CH666051A5 - Verfahren zur herstellung von menschlichem leukozytaerem interferon alpha-2. - Google Patents
Verfahren zur herstellung von menschlichem leukozytaerem interferon alpha-2. Download PDFInfo
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Description
BESCHREIBUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2, das eine antivirale Aktivität aufweist und in der Medizin zur Prophylaxe und Behandlung einer Reihe von Massenerkrankungen der Virusätiologie Verwendung findet.
Interferone sind Eiweisse, synthetisiert durch menschliche Sonderzellen als Reaktion einer Virusinfektion. In Abhängigkeit von dem Typ der Produzentenzelle und den strukturfunktionellen Besonderheiten der Interferone lassen sich diese Eiweisse in drei Haupttypen, d.h. Alpha- oder leukozytärer Typ (produziert durch Leukozyten), Beta- oder Fibroblasttyp (produziert durch Fibroblaste) und Gamma- oder Immuntyp (produziert durch T-Lymphozyten) einteilen.
Neben der antiviralen Aktivität besitzen die Interferone auch eine antiproliferative Aktivität und beeinflussen die Immunantwort. Dies ermöglicht es, die Arzneipräparate auf der Interferonbasis als potentiell wirksame Mittel zur Behandlung einer Reihe bösartiger Neubildungen zu betrachten. Heute sind hochgereinigte Präparate des menschlichen Interferons hergestellt, das eine Familie von 13 bis-15 eng verwandten Eiweissen darstellt, wobei jedes von denen durch das eigene Strukturgen im Chromosom kodiert wird. Das Isolieren von leukozytärem Interferon aus dem Spenderblut kann jedoch seine Herstellung in einer Menge, die zur weiten Verwendung desselben in der Klinik ausreicht, nicht sichern, weil der Interferongehalt je 1 Liter Blut in der Regel 105 Aktivitätseinheiten nicht übersteigt, während die wirksame Einzeldosis von Interferon zur intravenösen Injektion beim Kranken nach den vorherigen klinischen Beobachtungen mindestens 106 Aktivitätseinheiten beträgt.
Bekannt sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von menschlichen leukozytären Interferonen, die auf der Benutzung unterschiedlicher Mikroorganismenstämme als Produzenten basieren, in welche mittels vektorieller Moleküle die individuellen Gene des menschlichen Interferons übertragen sind. Als Produzenten dienen insbesondere die Stämme von Bakterien Escherichia coli, Bacillus subtilis, Methylophilus methylotrophus und anderen (EP Nr. 006297IA2, veröffentlicht 1982, IPK\ C 12 N 15/00).
Die Mikroorganismen, welche über ein Plasmid mit dem darin integrierten Gen des menschlichen leukozytären Interferons verfügen, produzieren das Interferon im Laufe der Züchtung derselben unter Bedingungen der aeroben Submerskultivierung auf Nährmedien, enthaltend assimilierbare
Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wuchsstoffe.
Bekannt ist ein Verfahren zur Herstellung von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 (GB-PS Nr. 207929IA, veröffentlicht 1982, C 12 N 15/00), das in der Verwendung von Bakterien E. coli K-12 des Stammes 294 besteht, der durch die Einführung der rekombinanten Plasmide pie IFA trp 2,5 hergestellt ist, in welcher das Gen des Interferons Alpha-2 durch Regulatorbereiche des Tryptophanoperons von E. coli kontrolliert wird.
Der angegebene Stamm wird unter Bedingungen der Submerskultivierung auf Nährmedien, die Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wuchsstoffe enthalten, in Anwesenheit eines Antibiotikums gezüchtet.
Beim genannten Produzenten beträgt die Interferonausbeute 2,5 x 108 Aktivitätseinheiten je 1 Liter Kulturflüssigkeit.
Der Einsatz von E. coli als Industrieproduzent ist mit einer Reihe von Nachteilen verbunden. Das Bakterium E. coli ist ein bedingt pathogener Mikroorganismus, und verschiedene Stämme dieses Bakteriums sind in der Darmflora des Menschen ständig vorhanden. Dies stellt die Sonderanforderungen an die Reinigung von auf der Basis von E. coli herstellbaren Präparaten und an die vollständige Trennung artfremder Begleiteiweisse und -endotoxine, wodurch die Technologie der Herstellung von Interferon bedeutend verteuert und die Ausbeute an Reinprodukt herabgesetzt wird. Alle bekannten Stämme von E. coli sind ausserdem einer Phago-lyse ausgesetzt: Die identifizierte Anzahl von E. coli-spezifi-schen Phagen erreicht einige Hundert.
Das genannte Verfahren zeichnet sich durch eine verhältnismässig geringe Kulturproduktivität aus, wodurch das Isolieren von Interferon aus der zellulären Biomasse und die anschliessende Reinigung desselben bis zur Erzielung eines homogenen Zustands eine arbeitsaufwendige Stufe darstellen.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch die Verwendung eines neuen Produzentenstammes die Ausbeute an menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 zu erhöhen und die Technologie seines Isolierens zu vereinfachen.
Die Aufgabe wird dadurch gelöst, dass im Verfahren zur Herstellung von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 durch Submerskultivierung eines ein Plasmid mit dem darin integrierten Gen des menschlichen leukozytären Interferons Alpha-2 enthaltenden Produzentenstammes auf einem Nährmedium, das Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wuchsstoffe enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Antibiotikums, anschliessendes Isolieren und darauffolgende Reinigung des Endprodukts erfindungsgemäss man als Produzentenstamm ein Stamm Pseudomonas species VG-84 mit einer Plasmide pVG3, SRIA Nr. 1742 verwendet und die Kultivierung des Produzentenstammes in Anwesenheit des Antibiotikums, Streptomyzin oder Tetrazyklin oder eines Gemisches derselben durchgeführt wird. Vorteilhaft wird Tetrazyklin in einer Menge von 30 bis 50 mg/1 und Streptomyzin in einer Menge von 50 bis 150 mg/1 eingesetzt.
Das erfindungsgemässe Verfahren gestattet dank der Verwendung eines neuen hochproduktiven Stammes Pseudomonas species VG-84 die Ausbeute am Endprodukt zu erhöhen und die Technologie des Isolierens desselben zu vereinfachen. Beim erfindungsgemässen Verfahren benutzt man einen neuen Stamm Pseudomonas species VG-84, in dem das Gen von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 im Bestand der Vielkopienplasmide pVG3 unter der Kontrolle von den Regulatorbereichen des Gens D des Bakteriophagen 0X174 kloniert ist.
Die Plasmide pVG3 stellt eine molekulare Hybride zwischen der vektoriellen Vielkopienplasmid pAYC34 mit dem breiten Wirtskreis und der Plasmide PIFN-cc2-P2 dar, welche
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das Replikon pBR 322 und das Gen des Interferons Alpha-2 enthält und die Zellresistenz gegen Tetrazyklin und Ampizil-lin determiniert. In der Plasmide pIFN-a2-P2 steht das Gen des Interferons Alpha-2 unter Kontrolle der Regulatorbereiche des Gens D des Bakteriophagen 0X174. Die vektorielle Plasmide pAYC34, die 9,4 Tausend Paar Nukleotide gross ist, gehört der Unverträglichkeitsgruppe Incp-4/Q zu, determiniert die Zellresistenz gegen Streptomyzin. Die DNS pAYC34 und pIFN-a2-P2 der Plasmide wurde mit Restriktase Pst 1 behandelt, und die kompetenten Zellen des Stammes E. coli C600 wurden mit einem legierten Gemisch transformiert. Die Transformanten wurden auf einem vollwertigen Nährmedium, enthaltend Antibiotika Ampizillin (50 jig/ml), Streptomyzin (100 (ig/ml) und Tetrazyklin (25 (ig/ml), entnommen. In den Transformantenklonen wurde die Plasmiden-DNS, genannt pVG3, nachgewiesen, die einer Hybride zwischen den Plasmiden pAYC34 und pIFN-a2-P2 nach der Grösse und Restriktionskarte entspricht. Die Plasmide pVG3 determiniert die Zellresistenz gegen Streptomyzin wie pAYC34 und gegen Tetrazyklin und Ampizillin wie pIFN-a2-P2. Die Grösse der Plasmide pVG3, die 14,8 Tausend Paar Nukleotide beträgt, ist gleich der Gesamtgrösse der Plasmiden pIFN-<x2-P2 5,4 Tausend Paar Nukleotide und pAYC34 9,4 Tausend Paar Nukleotide.
In einen der Stämme E. coli C600, der die Hybridenplas-mide pVG3 enthält, wurde eine konjugative Plasmide R 751 mit dem breiten Wirtskreis eingeführt. In einer Reihe konju-gativer Kreuzungen wurde die Plasmide pVG3 in Bakterien der Gattung Pseudomonas und andere gramnegative Bakterien überführt. Man entnahm die Transkonjugantenbakterien auf einem selektiven Medium mit den oben angegebenen Antibiotika und prüfte auf die Fähigkeit, das Interferon zu synthetisieren.
Die nach dem beschriebenen Verfahren erhaltenen Kulturen wurden unter aeroben Bedingungen bei einer Temperatur von 30 °C auf dem L-Bouillon innerhalb von 6 bis 10 Stunden bis zum Erzielen eines Bakterientiters von 2 bis 5 x 109 Zellen je 1 ml gezüchtet. Man sammelte die Bakterien durch Zentri-fugieren an, zerstörte mit Ultraschall und bestimmte den Interferongehalt der zellulären Extrakte nach einem radioimmunologischen Verfahren. Es wurden 18 Stämme der gramnegativen Bakterien der Gattungen Escherichia, Salmonella, Pseudomonas, Methylomonas, Erwinia und Rhizobium geprüft. Die meisten geprüften Stämme produzierten das aktive Interferon. Durch die grösste Produktivität zeichnete sich der Stamm Pseudomonas sp. VG-84 aus. Unter den angegebenen Bedingungen produzierte dieser Stamm 5 x 109 bis 1 x 1010 Aktivitätseinheiten Interferon je 1 Liter Kulturflüssigkeit.
Der Stamm Pseudomonas sp. VG-84, welcher das Plasmid pVG3 enthält, ist in der Kulturensammlung Vsesojuzni nauchno-issledovatelsky institut Antibiotikov, Nagatinskaya ulitsa 3a, Moskva, USSR (USSR Research Institute for Anti-biotics of the USSR Ministry of the Medicai and Microbiolo-gical Industry, Nagatinskaya Street 3-a, 113105 Moscow-USSR) am 12. April 1984 deponiert und hat eine Registriernummer 1742.
Kulturmorphologische Charakteristika des Stammes Pseudomonas sp. VG-84 mit dem Plasmid pVG3
Morphologie im Gramnegative bewegliche 3 bis 5 Jim
Mikroskop lange Stäbchen
Morphologie auf Nach 24 Std. Wachstum bei 25 bis verschiedenen Medien 30 ° C bildet Kolonien mit unebenem Fleisch-Pepton-Agar Rand von 3 bis 4 mm Durchmesser, Oberfläche rauh, Farbe hellgrün
Fleisch-Pepton-BouillonStichwachstum mässig,
hauptsächlich auf der Oberfläche des Mediums. Wachstum ohne Belüftung ist schwach. Glukosehaltige Nach 2 Tagen Wachstum bildet
Minimalmedium M9 Kolonien von 2 bis 3 mm
Durchmesser, grauer Farbe, Kolonien sind rund, rauh. Physiologische und Wächst bei 25 bis 35 °C, optimal biochemische Merkmale 30°, pH-Wert 7,0.
Kohlenstoffquellen: verwertet Glukose, Arabinose. Stickstoffquellen: gut assimiliert. Bedarf Adenin. Stabil gegen Streptomyzin und Tetrazyklin.
Das erfindungsgemässe Verfahren wird im einzelnen wie folgt durchgeführt. Man züchtet den Stamm Pseudomonas sp. VG-84 auf einem agarisierten Nährmedium bei einer zwischen 28 und 30° C liegenden Temperatur innerhalb von 8 bis 12 Stunden, überimpft dann auf ein flüssiges Nährmedium und züchtet das Inokulum unter heftiger Vermischung und Belüftung im Verlaufe von 3 bis 6 Stunden bei einer Temperatur von 28 °C. Die Fermentation wird in einem Fermenter auf beliebiger geeigneter Nährflüssigkeit, die Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wuchsstoffe enthält, beispielsweise auf einem Nährmedium, enthaltend Glukose, Hefeextrakt oder -autolysat oder Tripton oder Pepton oder Kasein-hydrolysat oder Hefehydrolysat oder Gemisch derselben, durchgeführt. Die Fermentation erfolgt in Gegenwart von Antibiotika Streptomyzin oder Tetrazyklin oder Gemisch derselben. Vorteilhaft benutzt man Tetrazyklin in einer Menge von 30 bis 50 mg/1 und Streptomyzin in einer Menge von 50 bis 150 mg/1. Die Fermentation dauert 6 bis 10 Stunden bei einer zwischen 28 und 32 °C liegenden Temperatur bei einem pH-Wert von 6,7 bis 7,1 unter inniger Belüftung. Im Laufe des Prozesses wird die optische Dichte der Bakteriensuspension A550 gemessen, wobei die Grösse der optischen Dichte zu Fermentationsende 5 bis 7 Einheiten erreicht.
Unter den beschriebenen Kultivierungsbedingungen beträgt die Interferonausbeute nach den Angaben der radioimmunologischen Analyse oder der Bestimmung der antiviralen Aktivität an den Kulturen von menschlichen Fibroblasten 5 x 109 bis 1,5 x 1010 Aktivitätseinheiten je 1 Liter Kulturflüssigkeit.
Nachdem der Fermentationsprozess im Falle der Erzielung der angegebenen optischen Dichte vollendet ist, werden die Bakterienzellen durch Zentrifugieren angesammelt, im geeigneten Puffer resuspendiert und durch Ultraschallbehandlung oder nach einem beliebigen Verfahren, das die Zertrümmerung von Zellen oder die Störung der Ganzheit der Zellhaut bewirkt, wie Lysozymbehandlung, Behandlung nach ballistischen Methoden unter Anwendung von Glas- oder metallischen Kugeln, mit Hilfe einer French-Presse u.a. zerstört. Man trennt die Zellbruchstücke durch Zentrifugieren ab und isoliert aus der supernatanten Fraktion, die einen Zellextrakt darstellt, das darin vorhandene Interferon unter Anwendung der bekannten Fraktionier- und Reinigungsverfahren von Eiweissen. Die Ausbeute an Interferon, welches nach verschiedenen physikalisch-chemischen Kriterien homogen ist, liegt zwischen 20 und 60 Prozent bei einem 200- bis 500fachen Reinheitsgrad und einer 4 x 108 Aktivitätseinheiten betragenden spezifischen Aktivität des durch die Reinigung hergestellten Endprodukts. Man überwacht den Reinigungsverlauf in der Weise, dass man die antivirale Aktivität des Interferons an den Kulturen von menschlichen Fibroblasten unter Anwendung des Virus der vesikulären Stomatitis und durch
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radioimmunologische oder Immunfermentanalyse bestimmt. Die Reinheit der durch Reinigung hergestellen Interferonpräparate wird nach Immun-, Elektrophorese-, Gel-Filtrations-und Sedimentationsverfahren sowie durch Bestimmung des Aminosäurenbestandes und der N-terminalen Aminosäurensequenz des isolierten Endprodukts kontrolliert. Die erhaltenen homogenen Präparate von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 zeichnen sich durch einen ganzen Satz von strukturfunktionellen Merkmalen aus, die diesem Interferontyp eigen sind.
Der Vorteil des erfindungsgemässen Verfahrens gegenüber dem bekannten besteht darin, dass im Zusammenhang mit der Benutzung des neuen hochproduktiven Stammes das hohe Aktivitätsniveau auf der Fermentationsstufe erreicht wird, wodurch eine und dieselbe Interferonmenge aus einem kleineren Volumen der Biomasse dargestellt werden kann, was die Herabsetzung von Kosten für Isolieren der Biomasse, Abbau derselben und alle anschliessenden Arbeitsgänge bei der Herstellung des homogenen Präparats begünstigt.
Nach den Angaben der automatischen Sequenzanalyse laut Edmann hat das homogene aus der Biomasse des Produzentenstammes Pseudomonas sp. VG-84 isolierte Interferon die N-terminale Aminosäurensequenz Cys-Asp-Leu-Pro-Glu-Thr-His-Ser... und enthält den Methioninrest am N-Ende nicht, wodurch es strukturell mit dem durch die Leukozyten des Menschen produzierbaren Interferon Alpha-2 völlig identisch ist.
Zum besseren Verstehen der vorliegenden Erfindung werden folgende Ausführungsbeispiele des Verfahrens zur Herstellung von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 angeführt.
Beispiel 1
Der Stamm Pseudomonas sp. VG-84 wird bei einer Temperatur von 28 °C innerhalb von 12 Stunden auf einem agari-sierten Schrägnährboden folgender Zusammensetzung: 10 g/1 Tripton, 5 g/1 Hefeextrakt, 80 mg/1 Adenin, 10 g/1 Glukose, 150 mg/1 Streptomyzin, 50 mg/1 Tetrazyklin, bis zur Auffüllung auf 1 1 destilliertes Wasser, 15 g/1 Agar-Agar gezüchtet. Die auf den schrägen Oberflächen gezüchtete Biomasse benutzt man zur Bereitung des Inokulums. Die Zellen werden dazu in Erlenmeyer-Kolben von 750 ml Fassungsvermögen von 100 ml des angegebenen Nährbodens (ohne Agar) übertragen und auf einem Schütteltisch innerhalb von 6 Stunden unter heftigem Umrühren (240 U/min) bei einer Temperatur von 28 ° C gezüchtet. Die optische Dichte der Impfkultur beträgt 2 optische Einheiten.
Die Kultivierung findet in einem Fermenter statt, der mit Systemen zur Regelung der Temperatur, des pH-Wertes, der Umrührungsgeschwindigkeit und der Belüftungsgeschwindigkeit, mit einem Geber für das Messen des Partialdrucks von gelöstem Sauerstoff ausgestattet ist. Die Impfkultur wird dazu in einer Menge von 5 Prozent in einen Fermenter mit der Nährflüssigkeit der oben angegebenen Zusammensetzung (ohne Agar) eingetragen und im Verlaufe von 6 Stunden bei einer Temperatur von 28 ± 0,5°, einem pH-Wert von 6,7 bis 6,9 unter heftiger Belüftung und Umrühren gezüchtet. Die Belüftungs- und Umrührbedingungen werden so gewählt,
dass das Wachstum der Kultur durch die Konzentration von gelöstem Sauerstoff nicht limitiert wird, wozu der Partial-druck von Sauerstoff in einem Bereich von 5 bis 10 Prozent des Sättigungs werts konstant gehalten wird. Zur Stabilisation des pH-Wertes verwendet man das Ammoniakwasser.
Das Wachstum der Biomasse wird durch das Messen der optischen Dichte der Kulturflüssigkeit kontrolliert, was jede Stunde durchgeführt wird. Die Fermentation wird vollendet, wenn die Grösse der optischen Dichte Asso 5 optische Einheiten erreicht.
Nach der vollendeten Fermentation beträgt die Konzentration von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 1,5 x 1010 Aktivitätseinheiten je 11 Kulturflüssigkeit. Zur Ermittlung der Konzentration von erhaltenem Interferon bedient man sich der Festkörpermodifikation der radioimmunologischen Analyse unter Anwendung polyklonaler Anti-interferon-Antikörper von Kaninchen und monoklonaler mit Jod-125 markierter Antikörper von Mäusen sowie bestimmt die antivirale Aktivität des Interferons nach seinem Schutzeffekt gegen zytopathische Wirkung des Virus der vesikulären Stomatitis an den Kulturen von diploiden menschlichen Fibroblasten. Als Referenz-Präparate dient das Interferon gemäss der Norm MRC B/19 (Grossbritannien).
Die durch das Zentrifugieren nach der Durchführung der Fermentation angesammelten Zellen benutzt man als Interferonquelle. Die Zellen werden in 0,1 Mol tris-Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 berechnet von 1 g Zellen je 5 bis 10 ml Puffer, suspendiert und mit Hilfe eines Ultraschalldesintegrators zertrümmert. Die Zellbruchstücke werden durch das Zentrifugieren bei 30000 g abgetrennt, und aus der super-natanten Fraktion (Zellextrakt) wird das homogene menschliche leukozytäre Interferon Alpha-2 isoliert.
Durch die Reinigung erhält man das elektrophoretisch homogene Präparat des menschlichen leukozytären Interferons Alpha-2 mit einem 210fachen Reinheitsgrad und einer Aktivitätsausbeute von 41 Prozent bei einer spezifischen Aktivität von 4,0 x 108 Aktivitätseinheiten. Die Angaben der elek-trophoretischen Analyse von menschlichem leukozytärem Interferon Alpha-2 zeigt die Figur, wo A das Interferonpräparat vor der Reinigung, B das Interferonpräparat nach der Reinigung bedeuten, und das Molekulargewicht von Standard-eiweissen durch Ziffern rechts in kD (die Elektrophorese erfolgt in 12,5%igem Polyakrylamidgel bei Anwesenheit von Natriumdodezylsulfat) angegeben ist. Nach der spezifischen Aktivität, dem Molekulargewicht (18,4 kD), dem Amino-säurenbestand und anderen Kennwerten unterscheidet sich das isolierte menschliche leukozytäre Interferon Alpha-2 von dem aus anderen bakteriellen Produzentenstämmen isolierten menschlichen leukozytären Interferon Alpha-2 nicht.
Beispiel 2
Der Prozess wird analog dem in Beispiel 1 beschriebenen durchgeführt. -Das Züchten des Produzenten verwirklicht man in Anwesenheit von Antibiotika, und zwar 50 mg/1 Streptomyzin und 30 mg/1 Tetrazyklin. Nach 6 Stunden Fermentationsdauer beträgt die optische Dichte der bakteriellen Suspension 4,2 optische Einheiten und der Gehalt an menschlichem leukozytären Interferon Alpha-2 7,5 x 109 Aktivitätseinheiten je 11 Kulturflüssigkeit.
Beispiel 3
Der Prozess erfolgt analog dem beschriebenen in Beispiel 1. Das Züchten des Produzenten verwirklicht man in Anwesenheit des Antibiotikums Tetrazyklin in einer Menge von 50 mg/1. Nach 5,5 Stunden Fermentationsdauer beträgt die optische Einheit und die Konzentration von Interferon 9,5 x 109 Aktivitätseinheiten je 11 Kulturflüssigkeit.
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1 Blatt Zeichnungen
Claims (2)
1. Verfahren zur Herstellung von menschlichem leuko-zytärem Interferon Alpha-2 durch die Submerskultivierung eines ein Plasmid mit dem darin integrierten Gen des menschlichen leukozytären Interferons Alpha-2 enthaltenden Produzentenstammes auf einem Nährmedium, das Kohlenstoff-, Stickstoffquellen, Mineralsalze und Wuchsstoffe enthält, unter aeroben Bedingungen in Gegenwart eines Antibiotikums, anschliessendes Isolieren und darauffolgende Reinigung des Endprodukts, dadurch gekennzeichnet, dass man als Produzentenstamm einen Stamm Pseudomonas species VG-84 mit einem Plasmid pVG3, SRIA Nr. 1742 verwendet und die Kultivierung des Produzentenstammes in Anwesenheit des Antibiotikums Streptomyzin oder Tetrazyklin oder eines Gemisches derselben durchführt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass Tetrazyklin in einer Menge von 30 bis 50 mg/1 und Streptomyzin in einer Menge von 50 bis 150 mg/1 eingesetzt wird.
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