bacterium pseudomonas sp - a producer of human interferon @@@-i1 | |
| SU1210278A1 (en) | Escherichia coli hb 101 prd 39 strain - producer of cholera germ neuraminidase | |
| JPS61502799A (en) | Recombinant DNA molecules, transformed microorganisms, and methods for producing penicillin V amidase | |
| RU2045575C1 (en) | RECOMBINANT PLASMIDE DNA PPR-TGATG-HIL-Iβ-TSR WHICH PROVIDES SYNTHESIS OF RECOMBINANT INTERLEIKIN-1 AND STRAIN BSCHERICHIA COLI BEING PRODUCER OF RECOMBINANT HUMAN INTERLEIKIN-1 b | |
| US5585260A (en) | PSM112 plasmid vector for expression in bacillus subtilis | |
| RU2099421C1 (en) | Method of preparing the human recombinant interleukin-3, recombinant plasmid dna p3pteil3 encoding the human recombinant interleukin-3, strain of bacterium escherichia coli - a producer of the human recombinant interleukin-3 | |
| RU1660388C (en) | Recombinant plasmid dna pvgib encoding bovine gamma-interferon, method of its preparing and yeast strain saccharomyces cerevisiae - a producer of bovine gamma-interferon | |
| JPH0638741A (en) | Production of flounder growth hormone |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| BV | The patent application has lapsed |