HU203579B - Process for producing fusion-proteins - Google Patents

Process for producing fusion-proteins Download PDF

Info

Publication number
HU203579B
HU203579B HU864872A HU487286A HU203579B HU 203579 B HU203579 B HU 203579B HU 864872 A HU864872 A HU 864872A HU 487286 A HU487286 A HU 487286A HU 203579 B HU203579 B HU 203579B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
plasmid
sequence
protein
amino acid
fusion protein
Prior art date
Application number
HU864872A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT43642A (en
Inventor
Paul Habermann
Friedrich Wengenmayer
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HUT43642A publication Critical patent/HUT43642A/hu
Publication of HU203579B publication Critical patent/HU203579B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás eukarióta proteinek előállítására géntechnológiai úton. A proteinek expresszióját a 2-interleukint kódoló DNS-ból származó „nyitott olvasóraszter” segítségével végezzük.
Kisebb (mintegy 15 000 daltonig terjedő) mól tömegű, diszulfid-hidakat tartalmazó eukarióta proteinek géntechnológiai előállításakor baktériumokban a hozam gyakran alacsony. Feltételezhető, hogy a gazdasejt saját proteáz enzimjei a képződött proteint hamar lebontják. Ezért célszerű olyan génszerkezet létrehozása, amely fúziós proteint kódol; a fúziós protein nem kívánt része a gazdasejt egyik proteinje, ezt a részt később lehasítják.
Azt találtuk, hogy lényegében a 2-interIeukin Nterminális részének első 100 aminosavának megfelelő más. Primer termékként tehát teljesen vagy legnagyobb részében eukarióta proteinből álló fúziós protein keletkezik. Feltehető, hogy a gazdasejt a protein idegen voltát nem fedezi fel, ezért nem is bontja le a terméket. Előnyös továbbá, hogy a találmány szerint előállított fúziós proteinek nehezen oldódó, illetve oldhatatlan vegyületek, ezért egyszerű módon, célszerűen centrifugálissal választhatók el az oldott proteinek mellől.
Tekintve, hogy a fúziós protein interleukinrésze csak „ballasztként” szerepel, nem játszik szerepet az a tény, hogy az interleukin biológiailag aktív molekula. Ezért nem szükséges az interleukinnel való teljes azonosság. A találmány céljaira elég, ha lényegében az N-terminális rész első 100 aminosav van jelen. így az N-terminális részt olyan módon variálhatjuk, hogy a kívánt protein lehasíthatóvá váljék (amennyiben az N-terminálishoz kötődik). Ha a kívánt protein - a szokásos módon - C-terminálisan kötődik a fúziós proteinben, a lehasíthatóság érdekében a C-terminálist módosítjuk.
A humán 2-interleukint (az alábbiakban 2-IL) kódoló természetes DNS-szekvencia az EP-A1-0 091539 szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésből ismert. Az említett bejelentés égés és patkány 2-IL-re is kiterjed; ez az emlős 2 EL szintén alkalmazható a találmány szerinti protein-szintézishez, előnyösebb azonban, ha szintetikus DNS-ből indulunk ki. Különösen előnyös a 0 163 248 szám alatt publikált európai bejelentésnek megfelelő, köre nem bocsátott 34 19 995 számú NSZK-beli szabadalmi bejelentésben leírt DNS, amely humán 2IL-t kódol. Ezt a szekvenciát az 1. mellékletben tüntettük fel. E szekvenicának az az előnye, hogy kodonjai a leggyakrabban használt gazdasejtnek, az E. coli adottságaihoz illenek, továbbá, hogy néhány restrikciós endonukleázos vágóhelyet tartalmaz, amely a találmány szerinti eljárás során felhasználható. Az alábbi I. táblázatban a DNS-eleje és 100. aminosava közötti részben fellelhető előnyös vágóhelyeket tüntettük fel, a két vágóhely közötti részt kívánt esetben módosíthatjuk, a fent említett szabadalmi bejelentésben ismertetett további vágóhelyek felhasználásával.
1. táblázat
Restrikciós enzim felismerés szekvenciája A felismerés szekvenciája elsőnukleotidjének helye a kódoló szálon
AhaII,BanI 5’ 3’
Hae Π, Nar I Bán Π, Sac I GGCGCC 8
SstI GAGCTC 291
Hhal GCGC 9
HinfI GACTC 35
Pvul CGATCG 346
Taql TCGA
Amennyiben a Bán Π, Sac I vagy Ssr I nukleázt alkalmazzuk, mintegy 95 aminosavat kódoló 2-ILrészszekvenciát kapunk. A lánc ezen hossza általában elég ahhoz, hogy oldhatatlan fúziós protein keletkezzék. Olyan esetben, ahol - például hidrofileukarióta protein esetén - az oldódás még mindig túl jó, de a minél kevesebb ballaszt termelése érdekében a C-terminálishoz közelebb eső vágóhelyet nem kívánunk felhasználni, az N- és/vagy C-terminális végét képező DNS-szekvenciát megfelelő adapter, illetve linker alkalmazásával meghosszabbíthatjuk, úgyszólván méretre szabott ballasztot alakítva ki. Természetesen a DNS-szekvenciát többé-kevésbé a teljes terjedelmében is hasznosíthatjuk, így - adott esetben módosított - biológiaüag aktív 2-IL-t kapunk melléktermékként, illetve kettős hatású proteint alakítunk ki, amely a 2-EL hatáson túlmenően a kódolt protein hatásával is rendelkezik.
A találmány tárgya tehát eljárás la és Ib képletű fúziós proteinek előállítására
Met-X-(Y)m-Z Met-Z-(Y)m-X (la) (ib) ahol
Z a célfehérjét vagy -pepiidet jelenti,
X jelentése 2-IL, előnyösen emberi 2-D első 90133 aminosavának szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav cseréjével megváltoztatott variánsa,
Y jelentése 1-4 aminosavból álló híd, amely kémiai úton vagy enzimesen hasítható, illetve lehasítható és m jelentése zéró, ha a kívánt proteinhez szomszédos aminosav a kívánt protein lehasítását lehetővé teszi, máskülönben m jelentése 1,2,3 vagy 4.
Ahogy az (la) és (Ib) képletek mutatják és a fentiekben már említettük, a kívánt proteint a 2-IL-rész előtt, de utána is kifejezhetjük. Az egyszerűség kedvéért az alábbiakban főleg az első lehetőséget ismertetjük, amely a fúziós proteinek hagyományos előállításának felel meg; e klasszikus” módszer ismertetése azonban a másik lehetőséget nem zárja ki.
A fúziós protein hasítása önmagában ismert módon kémiai vagy enzimes úton történhet. Az alkal-2HU 203579Β más módszer főleg a kívánt protein aminosavszekveniájától függ. Amennyiben a protein nem tartalmaz metionint, Y helyén Met állhat, és klór-, illetve brómciánnal végzett kémiai hasítás lehetséges. Ha az Y jelű közbenső tag a karboxilterminálisan ciszteint tartalmaz, vagy Y jelentése Cys, cisztein-specifikus enzimmel vagy kémiailag, például előzetesen végzett specifikus S-cianilezés után lehet hasítani. Amennyiben az Y jelű áthidaló tag a karboxilterminálisan triptofánt tartalmaz, vagy Y jelentése Trp, a kémiai hasítás N-bróm-szukcinimiddel lehetséges.
Az aminosav-szekvenciában Asp-Pro-t nem tartalmazó és máskülönben savval szemben eléggé ellenálló proteineket ismert módon proteolítikusan hasítunk. Ez úton N-terminálisan prolint, illetve Cterminálisan aszparaginasvat tartalmazó proteint, azaz módosított proteint állíthatunk elő.
Az Asp-Pro-kötést még jobban savérzékennyé lehet tenni, ha az áthidaló tag jelentése (Asp)n-Pro vagy Glu-(Asp)n-Pro, ahol n jelentése 1,2 vagy 3.
Enzimes hasításra is ismertek példák, és módosított, azaz javított specifitású enzimek alkalmazása is lehetséges [C. S. Craik és mts-i, Science 228 (1985), 291-297]. Ha kívánt eukarióta peptidként humán proinzulint akarunk nyerni, az Y jelű szekvenciaként olyan peptidszekvenciát választhatunk, amely a proinzulin N-terminális amínosavához (Phe) kapcsolódó, tripszinnel lehasítható aminosavat (Arg, Lys) tartalmaz, így Y lehet például AlaSer-Met-Thyr-Arg, és az arginin-specifikus hasítást tripszin proteázzal lehet végezni.
Amennyiben a kívánt proteinben az De-Glu-GlyArg aminosavszekvencia nem szerepel, a hasítás az Xa faktorral is végezhető (0161937 sz. európai szabadalmi bejelentés).
A fúziós proteint alkalmas expressziós rendszerben ismert módon exprimál juk. Bármely gazdavektor-rendszer alkalmas, tehát például emlős sejtek és mikroorganizmusok, így élesztők, de előnyösen baktériumok, különösen előnyösen E. Coli.
A kívánt proteint kódoló DNS-szekvenciát ismert módon olyan vektorba építjük, amely a választott expressziós rendszerben jó expressziót biztosít.
Ha a gazdasejt baktérium, előnyösen a λ-fág Lac, Tac, Pl vagy Pr csoportjából választunk promotort és operátort, alkalmasak hsp, omp vagy szintetikus promotorok is, amelyeket a 3 430 683. számú európai szabadalmi bejelentés) ismertet. Előnyös a tac promotor-operátor-szekvencía, amely most már kereskedelmi termék (pl. a pKK223-3 expressziós vektor, Pharmacia, „Molecular Biolpgicals, Chemicals and Equipment fór Molecular Biology, 1984, 63. old.).
A fúziós protein expressziója során célszerű lehet, ha az ATG indító kodont követő első aminosavak egyes triplettjeit megváltoztatjuk, hogy a küldönc RNS szintjént esetleg bekövetkező bázispár képződést megakadályozzuk. Az üyen módosítások, mint ahogy a 2-IL-részben egyes aminosavak megváltoztatása, kihagyása vagy hozzáadása is szakember számára ismert műveletek, és a találmány ezekre is kiterjed.
Az alábbi példákkal a találmányt a rajzok alapján közelebbről ismertetjük. Az
1. ábra, valamint annak folytatása, az la. ábra a hirudin-szekvenciát tartalmazó fúziós proteint kódoló pK360 plazmid előállítására szemlélteti, a
2. ábra, valamint annak folytatása, a
2a. ábra a pK410 plazmid szintézisét mutatja; ez a plazmid szintén egy, a hirudin aminosav-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódol; a
3. ábra, és folytatását képező
3a-3c. ábrák a pH 15,16,20 és 30 plazmidok szerkesztését ábrázolják, e plazmidok a majom-proinzulins aminoasv-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódolnak. A
4. ábra a pH 100 plazmid szintézisét ábrázolja, a benne kódolt fúziós protein a hirudin aminosav-sorozatát tartalmazza. Az
5. ábra, valamint annak folytatása, az
5a. ábra a pK 370 plazmid szerkesztését mutatja; szintén olyan fúziós proteint kódol, amely a hirudin-szekvenciát tartalmazza, míg a
6. ábra, valamint annak folytatása, a
6a. ábra a pHIOl plazmid szintézisét szemlélteti; e plazmid egy, a majom-proinzulin aminosav-sorozatát tartalmazó fúziós proteint kódol.
A példákban alkalmazott vektorok, plazmidok és baktériumok az alábbiak szerint hozzáférhetők:
pKK 223-3 és pUC 12: a kereskedelmi forgalomban kapható plazmidok, a Pharmacia Inc. USA-beli cég 1984-ben kiadott gyártmányismertetőjének 58., illetve 63. oldalán szerepelnek.
pKK 177-3: Amannetal.,Gene 25,167/1983 p 159/6:34 19 955 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat. A 3. példában említett (26) jelű DNS-szekvencia előállítását is ez a közrebocsátási irat ismerteti.
E. coli HB101
E. coli MM 294: az ATCC-katalógusban 33694, illetve 39604 szám alatt szerepel.
A rajzok nem méretarányosak, főlega polilinkerek feltüntetésekor „nyújtás” történt.
A példákban említett műveletek egy részét T. Maniatis, E.F. Fritsch és J. Sambrook „Molecular Cloning, a Laboratory Manual” c. könyvében (Cold Spring Habor Laboratory, New York, 1982) részletesen és reprodukálhatóan leírták. Tekintettel arra, hogy a következő példákban e műveletek többszörösen szerepelnek, az alábbiakban hivatkozási listát közlünk, amelyben hivatkozási szám mellett az adott műveletek és a fent említett könyv egy-egy oldalszáma szerepel; a példa vonatkozó részében csak a hivatkozási számot adjuk meg, amelyhez a lista alapján a pontos irodalmi hely nehézség nélkül hozzárendelhető.
1. DNS vágása, plazmid nyitása: 104. oldaltól kezdve, valamint az enzimet előállító cég prospektusa
2. DNS utókezelései
2.1 Rövidítés
2.1.1 Exonuklázos kezelés rövidítés céljából: A BamHl enzimet alkalmaztuk, lásd 135. oldal
2.1.2 túlnyúló végek levágása: 140. oldal
2.1.3 túlnyúló végek feltöltése: 113.oldal
3. DNS-fragmensek izolálása
A DNS-fragmensek szétválasztása gél-elektroforézis útján, agaróz-gél segítségével (150-172. oldal), vagy - rövid, azaz 1 kb-nál kisebb fragmensek ese3
-3HU 203579Β tén - poliakrilamid-gél segítségével (173-181. oldal) történik.
4. Ligálás: 146., valamint 390-301. old.
5. E coli sejtek transzformálása: 249-251. old.
6. Azonosítás
6.1 Szélesztés: 55-61., 68-79. és 249-250. old.
6.2 Restrikciós elemzés: 104. old.
6.3 szekvencia elemzés: 475. old.
A hivatkozási számokat szögletes zárójelben [] tüntetjük fel, hogy a rajzokra való hivatkozásoktól megkülönböztethetők legyenek.
1. példa
A lac-represszort (P. J. Farabaugh, Natúré 274 (1978), 756-769) a pKK 177-3 plazmidba (Amann és munkatársai, Gebe 25 (1983) 167) juttatva a pJF 118(1) plazmidot kapjuk (1. ábra: P 35 26 995.2. sz. NSZK-beli szabadalmi bejelentés 6. példája és 6. ábrája). Ezt az Ava I restrikciós enzim kizárólagos vágóhelyénél megnyitjuk [1] és ismert módon exonukleázzal kezelve [2.1.1] mintegy 1000 bázispárral rövidítjük. Ligálás [4] után a pEW 1000 (2) plazmidot (1. ábra) kapjuk. A plazmid a teljes lac-represszor-gént tartalmazza, ugyanakkor a kicsinyítés következtében szignifikánsan magasabb darabszámban fejeződik ki, mind a kiinduló plazmid.
A pKK 177-3 plazmid helyett a már említett, kereskedelmi forgalomban levő pKK223-3 plazmádból is indulhatunk ki, ez esetben is a lac-represszor beépítése után a plazmidot rövidítjük.
a pEW 1000 plazmidot (2) az EcOR I és Sál I resktrikciós enzimmel megnyitjuk (3) [ 1 ].
A hirudint kódoló plazmidot (4) (előállítva a 34 29 430 sz, NSZK-beli közrebocsátási irat 4. példája és 3. ábrája szerint: ez a 0 171024 szám alatt közzétett európai szabadalmi bejelentésnek felel meg), az Acc I és Sál I restrikciós enzimmel megnyitjuk [1], és az (5) számú, majdnem teljesen a hirudin-szekvenciából álló kis fragmenst elkülönítjük [3],
A pl59/6 plazmidot (6) (előállítva a 34 19 995. számú NSZK-beli közrebocsátási irat 4. példája szerint; ez a O 163 249. szám alatt publikált európai szabadalmi bejelentésnek felel meg) az Ecó Rí és Pvu I restrikciós enzimmel megnyitjuk [1], és a 2IL-szekvencia legnagyobb részét tartalmazó kis fragmenst (7) elkülönítjük [3], Ezt a rész-szekvenciát - a későbbiekben más rövidített 2-IL-szekvenciákat is - a rajzokon „AIL2”-ként jelöltük meg.
A (3), (5) és (7) jelű szekvenciát, valamint az la. rajzon (8) szám alatt szereplő szintetikus DNSszekvenciát T4-ligázzal kezeljük [4], ami a pK360 plazmidhoz (9) vezet.
A ligális termékét kompetens E. coli sejtekbe juttatjuk [5] és a sejteket 25 pg/ml ampicillint tartalmazó tápagar lemezeken szélesztjük [6.1]; a kiónok plazmid DNS-ét restrikciós [6.2] és szekvenciaelemzéssel [6.3] jellemezzük.
A (9) jelű plazmidot tartalmazó E. coli transzformáit egyedekből álló, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) egy éjszakán át tenyésztett kultúrából mintegy 1:100 új tenyészetet állítunk be, és a növekedést OD-méréssel figyeljük. OD - 0,5 értéknél a tenyészethez annyi izopropil-p-D-galaktopiranozidot (IPTG) adunk, hogy koncentrációja a közegben 1 mmól legyen. 150-180 perc elteltével a baktériumokat lecentrifugáljuk, 5 percen át pufferoldatban (7 M karbamid, 0,1 % SDS, 0,1M nátrium-foszfát, ph 7) forraljuk, majd mintákat SDS-gél-elektroforézis lemezre viszünk. A (9) jelű plazmidot tartalmazó baktériumok az elektroforézis során olyan proteinsávot adnak, amely a várt fúziós protein móltömegének megfelel. Á baktériumok feltárása (French Press; (K'Dyno-malom) és centrifugálása után a fúziós protein a csapadékban van, így a felülúszó rész eltávolításával a többi protein zömét már elválasztjuk.
Az elkülönítés után brómciános hasítással felszabadítjuk a kívánt hirudin-peptidet. Ehhez 4 g nedves fúziós proteint (szárazanyag tartalom kb. 25 tömeg%) 10 ml 98-100%-os foszforsavban oldunk, és az oldathoz 0,5 g brómciánt adunk. Az elegyet 40 °C-on 6 órán át reagálni hagyjuk, utána 100 ml vízzel hígítjuk és fagyasztva szárítjuk.
A BrCN-hasi tás során kapott termék 5 g-ját 0,1 liter pufferben (6 M karbamid, 0,1 M trisz-HCl, pH 8,5) oldjuk, az oldatot 30 °C-ra melegítjük, és 5 g nátrium-szulfotot, valamint l,25gnátrium-tetrationátot adunk hozzá. 90 perc elteltével az oldatot azonos térfogatú vízzel hígítjuk és FRAKTOGEL TSK DEAE-650M gélen kromatografáljuk. Eluensként 0,05 M-tól 0,5 M-ig változó NaCl-gradienst (6 litert) alkalmazunk. A hirudin-tartalmú frakciókhoz a hétszeres mennyiségű acetont adva a proteint kicsapjuk. A csapadékot 20 ml vízzel mossuk, majd fagyasztva szárítjuk.
A protein hajtogatása, valamint a diszulfid-hidak kialakítása céljából a kapott S-szulfonátot 50 ml puffer-oldatban (8 M karbamid, 0,02M triszHCl, pH 7,5) oldjuk, és néhány csepp oktanol adagolása után 15 percen át nítrogéngázt vezetünk az oldaton keresztül. Ezt követően 16 ml 2-merkaptoetanolt adagolunk, és az elegyet szobahőmérsékleten egy órán át keverjük. Az oldatot 5x60 cm méretű SEPHADEX G25 adszorbenssel töltött kromatográfiás oszlopra adjuk és 300 ml puffer-oldattal (0,05 M glicin/trisz-HCl, pH 8,5, 3 mM glutation, 0,5 mM glutation-diszulfid) eluáljuk. Az eluátumot 4 °C-on 2 napon keresztül állni hagyjuk, utána ultraszűréssel töményítjük. Ezt követően a protein-elegyet fordított fázisú nagynyomású folyadékkromatográfiásán (szilikagél RP 18, eluens: 20%-tól 50%ig változó acetongradiens 0,1 %-os trifluor-ecetsavban) szétválasztjuk és a hirudin-tartalmú frakciókat összegyűjtjük. A proteint szekvencia-elemzéssel [6.3] azonosítjuk.
Az itt megadott indukciós körülmények rázott tenyészetre érvényesek; nagyobb térfogatú fermentálás esetén megfelelően megváltozott OD-értékek és adott esetben némiképp módosított IPTG-koncentrációk alkalmazandók.
2. példa
A (4) plazmidot (1. ábra) AccI enzimmel megnyitjuk [1], és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük [2.1.3]. Ezt követően Sac I enzimmel vágjuk [1 ], így a hirudin-szekvencia legnagyobb részét tartalmazó (10) fragmenst kapjuk, A kereskedelemben kapható pUC 13 vektort a Sac I és Sma I
-4HU 203579Β restrikciós enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a (11) jelű nagy fragmenst izoláljuk [3; agaróz-fél].
Ezt követően a két fragmenst (10 és 11) T4-ligázzal a pK 400 jelű, (12) számú plazmiddá ligái juk [4], Ezt a plazmidot a 2. ábrában kétszer ábrázoltuk; az alsó rajzon a kapható hirudin-származék aminosavszekvenciája látható.
A (4) plazmidot (1. ábra) Κρη I és Sál I restrikciós enzimekkel megnyitjuk [1] és a hirudin rész-szekvenciát tartalmazó kis (13) fragmenst izoláljuk [3]. Az 1 a. ábrán (9) számmal jelölt plazmidot Ecor I enzimmel parciálisán vágjuk [ 1 ], a szabad végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük (”fill in” reakció) [2.1.3], majd Sál I enzimmel vágjuk [1]. így a pK.360 plazmid (15) jelű származékot kapjuk.
A (3), (13), (14) és (15) fragmenseket ligáivá a 2a. sz. rajzon kétszer feltüntetett pK410 plazmidot (16) kapjuk; az alsó rajz a fúziós protein, illetve a savval végzett hasítás után kapott hirudin aminosav-sorozatát mutatja.
A kifejezés és az 1. példa szerint végzett feldolgozás után új hirudin-származékot kapunk, amely az 1-es és a 2-es helyzetben prolint, illetve hisztidint tartalmaz. Ez a hirudin ugyanolyan aktivitást mutat, mint a 34 29 430 sz, NSZK-beli közrebocsátási iratban ismertetett természetes hirudin, amely az említett pozíciókban treonint és tirozint tartalmaz. Az új hirudin-származék azonban aminopeptidáz enzimekkel szemben ellenállóbb, amiből előnyök adódhatnak az in vivő alkalmazás során.
3. példa
A kereskedelmi forgalomban beszerezhető pBR 322 vektort BamH I enzimmel megnyitjuk [ 1 ]. A kapott kiegyenesített (17) plazmid szabad végeit dATP, dGTP és dTTP (nukleotid-trifoszfátok) segítségével feltöltjük, és a túlnyúló G nukleotidot S1 nukleázzal lebontjuk [2.1.2], így a pBR 322 plazmidot (18) sz. származékát kapjuk.
A majom-proinzulinból származó Hae ΙΠ fragmenst (19) (Wetekam és munkatársai, Gene 19 /1982/ 181) a módosított (18) plazmiddal ligái juk [4], így a pPH 1 (20) plazmidot kapjuk. Az inzulinrészszekvencia a tetraciklin-génben helyezkedik el, ezért a pPH 1 plazmidot tartalmazó kiónok tetraciklinnel szemben nem reziksztensek, és ennek révén azonosíthatók [6.1].
A (20) plazmidot BamH I Dde I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ], és a (21) kis fragmenst izoláljuk [3].
Járulékosan a majom proinzulin szekvenciájából a Dd I és Pvu Π vágóhelyek közötti (22) rész különítjük el [1; 3].
Az inzulin (21) és (22) részszekvenciáit a megnyitott (23) plazmiddal ligáivá [4] a pPH5 plazmidot (24) kapjuk. Ezt BamHI és Pvu Π enzimmel megnyitjuk [1] és a kis (25) fragmenst izoláljuk [3]. Az inzulin szerkezetének kiegészítése céljából a (26) DNS-szekvenciát szintetizáljuk.
A kereskedelemben kapható pUC 8 vektort BamH I és Sál I enzimekkel megnyitjuk [1] és a (27) maradék plazmidot izoláljuk [3]. Ezt a (25) és (26) DNS-szekvenciákkal a (28) pPH 15 plaziddá ligáljuk [4], amelyet Sál I enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.2], A kapott (29) plazmid-származékból Bam Η I enzimmel a (30) szekveniát lehasítjuk [ 1 ].
A pUC 9 vektort (kereskedelmi termék) BamH I és Sma I enzimmel megnyitjuk és a nagy (31) fragmenst izoláljuk [1;3]. Ezt a fragmenst a (3) DNSszekvenciával ligái juk [4], így a (32) pPH 16 plazmidot kapjuk.
A (32) plazmidot Sál I enzimmel megnyitjuk, a kapott kiegyenesített (33) plazmidot dCTP, dGTP és dTTP alkalmazásával parciálisán feltöltjük [2,1,3], és a megmaradt T nukleotidot SÍ-nukleázzal lehasítjuk [2.1.2], A kapott (34) plazmidot BamH I enzimmel kezeljük [ 1 ], és a (35) termékből S1 -nukleázzal a túlnyúló GATC-szálat eltávolítjuk [2.1.2], így a (36) plazmidhoz jutunk.
A (36) plazmid tompa végeit a (37) pPH 20 plazmiddá cüdizáljuk [4],
Kompetens E. coli HB 101 sejteket a ligáit eleggyel transzfomálunk [5] és szelektív táptalajon szélesztünk [6.1]. A kívánt plazmidot tartalmazó kiónok proinzulint exprimálnak: 70 megvizsgált klón közül 28-ban volt radioimmunológiaüag kimutatható proinzulin. A plazmidokat DNS-szekvenciaelemzéssel is azonosítjuk [6.3]. A bennük levő DNS a B-lánc első aminosavjának (Phe) kodon ja előtt arginint kódol.
A (37) plazmidot Hind III enzimmel megnyitjuk [1], a túúínyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Dde I enzimmel utóvágjuk [ 1 ]. A kis (38) fragmenst izoláljuk [3].
A 3a rajzon (28) számmal szereplő plazmidot Sál I és Dde I enzimmel megnyitjuk és a kis (39) grafmenst elkülönítjük [ 1 ;3].
A (9) plazmidot (la.ábra) először AccI enzimmel megnyitjuk [ 1 ], a szabad végeket feltöltjük [2.1.3] és EcoR I enzimmel részlegesen utóvágjuk. A rövidített 2-IL-szekvenciát tartalmazó (40) fragmenst izoláljuk [3].
A kiegyenesített (3) plazmidot (1. ábra) a (38), (39) és (40) DNS-szegmensekkel ligái juk [4]. A kapott (41) plazmid olyan fúziós proteint kódol, amely a 2-IL1-114. aminosavja után az Asp-Phe-Met-BeThr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg szekvenciát tartalmazza. Az arginin mint az áthidaló tag utolsó aminosava lehetővé teszi az inzulinláncok tripszinnel végzett lehasítását.
A (9) plazmidból (la. ábra) kiindulva az alábbi úton is juthatunk a (41) plazmidhoz: a (9) plazmidot AccI enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3] és Sál I enzimmel utóvágjuk [1], majd a kapott (42) plazmidszármazékot a (3) és (39) szegmensekkel ligáljuk [4],
4. példa
A (6) plazmidot (1. ábra) a Taq I és EcoR I restrikciós enzimekkel megnyitjuk [1] és a (43) kis fragmenst izoláljuk [3]. Ezt a fragmenst a (44) szintetikus DNS-szekvenciával és a (3) és (5) szegmensekkel a (45) pPH 100 plazmiddá ligáljuk [4]. Ez a plazmid olyan fúziós proteint kódol, amelyben a 2-IL első 132 aminosava után az Asp-Pro képletű áthidaló tag, majd ezután a hirudin aminosav-szekvenciája következik. A fúziós protein proteolítikus hasítása módosított, biológiailag aktív 2’-IL-t ad (amelyben a 133. helyen Thr helyett Asp van), amellett olyan hirudin-származékot, amely a természetes termék
-5HU 203579Β aminosav-sorozata előtt N-terminálisan Pro-t tartalmaz. Ez a termék szintén biológiailag aktív, ugyanakkor proteázokkal szemben a természetes hirudinnál ellenállóbb.
A 2’-IL-es fúziós protein biológiai aktivitást mu- 5 tatott olyan sejtproliferációs tesztben, amelyet 2EL-től függő sejtvonallal (CT 112) végeztünk (D,
Stull ésS. Gillis, J. Immunoi. 126,1680-1683/1981/;
539 sz. európai szabadalmi leírás 15. oldala).
A proteint 6 mólos guanidinium-hidrolklorid-ol- 10 dattal denaturálva, majd puffer-oldattal (10 mM trisz-HCl, pH 8,5, 1 mM EDTA) regenerálva továbbra is nagy 2-IL-aktivitást tapasztaltunk. Emellett a fúziós protein savval és trombinnal kezelt vér alvadási idejét meghosszabbította. A kapott fúziós 15 protein tehát kettős hatású.
5. példa
A kereskedelmi forgalomban levő pUC 12 vektort EcoR I és Sac I enzimekkel megnyitjuk [ 1 ] és a 20 kapott (46) kiegynesített plazmidba olyan 2-IL-rész szekvenciát ültetünk be [4], amelyet a 6 plazmidból (1. ábra Eco Rí és Sac I enzimekkel kivágtunk. A (47) szekvencia a 2-IL első 94 aminosavjának komplett triplettjeit tartalmazza. A (46) és (47) 25 fragmenseket ligáivá [4] a (48) pK 300 plazmidot kapjuk.
A (9) plazmidot (la. ábra) Eco Rí enzimmel megnyitjuk [1], a túlnyúló végeket feltöltjük [2,1.3] és Hind ΠΙ enzimmel utóvágjuk [ 1 ]. A hirudint kódoló 30 szekvenciát követően a pUC 12 plazmidból származó polilinker egy részét tartalmazó kis (49) fragmenst izoláljuk.
A (48) plazmidot Sma I és Hind ΙΠ enzimmel megnyitjuk [1] és a nagy (50) fragmenst izoláljuk 35 [3]. A (49) és (50) fragmenst ligáljuk az (51) pK 301 plazmiddá [4],
A ligáit eleggyel kompetens E. coli 294 sejteket transzformálunk [5]. Az (51) plazmidot tartalmazó kiónokat restrikciós elemzéssel [6.2] azonosítjuk; 40 olyan DNS-t tartalmaznak, amely a 2-EL első 96 aminosavjának kodonjait követve 6 aminosavból ál10 ló áthidaló tag kodonjait, majd a hirudin kodonjait tartalmazza.
Az (51) plazmidot Eco Rí és Hind ΠΙ enzimmel megnyitjuk. A kapott kiegyenesített (53) plazmidot az (52) DNS-szekvenciával ligáljuk [4], így az (54) pK 370 plazmidot kapjuk.
Ha az (54) plazmidot az 1. példa szerinti módon E. coli sejtekben kifejezzük, olyan fúziós proteint kapunk, amely a 2-IL első 96 aminosavját követően az
Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr képletű áthidaló tagot, majd utána a hirudin aminosav-szekvenciát tartalmazza.
6. példa
A (41) plazmidból (3. példa; 3a. ábra) az Eco Rí és Hind ΙΠ restrikciós enzimekkel a majom-proinzulint kódoló DNS-szegmenst kivágjuk [ 1 ]. A túlnyúló végeket feltöltjük [2.1.3], így az (55) DNS-szegrnenst kapjuk.
A (48) plazmidot (5. példa, 5. ábra) Sma I enzimmel megnyitjuk [1] és alkálikus marhafoszf átázzál kezeljük [Maniatis fent említett könyve 133. oldala]. Az így kapott kiegyenesített (56) plazmidot az (55) DNS-szegmenssel ligáljuk az (57) plazmiddá [1], A ligáit eleggyel E. coli 294 sejteket transzformálunk [5], és a kívánt plazmidot tartalmazó kiónokat először restrikciós elemzéssel [6.2], majd a plazmid-DNS szekvencia-elemzésével [6.3] azonosítjuk.
Az (57) plazmidból Eco Rí és Hind ΙΠ enzimmel a 2-IL-t és a majom-proinzulint kódoló (58) szegmenst kivágjuk [1],
A (2) plazmidot (1. példa, 1. ábra) szintén Eco Rí és Hind ΠΙ enzimmel megnyitjuk, és az így kiegyenesített (53) plazmidba az (58) szegmenst belelifáljuk [4]. így az (59) pKH 101 plazmidhoz jutunk.
Az 1. példa szerint exprimálva olyan fúziós proteint kapunk, amely a 2-IL első 96 aminosavja után 14 aminosavból álló áthidaló tagot (az 58 DNSszegmens Y-ját), majd a malomproinzulin aminosav-szekvenciát tartalmazza.
I. sz. melléklet: a 2-interleukin aminosav-sorozata
Triplett sorszáma 0 12
aminoav nukleotid sorszáma kódoló szál nem kódoló szál 5’ AA 3’ 1 TTC Met ATG G Alá GCG TAC Pro 10 CCG CG(GGC
3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu
20 30 40
ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG
TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC
13 1415 16 17 18 19 20 21 22
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin
50 60 70
CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG
GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC
-6HU 203579Β
12
I. sz. melléklet: a 2-mterleukin aminosav-sorozata folytatása
23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Met De Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys
80 90 100
ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA
TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT
33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe
110 120 13
AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC
TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG
43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Alá Thr Glu
140 150 160
AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA
TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu
170 180 190
CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG
GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC
63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu
200 210 220
CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG
GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82
Alá Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro
230 240 250
GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG
CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC
83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Arg Asp Leu De Ser Asn He Asn Val Ile
260 270 280
CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC
GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG
93 94 95 96 97 98 99 100 101 102
Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr
290 300 310
GTT CTG GAG CTC AAA GGT TCT GAA ACC ACG
CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC
103 104 105 106 107 108 109 110 Tll 112
Phe Met Cys Glu Tyr Alá Asp Glu Thr Alá
320 330 340
TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG
AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC
113 114 115 116 117 118 119 120 121 122
Thr He Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp He
350 360 370
ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC
TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG
-7HU 203579Β
14
I. sz. melléklet: a 2-interleukin aminosav-sorozata folytatása
123 124 125 126 127 128 129 130 131 132
Thr Phe Cys Gin Ser De He Ser Thr Leu
380 390 400
ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG
TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC
133 134 135
Thr 410
ACC RGA TAG 3’
TGG ACT ATC AGC T 5’
SZABADALMI IGÉNYPONTOK

Claims (2)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás la éslbképletű fúziós proteinek előállítására
    Met-X-(Y)m-Z Met-Z-(Y)m-X (la) (Ib) ahol
    Z a célfehérjét vagy -peptidet jelenti,
    X jelentése 2-IL, előnyösen emberi 2-IL első 90133 aminosavának szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav cseréjével megváltoztatott variánsa,
    Y jelentése 1-4 aminosavból álló híd, amely kémiai úton vagy enzimesen hasítható, illetve lehasítható és m jelentése zéró, ha a kívánt proteinhez szomszédos aminosav a kívánt protein lehasítását lehetővé teszi máskülönben m jelentése 1,2,3 vagy 4, azzal
    20 jellemezve, hogy az X szekvenciát kódoló DNSfragmenst, a Z szekvenviát kódoló DNS-fragmenst és kívánt esetben az -(Y)m- hidat kódoló DNS-fragmenst egymással, valamint valamely E.coli-ban exprimálható plazmidból ligái juk, a kapott plazmid25 dal E. coli törzset transzformálunk, a törzset alkalmas tápközegben szaporítjuk, majd a fúziós proteint elválasztjuk.
  2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fúziós proteint centrifugálással vá30 lasztjuk el az oldható proteinek mellől.
HU864872A 1985-11-27 1986-11-25 Process for producing fusion-proteins HU203579B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853541856 DE3541856A1 (de) 1985-11-27 1985-11-27 Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT43642A HUT43642A (en) 1987-11-30
HU203579B true HU203579B (en) 1991-08-28

Family

ID=6286938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU864872A HU203579B (en) 1985-11-27 1986-11-25 Process for producing fusion-proteins

Country Status (17)

Country Link
EP (3) EP0227938B1 (hu)
JP (1) JP2566933B2 (hu)
KR (1) KR950000300B1 (hu)
AT (2) ATE127841T1 (hu)
AU (1) AU595262B2 (hu)
CA (1) CA1341203C (hu)
DE (4) DE3541856A1 (hu)
DK (2) DK172064B1 (hu)
ES (3) ES2077747T3 (hu)
FI (1) FI93471C (hu)
GR (1) GR3005042T3 (hu)
HU (1) HU203579B (hu)
IE (1) IE59488B1 (hu)
IL (1) IL80755A0 (hu)
NO (1) NO176481C (hu)
PT (1) PT83813B (hu)
ZA (1) ZA868943B (hu)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3125021A (en) * 1955-11-14 1964-03-17 Smooth
EP0168342B1 (de) * 1984-06-14 1991-07-03 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren
DE3712985A1 (de) * 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
DE3545568A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-16 Hoechst Ag Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung
DE3819079A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-07 Hoechst Ag Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung
DE3835815A1 (de) * 1988-10-21 1990-04-26 Hoechst Ag Neue isohirudine
DE3844211A1 (de) * 1988-12-29 1990-07-05 Hoechst Ag Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
WO1991000912A1 (en) * 1989-07-07 1991-01-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of hybrid protease inhibitors
CU22222A1 (es) * 1989-08-03 1995-01-31 Cigb Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
DE3942580A1 (de) * 1989-12-22 1991-06-27 Basf Ag Verfahren zur herstellung von hirudin
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
DE4140381A1 (de) * 1991-12-07 1993-06-09 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet
DE4404168A1 (de) * 1994-02-10 1995-08-17 Hoechst Ag Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
DE10033195A1 (de) * 2000-07-07 2002-03-21 Aventis Pharma Gmbh Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
HUE037449T2 (hu) 2008-10-17 2018-08-28 Sanofi Aventis Deutschland Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja
RU2537239C2 (ru) 2009-11-13 2014-12-27 Санофи-Авентис Дойчланд Гмбх Фармацевтическая композиция, включающая агонист glp-1, инсулин и метионин
PE20121316A1 (es) 2009-11-13 2012-10-05 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1 y metionina
PT2611458T (pt) 2010-08-30 2016-12-16 Sanofi Aventis Deutschland Utilização de ave0010 para o fabrico de um medicamento para o tratamento da diabetes mellitus tipo 2
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
PT2750699E (pt) 2011-08-29 2015-11-03 Sanofi Aventis Deutschland Acelerómetro pendular
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
CA2970200A1 (en) 2014-12-12 2016-06-16 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin glargine/lixisenatide fixed ratio formulation
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
KR20200080748A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법
KR20200080747A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
DK108685A (da) * 1984-03-19 1985-09-20 Fujisawa Pharmaceutical Co Vaekstfaktor i
CA1341417C (fr) * 1984-03-27 2003-01-21 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
EP0158198A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3526995A1 (de) * 1985-07-27 1987-02-05 Hoechst Ag Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
US4865974A (en) * 1985-09-20 1989-09-12 Cetus Corporation Bacterial methionine N-terminal peptidase
CA1297003C (en) * 1985-09-20 1992-03-10 Jack H. Nunberg Composition and method for treating animals

Also Published As

Publication number Publication date
DK52292A (da) 1992-04-21
DE3684892D1 (de) 1992-05-21
EP0468539A1 (de) 1992-01-29
ES2077747T3 (es) 1995-12-01
IE59488B1 (en) 1994-03-09
AU6569386A (en) 1987-06-04
DE3541856A1 (de) 1987-06-04
ATE122397T1 (de) 1995-05-15
NO176481C (no) 1995-04-12
FI864798A (fi) 1987-05-28
DE3650322D1 (de) 1995-06-14
FI93471B (fi) 1994-12-30
DK172210B1 (da) 1998-01-05
FI864798A0 (fi) 1986-11-25
IL80755A0 (en) 1987-02-27
ZA868943B (en) 1987-07-29
DK568586D0 (da) 1986-11-26
CA1341203C (en) 2001-03-13
NO176481B (no) 1995-01-02
ATE127841T1 (de) 1995-09-15
NO864759D0 (no) 1986-11-26
KR870005098A (ko) 1987-06-04
JP2566933B2 (ja) 1996-12-25
KR950000300B1 (ko) 1995-01-13
DK172064B1 (da) 1997-10-06
EP0227938A3 (en) 1988-11-23
ES2032378T3 (es) 1993-02-16
DE3650396D1 (de) 1995-10-19
FI93471C (fi) 1995-04-10
GR3005042T3 (hu) 1993-05-24
HUT43642A (en) 1987-11-30
DK52292D0 (da) 1992-04-21
EP0468539B1 (de) 1995-09-13
DK568586A (da) 1987-05-28
EP0227938A2 (de) 1987-07-08
PT83813A (de) 1986-12-01
JPS62143696A (ja) 1987-06-26
EP0464867A1 (de) 1992-01-08
ES2073081T3 (es) 1995-08-01
EP0227938B1 (de) 1992-04-15
EP0464867B1 (de) 1995-05-10
IE863119L (en) 1987-05-27
AU595262B2 (en) 1990-03-29
PT83813B (pt) 1989-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU203579B (en) Process for producing fusion-proteins
DK175217B1 (da) Hirudinanalog, vektorer til ekspression af hirudinanalog, transformerede celler og fremgangsmåde til fremstilling af hirudinanalog
JPH08242881A (ja) 部分的合成遺伝子の発現によるペプチドの製法
JP2533470B2 (ja) 豚成長ホルモンを生産するためのｄｎａ配列，組換ｄｎａ分子および生産方法
US5496924A (en) Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion
KR940005585B1 (ko) 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법
Baty et al. Extracellular release of colicin A is non‐specific.
JPH07113040B2 (ja) 融合タンパク質、その生産方法及びその用途
JPS59156284A (ja) ヒト−レラキシンｈ２遺伝子
HU209747B (en) Process for producing fusion proteins with eukaryotic ballastparts
US5087564A (en) Release of recombinant peptides from polypeptides using V8 endopeptidase
US6171823B1 (en) Process for producing extracellular proteins in bacteria
CA2159079C (en) Methods and dna expression systems for over-expression of proteins in host cells
WO1990004035A1 (en) Recombinant pdgf and methods for production
JPH08503376A (ja) 細菌内の異種遺伝子の発現の間の内因性アミノペプチダーゼ媒介ｎ−末端アミノ酸開裂の防止
EP0745669B1 (en) Mutant staphylococcus aureus V8 proteases
AU643194B2 (en) Recombinant fish hormone proteins
CN100445394C (zh) 控制OmpT蛋白酶切割的方法
AU780429B2 (en) Chlamysin B antibacterial protein, gene encoding it and an expression system for it
JPH04182498A (ja) ポリペプチド
Rhee et al. High-level expression of human insulin-like growth factor II in Escherichia coli
JP2887060B2 (ja) グリセンチンの生産方法
FI97239B (fi) Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi
JPH01165384A (ja) 魚類成長ホルモン及びその製造法
WO1991000355A1 (en) Genetic elements useful in production of active protein

Legal Events

Date Code Title Description
HMM4 Cancellation of final prot. due to non-payment of fee