FI93471B - Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi sekä menetelmän toteuttamisessa käytettäviä tuotteita - Google Patents

Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi sekä menetelmän toteuttamisessa käytettäviä tuotteita Download PDF

Info

Publication number
FI93471B
FI93471B FI864798A FI864798A FI93471B FI 93471 B FI93471 B FI 93471B FI 864798 A FI864798 A FI 864798A FI 864798 A FI864798 A FI 864798A FI 93471 B FI93471 B FI 93471B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
plasmid
fusion protein
sequence
amino acids
amino acid
Prior art date
Application number
FI864798A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI864798A (fi
FI93471C (fi
FI864798A0 (fi
Inventor
Paul Habermann
Friedrich Wengenmayer
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI864798A0 publication Critical patent/FI864798A0/fi
Publication of FI864798A publication Critical patent/FI864798A/fi
Priority to FI925312A priority Critical patent/FI925312A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI93471B publication Critical patent/FI93471B/fi
Publication of FI93471C publication Critical patent/FI93471C/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • C07K14/55—IL-2
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Materials For Medical Uses (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

93471
Menetelmä fuusloprotelinlen valmistamiseksi sekä menetelmän toteuttamisessa käytettäviä tuotteita
Keksintö koskee menetelmää fuusioproreiinin valmis-5 tamiseksi, geenirakennetta, joka koodaa tällaista fuusio-proteiinia, vektoria, joka sisältää mainitun geeniraken-teen, ja vektoria sisältäviä bakteeri-isäntiä sekä plasmi-deja, jotka ovat käyttökelpoisia fuusloprotelinlen valmistuksessa.
10 Keksintö perustuu interleukiini-2:ta koodaavan DNA:n "avoimeen lukuvaiheistukseen” ja tämän DNA:n käyttöön ilmentymisapuneuvona peptidien tai proteiinien tuottamiseksi .
Valmistettaessa eukaryoottisia proteiineja geeni-15 teknisesti saadaan bakteereissa usein pieni saanto, erityisesti pienten proteiinien, joiden molekyylipaino on korkeintaan noin 15 000 daltonia ja joiden rakenne sisältää disulfidisiltoja, ollessa kyseessä. Oletetaan, että isännän omat proteaasit hajottavat nopeasti muodostuneita 20 proteiineja. Siksi on tarkoituksenmukaista muodostaa gee-nirakenteita, jotka koodaavat fuusioproteiineja, joissa fuusioproteiinin epätoivottava osa on isännän oma proteiini, joka poistetaan primaarituotteen eristämisen jälkeen sinänsä tunnetuilla menetelmillä.
25 Nyt on yllättävästi havaittu, että interleukiini- 2:n N-terminaalinen osa, joka vastaa suurin piirtein 100 ensimmäistä aminohappoa, soveltuu erityisen hyvin fuusio-proteiinien valmistamiseen. Primaarituotteena saadaan siis fuusioproteiini, joka kokonaan tai hyvin suurelta osin .. 30 koostuu eukaryoottisista proteiinisekvensseistä. Yllättävästi kyseessä oleva isäntäorganismi ei ilmeisesti tunnista tätä proteiinia vieraaksi proteiiniksi, eikä se heti hajoa uudelleen. Lisäetuna on se, että saatavat fuusiopro-teiinit ovat niukkaliukoisia tai liukenemattomia, ja ne 35 voidaan siten erottaa liukoisista proteiineista yksinkertaisesti, tarkoituksenmukaisesti sentrifugoimalla.
___ I
93471 2
Koska interleukiini-2-osan toimiminen fuusioprote-iinin "painolastiosana" ei ole riippuvainen siitä, että tämä osa on biologisesti aktiivinen molekyyli, ei myös olla riippuvaisia interleukiini-2-osan täsmällisestä ra-5 kanteesta. Tähän tarkoitukseen riittää, että läsnä on suurin piirtein 100 ensimmäistä N-terminaalista aminohappoa. Siten on esimerkiksi mahdollista tehdä N-päähän muutoksia, jotka mahdollistavat fuusioproteiinin poistumisen, jos haluttu proteiini on liittyneenä siihen N-terminaalisesti. 10 Samaten voidaan C-päähän tehdä muutoksia, jotka mahdollistavat halutun proteiinin lohkeamisen tai helpottavat sitä, kun tämä on - kuten tavallista - liittyneenä fuusioproteiinin C-päähän.
Ihmisen interleukiini-2:a, tästedes nIL-2”, koodaa-15 vaa luonnon DNA-sekvenssiä kuvataan EP-hakemusjulkaisussa 0 091 539. Siinä annettu kirjallisuus käsittelee hiiren ja rotan IL-2:ta. Tätä imettäväis-DNA:ta voidaan käyttää keksinnön mukaisesti proteiinien syntetisoimiseen. Tarkoituksenmukaisempaa on kuitenkin lähteä synteettisestä DNA:sta, 20 erityisen edullisesti ihmisen IL-2:ta vastaavasta DNA:sta, jota on ehdotettu (esijulkaisemattomassa) DE-hakemusjulkaisussa 3 419 995 (vastaa EP-hakemusjulkaisua 0 163 249). Tämä synteettinen DNA-sekvenssi annetaan liitteessä (DNA-sekvenssi 1). Tämän synteettisen DNA-sekvenssin etuna ei 25 ole ainoastaan se, että se on kodonivalikoimaltaan useimmin käytetyn isännän, E. colin, kannalta sopiva, vaan myös se, että se sisältää joukon restriktioendonukleaasipilk-koutumiskohtia, joita voidaan keksinnön mukaisesti käyttää hyödyksi. Seuraavassa taulukossa 1 esitetään soveltuvien 30 katkaisukohtien valikoima jakson alusta eli 100 tripletin alueelta. Tällä ei kuitenkaan suljeta pois DNA-muutosten tekemistä välissä olevalla alueella, jolloin voidaan käyttää hyväksi edellä mainitussa patenttihakemuksessa annettuja muita katkaisukohtia.
3 93471
Taulukko 1
Restriktio- Tunnistus- Tunnistussekvenssin entsyymi sekvenssi ensimmäisen nukleo- 5 tidin asema _ (koodaava säie)_ 5' 3' 10 Aha II, Ban I,
Hae II, Nar I, GGCGCC 8
Ban II, Sac I, Sst I GAGCTC 291 15
Hha I GCGC 9
Hinf I GACTC 35 20 Pvu I CGATCG 346
Taq I TCGA 387 25 Jos käytetään nukleaaseja Banll, Sacl tai SstI, saadaan IL-2-osasekvenssi, joka koodaa noin 95 aminohappoa. Tämä pituus on yleensä riittävä liukenemattoman fuu-sioproteiinin saamiseksi. Jos niukkaliukoisuus esimerkiksi halutun hydrofiilisen eukarioottisen proteiinin ollessa 30 kyseessä ei vielä ole riittävä eikä kuitenkaan haluta -mahdollisimman vähäisen "painolastin" aikaansaamiseksi -käyttää lähempänä C-päätä sijaitsevia pilkkoutumiskohtia, voidaan DNA-sekvenssiä pidentää N- ja/tai C-päästä sopivalla adapterilla eli kytkijällä ja "räätälöidä" sillä 35 tavalla "painolasti"-osaa.
Keksintö koskee siten menetelmää fuusloproteiinin valmistamiseksi, jolloin menetelmälle on tunnusomaista, että bakteeri-isäntäsolussa saatetaan geeni ilmentymään, joka koodaa fuusioproteiinia, jolla on C-tai N-terminaali-40 nen osa, joka oleellisesti vastaa interleukiini 2:n (IL-2) vähintään 96 ensimmäistä aminohappoa, mutta jolla ei ole interleukiini-2-aktiivisuutta.
4 93471
Edullisesti geeni koodaa fuusioproteiinia, jolla on yleinen kaava
Met - X - Y - z tai Met - Z - Y - X (la) (Ib) 5 joissa X on oleellisesti ihmisen interleukiini 2:n vähintään 96 ensimmäistä aminohappoa käsittävä aminohapposekvenssi, Y on suora sidos tai geneettisesti koodattavissa olevista aminohapoista koostuva siltajakso, joka mahdol-10 listaa aminohapposekvenssin Z lohkaisun, ja Z on geneettisesti koodattavissa olevista aminohapoista koostuva sekvenssi .
Kuten kaavoista la ja Ib käy ilmi - ja kuten jo edellä mainittiin - on mahdollista saattaa haluttu prote-15 iini ilmentymään IL-2-osan edellä tai jäljessä. Yksinkertaisuuden vuoksi valaistaan jäljempänä pääasiassa ensimmäistä mahdollisuutta, joka vastaa yleistä fuusioproteii-nien valmistusmenetelmää. Kun siis jäljempänä kuvataan tätä "klassista" vaihtoehtoa, ei täten suljeta pois toista 20 vaihtoehtoa.
Fuusioproteiinin pilkkominen voidaan tehdä sinänsä tunnetulla tavalla kemiallisesti tai entsymaattisesti. Soveltuvan menetelmän valinta määräytyy ennen kaikkea halutun proteiinin aminohapposekvenssin mukaan. Jos tämä ei 25 esimerkiksi sisällä metioniinia, voi Y olla Met, jonka kohdalta tapahtuu kemiallinen lohkaisu kloori- tai bromi-syaanilla. Jos yhdistävän jakson Y karboksyylipäässä on kysteiini tai Y on Cys, voidaan tehdä entsymaattinen kys-teiinispesifinen lohkaisu tai kemiallinen lohkaisu, esi-. 30 merkiksi spesifisen S-syanyloinnin jälkeen. Jos yhdistävän jakson Y karboksyylipäässä on tryptofaani tai Y on Trp, voidaan tehdä kemiallinen lohkaisu N-bromisukkinimidillä.
Proteiinit, joiden aminohapposekvenssi ei sisällä paria 35 Asp-Pro 5 93471 ja jotka ovat kyllin happoatabiIleja, voidaan lohkaista sinänsä tunnetulla tavalla proteolyyttisesti. Tällöin saadaan proteiineja, jotka sisältävät N-terminaalisen prolii-niryhmän tai C-terminaalisen asparagiinihapporyhmän. Tällä 5 tavalla voidaan siis syntetisoida myös muunnettuja proteiineja.
Asp-Pro-sidoksesta voidaan tehdä vielä herkempi hapoille, kun tämä välijakso on (Asp)n-Pro tai Glu-(Asp)n-Pro, jolloin n on 1 - 3.
10 Tunnetaan samoin esimerkkejä entsymaattisista loh- kaisuista, joissa voidaan käyttää myös muunnettuja entsyymejä, joilla on parannettu spesifisyys [vertaa C.S. Craik et ai., Science 228 (1985) 291 - 297]. Jos haluttu eukary-oottinen peptidi on proinsuliini, on tarkoituksenmukaista 15 valita sekvenssiksi Y peptidisekvenssi, jossa trypsiinillä lohkeava aminohappo (Arg, Lys) on liittyneenä proinsulii-nin N-terminaaliseen aminohappoon (Phe), esimerkiksi jakso Ala-Ser-Met-Thr-Arg, koska tällöin voidaan tehdä arginii-nispesifinen lohkaisu trypsiiniproteaasilla.
20 Ellei haluttu proteiini sisällä aminohappojaksoa
Ile-Glu-Gly-Arg, voidaan fuusioproteiini pilkkoa tekijä Xa:lla (EP-hakemus-julkaisut 0 025 190 ja 0 161 973).
Fuusioproteiinia muodostetaan sinänsä tunnetulla 25 tavalla soveltuvassa ilmentymissysteemissä tapahtuvan ilmentymisen kautta. Tähän tarkoitukseen soveltuvat kaikki tunnetut isäntävektorisysteemit, siis esimerkiksi nisäkäs-solut ja mikro-organismit, esimerkiksi hiivat ja edullisesti bakteerit, erityisesti E. coli.
. 30 Haluttua proteiinia koodaava DNA-sekvenssi sijoite taan tunnetulla tavalla vektoriin, joka saa aikaan hyvän ilmentymisen valitussa ilmentymissysteemissä.
Bakteeri-isäntien yhteydessä valitaan promoottori ja operaattori tarkoituksenmukaisesti ryhmästä lac, tae, 35 trp, λ-faagin PL tai PR, hsp, omp tai synteettinen pro- _ Γ 6 93471 moottori, joita ehdotetaan esimerkiksi DE-hakemusjulkaisussa 3 430 683 (EP-hakemusjulkaisu 0 173 149). Edullinen promoottori-operaattorisekvenssi on tae, joka sitä paitsi on kauppallisesti saatavissa (esimerkiksi ilmentymisvek-5 tori pKK223-3, Pharmacia, "Molecular Biologicals, Chemi cals and Equipment for Molecular Biology”, 1984, s. 64).
Keksinnön mukaisen fuusioproteiinin ilmentämisen yhteydessä voi osoittautua tarkoituksenmukaiseksi muuttaa ATG-aloituskodonia seuraavia, ensimmäisiä aminohappoja 10 vastaavia yksittäisiä triplettejä mRNA:n tasolla tapahtu van mahdollisen emäspariutumisen estämiseksi. Tällaiset muuttamiset, samoin kuin yksittäisten aminohappojen muutokset, poistot tai lisäykset IL-2-proteiiniosassa, ovat alan ammattimiehen tehtävissä ja sisältyvät keksinnön pii-15 riin.
Keksintöä valaistaan lähemmin seuraavissa esimerkeissä ja piirroksissa. Tällöin kuvio 1 ja sen jatko, kuvio la, esittävät plasmidin pK360, joka koodaa hirudiinisekvenssin sisältävää fuusiop-20 roteiinia, synteesiä; kuvio 2 ja sen jatko, kuvio 2a, esittävät plasmidin pK410, joka samoin koodaa hirudiiniaminohapposekvenssin sisältävää fuusioproteiinia, synteesiä; kuvio 3 ja sen jatko-osat, kuviot 3a - 3c, esittä-25 vät plasmidien pPH15, 16, 20 ja 30 muodostamista, jotka plasmidit koodaavat apinan proinsuliinin aminohapposekvenssin sisältäviä fuusioproteiineja; kuvio 5 ja sen jatko-osa, kuvio 5a, esittää plasmidin pK370, joka koodaa hirudiiniaminohapposekvenssin si-. . 30 sältävää fuusioproteiinia, muodostamista; ja kuvio 6 ja sen jatko-osa, kuvio 6a, esittävät plasmidin pKHIOI, joka koodaa apinan proinsuliinin aminohappo- 7 93471 jakson sisältävää fuusioproteiinia, synteesiä.
Kuvioiden mittakaava ei yleensä ole oikea, ennen kaikkea polykytkijän kohdalla on mittakaavaa "venytetty".
Esimerkki 1 5 Sijoittamalla lac-repressori [P. J. Farabaugh,
Nature 274 (1978) 765 - 769] plasmidiin pKK177-3 [Amann et ai.. Gene 25 (1983) 167] saadaan plasmidi pJE118 (1) (kuvio 1; vert. DE-patenttihakemus P 35 26 995.2, esimerkki 6, kuvio 6). Tämä avataan ainoan Aval-restriktiokohtansa 10 kohdalta ja lyhennetään sinänsä tunnetulla tavalla ekso-nukleaasikäsittelyllä noin 1000 emäsparin verran. Ligaa-tion jälkeen saadaan plasmidi pEWlOOO (2) (kuvio 1), jossa on tallella koko lac-repressorigeeni ja joka kuitenkin esiintyy pienemmän kokonsa ansiosta selvästi runsaslukui-15 sempana.
Plasmidin pKK177-3 sijasta voidaan käyttää lähtö-tuotteena myös edellä mainittua kaupallisesti saatavaa plasmidia pKK223-3, sijoittaa siihen lac-repressori ja lyhentää saatu tuote vastaavalla tavalla.
20 Plasmidi pEWlOOO (2) avataan restriktioentyymeillä
EcoRI ja Sali.
Hirudiinia koodaava plasmidi (4), joka valmistetaan DE-hakemusjulkaisun 3 429 430 (EP-hakemusjulkaisu 0 171 024) esimerkin 4 mukaisesti (kuvio 3), avataan restriktio-25 entyymeillä Accl ja Sali, ja eristetään pieni fragmentti (5), joka sisältää suurimmaksi osaksi hirudiinisekvenssin.
Plasmidi pl59/6 (8), joka valmistetaan DE-hakemus-julkaisun 3 419 995 (EP-hakemusjulkaisu 0 163 249) esimerkin 4 mukaisesti (kuvio 5), avataan restriktioentsyymeillä ; 30 EcoRI ja PvuI, ja eristetään pieni fragmentti, joka sisältää suurimman osan IL-2-sekvenssistä. Tästä osasekvenssistä ja jäljempänä myös muista lyhennetyistä IL-2-sekvens-seistä käytetään kuvioissa merkintää AIL2".
8 93471
Sen jälkeen käsitellään sekvenssit (3), (5), (7) ja synteettinen DNA-sekvenssl (8; kuvio la) T4-ligaasilla. Saadaan plasmidi pK360 (9).
Kompetentit E. coli -solut transformoidaan ligaa-5 tiotuotteella ja siirrostetaan NA-maljoille, jotka sisältävät 25 pg/ml ampisilliinia. Kloonien plasmidi-DNA karakterisoidaan restriktio- ja sekvenssianalyysillä.
E. coli -soluviljelmä, jota on kasvatettu yön yli ja joka sisältää plasmidia (9), laimennetaan LB-alustalla 10 (J. H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold
Spring Harbor Laboratory, 1972), joka sisältää 50 pg/ml ampisilliinia, suunnilleen suhteessa 1:100, ja seurataan kasvua mittaamalla optista tiheyttä (OD). OD-arvon ollessa 0,5 säädetään ravistusviljelmän isopropyyli-B-galaktopyra-15 nosidipitoisuus (IPTG-pitoisuus) arvoon 1 mM, ja bakteerit erotetaan sentrifugoimalla 150 - 180 min:n kuluttua. Bakteereita keitetään 5 min puskuriseoksessa (7 mol/1 ureaa, 0,1 % SDS:ää, 0,1 mol/1 natriumfosfaattia, pH 7,0), ja siirretään näytteet SDS-geelielektroforeesilevylle. Elekt-20 roforeesin jälkeen saadaan bakteereista, jotka sisältävät plasmidia (9), proteiinivyöhyke, joka vastaa odotetun fuu-sioproteiinin kokoa. Bakteerien rikkomisen (French Press; Dyno-MUhle ) ja sentrifugoinnin jälkeen on fuusioproteiini sakassa, niin että supernatantin mukana voidaan jo erottaa 25 huomattavia määriä muita proteiineja. Fuusioproteiinin eristämisen jälkeen vapautetaan haluttu hirudiinipeptidi bromisyaanilohkaisulla. Se karakterisoidaan eristämisen j älkeen proteiinisekvenssianalyysillä.
Annetut indusointiolosuhteet pätevät ravistusvil-: 30 jelmille; suurempien fermentointien ollessa kyseessä ovat vastaavasti muutetut OD-arvot ja mahdollisesti hieman muutetut IPTG-pitoisuudet tarkoituksenmukaisia.
Esimerkki 2
Plasmidi (4) (kuvio 1) avataan Acclrllä, ja täyte-35 tään yksisäikeiset päät Klenow-polymeraasin avulla. Sen
II
9 93471 jälkeen tehdään pilkkominen Sacl:llä, ja eristetään fragmentti (10), joka sisältää suurimman osan hirudiinisek-venssistä.
Kaupallisesti saatava vektori pUC13 avataan rest-5 riktioentsyymeillä Sacl ja Smal, ja eristetään suuri fragmentti (11).
Sitten ligatoidaan fragmentit (10) ja (11) plasmi-diin pK400 (12) (kuvio 2) T4-ligaasin avulla. Plasmidi (12) on esitetty kuviossa 2 kahtena piirroksena, joista 10 alemmassa näkyy täten saatavan hirudiinijohdannaisen aminohapposekvenssi .
Plasmidi (4) (kuvio 1) avataan restriktioentsyy-meillä Kpnl ja Sali, ja eristetään pieni fragmentti (13), joka sisältää hirudiiniosasekvenssin.
15 Plasmidin (12) annetaan reagoida restriktioentsyy- mien Hindi ja Kpnl kanssa, ja eristetään pieni fragmentti (14), joka sisältää hirudiiniosasekvenssin.
Plasmidi (9) (kuvio la) pilkotaan osittain
EcoRI:llä, täytetään vapaat päät Klenow-polymeraasin avul-20 la fill-in-reaktiolla, ja tehdään pilkkominen Sali:11a. Saadaan plasmidin pK360 johdannainen (15).
Ligatoimalla fragmentit (3), (13), (14) ja (15) saadaan plasmidi pK410 (16), joka esitetään kuviossa 2a kahdesti, jolloin alemmassa piirroksessa näkyy fuusiopro-25 teiinin ja siten happopilkkomisella saatavan hirudiinijoh-danna i sen aminohapposekvens s i.
Esimerkin 1 mukaisen ilmentämisen ja käsittelyn jälkeen saadaan uusi hirudiinijohdannainen, jonka asemissa 1 ja 2 on aminohapot proliini ja histidiini. Tällä hiru-. 30 diinijohdannaisella on samanlainen aktiivisuus kuin DE-ha-kemusjulkaisun mukaisella luonnontuotteella, jossa näissä asemissa on aminohapot treoniini ja tyrosiini, mutta se on kestävämpi aminopeptidaasien vaikutusta vastaan, mistä voi olla etua in vivo -käytön yhteydessä.
10 93471
Esimerkki 3
Kaupallisesti saatava vektori pBR322 avataan BamHI:llä, jolloin saadaan linearisoitunut plasmidi (17). Yksisäikeiset päät täytetään osittain käyttämällä dATP:tä, 5 dGTP:tä ja dTTP:tä, ja poistetaan ylimääräinen nukleotidi G Sl-nukleaasilla, jolloin saadaan pBR322-johdannainen (18).
Apinan proinsuliinigeenin [Wetekam et ai., Gene 19 (1982) 181] Haelll-fragmentti (19) ligatoidaan muunnettuun 10 plasmidiin (18), jolloin saadaan plasmidi pPHl (20). Koska insuliiniosasekvenssi sijoitettiin tetrasykliinigeeniin, eivät kloonit, jotka sisältävät tätä plasmidia, ole tetra-sykliiniresistenttejä, ja ne voidaan siten tunnistaa.
Plasmidi (20) avataan BamHI:llä ja Ddel:llä, ja 15 eristetään pieni fragmentti (21).
Lisäksi eristetään apinan proinsuliinisekvenssistä Ddel-PvuII-osasekvenssi (22).
Vektori pBR322 avataan BamHl:llä ja PvuII:lla, ja eristetään linearisoitu plasmidi (23).
20 Ligatoimalla insuliiniosasekvenssit (21) ja (22) avattuun plasmidiin (23) saadaan plasmidi pPH5 (24). Tämä avataan BamHl:llä ja PvuII:lla, ja eristetään pieni fragmentti (25).
Insuliinirakenteen täydentämiseksi syntetisoidaan ·· 25 DNA-sekvenssi (26).
Kaupallisesti saatava vektori pUC8 avataan entsyymeillä BamHI ja Sali, ja eristetään jäännösplasmidi (27). Tämä ligatoidaan DNA-sekvensseihin (25) ja (26) plasmidik-si pPH15 (28). Tämä avataan Sall:llä, ja täytetään yksi-... 30 säikeiset päät. Saadusta plasmidijohdannaisesta (29) loh kaistaan DNA-sekvenssi (30) BamHI:llä.
Kaupallisesti saatava vektori pUC9 avataan entsyymeillä BamHI ja Smal, ja eristetään suuri fragmentti (31). Tämä ligatoidaan DNA-sekvenssiin (30), jolloin saadaan 35 plasmidi pH16 (32).
11 93471
Plasmid! (32) avataan Sali:11a, täytetään linear!-soitu plasmidi (33) osittain dCTP:llä, dGTP:llä ja dTTP:llä, ja lohkaistaan jäljelle jäävä nukleotidi T Sl-nukleaasilla. Siten saatu plasmidijohdannainen (34) käsi-5 tellään BamHIrllä, ja poistetaan tuotteesta (35) ylimääräinen yksinkertainen säie Sl-nukleaasilla, jolloin saadaan plasmidijohdannainen (36).
Plasmidijohdannaisen (35) tylpät päät syklisoidaan plasmidiksi pPH20 (37).
10 Kompetentit E. coli Hb 101 -solut transformoidaan ligaatioseoksella ja siirrostetaan selektiiviselle alustalle. Haluttua plasmidia sisältävät kloonit tuottavat proinsuliinia, ja 70 tutkitusta kloonista 28 sisälsi ra-dioimmunologisesti havaittavissa olevaa proinsuliinia.
15 Plasmidit karakterisoidaan lisäksi DNA-sekvenssianalyysillä. Ne sisältävät DNA:ta, jossa on B-ketjun ensimmäistä aminohappoa (Phe) vastaavan kodonin edellä arginiinia koo-daava kodon!.
Plasmidi (37) pilkotaan HindIII:lla, täytetään yk- 20 sisäikeiset päät ja pilkotaan uudelleen Ddel:llä. Eristetään pieni fragmentti (38).
Plasmidi (28) (kuvio 3a) pilkotaan Sall:llä ja Ddel:llä, ja erotetaan pieni fragmentti (39).
Plasmidi (9) (kuvio la) pilkotaan ensin Accl:llä, “ 25 täytetään vapaat päät ja pilkotaan sitten EcoRI:llä. Eristetään fragmentti (40), joka sisältää lyhentyneen IL-2-sekvenssin.
Linearisoitu plasmidi (3) (kuvio 1) ja DNA-segmen-tit (38), (39) ja (40) ligatoidaan siten plasmidiksi pPH30 ,30 (41). Tämä plasmidi koodaa fuusioproteiinia, joka sisältää --- IL-2:n aminohappojen 1-114 jälkeen seuraavan aminohappo- sekvenssin:
Asp-Phe-Met-Ile-Thr-Thr-Tyr-Ser-Leu-Ala-Ala-Gly-Arg.
12 93471 Tämän välijakson Y viimeisenä aminohappona oleva arginiini mahdollistaa insuliiniketjun lohkaisemisen tryp-siinillä.
Plasmidista (9) (kuvio la) voidaan päästä plasmi-5 diin (41) myös seuraavaa tietä: (9) avataan Accl:llä, täytetään yksisäikeiset päät, pilkotaan Sälillä ja ligatoidaan saatu plasmidijohdannainen (42) segmentteihin (3), (38) ja (39).
Esimerkki 4 10 Kaupallisesti saatava vektori pUC12 avataan rest- riktioentsyymeillä EcoRI ja Sacl. Tähän linearisoituun plasmidiin (46) sijoitetaan IL-2-osasekvenssi, joka lohkaistaan plasmidista (6) (kuvio 1) restriktioentsyymeillä EcoRI ja Sacl. Tämä sekvenssi (47) sisältää IL-2:n 94 en-15 simmäistä aminohappoa vastaavat täydelliset tripletit. Ligatoimalla (46) ja (47) saadaan plasmidi pK300 (48).
Plasmidi (9) (kuvio la) avataan EcoRI:llä, täytetään yksisäikeiset päät ja pilkotaan sitten HindIII:lla. Eristetään pieni fragmentti (49), joka sisältää hirudiinia 20 koodaavan DNA-segmentin jälkeen osan pUC12:n polykytkijäs-tä.
Plasmidi (48) avataan restriktioentsyymeillä Smal ja Hinlll, ja eristetään suuri fragmentti (50). Ligatoimalla (50) (49):ään saadaan plasmidi pK301 (51).
“ 25 Kompetentit E. coli 294 -solut tranformoidaan li- gaatioseoksella. Kloonit, jotka sisältävät plasmidia (51), karakterisoidaan restriktioanalyysillä. Ne sisältävät DNA:ta, jossa on IL-2:n 96 ensimmäistä aminohappoa vastaavien kodonien jälkeen 6 aminohaposta koostuvaa yhdistävää . 30 jaksoa vastaavat kodonit ja sen jälkeen hirudiinia vastaavat kodonit.
Plasmidi (51) käsitellään EcoRI:llä ja HindIII:lla, ja eristetään fragmentti (52), joka sisältää mainittua eukaryoottista fuusioproteiinia vastaavan DNA-sekvenssin. 35 Plasmidi (2) (kuvio 1) avataan EcoRI:llä ja Hindll-
tv K
13 93471 I:11a. Saatu linearisoitu plasmid! (53) ligatoidaan DNA-sekvenssiin (52), jolloin saadaan plasmid! pH370 (54).
Kun plasmid! (54) saatetaan esimerkkiä 1 vastaavalla tavalla ilmentymään E. colissa, saadaan fuusioproteii-5 nia, jossa on IL- 2:n 96 ensimmäisen aminohapon jälkeen välijakso
Ala-Gln-Phe-Met-Ile-Thr ja sen jälkeen hirudiinin aminohappojakso.
Esimerkki 5 10 Plasmidista (41) (esimerkki 3; kuvio 3c) lohkais taan restriktioentsyymeillä EcoRI ja HindiII apinan pro-insuliinia koodaava DNA-segmentti, ja täytetään yksisäi-keiset päät. Saadaan DNA-segmentti (55).
Plasmidi (48) (esimerkki 5, kuvio 5) avataan 15 Smal:llä ja käsitellään alkalisella naudanfosfataasilla. Siten saatu linearoitu plasmidi (56) ligatoidaan DNA-seg-menttiin (55), jolloin saadaan plasmidi pK302 (57). E. coli 294 -solut transformoidaan ligaatioseoksella, ja karakterisoidaan kloonit, jotka sisältävät haluttua plasmi-20 dia, tekemällä plasmidi-DNA:lie ensin restriktio- ja sitten sekvenssianalyysi.
Plasmidista (57) lohkaistaan EcoRI:llä ja HindIII:lla segmentti (58), joka koodaa IL-2:ta ja apinan proinsuliinia.
· 25 Plasmidi (2) (esimerkki 1, kuvio 1) pilkotaan sa moin EcoRI:11a ja HindIII:lla, ja ligatoidaan segmentti (58) linearisoituun plasmidiin (3). Saadaan plasmidi pKHIOI (59).
Esimerkin 1 mukainen ilmentyminen johtaa fuusiopro-, . 30 teiiniin, jossa IL-2:n 96 ensimmäistä aminohappoa seuraa 14 aminohaposta koostuva yhdistyvä jakso [vastaa jaksoa Y DNA-segmentissä (58)], jota seuraa apinan proinsuliinin aminohappojakso.
14 93471
Liite I: Interleukiini-2:n DNA-sekvenssi
Tripletti nro 0 1 2 5 Aminohappo Met Ala Pro
Nukleotidi nro 1 10
Koodattava säie 5' AA TTC ATG GCG CCG
Koodaamaton säie_3J_G TAC CGC GGC
10 5 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gin Leu 20 30 40
ACC TCT TCT TCT ACC AAA AAG ACT CAA CTG
TGG AGA AGA AGA TGG TTT TTC TGA GTT GAC
15 13 H 15 16 17 18 19 20 21 22
Gin Leu Glu His Leu Leu Leu Asp Leu Gin 50 60 70
CAA CTG GAA CAC CTG CTG CTG GAC CTG CAG
GTT GAC CTT GTG GAC GAC GAC CTG GAC GTC
2 0 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32
Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys 80 90 100
ATG ATC CTG AAC GGT ATC AAC AAC TAC AAA
2 5 TAC TAG GAC TTG CCA TAG TTG TTG ATG TTT
33 34 35 36 37 38 39 40 41 42
Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe 110 120 130
30 AAC CCG AAA CTG ACG CGT ATG CTG ACC TTC
:· TTG GGC TTT GAC TGC GCA TAC GAC TGG AAG
15 93471 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52
Lys Phe Tyr Met Pro Lys Lys Ala Thr Glu 140 150 160
AAA TTC TAC ATG CCG AAA AAA GCT ACC GAA
5 TTT AAG ATG TAC GGC TTT TTT CGA TGG CTT
53 54 55 56 57 58 59 60 61 62
Leu Lys His Leu Gin Cys Leu Glu Glu Glu 170 180 190
10 CTG AAA CAC CTC CAG TGT CTA GAA GAA GAG
GAC TTT GTG GAG GTC ACA GAT CTT CTT CTC
63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
Leu Lys Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu 15 200 210 220
CTG AAA CCG CTG GAG GAA GTT CTG AAC CTG
GAC TTT GGC GAC CTC CTT CAA GAC TTG GAC
73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 20 Ala Gin Ser Lys Asn Phe His Leu Arg Pro 230 240 250
GCT CAG TCT AAA AAT TTC CAC CTG CGT CCG
CGA GTC AGA TTT TTA AAG GTG GAC GCA GGC
25 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92
Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val He 260 270 280
CGT GAC CTG ATC TCT AAC ATC AAC GTT ATC
GCA CTG GAC TAG AGA TTG TAG TTG CAA TAG
30 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 --- Val Leu Glu Leu Lys Gly Ser Glu Thr Thr 290 300 310
GTT CTG GAG CTC AAA GGT. TCT GAA ACC ACG
35 CAA GAC CTC GAG TTT CCA AGA CTT TGG TGC
ie 93471 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112
Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala 320 330 340
TTC ATG TGC GAA TAC GCG GAC GAA ACT GCG
5 AAG TAC ACG CTT ATG CGC CTG CTT TGA CGC
113 1H 115 116 117 118 119 120 121 122
Thr Ile Val Glu Phe leu Asn Arg Trp He 350 360 370
10 ACG ATC GTT GAA TTT CTG AAC CGT TGG ATC
TGC TAG CAA CTT AAA GAC TTG GCA ACC TAG
123 124 125 126 127 128 129 130 131 132
Thr Phe Cys Gin Ser He He Ser Thr Leu 15 380 390 400
ACC TTC TGC CAG TCG ATC ATC TCT ACC CTG
TGG AAG ACG GTC AGC TAG TAG AGA TGG GAC
133 134 135 20 Thr 410 ACC TGA TAG 3' TGG ACT ATC AGC T 5' • · * « ·

Claims (12)

93471 Patentt ivaat imukset
1. Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että bakteeri-isäntäsolussa saa-5 tetaan geeni ilmentymään, joka koodaa fuusioproteiinia, jolla on C-tai N-terminaalinen osa, joka oleellisesti vastaa interleukiini 2:n (IL-2) vähintään 96 ensimmäistä aminohappoa, mutta jolla ei ole interleukiini-2-aktiivisuut-ta.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että geeni koodaa fuusioproteiinia, jolla on yleinen kaava Met-X-Y-Z tai Met-Z-Y-X, 15 (la) (Ib) joissa X on oleellisesti ihmisen interleukiini 2:n vähintään 96 ensimmäistä aminohappoa käsittävä aminohapposekvenssi, Y on suora sidos tai geneettisesti koodattavissa 20 olevista aminohapoista koostuva siltajakso, joka mahdol listaa aminohapposekvenssin Z lohkaisun, ja Z on geneettisesti koodattavissa olevista aminohapoista koostuva sekvenssi.
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, ** 25 tunnettu siitä, että Y sisältää Z:n vieressä ryhmän Met, Cys, Trp, Arg tai Lys tai koostuu näistä aminohapoista.
4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Y sisältää Z:n vieressä sek- .. 30 venssin s · Asp-Pro tai koostuu tästä sekvenssistä. « * . Λ · ____ - 1“ 93471
5. Jonkin patenttivaatimuksista 1-4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että Z on proinsuliinin tai hirudiinin aminohapposekvenssi.
6. Jonkin patenttivaatimuksista 1-5 mukainen me-5 netelmä, tunnettu siitä, että fuusioproteiini erotetaan liukenevista proteiineista sentrifugoimalla.
7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on E. coli.
8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukaisella menetelmällä saatavan fuusioproteiinin käyttö proteiinin valmistamiseksi, joka oleellisesti vastaa aminohapposekvenssiä Z, kemiallisesti tai entsymaattisesti lohkaisemalla.
9. Geenirakenne, tunnettu siitä, että se koodaa patenttivaatimuksessa 1 tai 2 esitettyä fuusiopro-teiinia.
10. Vektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 9 mukaisen geenirakenteen.
11. Plasmidi, tunnettu siitä, että se on kuviossa 1 esitetty pEW 1000, kuviossa la esitetty pK360, kuviossa 2a esitetty pK410, kuviossa 3c esitetty pPH30, kuviossa 5a esitetty pK370 tai kuviossa 6a esitetty pKHIOI.
12. Bakteeri-isäntäsolu, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 10 mukaisen vektorin. 19 93471
FI864798A 1985-11-27 1986-11-25 Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi sekä menetelmän toteuttamisessa käytettäviä tuotteita FI93471C (fi)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FI925312A FI925312A0 (fi) 1985-11-27 1992-11-23 Hirudinderivat

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3541856 1985-11-27
DE19853541856 DE3541856A1 (de) 1985-11-27 1985-11-27 Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI864798A0 FI864798A0 (fi) 1986-11-25
FI864798A FI864798A (fi) 1987-05-28
FI93471B true FI93471B (fi) 1994-12-30
FI93471C FI93471C (fi) 1995-04-10

Family

ID=6286938

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI864798A FI93471C (fi) 1985-11-27 1986-11-25 Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi sekä menetelmän toteuttamisessa käytettäviä tuotteita

Country Status (17)

Country Link
EP (3) EP0227938B1 (fi)
JP (1) JP2566933B2 (fi)
KR (1) KR950000300B1 (fi)
AT (2) ATE127841T1 (fi)
AU (1) AU595262B2 (fi)
CA (1) CA1341203C (fi)
DE (4) DE3541856A1 (fi)
DK (2) DK172064B1 (fi)
ES (3) ES2073081T3 (fi)
FI (1) FI93471C (fi)
GR (1) GR3005042T3 (fi)
HU (1) HU203579B (fi)
IE (1) IE59488B1 (fi)
IL (1) IL80755A0 (fi)
NO (1) NO176481C (fi)
PT (1) PT83813B (fi)
ZA (1) ZA868943B (fi)

Families Citing this family (35)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3125021A (en) * 1955-11-14 1964-03-17 Smooth
EP0168342B1 (de) * 1984-06-14 1991-07-03 Ciba-Geigy Ag Verfahren zur Herstellung von Thrombin-Inhibitoren
DE3545568A1 (de) * 1985-12-21 1987-07-16 Hoechst Ag Gm-csf-protein, seine derivate, herstellung solcher proteine und ihre verwendung
DE3712985A1 (de) * 1987-04-16 1988-11-03 Hoechst Ag Bifunktionelle proteine
DE3819079A1 (de) * 1988-06-04 1989-12-07 Hoechst Ag Hirudin-derivate mit verzoegerter wirkung
DE3835815A1 (de) * 1988-10-21 1990-04-26 Hoechst Ag Neue isohirudine
DE3844211A1 (de) * 1988-12-29 1990-07-05 Hoechst Ag Neue insulinderivate, verfahren zu deren herstellung, ihre verwendung und eine sie enthaltende pharmazeutische zubereitung
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
WO1991000912A1 (en) * 1989-07-07 1991-01-24 Massachusetts Institute Of Technology Production and use of hybrid protease inhibitors
CU22222A1 (es) * 1989-08-03 1995-01-31 Cigb Procedimiento para la expresion de proteinas heterologicas producidas de forma fusionada en escherichia coli, su uso, vectores de expresion y cepas recombinantes
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
DE3942580A1 (de) * 1989-12-22 1991-06-27 Basf Ag Verfahren zur herstellung von hirudin
US5270181A (en) * 1991-02-06 1993-12-14 Genetics Institute, Inc. Peptide and protein fusions to thioredoxin and thioredoxin-like molecules
DE4140381A1 (de) * 1991-12-07 1993-06-09 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt, De Neue synthetische isohirudine mit verbesserter stabilitaet
DE4404168A1 (de) * 1994-02-10 1995-08-17 Hoechst Ag Hirudinderivate und Verfahren zu deren Herstellung
DK0821006T3 (da) 1996-07-26 2004-08-16 Aventis Pharma Gmbh Insulinderivater med öget zinkbinding
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
DE10033195A1 (de) * 2000-07-07 2002-03-21 Aventis Pharma Gmbh Bifunktionale Fusionsproteine aus Hirudin und TAP
US7638618B2 (en) 2001-02-20 2009-12-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Nucleic acids encoding a hirudin and pro-insulin as superscretable peptides and for parallel improvement of the exported forms of one or more polypeptides of interest
US7202059B2 (en) 2001-02-20 2007-04-10 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Fusion proteins capable of being secreted into a fermentation medium
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
HUE037449T2 (hu) 2008-10-17 2018-08-28 Sanofi Aventis Deutschland Egy inzulin és egy GLP-1 agonista kombinációja
AR080669A1 (es) 2009-11-13 2012-05-02 Sanofi Aventis Deutschland Composicion farmaceutica que comprende un agonista de glp-1, una insulina y metionina
WO2011058082A1 (de) 2009-11-13 2011-05-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmazeutische zusammensetzung umfassend einen glp-1-agonisten und methionin
ES2606554T3 (es) 2010-08-30 2017-03-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Uso de AVE0010 para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la diabetes mellitus de tipo 2
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
BR112014004726A2 (pt) 2011-08-29 2017-04-04 Sanofi Aventis Deutschland combinação farmacêutica para uso no controle glicêmico em pacientes de diabetes tipo 2
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
PL3229828T3 (pl) 2014-12-12 2023-07-31 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Formulacja o ustalonym stosunku insuliny glargine/liksysenatydu
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
KR20200080748A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법
KR20200080747A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1985000817A1 (en) * 1983-08-10 1985-02-28 Amgen Microbial expression of interleukin ii
DK108685A (da) * 1984-03-19 1985-09-20 Fujisawa Pharmaceutical Co Vaekstfaktor i
CA1341414C (fr) * 1984-03-27 2002-12-31 Paul Tolstoshev Vecteurs d'expression de l'hirudine, cellules transformees et procede de preparation de l'hirudine
EP0158198A1 (en) * 1984-03-29 1985-10-16 Takeda Chemical Industries, Ltd. DNA and use thereof
DE3429430A1 (de) * 1984-08-10 1986-02-20 Hoechst Ag, 6230 Frankfurt Gentechnologisches verfahren zur herstellung von hirudin und mittel zur durchfuehrung dieses verfahrens
DE3526995A1 (de) * 1985-07-27 1987-02-05 Hoechst Ag Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
CA1297003C (en) * 1985-09-20 1992-03-10 Jack H. Nunberg Composition and method for treating animals
US4865974A (en) * 1985-09-20 1989-09-12 Cetus Corporation Bacterial methionine N-terminal peptidase

Also Published As

Publication number Publication date
DK172064B1 (da) 1997-10-06
EP0227938A2 (de) 1987-07-08
HU203579B (en) 1991-08-28
DK172210B1 (da) 1998-01-05
FI864798A (fi) 1987-05-28
ES2032378T3 (es) 1993-02-16
IE59488B1 (en) 1994-03-09
IE863119L (en) 1987-05-27
AU6569386A (en) 1987-06-04
ES2073081T3 (es) 1995-08-01
DE3684892D1 (de) 1992-05-21
PT83813A (de) 1986-12-01
IL80755A0 (en) 1987-02-27
HUT43642A (en) 1987-11-30
DK568586D0 (da) 1986-11-26
KR870005098A (ko) 1987-06-04
DE3650396D1 (de) 1995-10-19
PT83813B (pt) 1989-06-30
KR950000300B1 (ko) 1995-01-13
GR3005042T3 (fi) 1993-05-24
DK52292A (da) 1992-04-21
ATE122397T1 (de) 1995-05-15
EP0227938A3 (en) 1988-11-23
ATE127841T1 (de) 1995-09-15
NO864759D0 (no) 1986-11-26
JP2566933B2 (ja) 1996-12-25
DE3650322D1 (de) 1995-06-14
ES2077747T3 (es) 1995-12-01
EP0468539A1 (de) 1992-01-29
ZA868943B (en) 1987-07-29
DE3541856A1 (de) 1987-06-04
NO176481B (no) 1995-01-02
NO176481C (no) 1995-04-12
EP0227938B1 (de) 1992-04-15
FI93471C (fi) 1995-04-10
FI864798A0 (fi) 1986-11-25
CA1341203C (en) 2001-03-13
DK52292D0 (da) 1992-04-21
EP0468539B1 (de) 1995-09-13
AU595262B2 (en) 1990-03-29
DK568586A (da) 1987-05-28
JPS62143696A (ja) 1987-06-26
EP0464867B1 (de) 1995-05-10
EP0464867A1 (de) 1992-01-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI93471B (fi) Menetelmä fuusioproteiinien valmistamiseksi sekä menetelmän toteuttamisessa käytettäviä tuotteita
FI93734B (fi) Menetelmä eukaryoottisen painolastiosan sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja menetelmässä käyttökelpoisia tuotteita
FI86887B (fi) Fusionsprotein, foerfarande foer deras framstaellning och deras anvaendning.
AU651955B2 (en) Production of recombinant human interleukin-1 inhibitor
US5496924A (en) Fusion protein comprising an interleukin-2 fragment ballast portion
IL95495A (en) Fusion proteins their preparation and use
KR940005585B1 (ko) 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법
HU214881B (hu) Rekombináns proteinek javított aktiválási eljárása
US5334532A (en) PDGF-B fusion protein, vectors, and host cells for use in production thereof
AU603883B2 (en) Genetic engineering process for the preparation of polypeptides
FI97239B (fi) Menetelmä fuusioproteiinin valmistamiseksi
JPH0816120B2 (ja) 成長ホルモン放出因子を含むハイブリドポリペプチド
FI97549C (fi) Menetelmä vierasproteiinien valmistamiseksi Streptomycessoluissa
US5426036A (en) Processes for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
US5268278A (en) Genetic expression of somatostatin as hybrid polypeptide
EP0453456A1 (de) Pdgf-a, pdgf-aa, pdgf-ab, herstellungsverfahren und sie enthaltende arzneimittel.
JPH02257883A (ja) シグナルペプチド、ｄｎａ配列、ベクター、細菌、およびポリペプチド周辺質生産法
KR890003715B1 (ko) 신규한 플라스미드 제조방법 및 그를 함유한 균주를 배양하여 인터루킨-2 또는 변이 인터루킨-2를 생산하는 방법

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
MM Patent lapsed

Owner name: HOECHST AKTIENGESELLSCHAFT