Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, ein Verfahren zu ihrem Konstruieren und einen Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-I9)-Produzent des menschlichen Interleukin-2.
Stand der Technik
Natürliches menschliches Interleukin-2 oder Wachstumsfaktor von T-Zellen ist Glykoprotein mit einer Molekularmasse der Polypeptidkette von etwa 15 000 Dalton und es wird durch die T-Zellen bei ihrer Aktivierung mit dem Leptin beziehungsweise mit einem entsprechenden Antigen produziert. Das Interleukin-2 ist Immunomodulator mit komplexem Wirkungsmechanismus, es stimuliert insbesondere die Immun-Antwort auf Kosten der Aktivierung der T-Lymphozyte, der Verstärkung der Mitogenese der Thymozyte, der Induktion der zytotoxischen Aktivität der T-Zellen und anderes mehr. Das Interleukin-2 hat entsprechend eine grössere potentielle Bedeutung für die Therapie immunologischer Störungen, solcher wie bösartige Degenerationen, bakterielle oder virusartige Infektionen, Erkrankungen, die mit dem Immunodefizit verbunden sind, autoimmune Erkrankungen und anderes mehr.
Das natürliche Interleukin-2, das unmittelbar aus dem menschlichen Serum beziehungsweise aus einem Kulturnährboden der Zellen der Jurkat-Linie ausgeschieden wird, ist in äusserst geringen Mengen zugänglich, die für die Untersuchung seiner Eigenschaften und des klinischen Potentials unzureichend sind. Als alternative Quelle des Interleukin-2 können die gentechnisch konstruierten Stämme der Mikroorganismen dienen, die die Rekombination-Plasmide mit einem Gen des Interleukin-2 tragen und die eine effektive Expression dieses Gens bewirken
Bekannt sind Rekombination-Plasmid-DNS, die das menschliche Interleukin-2 kodieren, beispielsweise die Rekombination-Plasmid-DNS pPLcMuHil 201 und Stamm E.coli KI2 DELTA HI DELTA trp (pPLcMuHil 201), der dieselbe enthält, (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J., Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Res., 11, 4307-4323).
In der Zusammensetzung des genannten Rekombinationmoleküls der DNS wird die Transkription des Gens des Interleukin -2 durch ein Regulator-Element PLOL der lambda Bakteriophage kontrolliert und die Einleitung der Translation des Eiweissproduktes des Gens wird auf Kosten des Konstruierens eines Hybridabschnitts der Verknüpfung der Ribosome auf der Grundlage der SD-Sequenz der Mu-Phage bewirkt. Die maximale Ausbeute an menschlichem Interleukin-2, die durch die Kultivierung des Produzenten-Stammes E.coli KI2 DELTA Hi DELTA trp (pPLcMuHil 201) gewährleistet wird, beträgt 5 bis 10%, bezogen auf die Gesamtmenge des Eiweissstoffes der Zellen.
Die genannten Rekombination-Plasmid-DNS und der Stamm, der dieselbe enthält, weisen eine Reihe von Nachteilen auf, die darauf zurückzuführen sind, dass die regulierbare Expression des IL2-Gens, die vom PL-Promotor bewirkt wird, entweder ein Resident-Plasmid mit einem Gen des temperaturempfindlichen cI-Repressors (cIts857) oder die Verwendung als Rezipient eines Stammes verlangt, der eine defekte Prophage mit einem Mutanten-Allel des cI-Gens enthält. All das führt zur Einengung des Stammkreises der Rezipienten und zur potentiellen Instabilität der Rekombination-Plasmide unter den Bedingungen der Kultivierung bei der grosstechnischen Produktion infolge der reCa-abhängigen Rekombination zwischen einem Plasmid, das das Gen des Interleukin-2 enthält, mit einem Kompatiblen Plasmid oder mit den entsprechenden Bereichen der defekten Prophage.
Die Verwendung für die Organisation eines Hybridabschnitts für die Verknüpfung der Ribosome einer relativ nicht langen SD-Sequenz ermöglicht es ausserdem nicht, in einem vollen Masse die potentielle Leistung des Translationsapparates von E.coli zu realisieren, was zu einem relativ niedrigen Niveau der Synthese des menschlichen Interleukin-2 in den Zellen des Produzenten-Stammes führt.
All das kann zu einer bedeutenden Verringerung des Gehaltes an Interleukin-2 in der Biomasse des Produzenten-Stammes bei seiner grosstechnischen Kultivierung führen, was letzten Endes die anschliessende Ausscheidung des reinen Eiweisses verkompliziert und die Ausbeute ein Endprodukt herabsetzt.
Darstellung der Erfindung
Die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, das Verfahren zu ihrem Konstruieren und der Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19), der dieselbe enthält, sind neu und wurden in der Literatur beschrieben.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Rekombination-Plasmid-DNS, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, ein Verfahren zu ihrem Konstruieren und einen hochproduktiven Produzenten-Stamm des Interleukin-2 zu entwickeln, der dieselbe enthält und die Erzeugung des Interleukin-2 in einer hohen Ausbeute bewirkt.
Die Aufgabe wurde durch die kennzeichnenden Merkmale von Anspruch 1 gelöst.
Das Verfahren zum Konstruieren der erfindungsgemässen Rekombination-Plasmid-DNS ist durch die Merkmale von Anspruch 2 gekennzeichnet.
Das erfindungsgemässe Plasmid ist u.a. dadurch gekennzeichnet, dass das Gen cIts857, Regulator der Einleitung der Transkription, angefangen von den früheren Promotoren der lambda -Bakteriophage, in seiner Zusammensetzung angeordnet ist und die Expression des Gens vom Interleukin-2 unter der Kontrolle des PR-Promotors sich befindet. Dieser Umstand ermöglicht es, die potentielle recA-abhängige Rekom bination zwischen einem Plasmid, das ein Gen des Interleukin-2 kodiert, mit einem kompatiblen Residenten-Plasmid oder mit einer defekten Prophage zu vemeiden.
Das erfindungsgemässe Verfahren zum Konstruieren des Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19, bei dem die SD-Sequenz und das AUG-Kodon des cro-Gens der lambda -Bakteriophage mit dem kodierenden Bereich eines Gens des menschlichen Interleukin-2 gekoppelt werden, gewährleistet die Herstellung eines Hybridabschnitts für die Verknüpfung der Ribosome eines Gens des Interleukin-2 mit optimaler primärer und räumlicher Struktur des 5 min -Endbereiches der Matrix-RNS bewirkt.
Zur Erfindung gehört auch ein Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) Produzent des menschlichen Interleukin-2, der die Rekombination-Plasmid-DNS pPRIL2-19 enthält, der gentechnisch durch Einführung der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 in die Bakterien Escherichia coli erzeugt wurde. Der erfindungsgemässe Stamm ist am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Allunions-Forschungsinstituts für Antibiotika UdSSR, Moskau, Nagatiskaya ulitsa, 3a deponiert und unter N. VNIIA1869 registriert. Der erfindungsgemässe Stamm ermöglicht es, eine stabile Speicherung des menschlichen Interleukin-2 unter Verhältnissen der grosstechnischen Kultivierung zu gewährleisten und eine Ausbeute an Endprodukt (von 8 bis 10).10<7> ME/l zu erreichen, was 8 bis 12%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes, entspricht.
Bester Weg zur Ausführung der Erfindung
Das Verfahren zum Konstruieren der erfindungsgemässen Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19 wird in mehreren Etappen durchgeführt.
Das Plasmid pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 kb, das auf der Grundlage des Plasmids pBR-322 konstruiert wurde und das ein ColEI-Replikon, ein Gen der Resistenz gegen Ampizillin und eine kDNS-Kopie eines Gens des Interleukin-2 enthält, dessen Expression durch einen Promotor und die SD-Sequenz des Tryptophan-Operons E-coli bewirkt wird, wird durch Substitution des Abschnittes der Restriktion für Stu I durch den Abschnitt der Restriktion Bgl II modifiziert und man erhält das Plasmid pAA1213-23B, das man mit der Restriktase Cfr13 behandelt und die entstehenden Einstrang-Enden der DNS-Moleküle mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli vervollständigt. Dann wird das Cfr13-Fragment des Plasmids pAA1213-23B, das ein Gen des Interleukin-2 enthält, durch präparative Elektrophorese im Gel der leichtschmelzenden Agarose ausgeschieden.
Man führt das Konstruieren des Vektor-Plasmids pPR124B durch. Hierfür wird in der DNS des Plasmids pPR40 am Abschnitt des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II die Deletion mit Hilfe der Exonuklease Bal31 vorgenommen, hierdurch erhält man das Plasmid pPR100, in dem der Abschnitt der Wiedererkennung BamHI unmittelbar hinter dem Bereich der Kopplung der Ribosome der lambda -Phage liegt, wobei im Bereich des iniziierenden AUG-Kodons folgende Sequenz entsteht:
EMI7.1
Im weiteren wird das kleinere PstI-BamHI-Fragment des Plasmids pPR100 mit dem grösseren PstI-BamHI-Fragment des Plasmids pML24 mit Hilfe der konventionellen gentechnischen Methodiken vereinigt und man erhält das Plasmid pPR124, in das man mit Hilfe eines Oligonukleotid-Linkers einen Abschnitt des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II anstelle XbaI einführt und man das Plasmid pPR124B erhält.
Dann wird das Cfr13-Fragment des Plasmids pAA1213-23B mit einem Gen des Interleukin-2 mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in die Zusammensetzung des Vektor-Moleküls pPR124 integriert, das mit der Restriktase BamHI gespaltet ist, und bei dem mit der SI-Endonuklease Einfaden-Enden der DNS entfernt sind, dann wird das Präparat mit der Restriktase Bgl II behandelt, wodurch die Zyklisierung der linearen DNS-Moleküle mit der DNS-Ligase T4 bewirkt wird. Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert, die Transformanten werden in einen Nährboden mit Ampizillin inokuliert und bei einer Temperatur von 28 DEG C mit anschliessender Selektion auf verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C kultiviert.
Aus den dadurch ausgewählten Klonen wird die Plasmid-DNS, die als pPR-IL2-19 bezeichnet wird, ausgeschieden, in der die Genauigkeit der Wiedervereinigung der Fragmente durch Wiederherstellung der früher fehlenden Sequenz des Wiedererkennens der Restriktase BspRI an der Stossstelle der Ausgangsabschnitte der DNS geprüft wird.
Der erfindungsgemässe Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) erhält man durch Transformation eines Rezipienten-Stammes der Bakterien Escherichia coli mit der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19. Als Rezipienten-Stamm können die Stämme E.coli C600, E.coli VNIIGENETIKA VL-903 (deponiert in der Allunionskollektion der industriellen Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Genetik und Selektion industrieller Mikroorganismen und registriert unter Nr. BKIIMB-3546) und andere Derivate E.coli K12 verwendet werden. Nach der Transformation erfolgt die Auswahl von Rekombination-Klonen am Nährboden mit Ampizillin bei einer Temperatur von 28 DEG C.
Der erfindungsgemässe Stamm wird durch die Synthese des menschlichen Interleukin-2 unter Verhältnissen der Depression des PR-Promotors, durch die Resistenz gegen Ampizillin sowie durch eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei der Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C gekennzeichnet.
Der erfindungsgemässe Stamm gestattet es, eine stabile Speicherung des menschlichen Interleukin-2 unter Bedingungen der grosstechnischen Kultivierung zu gewährleisten, und führt zu einer erhöhten Synthese desselben in den Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19), die bis (8-10).10<7> Einheiten/l beträgt, was 8 bis 12%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes, entspricht.
Der Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) wird durch folgende Merkmale gekennzeichnet.
Morphologische Merkmale. Die Zellen sind gerade, stäbchenförmig, schwachbeweglich, sind fähig zur Bildung von fadenförmigen Formen, gramm-negativ, nichtsporentragend, die Grösse der einzelnen Zellen beträgt von 3 bis 5 mu m.
Kulturmerkmale. Die Zellen wachsen gut an festen und flüssigen, einfachen, synthetischen, halbsynthetischen und komplexen Nährböden. Beim Wachsen an dem agarisierten Hottinger-Bouillon beziehungsweise dem L-Bouillon, bilden sie glatte, runde, schwachmattierte, verschleimte Kolonien. Bei der Züchtung an flüssigen Nährböden vom Typ des L-Bouillons oder M9 bilden sie mit den Kasaminsäuren eine homogene Suspension.
Physiologisch-biochemische Merkmale. Die Zellen sind zum Wachstum in einem Temperaturenbereich von 5 bis 40 DEG C (Optimum beträgt 37 DEG C) bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,5 fähig. Als Kohlenstoffquelle verwendet man Kohlenhydrate (beispielsweise Saccharose) und Aminosäuren. Die Zellen besitzen Auxotrophie nach Methionin. Als Stickstoffquelle können Mineralsalze in Ammoniumform sowie organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton, Hefeextrakt und Aminosäuren dienen.
Resistenz gegenüber Antibiotika. Der Stamm ist resistent gegen Ampizillin in einer Konzentration von höchstens 100 mg/l bei Züchtung an flüssigen und agarisierten Nährböden.
Stabilität des Plasmids. Bei der Aufbewahrung der Zellen am agarisierten Nährboden, bei einer Reihe von hintereinander folgenden Überimpfungen und während einer Submerskultivierung am flüssigen Nährboden mit einem Antibiotikum erfolgt kein Verlust und keine Umgestaltung des Plasmids.
Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen der Durchführung des Verfahrens zum Konstruieren des erfindungsgemässen Plasmids, des Verfahrens zur Erzeugung eines Stammes, seiner Kultivierung erläutert und durch folgende Figuren veranschaulicht, in denen es zeigen:
Fig. 1 physikalisch-genetische Karte des Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19;
Fig. 2 Schema der Erzeugung des erfindungsgemässen Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19.
Beispiel 1
Das Konstruieren des erfindungsgemässen Rekombination-Plasmids pPR-IL2-19 führt man in mehreren Etappen durch. Zunächst konstruiert man das Vektor-Plasmid pBR124B.
3 mu g DNS-Plasmid pPR40 spaltet man mit der Restriktase Bgl II in 60 mu l Pufferlösung für Restriktion-1, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert = 8,0), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 150 mMol NaCl enthält. Die DNS wird mit zwei Volumina Äthanols umgefällt. Den Niederschlag löst man in 20 mu l H2O auf. Die Behandlung der DNS mit der Exonuklease Bal31 führt man innerhalb von 3 min bei einer Temperatur von 30 DEG C in 30 mu l Pufferlösung durch, die 3 Mol NaCl, 60 mMol CaCl2, 60 mMol MgCl2, 100 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 8,0) und 5 mMol Äthylendiamintetraessigsäure enthält. Die DNS wird mit 2 Volumina Äthylalkohols umgefällt. Den Niederschlag löst man in 10 mu l H2O auf. Die Behandlung mit der Restriktase BamHI führt man in einer Probe mit einem Volumen von 30 mu l durch, die die genannte Pufferlösung für Restriktion-1 enthält.
Das Nachbauen der Einketten-3 min -Endabschnitte der DNS führt man durch Behandlung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit 20 mu l Volumen durch, die 10 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 8,0), 10 mMol MgCl2, 2 mu g DNS-Präparat, je 30 mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidtriphosphate enthält, 5 Einheiten des DNS-Fermentes werden aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100 mu l H2O aufgelöst. Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C während 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung (60 mMol tris-HCl, (pH-Wert = 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol, 0,4 mMol Adenosintriphosphat) und 1 mu g DNS enthält.
Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert, die Effektivität der Transformation beträgt bis 5.10<6> Kolonien je 1 mu g des nativen Plasmids pPR40. Es werden die gegen Ampizillin re sistenten Klone (100 g/ml) gewählt, aus ihnen wird die Plasmid-DNS nach dem modifizierten Birnboim- und Doly-Verfahren ausgeschieden und für die Restriktionsanalyse verwendet. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR100, das einen unikalen Abschnitt der Spaltung von BamHI enthält. Danach konstruiert man das Plasmid pPR124. Hierfür spaltet man 2 mu g DNS-Plasmid pML24 zusammen mit den Restriktasen BamHi und PstI in 40 mu l Pufferlösung für Restriktion-1 und vereinigt man mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage bei einer Temperatur von 0 DEG C mit Fragmenten, die bei der Hydrolyse des DNS-Plasmids pPR100 mit den Restriktasen BamHI und PstI erhalten wurden.
Mit dem hergestellten DNS-Präparat transformiert man die Zellen E.coli C600 mit Auswahl der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin mit anschliessender Selektion der Cm<r>-Klone an einem Nährboden mit 300 mu g/ml Chloramphenikol bei der Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C. Aus den dadurch ausgewählten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS und untersucht man mit Hilfe der Restriktionsanalyse. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR124, das einen Abschnitt der Spaltung mit der Restriktase BamHI enthält.
Dann werden 3 mu g DNS-Plasmid pPR124 mit der Restriktase XbaI in 70 mu l Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert beträgt 7,9), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl enthält, die DNS wird mit zwei Volumina Äthanol umgefällt. Den Niederschlag löst man in 15 mu l H2O auf. Das Nachbauen der Einketten-3 min -Endabschnitte der DNS führt man durch Behandlung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit 20 mu l-Volumen durch, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert = 8,0), 10 mu Mol MgCl2, 2 mu g DNS-Präparat je 30 mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidtriphosphate und 5 Einheiten des Fermentes enthält. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100 mu l H2O aufgelöst.
Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS mit den Bgl-Linkern führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C innerhalb von 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung (60 mMol tris-HCl, (pH-Wert = 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol und 0,4 mMol Adenosintriphosphat), 2 mu g der Plasmid-DNS und 0,5 mu g Linker enthält. Nach der Ligierung wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der fermentativen Hydrolyse mit der Restriktase Bgl II in einer Probe mit 40 mu l-Volumen ausgesetzt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 (6 mMol tris-HCl, pH-Wert beträgt 7,6), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 50 mMol NaCl) enthält.
Die DNS wird erneut mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der Zyklisierung ausgesetzt, wofür man 1 mu g Präparat der Plasmid-DNS in 240 mu l Pufferlösung für Ligierung mit der DNS-Ligase der T4-Phage behandelt. Mit dem hergestellten Gemisch transformiert man die Zellen E.coli C600.
Die Effektivität der Transformation beträgt höchstens 5.10<6> Kolonien je 1 mu g des nativen Plasmids pPR124. Man wählt Klone, die gegen Ampizillin (100 mu g/ml) resistent sind, aus, aus ihnen schneidet man die Plasmid-DNS aus und verwendet man dieselbe für die Restriktionsanalyse. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR124B, das im Unterschied zum Ausgangsvektor-Molekül pPR124 einen unikalen Abschnitt der Spaltung von Bgl II anstelle der vorhandenen Sequenz der Wiedererkennung Xbal (Fig. 2) enthält.
Dann werden 3 mu g des DNS-Plasmids pPR124B mit der Restriktase BamHI in einer Probe mit 12 mu l-Volumen gespaltet, die eine Pufferlösung für Restriktion-1 enthält. Die Reaktion wird durch die Phenol-Deproteinisierung der DNS und durch die Umfällung der Nukleinsäure mit Äthanol zum Stillstand gebracht. Den Niederschlag löst man in 20 mu l H2O auf. Die Entfernung der bei der Spaltng der DNS mit der Restriktase entstehenden Einstrang-Enden erfolgt unter Zuhilfenahme der SI-Endonuklease. Hierfür wird die DNS mit 30 Einheiten der SI-Endonuklease in einer Probe mit 50 mu l-Volumen, die 30 mMol CH3COONa, (pH-Wert = 4,4), 4,5 mMol ZnSO4, 250 mMol NaCl enthält, innerhalb von 20 min bei einer Temperatur von 20 DEG C hydrolysiert. Die Reaktion wird durch die Behandlung mit Phenol zum Stillstand gebracht, und die DNS wird mit Äthanol umgefällt. Den Niederschlag löst man in 15 mu l H2O auf.
Dann erhält man das Plasmid pAA1213-23B. Hierfür werden 3 mu g des DNS-Plasmids pAA1213-23 mit einer Grösse von 5,4 Tausend Basenpaaren, das auf der Grundlage des Plasmids pBR-322 konstruiert ist und die ein ColEI-Replikon, ein Gen der Resistenz gegen Ampizillin und eine kDNS-Kopie eines Gens des menschlichen Interleukin-2 enthält, dessen Expression durch einen Promotor und durch die SD-Sequenz des Tryptophanoperrons E.coli bewirkt wird, in 10 Einheiten der Restriktase Stu I in einer Probe mit 30 mu l-Volumen gespaltet, die eine Pufferlösung für Restriktion-1 [10 mMol tris-HCl (pH-Wert beträgt 7,9), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl] enthält, dann wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch durch den Äthanolzusatz gefällt. Der Niederschlag wird mittels Zentrifugierens in 20 mu l H2O ausgeschieden.
Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS mit den Bgl-II-Linkern führt man mit Hilfe von 20 Einheiten der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe mit 30 mu l-Volumen durch, die eine Pufferlösung für Ligierung [60 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol und 0,4 mMol Adenosintriphosphat], 2 mu g der Plasmid-DNS und 0,5 mu g Linker enthält. Nach der Ligierung wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der fermentativen Hydrolyse mit der Restriktase Bgl II in einer Probe mit 40 mu l-Volumen ausgesetzt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 [6 mMol tris-HCl (pH-Wert beträgt 7,7), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 50 mMol NaCl] enthält.
Die DNS wird erneut mit Äthanol gefällt, aufgelöst, und man gewährleistet die Zyklisierung der DNS-Moleküle, wofür man 1 mu g Präparat der Plasmid-DNS in 240 mu l einer Pufferlösung für Ligierung mit 2 Eineiten der DNS-Ligase der T4-Phage behandelt. Mit dem hergestellten Gemisch transformiert man die Zellen E.coli C600. Die Effektivität der Transformation beträgt bis 5.10<6> Kolonien je 1 mu g des nativen Plasmids pAA1213-23. Es werden die gegen Ampizillin (100 mu g/ml) Klone ausgewählt, aus ihnen wird die Plasmid-DNS nach dem modifizierten Birnboim- und Doly-Verfahren ausgeschieden, und man verwendet dieselbe für die Restriktionsanalyse. Das dadurch erzeugte Plasmid pAA1213-23B enthält im Unterschied zum Ausgangs-Rekombination-Molekül pAA1213-23 einen unikalen Abschnitt der Spaltung von Bgl II anstelle der vorhandenen Sequenz der Wiedererkennung Stu I (Fig. 2).
Man spaltet 30 mu g DNS-Plasmid pAA1213-23B mit der Restriktase Cfr13 (200 Aktivitätseinheiten) in einer Probe mit 100 mu l-Volumen, die eine Pufferlösung für Restriktion-1 enthält. Die Produkte der fermentativen Hydrolyse werden der Elektrophorese in 1,1%igem Gel der leichtschmelzenden Agarose in einem tris-Azetat-Puffer-System bei einer Feldspannung von 5 V/cm ausgesetzt. Die Gel-Zone, die ein DNS-Fragment mit einem Gen des Interleukin-2 mit einer Länge von 750 Basenpaaren enthält, wird ausgeschnitten, und man führt die Elution der DNS durch. Zum Nachbauen der Einstrang-Enden der DNS mit Hilfe des Klenowschen Fragmentes der DNS-Polymerase I E.coli wird das aus dem Gel ausgeschiedene Fragment in einer Probe mit einem Volumen von 20 mu l behandelt, die 10 mMol tris-HCl, (pH-Wert beträgt 8,0), 10 mMol MgCl2, je 30 mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidphosphate enthält.
Die Reaktion wird mittels Durchwärmung zum Stillstand gebracht, die DNS wird aus dem Gemisch mit Äthanol umgefällt und in 20 mu l H2O aufgelöst.
Dann wird das vorher erzeugte Präparat des linearisierten Plasmids pBR124B mit einem Fragment des Plasmids pAA1213-23B wiedervereinigt. Hierfür behandelt man 1 mu g DNS-Plasmid und 2 mu g Fragment mit der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Pufferlösung für Ligierung in einem Volumen des Reaktionsgemisches von 30 mu l. Nach der Umfällung der DNS und der Auflösung des Niederschlags in 20 mu l H2O wird das Präparat mit der Restriktase Bgl II, wie oben beschrieben, behandelt, man fällt die DNS nochmals mit Äthanol um, man löst und gewährleistet die Wiedervereinigung der linearen DNS-Moleküle zu Ringformen mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage bei der Behandlung des Fermentenpräparates in einem Volumen des Reaktionsgemisches von 300 mu l.
Das hergestellte Präparat verwendet man für die Transformation der Zellen E.coli C600 mit anschliessender Selektion der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin bei der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C. Aus den angefallenen Transformanten wählt man Varianten aus, die eine verringerte Fähigkeit zum Wachstum bei einer Temperatur von 42 DEG C aufweisen. Aus den genannten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS, wie oben beschrieben, aus und setzt man der Restriktionsanalyse aus. In dem erzeugten Plasmid pPR-IL2-19 (Fig. 2) entsteht an der Stossstelle der zu vereinigenden DNS-Abschnitte, die das erste Kodon des Cro-Gens der lambda -Phage und das Ala-Kodon des menschlichen Interleukin-2 kodieren, ein Abschnitt der Spaltung der Restriktionsendonuklease BspRI.
Beispiel 2
Die Erzeugung des Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19)-Produzenten des menschlichen Interleukin-2 erfolgt wie folgt: Das Plasmid pPR-IL2-19, das die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, führt man durch Transformation in die Zellen des Besipienten-Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 ein, der in der Allunionskollektion der industriemässigen Mikroorganismen des Unionsforschungsinstitutes für Genetik und Selektion der industriemässigen Mikroorganismen deponiert und unter Nr. BKIIM B-3546 registriert ist. Die Effektivität der Transformation der Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 beträgt etwa 10<6> Klone je 1 mu g des nativen Plasmids pPR-IL2-19. Die Transformanten werden an einem Nährboden gewählt, der Ampizillin (100 mu g/ml) nach der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C enthält.
Aus den ausgewählten Klonen scheidet man die Plasmid-DNS aus und weist man ihre Identität mit dem Präparat pPR-IL2-19 mit Hilfe der Restriktionsanalyse nach. Man erhält den Stamm E.coli VL 903 (pPR-IL2-19)-Produizent des menschlichen Interleukin-2.
Beispiel 3
Den Stamm E.coli VL 903 (pPR-IL2-19) züchtet man bei einer Temperatur von 28 DEG C an einem abgeschrägten agarisierten Hottinger-Nährboden, der 50 mu g/ml Ampizillin enthält, innerhalb von 14 h. Die an den Abschrägungen gewachsene Biomasse verwendet man für die Gewinnung des Inokulums. Hierfür werden die Zellen in die Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von 750 ml mit 100 ml Hottinger-Nährboden übertragen, der 100 mu g/ml Ampizillin enthält, und bei einer Temperatur von 28 DEG C in einer Schüttelvorrichtung bei 240 U/min innerhalb von 6 h gezüchtet. Die optische Dichte des Inokulums beträgt 1,5 bis 2,5 Einheiten.
Die Fermentierung führt man in einem Fermentationsapparat durch, der mit Systemen der Regelung des pH-Wertes, der Temperatur, der Geschwindigkeit des Vermischens und der Aeration ausgerüstet ist. Für die Fermentierung verwendet man den Hottinger-Nährboden mit 100 mu g/ml Ampizillin und 10 g/l Glykose. Das Inokulum trägt man in einer Menge von 5 bis 10 Masse-% ein. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 6,6 bis 6,8, wobei dieser Stand mittels Zuführung von Ammoniakwasser unterhalten wird. Den ersten Teil der Fermentierung führt man bis zu einer optischen Dichte gleich 3,5 bei 550 nm und einer Temperatur von 28 DEG C durch, danach wird die thermische Induktion vorgenommen, indem man die Temperatur innerhalb von 5 min von 42 auf 45 DEG C erhöht, wonach man die Fermentierung weitere 2 h fortsetzt.
Nach der Beendigung der Prozessführung werden die Zellen zwecks Ermittlung der Aktivität des menschlichen Interleukin-2 aus 1 ml Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren ausgefällt, der Niederschlag wird in 1 ml einer 8 molaren Lösung des Guanidinchlorids bei einer Temperatur von 20 DEG C innerhalb von 40 min resuspendiert. Danach wird der Niederschlag durch Zentrifugieren dekantiert, und man ermittelt die Aktivität der überstehenden Flüssigkeit einer Fraktion des Interleukin-2. Biologische Aktivität des hergestellten Interleukin-2 beträgt (8-10).10<7> ME/l.
Zur Ermittlung des Anteils des synthetisierten menschlichen Interleukin-2, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweisses, werden die Zellen aus 1 ml Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren ausgefällt und, wie oben beschrieben, behandelt. Das Präparat analysiert man mittels Elektrophorese im 15%igen Polyakrylamid-Gel in Gegenwart des 0,1%igen Natriumdodezylsulfats. Die im Gel getrennten Eiweissstoffe werden in der Kumassi-Lösung R-250 "Serva" (BRD) nach einer Standard-Methodik durchgefärbt. Der quantitative Gehalt an Eiweissstoffen in den Zonen ermittelt man nach der Abtastung des durchgefärbten Gels in einem Densitometer.
Die Identifizierung der Zone, die dem in den Zellen synthetisierten reifen menschlichen Interleukin-2 entspricht, führt man aufgrund des Vergleichs mit der elektrophoretischen Beweglichkeit der Markierungseiweissstoffe sowie der mit Hilfe des Blottings getrennten Eiweissstoffe auf Nitrozellulose-Filter unter anschliessender Entwicklung der Interleukin-Zonen mittels Bearbeitung in Lösungen durch, die Monoklonal-Mäuseantikörper gegen Interleukin-2 und Antimäuse-Kaninchen-Antikörper, die mit der Peroxydase aus Meerrettich konjugiert sind, enthalten. Nach dem entsprechenden Färbungsvorgang entwickelt sich die Interleukin-Zone in Form eines braunen Streifens an dem ungefärbten Hintergrund des Nitrozellulose-Filters.
Der Anteil des in den Zellen des Eiweissproduktes synthetisierten Gens des Interleukin-2 beträgt höchstens 12%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes.
Gewerbliche Verwertbarkeit
Die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IL2-19, die die Synthese des menschlichen Interleukin-2 kodiert, findet Anwendung bei der Erzeugung von Produzenten-Stämmen des menschlichen Interleukin-2 von hoher Aktivität. Der erfindungsgemässe Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19)-Produzent des menschlichen Interleukin-2 findet Anwendung in der mikrobiologischen und medizinischen Industrie bei der Herstellung des menschlichen Interleukin-2, der in der medizinischen Praxis angewendet werden kann.
Technical field
The present invention relates to a new recombination plasmid DNA pPR-IL2-19 which encodes the synthesis of human interleukin-2, a method for its construction and a strain of the bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-I9) - Producer of human interleukin-2.
State of the art
Natural human interleukin-2 or growth factor of T cells is glycoprotein with a molecular mass of the polypeptide chain of approximately 15,000 daltons and it is produced by the T cells when they are activated with the leptin or with a corresponding antigen. Interleukin-2 is an immunomodulator with a complex mechanism of action, in particular it stimulates the immune response at the expense of activation of the T lymphocyte, enhancement of mitogenesis of the thymocyte, induction of the cytotoxic activity of the T cells and more. The interleukin-2 is accordingly of greater potential importance for the therapy of immunological disorders, such as malignant degeneration, bacterial or virus-like infections, diseases associated with the immunodeficiency, autoimmune diseases and others.
The natural interleukin-2, which is excreted directly from human serum or from a culture medium of the cells of the Jurkat line, is accessible in extremely small amounts, which are insufficient for the study of its properties and clinical potential. The genetically engineered strains of the microorganisms which carry the recombination plasmids with a gene of the interleukin-2 and which bring about an effective expression of this gene can serve as an alternative source of the interleukin-2
Recombination plasmid DNA encoding human interleukin-2 is known, for example the recombination plasmid DNA pPLcMuHil 201 and strain E. coli KI2 DELTA HI DELTA trp (pPLcMuHil 201) containing the same (Devos R., Plaetinck G., Cheroutre H., Simons G., Degrave W., Tavernier J., Remaut E., Fiers W., 1983, Nucl. Acid. Res., 11, 4307-4323).
In the composition of said recombination molecule of DNA, the transcription of the gene of interleukin -2 is controlled by a regulator element PLOL of lambda bacteriophage and the initiation of translation of the protein product of the gene is based on the construction of a hybrid section of the linkage of the ribosomes of the Mu phage SD sequence. The maximum yield of human interleukin-2, which is ensured by the cultivation of the producer strain E. coli KI2 DELTA Hi DELTA trp (pPLcMuHil 201), is 5 to 10%, based on the total amount of the protein of the cells.
The recombination plasmid DNA mentioned and the strain containing the same have a number of disadvantages which are due to the fact that the regulatable expression of the IL2 gene which is caused by the PL promoter either contains a resident plasmid a gene of the temperature sensitive cI repressor (cIts857) or the use as a recipient of a strain containing a defective prophage with a mutant allele of the cI gene. All this leads to the narrowing of the parent circle of the recipients and to the potential instability of the recombination plasmids under the conditions of cultivation in large-scale production as a result of the reCa-dependent recombination between a plasmid which contains the gene of interleukin-2, a compatible plasmid or with the corresponding areas of the defective prophage.
Furthermore, the use for the organization of a hybrid section for the linkage of the ribosomes of a relatively short SD sequence does not make it possible to fully realize the potential performance of the E. coli translator, resulting in a relatively low level of human synthesis Interleukin-2 leads in the cells of the producer strain.
All of this can lead to a significant reduction in the content of interleukin-2 in the biomass of the producer strain during its large-scale cultivation, which ultimately complicates the subsequent excretion of the pure protein and reduces the yield of an end product.
Presentation of the invention
The recombination plasmid DNA pPR-IL2-19 according to the invention, which encodes the synthesis of human interleukin-2, the method for its construction and the strain of the bacteria Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19), which contains the same, are new and have been described in the literature.
The invention has for its object to develop a new recombination plasmid DNA encoding the synthesis of human interleukin-2, a process for its construction and a highly productive producer strain of interleukin-2 which contains the same and the generation of Interleukin-2 causes in a high yield.
The object was achieved by the characterizing features of claim 1.
The method for constructing the recombination plasmid DNA according to the invention is characterized by the features of claim 2.
The plasmid according to the invention is i.a. characterized in that the gene cIts857, regulator of initiation of transcription, starting from the previous promoters of the lambda bacteriophage, is arranged in its composition and the expression of the gene from interleukin-2 is under the control of the PR promoter. This fact makes it possible to avoid the potential recA-dependent recombination between a plasmid which codes for a gene of interleukin-2, with a compatible resident plasmid or with a defective prophage.
The method according to the invention for constructing the recombination plasmid pPR-IL2-19, in which the SD sequence and the AUG codon of the cro gene of the lambda bacteriophage are coupled to the coding region of a gene of the human interleukin-2, guarantees Production of a hybrid section for linking the ribosomes of a gene of interleukin-2 with optimal primary and spatial structure of the 5 min end region of the matrix RNA.
The invention also includes a strain E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) producer of human interleukin-2, which contains the recombination plasmid DNA pPRIL2-19, which is genetically engineered by introducing the recombination plasmid DNA pPR- IL2-19 was produced in the Escherichia coli bacteria. The strain according to the invention was deposited on January 12, 1987 in the collection of cultures of microorganisms of the All Union Research Institute for Antibiotics USSR, Moscow, Nagatiskaya ulitsa, 3a and registered under N. VNIIA1869. The strain according to the invention makes it possible to ensure stable storage of human interleukin-2 under conditions of large-scale cultivation and to achieve a yield of end product (from 8 to 10) .10 7 ME / l, which is 8 to 12%, based to the total amount of cell protein.
Best way to carry out the invention
The method for constructing the recombination plasmid DNA pPR-IL2-19 according to the invention is carried out in several stages.
The 5.4 kb plasmid pAA1213-23, which was constructed on the basis of plasmid pBR-322 and which contains a ColEI replicon, a gene for resistance to ampicillin and a kDNA copy of a gene of interleukin-2 , the expression of which is caused by a promoter and the SD sequence of the tryptophan operon E-coli, is modified by substituting the restriction section for Stu I by the restriction Bgl II section and obtaining the plasmid pAA1213-23B, which is obtained treated with the Cfr13 restrictase and the resulting single-strand ends of the DNA molecules were completed with the Klenow fragment of the DNA polymerase I E. coli. Then the Cfr13 fragment of the plasmid pAA1213-23B, which contains a gene of interleukin-2, is secreted by preparative electrophoresis in the gel of the low-melting agarose.
Construction of the vector plasmid pPR124B is carried out. For this purpose, the deletion is carried out in the DNA of the plasmid pPR40 at the section of the recognition of the restrictase Bgl II with the help of the exonuclease Bal31. This gives the plasmid pPR100, in which the section of the BamHI recognition immediately behind the region of the coupling of the ribosomes of the lambda Phage lies, whereby the following sequence arises in the area of the initiating AUG codon:
EMI7.1
Furthermore, the smaller PstI-BamHI fragment of the plasmid pPR100 is combined with the larger PstI-BamHI fragment of the plasmid pML24 using the conventional genetic engineering methods, and the plasmid pPR124 is obtained, into which a section of the .mu.l using an oligonucleotide linker Recognizing the Bgl II restriction instead of XbaI and obtaining the plasmid pPR124B.
Then the Cfr13 fragment of plasmid pAA1213-23B with a gene of interleukin-2 is integrated into the composition of the vector molecule pPR124, which is cleaved with the restriction enzyme BamHI, and with the help of the DNA ligase of the T4 phage the SI endonuclease single-thread ends of the DNA are removed, then the preparation is treated with the restriction glucose Bgl II, which causes the cyclization of the linear DNA molecules with the DNA ligase T4. The E.coli C600 cells are transformed with the mixture prepared, the transformants are inoculated into a nutrient medium with ampicillin and cultivated at a temperature of 28 ° C. with subsequent selection for a reduced growth rate at a temperature of 42 ° C.
From the clones thus selected, the plasmid DNA, designated pPR-IL2-19, is secreted, in which the accuracy of the reunification of the fragments is checked by restoring the previously missing sequence of the recognition of the restrictionase BspRI at the abutment point of the starting sections of the DNA becomes.
The E.coli VNIIGENETIKA VL 903 strain (pPR-IL2-19) according to the invention is obtained by transforming a recipient strain of the bacteria Escherichia coli with the recombination plasmid DNA pPR-IL2-19. As the recipient strain, the strains E.coli C600, E.coli VNIIGENETIKA VL-903 (deposited in the Union of industrial microorganisms collection of the Union Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms and registered under No. BKIIMB-3546) and other derivatives E .coli K12 can be used. After the transformation, recombination clones are selected on the nutrient medium with ampicillin at a temperature of 28 ° C.
The strain according to the invention is characterized by the synthesis of human interleukin-2 under conditions of depression of the PR promoter, by the resistance to ampicillin and by a reduced growth rate when culturing the cells at a temperature of 42 ° C.
The strain according to the invention makes it possible to ensure stable storage of human interleukin-2 under conditions of large-scale cultivation and leads to an increased synthesis of the same in the cells E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19), which up to (8 -10) .10 <7> units / l, which corresponds to 8 to 12%, based on the total amount of the cell protein substance.
The E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) strain is characterized by the following features.
Morphological characteristics. The cells are straight, rod-shaped, weakly mobile, capable of forming thread-like shapes, gram-negative, non-spore-bearing, the size of the individual cells is from 3 to 5 μm.
Cultural characteristics. The cells grow well on solid and liquid, simple, synthetic, semi-synthetic and complex nutrient media. When growing on the agarized Hottinger broth or the L broth, they form smooth, round, slightly matted, mucilaginous colonies. When cultivated on liquid nutrient media of the type L-broth or M9, they form a homogeneous suspension with the casamic acids.
Physiological-biochemical characteristics. The cells are capable of growth in a temperature range from 5 to 40 ° C. (optimum is 37 ° C.) at a pH of 6.7 to 7.5. Carbohydrates (e.g. sucrose) and amino acids are used as the carbon source. The cells have auxotrophy after methionine. Mineral salts in ammonium form and organic compounds in the form of peptone, tryptone, yeast extract and amino acids can serve as the nitrogen source.
Antibiotic resistance. The strain is resistant to ampicillin in a concentration of at most 100 mg / l when grown on liquid and agarized culture media.
Stability of the plasmid. When the cells are stored on the agarized nutrient medium, during a series of successive vaccinations and during submerged cultivation on the liquid nutrient medium with an antibiotic, there is no loss and no redesign of the plasmid.
The invention is explained below using examples of the implementation of the method for constructing the plasmid according to the invention, the method for generating a strain, its cultivation and illustrated by the following figures, in which:
1 physical-genetic map of the recombination plasmid pPR-IL2-19;
Fig. 2 Scheme of the generation of the recombination plasmid pPR-IL2-19 according to the invention.
example 1
The recombination plasmid pPR-IL2-19 according to the invention is constructed in several stages. The vector plasmid pBR124B is first constructed.
3 μg DNA plasmid pPR40 is cleaved with the restriction Bgl II in 60 μl buffer solution for restriction-1, the 10 mmol tris-HCl (pH = 8.0), 6 mmol MgCl2, 6 mmol 2-mercaptoethanol, Contains 150 mmol NaCl. The DNA is reprecipitated with two volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 20 μl of H2O. The treatment of the DNA with the exonuclease Bal31 is carried out within 3 min at a temperature of 30 ° C. in 30 μl buffer solution which contains 3 mol NaCl, 60 mmol CaCl2, 60 mmol MgCl2, 100 mmol tris-HCl, (pH Value is 8.0) and contains 5 mmol of ethylenediaminetetraacetic acid. The DNA is reprecipitated with 2 volumes of ethyl alcohol. The precipitate is dissolved in 10 ml of H2O. The treatment with the BamHI restrictionase is carried out in a sample with a volume of 30 μl which contains the said buffer solution for restriction-1.
Reconstruction of the single-chain 3 min end sections of the DNA is carried out by treatment with the Klenow fragment of the DNA polymerase I E. coli in a sample with a volume of 20 .mu.l and containing 10 mmol of tris-HCl, (pH value is 8 , 0), 10 mmol of MgCl2, 2 μg of DNA preparation, each containing 30 μmole of each of the deoxyribonucleoside triphosphates, 5 units of the DNA ferment are reprecipitated with ethanol from the reaction mixture and dissolved in 100 μl of H2O. The reunification of the linearized plasmid DNA is carried out at a temperature of 16 ° C. for 12 h with the aid of the T4 phage DNA ligase in a sample which contains a buffer solution for ligation (60 mmol tris-HCl, (pH value = 7.6), 10 mmol of MgCl2, 10 mmol of 2-mercaptoethanol, 0.4 mmol of adenosine triphosphate) and 1 μg of DNA.
The E.coli C600 cells are transformed with the mixture prepared, the effectiveness of the transformation is up to 5.10 colonies per 1 μg of the native plasmid pPR40. The clones resistant to ampicillin (100 g / ml) are selected, from them the plasmid DNA is secreted by the modified pear boim and doly method and used for the restriction analysis. The result is the plasmid pPR100, which contains a unique section of the BamHI cleavage. The plasmid pPR124 is then constructed. For this purpose, 2 μg of DNA plasmid pML24 are cleaved together with the BamHi and PstI restrictionases in 40 μl of buffer solution for restriction-1 and the T4 phage DNA ligase is combined with fragments at a temperature of 0 ° C. using the were obtained in the hydrolysis of the DNA plasmid pPR100 with the BamHI and PstI restrictases.
With the DNA preparation prepared, the E.coli C600 cells are transformed by selecting the transformants on a culture medium with ampicillin and then selecting the Cm <r> clones on a culture medium with 300 μg / ml chloramphenicol in the cultivation of the cells in a Temperature of 42 ° C. From the clones thus selected, the plasmid DNA is separated and examined using the restriction analysis. The result is the plasmid pPR124, which contains a section of the cleavage with the BamHI restrictionase.
Then 3 μg of DNA plasmid pPR124 are cleaved with the restrictionase XbaI in 70 μl of buffer solution for restriction-1, which contains 10 mmol of tris-HCl (pH value is 7.9), 6 mmol of MgCl2, 6 mmol of 2-mercaptoethanol and Contains 150 mmol NaCl, the DNA is reprecipitated with two volumes of ethanol. The precipitate is dissolved in 15 ml of H2O. Reconstruction of the single-chain 3 min end sections of the DNA is carried out by treatment with the Klenow fragment of the DNA polymerase I E. coli in a sample with a volume of 20 μl containing 10 mmol of tris-HCl (pH = 8 , 0), 10 mu moles of MgCl2, 2 mu g of DNA preparation contains 30 mu moles of each of the deoxyribonucleoside triphosphates and 5 units of the ferment. The DNA is reprecipitated with ethanol from the reaction mixture and dissolved in 100 μl of H2O.
The reunification of the linearized plasmid DNA with the Bgl linkers is carried out at a temperature of 16 ° C. within 12 h using the DNA ligase of the T4 phage in a sample which contains a buffer solution for ligation (60 mmol tris HCl, (pH = 7.6), 10 mmol MgCl2, 10 mmol 2-mercaptoethanol and 0.4 mmol adenosine triphosphate), 2 μg of the plasmid DNA and 0.5 μg linker. After the ligation, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved and subjected to fermentative hydrolysis with the restrictase Bgl II in a sample with a volume of 40 .mu.l, which contains a buffer solution for restriction-2 (6 mmol tris-HCl, pH Value is 7.6), 6 mmol MgCl2, 6 mmol 2-mercaptoethanol, 50 mmol NaCl).
The DNA is again precipitated with ethanol, dissolved and subjected to the cyclization, for which 1 μg preparation of the plasmid DNA in 240 μl buffer solution for ligation is treated with the DNA ligase of the T4 phage. With the mixture prepared, the cells are transformed into E.coli C600.
The effectiveness of the transformation is at most 5.10 colonies per 1 μg of the native plasmid pPR124. Clones which are resistant to ampicillin (100 μg / ml) are selected, the plasmid DNA is cut out from them and the same is used for the restriction analysis. The result is the plasmid pPR124B, which, in contrast to the starting vector molecule pPR124, contains a unique section of the cleavage of Bgl II instead of the existing sequence of recognition Xbal (FIG. 2).
Then 3 μg of the DNA plasmid pPR124B are cleaved with the BamHI restrictionase in a 12 μl volume sample which contains a buffer solution for restriction-1. The reaction is stopped by phenol deproteinization of the DNA and reprecipitation of the nucleic acid with ethanol. The precipitate is dissolved in 20 μl of H2O. The removal of the single-strand ends resulting from the cleavage of the DNA with the restrictase is carried out with the aid of the SI endonuclease. For this purpose, the DNA with 30 units of the SI endonuclease in a sample with a volume of 50 μl, which contains 30 mmol CH3COONa, (pH = 4.4), 4.5 mmol ZnSO4, 250 mmol NaCl, within 20 min hydrolyzed at a temperature of 20 ° C. The reaction is stopped by treatment with phenol and the DNA is reprecipitated with ethanol. The precipitate is dissolved in 15 ml of H2O.
Then the plasmid pAA1213-23B is obtained. For this purpose, 3 μg of the DNA plasmid pAA1213-23 with a size of 5.4 thousand base pairs, which is constructed on the basis of the plasmid pBR-322 and which contains a ColEI replicon, a gene of resistance to ampicillin and a kDNA- Contains a copy of a gene of human interleukin-2, the expression of which is caused by a promoter and by the SD sequence of the tryptophanoperron E. coli, cleaved in 10 units of the restriction Stu I in a sample with a volume of 30 μl containing a buffer solution for restriction-1 [10 mmol tris-HCl (pH is 7.9), 6 mmol MgCl2, 6 mmol 2-mercaptoethanol and 150 mmol NaCl], then the DNA is precipitated from the reaction mixture by the addition of ethanol. The precipitate is removed by centrifugation in 20 μl H2O.
The reunification of the linearized plasmid DNA with the Bgl II linkers is carried out using 20 units of the T4 phage DNA ligase in a sample with a volume of 30 μl, which contains a buffer solution for ligation [60 mmol tris HCl, (pH value is 7.6), 10 mmol of MgCl2, 10 mmol of 2-mercaptoethanol and 0.4 mmol of adenosine triphosphate], 2 μg of the plasmid DNA and 0.5 μg of linker. After ligation, the DNA is precipitated from the reaction mixture with ethanol, dissolved and subjected to fermentative hydrolysis with the restrictase Bgl II in a sample with a volume of 40 .mu.l, which contains a buffer solution for restriction-2 [6 mmol tris-HCl (pH Value is 7.7), 6 mmol MgCl2, 6 mmol 2-mercaptoethanol and 50 mmol NaCl].
The DNA is again precipitated with ethanol, dissolved, and the cyclization of the DNA molecules is ensured, for which 1 μg preparation of the plasmid DNA in 240 μl of a buffer solution for ligation is treated with 2 units of the DNA ligase of the T4 phage . With the mixture prepared, the cells are transformed into E.coli C600. The effectiveness of the transformation is up to 5.10 colonies per 1 μg of the native plasmid pAA1213-23. The clones against ampicillin (100 μg / ml) are selected, from them the plasmid DNA is secreted according to the modified Birnboim and Doly method, and they are used for the restriction analysis. In contrast to the starting recombination molecule pAA1213-23, the plasmid pAA1213-23B generated in this way contains a unique section of the cleavage of Bgl II instead of the existing sequence of the recognition Stu I (FIG. 2).
30 μg of DNA plasmid pAA1213-23B with the restrictionase Cfr13 (200 activity units) are cleaved in a sample with a volume of 100 μl, which contains a buffer solution for restriction-1. The products of the fermentative hydrolysis are subjected to electrophoresis in 1.1% gel of the low-melting agarose in a tris-acetate buffer system at a field voltage of 5 V / cm. The gel zone containing a DNA fragment with a 750 base-pair interleukin-2 gene is excised and the DNA is eluted. In order to replicate the single-stranded ends of the DNA with the aid of the Klenow fragment of DNA polymerase I E. coli, the fragment separated from the gel is treated in a sample with a volume of 20 μl, which contains 10 mmol of tris-HCl, (pH Value is 8.0), 10 mmoles of MgCl2, each containing 30 μmoles of each of the deoxyribonucleoside phosphates.
The reaction is brought to a standstill by heating, the DNA is reprecipitated from the mixture with ethanol and dissolved in 20 μl of H2O.
Then the previously generated preparation of the linearized plasmid pBR124B is reunited with a fragment of the plasmid pAA1213-23B. For this, 1 μg DNA plasmid and 2 μg fragment are treated with the T4 phage DNA ligase in a buffer solution for ligation in a volume of the reaction mixture of 30 μl. After the DNA has been reprecipitated and the precipitate has been dissolved in 20 μl of H2O, the preparation is treated with the Bgl II restrictionase as described above, the DNA is reprecipitated with ethanol, and the linear DNA molecules are reunited and guaranteed to reunite to ring shapes with the help of the DNA ligase of the T4 phage in the treatment of the ferment preparation in a volume of the reaction mixture of 300 ml.
The preparation prepared is used for the transformation of the E.coli C600 cells with subsequent selection of the transformants on a culture medium with ampicillin when the cells are cultivated within 24 h at a temperature of 28 ° C. Variants are selected from the transformants obtained, which have a reduced ability to grow at a temperature of 42 ° C. The plasmid DNA is separated from the clones mentioned, as described above, and subjected to the restriction analysis. In the generated plasmid pPR-IL2-19 (FIG. 2), at the junction of the DNA segments to be combined, which encode the first codon of the Cro gene of the lambda phage and the Ala codon of human interleukin-2, is formed Section of the restriction endonuclease BspRI cleavage.
Example 2
The E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) producer of human interleukin-2 is produced as follows: The plasmid pPR-IL2-19, which encodes the synthesis of human interleukin-2, is carried out by transformation into the cells of the E. coli VNIIGENETIKA VL 903 patient strain, which is deposited in the Union of industrial microorganisms collection of the Union Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms and is registered under No. BKIIM B-3546. The effectiveness of the transformation of the E.coli VNIIGENETIKA VL 903 cells is about 10 6 clones per 1 μg of the native plasmid pPR-IL2-19. The transformants are selected on a nutrient medium which contains ampicillin (100 μg / ml) after the cells have been cultivated within 24 h at a temperature of 28 ° C.
The plasmid DNA is separated from the selected clones and its identity with the preparation pPR-IL2-19 is verified using the restriction analysis. The strain E.coli VL 903 (pPR-IL2-19) producer of human interleukin-2 is obtained.
Example 3
The E.coli VL 903 strain (pPR-IL2-19) is grown at a temperature of 28 ° C. on a slanted agarized Hottinger culture medium which contains 50 μg / ml ampicillin within 14 hours. The biomass grown on the bevels is used to extract the inoculum. For this purpose, the cells are transferred into the Erlenmeyer flasks with a volume of 750 ml with 100 ml Hottinger culture medium containing 100 μg / ml ampicillin and at a temperature of 28 ° C. in a shaker at 240 rpm within 6 hours bred. The optical density of the inoculum is 1.5 to 2.5 units.
The fermentation is carried out in a fermentation apparatus which is equipped with systems for regulating the pH value, the temperature, the speed of mixing and the aeration. The Hottinger culture medium with 100 μg / ml ampicillin and 10 g / l glycose is used for the fermentation. The inoculum is entered in an amount of 5 to 10% by mass. The cultivation takes place at a pH of 6.6 to 6.8, this level being maintained by adding ammonia water. The first part of the fermentation is carried out up to an optical density equal to 3.5 at 550 nm and a temperature of 28 ° C. Then the thermal induction is carried out by increasing the temperature from 42 to 45 ° C. within 5 minutes after which the fermentation is continued for a further 2 hours.
After the end of the process control, the cells are precipitated from 1 ml of culture liquid by centrifuging to determine the activity of human interleukin-2, the precipitate is resuspended in 1 ml of an 8 molar solution of guanidine chloride at a temperature of 20 ° C. within 40 min. The precipitate is then decanted by centrifugation and the activity of the supernatant liquid of a fraction of interleukin-2 is determined. Biological activity of the interleukin-2 produced is (8-10) .10 <7> ME / l.
To determine the proportion of human interleukin-2 synthesized, based on the total amount of cell protein, the cells are precipitated from 1 ml of culture liquid by centrifugation and treated as described above. The preparation is analyzed by electrophoresis in 15% polyacrylamide gel in the presence of 0.1% sodium dodezyl sulfate. The proteins separated in the gel are dyed through in the Kumassi solution R-250 "Serva" (FRG) according to a standard method. The quantitative content of protein substances in the zones is determined after scanning the colored gel in a densitometer.
The identification of the zone corresponding to the mature human interleukin-2 synthesized in the cells is carried out on the basis of a comparison with the electrophoretic mobility of the labeling proteins and the proteins separated with the aid of blotting on nitrocellulose filters with subsequent development of the interleukin zones by means of processing in solutions containing monoclonal mouse antibodies to interleukin-2 and anti-mouse rabbit antibodies conjugated to horseradish peroxidase. After the corresponding staining process, the interleukin zone develops in the form of a brown stripe on the undyed background of the nitrocellulose filter.
The proportion of the gene of interleukin-2 synthesized in the cells of the protein product is at most 12%, based on the total amount of the cell protein substance.
Commercial usability
The recombination plasmid DNA pPR-IL2-19 according to the invention, which encodes the synthesis of human interleukin-2, is used in the production of producer strains of human interleukin-2 of high activity. The strain E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IL2-19) producer of human interleukin-2 according to the invention is used in the microbiological and medical industry in the production of human interleukin-2, which can be used in medical practice.