HU197356B - Process for producing fusion proteins - Google Patents

Process for producing fusion proteins Download PDF

Info

Publication number
HU197356B
HU197356B HU863100A HU310086A HU197356B HU 197356 B HU197356 B HU 197356B HU 863100 A HU863100 A HU 863100A HU 310086 A HU310086 A HU 310086A HU 197356 B HU197356 B HU 197356B
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
sequence
plasmid
amino acids
peptide
dna
Prior art date
Application number
HU863100A
Other languages
English (en)
Other versions
HUT43629A (en
Inventor
Paul Habermann
Siegfried Stengelin
Friedrich Wengenmayer
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of HUT43629A publication Critical patent/HUT43629A/hu
Publication of HU197356B publication Critical patent/HU197356B/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/62—Insulins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/81—Protease inhibitors
    • C07K14/815—Protease inhibitors from leeches, e.g. hirudin, eglin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

A találmány tárgya eljárás fehérjék vagy peptidek fúziós protein formán keresztül történő előállítására.
Kisebb (mintegy 15 000 daltonig terjedő) móltőmegű eukariőta proteinek géntechnológiai előállításakor baktériumokban a hozam gyakran alacsony. Feltételezhető, hogy a gazdasejt saját proteáz enzimjei a képződött proteint hamar lebontják. Ezért az említett kisebb móltőmegű proteineket célszerűen fúziós proteinként állitják elő, előnyösen olyan proteinrésszel, amely a gazdasejté; ezt a részt később lehasitják.
Azt találtuk, hogy az E. coli trp-operonjából származó D-proteinnek egy csupán mintegy 70 aminosavból álló szakasza különösen alkalmas fúziós proteinek képzéséhez, mégpedig a 23-tól 93-ig terjedő aminosavszekvencia tartományban [C. Yanofsky és mts-i, Nucleic Acids Rés. 9 (1981), 6647]. Ezt a részt az alábbiakban .D’-peptid'-nek is nevezzük. E. peptid karboxil-terminálisa és a kívánt eukariőta protein aminosavszekvenciája között egy vagy több genetikailag kódolható aminosavból álló olyan szekvencia helyezkedik el, amely lehetővé teszi a kívánt protein kémiai vagy enzimes lehasitását. A találmány szempontjából előnyös, ha az aminoterminálishoz a Lys-Ala aminosavszekvencia csatlakozik, amelyet adott esetben 1-10, előnyösen 1-3 további genetikailag kódolható aminosavból álló szekvencia, különösen előnyösen 2 aminosavból álló, legelőnyösebben a Lys-Gly szekvencia követ.
A találmány tárgya tehát eljárás valamely célfehérje vagy -peptid géntechnikai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállításénak megkönnyítésére. A találmány szerinti eljárásra jellemző, hogy egy
Met-Xn-D’-(Y).-Z képletű aminosav szekvenciának megfelelő génszerkezetet - a képletben n jelentése 0 vagy 1
X jelentése 1-12 aminosav hosszúságú szekvencia,
D’ jelentése az E. coli trp-operonjában előforduló D-peptid 23-93. aminosavának megfelelő 70 aminosav szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav kiiktatásával, hozzátoldásával vagy cseréjével megváltoztatott variánsa,
Y jelentése 1-4 aminosavból álló híd, amely enzimesen vagy kémiai úton hasítható, illetve lehasitható, m jelentése 1, 2, 3 vagy 4 és
Z jelentése a célfehérje vagy -peptid szekvenciája - megfelelő vektorba építünk, a vektort E. coli sejtbe transzformáljuk, a transzformált törzset megfelelő közegben tenyésztjük, a tenyészléből vagy a sejtekből a fúziós fehérjét izoláljuk, és a fúziós fehérjét az Y jelű hídnál hasítva a célfehérjét vagy -peptidet kinyerjük.
Természetesen előnyős, ha a fúziós protein nemkívánatos (a gazdasejt proteinjéből álló) része minél kisebb, mert ez esetben a sejt kevesebb .csomagolást termel, és Így a kívánt protein hozama nagyobb. Ezen kívül a nem kívánt rész lehasitásakor kevesebb melléktermék képződik, ami a feldolgozást megkönnyíti. Ezzel ellentétben áll, hogy a nem kívánt rész (feltételezett) .védőfunkció ja csak egy bizonyos nagyságrend felett várható. Meglepő módon megállapítást nyert, hogy a D-proteinböl a találmány szerint kiválasztott szegmens az említett funkciót ellátja, pedig csak mintegy 70 aminosavból áll.
Számos esetben - főleg az előnyben részesített kiviteli alak esetén, ahol X jelentése Lys-Ala vagy N-terminálisán ezt a szekvenciát tartalmazza - oldhatatlan fúziós protein keletkezik, amelyet egyszerűen lehet elválasztani az oldódó proteinek mellől, így a feldolgozás egyszerű és a hozam magas. Az oldhatatlan proteinek képződése meglepő, mert egyrészt a mintegy 70 aminosavból álló bakteriális rész eléggé jelentéktelen, másrészt ez a szakasz része egy olyan proteinnek, amely a gazdasejtben oldott állapotban van jelen.
.A D-peptid 23-tól 93-ig terjedő aminosav-szekvenciájának 70 aminosava vagy annak variánsa kifejezéssel azt kívánjuk érzékeltetni, hogy ismert módon variációk lehetségesek, azaz egyes aminosavak elhagyhatók, pótolhatók vagy kicserélhetek anélkül, hogy emiatt a találmány szerint előállítható fúziós proteinek tulajdonságai szignifikánsan változnának. Az ilyen variációk szintén a találmány tárgykörébe esnek.
A kívánt eukariőta protein előnyösen biológiailag aktív protein, például hirudin típusú protein vagy olyan protein elöterméke, mint például a humán proinzulin.
A fúziós E. coli-ban végzett expresszióval nyerjük és előnyösen a gazdasejtek feltárása után a csapadékban izoláljuk, ahol
- oldhatatlan anyag lévén - feldúsul. A proteint tehát könnyen elválaszthatjuk a sejt oldódó alkotóitól.
Előnyösen a λ-fág Lac, Tac, Pi vagy Pr csoportjából választunk promotort és operátort, alkalmasak hsp, omp vagy szintetikus promotorok is, amelyeket a 3 430 683 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat (0 173 149 sz. európai szabadalmi bejelentés) ismertet.
Különösen alkalmas olyan vektor, amely az E. coli trp-operonjából az alábbi elemeket tartalmazza: a promotort, az operátort és az L-peptid riboszóma-kötését. A kódoló tartományban előnyösen ennek az L-peptidnek az első három aminosava következik, és ehhez
- rövid aminosavszekvencián keresztül - a trp-operon D-proteinjének 29-93. aminosava csatlakozik.
A kívánt polipeptid lehasitását lehetővé tevő Y jelű közbenső szekvencia a kívánt peptid összetételétől függ: amennyiben ez a peptid nem tartalmaz metionint, Y helyén Met állhat, és brómciánnal végzett kémiai hasítás 3 lehetséges. Ha az Y jelű közbenső tag a karboxilterminélisan ciszteint tartalmaz, vagy
Y jelentése Cys, cisztein-specifikus enzimmel vagy kémiailag, például előzetesen végzett specifikus S-cianilezés után lehet hasítani. Amennyiben az Y jelű áthidaló tag a karboxilterminálisan triptofánt tartalmaz, vagy Y jelentése Trp, a kémiai hasítás N-bróm-szukcinimiddel lehetséges. Y=Asp-Pro esetén a hasítást ismert módon [D. Piszkiewicz és mts- i, Biochemical and Biophysical Research Communications 40, (1970), 1173-1178] proteolitikusan végezhetjük. Az Asp-Pro-kötést, úgy találtuk, még jobban savérzékennyé lehet tenni, ha Y jelentése (Asp)»-Pro, illetve Glu-(Asp)»-Pro (ahol m jelentése 1, vagy 2 vagy 3). Olyan hasitási termékek keletkeznek, amelyek N-terminálisan Pro-val kezdődnek, illetve C-terminálisan Asp-vel végződnek.
Enzimes hasításra is ismertek példák, és módositott, azaz javított specifitású enzimek alkalmazása is lehetéges [C. S. Craik és mts-i, Science 228 (1985), 291-297], Ha kivánt eukarióta pepiidként humán proinzulint akarunk nyerni, az Y jelű szekvenciaként olyan peptidszekvenciát választhatunk, amely a proinzulin N-terminális aminosavához (Phe) kapcsolódó, tripszinnel lehasitható aminosavat (Arg, Lys) tartalmaz, így Y lehet például Ala-Ser-Met-Thr-Arg, és az arginin-specifíkus hasítást tripszin proteázzal lehet végezni. Amennyiben a kívánt proteinben az Ile-Glu-Gly-Arg aminosavszekvencia nem szerepel, a hasítás az Xa faktorral is végezhető (0 161 937 sz. európai szabadalmi bejelentés).
Az Y jelű szekvencia kialakításakor a szintézis körülményeire is tekintettel lehetünk, például restrikciós enzimek számára alkalmas vágóhelyeket építhetünk be. igy az
Y jelű aminosavsorozatnak megfelelő DNS-szekvencia linker vagy adapter funkciót is teljesíthet.
A találmány szerint előállítható fúziós proteint előnyösen az E. coli trp-operonjának ellenőrzése alatt exprimáljuk. A trp-operon promotorát és operátorát tartalmazó DNS-szakasz mér kereskedelmi termék. A trp-operon ellenőrzése alatt végzett protein-expressziót már számos helyen leírták (0 036 776 sz. európai szabadalmi leírás). A trp-operon beindulását L-triptofán hiánya és/vagy indolil-3-akrilsav jelenléte segítségével érhetjük el.
A trp-operátor ellenőrzése alatt először a 14 aminosavból álló L-peptid íródik át. Az L-peptid 10. és 11. helyén L-triptofán van. Az L-peptid proteinszintézisének sebessége határozza meg azt, hogy a következő szerkezeti gének szintén forditódnak-e, vagy a proteinszintézis megáll-e. Amennyiben kevés a közeg az L-triptofán, az L-peptid csak lassan szintetizálódik, mert az L-triptofános tRNS koncentrációja kicsi, így a kővetkező proteinek szintézise halad. Nagy L-triptofán4
-koncentráció esetén viszont a küldönc (messenger) RNS megfelelő szakasza gyorsan leolvasódik, és a protein bioszintézise megszakad, mert a küldönc RNS terminálisszerű szerkezetet vesz fel (C. Yanofsky és mts-i, a fent megadott helyen).
A küldönc RNS transzlációjának gyakorisága erósen az indító kodon (startkodon) környezetében fellelhető nukleotidek milyenségétől függ. Fúziós protein trp-operon segítségével végzett expressziója esetén ezért előnyösnek tűnik, ha a fúziós protein szerkezeti génjének az elejét az L-peptid első aminosavainak a nukleotidjei alkotják. A találmány előnyös megvalósítása sorén a trp-rendszerben az L-peptid első három aminosavának (az alábbiakban L’-peptid) nukleotidjeit választottuk a fúziós protein N-terminális aminosavainak kodonjaiként.
A fentiek értelmében a találmány fúziós proteinek expressziójához alkalmas vektorokra, előnyösen plazmidokra is kiterjed, ahol a vektorok DNS-a az 5’-végtől sorolva (alkalmas -elrendezésben és fázisban) az alábbiakkal rendelkezik: egy promotor, egy operátor, egy riboszóma-kötőhely és a fúziós protein szerkezeti génje, és a fúziós protein a kivánt protein szekvenciája előtt az I. képletű aminosavszekvenciát (lásd mellékletek) tartalmazza. A szerkezeti gén előtt, illetve annak első triplettjeként az indító kodon (ATG) és adott esetben aminosavakat kódoló további kodonok helyezkednek el, az indító kodon és a D’-szekvencía vagy a D’-szekvencia és a kívánt protein génje között. A kivánt protein amínosav-ősszetételétől függően választjuk a szerkezeti gén előtti DNS-szekvenciát, olyat, amely a kívánt protein lehasitását lehetővé teszi.
A fúziós protein expressziója során célszerű lehet, ha az ATG indító kodont kővető első aminosavak egyes triplettjeit megváltoztatjuk, hogy a küldönc RNS szintjén esetleg bekövetkező bázis-párképződést megakadályozzuk. Az ilyen módosítások, mint ahogy a D’-protein egyes aminosavainak megváltoztatása, kihagyása vagy hozzáadása is szakember számára ismert műveletek, és a találmány ezekre is kiterjed.
Tekintettel arra, hogy a kisebb plazmidoknak több előnye is van, a találmány egy előnyős megvalósítása során a pBR 322 plazmádtól le származtatott plazmidokból a tetraciklin elleni rezisztenciát előidéző szerkezeti gént tartalmazó szakaszt eltávolítjuk. Előnyős, ha a 29. helyen lévő HindlII-vágóhely és a 2066. helyen lévó PvuII-vágóhely közötti szekvenciát távolitjuk el. Különösen előnyős, ha a találmány szerinti pla2midokból még a fentinél valamennyivel nagyobb DNS- szakaszt távolítunk el a trp-operon (leolvasási irányban nézve) elején lévó PvuII-vágóhely felhasználásával (ez a végóhely nem-esszenciális részben helyezkedik el). Ezúton a keletkező nagy fragmenst közvetlenül a
-3197356 két Pvu-végóhellyel ligálhatjuk. A kapott plazmid mintegy 2 kbp-ral (kilobázispárral) kisebb; az expresszió növekedését eredményezi, vélhetően a gazdasejtben készülő kópiák nagyobb száma miatt.
1. példa
a) Kromoszómából származó E. coli-DNS-t Hinf I enzimmel vágunk és a 492 bp fragmenst elkülönítjük; ez a fragmens a trp-operonból a promotort, az operátort, az L-peptid szerkezeti génjét, az attenuátort és a trp-E- szerkezeti gén első hat aminosavának kodonjait tartalmazza. A fragmenst Klenow-féle polimeráz segítségével dezoxinukleotid-trifoszfátokkal kiegészítjük, két végét a HindlII enzim számára felismerhető hellyel rendelkező oligonukleotiddel kötjük össze, majd Hindin enzimmel utóvágjuk.
Az igy kapott HindlII-fragmenst a pBR 322 HindlII-vágóhelyébe lígáljuk. A kapott plazmid a ptrpE2-l plazmid [J.C. Edmann és mts-i, Natúré 291 (1981) 503-506], amely az ott leirt módon ptrpLl plazmiddá alakítunk.
A szintetikusan előállított (NI) és (N2) képletű oligonukleotidek segítségével 5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3’ (NI)
5’ CCT TTG CTT TCA TTG T (N2) (e két oligonukleotid az (N3) képletű kétszálú oligonukleotiddé épül össze:
5’ CGA CAA TGA AAG CAA AGG 3’ (N3)
3’ T GTT ACT TTC GTT TCC. 5’) a ptrpLl plazmid Clal-helyébe az L-peptid első három aminosavának megfelelő DNS-szekvenciát építjük be, és (lásd 1. ábra) további DNS bevitel céljából restrikciós helyet (Stul) létesítünk. A ptrpLl plazmidot a Clal enzimmel a gyártó előírása szerint reagáitatjuk, az elegyet fenollal extraháljuk és a DNS-t etanollal kicsapjuk. Az 5’-végeken lévő foszfátcsoportok eltávolítása végett a kinyitott plazmidot E. coli-bői származó alkálikus foszfatázzal reagáitatjuk. A szintetikus nukleotideket az 5’-végükön foszforilezzűk és T4 DNS-ligázzal a kinyitott, foszfatázzal kezelt plazmidba illesztjük. A ligáz-reakció befejeztével a plazmidot E. coli 294 gazdasejtbe transzformáljuk, és a transzformált kiónokat ampicillin elleni rezisztencia és a Stul restrikciós hely megléte alapján szelektáljuk.
A kapott kiónok mintegy 80%-a rendelkezik a várt restrikciós hellyel, és az 1. ábrán feltüntetett nukleotid-szekvenciát szekvencia-elemzés igazolta. A kész plazmid a ΡΗ120/14 plazmid, amelyben az L-peptid riboszóma-kötőhelye után az L-peptid első három aminosavának nukleotid-triplettjei (L’~ -peptid) következnek, amelyekhez Stul-vágóhely csatlakozik. Az utóbbi további DNS beépítését és igy az L-peptid első három aminosavát tartalmazó fúziós proteinek előállítását teszi lehetővé.
b) Az alábbiakban az alkalmazott (NI) képlete oligonukleotid példáján az ilyen oligonukleotidek kémiai szintézisét részletezzük.
M.J. Gait és mts-i módszere szerint [Nucleic Acids Research 8 (1980), 1081-1096] a 3’-végen lévő nukleozidot - tehát jelen esetben a guanozint - a 3’-hidroxifunkción keresztül üveggyöngy hordozóhoz kapcsoljuk (CPG=controlled poré glase, LCAA=long chain alkyl aniine, gyártja: Pierce) oly módon, hogy a guanozint N-2-izobutiroil-3’-0-szukcinoil5’-dimetoxi-trietiléter alakjában N,N’-diciklohexil-karbodiimid és 4-dimetilami no-piridin jelenlétében a módosított hordozón lévő hosszú láncú amin aminocsoportját acilezi.
A következő lépésekben a bázis-komponenst, 5’-0-dimetoxi-tritil-nukleozid-3’-foszforossav-monometilészter-dialkilamid vagy -klorid alakjában alkalmazzuk. Az adenin N6-benzoil-származék, a citozin N4-benzoil-származék, a guanin N2-izobutil-származék és az aminocsoportot nem tartalmazó timin védöcsoport nélkül kerül felhasználásra, μιηοΐ között guanozint tartalmazó 40 mg hordozót az alábbi vegyszerekkel kezelünk:
a) diklór-metán,
b) diklór-metános 10%-os triklórecetsav-oldat
c) metanol
d) tetrahidrofurán
e) acetonitril
f) a megfelelő nukleozid-foszfit 15 Mmolja és 70 pmol tetrazol 0,3 ml vízmentes acetonban (3 perc),
g) 20%-os acetanhidrid 40% lutidint és 10% dimetilaminopiridint tartalmazó tetrahidrofuránban (2 perc),
Ii) tetrahidrofurán,
i) 20% vizet és 40% lutidint tartalmazó tetrahidrofurán,
J 3%-os jódoldat, kollidin, viz és tetrahidrofurán 5:4:1 térfogatarányban készített elegyében,
k) tetrahidrofurán,
l) metanol.
.Foszfif-on itt a dezoxiribóz-3’-monofoszforossav-monometilésztert értjük, amelynek harmadik vegyértékét klór vagy tercier aminocsoport, például diizopropilamino-csoport köti le. Az egyes szintézislépések hozamát a b) alatt végzett detritilező reakció utón mérhetjük spektrofotometriásán, a dimetoxitritil-kation 496 nm hullámhosszon mért ; abszorpciója alapján.
Az oligonukleotid befejezett szintézise után az oligomer metilfoszfát-védőcsoportjait p-tiokrezol és trietilamin segítségével lehasítjuk. Háromórás ammóniáé kezeléssel az oli, gonukleotidot elválasztjuk a hordozótól. A terméket két, három napon keresztül tömény ammóniával kezelve a bázisok védőcsoportjait kvantitative lehasítjuk. A nyers terméket nagynyomású folyadékkromatográfiával vagy poliakrilamid-gélelektroforézissel tisztítjuk.
A fentieknek megfelelően készítjük a többi oligonukleotideket is.
c) A ptrpE5-l palzmidot [R.A. Hallewell és mts-i, Gene 9 (1980) 27-47] a HindlII és Sáli restrikciós enzimekkel (a gyártó előírása szerint) vágjuk és a mintegy 620 bázispáros DNS-fragmenst eltávolítjuk. Az (N4) és (N5) képletű szintetikus oligonukleotideket 5’ AGC TTC CAT GAC GCG T 3’ (N4)
5’ ACG CGT CAT GGA 3’ (N5) foszforilezzük, együttesen 37 °C-on inkubáljuk, majd DNS-ligázzal a proinzulint kódoló tompa végű DNS-hez addicionáltatjuk [W. Wetekam és mts-i, Gene 19 (1982) 179-183]. HindlII és Sáli enzimekkel végzett kezelés után a most mér meghosszabbított proinzulin-DNS-t a T4 DNS-ligéz enzimmel kovalensen beépítjük a kinyitott plazmidba (2. ábra)» igy a pH10C7/4 plazmidot kapjuk.
A plazmidot először még egyszer Sáli enzimmel reagáltatjuk, az átlapoló végeket Klenow-féle polimerézzal tompa végekké kiegészítjük, majd a plazmidot Mstl enzimmel inkubáljuk. Mintegy 500 bázispáros DNSfragmenst izolálunk, amely a proinzulin komplett kódoló részét és az E. coli trp-operonjának D-proteinjéből mintegy 210 bázispáros szakaszt tartalmaz. A DNS-fragmens tompa végű; a pH120/14 plazmid Stul-helyébe juttatjuk (3. ébra), aminek során a pH154/25 plazmid keletkezik. Ez a plazmid a trp-operon ellenőrzése alatt olyan fúziós proteint képes exprimálni, amelyben az L’- és D’-peptid után az Ala-Ser-Met-Thr-Arg aminosavszekvencia következik, és ehhez a proinzulin aminosavszekvenciája csatlakozik.
2. példa
A pH 154/25 plazmidot (3. ábra) BamHI és XmalII restrikciós enzimekkel vágjuk, és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük, majd T4 DNS-ligázzal összekötjük. A pH254 plazmid (4. ábra) keletkezik, amely a trp-promotor ellenőrzése alatt L’,D’-proinzulin típusú aminosavszekvenciát tartalmazó fúziós protein expressziójára képes. A plazmid a pH154/25 plazmidnál valamennyivel kisebb, ami előnyös lehet.
3. példa
A pH254 plazmidot (2. példa, 4. ábra) az Miül és Sáli restrikciós enzimekkel inkubálva 280 bázispáros szakaszt szabadítunk fel, majd eltávolítjuk. A maradék plazmidot Klenow-polimerázzal tompa végű formává alakítjuk, majd DNS-ligázzal újból kovalensen ciklizéljuk. A kapott pH255 plazmid (4. ábra) alkalmas arra, hogy szerkezeti gént vigyen a Miül, Sáli vagy EcoRI restrikciós helyekbe. Indukáló körülmények között L’,D’-proteint tartalmazó fúziós protein képződik. Termé6 szetesen alkalmas linker alkalmazásával további restrikciós helyeken is bevihetünk a pH255 plazmidba.
4. példa
A pH154/25 plazmidot (3. ábra) a Miül és EcoRI enzimekkel inkubáljuk, és a kivált DNS-fragmenést (mintegy 300 bp) eltávolítjuk. A maradék plazmidot Klenow-polimerázzal feltöltjük. DNS-ligázzal gyűrúzárást végzünk. A kapott pH256 plazmid (5. ábra) szerkezeti géneknek az EcoRI-helybe történő beviteléhez alkalmas.
5. példa
A pH256 plazmidból (4. példa, 5. ábra) 600 bp-fragmenst távolítunk el a BamHI és Nrul enzimekkel, igy kapjuk a pH257 plazmidot (5. ábra). A pH256 plazmidot először BamHI enzimmel inkubáljuk, majd Klenow-polimerázzal tompa végeket alakítunk ki. Nrul enzimmel végzett inkubálás és a 600 bp-fragmens eltávolítása után DNS-ligázzal inkubaijuk a plazmidot, igy képződik a pH257 plazmid.
6. példa
A pKK 177-3 plazmidba [Amann és mts-i, Gene 25 (1983) 167] a lac-represszort beépítve [P.J. Farabaugh, Natúré 274 (1978) 765769] jutunk a pJF118 plazmidhoz. Ezt EcoRI és Sáli enzimekkel reagáltatjuk, és a maradék plazmidot izoláljuk.
A pH106/4 plazmidból (2. ábra) Sáli behatásával és Mtsl enzimmel végzett inkubalással mintegy 495 bázispáros fragmenst nyerünk.
A szintetikusan előállított (N6) és (N7) képletű oligonukleotideket 5’ ACG AAT TCA TGA AAG CAA AGG 3’ (N6)
5’ CCT TTG CTT TCA TGA ATT CGT 3’ (N7) foszforilezzük és DNS-ligázzal a tompa végű DNS-fragmenshez addicionáltatjuk. Az EcoRI és Sáli enzimekkel végzett reagáltatás útján átlapoló végeket alakítunk ki, amelyekkel ligálni lehet a DNS-fragmenst a kinyitott pJF118 plazmidba.
A kapott hibridplazmídot az E. coli 294 mikroorganizmusba transzformáljuk, majd a restrikciós fragmensek mérete alapján kiválasztjuk a kívánt kiónokat. A hibridplazmid (6. ábra) jele pJ120,
A fúziós protein expresszióját rázólombikban végezzük az alábbiak szerint.
A pJ120 plazmidot tartalmazó E. coli 294 transzformált egyedekből álló, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben (J.H. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, 1972) egy éjsza-510 kén ét tenyésztett kultúrából mintegy 1:100 arányban új tenyészetet állítunk be, és a növekedést OD-méréssel figyeljük. OD=0,5 értéknél a tenyészethez annyi izopropil-/3-Dgalaktropiranozidot (IPTG) adunk, hogy koncentrációja a közegben 1 mmól legyen. 150-180 perc elteltével a baktériumokat lecentrifugáljuk, 5 percen át pufferoldatban (7 M karbamid, 0,1% SDS, 0,1 M nátrium-foszfát, pH 7,0) forraljuk, majd mintákat SDS-gél-elektroforézis lemezre viszünk. A pJ120 plazmidot tartalmazó baktériumok az elektroforézis során olyan proteinsávot adnak, amely a várt fúziós protein móltőmegének megfelel és inzulin elleni antitestekkel reagál. A fúziós protein elkülönítése után brómciánnal fel lehet szabadítani a várt proinzulin-származékot. A baktériumok feltárása [French Press; (s)Dyno-malom] és centrifugálása után az L’-D’-proinzulin-fúziós protein a csapadékban van, igy a felülúszó rész eltávolításával a többi proteinek zömét már elválasztjuk.
A fenti körülmények rázott kultúrákra érvényesek; nagyobb fermentor esetén az OD-értéket megfelelően, adott esetben az IPTG-koncentrációt is enyhén meg kell változtatni.
7. példa
A pH154/25 plazmidot (3. ábra) tartalmazó E. coli 294 transzformált egyedekből álló, 50 pg/ml ampicillint tartalmazó LB-közegben egy éjszakán át tenyésztett kultúrát másnap mintegy 1:100 arányban 2000 pg/ml .Casamino acids hidrolizátumot és 1 pg/ml tiamint tartalmazó M9-kőzeggel (J.H. Miller, a fent megadott helyen) hígítjuk. OD=0,5 értéknél annyi indolil-3-akrilsavat adunk a tenyészethez, hogy a koncentráció 15 pg/ml legyen. Két-há -rom óra inkubálás után a baktériumokat lecentrifugáljuk. Az SDS-gél-elektroforézis a fúziós protein várt helyén igen erős proteinsávot mutat, amely inzulin elleni antitestekkel reakciót ad. A baktériumok feltárása és centrifugálása után az L’.D’-proinzulin-fúziós-protein a csapadékban van, így a felülúszó résszel együtt már a többi protein tetemes részét is eltávolítjuk.
Ez esetben is a megadott indukciós körülmények rázott tenyészetre érvényesek. Nagyobb térfogatú fermentálás esetén a Casamido acids koncentráció változtatása, illetve L-triptofán hozzáadása szükséges.
8. példa
A pH154/25 plazmidot (3. ábra) EcoRI enzimmel nyitjuk, és a túlnyúló DNS-szálakat Klenow-polimerázzal feltöltjük. Az így kapott DNS-t a Miül enzimmel inkubáljuk, és az inzulint kódoló DNS-részt a plazmidból kivágjuk. A kivágott részt gél-elektroforézissel elkülönítjük a maradék plazmádtól, és a maradék plazmidot izoláljuk.
A 3 429 430 sz. NSZK-beli közrebocsátási irat 3. ábráján ismertetett plazmidot az AccI és Sáli restrikciós enzimekkel reagáltatjuk és a hirudin-szekvenciát tartalmazó DNSfragmenst elkülönítjük. A Sáli vágóhely túlnyúló végeit Klenow-polimerázzal feltöltjük, és a DNS-t a szintetikusan előállított (N8) képletű DNS-sel
Met Thr
5’ CCG ACG CGT ATG ACG T 3’ (N8)
3’ GGG TGC GCA TAC TGC ATA 5’ ligáljuk. A ligációs terméket Miül enzimmel inkubáljuk, majd az enzimet 65 °C-on inaktiváljuk, és a DNS elegyet 37 °C-on egy órán át aikálikusan marhafoszfatázzal kezeljük. Utána mind a foszfatázt, mind a restrikciós enzimet fenollal végzett extrahálás útján az elegyből eltávolítjuk és a DNS-t etanollal kicsapva tisztítjuk. Az így kezelt DNS-t T4-1Ígázzal a pH154/25 nyitott maradék plazmidba illesztjük; így a 7. ábrán mutatott pK150 plazmidot kapjuk, amelyet restrikciós elemzéssel, valamint Maxam és Gilbert szerint végzett szekvencia-elemzéssel azonosítunk.
9. példa
A pK150 plazmidot (7. ábra) tartalmazó E. coli 294 baktériumokat 30-50 pg/ml ampicillint. tartalmazó LB-közegben egy éjszakán át 37 °C-on tenyésztjük, másnap a tenyészetet mintegy 1:100 arányban 2000 pg/1 .Casamino Acids. hidrolizátumot és 1 pg/ml tiamint tartalmazó M9-közeggel hígítjuk és 37 °C-on állandó keverés közben inkubáljuk. ODeoo= =0,5, illetve 1 esetén indolil-3-akrilsavat adunk a tenyészethez 15 pg/ml koncentráció eléréséig, majd 2-3 órán át, illetve 16 órán át inkubáljuk a tenyészetet. Utána a baktériumokat lecentrifugáljuk és 0,1 M nátrium-foszfát-pufferben (pH 6,5) nyomás alatt feltárjuk. A nehezen oldódó proteineket leszűrjük, és SDS-poliakrilamid elektroforézissel azonosítjuk. Azok a sejtek, amelyekben a trp-operon beindult, 20 000 daltonnái kisebb, de 14 000 daltonnái nagyobb mólsúlyú új proteint tartalmaznak, amely a nem indukált (be nem indult) sejtekben nem található. A fúziós proteint elkülönítjük és brómciánnal a hirucint felszabadítjuk.
10. példa
Az alábbiakban olyan szerkezeteket mutatunk be, amelyekkel különböző restrikciós enzimek által felismerhető helyeket minél nagyobb számban tartalmazó DNS-szekvenciákat lehet beépíteni a trp-D-szekvencia 5'-vége elé. Az így módosított trp-D-szekvencia a
-612 legkülönbözőbb prokarióta expressziós rendszerekbe univerzálisan beépíthető.
A pUC12 és pUC13 (Pharmacia P-L Biochemicals, 5401 St. Goar: The Molecular Biology Catalogue 1983, Appendix, 89. oldal) 5 plazmidok egy-egy polilinker szekvenciát tartalmaznak. A pUC13 plazmidba, mégpedig az Xmal és a SacI restrikciós vágóhelyek közé a pK150 plazmidból (7. ábra) származó HindlII-hirudin-SacI-fragmenssel fuzionált, 10 maga a p 106/4 plazmidból (2. ábra) származó Mstl-HindlII-trp-fragmenst építjük.
E célból a pUC13 plazmid DNS-ét először az Xmal restrikciós enzimmel kezeljük. A kiegyenesített plazmid végeit Klenow-polime- 15 rázzál feltöltjük. A DNS-t etanollal kicsapjuk.
Ezt követően a DNS-t vizes közegben a pH 106/4 plazmidból izolált Mstl-HindlII-trp-D-fragmenssel és a pK150 plazmidból izolált HindlII-SacI-hirudin-fragmenssel T4 DNS-li- 20 gáz jelenlétében reagáltatjuk.
Az így kapott pK160 plazmid közvetlenül a trp-D-szekvencia előtt többfúziós felismerési szakaszt tartalmaz, amely az Xmal, Smal, BamHI, Xbal, HincII, Sáli, AccI, Pstl és 25 HindlII restrikciós enzimek számára felismerhető vágóhelyeket tartalmaz. Emellett a hirudin-szekvencia 3’-végén EcoRI-vágóhely adódik (8. ábra).
11. példa
A pH131/5 plazmidot (a nyilvánosságra nem hozott P 3 514 113.1 sz. NSZK-beli sza- 35 badalmi bejelentés 1. példája szerint) úgy állítjuk elő, hogy a ptrpLl plazmidot [J.C. Edman és mts-ί, Natúré 291 (1981) 503-306] Clal enzimmel megnyitjuk, majd a szintetikusan előállított, önkomplementer (N9) képletű 40 oligonukleotiddel
5’ pCGACCATGGT 3’ (N9) ligáljuk.
Az igy kapott pH131/5 plazmid (9. ábra) már tartalmaz felismerési helyet az Ncol en- 45 zim számára. E helyen a plazmidot megnyitjuk, a túlnyúló végeket Klenow-polimeráz reakcióval kiegészítjük, és a kiegyenesített, sima végű DNS-t EcoRI enzimmel utóvágjuk. A két keletkezett DNS-szekvencia közül a na- 50 gyobbikat etanolos kicsapással a kisebb szekvenciától elválasztjuk. A pH131/5 plazmid igy nyert maradék DNS-ét a pK160 plazmidból származó, trp-D’-hirudint kódoló fragmenssel ligáljuk T4 ligázzal. Az említett frag- 55 menst a pK160 plazmidból vágjuk ki a Hinc II és EcoRI enzimekkel, gél-elektroforetikusan elválasztjuk a maradék plazmidtól, majd a gélanyagból eluáljuk. A Íigációs terméket az E. coli K12 törzsbe transzformáljuk. A 60 plazmid-DNS-t tartalmazó kiónokat izoláljuk és restrikciós elemzéssel, valamint DNS-szekvencia-elemzéssel azonosítjuk. A kapott pK-170 plazmid (9. ábra) a trp-operatorhoz fuzionálva olyan DNS-szekvenciát tartalmaz, 65 8 amely a Met-Asp-Ser-Arg-Gly-Ser-Pro-Gly-trp-D’-(hirudin) sorozatot kódolja.
12. példa
A pJF118 plazmidot (6. példa) EcoRI enzimmel megnyitjuk, és a túlnyúló DNS-végeket Klenow-polimeráz-reakcióval sima véggé alakítjuk. Az így kezelt plazmidot a Sáli enzimmel vágjuk. A rövid EcoRI-Sall fragmenst gélelektroforézissel eltávolítjuk.
A pK170 plazmidot (11. példa) Ncol enzimmel vágjuk, és a túlnyúló végeket Klenow-polime rázzál sima véggé alakítjuk. A plazmid-DNS-t etanolos kicsapással elválasztjuk a reakcióelegyből, majd a HindlII és BamHI enzimekkel kezeljük. A keletkező több fragmens közül kettőt elkülönítünk, mégpedig a (feltöltött végű) NcoI-trpD’-HindlII-fragraenst és a HindlII-hirudin-BamHI-fragmenst (9. ábra) (3 429 430 sz. NSZK-beli kőzrebocsátási irat). A két fragmenst elektroforetikai módon izoláljuk.
Végül a 3 429 430 sz. NSZK-beli közrebocsátás! irat 2. ábrája szerinti BamHI-SalI-hirudinll-fragmenst izoláljuk. Mind a négy fragmenst, azaz a pJF118 plazmid maradékát, az NcoI-trpD’-HindlII-fragmenst, a HindlII-hirudin-BamHI-fragmenst és a hirudinll-fragmenst Íigációs reakcióban reagáltatjuk egymással. A kapott pK180 plazmidot (10. ábra) a E. coli K12-W 3110 baktériumba transzformáljuk. A tervezettnek megfelelő plazmid-DNS-ben EcoRI-trpD’-hirudin-Sall-fragmens mutatható ki.
A trpD’-hirudin-szekvencia most össze van kötve a tac-promotorral. A fúziós protein expressziója a 6. példában leírtak szerint történik.
13. példa
A pBR 322 plazmidtól leszármaztatott plazmidok, így a pH120/14 (1. példa, 1. ábra), pH154/25 (1. példa, 3. ábra), pH256 (4. példa,
5. ábra), pK150 (8. példa 7. ábra) és pK170 (11. példa, 9. ábra) plazmidok esetén (az ábrákon az óramutató irányában) a fúziós protein indító kodonja és a legközelebbi HindIII-hely (a pBR322 29. helyén lévő HindlII-nak a megfelelője) között a trp-promotort és -operátort tartalmazó fragmensben (bár nem a promotor tartományán belül) járulékos PvuII-hely van.
Azt tapasztaltuk, hogy ha az említett PvuII-hely és a pBR322 plazmid 2066. helyének megfelelő PvuII-hely közötti DNS-szakaszt eltávolítjuk, a klónozott, illetve a fúziós protein hozama észrevehetően növekszik.
Az alábbiakban példaként a pH 154/25 plazmid rövidítését Írjuk le pH154/25* plazmiddá. Ez a művelet a többi említett plazmid esetén analóg módon elvégezhető (az így rő-714 videbbre szabott plazmidokat * csillaggal jelöltük).
A pH154/25 plazmidot (a gyártó előírása szerint) PvuII enzimmel reagáltatjuk, amikor is három fragmens keletkezik:
1. fragmens: a proinzulin PvuII-vágóhelyétől a pBR322 plazmid 2066. helyének megfelelő PvuII-vágóhelyigj
2. fragmens: a trp-promotorhoz közeli PvuII-vágóhelytől a proinzulin PvuII-helyéig;
3. fragmens: a trp-promotorhoz közeli PcuII-helytől a pBR322 plazmid 2066. helyének megfelelő PvuII-helyig·
A fragmenseket agarózon végzett elektroforézissel (Maniatis és mts-i, Molecular Cloning, Cold Spring Harbor 1982) szétválasztjuk.
Az 1. és 2. fragmenst .blunt end' körülmények között T4 DNS-ligázzal összekapcsoljuk. E. coli 294 mikroorganizmusba transzformálva megvizsgáljuk, hogy melyek azok a telepek, amelyekben a teljes proinzulin-szekvenciát tartalmazó plazmid előfordul, azaz a fragmensek a kívánt módon elrendeződtek. A pH154/25* plazmidot a 11. ábra mutatja. Az expressziót az előző példákban leírtak szerint végezzük. A fúziós protein hozama észrevehetően nagyobb.
14. példa
A pH154/25* plazmidot (13. példa, 11. ábra) HindllI és Sáli enzimekkel bontjuk, és a kisebb fragmenst (amely a proinzulin-szekvenciát tartalmazza) gél-elektroforetikusan elválasztjuk. A nagyobb fragmenst izoláljuk és az (N10) képletű szintetikus DNS-sel (Alá) Trp Glu Asp Pro Met Ile Glu (Gly) (Arg)
A GCT TGG GAG CCT ATG ATC GAG GG (N10)
ACC CTC CTA GGA TAC TAG CTC CCA GCT ligáljuk. A plntl3 plazmidot (12. ábra) kapjuk. Az (N10) képletű DNS olyan aminosav-szekvenciát kódol, amelyben több hasítási hely van kémiai hasítás elvégzésére:
a) Met a brómciános hasításhoz,
b) Trp az N-bróm-szukcinimiddel (NBS vagy BSI) végzett hasításhoz,
c) Asp-Pro a proteolitikus hasításhoz, ahol az előtte lévő Glu az Asp-Pro-kőtést még savérzékenyebbé teszi.
Azáltal, hogy az (N10) képletű HindlII-Sall-linkert egy kódolt polipeptid olvasókeretébe illesztettük, a kémiai hasítás fent említett lehetőségeit biztosítottuk, a kívánt protein aminosav-szekvenciája vagy hasító ágensekkel szembeni érzékenysége függvényében.
Az ábrák nem méretarányosak.
1. melléklet
Aminosav- •szekvencia
23 Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile
Tyr 10 Arg Asn His Ile Pro Alá Gin
Thr Leu Ile 20 Glu Arg Leu Alá Thr
Met Ser Asn Pro Val 30 Leu Met Leu
Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro 40 Ser
Glu Alá Gly Cys Met Pro Glu Leu
Leu 50 Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu
Pro Ile Ile 60 Gly Ile Cys Leu Gly
His Gin Alá Ile Val 70 Glu (93) Alá
1. Melléklet
DNS-szekvencia
Ser Asn Gly His Asn Val Val Ile
AGC AAT GGG CAT AAC GTG GTG ATT
10
Tyr Arg Asn His Ile Pro Alá Gin
TAC CGC AAC CAT ATA CCG GCG CAA
Thr Leu Ile 20 Glu Arg Leu Alá Thr
ACC TTA ATT GAA CGC TTG GCG ACC
50
Met Ser Asn Pro Val 30 Leu Met Leu
ATG AGT AAT CCG GTG CTG ATG CTT
Ser Pro Gly Pro Gly Val Pro 40 Ser
TCT CCT GGC CCC GGT GTG CCG AGC
100
Glu Alá Gly Cys Met Pro Glu Leu
GAA GCC GGT TGT ATG CCG GAA CTC
50
Leu Thr Arg Leu Arg Gly Lys Leu
CTC ACC CGC TTG CGT - GGC AAG CTG
150
9
-816
Pro Ile Ile Gly Ile Cys Leu Gly
CCC ATT ATT GGC ATT TGC CTC GGA
70
His Gin Alá . Ile Val Glu Alá
Cat CAG GCG ATT GTC GAA GCT
200

Claims (5)

  1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK
    1. Eljárás valamely célfehérje vagy peptid géntechnikai úton, fúziós fehérje formán keresztül végzett előállításának könnyítésére, azzal jellemezve, hogy egy
    Met-Xn-D’-(Y)--Z képletű amínosavszekvenciának megfelelő génszerkezetet - a képletben n jelentése 0 vagy 1,
    X jelentése 1-12 aminosav hosszúságú szekvencia,
    D’ jelentése az E. coli trp-operonjában előforduló D-peptid 23-93. aminosavának megfelelő 70 aminosav szekvenciája, illetve ennek legfeljebb 6 aminosav kiiktatásával, hozzátoldásával vagy cseréjével megváltoztatott variánsa,
    Y jelentése 1-4 aminosavból álló híd, amely enzimesen vagy kémiai úton hasítható, illetve lehasitható, m jelentése 1,
  2. 2, 3 vagy 4 és Z jelentése a célfehérje vagy -peptid szekvenciája - megfelelő vektorba épitünk, a vektort E. coli sejtbe transzoméi juk, a
    5 transzformált törzset megfelelő közegben tenyésztjük, a tenyészléből vagy a sejtekből a fúziós fehérjét izoláljuk, és a fúziós fehérjét az Y jelű hídnál hasítva a célfehérjét vagy -pepiidet kinyerjük.
    10 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy D’-ként a vektorba az 1. mellékletben feltüntetett DNS szekvenciát tartalmazó génszerkezetet építjük be.
  3. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljá15 rás, azzal jellemezve, hogy X-ként
    5’ AAA GCA AAG GGC 3’ kódoló szálú DNS szekvenciát tartalmazó génszerkezetet építünk be.
  4. 4. Az 1-3. igénypontok bármelyike sze20 rinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a génszerkezetet fázishűen olyan vektorba építve transzformáljuk a gazdasejtbe, amely vektor az E. coli trp-operonjából a promotort, az operátort és az L-peptid riboszómakötöhelyét
    25 tartalmazza.
  5. 5. A 4. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a vektor pBR 322 származék, amelyből a 29. helyen álló Hindlll hely és a 2066. helyen álló PvuII hely közötti
    30 DNS-rész hiányzik.
HU863100A 1985-07-27 1986-07-25 Process for producing fusion proteins HU197356B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE19853526995 DE3526995A1 (de) 1985-07-27 1985-07-27 Fusionsproteine, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung

Publications (2)

Publication Number Publication Date
HUT43629A HUT43629A (en) 1987-11-30
HU197356B true HU197356B (en) 1989-03-28

Family

ID=6276985

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HU863100A HU197356B (en) 1985-07-27 1986-07-25 Process for producing fusion proteins

Country Status (18)

Country Link
EP (1) EP0211299B1 (hu)
JP (1) JPH07113040B2 (hu)
KR (1) KR950000299B1 (hu)
AT (1) ATE50596T1 (hu)
AU (1) AU595221B2 (hu)
CA (1) CA1336329C (hu)
DE (2) DE3526995A1 (hu)
DK (1) DK172618B1 (hu)
ES (1) ES2000278A6 (hu)
FI (1) FI86887C (hu)
GR (1) GR861957B (hu)
HU (1) HU197356B (hu)
IE (1) IE59127B1 (hu)
IL (1) IL79522A (hu)
NO (1) NO175640C (hu)
NZ (1) NZ216967A (hu)
PT (1) PT83065B (hu)
ZA (1) ZA865556B (hu)

Families Citing this family (28)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3738541A1 (de) * 1987-11-13 1989-05-24 Hoechst Ag Verfahren zur isolierung und reinigung von hirudin
DE3541856A1 (de) * 1985-11-27 1987-06-04 Hoechst Ag Eukaryotische fusionsproteine, ihre herstellung und verwendung sowie mittel zur durchfuehrung des verfahrens
DE3781819T2 (de) * 1986-03-12 1993-01-07 Imcera Group Inc Hybride expressionsvektoren, deren herstellung und verwendungen.
WO1988010299A1 (en) * 1987-06-24 1988-12-29 Novo-Nordisk A/S A process for preparing a protein or polypeptide, a dna sequence coding for the polypeptide, a microorganism containing the dna sequence as well as the polypeptide and its use as a pharmaceutical preparation
US5179196A (en) * 1989-05-04 1993-01-12 Sri International Purification of proteins employing ctap-iii fusions
US5227293A (en) * 1989-08-29 1993-07-13 The General Hospital Corporation Fusion proteins, their preparation and use
US5358857A (en) * 1989-08-29 1994-10-25 The General Hospital Corp. Method of preparing fusion proteins
GR1005153B (el) * 1989-08-29 2006-03-13 The General Hospital Corporation Πρωτεινες συντηξεως, παρασκευη τους και χρηση τους.
GB8927722D0 (en) * 1989-12-07 1990-02-07 British Bio Technology Proteins and nucleic acids
DE3942580A1 (de) * 1989-12-22 1991-06-27 Basf Ag Verfahren zur herstellung von hirudin
ES2218622T3 (es) 1996-07-26 2004-11-16 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Derivados de insulina con actividad de union al zinc incrementada.
DE19726167B4 (de) 1997-06-20 2008-01-24 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulin, Verfahren zu seiner Herstellung und es enthaltende pharmazeutische Zubereitung
DE19825447A1 (de) 1998-06-06 1999-12-09 Hoechst Marion Roussel De Gmbh Neue Insulinanaloga mit erhöhter Zinkbildung
DE10114178A1 (de) 2001-03-23 2002-10-10 Aventis Pharma Gmbh Zinkfreie und zinkarme Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
DE10227232A1 (de) 2002-06-18 2004-01-15 Aventis Pharma Deutschland Gmbh Saure Insulinzubereitungen mit verbesserter Stabilität
PL2201120T3 (pl) 2007-09-21 2014-05-30 Cadila Healthcare Ltd Systemy białek fuzyjnych GCSF odpowiednie do wysokiej ekspresji peptydów
BR122013025625B1 (pt) 2008-10-17 2021-08-03 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Composição farmacêutica, seu uso e método de preparação da mesma, kit e dispositivo
ES2676373T3 (es) 2009-11-13 2018-07-19 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Composición farmacéutica que comprende un agonista de GLP-1, una insulina y metionina
SI2498801T1 (en) 2009-11-13 2018-06-29 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh A pharmaceutical composition containing desPro36Exendin-4 (1-39) -Lys6-NH2 and methionine
RS55378B1 (sr) 2010-08-30 2017-03-31 Sanofi Aventis Deutschland Upotreba ave0010 za proizvodnju leka za tretman diabetes mellitus tipa 2
US9821032B2 (en) 2011-05-13 2017-11-21 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for improving glycemic control as add-on therapy to basal insulin
US9408893B2 (en) 2011-08-29 2016-08-09 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Pharmaceutical combination for use in glycemic control in diabetes type 2 patients
TWI559929B (en) 2011-09-01 2016-12-01 Sanofi Aventis Deutschland Pharmaceutical composition for use in the treatment of a neurodegenerative disease
LT3229828T (lt) 2014-12-12 2023-06-12 Sanofi-Aventis Deutschland Gmbh Insulino glargino/liksisenatido fiksuoto santykio kompozicija
TWI748945B (zh) 2015-03-13 2021-12-11 德商賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患治療
TW201705975A (zh) 2015-03-18 2017-02-16 賽諾菲阿凡提斯德意志有限公司 第２型糖尿病病患之治療
KR20200080748A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 음이온 교환 크로마토그래피를 이용한 인슐린 전구체의 정제방법
KR20200080747A (ko) 2018-12-27 2020-07-07 주식회사 폴루스 인슐린 전구체의 인슐린 효소 전환용 조성물 및 이를 이용하여 인슐린 전구체를 인슐린으로 전환하는 방법

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GR68404B (hu) * 1979-06-01 1981-12-29 Univ California
ZA811368B (en) * 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
WO1986005513A1 (en) * 1985-03-18 1986-09-25 Gene Labs, Inc. Hybrid-gene cassette vector
GB8507666D0 (en) * 1985-03-25 1985-05-01 Wellcome Found Epidermal growth factor production
ATE109512T1 (de) * 1985-04-08 1994-08-15 Genetic Systems Corp Expression und diagnose mit gag-kodierten peptiden, die mit antikörpern gegen lav immunologisch reaktiv sind.

Also Published As

Publication number Publication date
AU595221B2 (en) 1990-03-29
DE3526995A1 (de) 1987-02-05
NO175640C (no) 1994-11-09
KR950000299B1 (ko) 1995-01-13
ES2000278A6 (es) 1988-02-01
CA1336329C (en) 1995-07-18
KR870001312A (ko) 1987-03-13
NO863000L (no) 1987-01-28
PT83065A (de) 1986-08-01
IL79522A (en) 1991-08-16
FI86887B (fi) 1992-07-15
DK355486D0 (da) 1986-07-25
FI863041A (fi) 1987-01-28
DK355486A (da) 1987-01-28
NZ216967A (en) 1988-08-30
HUT43629A (en) 1987-11-30
IL79522A0 (en) 1986-10-31
IE59127B1 (en) 1994-01-12
DE3669175D1 (de) 1990-04-05
EP0211299A2 (de) 1987-02-25
EP0211299A3 (en) 1988-06-01
PT83065B (pt) 1989-02-28
ZA865556B (en) 1987-03-25
ATE50596T1 (de) 1990-03-15
FI86887C (fi) 1992-10-26
IE861977L (en) 1987-01-27
EP0211299B1 (de) 1990-02-28
DK172618B1 (da) 1999-03-01
NO175640B (hu) 1994-08-01
GR861957B (en) 1986-11-25
JPH07113040B2 (ja) 1995-12-06
FI863041A0 (fi) 1986-07-24
AU6056586A (en) 1987-01-29
NO863000D0 (no) 1986-07-25
JPS6229600A (ja) 1987-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
HU197356B (en) Process for producing fusion proteins
IL95495A (en) Fusion proteins their preparation and use
KR930009337B1 (ko) 히루딘을 유전공학적으로 제조하는 방법
Urdea et al. Chemical synthesis of a gene for human epidermal growth factor urogastrone and its expression in yeast.
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
KR100858009B1 (ko) 세균 배양물의 상층액으로 목적 단백질의 분비를 위한 융합 단백질
JPH0141312B2 (hu)
EP0177915B1 (en) Novel dna, production and use thereof
HU197349B (en) Process for producing cloning vectors usable for the expression of growth hormones
KR940005585B1 (ko) 과립구 대식세포 콜로니 촉진 인자(gm-csf)단백질의 제조방법
JPH06153957A (ja) ヒトγ−インターフェロンの部分アミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列
CA2439042C (en) Use of fusion proteins whose n-terminal part is a hirudin derivative for the production of recombinant proteins via secretion by yeasts
DK166681B1 (da) Dna-sekvenser, dna-sekvenser og dna-oligonucleotider til brug ved fremstilling af de foerstnaevnte dna-sekvenser, hybridplasmider indeholdende dna-sekvens, vaertsceller indeholdende hybridplasmiderne samt genteknologisk fremgangsmaade til fremstilling af il-2
IE67890B1 (en) Enhanced Protein production in bacteria by employing a novel ribosome binding site
US20030170811A1 (en) Process for the production of alpha-human atrial natriuretic polypeptide
US4711847A (en) Preparation of secretin
IE57976B1 (en) Vectors for expressing bovine growth hormone derivatives
EP0207165A1 (en) Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms
IE852440L (en) Signal for protein transport
Giza et al. A self-inducing runaway-replication plasmid expression system utilizing the Rop protein
IE62522B1 (en) A process for the preparation of foreign proteins in streptomycetes
KR940004543B1 (ko) 이.콜라이의 trp 발현 시스템을 갖는 벡터를 제조하는 방법
JP2524693B2 (ja) 蛋白質の製造法
JPH0644866B2 (ja) ヒト表皮細胞増殖因子生産用形質転換体
JPH0642833B2 (ja) ヒト表皮細胞増殖因子の遺伝子

Legal Events

Date Code Title Description
HU90 Patent valid on 900628