NO176481B - Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, med en C- eller N-terminal andel som tilsvarer de første 90-132 aminosyrene av interleukin-2 (IL-2), men ikke oppviser noen interleukin-2-aktivitet.

Ved den gentekniske fremstillingen av eukaryotiske proteiner oppnås i bakterier ofte bare et lavt utbytte, spesielt ved små proteiner med en molekylvekt inntil 15.000 dalton, hvis strukturer inneholder disulfidbroer. Det antas at de dannede proteiner raskt nedbrytes av vertsegne proteaser. Det konstrueres derfor hensiktsmessig genstrukturer som koder for fusjonsproteiner, hvorved den uønskede andelen av fusjonsproteinet er det vertsegne proteinet, som etter isoleringen av primærproduktet kan avspaltes ved i og for seg kjente fremgangsmåter.

Det er nå overraskende funnet at en N-terminal andel av interleukin-2, som i det vesentlige tilsvarer de første 100 aminosyrene, egner seg spesielt godt til fremstilling av fusjonsproteiner. Man får altså som primærprodukt et fusjonsprotein som fullstendig, eller i overveiende grad, består av eukaryotiske proteinsekvenser. Overraskende gjenkjennes dette proteinet åpenbart ikke som fremmedprotein av, den aktuelle vertsorganismen, og nedbrytes derfor ikke straks. En ytterligere fordel er at funksjonsproteinene som fremstilles ifølge oppfinnelsen er tungt oppløselige til uoppløselige, og derfor lett lar seg fjerne fra de oppløse-lige proteinene, for eksempel ved sentrifugering.

Idet det ifølge oppfinnelsen vedrørende funksjonen som "ballast-andel" for fusjonsproteinet ikke er viktig at interleukin-2-andelen utgjør et biologisk aktivt molekyl, kommer det heller ikke an på den eksakte strukturen av interleukin-2-andelen. Det er tilstrekkelig at i det vesentlige de første 100 N-terminale aminosyrene foreligger. Det er altså eksempelvis mulig å foreta variasjoner på N-terminalen, som tillater en spalting av fusjonsproteinet dersom det ønskede proteinet er anordnet N-terminalt til dette. Omvendt kan man foreta C-terminale variasjoner for å muliggjøre eller lette avspaltingen av det ønskede proteinet dersom dette, som vanlig, er bundet C-terminalt i fusjonsproteinet .

Den for humant-interleukin-2, i det følgende "IL-2", kodende naturlige DNA-sekvens er kjent fra den europeiske patentpublikasjonen EP-A1-0091539. Den der angitte litteraturen vedrører også mus- og rotte-IL-2. Denne pattedyr-DNA kan anvendes til syntese av proteinene som fremstilles ifølge oppfinnelsen. Mer hensiktsmessig anvendes likevel syntetisk DNA, spesielt fordelaktig DNA for human-IL-2, som foreslått i det (ikke tidligere offentliggjorte) tyske utlegningsskrift 3419995 (svarende til den eropeiske patentpublikasjonen 0163249). Denne syntetiske DNA-sekvensen er gjengitt i bilaget (DNA-sekvens I). Denne syntetiske DNA-delen har ikke bare den fordelen at den når det gjelder kodon-valg er avstemt til forholdene i den hyppigst anvendte verten, E.coli, men den inneholder også en rekke snittsteder for restriksjonsendonukleaser, hvorav det ifølge oppfinnelsen kan gjøres bruk. I den følgende tabell 1 er det gjengitt et utvalg av de egnende snittstedene ved begynnelsen, henholdsvis i området for den 100. tripletten. Herved er det imidlertid ikke utelukket at det i det mellomliggende området foretas variasjoner i DNA, hvorved det kan gjøres bruk av de ytterligere snittstedene angitt i den ovenfor nevnte patentpublikasjonen.

Dersom det gjøres bruk av nukleasene Ban II, Sac I eller Sst I, så får man en IL-2-delsekvens, som koder for ca. 95 aminosyrer. Denne lengden er generelt tilstrekkelig til å oppnå et uoppløselig fusjonsprotein. Når tungtoppløselig-heten, eksempelvis ved et ønsket hydrofilt eukaryotisk protein, fremdeles ikke er tilstrekkelig, men man - for å produsere så lite "ballast" som mulig - ikke ønsker å gjøre bruk av de snittstedene som ligger nærmere C-terminalen, så kan man ved hjelp av tilsvarende adapter, henholdsvis forbindelsesledd, forlenge DNA-sekvensen ved den N- og/eller C-terminale enden, og dermed "skreddersy" "ballast"-andelen. Man kan naturligvis også anvende DNA-sekvensen, mer eller mindre, til enden, og på denne måten oppnå eventuelt modifisert, biologisk aktivt IL-2 som "biprodukt", henholdsvis fremstille et bifunksjonelt protein som viser IL-2-virkning i tillegg til virkningen av det kodede proteinet.

Oppfinnelsen tilveiebringer følgelig en fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, med en C— eller N—terminal andel som tilsvarer de første 90-132 aminosyrene av interleukin-2 (IL-2), men ikke oppviser noen interleukin-2-aktivitet, med den generelle formelen der X er aminosyrerekken for de 90-132 første aminosyrene av menneskelig interleukin-2, Y betyr en direktebinding eller et broledd av 2-14 genetisk kodbare aminosyrer, som muliggjør avspaltning av aminosyresekvensen Z, og Z er en sekvens av genetisk kodbare aminosyrer, hvor Y, nabo til Z, inneholder Met, Cys, Trp, Arg, Lys, Asp eller Pro eller består av disse aminosyrer. Fremgangsmåten er kjennetegnet ved at man transformerer en vertscelle med en for dette fusjonsproteinet kodende genstruktur, dyrker vertscellen og fraskiller det uttrykte fusjonsproteinet fra de oppløselige proteinene, fortrinnsvis ved sentrifugering.

Som det fremgår av formlene Ia og Ib, og som allerede nevnt ovenfor, er det mulig å bringe det ønskede proteinet til ekspresjon før eller etter IL-2-andelen. For å oppnå en forenkling beskrives i det følgende i det vesentlige den førstnevnte muligheten, som tilsvarer den opprinnelige fremgangsmåten til fremstilling av fusjonsproteiner. Når i det følgende denne "klassiske" varianten beskrives, er herved det andre alternativet ikke utelukket.

Spaltingen av fusjonsproteinet kan foregå på kjent måte kjemisk eller enzymatisk. Valget av den egnede fremgangsmåten avhenger fremfor alt av aminosyresekvensen for det ønskede proteinet. Når denne eksempelvis ikke inneholder metionin, kan Y stå for Met, hvorpå en kjemisk spalting foregår med klor- eller bromcyan. Dersom i bindeleddet Y cystein står ved karboksyterminalen eller dersom Y står for Cys, så kan det foregå en enzymatisk cysteinspesifikk spalting eller en kjemisk spalting, for eksempel etter spesifikk S-cyanylering. Dersom i broleddet Y tryptofan står ved karboksyterminalen eller Y står for Trp, så kan det foregå en kjemisk spalting med N-bromsuccinimid.

Proteiner som i aminosyresekvensen ikke inneholder

og er tilstrekkelig syrestabile, kan på i og for seg kjent måte spaltes proteolytisk. Herved får man proteiner som N-terminalt inneholder prolin, henholdsvis C-terminalt aspara-ginsyre. På denne måten kan altså også modifiserte proteiner syntetiseres.

Asp-Pro-bindingen kan også utformes syrelabil når dette broleddet er (Asp)n-Pro henholdsvis Glu-(Asp)n-Pro, hvorved n er 1 til 3.

Eksempler på enzymatiske spaltinger er også kjente hvorved modifiserte enzymer med forbedret spesifisitet kan anvendes (se C.S. Craik et al., Science 228 (1985) 291-297). Dersom det ønskede eukaryotiske peptidet er proinsulin, så velges hensiktsmessig som sekvens Y en peptidsekvens hvor en med trypsin avspaltbar aminosyre (Arg, lys) er bundet til den N-terminale aminosyren (Phe) for proinsulin, eksempelvis Ala-Ser-Met-Thr-Arg, idet da den arginin-spesifikke spaltningen kan foregå med proteasen trypsin.

Dersom det ønskede proteinet ikke inneholder aminosyrerekken

så kan fusjonsproteinet spaltes med faktor Xa (europeiske patentpublikasjoner 0025190 og 0161973).

Fusjonsproteinet utvinnes ved ekspresjon i et egnet ekspre-sjonssystem på i og for seg kjent måte. For dette formålet egner alle kjente vert-vektor-systemer seg, dvs. eksempelvis pattedyrceller og mikroorganismer, for eksempel gjærtyper og fortrinnsvis bakterier, spesielt E.coli.

DNA-sekvensen, som koder for det ønskede proteinet, innebyg-ges på kjent måte i en vektor, som sikrer en god ekspresjon i det valgte ekspresjonssystemet.

I bakterielle verter velges hensiktsmessig promotoren og operatoren fra gruppen lac, tac, trp, Pj^ eller Pjj for fagene X, hsp, omp eller en syntetisk promotor, for eksempel som foreslått i det tyske utlegningsskrift nr. 3430683 (europeisk patentpublikasjon 0173149). Fordelaktig er tac promotor-operator-sekvensen, som nå er handelsvanlig (for eksempel ekspresjonsvektor pKK223/3, Pharmacia, "Molecular Biologi-cals, Chemicals and Equipment for Molecular Biology", 1984, s. 63).

Ved ekspresjon av fusjonsproteinet ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan det vise seg hensiktsmessig å endre tripletter for de første aminosyrene etter ATG-start-kodonet for å forhindre en eventuell basepardannelse på nivået for mRNA. Slike forandringer, samt forandringer, utelatelser eller tilsatser av enkelte aminosyrer i IL-2-proteinandelen, er kjent for fagmannen.

Oppfinnelsen beskrives nærmere i de følgende eksemplene og i f igurene.

Fig. 1 og dens fortsettelse, fig. la, vedrører syntesen av plasmidet pk360, som koder for et fusjonsprotein, som oppviser hirudinsekvensen,

fig. 2 og dens fortsettelse, fig. 2a, vedrører syntesen av plasmidet pK410, som også koder for et fusjonsprotein med aminosyresekvensen for hirudin,

fig. 3 og dens fortsettelse, fig. 3a til 3c, vedrører konstruksjon av plasmidene pPH15, 16, 20 og 30, som koder for fusjonsproteiner som inneholder aminosyresekvensen av ape-proinsulin. Fig. 4 vedrører syntesen av plasmidet pPHlOO, som koder for et fusjonsprotein med aminosyresekvensen for hirudin. Fig. 5 og dens fortsettelse, fig. 5a, viser konstruksjonen av plasmidet pK370, som koder for et fusjonsprotein med aminosyresekvensen for hirudin, samt

fig. 6 og dens fortsettelse, fig. 6a, vedrører syntesen av plasmidet pKHlOl, som koder for et fusjonsprotein med aminosyrerekkefølgen fra ape-proinsulin.

Figurene er ikke gjengitt i riktig målestokk, fremfor alt ved gjengivelsen av polyforbindelsesstedet er målestokken "uttøyet".

EKSEMPEL 1

Ved innføring av lac-repressoren (P.J. Farabaugh, Nature 274

(1978) 765-769) i plasmidet pKK 177-3 (Amann et al., Gene 25

(1983) 167) får man plasmidet pJF118 (1) (fig. 1, se tysk patentsøknad P3526995.2, eksempel 6, fig. 6). Dette åpnes på det singulære restriksjonsstedet for Ava I og forminskes på i og for seg kjent måte ved exo-nukleasebehandling med ca. 1000 bp. Etter ligering oppnås plasmidet pEW 1000 (2), (fig. 1), hvori lac-repressorgenet er fullstendig, men som på grunn av< forminskelsen foreligger i betydelig høyere kopiantall enn utgangsplasmidet.

I stedet for plasmidet pKK177-3 kan man også ta utgangspunkt i det ovennevnte handelsvanlige plasmidet pKK223-3, bygge inn lac-repressoren og forkorte det oppnådde produktet på analog måte.

Plasmidet pEW 1000 (2) åpnes med restriksjonsenzymene EcoR I og Sal I (3).

Det for hirudin kodende plasmidet (4), fremstilt ifølge tysk utlegningsskrift 3429430 (europeisk patentpublikasjon 0171024), eksempel 4 (fig. 3), åpnes med restriksjonsenzymene Acc I og Sal I og det lille fragmentet (5), som for største delen inneholder hirudinsekvensen, isoleres.

Plasmidet pl59/6 (6), fremstilt ifølge det tyske utlegningsskrift 3419995 (europeisk patentpublikasjon 0163249), eksempel 4 (fig. 5), åpnes med restriksjonsenzymene Eco RI og Pvu I og det lille fragmentet (7) isoleres, som inneholder den største delen av IL-2-sekvensen. Denne delsekvensen, og i det følgende også andre forkortede IL-2-sekvenser, er i figurene betegnet som "AIL2".

Deretter behandles sekvensene (3), (5), (7) samt den syntetiske DNA-sekvensen (8, fig. la) med T4-ligase. Man får plasmidet pK360 (9).

Kompetente E.coli-celler transformeres med ligerings-produktet og belegges på NA-plater, som inneholder 25 pg/ml ampicillin. Plasmid-DNA forklonene karakteriseres ved hjelp av restriksjons- og sekvensanalyse.

En kultur av E.coli-celler som har stått over natten, som inneholder plasmidet (9), fortynnes med LB-medium (J.H. Miller, "Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972), som inneholder 50 jjg/ml ampicillin, i forhold på ca. 1:100 og veksten følges ved hjelp av 0D-måling. Ved OD = 0,5 innstilles rystekulturen på 1 mM isopropyl-e-galaktopyranosid (IPTG) og bakteriene frasentri-fugeres etter fra 150 til 180 minutter. Bakteriene kokes i 5 minutter i en bufferblanding (7M urinstoff, 0,l£ SDS, 0,1 M natriumfosfat, pH 7,0) og prøver påføres på en SDS/gelektro-foreseplate. Etter elektroforese oppnås det fra bakteriene som inneholder plasmid (9), et proteinbånd som tilsvarer størrelsen av det ventede fusjonsproteinet. Etter oppslut-ning av bakteriene ("French Press"; "Dyno-Miihle") og sentrifugering befinner fusjonsproteinet seg i bunnfallet slik at betydelige mengder av de øvrige proteinene kan fraskilles med supernatanten. Etter isolering av fusjonsproteinet settes det ventede hirudin-peptidet fri ved bromcyan-spalting. Peptidet karakteriseres etter isolering ved protein-sekvens-analyse.

De angitte induksjonsbetingelsene gjelder for rystekulturer: ved større fermenteringer er tilsvarende OD-verdier og eventuelt lett varierte IPTG-konsentrasjoner hensiktsmessig.

EKSEMPEL 2

Plasmidet (4) (fig. 1) åpnes med Acc I, og de overstående endene oppfylles med Klenow-polymerase. Deretter skjæres med Sac I og fragmentet (10) isoleres, dette inneholder den største delen av hirudinsekvensen.

Den handelsvanlige vektoren pUC 13 åpnes med restriksjonsenzymene Sac I og Sma I og det store fragmentet (11) isoleres.

Ved hjelp av T4-ligase ligeres nå fragmentene (10) og (11) til plasmid pK 400 (12) (fig. 2). Plasmidet (12) er gjengitt to ganger i fig. 2, hvorved aminosyresekvensen for det derved oppnådde hirudinderivatet er fremhevet i den nederste fremstillingen.

Plasmidet (4) (fig. 1) åpnes med restriksjonsenzymene Kpn I og Sal I og det lille fragmentet (13) som inneholder hirudin-delsekvensen, isoleres.

Plasmidet (12) omsettes med restriksjonsenzymene Hine II og Rpn I og det lille fragmentet (14) som inneholder hirudindel-sekvensen, isoleres.

Plasmidet (9) (fig. la) spaltes delvis med EcoR I, de frie endene oppfylles med Klenow-polymerase i en innfyllingsreak-sjon, og kuttes med Sal I. Man får derivatet av plasmidet pK360 (15).

Ved liger ing av fragmentene (3), (13), (14) og (15) får man plasmidet pK 410, (16), som er gjengitt to ganger i fig. 2a, hvorved den nederste gjengivelsen viser aminosyrerekkefølgen for fusjonsproteinet og dermed det etter syrespaltning oppnådde hirudinderivatet.

Etter ekspresjon og opparbeidelse ifølge eksempel 1, får man et nytt hirudinderivat, som i posisjonene 1 og 2 oppviser aminosyrene prolin og histidin. Dette hirudinderivatet viser den samme aktiviteten som naturproduktet ifølge det tyske utlegningsskriftet nr. 3429430, som i disse posisjonene oppvise aminosyrene threonin og tyrosin, men er mer stabilt mot angrep av aminopeptidaser, hvorved det kan oppnås fordeler ved in-vivo-anvendelse.

EKSEMPEL 3

Den handel svanlige vektoren pBR 322 åpnes med Barn H 1, hvorved det lineariserte plasmidet (17) oppnås. De frie endene oppfylles delvis under anvendelse av dATP, dGTP og dTTP, og det overstående nukleotidet G nedbrytes med Sl-nuklease, hvorved pBR 322-derivatet (18) oppnås.

Hae III-fragmentet (19) av ape-proinsulin (Wetekam et al., Gene 19 (1982) 181) ligeres med det modifiserte plasmidet (18), hvorved plasmidet pPH 1 (20) oppnås. Idet insulinse-kvensen ble anvendt i tetracyklingenet, er klonene som inneholder dette plasmidet ikke resistente mot tetracyklin og kan identifiseres på dette grunnlaget.

Plasmidet (20) åpnes med Barn Hl og Dde I og det lille fragmentet (21) isoleres.

I tillegg isoleres Dde I-Pvu II-delsekvensen (22) fra ape-proinsulinsekvensen.

Vektoren pBR 322 åpnes med Bam Hl og Pvu II og det lineariserte plasmidet (22) isoleres.

Ved ligering av insulindelsekvensene (21) og (22) med det åpnede plasmidet (23) oppnår man plasmidet pPH5 (24). Dette åpnes med Barn Hl og Pvu II og det lille fragmentet (25) isoleres.

For fullstendiggjørelse av insulinstrukturen syntetiseres DNA-sekvensen (26).

Den handelsvanlige vektoren pUC 8 åpnes med enzymene Bam HI og Sal I og restplasmidet (27) isoleres. Dette ligeres med DNA-sekvensene (25) og (26) til plasmid pPH 15 (28). Dette åpnes med Sal I og de ovenstående endene oppfylles. Fra de resulterende plasmidderivater (29) avspaltes DNA-sekvensen (30) med Bam Hl.

Den handelsvanlige vektoren pUC 9 åpnes med enzymene Bam HI og Sma I og det store fragmentet (31) isoleres. Dette ligeres med DNA-sekvensen (30) hvorved plasmidet pPH16 (32) oppnås.

Plasmidet (32) åpnes med Sal I og det lineariserte plasmidet (33) oppfylles delvis med dCTP, dGTP og dTTP og det gjenvær-ende nukleotidet T avspaltes med Sl-nuklease. Det derved oppnådde plasmidderivatet (34) behandles med Bam HI og fra produktet (35) fjernes den overstående enkeltstrengen med Sl-nuklease, hvorved plasmidderivatet (36) oppnås.

De butte endene av plasmidderivatet (35) ringsluttes til plasmid pPH 20 (37).

Kompetente E.coli Hb 101-celler transformeres med ligerings-blandingen og påføres på selektivt medium. Kloner som inneholder det ønskede plasmidet uttrykker proinsulin, av 70 undersøkte kloner inneholdt 26 radioimmunologisk påvisbart proinsulin. Plasmidene karakteriseres videre ved hjelp av DNA-sekvensanalyse. De inneholder DNA, som foran kodonet for de første aminosyrene av B-kjeden (Phe) koder for arginin. Plasmidet (37) spaltes med Hind II, de overstående endene oppfylles og etterspaltes med Dde I. Det lille fragmentet (38) isoleres.

Plasmidet (28) (fig. 3a) spaltes med Sal I og Dde I og det lille fragmentet (39) fraskilles.

Plasmidet (9) (fig. la) spaltes med først Acc I, de frie endene oppfylles og etterspaltes delvis med Eco RI. Fragmentet (40), som inneholder den forkortede IL-2-sekvensen isoleres.

Det lineariserte plasmidet (3) (fig. 1) og DNA-segmentene (38), (39) og (40) ligeres så til plasmidet pPH 30 (41). Dette plasmidet koder for et fusjonsprotein som i tilslutning til aminosyrene 1 til 114 av IL-2 oppviser følgende amino-syresekvens:

Argininet som siste aminosyre av dette broleddet Y muliggjør avspaltning av insulinkjeden med trypsin.

Med utgangspunkt i plasmid (9) (fig. la) kan man også ved følgende fremgangsmåte komme til plasmid (41): Man åpner (9) med Acc I, oppfyller de overstående endene, skjærer etter med Sal I og ligerer det oppnådde plasmidderivatet (42) med segmentene (3), (38) og (39).

EKSEMPEL 4:

Plasmidet (6) (fig. 1) åpnes med restriksjonsenzymene Taq I og Eco RI og det lille fragmentet (43) isoleres. Dette fragmentet ligeres med den syntetiserte DNA-sekvensen (44) og segmentene (3) og (5) til plasmid pPH 100 (45 ). Dette plasmidet koder for et fusjonsprotein, hvorved det etter de første 132 aminosyrene for IL-2 følger broledd Asp-Pro og heretter aminosyrerekken av hirudin. Den proteolytiske spaltningen gir følgelig et modifisert, biologisk aktivt IL-2', hvori posisjon 133 inneholder Asp i stedet for Thr, og et hirudinderivat som N-terminalt inneholder Pro før aminosyresekvensen av naturproduktet. Også dette produktet er biologisk aktivt, og sammenlignet med naturproduktet mer stabilt mot angrep av proteaser. IL-2'-hirudinfusjonsproteinet oppviser også biologisk aktivitet: I celleformeringsforsøk med en IL-2-avhengig cellelinje (CTLL2) ble det funnet biologisk aktivitet.

Etter denaturering i 6 M guanidiniumhydrokloridoppløsning og etterfølgende renaturering i bufferoppløsning (10 mM Tris-HC1, pH 8,5, 1 mM EDTA) ble det videre funnet høy IL-2-aktivitet. Videre ble koaguleringstiden for syrebehandlet, med trombin blandet blod, forlenget etter tilsats av fusjonsproteinet.

Det oppnås følgelig et bifunksjonelt fusjonsprotein.

EKSEMPEL 5:

Den handelsvanlige vektoren pUC 12 åpnes med restriksjonsenzymene Eco RI og Sac I. I dette lineariserte plasmidet (46) settes det inn en IL-2-delsekvens, som er utspaltet av plasmidet (6) (fig. 1) med restriksjonsenzymene Eco RI og Sac I. Denne sekvensen (47) omfatter den komplette tripletten for de første 94 aminosyrene av IL-2. Ved ligering av (46) og (47) får man plasmidet pK 300 (48).

Plasmidet (9) (fig. la) åpnes med Eco RI, de overstående endene oppfylles og etterspaltes med Hind III. Det lille fragmentet (49) isoleres, som i tilslutning til den for hirudin kodende DNA-sekvensen inneholder en del av polyfor-bindelsesleddet fra pUC 12.

Plasmidet (48) åpnes med restriksjonsenzymene Sma I og Hind III og det store fragmentet (50) isoleres. Ved ligering av (50) med (49) får man plasmid pK 301 (51).

Med 1igeringsblandingen transformeres kompetente E.coli 294-celler. Kloner som inneholder plasmidet (51) karakteriseres ved restriksjonsanalyse. De inneholder DNA som i tilslutning til kodonene for de første 96 aminosyrene av IL-2 inneholder kodoner for et broledd av 6 aminosyrer og de derpå følgende kodonene for hirudin.

Plasmidet (51) omsettes med Eco RI og Hind III og fragmentet (52) isoleres, dette inneholder DNA-sekvensen for det nevnte eukaryotiske fusjonsproteinet.

Plasmidet (2) (fig. 1) åpnes med Eco RI og Hind III. Det oppnådde lineariserte plasmidet (53) ligeres med DNA-sekvensen (52) hvorved plasmidet pK 370 (54) oppnås.

Dersom plasmidet (54) tilsvarende eksempel 1 eksprimeres i E.coli, får man et fusjonsprotein hvor det etter de første 96 aminosyrer av IL-2 følger broleddet

og i tilknytning til dette aminosyrerekken for hirudin.

EKSEMPEL 6:

Fra plasmidet (41) (eksempel 3, fig. 3c) utspaltes med restriksjonsenzymene Eco RI og Hind III DNA-segmentet som koder for ape-proinsulin, og de overstående endene oppfylles. Man får DNA-segmentet (55).

Plasmidet (48) (eksempel 5, fig. 5) åpnes med Sma I og behandles med alkalisk oksefosfatase. Det oppnådde lineariserte plasmidet (56) ligeres med DNA-segmentet (55) hvorved plasmidet pK302 (57) oppnås. E.coli 294-celler transformeres med 1igeringsblandingen, hvorved kloner som inneholder det ønskede plasmidet først karakteriseres ved restriksjons- og deretter ved sekvensanalyse for plasmid-DNA.

Fra plasmid (57) utspaltes med Eco RI og Hind III segmentet (58) som koder for IL-2 og ape-proinsulin.

Plasmidet (2) (eksempel 1, fig. 1) spaltes også med Eco RI og Hind III og i det lineariserte plasmidet (3) ligeres segmentet (58) inn. Man får plasmidet pKH 101 (59).

Ekspresjon ifølge eksempel 1 fører til et fusjonsprotein, hvori det etter de første 96 aminosyrene for IL-2 følger et broledd med 14 aminosyrer (svarende til Y i DNA-segment (58)), hvortil aminosyrerekken for ape-proinsulin slutter seg.

Vedlegg I; DNA- sekvensen for interleukin- 2

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et fusjonsprotein, med en C- eller N—terminal andel som tilsvarer de første 90-132 aminosyrene av interleukin-2 (IL-2), men ikke oppviser noen interleukin-2-aktivitet, med den generelle formelen der X er aminosyrerekken for de 90-132 første aminosyrene av menneskelig interleukin-2, Y betyr en direktebinding eller et broledd av 2-14 genetisk kodbare aminosyrer, som muliggjør avspaltning av aminosyresekvensen Z, og Z er en sekvens av genetisk kodbare aminosyrer, hvor Y, nabo til Z, inneholder Met, Cys, Trp, Arg, Lys, Asp eller Pro eller består av disse aminosyrer, karakterisert ved at man transformerer en vertscelle med en for dette fusjonsproteinet kodende genstruktur, dyrker vertscellen og fraskiller det uttrykte fusjonsproteinet fra de oppløselige proteinene, fortrinnsvis ved sentrifugering.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at det anvendes genstrukturer som koder for et fusjonsprotein hvori Y, nabo til Z, inneholder aminosyresekvensen eller består av denne.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1 eller 2, karakterisert ved at det anvendes genstrukturer som koder for et fusjonsprotein hvori Z betyr aminosyresekvensen til et proinsulin eller et hirudin.