CH676996A5

CH676996A5 -

Info

Publication number: CH676996A5
Application number: CH381588A
Authority: CH
Inventors: Vladimir Georgievich Debabov; Jury Ivanovich Kozlov; Sergei Vladimirovich Mashko; Alexandr Yakovlevich Strongin; Viktor Emilievich Sterkin; Vitaly Lvovich Jurin; Marina Ivanovna Lebedeva; Maxim Eduardovich Trukhan; Sergei Mikhailovich Podkovyrov; Alla Lvovna Lapidus; Andrei Vladimirovich Mochulsky
Original assignee: Vnii Genetiki Selek
Priority date: 1987-02-09
Filing date: 1988-02-08
Publication date: 1991-03-28
Also published as: SE8803567D0; FI884556A0; JPH01502478A; HUT50871A; GB2208866A; NL8820103A; WO1988005819A1; FI884556A; SU1703692A1; SE8803567L; GB8823728D0

Description


  
 


 Technisches Gebiet 
 



  Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, ein Verfahren zu ihrer Erzeugung und einen Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13)-Produzent des menschlichen  beta 1-Interferons, der dieselbe enthält. 


 Stand der Technik 
 



  Interferone sind Eiweissstoffe, die von den spezialisierten Menschenzellen als Antwort auf eine Virus-Infektion beziehungsweise auf die Wirkung verschiedener Induktoren synthesiert werden. Die zurzeit vorliegenden experimentellen Angaben zeugen von der Antiviren-, antiproliferativen und immunmodulierenden Wirkung des Interferons bei der Behandlung mit demselben von  individuellen Zellen, Geweben und eines Organismus insgesamt. In seinen universellen Anwendungsmöglichkeiten und in seiner Bedeutug für den Organismus ist das Interferon-System mit dem Immunitäts-System vergleichbar.

  In Übereinstimung mit den biologischen, chemischen und Antigeneigenschaften sowie in Abhängigkeit vom Typ der Zellen, die sie produzieren, werden die Menschen-Interferone in drei Gruppen geteilt:  alpha -Leukozyten,  beta -Fibroblast- und  gamma -Immun-Interferone, die hauptsächlich von den Zellen der Leukozyte, Fibroblaste bzw. T-Lymphozyte erzeugt werden. Gegenwärtig sind die Anwendungsbereiche der Interferone in der Medizin im grossen und ganzen festgelegt. 



  Da sind Keratite und Dermatosen, die Behandlung von respiratorischen Infektionen, die durch verschiedene Viren (Grippe, Adenoviren), Hepatitis B und andere provoziert werden. 



  Der Wirkungsmechanismus der Interferone, ihre strukturellen und funktionellen Besonderheiten und ihr klinisches Potential sind jedoch noch unzureichend untersucht. Das ist in vielem auf die Schwierigkeit der Gewinnung präparativer Mengen reiner Interferone in konventionellen Verfahren zurückzuführen, die auf der Verwendung induzierter Kulturen von Menschenzellen als Quellen dieses Eiweissstoffes beruhen. Der in diesem Fall synthetisierte Interferon stellt ausserdem in der Regel ein kompliziertes Gemisch aus seinen verschiedenen Untertypen und Formen dar, die sich durch ihre strukturellen und funktionellen Kenndaten, unterscheiden. Das kompliziert wesentlich die Untersuchung der Eigenschaften individueller Interferone. In diesem Zusammenhang erfährt die Gewinnung individueller Interferone durch mikrobiologische Synthese eine immer grössere Verbreitung. 



  Bekannt ist eine Reihe von Verfahren zur Gewinnung von  alpha -,  beta - und  gamma -Menschen-Interferone, die auf der Verwendung von Bakterien als Produzenten, insbesondere verschiedener Stämme von Escherichia coli, Bacillus subtilis, Pseudomonas sp., beruhen, die in ihrer Zusammensetzung Rekombination-Plasmid-DNS enthalten, die die Expression heterologischer Gene in einer neuen genetischen Umgebung bewirken. Im Falle mit dem menschlichen Fibroblast-Interferon (IFN  beta 1) wurde zur Erreichung der Expression des Gens IFN beta 1-Gens in den E.coli-Zellen der kodierende Teil des reifen Interferons unter die Kontrolle der Signale der Transkription und Translation der Gene (tuf B, rec A) und Operone (lac UV 5 trp) E.coli und Koliphagen (PL lambda ) gestellt.

  Der im Ergebnis der mikrobiologischen Synthese entstehende reife  beta 1-Interferon (mit einer Molekularmasse von  &tilde& 19 000 Dalton) wird durch das Fehlen einer Kohlenhydratkomponente und  durch das Vorliegen eines Formyl-Methionin-N-endrestes anstelle des Methioninrestes charakterisiert. Dieser Unterschied führt jedoch nicht zur Veränderung der biologischen Aktivität des Eiweissproduktes, des IFN beta 1-Gens im Vergleich zum natürlichen Glykoprotein, das in den Fibroblast-Zellen produziert wird. Der im genannten mikrobiologischen Verfahren synthetisierte  beta 1-Interferon kann sowohl für die Untersuchung molekularer Mechanismen der Wechselwirkung mit Zellen-Rezeptoren als auch in der medizinischen Praxis zum Einsatz kommen. 



  Bekannt sind Rekombination-Plasmid-DNS, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodieren, solche wie pC1857 und pPL c 245HFIF25 und E.coli-Stamm SG40444, der die genannten Plasmide enthält (Remaut E, Staussens P., Fiers G, 1983, Nucl. Acida Res. 11, 4677-4688). 



  In der Zusammensetzung der Rekombination-Plasmid-DNS pPLc245HFIF25 wird die Transkription des IFN  beta 1-Gens durch ein Regulator-Element PLOL der  lambda -Bakteriophage kontrolliert, und die Einleitung der Translation des Eiweissproduktes des Gens wird auf Kosten des Konstruierens eines Hybridabschnitts der Verknüpfung von Ribosomen auf der Grundlage der SD-Sequenz eines Replikase-Gens der MS2-Phage bewirkt. Die maximale Ausbeute an menschlichem   beta 1-Interferon, die durch das Kultivieren des genannten Stammes gesichert wird, beträgt 4%, bezogen auf den Gesamteiweissgehalt der plasmidhaltigen E.coli-Zellen. 



  Der genannte Stamm wird dadurch gekennzeichnet, dass die regulierbare Expression des IFN  beta 1-Gens, die vom PL-Promotor bewirkt wird, eines zusätzlichen pC1857-Plasmids mit einem auf demselben angeordneten temperaturempfindlichen Regulator-Gen cIts857 der  lambda -Phage bedarf. Das führt zu einer potentiellen Instabilität der Rekombination-Plasmid unter den Bedingungen der Kultivierung des Stammes in der grosstechnischen Produktion auf Kosten einer recA-abhängigen Rekombination zwischen den Plasmiden pC1857 und pPLc245HFIF25 nach den Homologie-Bereichen.

  Die Verwendung für die Organisation eines Hybridabschnit tes der Verknüpfung der Ribosome einer relativ nichtlangen SD-Sequenz der Replikase-Gens der MS2-Phage ermöglicht es ausserdem nicht, in einem vollen Masse die potentielle Leistung des Translationsapparates von E.coli infolge einer ungenügend effektiven Wechselwirkung mit den Ribosomen bei der Einleitung der Translation des Fibroblast-Interferons zu realisieren. Gleichzeitig verursacht das Fehlen in dem nichttranslationsbaren 3<1>-Endbereich des IFN  beta 1-Gens am Plasmid pPLc245HFI25 von  rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription eine wesentliche Verringerung der Kopienerzeugung und sogar den eventuellen Verlust des Rekombination-Plasmids unter den Bedingungen der Depression des hocheffektiven PL-Promotors der  lambda -Phage, die den Start der Transkription des IFN  beta 1-Gens bewirkt. 



   All das gestattet es nicht, ein hohes Niveau der Synthese des Produktes des IFN  beta 1-Gens zu erreichen und kann zur weiteren Verringerung des Gehaltes an   beta 1-Interferons in der Biomasse eines Produzenten-Stammes bei seiner grosstechnischen Kultivierung führen, was die Isolierung des reinen Eiweissstoffes kompliziert und die Ausbeute an Endprodukt verringert. 


 Darstellung der Erfindung 
 



  Die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13, das Verfahren zu ihrem Konstruieren und der Stamm der Bakteriene Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13), der dieselbe enthält, sind neu und wurden in der Literatur nicht beschrieben. 



  Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine neue Rekombination-Plasmid-DNS, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, ein Verfahren zu ihrem Konstruieren und einen neuen hochproduktiven Produzenten-Stamm des menschlichen   beta 1-Interferons, der dieselbe enthält,  welches  die  Herstellung  des    beta 1-Interferons in einer hohen Ausbeute gewährleistet, zu entwickeln. 



  Die Aufgabe wurde durch die kennzeichnenden Merkmale von Anspruch 1 gelöst. 



  Erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNSpPR-IFN  beta 1-13 bewirkt die Expression des IFN  beta 1-Gens unter Kontrolle des Regulator-Bereiches PROR der  lambda -Bakteriphage. Das cITs857-Gen, das Regulator der Einleitung der Transkription von den früheren Promotoren der  lambda -Bakteriophage ist, und das IFN  beta 1-Gen, das sich unter Kontrolle des PR-Promotors befindet, sind in der Zusammensetzung eines und desselben Rekombination-Plasmids pPR-IFN  beta 1-13 angeordnet. Dieser Umstand ermöglicht es, die potentielle Instabilität beim Kultivieren eines Stammes mit einem Rekombination-DNS-Molekül zu vermeiden, weil in der von uns vorgeschlagenen Konstruktion keine recA-abhängige Rekombination infolge des Fehlens eines zusätzlichen Plasmids in dem Produzenten-Stamm entsteht. 



  Zur Erfindung gehört auch ein Verfahren zum Konstruieren einer Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13 gemäss Anspruch 2. 



  Die Anwendung des Verfahrens zum Konstruieren des Rekombination-Plasmids pPR-IFN  beta 1-13, bei dem die von den für die Matrix-RNS E.coli bekannten Koliphagen besonders lange SD-Sequenz des cro-Gens der  lambda -Bakteriophage mit dem kodierenden Teil des reifen menschlichen   beta 1-Interferons gekoppelt wird, führt zur Organisation eines Hybridabschnitts der Verknüpfung der Ribosome des IFN  beta 1-Gens mit der optimalen primären und räumlichen Struktur des 5<1>-Endbereiches der Matrix-RNS.

  Im Unterschied zum bekannten Verfahren sichert das erfindungsgemässe Verfahren zum Konstruieren auch das Vorliegen in dem 3<1>-nichttranslationsbaren Bereich des IFN  beta 1-Gens am pPR-IFN  beta 1-13-Plasmid eines Tandems der  rho -abhängigen Terminatoren der Transkription, was die Interferenz zwischen der Replikation der Plasmid-DNS und der hocheffektiven Transkription des Gens des Fibroblast-Interferons unter den Verhältnissen der Depression des PR-Promotors verhindert. 



  Ausser dem genannten gehört zur Erfindung auch ein Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13), der Produzent des menschlichen   beta 1-Interferons, der die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13 enthält und der im gentechnischen Verfahren durch Einführen der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13 in Bakterien Escherichia coli erzeugt wurde, der am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Antibiotika, UdSSR, Moskau, Nagatinskaya ulitsa, 3a, deponiert und unter Nr. 1825 registriert wurde. 



  Der erfindungsgemässe Stamm ermöglicht es, eine stabile Speicherung des menschlichen   beta 1-Interferons unter den Verhältnissen einer grosstechnischen Kultivierung zu  gewährleisten und eine Ausbeute an Endprodukt über 2 x 10<9> Einheiten/l zu erreichen, was 5 bis 10%, bezogen auf die Gesamtmenge des Zelleneiweissstoffes, entspricht. 


 Bester Weg zur Ausführung der Erfindung 
 



  Das Verfahren zum Konstruieren der erfindungsgemässen Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13 erfolgt in mehreren Etappen. 



  In der ersten Etappe erfolgt das Konstruieren eines Vektor-Plasmids pPR124 B. 



  Hierfür wird in der DNS des pPR40-Plasmids [Molekularbiologie, 1987, Band 21, Nr. 5 (Moskau), S. 1309-1321] im Bereich des Abschnitts des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II die Deletion mit Hilfe der Exonuklease Bal 31 vorgenommen. 



  Hierdurch erhält man das Plasmid pPR 100, in dem der Abschnitt des Wiedererkennens BamHI unmittelbar hinter dem Bereich der Verknüpfung der Ribosome der  lambda -Page liegt, wobei im Bereich des initiierenden AUG-Kodons folgende Sequenz entsteht: 
EMI7.1
 



  Im weiteren wird mit Hilfe der konventionellen gentechnischen Methodiken das kleinere PstI-Bam Hi-Fragment des Plasmids pPR100 mit dem grösseren PstI-Bam HI-Fragment des Plasmids pML 24 unter Entstehung des Plasmids pPR124 gekoppelt, in das man unter Zuhilfenahme eines Oligonukleotid-Linkers einen Abschnitt des Wiedererkennens der Restriktase Bgl II einführt. Man erhält das Plasmid pPR 124B. 



  Dann erfolgt das Konstruieren eines Zwischen-Plasmids pPR-IFN  beta 1-123. 



  Das konstruierte Vektor-Plasmid pPR 124B spaltet man mit Restriktionsendonukleasen Eco RI und Bgl II und man nimmt die Kopplung des grösseren der entstehenden Fragmente des Vektor-Moleküls mit EcoR I - Sau3A-Fragment vor, das den kodierenden Teil des reifen   beta 1-Interferons aus dem Plasmid pIN  beta -trp 7 enthält. Man erhält ein Zwischen-Rekombinations-Plasmid pPR-IFN  beta 1-123. 



  Dann wird die dritte Etappe ausgeführt, das Konstruieren des Plasmids pPR-IFN  beta 1-13. Hierfür wird in dem Zwischen-Plasmid pPR-IFN  beta 1-123 die Annäherung der SD-Sequenz des cro-Gens und des ersten Kodons des   beta 1-Interferons vorgenommen, wofür man die Plasmid-DNS mit der Restriktase A Bam HI hydrolysiert, einen Anteil der Nukleoide mit Hilfe der Endonuklease-Aktivität der DNS-Polymerase I E.coli entfernt, die DNS mit der Restriktase E coRI spaltet, mit der SI-Endonuklease mit anschliessender vollständiger Wiederherstellung von Zweiketten-Enden mit Hilfe des Klenowschen Fragmentes der DNS-Polymerase I E.coli behandelt und die Zyklisation der entstandenen linearen DNS-Moleküle mit der DNS-Ligase der T4-Phage bewirkt. 



   Mit dem hergestellten Präparat werden die Zellen E.coli C600 transformiert, die Transformanten werden einem Nährboden mit Ampizillin bei der Kultivierung von Zellen bei einer Temperatur von 28 DEG C mit anschliessender Selektion auf eine verringerte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C entnommen. Aus den dadurch entnommenen Klonen scheidet man die Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13 aus. 



  Der erfindungsgemässe Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903(pPR-IFN  beta 1-13) stellt man durch Transformation des Rezipienten-Stammes mit der Rekombination-Plasmid pPR-IFN  beta 1-13 und darauffolgende Entnahme der Rekombination-Klone dem Nährboden mit Ampizillin bei einer Temperatur von 28 DEG C und durch Ermittlung der Aktivität des Fibroblast- beta 1-Interferons in Extrakten der Transormanten-Zellen nach der Depression des PR-Promotors, die durch Kultivierung des Stammes innerhalb von 1 bis 2 h bei einer Temperatur von 42 DEG C erreicht wird, her. Als Rezipient können auch Stämme E.coli C600 und andere Derivate von E.coli K12 eingesetzt werden. 



  Der Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-INF  beta 1-13) wird durch folgende Merkmale gekennzeichnet. 



  Morphologische Merkmale. Zellen sind gerade, stäb chenförmig (1,2-1,6) x (2,0-6,0)  mu m, schwachbeweglich, fähig zur Bildung fadenartiger Formen, grammnegativ und nicht sporentragend. 



  Kulturmerkmale. Zellen wachsen gut an dichten und flüssigen, einfachen, synthetischen, halbsynthetischen und komplexen Nährböden. Beim Wachstum an einem agarisierten Hottinger-Bouillon beziehungsweise am L-Bouillon bilden diese Zellen verschleimte, runde, schwachmattierte Kolonien. Bei der Züchtung an flüssigen Nährböden vom L-Bouillon-Typ oder M9 mit Kasamin-Säure bilden sie eine homogene Suspension. 



  Physiologisch-biochemische Merkmale. Zellen sind fähig zum Wachstum in einem Temperaturenbereich von 5 bis 40 DEG C (Optimum liegt bei 35 DEG C) bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,5. Als Kohlenstoffquelle verwendet man Aminosäuren und Kohlenhydrate (beispielsweise Saccharose). Als Stickstoffquelle können Mineralsalze in Ammoniumform sowie organische Verbindungen in Form von Pepton, Trypton, Hefeextrakt und Aminosäuren dienen. 



  Resistenz gegenüber Antibiotika. Der Stamm ist resistent gegen Ampizillin in einer Konzentration von höchstens 100 mg/l bei der Züchtung in flüssigen und in agarisierten Nährböden. 



  Stabilität des Plasmids. Bei der Zellenlagerung am agarisierten Nährboden (während einer Dauer bis zu 1 Monat), bei einer Reihe von hintereinander folgenden Überimpfungen (innerhalb von mindestens 6 Monaten) und bei der Kultivierung im Submersverfahren in einem flüssigen Nährboden mit einem Antibiotikum ist kein Verlust zu verzeichnen und es erfolgt keine Umwandlung des Plasmids. 



  Der hergestellte Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13) ist ein hocheffektiver Produzent des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons und kann für die grosstechnische Produktion von   beta 1-Interferon verwendet werden. 



  Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen der Durchführung eines Verfahrens zum Konstruieren des erfindungsgemässen Plasmids, eines Verfahrens zur  Herstellung des Stammes und seiner Kultivierung erläutert und durch folgende Figuren veranschaulicht, in denen es zeigen: 
 
   Fig. 1 physikalisch-genetische Karte des Rekombination-Plasmids pPR-IFN  beta 1-13; 
   Fig. 2 Schema der Herstellung des erfindungsgemässen Plasmids pPR-IFN  beta 1-13. 
 


 Beispiel 1 
 



  Rekombination-Plasmid pPR-IFN  beta 1-13 (Fig. 1) stellt man in mehreren Etappen her. Erste Etappe - Konstruieren des Vektor-Plasmids pPR 124 B. 



  Hierfür wird das Plasmid pPR 124 wie folgt konstruiert: 3   mu g DNS des Plasmids pPR 40 spaltet man mit der Restriktase Bgl II in 60  mu l Pufferlösung für Restriktion-1, die 10 mMol tris-HCl pH-Wert 8,0 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl enthält. Die DNS wird mit zwei Äthanol-Volumina umgefällt. Den Niederschlag löst man in 20  mu l H2O auf. Die Behandlung der DNS mit der Exonuklease Bal 31 führt man innerhalb von 3 min bei einer Temperatur von 30 DEG C in 30  mu l Pufferlösung durch, die 3 mMol NaCl, 60 mMol CaCl2, 60 mMol MgCl2, 100 mMol tris-HCl pH-Wert 8,0, 5 mMol Äthylendiamintetraessigsäure enthält. Die DNS wird mit zwei Volumina Äthanol umgefällt. Den Niederschlag löst man in 10  mu l H2O auf. Die Behandlung mit Restriktase Bam HI führt man in einer Probe mit einem Volumen von 30  mu l durch, die die genannte Pufferlösung für die Restriktion-1 enthält.

  Die Nachbildung der Einketten-3 min -Endabschnitte der DNS führt man mittels Bearbeitung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit einem Volumen von 20  mu l durch, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mMol MgCl2, 2  mu g eines DNS-Präparates, je 30  mu Mol jedes der Desoxyribonukleosidtriphosphate und 5 Einheiten eines Fermenten enthält. Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100  mu l H2O aufgelöst. Die Vereinigung der linearisierten Plasmid-DNS führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C innerhalb von 12 h mit  Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung [60 mMol tris-HCl (pH-Wert von 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol, 0,4 mMol Adenosintriphosphat] und 1  mu g DNS enthält. Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert. 



  Die Effektivität der Transformation beträgt bis 5.10<6> Kolonien je 1  mu g des nativen Plasmids pPR40. Man wählt Klone aus, die gegen Ampizillin (100  mu g/l) resistent sind, aus ihnen scheidet man die Plasmid-DNS nach der modifizierten Birboim-Methode und Doly-Methode aus und verwendet man für die Restriktionsanalyse. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR100, das einen unikalen Abschnitt der Spaltung von BamHI aufweist. Danach führt man das Konstruieren des Plasmids pPR124 durch. 



  Hierfür werden 2  mu g DNS des Plasmids pML24 zusammen mit den Restriktasen BamHI und PstI in 40  mu l Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet. Man vereinigt diese mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage bei 0 DEG C mit den Fragmenten, die bei der Hydrolyse der DNS des Plasmids pPR100 mit den Restriktasen Bam HI und PstI erzeugt wurden. Mit dem hergestellten DNS-Präparat transformiert man die Zellen E.coli C600 mit Auswahl der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin mit anschliessender Selektion von Cm<r>-Klonen auf einem Nährboden mit 300  mu g/l Chloramphenikol bei der Kultivierung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C. Aus den dadurch ausgewählten Klonen wird die Plasmid-DNS ausgeschieden und mit Hilfe der Restriktionsanalyse untersucht. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR 124, das einen unikalen Abschnitt der Spaltung mit der Restriktase BamHI enthält.

   Dann werden 3  mu g DNK des Plasmids pPR 124 mit Restriktase Xbal in 70  mu l Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,9), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol und 150 mMol NaCl enthält. Die DNS wird mit zwei Volumina des Äthanols umgefällt. Der Niederschlag wird in 15  mu l H2O aufgelöst. Die Nachbildung der Einketten-3<1>-Endabschnitte der DNS  führt man durch Behandlung mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli in einer Probe mit einem Volumen von 20  mu l durch, die 10 mMol tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mMol MgCl2, 2  mu g DNS-Präparat, je 30  mu Mol Desoxyribonukleosidtriphosphate und 5 Einheiten eines Fermenten enthält.

  Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt und in 100  mu l H2O aufgelöst.  Die Wiedervereinigung der linearisierten Plasmid-DNS mit Bgl II-Linkern führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C innerhalb von 12 h mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe durch, die eine Pufferlösung für Ligierung 60 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol 2-Merkaptoäthanol, und 0,4 mMol Adenosintriphosphat, 2  mu g Plasmid-DNS und 0,5  mu g Linker enthält. 



  Nach der Durchführung der Ligierung wird die DNS aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol gefällt, aufgelöst und der fermentativen Hydrolyse mit der Restriktase Bgl II in einer Probe mit einem Volumen von 40  mu l ausgesetzt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 [60 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,6), 6 mMol MgCl2, 6 mMol 2-Merkaptoäthanol, 50 mMol MaCl] enthält. Die DNS wird erneut mit Äthanol umgefällt, aufgelöst und man bewirkt die Zyklisierung der DNS-Moleküle, wofür man 1  mu g Präparat der Plasmid-DNS in 240  mu l einer Pufferlösung für Ligierung mit der DNS-Ligase der T4-Phage behandelt. Mit dem hergestellten Gemisch werden die Zellen E.coli C600 transformiert. Die Effektivität der Transformation beträgt 5.10<6> Kolonien, je 1  mu g des nativen Plasmids pPr 124.

  Man wählt Klone aus, die resistent gegen Ampizillin (100  mu g/l) sind, aus ihnen wird die Plasmid-DNS nach der modifizierten Birnboim- und Doly-Methode ausgeschieden und sie wird für die Restriktionsanalyse verwendet. Im Ergebnis erhält man das Plasmid pPR 124B, das im Unterschied zum Vektor-Ausgangsmolekül pPR 124 einen unikalen Abschnitt für die Spaltung von Bgl II anstelle der vorhandenen Sequenz des Wiedererkennens XbaI (Fig. 2) enthält. 



  Zweite Etappe - Konstruieren eines Zwischen-Plasmids pPR-IFN  beta 1-123. In die Zusammensetzung des Vektors  pPR124B integriert man eine kodierende Sequenz des menschlichen Fibroblast-Interferons aus dem Plasmid pIN  beta -trp 7. Hierfür werden 10 mg DNS pIN  beta -trp 7 zusammen mit den Restriktasen EcoRI und Sau beta A in einer Probe mit einem Volumen von 100  mu l gehandelt, die eine Pufferlösung für Restriktion-2 enthält. Das hergestellte Präparat wird auf ein Gel aus 1,1%iger leichtschmelzender Agarose aufgetragen und der Elektrophorese in einem tris-Azetat-Puffersystem ausgesetzt. Ein Streifen des Gels, der ein DNS-Fragment mit einer Länge von 510 Basenpaaren enthält, schneidet man aus und die DNS aus dem Gel eluiert. Das dadurch hergestellte DNS-Fragment ( &tilde& 1  mu g) integriert man in das Plasmid pPR124B.

  Hierfür wird 1  mu g DNS pPR124B mit den Restriktasen E.coRI und Bgl II in einer Probe mit einem Volumen von 20  mu l in einer Pufferlösung für Restriktion-2 gespaltet. Das hergestellte Präparat setzt man der Phenol-Deproteinisierung aus, die DNS fällt man mit Äthanol aus und löst man in 10  mu l H2O auf. 0,5  mu g DNS des gespalteten Plasmids pPR124B vereinigt man mit 1  mu g des ausgeschiedenen Fragmentes des Plasmids pIN  beta -trp 7 und behandelt man mit der DNS-Ligase der T4-Phage in einer Probe mit einem Volumen von 30  mu l in einer Pufferlösung für Ligierung. Mit dem hergestellten Präparat DNS führt man die Transformation der Zellen E.coli C600 mit der Auswahl der Transformanten auf einem Nährboden mit Ampizillin mit anschliessender Selektion der Cm<s>-Klone auf einem Nährboden mit 200  mu g/l Chloramphenikol bei der Züchtung der Zellen bei einer Temperatur von 42 DEG C durch.

  Aus den dadurch ausgewählten Klonen wird die Plasmid-DNS ausgeschieden und mit Hilfe der Restriktionsanalyse geprüft. In dem hergestellten Plasmid EcoRI -Bgl II ist das Fragment, das den C-Endabschnitt der Chloramphenikolazetyltransferase in der Zusammensetzung des Vektors pPR124B kodiert, durch eine kodierende Sequenz eines reifen menschlichen   beta 1-Interferons substituiert. Dieses Plasmid wird durch pPR-IFN  beta 1-123 bezeichnet und in der nächsten Stufe des Konstruierens verwendet. 



  Dritte Etappe - Konstruieren des Plasmids pPR-IFN  beta 1-13. 



  30  mu g DNS des Plasmids pPR-IFN  beta 1-123 spaltet man mit der Restriktase BamHI in 150  mu l einer Pufferlösung für Restriktion-1, die DNS setzt man der Phenol-Deproteinisierung aus und fällt man mit Äthanol aus. Den Niederschlag löst man in 40  mu l H2O auf. Zwecks einer beschränkten Degradation der DNS mit Hilfe von 3<1> -> 5<1>-Exonuklease-Aktivität der DNS-Polymerase I E.coli wird das hergestellte DNS-Präparat in einer Probe mit einem Volumen von 150  mu l inkubiert, die 50 mMol tris-HCl (pH-Wert 8,0), 10 mMol Äthylendiamintetraessigsäure, 5 mMol MgCl2, 100  mu Mol Desoxyadenosintriphosphat (und dann Desoxyguanosinphosphat) und 20 Einheiten der DNS-Polymerase enthält.

  Die Reaktion wird zum Stillstand gebracht, man führt das Umfällen der DNS durch und den Niederschlag löst man erneut in 40  mu l H2O auf. 10  mu g des erzeugten Präparates behandelt man mit der Restriktase EcoRI in 50  mu l einer Pufferlösung für Restriktion-2, man führt die Phenol-Deproteinisierung und die Ausfällung der DNS mit Äthanol durch und den Niederschlag löst man in 30  mu l H2O auf. 



  Die Entfernung der Einfaden-Abschnitte des hergestellten DNS-Präparates führt man mit Hilfe der Endonuklease SI in einer Probe mit einem Volumen von 100  mu l durch, die 30 mMol CH3COONa (pH-Wert 4,4), 4,5 mMol ZnSO4, 250 mMol NaCl, 10  mu g DNS und 200 Einheiten SI-Endonuklease enthält. Die Reaktion führt man bei einer Temperatur von 20 DEG C durch, wonach man das Gemisch der Phenolbehandlung aussetzt und der Umfällung der Nukleinsäure mit Äthanol aussetzt. Den Niederschlag löst man in 20  mu l H2O auf. 4  mu g des auf diese Weise erzeugten DNS-Präparates behandelt man mit dem Klenowschen Fragment der DNS-Polymerase I E.coli unter den oben beschriebenen Verhältnissen zwecks Nachbildung der eventuell vorhandenen Einketten-Enden der Moleküle bis zu den Zweiketten-Enden.

   Die Reaktion wird mit Hilfe der Deproteinisierung zum Stillstand gebracht, die Nukleinsäuren werden mit Äthanol ausgefällt und in 20  mu l H2O aufgelöst. 



  Die Legierung der linearen DNS-Moleküle mit Zweiketten-Enden führt man bei einer Temperatur von 16 DEG C in  einer Probe mit einem Volumen von 50  mu l durch, die 60 mMol tris-HCl (pH-Wert 7,6), 10 mMol MgCl2, 10 mMol Dithiothreitol, 4 mMol Adenosintriphosphat, 8 Masse-% Polyäthylenglykol-6000, 4  mu g DNS und 100 Einheiten DNS-Ligase der T4-Phage enthält. Nach der Beendigung der Reaktion wird die Probe vierfach verdünnt und man führt die Ausfällung der Nukleinsäuren mit Äthanol, 2  mu g der in H2O aufgelösten DNS behandelt man mit der Restriktase Bgl II in 30  mu l einer Pufferlösung für Restriktion-2, die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol ausgefällt, in Wasser aufgelöst und mit der DNS-Ligase der T4-Phage in 20  mu l einer Pufferlösung für Ligierung behandelt.

  Das hergestellte DNS-Präparat verwendet man für die Transformation der Zellen E.coli C600, wie oben beschrieben, mit anschliessender Selektion der Transformanten an einem Nährboden mit Ampizillin bei der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C. Aus den erzeugten Transformanten wählt man die Varianten aus, die eine verringerte Wachstumsfähigkeit bei der Temperatur von 42 DEG C besitzen. Aus den genannten Klonen wird die Plasmid-DNS, wie oben beschrieben, ausgeschieden und der Restriktionsanalyse ausgesetzt. 



  Für die Ermittlung der primären Struktur des Hybridabschnittes der Verknüpfng der Ribosome vor dem Gen IFN  beta 1 in dem auf solche Weise erzeugten Plasmid pPR-IFN  beta 1-13 werden 30  mu g einer entsprechenden DNS mit der Restriktase Hind II in 100  mu l einer Pufferlösung für Restriktion-2 behandelt, das Präparat wird auf das Gradienten- (von 4 bis 12%) Polyakrylamidgel aufgetragen und der Elektrophorese in einem tris-Azetat-Puffersystem ausgesetzt. Das DNS-Fragment mit einer Länge von 190 Basenpaaren eluiert man nach der Maxam-Hilbert-Methode, es werden mit Hilfe der DNS-Ligase der T4-Phage die BamHI-Linker an dasselbe analog dem obenbeschriebenen Verfahren der Anlagerung der Bgl II-Linker an das linearisierte Plasmid pPR124 gebunden.

  Die DNS wird aus dem Reaktionsgemisch mit Äthanol umgefällt, der Niederschlag in 20  mu l H2O aufgelöst und mit Restriktase BamHI in 30  mu l  einer Pufferlösung für Restriktion-1 gespaltet, die DNS wird der Phenol-Deproteinisierung ausgesetzt, erneut mit Äthanol ausgefällt und in H2O aufgelöst. 



  Die Molekular-Klonung des bei der Spaltung der BamHI des DNS-Fragmentes in der Zusammensetzung der replikativen Form der DNS der Bakteriophage M13mp 10, die Selektion der Rekombination-Phage an einem Indikator-Nährboden,  der 5<1>-Brom-4-chlor-3 min -indolyl- beta -D-galaktosid enthält, die Ausscheidung der Einketten-Phagen-DNS und die Ermittlung der primären Struktur des geklonten Fragmentes mit Hilfe der Methode eines beschränkten Matrix-Kopierens (F.Senger-Methode) erfolgen in Übereinstimmung mit den Standard-Methoden. Die in der Senger-Methode festgelegte Nukleotid-Sequenz des Hybrid-Abschnitts der Verknüpfung der Ribosomen in der Zusammensetzung des Plasmids pPR-IFN  beta 1-13 ist wie folgt:
 5<1>-...TAAGGAGGTTGGATG...-3<1>, worin TAAGGAGGT die SD-Sequenz des cro-Gens der Phage  lambda  und ATG des Methionin-Koden des   beta 1-Interferons ist. 


 Beispiel 2 
 



  Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13)-Produzent des menschlichen Fibroblast-  beta 1-Interferons wird wie folgt erzeugt. 



  Das Plasmid pPR-IFN  beta 1-13, das die Synthese des menschlichen Fibroblast-Interferons kodiert, wird mittels Transformation, wie in Beispiel 1 beschrieben, in die Zellen des Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 eingeführt (der in der Allunionskollektion der industriemässigen Mikroorganismen des Allunions-Forschungsinstitutes für Genetik und Selektion industriemässiger Organismen deponiert und unter Nr. BKIIM B-3546 registriert wurde). 



  Die Effektivität der Transformation der Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 beträgt etwa 10<6> Klone je 1  mu g der nativen DNS des Plasmids pPR-IFN  beta 1-13. Die Transformanten entnimmt man an einem Nährboden, der Ampizillin (100  mu g/l) nach der Kultivierung der Zellen innerhalb von 24 h bei einer Temperatur von 28 DEG C enthält. Aus den ausgewählten Klonen scheidet man die  Plasmid-DNS und weist man ihre Identität mit dem DNS-Präparat pPR-IFN  beta 1-13 mit Hilfe der Restriktionsanalyse nach. Man erhält den Stamm E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13). 



  Zur Ermittlung der Produktivität des Stammes E. coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13) werden die plasmidhaltigen Zellen bei einer Temperatur von 28 DEG C an einem abgeschrägten agarisierten Standard-Hottinger-Nährboden, der 50  mu g/ml Ampizillin enthält, innerhalb von 14 h gezüchtet. Die an Abschrägungen gewachsene Biomasse verwendet man für die Erzeugung von Inokulums. Hierfür werden die Zellen in die Erlenmeyerkolben mit einem Volumen von 750 ml mit 100 ml Hottinger-Nährboden, mit 100  mu g/ml Ampizillin übertragen und bei einer Temperatur von 28 DEG C in einer Schüttelvorrichtung bei 240 U/min innerhalb von 6 h gezüchtet. Die optische Dichte des Inokulums beträgt von 1,5 bis 2,5 Einheiten. 



  Die Fermentierung führt man in einem Fermentator, der mit Systemen für die Regulierung des pH-Wertes, der Temperatur, der Geschwindigkeit der Vermischung und Aeration versehen ist, durch. Für die Fermentierung verwendet man den Hottinger-Nährboden mit 100  mu g/ml Ampizillin und 10  mu g/l Glykose. Das Inokulum bringt man in einer Menge von 5 bis 10 Masse-% ein. Die Kultivierung erfolgt bei einem pH-Wert von 6,6 bis 6,8 und dieser Stand wird mittels Zuführung von Ammoniakwasser unterhalten. Der erste Teil der Fermentierung führt man bei einer Temperatur von 28 DEG C bis zur Erzielung einer optischen Dichte gleich 3,5 bei 550 Nm durch und dann erfolgt die Thermoinduktion durch die Temperatursteigerung auf 42 bis 45 DEG C innerhalb von 5 min, wonach man die Fermentierung weitere 2 h bei derselben Temperatur fortsetzt. 



   Nach der Beendigung der Prozessführung werden die Interferon-Zellen zwecks Ermittlung der Aktivität aus 1 ml Kulturflüssigkeit mittels Zentrifugierens ausgefällt, der Niederschlag wird in 1 ml 1%iger Lösung des Natriumdodezylsulfats in 0,02 Mol Phosphat-Pufferlösung mit einem pH-Wert von 7,2 resuspendiert, die 1% 2-Mer kaptoäthanol enthält, und 2 bis 4 min bei einer Temperatur von 100 DEG C durchgewärmt. Danach wird der Niederschlag durch Zentrifugieren beseitigt und die Aktivität des Interferons, der im Überlauf enthalten ist, wird mit Standardmethoden beziehungsweise nach dem Schutz von Diploid-Fibroblaste des Menschen vor der zytopatischen Wirkung des Virus der vesikulären Stomatitis oder mit der Methode der Immun-Fermenten-Analyse ermittelt.

  Als Standards verwendet man Präparate des  beta -Interferons ("Torey", Japan), die gemäss dem Standard des Leukozyten-Interferons B 69/19 (Grossbritannien) titriert wurden. 



  Gemäss den unterschiedlichen Methoden der Ermittlung beträgt die Aktivität des menschlichen Fibroblast-Interferons, der in den Zellen des Stammes E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13) synthetisiert wird, über 2.10<9> internationaler Einheiten"1 Bakterienkultur. 



  Zur Ermittlung des Anteils des synthetisierten Fibroblast-Interferons am gesamten Zelleneiweiss werden die Zellen aus 1 ml Kulturflüssigkeit durch Zentrifugieren ausgefällt und, wie oben beschrieben, behandelt, das Präparat wird mittels Elektrophorese in Gegenwart von 1,0%igem Natriumdodezylsulfat in 15%igem Polyakrylamidgel getrennt und in der Kumassi-Lösung R-250 "Serva" (BRD) nach einer Standard-Methodik durchgefärbt. Der quantitative Gehalt an Eiweissstoffen in den Zonen ermittelt man nach dem Abtasten in einem automatischen Laser-Densitometer.

  Die Identifizierung der Zone, die dem in den Zellen synthetisierten reifen Fibroblast-Interferon (19kD) entspricht, erfolgt aufgrund des Vergleichs mit der elektrophoretischen Beweglichkeit von Marker-Proteinen sowie mit Hilfe des Immunoblotings geteilter Eiweissfraktionen in Nitrozellulose-Filter und der Identifizierung der Zone des Interferons durch Bearbeitung der Filter in Lösungen, die monoklonale Antikörper der Mäuse gegen den  beta -Interferon und Antimäuse-Kaninchen-Antikörper, enthalten, die mit der Peroxydase aus dem Meerrettich konjugiert sind. Nach dem entsprechen den Arbeitsgang der Färbung sieht die Zone des Interferons als ein dunkler Streifen von braunem Farbton auf dem nichtgefärbten Hintergrund eines Nitrozellulose-Filters aus. 



   Der Gehalt an Eiweiss in der Zone, die dem   beta 1-Interferon entspricht, beträgt etwa 10%, bezogen auf die Gesamt-Eiweissmenge der plasmidhaltigen Zellen E.coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13). 


 Gewerbliche Verwertbarkeit 
 



  Die erfindungsgemässe Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN  beta 1-13, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, findet Anwendung für die Erzeugung der Produzenten-Stämme des menschlichen   beta 1-Interferons mit einer hohen Aktivität. 



  Der erfindungsgemässe Stamm der Bakterien Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN  beta 1-13)-Produzent des menschlichen Interferons findet Anwendung in der mikrobiologischen und medizinischen Industrie für die Herstellung von menschlichem   beta 1-Interferon, der in der medizinischen Praxis angewendet werden.

Claims

1. Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Grösse von 3,9 kb aufweist und sich aus folgenden Elementen zusammensetzt: - einen BamHI - Bgl II-Fragment mit einer Grösse von 3,4 kb des Vektor-Plasmids pPR124B mit der Restriktionskarte nach Fig. 2; - einem EcoRI -Sau3A-Fragment des Plasmids pIN beta -trp 7 mit einer Grösse von 510 Basenpaaren und durch folgende Merkmale charakterisiert wird:

: - sie enthält einen Abschnitt, der für die Einleitung der Replikation und ihre Regulierung, Col EI-Replikon, verantwortlich ist, ein Gen des Repressors cIts 857 der Phage lambda , ein Gen der Resistenz gegen Ampizillin Ap<r>, ein Tandem von rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription der fd-Phage, einen Regulator-Bereich PROR und eine SD-Sequenz, des lambda cro-Gens, die die Sequenz des reifen menschlichen IFN beta 1-Fibroblast-Interferons mit eigenem Methionin-Kodon kodiert; - die Lage des Regulator-Bereiches des cro-Gens, des kodierenden Teils des IFN beta 1-Interferons und der Terminatoren der Transkription fd-Phage ist derart, dass vor dem IFN beta 1-Gen ein Hybridabschnitt der Verknüpfung von Ribosomen vorliegt, der folgende Nukleotid-Sequenz aufweist:

5<1>-...TAAGGAGGTTGGATG...3<1>, worin TAAGGAGGT die SD-Sequenz des cro-Gens der Phage lambda , ATG des Methionin-Kodon des Interferons ist, und unmittelbar hinter dem terminierenden Kodon des IFN beta 1-Gens liegt ein Tandem der rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription der fd-Phage; - sie enthält einzelne Abschnitte der Wiedererkennung der Restriktasen C l aI, wobei die Koordinate den Beginn der Ablesung (o), Pvu II ( &tilde& 1110), Bgl II ( &tilde& 1480), AccI ( &tilde& 1870), Pvu I ( &tilde& 3360) darstellt; sie ist am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Antibiotika in E.coli deponiert und unter Nr. VNIIA 1825 registriert.

2.

Verfahren zum Konstruieren der Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man das Vektor-Plasmid pPR124B mit Restriktionsendonukleasen EcoRI und Bgl II spaltet und die Kopplung des grösseren der entstehenden Fragmente des Vektor-Moleküls mit dem EcoRI-Sau3A-Fragment des Plasmids pIN beta -trp 7, das den kodierenden Teil des reifen beta 1-Interferons enthält, vornimmt, in dem dadurch erzeugten Rekombination-Plasmid pPR-IFN beta 1-123 man die Annäherung der SD-Sequenz des cro-Gens und des ersten (Methionin)-Kodons des beta 1-Interferons durchführt, wofür man die Plasmid-DNS mit der Restriktase BamHI hydrolysiert, ein Teil der Nukleotide mit Hilfe der Exonuklease-Aktivität der DNS-Polymerase I E.coli entfernt,

man die DNS mit der Restriktase EcoRI fermentativ spaltet und zwecks Entfernung von Einketten-Ab schnitten der DNS mit der SI-Endonuklease behandelt, dann man die Zweiketten-Enden mit Hilfe des Klenowschen Fragmentes der DNS-Polymerase I E.coli wiederherstellt und die entstehenden linearen DNS-Moleküle mit der DNS-Ligase der Phage T4 zyklisiert, man mit dem erzeugten Präparat die Zellen E.coli C600 transformiert, die Transformanten auf einem Nährboden mit Ampizillin bei einer Temperatur von 28 DEG C kultiviert und anschliessend die Klone, die eine herabgesetzte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C besitzen, selektioniert, wonach man aus den ausgewählten Klonen die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 ausscheidet.

3.

Stamm von Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) als Produzent des menschlichen beta 1-Interferons, der die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 nach Anspruch 1 enthält und am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Antibiotika deponiert und unter Nr. VNIIA 1825 registriert ist. 1. Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13, die die Synthese des menschlichen Fibroblast- beta 1-Interferons kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Grösse von 3,9 kb aufweist und sich aus folgenden Elementen zusammensetzt: - einen BamHI - Bgl II-Fragment mit einer Grösse von 3,4 kb des Vektor-Plasmids pPR124B mit der Restriktionskarte nach Fig. 2; - einem EcoRI -Sau3A-Fragment des Plasmids pIN beta -trp 7 mit einer Grösse von 510 Basenpaaren und durch folgende Merkmale charakterisiert wird:

5<1>-...TAAGGAGGTTGGATG...3<1>, worin TAAGGAGGT die SD-Sequenz des cro-Gens der Phage lambda , ATG des Methionin-Kodon des Interferons ist, und unmittelbar hinter dem terminierenden Kodon des IFN beta 1-Gens liegt ein Tandem der rho -unabhängigen Terminatoren der Transkription der fd-Phage; - sie enthält einzelne Abschnitte der Wiedererkennung der Restriktasen C l aI, wobei die Koordinate den Beginn der Ablesung (o), Pvu II ( &tilde& 1110), Bgl II ( &tilde& 1480), AccI ( &tilde& 1870), Pvu I ( &tilde& 3360) darstellt; sie ist am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Antibiotika in E.coli deponiert und unter Nr. VNIIA 1825 registriert. 2.

man die DNS mit der Restriktase EcoRI fermentativ spaltet und zwecks Entfernung von Einketten-Ab schnitten der DNS mit der SI-Endonuklease behandelt, dann man die Zweiketten-Enden mit Hilfe des Klenowschen Fragmentes der DNS-Polymerase I E.coli wiederherstellt und die entstehenden linearen DNS-Moleküle mit der DNS-Ligase der Phage T4 zyklisiert, man mit dem erzeugten Präparat die Zellen E.coli C600 transformiert, die Transformanten auf einem Nährboden mit Ampizillin bei einer Temperatur von 28 DEG C kultiviert und anschliessend die Klone, die eine herabgesetzte Wachstumsgeschwindigkeit bei einer Temperatur von 42 DEG C besitzen, selektioniert, wonach man aus den ausgewählten Klonen die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 ausscheidet. 3.

Stamm von Escherichia coli VNIIGENETIKA VL 903 (pPR-IFN beta 1-13) als Produzent des menschlichen beta 1-Interferons, der die Rekombination-Plasmid-DNS pPR-IFN beta 1-13 nach Anspruch 1 enthält und am 12.01.1987 in der Kollektion der Kulturen der Mikroorganismen des Unions-Forschungsinstitutes für Antibiotika deponiert und unter Nr. VNIIA 1825 registriert ist.