DD260287A1 - Verfahren zur herstellung von actinomyces-staemmen mit im genetischen material stabil inserierten heterologen dns-abschnitten - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von neuen Actinomyces-Staemmen mit im genetischen Material stabil inserierten heterologen DNS-Abschnitten. Sie verfolgt das Ziel, derartige Staemme auf mikrobiologischem Wege bereitzustellen. Die diesem Ziel zugeordnete Aufgabe wird geloest, indem Zellen des gewaehlten plasmidfreien Ausgangsstammes, vorzugsweise eines plasmidfreien Streptomyces-Stammes, nacheinander- einer 1. Chemostaten-Kultivierung,- einer Transformation mit einem Plasmid, das u. a. einen heterologen DNS-Abschnitt in Kombination mit einem Resistenzmarker traegt, sowie- einer 2. Chemostaten-Kultivierung unter Selektionsdruckunterworfen werden. In einer speziellen Ausfuehrungsform der erfinderischen Loesung werden insbesondere die S. lividans-Staemme TK24TC41-78 und TK24TC41-92 erhalten.

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung, Charakterisierung und Bereitstellung von neuartigen Actinomyces-Stämmen, vorzugsweise Streptomyces-Stämmen, die einen jeweils in ihr genetisches Material inserierten heterologen DNS-Abschnitt stabil vererben.

Die Erfindung bietet Nutzungsmöglichkeiten zunächst in der Gentechnologie sowie auf anderen Gebieten von Molekularbiologie und -genetik und nachgelagert in der biotechnologischen sowie pharmazeutisch-chemischen Industrie, deren Produkte ihrerseits in vielen Bereichen der Industrie, der Human- und der Veterinärmedizin verwendet werden.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Für die industrielle Erzeugung von Wirkstoffen werden in ständig zunehmendem Maße gentechnisch veränderte Mikroorganismen verwendet, weil auf diese Weise eine Massenproduktion von bisher schwer zugänglichen und/oder neuartigen Proteinen durchführbar ist.

Zu diesem Zweck werden DNS-Abschnitte, auf denen die genetische Information für das gewünschte Protein kodiert ist, aus Prokaryoten und/oder Eukaryoten isoliert und in mikrobiellen Wirten — insbesondere in E.coli, aber auch in Streptomyceten — kliniert und exprimiert (siehe etwa E.-LWinnacker, Gene und Klone, Verlag Chemie, Weinheim, 1984). Dies geschieht in der Regel durch Kopplung des Strukturgen-tragenden DNS-Abschnittes an ein Expressionssignal, das vom Transkriptions- sowie Translationsapparat des jeweiligen Produktionsstammes erkannt wird und welches auf einem Vektorplasmid lokalisiert ist, das aus Gründen der Selektierbarkeit weiterhin mindestens noch eine Antibiotika-Resistenzdeterminate trägt. Durch Zugabe des' diesbezüglichen Antibiotikums zum Kultivierungsmedium wird bei diesem Vorgehen verhindert, daß solche Mikroorganismenzellen, die das Trägerplasmid verloren haben,— ein derartiger Prozeß findet in einer Mikroorganismenpopulation während ihrer Kultivierung ohne Zusatz von Antibiotika stets mit mehr oder weniger großer Häufigkeit statt — die Plasmid-tragenden Zellen aus der Population verdrängen.

In der Patentschrift DD 159348 wird nun in diesem Zusammenhang ein Verfahren vorgestellt, dessen Prinzip darin besteht, daß ein Plasmid-haltiger E.coli-Stamm kontinuierlich in einem Chemostaten unter solchen Bedingungen kultiviert wird (Ammonium-Limitation, Kultivierungstemperatur 37"C, Verdünnungsrate D = 0,15/Std.), die gewährleisten, daß in der Population die Plasmid-tragenden Zellen mit einer Wahrscheinlichkeit von wenigstens 99% enthalten sind. Dieses Verfahren weist jedoch den Nachteil auf, daß lediglich auf das Vorhandensein des Trägerplasmids, nicht aber auf den in diesen Träger inserierten (und die genetische Information für das gewünschte Protein enthaltenden) DNS-Abschnitt, der erfahrungsgemäß vom Wirtsorganismus häufig abgestoßen wird, selektiert wird.

Bekannt ist weiterhin die Patentschrift DD 240565, in der ein Verfahren zur kontinuierlichen Kultivierung von Streptomyces-Stämmen beschrieben wird und in dem auf den Verlust der ursprünglich im jeweiligen Stamm kodierten Antibiotika-Resistenzdeterminante selektiert wird. Auch dieses Verfahren hat den Nachteil, daß in ihm keine Prüfung auf die stabile Vererbung eines mittels gentechnologischer-Methodik in das genetische Material des herangezogenen Mikroorganismenstammes inserierten DNS-Abschnittes erfolgt.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung verfolgt das Ziel, neue Actinomyces-Stämme herzustellen, die einen in ihr genetisches Material inserierten heterologen DNS-Abschnitt stabil zu vererben vermögen.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein einfach handhabbares mikrobiologisch-populationsgenetisches Verfahren für die gezielte Herstellung solcher Actinomyces-Stämme zu beschreiben, die einen in ihr genetisches Material inserierten heterologen DNS-Abschnitt stabil zu vererben vermögen.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe in ihrem Grundzug wie folgt gelöst:

Unter Verwendung der allgemeinen Methode der kontinuierlichen Submerskultivierung werden Zellen des als Empfänger (und damit des für den Erwerb der Potenz zur stabilen Vererbung heterologer DNS-Abschnitte) ausgewählte plasmidfreien Actinomyces-Ausgangsstammes im ersten Schritt des Verfahrens einer Chemostaten-Kultivierung unter Stickstoff-Limitierung unterworfen. Diese Chemostaten-Kultivierung I wird unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium durchgeführt, welches neben assimilierbaren Salzen wenigstens eine organische Kohlenstoff-Quelle sowie eine das Wachstum limitierende Stickstoff-Quelle enthält.

Zellen der in der mehrwöchigen Chemostaten-Kultivierung I anfallenden genetisch homogenen Bakterien population werden im nächsten Verfahrensschritt mit einem in Actinomyces-Stämmen replizierenden Plasmid transformiert, welches einen wenigstens eine Expressions-Sekretions-Einheit enthaltenden heterologen DNS-Abschnitt in Leserahmen-gerechter Kombination zum Strukturgen eines Antibiotika-Resistenzmarkers trägt.

Im dritten Schritt des Verfahrens werden Zellen der Transformanten-Kultur einer zweiten, insgesamt gleichfalls mehrwöchigen Chemostaten-Kultivierung unterzogen, in der neben einer erneuten Stickstoff-Limitierung nunmehr auch ein Selektionsdruck (realisiert durch Beigabe jenes Antibiotikums, für welches die herangezogenen Zellen durch die Transformation eine Resistenzdeterminante erworben haben) ausgeübt wird. Aus der Chemostaten-Kultur Il werden abschließend jene Actinomyces-Zellen, die eine signifikant stabilisierte Resistenz gegen das beigefügte Antibiotikum erworben haben, in an sich bekannter Weise isoliert.

In weiterer Ausgestaltung dieses Grundzuges des Verfahrens wird als plasmidfreier Actinomyces-Ausgangsstamm ein Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, vorzugsweise ein Stamm der Art S. lividans, für die Chemostaten-Kultivierung I bereitgestellt. Der gewählte Streptomyces-Stamm wird hierbei in einem Kulturmedium, welches Glucose als Kohlenstoff- sowie Ammoniumchlorid als limitierende Stickstoff-Quelle enthält, bei Temperaturen von 25⁰C bis 39⁰C aerob gezüchtet. Weiterhin wird diese submerse Chemostaten-Kultur hochtourig gerührt, um das vegetative Mycel hinreichend zu zerkleinern. Dabei wird die Verdünnungsrate auf höchstens 0,15/Std. eingestellt. Die Kultivierung wird in an sich bekannter Weise für die Dauer von 20 Tagen bis 28 Tagen, d.h. beiden eingesetzten Streptomyces-Stämmen für eine Dauer von mindestens 100 Verdopplungszeiten der Biomasse, durchgeführt.

Bei einer Kultivierungsdauer in dieser Größenordnung ergibt die Prüfung von aus dem Chemostaten entnommenen Klonen, daß die Kultur zu mindestens 99% genetisch homogen ist. Eine auf diese Weise angereicherte Population ist somit hinsichtlich ihrer Wachstumsform an die kontinuierliche Kultivierung im Chemostaten angepaßt und dabei genetisch homogen. Für die anschließende Transformation wird in der weiteren Ausgestaltung des Grundzuges der Verfahrenslösung ein Strepmyces-Plasmid herangezogen, welches an definierter Position seiner physischen Karte eine in die Primärstruktur

— Transkriptionsterminator

— Polylinker bzw. singuläre Restriktionsspaltstelle

— Promoter-loses Strukturgen für das Enzym-Amino-glykosid- Phophotransferase Il (kurz APhll-Gen) Leserahmen-gerecht inserierte Expressions-Sekretions-Einheit des Staphylokinase-Gens des Staphylococcus aureus-SpenderphagenO42D (kurz: SAK-ESE) trägt. Vorzugsweise wird in diesem Schritt des Verfahrens für die Transformation auf ein Plasmid zurückgegriffen, welches als heterologen DNS-Abschnitt die SAK-ESE in einer Kompaktregion in festem Verbund mit einem pro- bzw. eukaryotischen Strukturgen aufweist. Solche rekombinanten Streptomyces-Plasmide sind im Ergebnis des Verfahrens aus einer anderen Patentanmeldung des Zentralinstituts als Vektoren der pMG-Familie verfügbar geworden.

Die im Anschluß an diesen Transformationsschritt durchzuführende Chemostaten-Kultivierung Il ist in der weiteren Ausgestaltung des Grundzuges der vorliegenden technischen Lösung dadurch gekennzeichnet, daß

— in ihr die hochtourige Rührung entfällt,

— als limitierendes Substrat entweder wiederum eine anorganische Stickstoff-Quelle oder aber ein Aminosäuregemisch, beispielsweise Casaminoacids, eingesetzt wird und

— die kontinuierliche Kultivierung hinsichtlich der Anwendung von Selektionsdruck in 2 Phasen erfolgt.

Hierbei wird in der ersten Phase (Dauer: 10 Tage bis 14Tage) die Konzentration des zuzusetzenden Aminoglykosid-Antibiotikums in 2-Tages-lntervallen auf ein Endniveau in der Größenordnung von 75μg/ml bis 150μg/ml erhöht und in der zweiten Phase mindestens weitere 14 Tage auf dem ausgangs der ersten Phase erreichten Niveau der Antibiotika-Konzentration weiter kultiviert.

Abschließend werden aus dem Chemostaten in an sich bekannter Weise dann jene Streptomyces-Klone, vorwiegend S. lividans-Klone, isoliert, die—vermittelt durch das vorzugsweise jeweils integrierte pMG-Plasmid—nunmehr eine signifikant stabilisierte Resistenz gegen Aminoglykoside aufweisen.

-4- ZbUZB/

In einer besonderen Ausführungsform wird für das vorgeschlagene Verfahren zur Herstellung neuer Actino- bzw. Streptomyces-Stämme mit im genetischen Material stabil inserierten heterologen DNS-Abschnitten der literaturbekannte S.lividans-Stamm TK24 herangezogen.

Genetisch homogenes Zellmaterial des Stammes TK24, welches aus einer bei einer Temperatur von 30⁰C sowie mit Ammoniumchlorid als limitierender Stickstoff-Quelle durchgeführten, 25tägigen Chemostaten-Kultivierung I erhalten worden war, wird hierbei mit DNS solcher pMG-Rekombinantenplasmide transformiert, welche in der erwähnten Primärstruktur

— Transkriptionsterminator

— Polylinker bzw. singuläre Restriktionsspaltstelle

— Promoter-loses Aphll-Gen

eine Leserahmen-gerecht eingefügte Fremd-DNS in Form einer 1038 bp Kompaktregion, bestehend aus dem Human-Interferon-Alphai-Strukturgen (kurz: h1IFN-Strukturgen) in Expressionspassung an die SAK-ESE, aufweisen. Prototypen solcher MIFN-rekombinanten Vektoren liegen inzwischen, hergestellt nach dem Verfahren einer simultanen Patentanmeldung des Zentralinstituts, mit den S. lividans-Plasmiden pMG340 sowie pMG341 (Molekülgröße jeweils 7,2 kb) vor. In der Transformanten-Kultur wird in dieser Verfahrensvariante nunmehr auf Ausprägung einer Neomycin- bzw. Kanamycin-Resistenz auf einem Mindestniveau von 15pg/ml selektiert.

Mit pMG340- bzw. pMG341-DNS transformierte S. lividans-Kulturen, die dieser Anforderung genügen, werdne sodann einer Chemostaten-Kultivierung Il ohne hochtourige Rührung unterzogen, wobei in dem eingesetzten Glucose-Mineralsalz-Medium Casaminoacids als limitierende Stickstoff-Quelle wirkt. In der ersten Phase dieser Kultivierung wird der Nährlösung in der Vorratsflasche im zeitlichen Abstand von 2 Tagen jeweils eine solche Menge Neomycin zugesetzt, daß nach insgesamt 10 Tagen eine Endkonzentration von 100 pg Antibiotikum/ml erreicht ist. Mit dieser Nährlösung wird anschließend in der zweiten Phase die Kultivierung noch weitere 15 Tage fortgesetzt.

Die in der bevorzugten Ausführungsform am Ende der Chemostaten-Kultivierung Il jeweils gezüchtete Bakterienpopulation, bezeichnet als S.lividans-Stamm der TK24TC41-Serie, hat mit einer Häufigkeit von mindestens 99% eine signifikant erhöhte und durch eine Reversionsrate von weniger als 10~⁶ pro Generation charakterisierte Neomycin-Resistenz und damit signifikant stabilisierte pMG340- bzw. pMG341-DNS erworben.

Die Durchführung des dargelegten Verfahrens mit dem Bakterium S. lividansTK24, transformiert durch das h1IFN-rekombinierte Plasmid pMG341, führte in dem einen Fall zu dem neuen Stamm S.lividansTK24TC41-78, der in der Hinterlegungsstelle für Mikroorganismen der DDR, Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie der AdW, DDR - 6900 Jena, Beutenbergstr. 11 unter der Registriernummer ZIMET 43832 hinterlegt worden ist.

In einer weiteren Variante der bevorzugten Ausführungsform, die gleichfalls mit der Einsatzkombination „S. lividans TK24 — Rekombinantenplasmid pMG341" gemäß den o.g. Verfahrensbedingungen durchgeführt wurde, ist der Stamm TK24TC41-92 erhalten worden. Dieser gleichfalls zur Synthese eines modifizierten Human-Alpha1-Interferons befähigte neue Mikroorganismus ist in der oben angegebenen Hinterlegungsstelle unter der Registriernummer ZIMET 43833 hinterlegt worden.

Der letztgenannte neue S. lividans TK24TC41-78 durch eine weniger zur Pelletbildung neigende Wachstumsform und infolgedessen durch eine geringfügig niedrigere Resistenz gegen Neomycin gekennzeichnet (s. a. die beiliegende Tabelle).

Die Vorteile der Erfindung bestehen zusammengefaßt in Folgendem:

Die nach dem beschriebenen, leicht handhabbaren Verfahren gewonnenen Actinomyces-, vorzugsweise Streptomyces-Stämme sind dadurch gekennzeichnet, daß sie das jeweilige rekombinante Plasmid und damit den inserierten heterologen DNS-Abschnitt mit einer hohen Stabilität (Reversionsrate von weniger als 10~⁶ pro Generation) vererben und dessen genetische Information nach Maß der erhöhten Antibiotika-, beispielsweise Neomycin-Resistenz, exprimieren.

Insbesondere konnten nach diesem Verfahren neue rekombinante Streptomyces-Stämme gewonnen werden, die bei Fermentation gemäß dem Verfahren einer simultanen Patentanmeldung des Zentralinstituts eine erhöhte Syntheseleistung für ein modifiziertes Human-Alpha1-Interferon aufweisen.

Ausführungsbeispiel

Das nachstehende Beispiel dient dazu, die Erfindung näher zu erläutern, ohne sie hierauf zu beschränken.

Beispiel 1

10⁸ Sporen des Stammes S. lividans TK24 werden in 100 ml einer Glucose-Mineralsalz-Lösung mit Casaminoacids als limitierender Stickstoff-Quelle 16 Stunden unter Schütteln bei 30⁰C kultiviert. Die entstandene Submerskultur wird in das leere Kulturgefäß des Chemostaten (Arbeitsvolumen 200ml) überführt Anschließend werden sofort

— die Zufuhr einer Nährlösung obiger Zusammensetzung mit einer Verdünnungsrate von D = 0,12/h,

— die Rührung durch ein horizontal an der Rührwelle befestigtes Glasplättchen mit einer Drehzahl von 2800/min,

— die Belüftung mit einer Rate von 0,11 Luft pro Stunde und Liter Kulturvolumen sowie

— die Kultivierungstemperatur von 30⁰C eingestellt.

Nach einer Kultivierungszeit von 25 Tagen (entsprechend 100 Verdopplungen der Biomasse) wird die dann in Chemostaten befindliche Population in verdünnter Form auf Nähragar M79 ausgeplattet. Unter 100 auf diesem Agar nach 5tägigier Bebrütung bei 30⁰C entstandenen Kolonien wird höchstens eine Kolonie auffindbar sind, die sich in ihrer Morphologie von allen übrigen gleichartigen Kolonien unterscheidet.

Von einer dieser gleichartigen Kolonien wird anschließend die Biomasse in an sich bekannter Weise vermehrt und mit dem h1IFN-rekombinanten Plasmid pMG341 transformiert. Das APhll-Gen auf pMG341 wird durch die in obiger Kompaktregion befindliche Expressionseinheit nunmehr ebenfalls mit ausgeprägt.

Eine Neomycin-resistenteTransformante mit einem Resistenzniveau von mindestens 15Mg/ml wird nachfolgend auf Nähragar M79 geimpft und 7 Tage bei einer Temperatur von 3O⁰C bebrütet.

Das hierbei entstehende Oberflächenmycel wird in 50ml einer Glucose-Mineralsalz-Nährlösung mit Casaminoacids als limitierender Stickstoffquelleiür die Dauer von 3 Tagen bei 3O⁰C geschüttelt. Diese Submerskultur wird dann einer zweiten

kontinuierlichen Kultivierung im Chemostaten unterzogen, wobei im Gegensaatz zur Kultivierung im einleitenden Verfahrensschritt die Rührung, d.h. die mechanische Fraktionierung, unterbleibt. Als Nährlösung wird erneut das o.g. Glucose-Casaminoacids-Mineralsalz-Medium für Stickstoff-Limitation verwendet. 48 Stunden nach dem Beginn der kontinuierlichen Kultivierung wird die Nährlösung in der Vorratsflasche mit Neomycin bis zu einer Konzentration von 20Mg/ml versetzt. Nach jeweils48 Stunden wird die Neomycin-Konzentration der Nährlösung um weitere 20pg/ml erhöht, so daß nach 240 Stunden die Neomycin-Endkonzentration in der Nährlösung den Wert von 100Mg/ml erreicht hat. Mit dieser Nährlösung wird die kontinuierliche Kultivierung noch 15Tage (entsprechend 60 Verdopplungen der Biomasse) weitergeführt. Anschließend werden Proben aus dem Chemostaten in 1O^-4 bis 10~⁵-facher Verdünnung auf Nähragar M79 ausgespatelt. Die nach einer 5tägigen Bebrütung bei einer Temperatur von 28^CC entstandenen Kolonien werden hinsichtlich ihrer Neomycin-Resistenz nunmehr wie folgt geprüft: Mit einer Öse werden Kolonien in 10ml einer Neomycin-freien Nährlösung M79 übertragen und 40 Stunden bei 28°C geschüttelt. Von den dabei entstandenen Kulturen wird eine 0,05 ml-Portion auf eine M79-Nähragarfläche von 10cm Durchmesser und 2,5 mm Dicke gespatelt. Anschließend werden aus der Agarschicht Löcher von 8 mm Durchmesser ausgestanzt und diese mit je 0,05ml einer Neomycin-Lösung unterschiedlicher Konzentration gefüllt.

Die so bereiteten Nähragar-Platten werden dann für die Dauer von 2 Tagen bei 3O⁰C kultiviert. Dabei entsteht ein dichtes Oberflächenmycel; lediglich in der Umgebung der Stanzlöcher ist das Wachstum durch das in den Nähragar diffundierende Neomycin gehemmt, wodurch Hemmhöfe unterschiedlichen Durchmessers entstanden sind. Die Tabelle 1 zeigt Hemmhof-Durchmesser in Abhängigkeit von der Neomycin-Konzentration

a) beiderTranformantenTN341 vorderChemostaten-Kultivierung II,

b) bei einer Seiektanten TK24TC41-78 nach der Chemostaten-Kultivierung Il sowie

c) bei einer weiteren Seiektanten TK24TC41-92 gleichfalls nach der Chemostaten-Kultivierung II.

Wie der Vergleich zeigt, sind die Hemmhöfe im Oberflächenmycel dieser beiden Seiektanten signifikant kleiner als jene im Falle der ursprünglichen Transformante.

Auf diese Weise wurden mehr als 100 Seiektanten geprüft. Unter ihnen wurde keine aufgefunden, die ein mit der ursprünglichen Transformante vergleichbares Resistenzniveau gegen Neomycin nach Maßgabe der in Tab. 1 offenbarten Hemmhöfe hat.

Demzufolge besteht die nach der zweiten verfahrensgemäßen Chemostaten-Kultivierung erhaltene Streptomyces liyidans-Population mindestens zu 99% aus Klonen mit stabilisierter Neomycin-Resistenz, d. h. mit stabil im Trägerplasmid inserierter heterologer DNS, die u.a. eine Expressionseinheit enthält, durch die nunmehr die Ausprägung des APHII-Gens bewirkt wird.

Zusammensetzung der Nährmedien (Angaben in g/l):

Glucose-Casaminoacids-Mineralsalz-Medium:

Glucose 2,0; Ammoniumchlorid 0,08; CasaminoacidsO,5; KH₂Po₄ 2,72; Na₂HPO₄- 12 H₂O 7,16; NaCI 5,1; Na₂SO₄ 1,07; MgCI₂-

H₂O 0,04; FeCI_2/30,005; MnCI₂0,004; pH 6,0; Lösungsmittel: Aqua dest. ·

M79-Medium:

Glucose 10,0; Pepton 10,0; Casaminoacids 1,0; Hefeextrakt 2,0; NaCI 6,0; Agar-Agar 15,0; Lösungsmittel: Aqua dest.

Tabelle 1: Hemmhofdurchmesser [mm]

Streptomyces-Stamm Neomycin-Konzentrationen [^g/ml]

100 300 1000 3 000

TN341	11	15	25	40
TC41-78	0	9	13	25
TC41-92	0	10	14	26

Claims (18)

1. Verfahren zur Herstellung von Actinomyces-Stämmen mit im genetischen Material stabil inserierten heterologen DNS-Abschnitten unter Verwendung der allgemeinen Methode der kontinuierlichen Submerskultivierung, gekennzeichnet dadurch, daß man

— Zellen eines plasmidfreien Actinomyces-Ausgangsstammes einer Chemostaten-Kultivierung I unter Stickstoff-Limitierung,

— Zellen der hierbei anfallenden genetisch homogenen Kultur einer Transformation mit einem in Actinomyces-Stämmen replizierenden Plasmid, welches einen wenigstens eine Expressions-Sekretions-Einheit enthaltenden heterologen DNS-Abschnitt in Leserahmen-gerechter Kombination zum Strukturgen eines Resistenzmarkers trägt, sowie

— dieTransformanten-Zellen einer Chemostaten-Kultivierung Il unter Stickstoff-Limitierung und Selektionsdruck

unterwirft und jene erhaltenen Acinomyces-Zellen, die eine signifikant stabilisierte Resistenz gegen das beigefügte Antibiotikum erworben haben, in an sich bekannter Weise isoliert.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, gekennzeichnet dadurch, daß man als plasmidfreien Actinomyces-Ausgangsstamm einen Stamm der Gattung Streptomyces bereitstellt.

3. Verfahren gemäß Anspruchs, gekennzeichnet dadurch, daß man als plasmidfreien Ausgangsstamm einen Stamm der Art S. lividans bereitstellt.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, gekennzeichnet dadurch, daß man als plasmidfreien Ausgangsstamm den Stamm S. lividans TK24 bereitstellt.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die Chemostaten-Kultivierung I unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium, welches neben assimilierbaren Salzen wenigstens eine organische Kohlenstoff-Quelle und eine als limitierendes Substrat wirkende Stickstoff-Quelle enthält, durchführt.

6. Verfahren gemäß Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, daß man in der Chemostaten-Kultivierung I Glucose als Kohlenstoff-Quelle einsetzt.

7. Verfahren gemäß Anspruch 5 und 6, gekennzeichnet dadurch, daß man in der Chemostaten-Kultivierung I Ammoniumchlorid als limitierende Stickstoff-Quelle einsetzt.

8. Verfahren gemäß Anspruch 5 bis 7, gekennzeichnet dadurch, daß man die Chemostaten-Kultivierung I unter hochtouriger Rührung bei Temperaturen von 25⁰C bis 39⁰C während einer Dauer von 20 Tagen bis 28 Tagen bei einer Verdünnungsrate von höchstens 0,15/Std. durchführt.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, gekennzeichnet dadurch, daß man die Chemostaten-Kultivierung I bei einer Temperatur von 3O⁰C während einer Dauer von 25 Tagen durchführt.

10. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 2 bis 9, gekennzeichnet dadurch, daß man zurTransformation ein Streptomyces-Plasmid heranzieht, welches an definierter Position seiner physischen Karte eine in die Primärstruktur

— Transkriptionsterminator

— Polylinker bzw. singuläre Restriktionsspaltstelle

— Promoter-loses Strukturgen des Enzyms Aminoglykosid-Phosphotransferase Il (APhll-Gen) Leserahmen-gerecht inserierte SAK-Expressions-Sekretions-Einheit enthält.

11. Verfahren gemäß Anspruch 1 sowie 2 bis 10, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Transformation ein Streptomyces-Plasmid heranzieht, welches eine in voranstehend genannte Primärstruktur Leserahmen-gerecht inserierte 1 038bp große Kompaktregion, bestehend aus der SAK-Expressions-Sekretions-Einheit und dem Human-Interferon-Alpha I-Strukturgen, erhält.

12. Verfahren gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Transformation das S. lividans-Plasmid pMG340 (Molekülgröße 7,2 kb) heranzieht und in der transformierten Actinomyces-Population auf Ausprägung einer Resistenz gegen Aminoglykoside wie Neomycin bzw. Kanamycin selektiert.

13. Verfahren gemäß Anspruch 11, gekennzeichnet dadurch, daß man zur Transformation das S. lividans-Plasmid pMG341 (Molekülgröße 7,2 kb) heranzieht und in der transformierten Actinomyces-Population auf Ausprägung einer Resistenz gegen Aminoglykoside wie Neomycin bzw. Kanamycin selektiert.

14. Verfahren gemäß Anspruch 1,4,11 und 12, gekennzeichnet dadurch, daß man zurTransformation das Plasmid pMG340 einsetzt und in der transformierten S. lividans TK24-Population auf Ausprägung einer Neomycin- bzw. Kanamycin-Resistenz (Mindestniveau: 15μg/ml selektiert.

15. Verfahren gemäß Anspruch 1,4,11 und 13, gekennzeichnet dadurch, daß man zurTransformation das Plasmid pMG341 einsetzt und in der transformierten S. lividans TK24-Population auf

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Ausprägung einer Neomycin- bzw. Kanamycin-Resistenz (Mindestniveau: "^g/ml selektiert.

16. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 13, gekennzeichnet dadurch, daß man die Chemostaten-Kultivierung Il wie die Kultivierung I, jedoch mit den Änderungen

— Wegfall der hochtourigen Rührung;

— wahlweiser Einsatz einer anorganischen Stickstoff-Quelle bzw. eines Aminosäure-Gemisches als limitierendes Substrat;

— Kultivierung in 2 Phasen, wobei in der ersten Phase (Dauer: 10 Tage bis 14Tage) die Konzentration des zuzusetzenden Antibiotikums in 2-Tages-lntervallen erhöht sowie in der zweiten Phase mindestens weitere 14 Tage auf dem ausgangs der ersten Phase erreichten Niveau der Antibiotikum-Konzentration weiter inkubiert wird,

durchführt und jene Actinomyces-, vorzugsweise Streptomycesstämme, die eine signifikant stabilisierte Resistenz gegen Aminoglykoside erworben haben, in an sich bekannter Weise isoliert.

17. Verfahren gemäß Anspruch 1,14 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß man

— die Chemostaten-Kultivierung Il mit Zellen des Stammes S. lividans TK24(pmG340) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium für Stickstoff-Limitation durchführt, dabei

— in der 10tägigen ersten Phase die Neomycin-Konzentration intervallweise auf das Endniveau von 10C^g/ml erhöht,

— in der zweiten Phase weitere 15 Tage inkubiert und

— schließlich jene S. lividans-Stämme der TK24TC41-Serie, die eine signifikant stabilisierte Resistenz gegen das Antibiotikum erworben haben, in an sich bekannter Weise isoliert.

18. Verfahren gemäß Anspruch 1,15 und 16, gekennzeichnet dadurch, daß man

— die Chemostaten-Kultivierung Il mit Zellen des Stammes S. lividans TK24(pMG341) in einem Glucose-Mineralsalz-Medium für Stickstoff-Limitation durchführt, dabei

— in der lOtägigen ersten Phase die Neomycin-Konzentration intervallweise auf das Endniveau von 100Mg/ml erhöht,

— in der zweiten Phase weitere 15 Tage inkubiert und

— schließlich jene S. lividans-Stämme der TK24TC41-Serie, so die Stämme TK24TC41-78 und TK24TC41-92, die eine signifikant stabilisierte Resistenz gegen das Antibiotikum erworben haben, in an sich bekannter Weise isoliert.