KR100468268B1 - 카메라단백질및프로세싱효소를사용한이의절단방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 목적 단백질을 포함하는 키메라 단백질로서, 프로세싱 효소에 의해 용이하게 개열되고, 우수한 효율로 목적 단백질을 회수할 수 있도록 하는 화학식 1의 키메라 단백질을 제공하는 것이다.
화학식 1
A-L-B
상기식에서,
A는 보호 펩티드이고;
B는 목적 펩티드이고;
L은 링커 펩티드로서, 이의 C-말단 부분에 X1-X2-(Pro, Lys 또는 Arg)-Arg(여기서, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다) 서열을 가지고, N-말단에 His가 풍부한 부분을 가진다.

Description

키메라 단백질 및 프로세싱 효소를 사용한 이의 절단 방법
본 발명은, 생리활성 펩티드 또는 이의 전구체를 생산할 때에 기질이 되는 키메라 단백질 및 이의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 키메라 단백질로부터 상기 생리활성 펩티드를 유리시켜 정제하는 방법에 관한 것이다.
키메라 단백질 발현법에 의한 다수의 펩티드 생산 방법이 시도되고 있다. 목적 펩티드의 유리 방법으로서, 화학적 혹은 효소에 의한 절단이 사용되고 있다. 효소로서는, 라이신 잔기의 C 말단측의 펩티드 결합을 특이적으로 절단하는 라이실엔도 펩티다제(아크로모벡터프로테아제-I), 글루타민산 잔기의 C 말단측을 특이적으로 절단하는 포도상구균성 프로테아제(staphylococcal protease) V8 등이 있다. 화학적 방법으로서는, 아질산에 의한 아스파라긴 잔기의 개열, CNBr에 의한 메티오닌 잔기의 개열 등이 있다.
화학적 방법은, 목적 펩티드의 변형을 피할 수 없고, 절단 후의 목적 펩티드의 정제에 있어서 여러가지의 유사체로부터의 정제가 필요하게 된다. 한편, 효소 절단 방법은, 특이성이 높고, 절단도 비교적 온화한 조건으로 행하여지기 때문에, 목적 펩티드의 정제가 용이하지만, 이들의 효소가 이용가능한가 아닌가는 목적 펩티드의 아미노산 서열에 의존하기 때문에, 기존의 프로테아제를 선택할 수 없는 경우가 있고, 범용성이 높은 절단 효소가 요구되고 있다.
펩티드 호르몬 및 이의 전구체가 생체내에서 생성될 때, 상기 펩티드의 전구폴리펩티드가 효소(프로세싱 효소)에 의해 특이적으로 절단된다. 상기 효소에는, 전구체 변환효소 1/3(PC1/3), 전구체 변환효소 2(PC2), 푸린(furin) 등이 공지되어 있고, 사카로마이세스·세레비시애(Saccharomyces cerevisiae)의 α-인자(α-mating factor)의 생성시에 작용하는 Kex2 프로테아제도 이의 일종이다. 이들 프로세싱 효소를 키메라 단백질로부터의 목적 펩티드의 절단에 직접 사용할 경우, 펩티드 호르몬을 손상시키지 않고, 또한, 다종다양한 펩티드에 적용할 수 있는 것으로 기대할 수 있기 때문에, 이러한 생산 방법이 요망되고 있다.
본 발명자들은, 대장균 β-갈락토시다제 유래 폴리펩티드를 보호 펩티드로하여, 적절한 링커 펩티드를 선택하여, 목적 펩티드와의 키메라 단백질을 대장균체 내에서, 효율적으로 불용성의 봉입체로서 생산하는 방법을 보고하였다(공개특허공보 제5-328992호). 상기 키메라 단백질은, 요소 등의 변성제로 가용화되어, 프로세싱 효소의 기질로 된다.
한편, 본 발명자들은 막 결합형 효소인 사카로마이세스·세레비시애 유래의 Kex2 프로테아제를, 이의 유전자를 개변함으로써, 가용성 효소(분비형 Kex2 유도체)로서 생산하는 방법을 보고하였다(「분비형 Kex2 유도체의 제조방법」이라는 표제의 평성 8년 3월 4일 출원의 명세서). 그러나, 본 효소를 프로세싱 효소로서 사용하는데 있어서, 이의 기질이 되는 키메라 단백질의 설계에 대한 언급은 이루어지지 않았다.
그리고, 대량 배양하에, 대장균체내에서 효율이 우수한 봉입체로서 생산되어, 프로세싱 효소가 유효하게 작용하는 조건하에서 용이하게 가용화되는 키메라 단백질을 설계하여, 생산하는 방법, 또한 프로세싱 효소에 의해 목적 펩티드가 키메라 단백질로부터 우수한 효율로 절단되도록 절단 부위 부근의 아미노산 서열을 설계하여, 생산하는 방법의 개발이 요망되고 있다. 또한, 이렇게 하여 생산된 생리활성 펩티드를 99% 이상 순도로까지 높은 회수율로 정제하는, 범용성이 높은 정제 방법의 개발도 동시에 요망되고 있다.
따라서, 본 발명은 분비형 Kex2 유도체와 같은 프로세싱 효소를 사용하여 생리활성 펩티드를 생산할 때에 기질이 되는 키메라 단백질의 설계, 생산 방법 및 상기 펩티드의 정제 방법을 제공하고자 하는 것이다.
본 발명자들은, 상기의 과제의 해결 방법을 검토한 결과,
1) 키메라 단백질에, His가 풍부한 서열, 예를 들면 {(His)4-Pro-Gly}n(n=1 내지 6)을 포함하는 링커 펩티드를 삽입하는 것이 생산량의 증가와 분비형 Kex2 유도체와 같은 프로세싱 효소 반응 조건하에서의 용해성의 상승으로 연결된다는 사실,
2) 링커내의 프로세싱 효소 작용 부위의 아미노산 서열을 X1-X2-(Lys/Arg/Pro)-Arg로 하고, 바람직하게는, X1로서 Lys, Arg 또는 His를 선택하고, X2로서 His 또는 Phe를 선택하는 것이, 반응성이 높은 기질의 조건이라는 사실, 또한,
3) 반응 후, 반응액의 pH를 약산성으로 이동시키고, 다시 희석하여 변성제의 농도를 저하시켜 목적 펩티드 이외의 성분의 대부분을 침전시키고, 원심분리 혹은 압착여과에 의해 목적 펩티드를 95% 이상 상등액으로 회수할 수 있고, 그리고 예를 들면 양이온 교환 크로마토그래피, 저압 역상 크로마토그래피, 역상 HPLC 등을 단독으로 또한 바람직하게는 조합하여 사용함으로써 고순도 및 고회수율로 목적 펩티드를 정제할 수 있다는 사실을 처음으로 밝혀내어, 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명은, 하기 화학식 1의 키메라 단백질을 제공한다.
[화학식 1]
A-L-B
상기식에서,
A는 보호 펩티드이고;
B는 목적 펩티드이고;
L은 링커 펩티드로서, 이의 C-말단 부분에 X1-X2-(Pro, Lys 또는 Arg)-Arg(여기서, X1 및 X2는 임의의 아미노산이다) 서열을 가지고, N-말단에 His가 풍부한 부분을 가진다.
상기 N-말단의 His가 풍부한 부분으로서는 서열: [(His)4-Pro-Gly]n(여기서, n은 1 내지 6이다)가 바람직하고, 또한 X1은 Arg, Lys 또는 His이고, X2는 His 또는 Phe인 것이 바람직하다. 또한, 상기 N-말단 부분의 아미노산 서열과 상기 C-말단 부분의 아미노산 서열과의 사이에 1 내지 5개의 임의의 아미노산이 존재하고 있어도 바람직하다.
본 발명은 또한, 상기의 키메라 단백질의 제조 방법에 있어서, 상기 키메라 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜, 수득된 형질전환체를 배양하여, 상기 배양물로부터 상기 키메라 단백질을 채취하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기의 목적 펩티드(B)의 제조 방법에 있어서, 상기의 키메라 단백질에 프로세싱 효소를 작용시켜서 링커 펩티드(L)의 C-말단과 목적 펩티드(B)의 N-말단과의 사이의 펩티드 결합을 절단하여, 목적 펩티드(B)를 수득하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기의 방법은, 바람직한 양태에 있어서는, 키메라 단백질을 암호화하는 유전자를 발현시킬 수 있는 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜, 수득된 형질전환체를 배양하여, 상기 형질전환체를 파쇄하여 봉입체의 불용성 분획을 수득하고, 불용성 분획을 가용화제로 처리함으로써 봉입체내의 키메라 단백질을 가용화하여, 상기 가용화된 키메라 단백질의 당해 링커 아미노산 잔기의 C 말단과 상기 목적 펩티드의 N 말단의 사이의 펩티드 결합을 분비형 Kex2 유도체와 같은 프로세싱 효소에 의해 절단하여 상기 목적 펩티드를 분리하고, 침전 처리, 양이온 교환 크로마토그래피, 저압 역상 크로마토그래피 및 역상 HPLC에 의해 상기 목적 펩티드를 정제한다.
본 발명의 방법에 의해, 상기 보호 펩티드, 링커 및 생리활성 펩티드(목적 펩티드)로 이루어지는 키메라 단백질을 프로세싱 효소에 의해 절단하여, 생리활성 펩티드를 제조할 수 있다. 이러한 목적 펩티드로서는, 사람 부갑상선 호르몬(hPTH(1-84)) 및 이의 유도체(hPTH(1-34), hPTH(1-37), hPTH(1-38)), 사람 부갑상선 호르몬의 다른 유도체(hPTH(1-31) Gly, hPTH(1-34) Gly, hPTH(1-37) Gly, hPTH(1-38) Gly, hPTH(3-84), hPTH(3-34), hPTH(3-37), hPTH(3-38)), 세포증식 인자, 칼시토닌 및 이의 전구체, 글루카곤 유사 단백질 1(Glucagon-like peptide 1: GLP-1) 및 이의 유도체[GLP-1(1-37), GLP-1(7-37), GLP-1(7-36) NH2 등] 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
또한, 프로세싱 효소로서는, Kex2 프로테아제, 푸린(Furin), 전구체 변환효소 1(PC1) 또는 전구체 변환효소 2(PC2) 또는 이들의 유도체 등을 사용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 본 발명에 있어서는 특히 Kex2 효소의 C-말단을 제거함으로써 수득되는 분비형 Kex2 유도체가 바람직하다.
본 발명에 있어서의 보호 펩티드는, 크기가 220 아미노산 이하의 펩티드인 것이 바람직하다. 예를 들면, 대장균 β 갈락토시다제의 N 말단의 1위치로부터 90 내지 210개의 아미노산으로 이루어지는 것이 바람직하다. 또한, 바람직하게는 대장균 β 갈락토시다제의 N 말단의 1위치로부터 97위치, 117위치 또는 139위치로 이루어지는 펩티드이다. 그리고, 또한 바람직하게는 이들의 펩티드의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환된 것이며, 가장 바람직한 것은, 또한 14위치의 알기닌 잔기가 라이신 잔기로 치환된 것이다. 또한, 보호 펩티드 중에는 프로세싱 효소에 의해 인식되는 서열, 예를 들면 Pro-Arg, Arg-Arg, Lys-Arg 등을 포함하지 않은 것이 바람직하고, 보호 펩티드 중에 상기 인식서열이 있는 경우에는, 이와 같은 인식 서열의 적어도 하나의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여, 프로세싱 효소에 의해 인식되지 않는 서열로 만들어서, 프로세싱 효소에 의한 절단을 방지할 수 있다.
키메라 단백질의 용해성을 개선하기 위한 링커 아미노산으로서는, 친수성인 것이 바람직하다. 목적 펩티드의 종류에 의해 키메라 단백질의 전하가 변화하여, 봉입체 생산성의 저하를 가져오는 경우가 있기 때문에, 친수성 아미노산으로서, 봉입체 생산의 장소인 균체내의 생리적 pH (중성) 부근에서 완충 능력을 갖는 히스티딘 잔기를 사용하는 것이 바람직하다. 또한 변성· 가용화 후, 링커 부분의 이차 구조를 느슨하게 할 목적으로 Pro-Gly 서열을 삽입하는 것이 바람직하다. 다종의 생리활성 펩티드에 대응할 수 있도록, (His)4-Pro-Gly를 암호화하는 합성 DNA 단편을 준비하여, 보호 펩티드를 암호화하는 DNA 단편 중에 적당히 중복 삽입시켜서, {(His)4-Pro-Gly}n(n=1 내지 6)이 되도록 링커를 설계하는 것이 가장 바람직하다. 또한, 이하 상기 링커의 N 말단 부분의 서열을 LN이라 표시한다.
또한, 본 발명자들은, 대량 생산 가능하게 된 사카로마이세스· 세레비시애 유래의 Kex2 프로테아제 유도체(분비형 Kex2 유도체)가, 키메라 단백질을 기질로한 경우, Kex2 프로테아제 인식 부위(Lys/Arg/Pro)-Arg 부근의 아미노산도 이의 활성에 크게 영향을 미치는 것을 처음으로 밝혀내었다. 즉, 링커의 C 말단에 위치하는 아미노산 서열을, X1-X2-(Lys/Arg/Pro)-Arg(여기서, X1, X2는 임의의 아미노산)로 하여, X1에는 Arg, Lys 또는 His를, X2에는 His 또한 Phe를 사용한 경우에 분비형 Kex2 유도체 활성이 최대로 되는 것을 밝혀내었다. 또한, 이하 상기 링커의 C말단 부분의 서열을 LC로 표시한다.
키메라 단백질법으로 생산되어 절단된 목적 펩티드는, 여러가지의 방법으로 정제되지만, 상기 키메라 단백질을 사용한 경우, 미반응 키메라 단백질, 보호 펩티드류, 대장균 유래 불순물을 간편한 침전 조작에 의해, 효율적으로 제거할 수 있는 것으로 밝혀내었다. 즉, 분비형 Kex2 유도체 반응 후, pH를 약산성측으로 이동시키고, 또한 반응액을 희석하여 변성제 농도를 저하시키는 것으로, 대장균 유래, 불순물의 대부분과, 미반응 키메라 단백질, 보호 펩티드류를 95% 이상 침전으로 이행시켜, 목적 펩티드를 95% 이상 상등액으로 유지할 수 있고, 원심분리 혹은 압착 여과에 의해 목적 펩티드를 포함하는 청징액을 간편하게 수득할 수 있음을 밝혀내었다.
본 상등액을 pH 조정 등의 후에 직접 양이온 교환 크로마토그래피에 통과시켜 목적 펩티드를 흡착시키고, 염 농도의 변화 혹은 pH의 변화를 이용하여 용출시키고, 또한, 용출 분획을 저압의 역상 크로마토그래피에 통과시켜 목적 펩티드를 흡착시키고, 유기 용매 농도의 변화를 이용하여 용출 및 농축시켰다. 유기 용매 농도를 저하시킨 후, 역상 HPLC에 제공하여, 유기 용매 농도의 변화를 이용하여 분리 분획하여, 고순도의 목적 펩티드를 수득했다.
다음에, 본 발명을 목적 펩티드가 사람 부갑상선 호르몬 유도체 hPTH(1-34)인 경우를 예로 설명한다.
β Gal-210SPPH84 발현용 플라스미드 pG210ShProPTH는, 우선 hPTH(1-84) 유전자를 합성 DNA 올리고머의 연결에 의해 제조하고, 다음에 제조한 유전자를 플라스미드 pG210ShCT[G]의 hCT[G] 유전자를 암호화하는 영역과 치환하여 제조했다(도 3). hPTH(1-84) 유전자의 N 말단에서 35번째의 아미노산(Val)을 암호화하는 코돈을 해독 정지 코돈으로, β Gal-210S(대장균 β -갈락토시다제의 N 말단 1위치로부터 210위치까지의 펩티드에 있어서, 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되어 있는 펩티드)를 암호화하는 유전자를 β Gal-117S(대장균 β -갈락토시다제의 N 말단 1위치로부터 117위치까지의 펩티드에 있어서, 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되어 있는 펩티드)를 암호화하는 유전자로 대체한 pG117SHPPH34를 제조했다(도 6 내지 7).
동일한 방법으로, β Gal-210S를 암호화하는 유전자 대신에, β Gal-139S를 암호화하는 유전자 또는 β Gal-197S를 암호화하는 유전자를 삽입함으로써, pG139SHPPH34 또는 pG97SHPPH34를 제조할 수 있다.
이들의 플라스미드는, 각각 β Gal-97S, β Gal-117S 및 β Gal-139S를 암호화하는 구조 유전자와 유도체 hPTH(1-34)의 구조 유전자가 링커 펩티드 Phe-Met-Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg를 사이에 두고 연결되어 있고, 상기 키메라 단백질을 암호화하는 구조 유전자는 lac 프로모터의 제어하에 있다. 또한, 상기 플라스미드는 테트라사이클린 내성 유전자 마커를 함유한다.
β Gal-97SPPH34는 요소 용액에서의 용해도가 높지만 생산량이 적고, β Gal-117SPPH34와 β Gal-139SPPH34는 생산량은 많지만 분비형 Kex2 유도체 반응 조건하에서의 용해성이 저하하여, 키메라 단백질로부터 유도체 hPTH(1-34)를 절단하기 위해서는, 보다 많은 분비형 Kex2 유도체가 필요하다. 따라서, 생산량이 많고 요소 용액에서의 용해도가 높은 키메라 단백질을 수득하기 위해서, 상기 보호 펩티드와 링커 Met-Ser-Val-Lys-Lys-Arg의 사이에, 친수성 또한 중성 부근에서 완충 능력을 가지며, 키메라 단백질의 이차 구조 형성을 저해하는 아미노산으로 이루어지는 링커 LN을 삽입했다.
LN으로서는, {(His)4-Pro-Gly}n(n=1~6)으로 이루어지는 펩티드를 사용했다. {(His)4-Pro-Gly}n(n=1~6)의 도입은, (His)4-Pro-Gly 또는 {(His)4-Pro-Gly}2를 암호화하는 DNA 단편을 합성하여, 보호 펩티드를 암호화하는 DNA 단편의 3' 말단 부분에 적당한 몰비로 삽입 반응시켜, 상기 아미노산 서열을 하나 또는 복수개 함유한 링커 펩티드를 포함하는 키메라 단백질을 암호화하는 유전자를 제조할 수 있다.
또한, DNA 단편이 역방향으로 삽입된 것은, DNA 염기 서열분석으로 확인하여 제외했다. 이들의 키메라 단백질을 암호화하는 플라스미드로 대장균 M25주를 형질전환시켜, 키메라 단백질의 생산성을 관찰했다(도 8). 그 결과, 보호 펩티드β Gal-97S 및 β Gal-139S의 경우는 n이 3일때, β Gal-117S 인 경우는 n이 1 내지 6일때, 키메라 단백질의 생산량이 높다는 것을 밝혀냈다. 또한, 이들 키메라 단백질의 봉입체를 균체 파쇄, 원심분리에 의해 세정하고 단리하여, 요소로 가용화· 희석하여, Kex2-660 반응에 제공했다(도 9).
그 결과, {(His)4-Pro-Gly}n(n=1 내지 6)의 도입에 의해, 모든 키메라 단백질이 Kex2-660에 대하여 감수성이 높아진다는 것을 밝혀냈다. 그리고, 키메라 단백질 생산량, Kex2-660에 대한 반응성 및 보호 펩티드의 크기를 고려하여, hPTH(1-34) 생산용의 키메라 단백질에는, 보호 펩티드로서 β Gal-117S, 링커 펩티드 LN으로서 (His)4-Pro-Gly로 이루어진 β Gal-117S 4HPPH34를 사용했다.
이상의 결과에서, 분비형 Kex2 유도체에 의해 생리활성 펩티드를 절단하기 위한 키메라 단백질의 설계로서, 대장균체내에서의 생산성뿐만 아니라, 분비형 Kex2 유도체 반응 조건하에서의 용해성을 개선하기 위해, {(His)4-Pro-Gly)n(n=1 내지 6)인 펩티드를 삽입하는 것이 적합한 것임이 명백하다.
본 과정에서는, 분비형 Kex2 유도체가 몰비로 키메라 단백질의 1/1000 정도 필요하며, 제조 원재료비의 대부분을 차지하고 있다. 따라서, 또한, 분비형 Kex2 유도체에 의해 절단되기 쉬운 키메라 단백질을 설계할 필요가 있다. β Gal-117S4HPPH34의 분비형 Kex2 유도체 인식 부위는, 사람 부갑상선 호르몬 전구체의 프로서열 Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg를 사용했다.
그러나, 상기 서열이 분비형 Kex2 유도체에 의한 절단에 최고 적합한가의 여부는 불명확하고, 많은 다른 프로테아제에 나타내는 바와 같이 최적화에 의해 또한 절단 효율이 증가하는 가능성이 고려된다. 인식 부위의 C 말단측에는 hPTH(1-34)가 연속되어 있기 때문에, 아미노산의 치환을 할 수 없지만, N 말단측의 서열은 새로 인식 부위를 생성시키지 않을 경우에 임의로 선택할 수 있다. 그리고, 기질인 키메라 단백질의 P3 부위(X2)를 임의의 아미노산으로 변환하는 것을 시험했다. 도 10에 나타내는 18종류의 아미노산 서열에 대해서 검토한 결과, X2에 His 또는 Phe를 도입하면, 키메라 단백질로부터의 hPT(1-34)의 절단 효율이 우수하다는 것이 판명되었다.
다음에, 부반응이 적었던 His를 X2에 고정하여, P4 부위(X1)를 도 11에 나타내는 20종류의 아미노산 서열에 대하여 검토한 결과, X1에 Arg, Lys 또는 His를 도입하면, 키메라 단백질로부터의 hPTH(1-34)의 절단 효율이 우수하다는 것이 판명되었다. 이중 가장 절단 효율이 우수한 Arg-His-Lys-Arg를 LC로 선택했다.
또한, 본 연구의 과정에서, β Gal-117S의 13, 14위치에 존재하는 Arg-Arg 서열의 C 말단측의 펩티드 결합이 분비형 Kex2 유도체에 의해 절단되어, 상기 결과 수득되는 β Gal(1-14)가, 이후의 산성침전에 의한 정제 공정에 있어서, hPTH(1-34)와 같은 상등액 분획으로 회수되는 것이 판명되었기 때문에, 14위치의 Arg을 Lys으로 치환하여 절단을 억제하고, β Gal(1-14)의 생성을 억제했다.
이상의 결과에서, hPTH(1-34) 생산용 키메라 단백질에는, 보호 펩티드로서 14위치의 Arg을 Lys으로 치환한 β Gal-117S(β Gal-117KS)를, 링커 펩티드로서 Pro-His-His-His-His-Pro-Gly-Gly-Arg-Pro-Ser-Arg-His-Lys-Arg의 아미노산 서열을 갖는 펩티드를 사용했다.
다음에 본 발명자들은, 이렇게 하여 설계한 키메라 단백질 β Gal-117KS4HRHPH34를 대장균으로 발현시켜, 봉입체로서 세정 회수 후 가용화하여, 분비형 Kex2 유도체 반응에 제공한 후 정제 방법을 검토하였다. 대장균 유래 불순물, 미반응 키메라 단백질이라든지 보호 펩티드를 포함하는 펩티드는, 중성에서 약산성으로 용해성이 극단적으로 저하하는 것을 이용하고, pH를 분비형 Kex2 유도체 반응에 가장 적합한 pH인 7.8 내지 8.2로부터 6.2 내지 6.5로 이동시키는 것으로 침전시킬 수 있다.
또한, 변성제(요소) 농도를 희석에 의해 저하시킴으로써 대부분의 불순물을 침전시킬 수 있었다. 원심분리 또는 압착 여과에 의해 침전을 제거하고, hPTH(1-34)를 우수한 효율로 상등액으로 회수했다. 상등액을 pH 5.0으로 조정 후 양이온 교환 크로마토그래피(예를 들면, PorosHS, SP 토요펄)에 hPTH(1-34)를 흡착시키고, 0.3M 내지 0.4M의 NaCl에서 용출시켰다. 용출액에 아세트산을 첨가하여, 저압 역상 크로마토그래피(예를 들면, PorosR2, SokenODS-W)에 hPTH(1-34)를 흡착시켜, 30% 정도의 아세토니트릴로 용출시켜, 농축 및 역상 HPLC에 악영향을 주는 불순물의 제거를 수행했다.
용출액 중의 아세토니트릴을 감압 증류로 제거하고, 0.22㎛의 필터로 여과하여, 역상 HPLC(예를 들면, InertsilPrepODS, TSK120T)에 hPTH(1-34)를 흡착시켜, 아세토니트릴의 구배 용출로써 분획하여, 고순도의 분획을 모아, 순도 99.5%의 hPTH(1-34)를 회수율 40% 내지 70%로 분취했다. 이상의 결과에서, 상기 회수율은 지금까지 보고되어 있는 중에서 가장 높아, 본 발명의 유용성이 실증되었다.
실시예
실시예에 의해 본 발명을 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들에 한정되지 않는다.
이하 본 발명을 위한 재료로서 사용한 플라스미드, 대장균, 각 실시예에 공통인 기본적인 실험조작에 관하여 서술한다.
플라스미드
플라스미드 pG210ShCT[G]는, β-갈락토시다제의 N 말단 1위치로부터 210위치 까지의 아미노산으로 구성되는 펩티드 중, 76위치, 122위치 및 154위치의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되어 있는 것(β Gal-210S)에 글루타민산 잔기를 통해, hCT[G](사람칼시토닌 32위치의 아미노산의 C 말단에 글리신 잔기가 부가된 펩티드)가 결합된 키메라 단백질을 대장균 락토스 오페론의 프로모터(lac 프로모터)에 의해 발현시킬 수 있는 플라스미드이다.
pGHα 210(Ser) rop-를 제한효소 PvuII와 EcoRI로 분해하여 수득되는 β Gal-210S의 일부를 암호화하는 유전자를 포함하는 DNA 단편과 pG97S4DhCT[G]를 제한효소 PvuII와 EcoRI로 분해하여 수득되는 벡터 부분을 포함하는 DNA 단편과 연결하여 제조했다(도 13). 또한, pGHα 210(Ser) rop-의 제조방법에 관한 공개특허공보 제6-87788호에 기술되어 있는, 플라스미드 pG97S4DhCT[G]를 함유하는 대장균 W3110 주는, 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) SBM323로 호칭되고, 공업기술원 미생물 공업기술연구소에 수탁번호 : 미공연조기 제3503호(FERM BP-3503)로서 1991년 8월 8일에 기탁되어 있다.
플라스미드 pG210ShCT[G]에 목적하는 펩티드를 암호화하는 DNA 영역을 해독 프레임에 맞추어 EcoRI-Sal I DNA 단편으로서 도입하면, β Gal-210S와의 키메라 단백질을 발현시킬 수 있다. 이 플라스미드를 합성 사람 부갑상선 호르몬 전구체(hProPTH(1-84)) 유전자의 클로닝 및 플라스미드 pGP#19 제조의 재료로서 사용했다(도 3).
대장균
대장균 JM109주를 수용능 세포(competent cell)의 상태로 동양방적(주)에서 구입하여, 플라스미드의 제조에 이용했다. 대장균 M25주(W3110/ompT: Sugimura et al. Biochem. Biophys. Res. Commun., 153, 753-759, 1988)를 키메라 단백질의 발현에 이용한다.
배지
대장균의 배양에는 이하의 배지를 사용했다.
SB 배지: 0.5%(w/v) 글리세롤, 2.4%(W/V) 효모 추출물, 1.2%(w/v) 트립톤, 0.1M 인산수소칼륨 완충액(pH 7.5)
NU1 합성 배지: 0.4%(w/v) 효모 추출물, 0.4%(w/v) K2HPO4, 0.4%(w/v) KH2PO4, 0.27%(w/v) Na2HPO4, 1.2%(w/v) (NH4)2SO4, 0.02%(w/v) NH4Cl, 0.3%(w/v) L-메티오닌, 0.2%(w/v) MgSO4· 7H2O, 40mg/L FeSO4· 7H2O, 40mg/L CaCl2· 2H2O, 10mg/L AlCl3.· 6H2,O, 10mg/L CoCl2,· 6H2O, 2mg/L ZnSO4· 7H2O, 2mg/L Na2Mo4· 2H2O, 1mg/L CuCl2· 2H2O, 0.5mg/L H3BO3 및 10mg/L MnSO4· nH2O.
기본적인 실험 조작
구체적으로 실시예에 나타내지 않은 경우, 실험 조작은 이하의 방법에 따랐다.
DNA 프라이머는, 포스포아미다이트법에 의한 전자동 합성기(어플라이드 바이오시스템 모델 320A)로 합성하였다. DNA 염기 서열은 디데옥시법으로 결정했다.
DNA 절단은 구입선이 지정한 3 내지 10배량의 제한효소를 사용하여 1시간 동안 반응시켰다. 플라스미드 구조의 해석은 0.5 내지 1㎍의 DNA를 사용하여 20㎕ 반응액 중에서 수행하고, DNA의 제조는 3 내지 10㎍의 DNA를 사용하여 50 내지 100㎕ 반응액 중에서 수행했다. 반응 온도, 반응 완충액 등의 조건은 구입선의 지정에 따랐다.
아가로스 겔 전기영동 샘플은, 반응액에 1/5 용량의 색소액(0.25%(w/v) 브롬페놀 블루를 포함하는 15%(w/v) Ficoll 수용액)을 첨가하여 제조했다. 아가로스 겔 전기영동용 완충액으로 TAE 완충액(40mM 트리스/아세트산, 2mM EDTA)을 사용했다. 플라스미드의 구조해석에는 Mupid-2(코스모바이오(주))를 사용하여 100볼트 1시간의 전기영동을 수행하고, DNA의 제조를 위해서는 수평 겔(20cm x 15cm x 0.7cm)을 사용하여 150볼트 4시간 또는 35볼트 13시간의 전기영동을 수행했다. 겔은 에티듐 브로마이드 수용액(0.5㎍/ml)으로 20분 동안 염색한 후, 자외선 조사하여 DNA 밴드를 검출했다. 아가로스 겔 농도는, 분획된 DNA 단편의 크기에 맞춰서, 1.0 또는 2.0%(w/v)를 사용했다.
아가로스 겔 중의 DNA는, 0.1x TAE 완충액을 채운 투석 튜브내에 겔을 넣어 전압을 통해 용출시키고, 겔로부터 추출했다. DNA 용액을 페놀 처리, 클로로포름 처리 후, 에탄올 침전을 수행하여, DNA를 정제했다.
라이게이션 반응은, 0.05 내지 1㎍의 DNA 단편을 포함하는 반응액(67mM 트리스/HCl(pH 7.5), 5mM MgCl2, 5mM DTT, 1mM ATP) 30㎕에 10단위의 T4 DNA 리가제를 첨가하여, 16℃에서 12 내지 18시간 반응을 수행하거나, 다카라 라이게이션 키트(TAKARA ligation Kit)(다카라주조(주))를 사용하여 수행했다.
대장균 JM109주의 형질전환법은 구입선의 지시에 따라서 수행하고, 대장균 M25주의 형질전환법은 염화칼슘법에 준하여 수행하고, 형질전환주는 약제 내성(테트라사이클린)으로 선택했다.
SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(SDS-PACE) 샘플은, 동량의 SDS 샘플 완충액(63mM 트리스/HCl(pH 6.8), 10%(w/v) 글리세롤, 10%(w/v) SDS, 10㎍/ml 브롬페놀블루)을 첨가하여, 3분간 비등시켜 제조했다. 전기영동은, 16%(w/v) SDSPAGEmini(TEFCO) 겔을 사용하여 1매당 20mA에서 70분간 수행하고, 겔은 쿠마지브릴리언트 블루 G에서 염색했다.
hPTH(1-34)의 정량은, 우선, hPTH(1-34)를 포함하는 용액을 샘플 완충액(1M 아세트산/2M 요소)으로 10배 내지 20배로 희석 후, 원심분리 상등액을 수득하고, 다음에, 이것을 YMC-ODS-A302(d4.6mmX150mm) 칼럼((주) 야마무라화학연구소)을 접속한 HPLC(시마리쯔제작소(주) LC10A)에 제공하고, A액(0.1%(v/v) 트리플루오로아세트산(TFA)/10%(v/v) 아세토니트릴), B액(0.094%(v/v) TFA/50%(v/v) 아세토니트릴), B40→ 80%/20분 구배의 계에서 전개하여, 214nm의 흡광도 측정으로 검출된 hPTH(1-34)의 피크 면적을 기지 농도의 표준 hPTH(1-34)의 피크 면적과 비교하여 수행했다.
그외에 별도로 표시하는 이외에, 기본적인 유전자 조작은 문헌[참조: Molecular Cloning, Maniatis et al., Cold Spring Harbor laboratory, New York(1982)]에 기재된 방법에 따라서 수행했다.
실시예 1. hProPTH(1-84) 유전자의 제조
hProPTH(1-84) 유전자는 도 1에서 나타내는 바와 같이 U1 내지 U7(서열 1 내지 7) 및 L1 내지 L7(서열 8 내지 14)의 14개의 단편으로 나누어, 합성했다.
hProPTH(1-84) 유전자는, 각 단편을 아래와 같이 연결하여, 제조했다(도 2).
우선, DNA 단편 U1(서열 1)과 L7(서열 14)(각각 약 1㎍)을 16단위의 T4 폴리뉴클레오티드 키나제와 0.5nM(1MBq 이상)의 [γ -82P] dATP를 포함하는 인산화 반응액 15㎕ 중(50mM 트리스/HCl(pH 7.6), 10mM MgCl2, 5mM DTT)에서 37℃, 15분간 반응시켰다. 이에 5mM ATP를 포함하는 인산화 반응액 5㎕를 가하고, 또한 37℃에서 45분간 반응시켰다. U2(서열 2)와 L6(서열 13), U3(서열 3)과 L5(서열 12), U4(서열 4)와 L4(서열 11), U5(서열 5)와 L3(서열 10), U6(서열 6)과 L2(서열 9), 및 U7(서열 7)과 L1(서열 8)에 대하여도 마찬가지로 수행했다.
상술한 7개의 반응액을 하나로 묶어, 에탄올 침전을 수행하여 DNA를 회수했다. 이것을 80㎕의 100mM 트리스/HCl(pH 7.6), 6.5mM MgCl2 및 300mM NaCl에 용해시켰다. 이 중 40㎕를 95℃에서 5분간 방치한 후, 30분에 걸쳐 43℃까지 온도를 저하시켰다. 냉각 후 40㎕의 라이게이션 B액(다까라주조(주))을 첨가하여, 26℃에서 15분 동안 방치했다.
상기 샘플을 5% 폴리아크릴아미드 전기영동을 했다. 전기영동 후, 오토라디오그래피로 연결된 DNA 단편을 검출했다. 약 280bp에 대응하는 DNA 단편을 겔로부터 추출 후, 통상의 방법에 따라서 정제했다.
실시예 2. β Gal-139S(FM)PPH84 발현 플라스미드 pGP#19의 제조
합성 hProPTH(1-84) 유전자를 포함하는 약 280bp의 DNA 단편에는, 5' 말단에는 제한효소 EcoRI 부위가 3' 말단에는 제한효소 Sal I 부위가 존재한다. hProPTH(1-84) 유전자의 클로닝은 상기 EcoRI/Sal I DNA 단편을 pG210ShCT[G]의 EcoRI/Sal I 부위에 삽입하여 수행했다.
pG210ShCT[G]를 제한효소 EcoRI과 Sal I로 절단 후, 벡터 부분을 포함하는 약 3.5kb DNA 단편을 제조했다. 이것과 실시예 1에서 수득된 약 280bp로 이루어지는 hProPTH(1-84) 유전자의 DNA 단편을 연결하여, 플라스미드 pG210ShProPTH를 수득했다(도 3). pG210ShProPTH를 사용하여 대장균 JM109주를 형질전환시켜, JM109[pG210ShProPTH]를 수득했다.
또한, pG210ShProPTH의 제한효소 XhoI/EcoRI 부위에 링커 KM091(서열 15) 및 KM092(서열 16)를 도입하여, 플라스미드 pG210S(S/X)를 제조했다(도 3). 또한, 상기 링커는, 양단에 제한효소 XhoI과 EcoRI 부위를, 그 사이에 Sac I 부위를 갖는다.
pG210S(S/X)는, 제한효소 Sac I 및 Xho I로 분해 후, 킬로-서열용 결실 키트(다카라주조(주))를 사용하여, β Gal-210S를 암호화하는 DNA 영역을 경시적으로 또한 특이적으로 결실시켰다. 클레노우(Klenow) 단편으로 말단 수복을 수행한 후, 셀프라이게이션(selfligation)을 수행하고, β Gal-139S와 hProPTH(1-84)가 Phe-Met를 사이에 두고 연결된 키메라 단백질 β Gal-139S(FM) PPH84을 암호화하는 플라스미드 pGP#19를 수득했다(도 4). pGP#19를 도입한 대장균 JM109주를 JM109 pGP#19로 칭했다.
실시예 3. β Gal-117SmPPH34 발현 플라스미드 pG117SmHPPH34의 제조
본 실시예에 있어서는, β Gal-117SmHPPH34 발현 플라스미드 pG117SmHPPH34의 제조를 예로 들지만, β Gal-117S 대신에 β Gal-97S 또는 β Gal-139S를 사용함으로써, β Gal-97SmHPPH34 발현 플라스미드 pG97SmHPPH34 또는 β Gal-139SmHPPH34 발현 플라스미드 pG139SmHPPH34를 제조할 수 있다.
1) pGP#19PPH34의 제조
pGP#19PPH34는, pGP#19를 주형으로 S01(서열 17) 및 S02(서열 18)를 프라이머로서, PCR법에 의해, hPTH(1-84)의 35위치의 발린 잔기의 코돈 GTT를 해독 정지 코돈 TAA로 변환한 DNA 단편을 증폭 후, 통상의 방법에 의해 제한효소 Aat II-Sal I DNA 단편을 단리 정제하여, pGP#19의 대응하는 부분과 교환하여 제조했다(도 5).
2) pG117SPPH34의 제조
pG210(S/X)을 주형으로 S03(서열 19)과 S05(서열 20)를 프라이머로서 PCR법에 의해 증폭 후, 제한효소 Pvu I과 Sma I로 분해한 DNA 단편, pGP#19PPH34를 주형으로 S07(서열 21) 및 S02를 프라이머로서 PCR법에 의해 증폭 후, 제한효소 Sal I과 Sma I로 분해한 DNA 단편, 및 pGP#19PPH34의 복제 개시 기점을 포함하는 제한효소 Pvu I-Sal I DNA 단편을 T4 리가제로 연결하여, pG117SPPH34를 제조했다(도 6 내지 7).
3) pG117SmHPPH34(m=4 또는 8)의 제조
pG117SmHPPH34(m=4 또는 8)은, pG117SPPH34의 제한효소 Sma I 부위에 (His)4-Pro-Gly를 암호화하는 링커 S08(서열 22)과 S09(서열 23) 및 {(His)4-Pro-Gly}2를 암호화하는 링커 S10(서열 24)과 S11(서열 25)을 삽입하여 제조했다. 또한, 링커의 길이를 바꿈으로써, m이 12, 16 또는 24인 플라스미드를 제조할 수 있다(도 6 내지 7).
또한, pG117SPPH34의 제한효소 Sma I부위에 (Lys)4-Pro-Gly를 암호화하는 링커 S12(서열 26)와 S13(서열 27)을 삽입하여, pG117S4KPPH34를 제조했다. 동일한 방법으로 pG97S4KPPH34, pG139S4KPPH34를 제조할 수 있다.
또한, 삽입된 링커의 수 및 방향은, 플라스미드를 제조한 후, DNA 염기 서열 결정으로 확인하였고, 본 실시예에 있어서 제조된 키메라 단백질을 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pat00043
표 중, H는 히스티딘 잔기를, K는 라이신 잔기를 나타내고, 숫자는 각 아미노산의 수를 나타낸다.
실시예 4. hPTH(1-34) 키메라 단백질의 생산
표 1에 나타낸 키메라 단백질의 생산성을 SDS-PAGE를 사용하여 조사했다.
표 1에 나타낸 키메라 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 플라스미드 16개를 각각 대장균 JM109주에 도입하여, 2ml의 SB 배지에서 37℃, 16시간 동안 시험관으로 진탕배양 후, 생리 식염수로 희석하여, 배양액 탁도(OD660)를 10으로 하였다. 상기 현탁액 100㎕에 동일한 양의 SDS 샘플 완충액을 첨가하여, 3분간 비등시켜, 이의 상등액 10㎕을 사용하여 SDS-PAGE를 수행하여, 각 균체당의 키메라 단백질 생산량을 비교했다.
결과를 도 8에 나타낸다. 그 결과, β-갈락토시다제 유도체와 히스티딘 잔기의 수의 조합에 의해 발현량이 변화하며, β Gal-97S에서는 {(His)4-Pro-Gly}n에서의 n이 2, 3인 경우, β Gal-117S에서는 n=1, 2, 3, 4, 6인 경우, β Gal-139S에서는 n이 2, 3인 경우 높은 생산성을 획득한다는 것이 밝혀졌다. 특히 β Gal-117S의 유도체에 있어서는 {(His)4-Pro-Gly}n(n=1 내지 6)의 도입에 의해 발현량이 현저하게 증가하여, 이들의 생산량은 라이신 잔기에 의해서 단지 전하를 바꾼 것보다 많았다.
실시예 5. 키메라 단백질로부터의 hPTH(1-34) 절단
높은 생산량의 키메라 단백질(β Gal-97SmHPPH34(m=12), β Gal-117SmHPPH34(m=0, 4, 8, 12, 16, 24), β Gal-139SmHPPH34(m=0, 12); m이 0일 경우는 대조군)에 대하여, Kex2-660의 기질로서의 적합성을 조사하기 위해서, 키메라 단백질 봉입체를 회수하고, 8M 요소로 용해 후 반응액 조성(20mM 트리스/HCl(pH 8.2), 100mM NaCl, 3.0M 요소, 2.0mM CaCl2, 8mg/ml 키메라 단백질)이 되도록 희석하여, Kex2-660을 종료 농도 20kU/ml가 되도록 첨가하여, hPTH(1-34)를 절단했다. 본 조건하에, 1시간으로 대조군의 β Gal-117SPPH34는 90% 이상 절단되었다.
각 유도체의 Kex2-660 반응성은, pG117SPPH34의 kcat와의 비를 가지고 도 9에 나타낸다. hPTH(1-34)의 정량은 [기본적인 실험 조건]에 나타낸 방법으로 하였다. 이 결과, 실시한 모든 예에서 n이 1 내지 6인 {(His)4-Pro-Gly}n의 도입에 의해 Kex2-660 반응성도 개선된다는 것을 알 수 있다.
특히, β Gal-117S4HPPH34는, 1개의 (His)4-Pro-Gly 링커의 삽입으로, 키메라 단백질의 생산량과 Kex2-660 반응성이 개선되고, 또한 Kex2 반응 조건하에서의 용해도도 15g/L 이상으로 β Gal-139SPPH34의 8g/L에 비하여 개선된다는 것을 알 수 있다.
실시예 6. hPTH(1-34)의 대량 생산
고발현 및 Kex2-660의 기질로서도 적합한 키메라 단백질 β Gal-117S4HPPH34를 대량으로 수득하기 위해서, 본 키메라 단백질을 암호화하는 유전자를 갖는 플라스미드 pG117S4HPPH34로 대장균 M25주(W3110/ompT)를 형질전환시켜, M25[pG117S4HPPH34]주를 수득하였다. M25[pG117S4HPPM34]주는, 2%(w/v) 효모 추출물, 1%(w/v) 트립톤, 1.2%(w/v) K2HPO4, 0.3%(w/v) KH2PO4, 0.5%(w/v) 글리세린으로 이루어지는 배지를 사용하여, 20L 배양조에서 37℃로 배양했다.
균체 농도가 OD660이 1.0일 때에 IPTG(이소프로필베타티오갈락토사이드)를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가하여, 균체 농도가 OD660이 12로 될 때까지 배양을 계속했다. 집균 후, TE(10mM 트리스/HCl, 1mM EDTA(pH 8.0))에 현탁하여, 고압 균질화기(공급원: Manton-Gaullin)에 의해 균체를 파쇄하고, 수득된 균질화물을 원심분리하여 키메라 단백질을 함유하는 침전물을 수득한 다음, 이 침전물을 TE 및 탈이온수로 세정했다. 이로써, 20L 배양물로부터 키메라 단백질을 함유하는 봉입체 약 100g을 수득했다. 봉입체 현탁액(160g/L) 250ml에, 1M 트리스/HCl(pH 8.2) 100ml, 5M NaCl 50ml, 탈이온수 500ml, 요소 900g을 첨가하여 30℃의 항온조내에서 30분 동안 교반 용해하여, 가온한 탈이온수로 희석하여, 30℃에서 5L로 만들었다.
이것에 250mM CaCl2 용액 50ml를 교반하면서 온화하게 첨가하고, 또한 Kex2-660을 20kU/ml가 되도록 첨가했다. 2시간 후, (절단율은 90% 이상) 아세트산으로 pH를 6.4로 맞추고, 또한 탈이온수로 2배로 희석하여, 미반응 키메라 단백질 및 보호 펩티드를 응집 침전시켰다. 원심분리에 의해 hPTH(1-34)를 포함하는 상등액을 수득하여, 아세트산으로 pH를 5.0으로 만들고, 10mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 평형화한 양이온 교환 수지(SP 토요펄) 칼럼을 통해서 hPTH(1-34)를 흡착시키고, 0.4M NaCl에서, hPTH(1-34)를 용출시켰다.
이것에 아세트산을 최종 3%(v/v)가 되도록 첨가하여, 3%(v/v) 아세트산으로 평형화한 저압 역상 칼럼(SokenODS-W)을 통해 hPTH(1-34)를 흡착시켜, 3%(v/v) 아세트산을 포함하는 30%(v/v) 아세토니트릴 용액으로 hPTH(1-34)를 용출시켰다. 감압하에서 아세토니트릴을 제거하고, 0.22㎛의 멤브레인 필터로 여과하여, 역상 HPLC 분취 칼럼(TSXgelODS120T φ 55×600)에 의해 정제했다. 용출은, 아세토니트릴의 직선 농도 구배(A: 5%(v/v) 아세트산/10%(v/v) 아세토니트릴; B: 5%(v/v) 아세트산/40%(v/v) 아세토니트릴; % B=20%→ 80%/60분, 유속 40ml/분)으로 용출했다. 각 공정에서의 hPTH(1-34) 회수율을 표 2에 나타냈다.
[표 2]
hPTH(1-34)의 회수율
Figure pat00044
실시예 7. 키메라 단백질의 Kex2-660 인식 부위 P3의 아미노산 치환
P3 부위의 아미노산(Lys)을 다른 아미노산으로 변환하기 위해서, P3 부위에 대응하는 코돈을 변환한 올리고뉴클레오티드 S14 내지 S18(서열 28 내지 32)을 합성하여, 이들과 S02(서열 18)를 프라이머에, pG117S4HPPH34를 주형으로서, PCR법에 의해 DNA 단편을 합성했다. 상기 DNA 단편을, 에탄올 침전법에 의해 정제하고, Stu I 및 Sal I로 절단 후, 2.0%(w/v) 아가로스 전기영동을 수행하여, 목적으로 하는 0.4kbp의 Stu I-Sal I 단편을 정제했다.
다음에 상기 DNA 단편과, Stu I 및 Sal I로 분해한 바와 동일하게 정제한 pG117S4HPPH34의 β 갈락토시다제 부분을 암호화하는 DNA 단편을 라이게이션 반응시켰다. 반응 후, 대장균 JM109주를 형질전환시켰다. 각 조합마다 테트라사이클린 내성 클론을 10개 선택하고, 이의 클론으로부터 플라스미드를 DNA 서열 결정에 의해 분석하여, 목적하는 발현 벡터를 수득했다.
즉, pG117S4HPPH34를 암호화하는 키메라 단백질의 Kex2-660 인식 부위 Ser-Val-Lys-Lys-Arg가 Ser-Val-X-Lys-Arg(여기서, X는 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, Phe, Tyr, Trp, His, Pro이다)로 치환된 아미노산 서열을 갖는 키메라 단백질 β Gal-117S4HVXPH34의 발현 벡터 pG117S4HVXPH34를 수득했다.
각 키메라 단백질과 Kex2-660의 반응성을 조사하기 위해, 각 클론을 50ml의 SB 배지에서 배양하고, 균체 농도가 OD660이 1.0일 때에 IPTG에서 발현을 유도 후, 또한 4시간 배양을 계속하여, 집균, TE 완충액 세정, 현탁, 파쇄, 원심분리를 수행하여, 봉입체를 수득했다. 또한, 각 봉입체를 1%(w/v) 트리톤 X100, 10mM EDTA 및 TE로 세정하여, 정제한 봉입체를 수득했다.
상기 봉입체에 포함되는 펩티드 성분의 90% 이상이 목적하는 키메라 단백질이었다. 각 키메라 단백질의 봉입체 현탁액에, 1M 트리스/HCl(pH 8.2) 20㎕, 5M NaCl 20㎕, 10M 요소 300㎕를 첨가하여 용해하고, 탈이온수 650㎕로 희석 후, 30℃의 항온조 내에서 10분 동안 보온하여, 이것에 250mM CaCl2 용액 10㎕를 첨가하고, 또한 Kex2-660을 20kU/ml가 되도록 첨가했다.
본 조건하에, 1시간으로 대조군의 β Cal-117SPPH34는 90% 이상 절단되었다. hPTH(1-34)의 생성은, 상술한 ODS 칼럼을 사용한 HPLC로 정량했다. 각 유도체의 Kex2-660 반응성은, pG117S4HPPH34의 kcat와의 비로 나타낸다(도 10). X가 Phe, His일 경우는, Kex2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 효율이 우수하게 되고, X가 Pro인 경우는 Kex2-660에 의해 hPTH(1-34)가 거의 절단되지 않는 것으로 밝혀졌다.
실시예 8. 키메라 단백질의 Kex2-660 인식 부위 P4의 아미노산 치환
실시예 7의 결과 및, 절단시 부생성물이 적은 것부터, P3 부위에 히스티딘 잔기를 갖는 키메라 단백질 β Gal-117S4HVHPH34를 hPTH(1-34) 생산을 위해 키메라 단백질로서 선택하여, P4 부위의 아미노산 치환에 의한 Kex2-660 반응성의 향상을 시도했다. 올리고뉴클레오티드 S19 내지 S24(서열 33 내지 38)를 합성하여, 이들과 S02를 프라이머로 하여, pG117S4HVHPPH34를 주형으로서, PCR법에 의해 변이가 도입된 DNA 단편을 합성하였다.
실시예 7에 나타낸 방법으로, 키메라 단백질의 Kex2-660 인식 부위 Ser-Val-His-Lys-Arg가 Ser-X-His-Lys-Arg(여기서, X는 Gly, Ala, Leu, Ile, Ser, Thr, Asp, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg, Cys, Met, Phe, Tyr, Trp, His, Pro, Val이다)로 치환된 구조를 갖는 키메라 단백질 β Gal-117S34HXHPH34의 발현 벡터 pG117S4HXHPH34를 수득했다.
상기 키메라 단백질을 기질로서 실시예 6과 같은 조건으로 Kex2-660에 대한 감수성을 판단했다. X가 Lys, Arg일 경우는, Kex2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 효율이 우수하게 되고, X가 산성 아미노산(Asp, Glu)일 경우는 Kex2-660에 의해 hPTH(1-34)가 거의 절단되지 않는 것으로 밝혀졌다(도 11). 이와 같이, Kex2-660 프로테아제는, P1 부위에 알기닌 잔기, P2 부위에 강한 염기성 아미노산 또는 프롤린 잔기를 요구할 뿐만 아니라, P3 부위에 히스티딘 잔기 또는 페닐알라닌 잔기, P4 부위에 강염기성 아미노산을 선호하고, P3 부위에 프롤린 잔기가 있거나, P4 부위에 산성 아미노산이 있을 경우에는 상기 키메라 단백질 절단 활성이 극단적으로 저하되는 것이 처음으로 밝혀졌다.
실시예 9. 보호 펩티드의 Kex2-660 절단 부위의 제거
실시예 7 및 8에 있어서의 Kex2-660 절단 반응을 경시적으로 HPLC에서 추적한 결과, 보호 펩티드β Gal-117S의 13, 14위치의 Arg-Arg 서열의 C 말단측의 펩티드 결합이 절단된다는 것이 판명되었다. 이것에 따라, 생성되는 β Gal(1-14)는, hPTH(1-34)를 산성 침전에 의해 정제할 때에 혼입된다고 예상되었다. 따라서, 14 위치의 Arg를 Lys로 치환하여, Kex2-660에 의한 절단을 억제함으로써, β Gal(1-14)의 생성을 억제하는 것을 시도했다.
14위치의 Arg를 Lys로 치환한 키메라 단백질(β Gal-117KS4HRHPH34)을 암호화하는 플라스미드 pGKSPH34(도 12)를 다음과 같이 제조했다. 우선, 올리고뉴클레오티드 S25(서열 39)와 S26(서열 40)을 프라이머로 하여, pG117S4HRHPH34를 주형으로서, PCR법에 의해 변이가 도입된 DNA 단편, Ase I-RK를 합성했다. 동일한 방식으로 올리고뉴클레오티드 S27(서열 41)와 S28(서열 42)을 프라이머로 하여, DNA 단편, RK-Bgl II를 합성했다.
각 DNA 단편을 정제하여, 각각 약 1ng씩을 혼합하여, 프라이머 부재하에서 PCR을 4회 수행하여, 변이를 도입했다. Ase I-Bgl II 단편을 합성했다. 여기에 다시 올리고뉴클레오티드 S25와 S28을 첨가하여 PCR을 계속하여, 동일한 단편을 증폭시켰다. 본 단편을 에탄올 침전법에 의해 정제하고, Ase I 및 Bgl II로 절단 후, 2.0%(w/v) 아가로스 전기영동을 수행하여, 목적하는 0.35kbp의 단편을 제조했다. pG117S4HRHPH34의 Ase I/Sph I(1.8kbp) 단편 및 Sph I/Bgl II(1.4kbp) 단편을, 1.0%(w/v) 아가로스 전기영동을 수행하여 정제했다.
상기 3개 단편을 라이게이션 반응 후, 대장균 JM109를 형질전환시켜 테트라사이클린 내성주를 수득하여, 플라스미드를 알칼리법에 의해 제조 후, 변이 도입 부분의 DNA 염기 서열을 해석하고, 보호 펩티드 14위치의 Arg를 암호화하는 DNA 서열 CGG를 AAG로 치환한 유전자를 포함하는 플라스미드 pGKSPH34를 갖는 목적 클론을 선택했다. 실시예 5에 나타낸 방법으로, 키메라 단백질의 봉입체를 수득하고, Kex2-660 반응에 제공한 결과, 상기 치환에 의해 거의 완전히 보호 펩티드의 절단이 억제되고, 정제 공정의 부담을 경감할 수 있는 것으로 판명되었다.
실시예 10. 키메라 단백질 β Gal-117KS4HRHPH34의 대량 제조와 hPTH(1-34)의 생산
시험관 수준으로 Kex2-660의 기질로서 매우 적당하다고 고려된 키메라 단백질 β Gal-117KS4HRHPH34의 대량 배양 조건하에 있어서의 생산성과 Kex2-66O 프로테아제에 의한 절단 및 hPTH(1-34)의 정제를 수행했다.
pGKSPH34에서, 대장균 M25주를 형질전환시켜, 테트라사이클린 내성주를 취득하여, 생산주 M25[pGKSPH34]를 제조했다. M25[pGKSPH34]주를 2%(w/v) 글루코스를 포함하는 NU1 합성 배지에서 대량 배양을 수행했다.
글루코스 소비 후, 탄소원으로서 글리세롤을 넣고, pH를 7.0으로 조정하면서, 24시간 동안 배양을 수행했다. 최종 도달 균체 농도는, 150-2000D이었다. 상기 키메라 단백질은, 대량 배양 조건하에서도 안정한 생산성을 나타냈고, 대량 발현에도 불구하고, 현저한 숙주 대장균의 생육 저해는 나타나지 않았다. 봉입체 생산량은 약 5g/L배지이었다. 균체 파쇄 후의 불용성 분획을 TE 및 탈이온수로 세정하여 정제 봉입체를 수득했다.
요소로 가용화한 후 희석하고, 반응액 조성을 20mM 트리스/HCl(pH 8.2), 50mM NaCl, 2.5mM CaCl2, 2.7M 요소, 8.0mg/ml 키메라 단백질로 하여, 반응 온도 30℃에서 Kex2-660을 5kU/ml가 되도록 첨가하여, 키메라 단백질로부터 hPTH(1-34)의 절단을 수행한 다음, hPTH(1-34)의 생성을 정량했다. 30분에 절단율 90% 이상으로 되고, β Gal-117S4HPH34와 비교하여, Kex2-660 양이 1/4로 감소했다. 반응 종료 후, 실시예 5와 동일한 방법으로 hPTH(1-34)를 정제했다. 정제 공정의 회수율은 실시예 5의 경우와 거의 동일하였다.
실시예 11. β Gal-117S4HGP 생산 플라스미드, pG117S4HGP의 제조
글루카곤 유사 펩티드 I(hGLP-1(7-37))을 포함하는 키메라 단백질(β Gal-117SS4HGP)을 생산하는 플라스미드, pG117S4HGP는 이하의 순서로 제조했다. 우선, 도 14(a)에 나타낸 4개의 DNA(GLP-1(서열 43), GLP-2(서열 44), GLP-3(서열 45), GLP-4(서열 46)를 합성하여, 이를 T4 폴리뉴클레오티드 포스포릴라제를 사용하여 5' 말단을 인산화한 후, 이들을 혼합하여, 어닐링(annealing)시켜, HGLP-1(7-37) 유전자(DNA(I))를 제조했다. 한편, 도 14(b)에 나타낸 2개의 합성 DNA(117S4H Sph I 프라이머(서열 47), 117S4H Bgl II 프라이머(서열 48)를 PCR 프라이머로서 사용하고, pGKSPH34를 주형으로 하여 PCR을 수행했다. 수득한 PCR 산물을 Bgl II 및 Sph I로 분해하여, Bgl II 및 Sph I의 점착 말단을 갖는 DNA 단편(DNA(II))을 제조했다.
다음에, pGKSPH34를 Bgl II 및 Sal I로 분해 후, 1% 아가로스 전기영동을 수행하여, 큰 쪽의 DNA 단편(DNA(III))을 겔로부터 회수했다. 이와 같이 수득된 DNA(I), DNA(II) 및 DNA(III)를 T4 DNA 리가제를 사용하여 연결하여 pG117S4HGP를 제조했다(도 15).
실시예 12. 키메라 단백질 β Gal-117S4HGP의 생산
제조된 pG117S4HGP를 갖는 대장균 W3110M25주를, 1.5% 글루코스, 4g/ℓ K2HPO4, 4g/ℓ KH2PO4, 2.7g/ℓ Na2HPO4, 0.2g/ℓ NH4Cl, 1.2g/ℓ (NH4)2SO4, 4g/ℓ 효모 추출물, 2g/ℓ L-메티오닌, 2g/ℓ MgSO4· 7H2O, 40mg/ℓ CaCl2· 2H2O, 40mg/ℓ FeSO4· 7H2O, 10mg/ℓ MnSO4· nH2O, 10mg/ℓ AlCl3· H2O, 4mg/ℓ CoCl2· 6H2O, 2mg/ℓ ZnSO4· 7H2O, 2mg/ℓ Na2MoO4· 2H2O, 1mg/ℓ CuCl2· 2H2O, 0.5mg/ℓ H3BO4, 10mg/ℓ 테트라사이클린을 포함하는 배지에서, 32℃, pH 7.0에서 배양하여, 글루코스의 고갈 후, 글리세린을 탄소원으로 하여, 37℃에서 또한 8시간 배양하여, 균체내에 β Gal-117S4HGP의 봉입체를 생산했다.
배양 종료 후, 배양액을 만톤-가울린 균질화기(만톤-가울린사제, 모델 15M-8TA)에 의해 600KG/cm2의 조건에서 균질화 처리하여, 원심분리(CEPA 원심분리기)에 의해 침전 분획을 회수했다. 수득된 침전물을 배양액과 동일한 양의 완충액(10mM 트리스-HCl(pH 8.0), 1mM EDTA)에 현탁한 후, 재차, 원심분리로 침전물을 회수하여, 배양액과 동일한 양의 탈이온수에 현탁하였다. 이후, 다시 원심분리를 수행하여 침전물을 회수한 후, 침전물과 동일한 용량의 탈이온수에 현탁하여, 이후의 조작에 사용했다.
실시예 13. 키메라 단백질에서의 hGLP-1(7-37)의 절단
실시예 12에서 수득된 키메라 단백질 봉입체를 회수하고, 8M 요소에 용해시킨 후, 반응액 조성(20mM 트리스-HCl(pH 8.2), 100mM NaCl, 3.0M 요소, 2.0mM CaCl2, 8mg/ml 키메라 단백질)이 되도록 희석하고, Kex2-660을 10,000U/ml를 첨가하여, hGLP-1(7-37)의 절단을 수행했다. 본 조건하에, 한시간에 대조군의 β Gal-117S4MGP는 90% 이상 절단되었다.
실시예 14. hGLP-1(7-37)의 분취(도 16, 표 3)
고발현 및 Kex2-660의 기질로서도 적당한 키메라 단백질 β Gal-117S4HGP를 대량으로 수득하기 위해, 본 키메라 단백질을 암호화하는 플라스미드 pG117S4HGP로 대장균 M25(W3110/ompT)를 형질전환시켜, 20L 배양조에서 배양했다. 배양은 효모 추출물 20g/L, 박토트립톤 10g/L, K2HPO4 12g/L, KH2PO4 3g/L, 글리세린 5g/L로 이루어졌고, 균체 농도가 OD660이 1.0으로 되었을 때, IPTG(이소프로필베타티오갈락토사이드)를 최종 농도 1mM이 되도록 첨가했다. 소포제(디스폼 CC-222, (주)일본유지)를 사용했다.
37℃에서 균체 농도가 OD660이 12까지 되도록 배양을 계속했다. 집균 후, TE(10mM 트리스/HCl, 1mM EDTA pH 8.0)에 현탁하여, 고압 균질화기(공급원: Manton-Gaulline)에 의해 균체를 파쇄하여, 수득된 균질화물을 원심분리하여 키메라 단백질을 함유하는 침천물을 수득한 다음, 이 침전물을 TE 및 탈이온수로 세정했다. 이렇게 하여, 20L 배양물로부터 키메라 단백질을 함유하는 봉입체 약 100g을 수득했다. 봉입체 현탁액(160g/L) 250ml에, 1M 트리스/HCl(pH 8.2) 100ml, 5몰 NaCl 용액 50ml, 탈이온수 500ml, 요소 900g을 첨가하여 30℃의 항온조내에서 30분 교반 용해하여, 가온한 탈이온수로 희석하고, 30℃에서 5L로 만들었다. 이것에 250mM CaCl2 용액 50ml를 교반하면서 완만하게 첨가하고, 또한 Kex2-660을 20,000단위/ml(약 4.0mg/L)가 되도록 첨가했다.
2시간 후, (절단률은 90% 이상) 아세트산으로 pH를 6.4로 맞추고, 탈이온수로 2배로 희석하여, 미반응 키메라 단백질 및 보호 펩티드를 응집 침전시켰다. 원심분리에 의해 hGLP-1(7-37)을 포함하는 상등액을 수득하고, 아세트산으로 pH를 5.0으로 만들고, 2M 요소·10mM 아세트산나트륨 완충액(pH 5.0)으로 평형화한 양이온 교환 수지(SP 토요펄) 칼럼을 통해 hGLP-1(7-37)을 흡착시키고, 2M 요소·10mM 아세트산나트륨 완충액(pH 6.2)으로 세정 후, 0M에서 300mM 까지의 염화나트륨 농도 구배에서, hGLP-1(7-37)을 용출시켰다. 사전에 분획 튜브에는, 최종 3%가 되도록 아세트산을 넣고, hGLP-1(7-37)의 응집을 억제했다. hGLP-1(7-37)을 함유한 분획을 모아, 5% 아세트산으로 평형화한 저압 역상 칼럼(공급원: SokenODS-W)을 통해 hGLP-1(7-37)을 흡착시켜, 5% 아세트산을 포함하는 50% 아세토니트릴 용액으로 hGLP-1(7-37)을 용출시켰다. 감압하에서 아세트니트릴을 제거하고, 0.22㎛의 멤브레인 필터 여과 후, 동결 건조시켰다.
hGLP-1(7-37)의 정량을 이하 상술한다. hGLP-1(7-37)을 포함하는 용액을 샘플 완충액(1M 아세트산/2M 요소)으로 10배 내지 20배로 희석하여, 원심분리 상등액을 수득했다. HPLC(시마리쯔 LC10A)에 YMC-C8-A302(4.6mm I. D, x 150mm) 칼럼을 접속하고, A액(0.1% TFA/10% 아세토니트릴), B액(0.094% TFA/60% 아세토니트릴), B 40%→ 80%/20분 구배의 계에서 상기 상등액의 10㎕ 내지 20㎕를 전개하여, 220nm의 흡광도 측정에 의해 검출된 hGLP-1(7-37)과 기지의 농도의 표준 hGLP-1(7-37)의 피크 면적비로부터 정량했다. 회수율 표를 표 3에 나타낸다.
[표 3]
hGLP-1(7-37) 회수율
Figure pat00045
본 발명은 분비형 Kex2 유도체와 같은 프로세싱 효소를 사용하여 생리활성 펩티드를 생산할 때에 기질이 되는 키메라 단백질의 설계, 생산 방법 및 상기 펩티드의 정제 방법을 제공한다.
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도 1은 합성 hProPTH(1-84) 유전자 제조에 사용한 합성 올리고머의 서열을 나타낸다.
도 2는 합성 hProPTH(1-84) 유전자의 제조방법을 나타낸다.
도 3은 플라스미드 pG210S(S/X)의 제조방법을 나타내는 도면이다. Plac는 대장균의 락토스 오페론의 프로모터(promoter)를, Ttrp은 대장균의 TrpE의 어테뉴에이터 터미네이터를 나타낸다.
도 4는 키메라 단백질 β Gal-139S(FM) PPH84를 발현시키는 플라스미드 pGP#19의 제조방법을 나타낸다.
도 5는 키메라 단백질 β Gal-139S(FM) PPH34을 발현시키는 플라스미드 pGP#19PPH34의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 6은 키메라 단백질 β Gal-117SPPH34 및 β Gal-117SnHPPH34을 발현시키는 플라스미드 pG117SPPH34와 pG117SnHPPH34의 제조방법의 전반부분을 나타내는 도면이다(n=1 내지 6). pG97SPPH34과 pG97SnHPPH34는 프라이머 S05를 S04로 대체하고, pG139SPPH34와 pG139SnHPPH34는 프라이머 S05를 S06으로 대체하여 제조하였다.
도 7은 키메라 단백질 β Gal-117SPPH34 및 β Gal-117SnHPPH34를 발현시키는 플라스미드 pG117SPPH34와 pG117SnHPPH34의 제조방법의 후반부분을 나타내는 도면이다(n=1 내지 6). pG97SPPH34와 pG97SnHPPH34는 프라이머 S05를 S04로 대체하고, pG139SPPH34와 pG139SnHPPH34는 프라이머 S05를 S06으로 대체하여 제조하였다.
도 8은 폴리히스티딘 링커{(His)4-Pro-Gly}n(n=1 내지 6)이 키메라 단백질의 생산량에 미치는 영향을 조사한 SDS-PAGE의 결과를 나타낸 도면이다. 도면 중 4H는 히스티딘 잔기가 4개, 즉, n=1인 것을 나타낸다.
도 9는 Kex2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 효율에 미치는 폴리히스티딘 링커{(His)4-Pro-Gly}n(n=1 내지 6)의 영향을 나타내는 도면이다. 횡축은 β Gal-117SPPH34의 kcat 치를 1로 할 때의 상대치를 나타낸다.
도 10은 Kex2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 효율에 미치는 Kex2 프로테아제의 인식 부위 P3의 아미노산의 영향을 나타낸 도면이다. P4의 아미노산은 발린 잔기에 고정하여, P3 부위의 아미노산을 치환하였다. 횡축은 β Gal-117S4HVKPH34의 kcat 치를 1로 하였을 때의 상대치를 나타내었다.
도 11은 Kex2-660에 의한 hPTH(1-34)의 절단 효율에 대한 Kex2 프로테아제의 인식 부위 P4의 아미노산의 영향을 나타낸 도면이다. P3의 아미노산은 히스티딘 잔기에 고정하여, P4 부위의 아미노산을 치환하였다. 횡축은 β Gal-117S4HVKPH34의 kcat 치를 1로 하였을 때의 상대치를 나타낸다.
도 12는 β Gal-117KS4HRHPH34 유전자의 발현 벡터 pGKSPH34의 구조를 모식적으로 나타낸 도면이다. 또한, β Gal-117KS는 β Gal-117S의 14위치의 알기닌 잔기가 라이신 잔기로 치환되어 있는 펩티드이다.
도 13은 플라스미드 pG210ShCT(G)의 제조방법을 나타내는 도면이다.
도 14는 HGLP-1(7-37) 유전자(DNA(I)) 제조용 합성 올리고뉴클레오티드의 염기 서열 및 pGKSPH34를 주형으로 하는 PCR용 프라이머의 염기 서열을 나타낸다.
도 15는 플라스미드 pG117S4HGP의 제조 과정을 나타낸다.
도 16은 hGLP-1의 정제의 프로파일이고, A는 Kex2 반응 후, B는 산성 침전상등액, C는 양이온 교환 칼럼 후, D는 저압 역상 칼럼 후의 결과를 나타낸다. 피크 1은 hGLP-1(7-37), 피크 2는 hGLP-1, 피크 3은 보호 펩티드, 피크 4는 키메라 단백질을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 하기 화학식 1의 키메라 단백질.
    화학식 1
    A-L-B
    상기식에서,
    A는 보호 펩티드이고;
    B는 목적 펩티드이고;
    L은 링커 펩티드로서, 이의 C-말단 부분에 X1-X2-(Pro, Lys 또는 Arg)-Arg(여기서, X1은 Asp 및 Glu 이외의 아미노산이고, X2는 Pro 이외의 아미노산이다) 서열을 가지고, N-말단에 His가 풍부한 부분을 가진다.
  2. 제1항에 있어서, N-말단의 His가 풍부한 부분이 [(His)4-Pro-Gly]n(여기서, n은 1 내지 6이다) 서열을 갖는 키메라 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, N-말단 부분의 아미노산 서열과 C-말단 부분의 아미노산 서열과의 사이에 1 내지 5개의 임의의 아미노산이 존재하는 키메라 단백질.
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서, X1이 Arg, Lys 또는 His이고, X2가 His 또는 Phe인 키메라 단백질.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, A가 아미노산 서열; Pro-Arg, Arg-Arg 및 Lys-Arg를 함유하지 않는 폴리펩티드인 키메라 단백질.
  6. 제1항 또는 제2항에 있어서, A가 아미노산 서열; Pro-Arg, Arg-Arg 또는 Lys-Arg를 함유하는 폴리펩티드인 경우, A 중에 상기 아미노산 서열을 함유하지 않도록 상기 아미노산 서열 중 1개 또는 2개의 아미노산이 다른 아미노산으로 치환되어 있는 키메라 단백질.
  7. 제1항 또는 제2항에 있어서, A가 220개 이하의 아미노산 잔기의 폴리펩티드인 키메라 단백질.
  8. 제7항에 있어서, A가 대장균 유래의 β-갈락토시다제의 N-말단측의 1위치의 아미노산으로부터 97위치, 117위치 또는 139위치의 아미노산까지의 펩티드인 키메라 단백질.
  9. 제1항 또는 제2항에 있어서, A 중의 시스테인 잔기가 세린 잔기로 치환되어 있는 키메라 단백질.
  10. 제1항에 있어서, B가 (1) 사람 부갑상선 호르몬[hPTH(1-84)], (2) 상기 사람 부갑상선 호르몬의 N-말단의 1위치 또는 3위치의 아미노산 잔기로부터, 31위치, 34위치, 37위치, 38위치 또는 84위치의 아미노산 잔기까지의 서열을 갖는 펩티드, 및 (3) 상기 (2)에 해당하는 펩티드의 C-말단에 Gly를 부가한 펩티드로부터 선택되는 펩티드의 키메라 단백질.
  11. 제1항에 있어서, B가 (1) GLP-1[GLP-1(1-37)] 및 (2) 상기 GLP-1의 아미노산 서열에 있어서 1개 이상의 아미노산 잔기가 결실된 서열을 갖는 펩티드로부터 선택되는 펩티드인 키메라 단백질.
  12. 제1항에 기재된 키메라 단백질을 암호화하는 DNA를 포함하는 발현 벡터로 숙주 세포를 형질전환시켜, 수득된 형질전환체를 배양하고, 상기 배양물로부터 상기 키메라 단백질을 채취함을 특징으로 하는, 제1항에 기재된 키메라 단백질의 제조방법.
  13. 제1항에 기재된 키메라 단백질에 Kex2 프로테아제, 푸린(Furin), 전구체 변환효소 1/3(PC1/3) 및 전구체 변환효소 2(PC2), 및 프로세싱 효소 활성을 갖는 이들의 유도체로부터 선택되는 프로세싱 효소를 작용시켜 링커 펩티드(L)의 C-말단과 목적 펩티드(B)의 N-말단 사이의 펩티드 결합을 절단하고, 목적 펩티드(B)를 수득함을 특징으로 하는, 목적 펩티드(B)의 제조방법.
  14. 제12항 또는 제13항에 있어서, 목적 펩티드(B)를 수득할 때에 등전점 침전처리를 사용함을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항에 있어서, 상기 (2)에 해당하는 펩티드가 GLP-1의 N-말단의 7위치의 아미노산 잔기로부터 37위치의 아미노산 잔기까지의 서열을 갖는 펩티드 GLP-1(7-37)인 키메라 단백질.
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