TW480270B - Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme - Google Patents

Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme Download PDF

Info

Publication number
TW480270B
TW480270B TW086102706A TW86102706A TW480270B TW 480270 B TW480270 B TW 480270B TW 086102706 A TW086102706 A TW 086102706A TW 86102706 A TW86102706 A TW 86102706A TW 480270 B TW480270 B TW 480270B
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
sequence
chimeric protein
amino acid
patent application
peptide
Prior art date
Application number
TW086102706A
Other languages
English (en)
Inventor
Yuji Suzuki
Koji Magota
Toyofumi Masuda
Original Assignee
Suntory Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Suntory Ltd filed Critical Suntory Ltd
Application granted granted Critical
Publication of TW480270B publication Critical patent/TW480270B/zh

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/585—Calcitonins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/12—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length by hydrolysis, i.e. solvolysis in general
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/635—Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2468—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1) acting on beta-galactose-glycoside bonds, e.g. carrageenases (3.2.1.83; 3.2.1.157); beta-agarase (3.2.1.81)
    • C12N9/2471—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y302/00—Hydrolases acting on glycosyl compounds, i.e. glycosylases (3.2)
    • C12Y302/01—Glycosidases, i.e. enzymes hydrolysing O- and S-glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12Y302/01023—Beta-galactosidase (3.2.1.23), i.e. exo-(1-->4)-beta-D-galactanase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/50—Fusion polypeptide containing protease site
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（1) 發明背景 本發明傜關於一種生成一可作為受質的具生理活性之 胜肽或其前驅物的嵌合型蛋白質，以及一種生成該具生理 活性之胜或其前驅物的方法。再者，本發明偽關於一種用 於由該嵌合型蛋白質中分離出該具生理活性之胜肽，以純 化該具生理活性之胜肽的方法。 相關桔術 許多利用嵌合型蛋白質之表現的胜肽生成法已被嘗試 。本案偽以化學性或酵素性切割來分離一標的胜肽。使用 於此方法之酵素包括可用於專一性地切割一離胺酸殘基之 c-端胜肽鍵的離胺酸-蛋白内切酶（無色菌蛋白酶I )以 及用於專一性地切割一麩胺酸之〇端的葡萄球菌蛋白酶νδ 。化學法包括以亞硝酸切割天門冬胺酸和以溴化氰切割甲 硫胺酸。 就化學法而言，標的蛋白的修飾是無可避免的，必須 在切割後將標的蛋白自許多類似物中分離出來。另一方面 ，就酵素法而言，其專一性高，且該切割偽在相對緩和之 條件下進行，而有肋於標的蛋白的純化。然而，酵素是否 可被使用傺取決於標的蛋白之胺基酸序列，故現有的蛋白 酶並非皆可被使用，因而需要一種廣用的切割酵素。 當一生物體内生成一胜肽激素或其前驅物時，該胜肽 的前驅多胜會被一酵素（加工酵素.）專一性地切斷。該等 習知於本技藝中的酵素包括前激素酵素1/3 (prohormone e n z y m e 1 / 3 , P C 1 / 3)，前激素酵素2 ( P C 2)及芙琳 -4 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨Ox 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装. 訂 480270 IV 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明（2 ) (f ur ί η )。作用於哗酒酵母菌之a -交配因子的生成過程上 的KeX2蛋白酶亦為前述酵素的一種。當將此等加工酵素用 於由嵌合型蛋白質切下標的蛋白時，可預期該胜眈激素不 會受到破壞’且該該加工酵素可供用於廣泛種類之胜肽上 。因此，發展出此等生成方法在本技藝中偽為所欲的，。 本案之發明者曾發表一方法，該方法包含將一源自於 大腸桿菌々-半乳糖苷酶之多胜作為保護性胜肽、擇出適 當之聯結胜肽，並有效地與一標的胜肽共同形成一嵌合型 蛋白質，以形成一不溶性包含體（日本未審查專利公開 (Kokai)案第5-328992號）。此嵌合型蛋白質在具有諸如尿 素之改質劑（mod i f i er)時可被溶解，且被使用作為加工酵 素之受質。 夫發表夕枝術 另一方面，本發明者曽掲露一藉由改變基因而將衍生 自啤酒酵母菌之一膜結合型酵素Kex2蛋白酶製成水溶性酵 素（一Kex2分泌型衍生物）之方法（於1996年3月4日所提申 之該案發明說明書；該發明之標題為“用於生成分泌型 Kex2衍生物的方法”）。該說明書中使用此酵素作為加工 酵素，並未提及以一供作受質之嵌合型蛋白質。 發明簡介 據此，發展一種用以設計與生成一能於大量培養條件 下在大腸桿菌内有效地生成為一包含體，並易於溶解於允 許一加工酵素有效作用的條件之嵌合型蛋白質的方法；以 及一用以設計並生成一位在切割址附近的胺基酸序列，俾 5 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 A7 B7 五、發明説明（ 使標的胜肽可藉由一加工酵素而有效地自該嵌合型蛋白質 切下的方法，偽所欲於本技藝中。再者，發展一種用以將 被生成之具生理活性的胜肽純化至不低於99¾之純度的高 度多用途方法亦為本技藝所欲的。 據此，本發明之目的偽提供一種用以設計及生成一在 利用一諸如分泌型Kex2衍生物之加工酵素來生成一具生理 活性之胜肽上，作為受質之嵌合型蛋白質的方法，以及一 種純化該胜肽之方法。 本發明已進行解決上述問題之研究，結果首次蘭明： 1) 一段例如一含有 U:His)4-Pr〇-Gly)n (1 t 〇 6)聯結 請 先 閱 讀 背 意 事 項 再 填‘ 寫 本 頁
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 胜肽之富含組胺酸的序列插入嵌合型蛋白質可導致生成量 增加，亦增加該嵌合型蛋白質在與諸如分泌型KeX2衍生物 之加工酵素反應條件下的溶解度。 2) 對一高反應性受質之需求，即將胺基酸序列乂，-)^-(Lys/Arg/Pro) -Arg用作為聯結子（1 inker )内之該加工酵 素作用址的胺基酸序列，其中Xi傺較佳為離胺酸、精胺酸 或組胺酸，X2傺較佳為組胺酸或苯丙胺酸，以及 3) 在反應後，將反應溶液酸鹼值轉移至酸性側、稀釋變 性劑致使標的胜肽外大部份成份沉澱、離心或加壓過濾使 95¾以上的標的胜胜肽自上清液中回收，以及單獨地或共 同地使用陽離子交換層析及反相HPLC等高回收且高度純化 標的胜肽的一条列步驟，以促使本發明之完成。 因此’根據本發明之一觀點，提供一以下式來表示之 嵌合型蛋白質： -6 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) 見格（210X 297公釐） 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（4 )
A-L-B 其中A偽代表一保護性胜肽； B傜代表一標的胜肽； L偽代表一 C-端具有序列Xi-XrfPro、Lys或Arg)-Ar g而N -端有一富含組胺酸之區域的聯結胜呔，其中χ t與 Xs代表任一胺基酸。該N-端富含組胺酸之區域有[(His) 4-Pr〇-Gly]n序列為佳，其中n為1至6。另外，較佳地，Xi 代表精胺酸、離胺酸或組胺酸，而X2代表組胺酸或苯丙胺 酸。任意1至5個胺基酸可存在於Ν-端區域的胺基酸序列與 C-端區域的胺基酸序列之間。 依據本發明之另一態樣，其提供一種用以生成上述嵌 合型蛋白質的方法，其含下列步驟：以一含有編碼該嵌合 型蛋白質之去氧核醣核酸的表現載體轉形一寄主細胞，培 養所得之轉形株（t r a n s f 〇 r m a n t s)及由培養中獲取該嵌合 型蛋白質。 依據本發明之另一態樣，其傺提供一用以生成上述標 的胜肽（B)之方法，其中令一加工酵素作用於如申請專利 範圍第1至13項中任一項之嵌合型蛋白質，來切割聯結胜 呔（L)之C-端與標的胜呔（B)之N-端間的胜肽鍵，以獲得該 標的胜肽（B)。 根據本發明之一較佳實施例，上述方法包含下列步驟 ••以一能表現一編碼一嵌合型蛋白質的基因之載體轉形一 寄主細胞内；培養所得之轉形菌；分解該轉形麵以提供一 包含體之不溶性分離部份；用一溶解劑（so 1 iib i 1 i z i ng 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項·#填寫本頁)
經濟部中央標準局負工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 五、發明説明（5) agent)來處理不溶性分離部份，以溶解包含體内的嵌合型 蛋白質；藉由一諸如分泌型Kex2-660衍生物的加工酵素， 來切割介於該溶解的嵌合型蛋白質之聯結子胺基酸殘基的 C-端及標的胜肽的N-端之間一胜肽鍵，以分離該標的胜肽 ;以及一藉由沉澱、陽離子交換層析、低壓逆向層析與反 相HPLC純化該標的胜肽。 圖示簡沭 第1圖顯示用於製備合成hProPTH (1-84)基因之合成 寡聚體序列。 第2圔為一顯示合成hProPTH (1-84)基因之製備的圖 譜。 第3圔為一顯示質體PG210S (S/X)之製備的圖譜，其 中P 1 ac偽代表大腸桿菌乳糖操作子（operori )之一起始子， 而TtrP代表大腸桿菌之TrpE減缓子之終結子。 第4圔為一顯示一可表現嵌合型蛋白質/3 Gal-139S (FM)PPH84之質體pGPtfl9的製備之圖譜。 第5圔為一顯示一可表現嵌合型蛋白質Gal-139S (FM) PPH34之質體pGPtfl9PPH34的製備之圖譜。 第6圖為一顯示一種用以生成可表現嵌合型蛋白質 /3 Gal- 117SPPH34 及 /3 Ga 卜117SnHPPH34 (η為 1至 6)之質體 PG117SPPH34及pG117SnHPPH34之方法的前半部之圖譜，其 中PG97SPPH34偽藉由以S04引子取代S05引子來製備，而 PG139SPPH34及pG139SnHPPH34偽藉由以S06引子取代S05引 子來製備。 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(2丨0:< 297公釐） ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 A 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明（6) 第7圖為一顯示一種用以生成可表現嵌合型蛋白質 /?〇31-117$??[13 4及/3〇3 1-117$』？？[134&為1至6)之質體 PG117SPPH34及pG117SnHPPH34之方法的後半部之圖譜，其 中PG97SPPH34及pG97SnHPPH34像藉由以S04引子取代S05引 子來製備，而PG139SPPH34及pG139SnHPPH34偽藉由以S06 引子取代S05引子來製備。 第8圖為一顯示SDS-PAGE之結果的圖譜，藉此研究寡 組胺酸聯結子{ (H i s) 4 - P r 〇 - G 1 y } η (η為1到6)對一嵌合型 蛋白質生成效率之影響，其中4Η係代表組胺酸殘基的數目 為4，亦即η等於lc 第9圔為一顯示一聚組胺酸聯結子{(H is) 4-Pro -Gly}n (η為1到6)對以Kex2-660切割hPTH (1-34)之效率的影 響之圖譜，其中該撗座標像代表假設/?Gal-117SPPH34之 k c a t值為1時的相對k c a t值。 第10圖為一顯示一位於Kex2蛋白酶辨識址P3之胺基酸 對於以Kex2-660切割hPTH(l-34)之效率的影響之圖譜，該 位於P4址之胺基酸被固定為纈胺酸，且該位於P3址之胺基 酸被置換，其中該橫座標偽代表假設/3Gal-117S4HVKPH34 之k c a t值為1時的相對k c a t值。 第11圖為一顯示一位於Kex2蛋白酶識別址P4之胺基酸 對於以Kex2-660切割hPTH(l-34)之效率的影響之圖譜，該 位於P3址之胺基酸被固定為組胺酸，且位於P4址之胺基酸 被置換，其中該橫座標偽代表假設/3 Ga卜117S4HVKPH34之 kcat值為1時的相對kcat值。 9 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 _ 五、發明説明（7 ) 第12圖為一顯示一用於Gal-117KS4HRHPH34基因之 表現載體PGKSPH34結構的典型圖譜，其中ySGal-117KS為 一藉離胺酸殘基來取代/S Gal-117S中位於第14位置之精胺 酸的胜呔。 第13圖為一顯示質體pG210ShCT(G)之製備的圖譜。 第14圖顯示利用PGKSPH34為模本，而用以構建hGLP-1 (7-37)基因之合成寡核苷酸的核苷酸序列以及PCR引子的 核苷酸序列。 第15圖顯示一用以構建質體PG117S4HGP的方法。 第16圖顯示hGLP-Ι之純化曲線，其中A顯示一樣品與 Kex2反應後之結果，B顯示一來自於酸沉澱之上澄液的結 果，C顯示一樣品經過陽離子交換管柱層析後之結果，D 顯示一試樣經一低壓反相交換管柱層析後之結果；尖峰1 為hGLP-1 (7-37)，尖峰2為hGLP-Ι，尖峰3為一保護性胜 肽，尖峰4為嵌合型蛋白質。 詳細説明 依據本發明之該方法，前述之嵌合型蛋白質包含一保 護性胜肽、一聯結子與一可藉一加工酵素切割而生成生理 活性胜肽之具生理活性之胜肽（一標的胜肽）。該等實例包 括人類副甲狀腺激素（hPTH (1-84),)、人類副甲狀腺激素 之衍生物（hPTH (1-34) , hPTH (1-37 )及 hPTH (1-38 ))、其它 人類副甲狀腺激素之衍生物（hPTH( 1-31) Gly,hPTH( 1-34) Gly, hPTH(l-37) Gly, hPTH(l-38) G 1 y,hPTH (3-84), hPTH(3-34), hPTH(3-37)與 hPTH(3-38))細胞生長因子、 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 29?公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明（8 ) 降血鈣素及其前驅物、與類升血糖素胜肽1 (GLP-υ及其 衍生物（GLP-l(l-37), GLP-l(7-37)，GLP-l(7-36) _2等） ，但非僅限於此。 可用於此處之加工酵素包括蛋白酶、芙琳 (furin)、前激素轉化酶1 (PCI)、前激素轉化酶2 (PC2) 或其等之衍生物，但非僅限於此。於本發明内，藉去除 Kex2蛋白酶疏水性區域之C -端製備而成的分泌型Kex2衍 生物是所欲的。 依據本發明，該保護性胜呔#以一大小不超過220個 胺基酸之胜呔為優。譬如一自大腸捍半乳糖苷酶之 N -端的1-位址計算90至210個胺基酸之胜肽為優。一大腸 桿菌/5 _半乳糖苷酶N-端1至97個、且更佳為1至117個或1 至139個胺基酸之胜肽。較佳地，上述胜肽傺藉由絲胺酸 來取代半胱胺酸。較佳地，在上述胜肽中，位於第14-位 置之精胺酸傺以離胺酸所取代。再者’較佳地’保護性胜 肤不含有諸如pr0-Arg，Arg-Arg及Lys-Arg之被加工酵素 所辨識之序列。若保護性胜肽内含該辨識序列，至少將一 前述該辨識序列内之胺基酸以一不同胺基酸取代而令加工 酵素無法辨識該序列，俾可避免被加工酵素切割。 為增進該嵌合型蛋白質之溶解性’聯結子胺基酸以親 水性為佳。某些標的蛋白致使該嵌合型蛋白質電荷改變會 導致該包含體産量降低親水性版基酸以一對於生成包含 體之細_内的生理酸鹼值具有缓衝性質之組胺酸殘基較佳 。此外，由缓和聯結子之二级結構的觀點’變性與溶解後 -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公慶） 丨丨ί丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) __.丁 "口 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明説明（9 )
Pro-Gly序列之插入為佳。最好能提供一編碼（Hi s)4 -Pro-Gly之合成去氧核_核酸片段並適當地重複插入一編 碼保護性胜肽之去氧核_核酸片段，而設計一 U H i s .) 4 -Pro-GlyU之聯結子，其中η為1到6，以期能與不同之具生 理活性之胜呔相抗衡。此聯結子之Ν -端部份的該序列在 下文稱為LN。 再者，本案發明人已首先闡明：源自於哗酒酵母之 Kex2蛋白酶衍生物（分泌型Kex2衍生物）已可大量製造， 而當使用一嵌合型蛋白質作為一受質時，一位於Kex2蛋白 酶辨識址附近之胺基酸亦會大大地影響活性。本案發明人 特別闡述當位於聯結子C -端之胺基酸序列為Xi -X2 - (Lys/ Arg/Pr〇)-i\rg，其中表任意胺基酸，提供條件： 當Xi.精胺酸、離胺酸或組胺酸，而X2為組Μ酸或苯丙胺 酸，該分泌型Kex2衍生物之活性成為最大。聯結子C -端 部份之該序列在下文稱為“LC” 。 經嵌合型蛋白質方法生成與切割之標的胜肽可藉不同 方法純化之。於本案中，前述該嵌合型蛋白質之利用允許 該嵌合型蛋白質維持不反應性，該保護性胜肽與源於大腸 桿菌之不純物可藉由一簡易沉澱程序有效去除之。待別地 ，已發現在與分泌型(Cex2衍生物反應後，將酸鹼值轉移至 弱酸側，隨後稀釋該反應溶液以降低該變性劑濃度，不僅 能使大部份源於大腸捍麵之不純物，亦可使不低於95%之 該維持不反應性嵌合型蛋白質與保護性胜呔被轉送至沉澱 物内，致使不低於95%之該標的胜肽留於該上清液，可藉 12 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A«4規格（2丨OX 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 五、發明說明（10 ) 離心或加壓過濾而易於取得一含標的胜眈之澄清液體。 經酸鹼值調整及其類似步驟，該上清液直接通過一陽 離子交換層析以吸附標的胜肽，隨後利用一鹽類濃度或酸 鹼值改變洗脱出該標的胜肽，該洗脱物通過一低壓反相層 析以吸附藉一有機溶媒濃度及隨後之該洗脱物濃度變化而 洗脱出之標的胜肽。降低該有機溶媒濃度後，該洗脱物接 受反相HPLC，藉改變該有機溶媒濃度進行分離與分餾以提 供一高純度標的胜肽。 本發明將藉一人類副甲狀腺激素衍生物hPTH (1-34) 為標的胜肽，以實例敘述之。 一 /3 031-2105??1184表現質體卩02103[1?「(^別傜將合成 的去氧核醣核酸寡聚體連接在一起，以製備一hPTH(l-84) 基因，並取代如是製備之一質體pG210ShCT[G]内其編碼 hCT[G]區域製備而成（第3圖）。製備一 pG117SHPPH34，其 一轉譯終止密碼子取代一位於一 hPTH( 1-34)基因距N -端 35-位置之一編碼胺基酸（Val)的密碼，並且其一編碼 /3 Gal_117S之基因（一大腸桿菌召-半乳糖苷酶之N -端第1 至117胺基酸之半胱胺酸殘基以絲胺酸殘基取代之胜肽:)取 代一編碼/3 Gal-210S之基因（一大腸桿® /3 -半乳糖苷酶之 N -端第1至210胺基酸之半胱胺酸殘基以絲胺酸殘基取代） (第6及7圖）。 如前所述可製備PG13 9SHPPH3 4或PG97SHPPH34，唯應 嵌入者為一編碼/3 Gal_139S或一 /3 Gal-97S之基因而非 /3 Ga 卜210S。 -13 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A料見格（210X297公釐） — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（11) 在此等質體中，分別編碼/SGal-97S、/?Gal-117S及 /3 Gal_139S之結構基因經由一聯結胜狀Phe-Met-Lys_Ser-Val-Lys-Lys-Arg與一 hPTH (1-34)之結搆基因相連，該編 碼此嵌合型蛋白質之結構基因係由一 1 ac起始子:）來調控 。此外，此質體含有一抗四璟素基因標記。 雖然/SGa卜97SPPH34於尿素溶液中具高溶解度，但其 生成率低。另一方面，/5〇31-11731^評34與/3〇3卜 139SPPH34之生成率雖高，在與分泌型Kex2衍生物反應條 件下之該溶解度極低，以致必須使用大量的分泌型Kex2衍 生物方能自該嵌合型蛋白質切下hPTH( 1-34)。據此理由， 為提供在尿素溶液内具高生成率與高溶解度之一嵌合型蛋 白質，一親水性、在酸鹼值7 (中性）左右表現缓衝性質且 含有能抑制該嵌合型蛋白質二級結構之形成的胺基酸之聯 結子LN被插入保護性胜肽與聯結子Met-Ser-Va 1 -Lys-Lys-Arg之間。 一具有（（}]^)4-?「〇-017)«序列之胜肽被用於1^，其 中η為1至6。被引進之{(His)4-Pr〇-Gly)n，其中η為1至6 ，藉合成一編碼（His)4-Pr〇-Gly 或（（His)4-Pr〇-Gly)« 之 去氧核醣核酸片段，以一適當的莫耳比例將該去氧核醣核 酸片段嵌入一編碼該保護性胜狀之去氣核_核酸片段的 3 ’ -端。如此，一編碼一包含含有一段或多段上述該胺基 酸序列之聯結胜肽的嵌合塱蛋白質之基因被製備。 一帶有反向嵌入之去氣核醣核酸片段的基因藉去氧核 _核酸定序確任後被剔除。大腸桿菌M25菌株藉編碼嵌合 - 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 策·
、1T 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（12) 型蛋白質之質體轉形以測驗該嵌合型蛋白質之生成率（第8 圖）。結果發現在該保護性胜肽/3 Gal_97S與/? Ga卜139S之 例中，η為3時呈現該嵌合型蛋白質之高生成率；然在該保 護性胜肽/3 Ga卜117S之例中，η為1至6時呈現該嵌合型蛋 白質之高生成率。此等嵌合型蛋白質之包含體經細胞破壞 與離心以進行洗滌與分離，以尿素溶解，稀釋而用於與 Kex2-660之反應（第9圖）。 結果發現（（His)4-Pr〇-Gly)n之引用增進所有歌合型 蛋白質對Kex2-660之敏感性，其中η為1至6。據此，為了 用於hPTH (1-34)生成之該嵌合型蛋白質，含有作為保護 性胜之Ga卜117S與作為聯結胜肽LN之（His)4-Pro_Gly之 召Ga卜117S4HPPH34，經考慮該嵌合型蛋白質之生成率、 與Kex2-660之反應性，及該保護性胜肽之大小後被採納。 上述結果顯示，在一供分泌型Kex2衍生物切下一生理 活性胜肽之一嵌合型蛋白質的設計中，一段（（His) 4-Pro-GlyU之胜肽的嵌入，不僅適於改善大腸捍菌生成率’亦 改善與分泌型Kex2衍生物反應條件下之溶解度，其中η為1 至6。 在本方法中，分泌型衍生物使用時與嵌合型蛋白 質之莫耳數比例以約1比為宜’因此佔了該製造原料 價格之主要部份。因此’需要設計一較易藉分泌型Kex2衍 生物切割之嵌合型蛋白質° 一人類副甲狀腺激素前驅物之 一前序列 Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg被用於 /3 Gal-117S4HPPH34之該分泌型Kex2衍生物辨識址。然而此序列 15 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210x 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7 五、發明説明（13) 是否最適於藉分泌型Kex2衍生物切割為未知，且如同許多 其他蛋白酶最佳化有導致更進一步增加切割效率之可能。 由於hPTH(l_34)以其C -端側與該辨識址相連，不能進行 胺基酸之取代。反之，就没有新産生的辨識址而言，位於 N -端側之序列是可以被自由選擇的。據此，嘗試將該作 為受質之嵌合型蛋白質的P3-址（:X2)轉變成任一胺基酸。 被研究過之1δ段胺基酸序列顯示於第10圖。結果發現組胺 酸或苯丙胺酸引入Χ2允許hPTH( 1-34)以較佳效率自該嵌合 型蛋白質被切下。 因此，顯示於第11圖之20段胺基酸序列被用以研究該 P4址，而未顯現顯著副反應之組胺酸於》2固定不動。結果 發現將精胺酸、離胺酸或組胺酸引入Xi允許hPTH(l-34)以 較高效率自該嵌合型蛋白質被切下。能提供最高切割效率 之 Arg-His-Lys-Arg被選為 LC。 在本研究過程之中，發現藉一分泌型Kex2衍生物可切 割位於/3 Ga卜117S之13與14-址的Arg-Arg序列之C -端的 胜呔鍵。因此，在後續藉酸沉澱純化之步驟中，該産生之 /3 Gal (1 -14)與hPTH (1-34)被回收於上清液分離部份中。 因此，離胺酸取代14精胺酸而抑制了該切割’藉以避免 /3 Gal (1-14)之生成。 基於前述結果，對用於生成hPTH(l-34)之嵌合型蛋白 質而言，14精胺酸以離胺酸取代之/3Gal-117S(/3Gal -117KS)被採納為該保護性胜肽，且一有一胺基酸序列卩「〇-His-His-His-His-Pro-Gly-Gly-Arg-Pro-Ser'Arg-His- 一 16 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公着） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 480270 i_I__ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明（14)
Lys-Arg之胜肽被採納為一聯結胜肽。 本案發明人於大腸桿菌内表現該嵌合型蛋白質/3 Ga卜 117KS4HRHPH34，將所得之包含體予以洗滌、回收、溶解 及令其與一分泌型Kex2衍生物進行反應，接著研究純化方 法。結果，含源自於大腸桿_不純物之一胜肽，未反應之 嵌合型蛋白質與保護性胜呔，可藉利用一將酸鹼值由中性 移至弱酸性，致使溶解度明顯降低之現象而被沉澱，亦即 將適合一分泌型Kex2衍生物反應之酸鹼值7.8至8.2轉移到 6 · 2 至 6 · 5 ° ^ 另外，藉稀釋以降低變性劑（尿素）濃度能令大部份不 純物沉澱。該沉澱物藉離心或加壓過濾去除以自上清液中 有效地回收hPTH( 1-34)。將該上清液調整至酸鹼值5.0後 通過一陽離子交換層析（例如PorosHS，SP ToyoPearl)以 吸附hPTH(l-34)，接著以0.3至0.4M NaCl洗脱。在洗脱物 中加入醋酸，接箸該混合溶液通入一低壓反相層析（例如 PorosR2 SokenODS-W)以吸附 hPTH(l-34)，接著以約 30% 乙腈（aceton i i le)洗脱以去除對濃縮與逆相HPLC有不利 影響之不純物。 洗脱物中之乙睛以減壓被蒸餾移除，該殘餘物以 0.22揮濾器過濾，通過反相HPLC(例如InertsiliPrepODS ，TSK-0DS-120T)以吸附hPTH (1-34)，並藉乙腈之梯度洗 脫（g r a d i e n t e 1 u t i ο η)分離之。一高純度的分離部份被選 出。如此，具有99.5¾之純度的hPTH (1-34)以40至70¾之 回收被分離。上述結果顯示此回收為本技術已報告者中最 17 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Λ4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 s____ 五、發明説明（15) 高，證實本發明之實用性。 窨例 雖不僅限於此等實例，本發明將參照後述實例做較詳 盡之說明。 首先，將説明用於本發明之質體、大腸桿菌以及各實 例共通之基本實驗程序。 質髏 一質體pG210ShCT [G]為一在大腸桿菌乳醣操作子之一 起始子（一 1 ac啓始子）調控下能表現一嵌合型蛋白質，亦 卽Ga卜210S之質體該嵌合型蛋白質含有位於-半乳糖 苷酶之N -端的胺基酸1-210之胜肽，且其76 Cys、122Cys 、與154 Cys由絲胺酸取代之；亦表現經一麩胺酸殘基與 /3 Gal210S鍵結之hCT [G](—在胺基酸32之C -端加入一甘 胺酸殘基之人類降血鈣素的胜呔）。 質體之製備像以一經限制酶Ρνιι 11與EcoR I消化之 pGHcc210(Ser)rop-來製備，含有一部份編碼 /3Gal-210S 之基因的去氧核醣核酸片段，與另一含有經限制酶Pvu II 與EcoRI消化之載體PG97S4DhCT [G]的去氧核_核酸片段 相連接（第13圖）。製備p G H ex 210 ( S e r:) r ο p -之方法見於曰 本未審查專利公開案（Kokoku)第6-87788號。而含有質體 F>G97S4DhCT [G]之大腸桿菌W31100菌株命名為大腸桿菌 SBM323，於1991年8月8日以FERM BP-35 03寄存於國際工商 業部工業科技之生物科學與人類技術所（I n s t i t u t e 〇 f Bioscience and Human Technology Agency of 13 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（16)
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade & Industry) ° 引進一編碼一標的蛋白之去氧核_核酸區域作為一 EcoRI-Sall去氣核_核酸片段至質體pG210ShCT[G]内，該 讀取架構吻合時能使一嵌合型蛋白質與Ga卜210S進行表 現。該質體被用於一合成人類副甲狀腺激素（hProPTH (1 -84))基因之選殖以及一製備質體pGPtfl9時之原料（第3 圖）。 大腸捍_ 以購自Toy obo公司之大腸桿菌JM1 09菌株作為勝任細 胞（c 〇 m p e t e n t c e 1 1)及用於質體之製備ϋ大腸桿_ Μ 2 5菌 株(W3110/ompT- S u g i m u r a et a 1. B i ο π h e m. B i 〇 p h y s, Rjes_ Commu . 153, 753-759, 1988)被用於嵌合型蛋白質 之表現。 培養基 下列培養基用於大腸捍菌之培養。 S B培養基：〇 · 5 % (w / v)甘油，2 · 4 % (w / v)酵母菌萃取 物，1.2% (w/v)蛋白腺（trypton)， 0·1Μ磷酸氫錚緩衝 液（ρΗ7·5)。
NU1合成培養基：0.4% (w/v)酵母菌萃取物、10·« (w/v) K2HP〇4 - 0.4¾ (w/v) KH2P〇4l 0. 27¾ (w/v) Na2HP〇4 、 1,2¾ U/v) (NH4)2S〇4、 0.02¾ U/v) NH4C1、 (K3%(w/V) L-甲硫胺酸、0.2¾ (w/v) MgS〇4*7H2〇、 40mg/L FeS〇4 . 7H2〇 、 40mg/L CaCl2 ♦ 2H2〇 、 lOmg/L 19 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 480270 A7 ___B7 _ 五、發明説明（17)
Aids · 6H2O - lOmg/L C0CI2 * 6H2〇 > 2mg/LZnS〇4 · 7H2〇 、2mg/L Na2M〇4· 2H2O、lmg/L C11CI2· 2H2O、0.5 mg/L H3BO3及 lOmg/L MnSCU· nHsO。 基本實驗程序 若非另有指定，下述實驗程序應用於該等實驗中。 去氧核_核酸引子傺藉磷酸醯胺方法 (phosphoamidite method)以自動合成儀（Model 320 A Applied Biosystems製造）合成。去氧核聽核酸序列藉雙 去氧法（d i deoxy me t hod)決定。 去氧核_核酸傺利用限制酶（3至10倍量）依供應商指 示作用1小時。質體之結構傺以20 /i 1反應溶液中之0 · 5至 1 〃 g去氧核_核酸進行分析，而去氯核醣核酸之製備則以 3至10/i g去氧核醣核酸在50至100,u 1反應溶液中進行。反 應溫度、反應緩衝液及其他條件偽依供應商之指示。 在瓊脂膠體上電泳之試樣製備偽在反應溶液中加入 0.2倍體積的染劑（含0.25% (w/v)溴酚藍（bromophenol blue)之 15% (tf/v)液態 Ficol 1溶液）。以 TAE緩衝液（40mM Tris/醋酸，2mM EDTA)作為在瓊脂膠體上電泳之緩衝液° 分析一質體之結構像用M u p i d - 2 ( C 〇 s m ο B i 〇 C 〇 ·，L t d ·製） 以100V電泳1小時。製備去氧核醣核酸時電泳則在一水平 顧體（20cm X 15cmX 0.7cm)上以150 V進行4小時或以35 V進 行13小時。該膠髏經液態溴化乙基啶溶液（ethidiuin b r 0 m i d e 0 . 5 /i g / m 1)染色2 0分鐘後以紫外光照射撿測去氧 核醣核酸帶。瓊脂膠體濃度視需分離之去氧核醣核酸片段 -20 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂 480270 A7 B7 五、發明説明（1δ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 大小由1 · 0 %至2 · 0 %。 瓊脂膠體内之去氧核醣核酸之萃取偽將膠體置於一充 滿0 · 1倍ΤΑΕ緩衝液之透析管中，通入電壓以進行洗脱。去 氧核_核酸溶液以酚與氯仿處理，復用乙醇沉澱以純化去 氧核醣核酸ϋ 接合反應（ligation)偽於30ul含有0.05至lug去氧 核_核酸片段之反應溶液（67mM Tris/HCI (pH7,5)， 5raM MgCl2、5niM DTT、ImM ATP)中加入10單位T4接合酶，且令 反應於16°C進行12至18小時，或藉TAKARA試劑組（Takara Shuzo Co·, Ltd♦製造）為之。 大腸桿M JM109菌株偽依供應商之指南進行轉形。大 腸桿_ Μ25菌株依氯化鈣法來轉形。轉形之菌株利用抗藥 性（四環素）篩選之。 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳（SDS-PAGE)試樣之製備傺加 入等量之SDS試樣緩衝液（63mM Tris/HCl (ΡΗ6.8)、10¾ (w/v)甘油、10¾ (tf/v) SDS、10/il/mL溴酚籃）並將混合 物煮沸3分鐘。電泳於16% (w/v) SDS-PAGE迷你（TEFC0)膠 體上以每片膠體20mA之電流進行70分鐘，膠體傺藉考馬斯 氏藍G來染色。 hPTH (1-34)之定量首先傺將一含hPTH (1-34)之溶液 以一試樣緩衝液（1M醋酸鹽/2M尿素）稀釋10至20倍後，將 稀釋液離心以取得上清液，該上清液用於連接了 YMOODS- A302 (d4.6nun X 150fflffl)管柱（IK· Yamamura Kagaku Kenkyujo 製造）之 HPLC (LC10A Shimadzu Seisakusho Ltd 21 一 21 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 五、發明説明（19) 製造），利用A液（0·1% (v/v)三氟乙酸（TFA)/10% (v/v) 乙睛）及 B 液（ 0.094% (v/v) TFA/50% (v/v)乙腈）並以 梯度B40%->80%/20分鐘來進行，並將藉由測量在214 nm 處之吸收所測出的hPTH (1-34)峰域，與具有一已知濃度 之標準hPTH (1-34)峰域予以比較。 其他基本基因操作若未指明偽依據分子選殖（Man iat is , et al, Cold Spring Harbor Laboratory,New York (1982) )一書所述。 實例1 hProPTH (1-84)基因之製備 如第1圖所示，hProPTH (1-84)基因被合成為lil至U7 (序列辨識碼：1至7)與L1至L7 (序列辨識碼：8至14 ) 14個分 開的片段。 此等片段如下述被接合以製備hProPTH (1-84)基因 (第2圖）。 首先，約1/i g去氧核醣核酸片段U1(序列辨識碼1)與 約ly g去氣核_核酸片段L7(序列辨識碼：14)在含有16單 位T4聚核苷酸激Μ與0,5nM (IMBq或以上）[7-32P]dATP之 磷酸溶液中以37°C作用15分鐘，隨後再加入5 v 1含5mM 、 ATP之磷酸化溶液於37 °C繼續作用45分鐘。相同方法重複 用於ϋ2(序列辨識碼：2)及L6(序列辨識碼：13)、U3(序列辨 識碼：3)及L5(序列辨識碼：12)、U4(序列辨識碼：4)及U (序列辨識碼：11)、U5 (序列辨識碼：5 )及L3 (序列辨識碼： 10)、U6(序列辨識碼：6)及L2(序列辨識碼：9)以及U7(序列 辨識碼：7 )及L 1 (序列辨識碼：8 )之組合。 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 _______ B7 五、發明説明（20) 將以上該7組反應反應溶液結合，所得之混合物以乙 醇沉澱回收去氧核_核酸，然後溶於80 y 1 100mMT「is/ HC1 (ρΗ7·6)、6·5πιΜ MgCI2、300mM NaCl。分裝其中 40/i 1置於95¾作用5分鐘，繼而以30分鐘將該溫度降至 43°C ’用冰將其冷卻。加入40 /i 1接合反應B液（Takara Shuzo Co. Ltd.製造），令該混合物置於26°C 15分鐘。 此試樣以5¾聚丙烯醯胺膠體上進行電泳。電泳後，藉 自動放射攝影術撿測接合之去氧核醣核酸。一對應於約 280bp之去氧核醣核酸片段自膠體中被萃取出來，然後藉 傳統方法純化之。 實例2 A Ga卜139S(FM)PPH84之表現質體pGPtfl9的製備 含有一合成hProPTH (1-84)之該約280bp去氧核醣核 酸片段其5’-端具有一限制酶EcoRI址，3’-端具有一 Sail 址。藉由將該EcoRI/Sal I去氧核_核酸片段嵌入 pG210ShCT[G]之 Ec〇RI/Sal I址進行 hProPTH (1-84)之選殖 〇 pG210ShCT[G]以限制酶EcoRI與Sail消化後，一含有 載體部份，長約3 . 5kb去氧核醣核酸片段被製備。此片段 與實例1製備之約280bp去氧核醣核酸片段hProPTH (1-84) 接合而成為 pG210ShProPTH(第 3圖）。pG210ShProPTH 轉形 大腸捍菌JM109菌株内而成為JM109 [pG210ShProPTH]菌株 Ο ' 其次，將引子KM091C序列辨識碼：15)與KM092 (序列 辨識碼：16)嵌入pG210ShProPTH之限制酶Xho I/EcoR I址， -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7__ 五、發明説明（21) 以製備質體PG210S (S/X)(第3圖）。該上述引子兩端分別 具有限制酶Xhol與EcoRI址，其内並具有SacI址。 將PG210S (S/X)以限制酶SacI與Xhol消化，一編碼 /3 Ga卜210S之去氧核_核酸區域傺使用一用於巨大序列之 移除套件（T a k a r a S h u ζ 〇 C 〇 .，L t d .製造）做專一性刪除^ 末端用KlenowH段修整後藉自我接合（self-ligation)製 備一編碼一含/3 Gal - 139S及經Phe-Met與其鍵結之 hProPTH的嵌合型蛋白質之質體pGPiil9 (第4圖）。將pGPtfl9 引進其内之大腸捍菌JM109_株命名為JM109 [pGPtfl9]。 實例 3 /3 GaW17SiiiHPPH34表現質體 pG117SmHPPH34之製備 本實例中，/SGa 卜 117SmHPPH34 表現質體 pG117SmHPPH34 之製備將藉實例敘述。/3 Ga卜97SjhHPPH34表現質體 ， pG97SmHPPH34或 /3 Gai-139SmHPPH34表現質體 pG139SmHPPH 34可用 /? Gal-97S或 /3 Gal-139S而非 /3 Ga 卜139S製備。 1) pGPtfl9PPH34 之製備 pGPtfl9PPH34製備如後。一 35 Val之密碼GTT被轉變為 轉譯停止密碼TAA之hPTH (1-84)去氧核醣核酸片段用 PGPM9為模本，S01 (序列辨識碼：17)及S02(序列辨識碼： 18)為引子，藉PCR進行擴增。一限制酶Aat-Sall去氧核_ 核酸片段藉傳統方法分離及純化，而後藉一與pGPtfl9對應 部份之交換以製備pGPttl9PPH34 (第5圖:）。 2) PG117SPPH34 之製備 以PG210為模本，S03(序列辨識碼：19)與S05(序列辨 識碼：20)為引子，藉PCR進行增幅；隨後藉限制酶Pvu I及 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（2丨0><297公釐Ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（22 ) Sma I消化製備一去氧核_核酸片段。其次，以 pGPtfl9PPH34為模本，S07(序列辨識碼：21)與S02為引子， 藉PCR進行擴增。隨後藉限制酶Sail及Smal消化製備另一 去氧核_核酸片段。前述二段去氧核醣核酸片段及一含一 供 PGPtfl9PPH34作為複製原點（rePI ication origin)之限 制酶Pvu I-Sa 1 I去氧核醣核酸片段用T4接合酶接合在一起 ，以製備pG117SPPH34(第6及7圔）。 3) pG117SmHPPH34 (m 為 4至 8)之製備 pG117SmHPPH34 (m為4至8)傺藉將聯結子S08 (序列辨 識碼：22)、編碼（。3)4忏^刊1〃之聯結子309(序列辨識碼 :23)、聯結子S10(序列辨識碼：24)及編碼{(Hish-Pro-Gly) n.之聯結子S11 (序列辨識碼：25)嵌入PG117SPPH34之限 制酶Smal址而製備。於該連結時，應留意一質體（m為12、 16或24)可藉更改聯結子之長度而製備。 其次，PG117S4KPPH34#藉將聯結子S12(序列辨識碼： 26)、編碼（1^3)4-?广〇-017之聯結子313(序列辨識碼：27) 嵌入pG117SPPH_34之限制酶Smal址而製備。同樣地’ pG97S4kPPH34與 pG139S4kPPH34亦可製備。 插入聯結子之數目與方向偽於質體製備後’藉決定去 氧核醣核酸序列來確定，而此實例中製備之嵌合型蛋白質 列示於表1。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
25 本纸張尺度適用中國國家榡準（CMS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 A7 B7 五、發明説明（23 表1 β Gal-97SmHPPH34 β Gal-SmHPPH34 β Gal~139SmHPPH34 - 〇 〇 〇 4H 〇 Ο 8H 〇 〇 〇 2H 〇 〇 〇 6H 〇 4H 〇 4K 〇 〇 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 在該表之内，Η代表一組胺酸殘基，K代表一離胺酸殘 基，附加於Η或Κ的數字代表胺基酸之數目。 實例4 嵌合型蛋白質hPTH( 1-34)之生成 列於表1之該嵌合型蛋白質生成率以SDS-PAGE試驗之。 表1中含有一編碼一嵌合型蛋白質之基因的16個質體分別 被引進大腸桿菌JM109菌株。轉形細胞被培養於一含有2m 1 SB培養基之試管内於37 °C搖動16小時，隨後藉生理食鹽水 將培養濁度（ODwq)稀釋至1〇。在100^ 1懸浮液中加入等 量之SDS試樣緩衝液，將該混合物煮沸3分鐘。該上清液取 l〇ul接受SDS-PAGE以比較每一細菌生成嵌合型蛋白質之量 該結果顯示於第8圖。由第8圖明顯可知，表現嵌合型 蛋白質之量依該/3 -半乳糖苷酶衍生物/組胺酸殘基數目組 合而改變。專一地，對於Ga卜97S，就（（His) 4-Pro-GlyU其中 ^ 為 2與 3而言 ，可獲至高生成率； 對於 /?Gal - 26 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明（24 ) 117S，就{(Hish^Pro-Gly}»!其中 π為1、2、3、4與 6而 5 ，可獲至高生成率；對於G a 1 -13 9 S，就（（H i s) 4 - P r ο-α 1 y } n 其中 η 為 2 與 3 而言 ，可 獲至高 生成率 ° 特 別地是 ，對 於/3Ga卜117S之衍生物，引進（（His)4 - Pro-GlyU其中η為 1至6，導致表現之嵌合型蛋白質量明顯增加’且於此例中 ，表現之嵌合型蛋白質量大於僅藉離胺酸改變電荷者° 實例5 由嵌合型蛋白質切下hPTH( 1-34) 對該高生成嵌合型蛋白質/3 Gal-97SmHPPH34 (m為12) 、/? Ga 卜 117SinHPPH34 (in為 0、4、8、12、16及 24)與 /3〇81-1393111[^?^134(111為0及12，以111為0時作對照組），為 研究作為Kex2-600之受質的適切性，該嵌合型蛋白質包含 體被回收，溶解於8M尿素，並稀釋而成為一反應組合 (20mM Tris/HCl (ρΗ8·2)、ΙΟΟιηΜ NaCl，3.0M尿素、2·0Μ CaCl2，8mg/nil嵌合型蛋白質:）。隨後加入Kex2-660至其最 終濃度達20kU/ml，以切割hPTH (1-34)。在此等條件作 用1小時，90%或更多作為對照組之/?Gal-117SPPH34被切 下0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第9圖中，每一衍生物與Kex2-660之反應性以相對於 PG117SPPH34的kcat之比率表示。 hPTH (1-34)之定量偽根據前述基本實驗程序的方法實行。 結果發現在所有例子裡，引進（（HiS)4-Pr〇-Gly}n更進一 步改善與Kex2-660之反應性，其中η為1至6。 特別對於yS Ga卜117S4HPPH34，插入一聯結子（(^3)4-Pro-G 1 y導致該嵌合型蛋白質生成及與Kex2-660反應性的 27 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 五 經濟'那中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7__ 發明説明（25) 改善，此外，更提供在Kex2反應條件下不低於15g/L之溶 解度，亦即在溶解度上較Gal-139SPPH34(8g/L)之溶解 度改善。 實例6 hPTH (1-34)之大量生成 為了已發現其能以高生成率被表現且適合作為 660之受質的該嵌合型蛋白質召〇3丨_11754卟？[134之大量生 成，以含有一編碼此嵌合型蛋白質的質體PG117S4HPPH34 轉形大腸桿菌M25菌株（W3110/ompT)來製備 M25[pG117S4HPPH34]菌株。該 M25[pG117S4HPPH34]菌株用 一20L培養桶盛裝培養基（2% (w/v)酵母萃取物、1¾蛋白腺 、1·2% K2HP〇4、0.3¾ U/v) KH2P〇4 及 0.5¾ (w/v)甘油） 於37 °C培養。 當細胞濃度達ODsfla為1.0時，加入IPTG至最終濃度 ImM，而後繼續培養至該細胞濃度達〇D〃d為12。該細胞被 收集，懸浮於 TE (lOmM Tris/HCllmM EDTA (ρΗ8·0))。該 懸浮液接受高壓均質（Man ton-Gauli η)以分解該細胞。將 該均質物離心以取得含嵌合型蛋白質之沉澱物，接著以ΤΕ 及去離子水洗滌之。由2 0 L培養可取得約10 0 g含嵌合型蛋 白質之包含體。將 100ml IMTris/HCl (ρΗ8·2)、50ιη1 5M NaCl、50〇11»1去離子水及90(^尿素加入25〇1111該懸浮液中， 置該混合物於一 30°C恆溫室内攪拌30分鐘以溶解該成份， 再於30 °C以溫的去離子水稀釋至5L。 攪拌時緩緩加入50ml 250mM CaCl2溶液，並加入 Kex2-660至20kU/ml。加入Kex2-660二小時後（切割百分率 28 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 —^__ 五、發明説明（26) :不低於9 0 % )’藉添加醋酸調整酸齡值至6.4，隨後藉去 離子水二倍稀釋以凝結及沉降未反應之該嵌合型蛋白質與 該保護性胜狀離心以獲得一含h P T Η (1 - 3 4)之上清液ϋ該 上清液藉添加醋酸調整酸鹼值至5.0，通過一以1 ΟπιΜ醋酸 鈉緩衝液（PH5.0)平衡之陽離子交換樹脂（SP ToyoPearl) 管柱以吸附hPTH (1-34)，然後以〇,4M NaCl洗脱 hPTH (卜34)。 .加入醋酸至3¾之最終濃度，該混合物被通過以3¾ (v/v)醋酸平衡之一低壓反相管柱（SokenODS-W)以吸附 hPTH(l-34)，繼而以含3% (v/v)醋酸之30% (v/v)乙腈溶 液洗脱hPTH (1-34)。乙腈於低壓被去除，該殘餘物經一 0.22um膜濾器過濾並以一反相HPLC製備管柱 (TSKgel0DS120T<D 55x600)純化之。此例中，洗脱偽在流 速40ml/min，以一具線性密度梯度：A: 5¾ (v/v)醋酸/ 10¾ (v/v)乙腈；B: 5%(v/v)醋酸/40¾ (v/v)乙腈；= 20%—80%/60min)之乙腈來完成。每一步驟該hPTH (1-34) 之回收表列於表2。 表2 步驟 PTH之量（g) 回收（¾) 與Kex2-660反應 7.0 100 獲得自酸沉澱之上清液 6,7 95 陽離子交換管柱 6.0 85 低壓逆相管柱 5.8 82 HPLC 4.0 57 -29 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __B7_ 五、發明k明（27) 實例7 位於嵌合型蛋白質之Kex2-660識別址P3胺基酸之 取代 為將位於P3址之胺基酸（Lys)轉變成不同胺基酸，含 一對應於被轉變之P3址之密碼子的寡核苷酸S14至S 18 (序 列辨識碼：28至32)被合成，而一去氧核_核酸片段利用 此等寡核苷酸及S02(序列辨識碼：1δ)為引子， PG117S4HPPH34為模本，藉PCR合成。如此獲得之去氧核醣 核酸片段藉乙醇沉澱純化，以StuI與Sail切割，並在2.0% U/v)瓊脂膠體上電泳以純化一標的0.4Kbp Stu I-Sa 1 I片 段。 此去氧核_核酸片段與一藉StuI及Sail消化，編碼一 PG117S4HPPH34之/3半乳糖苷酶部份的去氧核醣核酸片段 接合，並依前述與該標的Stul-Sa II去氧核醣核酸片段相 同方式進行純化。接合反應完畢後，接合混合物被用於轉 . 形大腸桿菌JM109_株。對每一組合，獲得10個抗四璟素 選殖株，來自該等株之質體藉去氧核醣核酸定序分析以獲 得所欲之表現載體。 換言之，為了一具有一胺基酸序列之嵌合型蛋白質 /3 Gal-117S4HVXPH34，一表現載體 口011734[1〇?}{34被製備 。該序列内含一編碼PG117S4HPPH34之嵌合型蛋白質的 Kex2-660識別址 Ser-Val-Lys-Lys-Arg已被 Ser~VaI - X-Lys-Arg所取代，其中 X為 Giy、Ala、Val、Leu、lie、Ser 、T h r、A s p .、G 1 u、A s n、G i n、L y s、A r g、P h e、T y r、T r p 、H i s Λ P r o 0 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟、那中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 1、發明説明（28) 為研究每一嵌合型蛋白質與Kex2-660之反應性，每一 株均被培養於50ml SB培養基内。當該細胞濃度到逹〇Ds 0〇 為1.0時，藉IPTG誘發表現，再繼續培養4小時。其後，收 集細胞，經TE緩衝液洗滌、懸浮、分解及離心以製備包含 體。包含體用含ΙΟιηΜ EDTA之1¾ Triton X100及TE洗滌以 製備純化之包含體。包含體内90%或更多之胜肽成份為一 標的嵌合型蛋白質。將20/i 1 1M Tris/HCl (PH8.2)、 20ι15Μ NaCl及300 α 1 10Μ尿素加入每一嵌合型蛋白質包 含體之懸浮物中並溶解之，隨後該混合物以650u 1去離子 水稀釋並置於一 30 °C之恆溫室内10分鐘，加入10/i 1之 250inM CaCl2，復加入 Kex2-660 至濃度為 20kU/ml。 在此等條件下歴時1小時，90%或更多作為對照組之 /?Gal-117SPPH34被切割。生成之hPTH (1-34)用前述之 0DS管柱藉HPLC定量。每一衍生物與Kex2-660之反應性以 相對於PG117S4HPPH34的kcat之比率表示（第10圖）。當X為 • Phe或His時，hPTH (1-34)藉Kex2-660切割之效率被改善 ，然而當X為Pro時，大體上沒有hPTH(l-34.)被Kex2-660所 切割。 實例8 位於嵌合型蛋白質之Kex2-660識別址P4胺基酸之 取代 基於實例7之結果與該切割時間内副産物量少的事實.， 一 P3址具有一組胺酸殘基之嵌合型蛋白質/?(^1-117S4HVHPH34被挑選出來作為生成hPTH (1-34 )之嵌合型 蛋白質，並嘗試置換位於P4址之該胺基_以改善與Kex2- -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明說明（29) 660之反應性。寡核苷酸S19至S24(SEQ ID N0S:33至38) 被合成，一含有被引進的突變之去氧核醣核酸片段利用前 述寡核苷酸及S02為引子，PG117S4HVHPPH34為模本，藉 PCR被合成。 實例7之方法為了一含有該Kex2_660識別址Ser-Va卜 His-Lys-Arg已被Ser-X-His-Lys-Arg取代之結構的嵌合型 蛋白質〇31-11754以[^1]34而重複以製備表現載體 PG11.7S4HXHPH34 〇 其中 X為 Gly、Ala、Leu、lie、Ser、Thr、Asp、Glu、i\sn、Gin、Lys、Arg、Cys、Met、Phe、 Tyr、 Trp、 His、 Pro或Val0 對Kex2-660之敏感性像用該嵌合型蛋白質為受質，在 與實例6相同的條件下判定。結果發現，當X為Lys或Arg ’ 可改善ffKex2-660對hPTH(l-34)之切割，然而當X為一酸 性胺基酸（Asp或Gin)，大體上並無hPTH(l-34)被Kex2-660 切下（第11圖）。因此，此為首次掲示Kex2-660蛋白酶在該 P1址需要一精胺酸殘基，該P2址需要一強鹼性胺基酸或一 腩胺酸殘基，同時，P3址以一組胺酸殘基或一苯丙胺酸殘 基而P4址以一強鹼性胺基酸為佳，然P3址出現一脯胺酸或 P4址出現一酸性胺基酸會導致嶔合型蛋白質切割活性明顯 下降。 實例9 保護性胜肽的!Ux2-660切割址之移除 在實例7與8中該Kex2-660切割活性在藉HPLC撿測時間 内為微量。結果發現，一結合於該保護性胜肽Θ Ga卜117S 之13、14位置的序列Arg-A「g之C -端的胜肽被切割。因此 -32 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λϋ_— n —Λν 、tr 4·γ>ϋ ϋϋ ·ϋ^ 1 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明k明（3。） 預想在藉酸沉澱hPTH (1-34)之純化時間内所産生的 /3 Gal (1-14)被包含在内。據此，嘗試用Lys取代14 Arg 以抑制Kex2-660切割，藉以抑制々Gal (1-14)之生成。 一編碼一 14 Arg被Lys取代的嵌合型蛋白質（/3 Gal -117KS4HRHPH34)之質體pGKSPH34(第12圖）偽如下述製備 。首先，一被引進突變之去氧核醣核酸片段Ase卜RK利用 一寡核苷酸S25 (序列辨識碼：39)及S26 (序列辨識碼：40 )為引子，以PG117S4HRHPH34為模本，藉PCR被合成。一去 氧核醣核酸片段RK-Bg 1 11利用一寡核苷酸S27 (序列辨識碼 :41)及S28 (序列辨識碼：42)為引子，以相似方法製備。 每一去氧核醣核酸片段均被純化並各量取約1 n g純化 之去氯核醣核酸片段，將該量取之片段共同混合，進行四 次不含引子的PCR以合成一被引進突變之Asel-Bglll片段。 ’ 加入寡核苷酸S25與S28，繼續進行PCR以合成該片段。藉 乙醇沉澱純化該片段，以Asel與Bglll切割，在2.(UU/v) ‘ 瓊脂膠體上電泳以製備一標的〇.35kbp片段。一Asel/SphI (1 · 8kbp)片段與 PG117S4HRHPH34 之一 Sph/Bglll (1.4kbP) Η段在1.0 U/v)瓊脂膠體上電泳以純化此等片段。 前述三片段被接合在一起，該接合混合物被用以轉形 大腸捍菌JM109菌株。取得抗四環素株，藉鹼溶解法製備 質體並以去氧核_核酸定序分析之。一含有一編碼保護性 胜肽14 Arg之去氧核_核酸序列CGG已被AAG取代的基因之 質體PGKSPH34之標的株被選取。嵌合型蛋白質之包含體以 與實例5相同方法獲得。其與Kex2-660進行反應。結果發 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7_ 五、發明k明（31) 現，該前述取代大體上完全抑制了保護性胜肽之切割，減 輕了加在純化過程的負擔。 實例10 嵌合型蛋白質/5〇31-117!^4[^[^[134之大量生成 及hPTH (1-34)之生成 在該實例中，進行在被認為於試管平階段最適宜作為 Kex2-660受質之大量培養條件下嵌合型蛋白質Gal -117KS4HRHPH34 之生成、藉 Kex2-660 切割，以及 hPTH (1 -3 4)之純化。 PGKSPH34被用於將大腸桿菌M25菌株轉形為具四璟素 抵抗性以獲取抗四環素株，繼而製備一生成菌株 M25[pGKSPH34]。該 M25[pGKSPH34]_ 株被大量培養於一含 有2¾ U/v)M萄糖的NU1合成培養基。 葡萄糖之消耗後，甘油被作為磺來源供給之。培養在 酸鹼值調節至7.0下進行24小時，該最終細胞濃度為150至 200 0D。在大量培養條件下此嵌合型蛋白質穩定的生成， / 不論其高水準表現，並未見該寄主大腸桿菌之生長之明顯 抑制。包含體生成之量約5g/L。細胞粉碎後，不溶物以TE 與去離子水洗去以製備一純化之包含體。 該包含體以尿素溶解並稀釋以提供一 20mM Tr i s/HC 1 (pH8.2)、50mM NaCl、2·5πιΜ CaCl2、2·7Μ 尿素與 8.0mg/ m 1嵌合型蛋白質之反應溶液成份。在30 °C之反應溫度下v 加入Kex2-660至5k(J/nil之濃度以自該嵌合型蛋白質切割hP ΤΗ (1-34)，該hPTH (1-34)之生成被定量。結果該反應開 始30分鐘後，切割百分率達90¾以上，相較於/3 Gal-117S4 -34 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 一 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明（32) HPH34其Kex2-660之量被降低至1/4。 反應結束後，hPTH (1-34)被以與實例5相同的方式純化之。純化程序内之回 收大體與實例5相同。 實例11 /3 GaI-117S4HGP生成質體PG117S4HGP之製備 一生成一含有一人類類升_激素（glucagon)胜肽I (hGLP-1 (7-37))的嵌合型蛋白質（/3 Ga卜117S4HGP)之質 體PG117S4HGP被依後述程序構建。首先，第14(a)圖所示 之四段去氧核醣核酸（GLP-1 (序列辨識碼：43)、GLP-2 (序列辨識碼：44)、GLP-3 (序列辨識碼：45)與GLP-4 (序 列辨識碼：46))被合成。此等去氧核醣核酸於5 f -端被T4 聚核苷酸激酶磷酸化，互相混合並黏結以製備一 hGLP-1(7-37)基因（DNA(l))。另一方面，第14(b)圖所示之二 段合成去氧核醣核酸（117S4H SphI引子（序列辨識碼：47) 與117S4H Bglll引子（序列辨識碼：48))被作為PCR之引子 而進行PCR傺以PGKSPH34為模版。産生的PCR産物以Bglll 與& hi以製備一具有Bglll與SphI黏著端（sticky ends)之 去氧核_核酸片段（DNA (11))。 然後，PGKSPH34以Bgll與SphI消化，在1%瓊脂膠體上 電泳以回收一較大的去氯核醣核酸片段（DMA (111))。如此 獲得的DHA(I)、DNA(II)與DNA(III)藉T4去氧核_核酸接 合酶以製備PG117S4HGP(第15圖）。 實例12 嵌合型蛋白質/3 Ga卜117S4HGP之生成 含有前述製備的PG117S4HGP之大腸捍菌W3110M25菌株 在32 °C及酸鹼值7.0之條件下被培養於一含1 · 0¾¾萄糖、 - 35 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明叙明（33 ) 4g/L K2HP〇4 、 4g/L 〇2P〇4 、 2.7g/L Na2HP〇4 、 0.2g/L NHiCl、1.2g/l (NH4)2S04、4g/l 酵母萃取物、2g/l L-甲硫胺酸、2g/l MgS〇4 * 7H2〇 - 40mg/l CaCls * 2H2〇 ^ 40mg/l FeSCU · 7H2〇、lOmg MnSO 4 · nH 2 0 ^ lOmg/1 AICI3 · H2O、 4mg/l C0CI2 · 6H2〇、 2mg/l ZnSCU · 7H2〇、 2mg/l NS12M0CU · 2H2O、lmg/1 CuCl2 · 2H2〇、0.5mg/l H 3 BO 4及lOmg/Ι四環素之培養基。®萄糖祜竭後，甘油被 用作碳來源，在37°C繼續培養8小時以在細菌内生成 /3 Ga卜117S4HGP之包含體。培養結束後，該培養物藉 Manton-Gaulline均質機（model 15M-8TA，Manton-Gaulline製造）在600 KG/cm2被均質化並離心以回收一沉 澱分離部份。該沉澱物以與該培養物等量之一緩衝液 (lOroM Tris-HCl(pH δ·0)，ImM EDTA)懸浮，再次藉離心 回收並以與該培養物等量之去離子水懸浮。其後，再次離 心以回收該沉澱物，隨後以與該沉澱物等量之去離子水懸 浮以用接下來之方法。 實例13 由嵌合型蛋白質上切下hGLP-1 (7-37) 實例12中製備的該嵌合型蛋白質包含體被回收，溶解 於8M尿素，並稀釋以提供一反應成份（20inM Tris/HCl (ρΗ8·2)、100mM NaH、3·0Μ尿素、2·0ιβΜ CaClrS8mg/ml 嵌合型蛋白質）。接著加入Kex2-660至一最終濃度 10,000 U/ml以切割hGLP-1 (7-37)。在此等條件下歷時一 小時，作為對照組之冷Ga卜117S4HGP有90%以上被切割。 實例14 hGLP-1 (7-37)之分離（第16圖，表3.) 36 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明說明（34) 為大量生成該已發現具高生成率且適宜作為((ex2-660 受質之嵌合型蛋白質/3 Ga卜117S4HGP，將編碼此嵌合型蛋 白質之質體轉形大腸桿菌M25菌株（W3110/omPT)，接著被 培養於一 20L培養桶内。該培養基含有20g/L酵母萃取物、 10g/L 細菌蛋白腺、12g/L K2HP〇4、3g/L 〇2P〇4 及 5g/L 甘 油。當該細胞濃度達0D660為1.0時，加入IPTG (異丙基 /3 -硫化半乳糖苷）至最終濃度lmM。一抗發泡劑 (DISFOAM CC-222 Nippon Oil & FatsCo·, Ltd.製造）被 使用。該培養於37°C繼續進行至該細胞濃度達0Dsflfl為12 。該細胞被收集並懸浮於TE (lOmMIVis/HCl，ImM EDTA (Ρ Η 8.0))中該懸浮物接受一高壓均質（M a n t ο η - G a u 1 i η)以 粉碎細胞。均質物經離心以獲得含嵌合型蛋白質之沉澱物 ，其隨後以TE與去離子水洗滌。由20L培養可獲得約100g 含嵌合型蛋白質之包含體。250ml該包含體（160g/L)之懸 浮物被加入 100ml 1M Tris/HCl (ρΗ8·2)、50ml 5M NaCl、 '500ml去離子水與900g尿素，將該混合物置於一保持30 °C 之恆溫室内攪拌30分鐘以使該成份溶解，其後於30 °C以溫 的去離子水稀釋至5L。攪拌時緩緩加入50ml 250mM CaCl2 溶液，再加入1^乂2-6(50至20,000 11/1111(約4.0111§几）。加 入Kex2-660二小時後（切割百分率：不低於90¾)，藉醋酸 之添加將酸鹼值調整至6 · 4，隨後藉去離子水進行二倍稀 釋以凝結及沉澱未反應之嵌合型蛋白質及保護性胜呔°離 心以獲得一含hGLP-1 (7-37)之上清液。該上清液藉醋酸 之添加將酸鹼值調整至5.0並通過一用2M尿素/lOmM醋酸鈉 -37 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210Χ 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明（35 ) 缓衝液（ρΗ5·0)平衡之陽離子交換樹脂（SP Toyopearl)管 柱以吸附hGLP-1 (7-37)，繼而以一2M尿素/ΙΟπιΜ醋酸鈉 缓衝液（pH6 · 2)洗滌及以由〇 Μ至300mM之氯化鈉密度梯度 進行hGLP-1 (7-37)之洗脫。預先將醋酸盛於分離試管 (fraction tube)内提供一 3%之最終濃度以避免hGLP-1 (7-37)之凝結。一含有hGLP-1 (7-37)之分離部份被收集 並通過一用5%醋酸平衡之低壓反相管柱（Soken ODS-tf)吸 附hGLP-1 (7-37)，繼而以一含5¾醋酸之50¾乙睛溶液進行 hGLP-1(7-37)之洗脫。乙腈在低壓下被去除，該殘餘物經 一0.22-um膜濾器過濾並冷凍乾燥之。 hGLP-1 (7-37)之定量將被詳述。一含有hGLP-1 (7-37)之溶液接受一試樣緩衝液（1M醋酸鹽/2M尿素）10至 20倍稀釋，該稀釋溶液被離心以獲得一上清液。該上清液 隨後加到已銜接 YMC-C8-A302 (4.6mm I,D. X 150mm)管柱 (Κ· Κ· Yamamura Kagaku Kenkyujo製造.）之 HPLC (LC10A Shimadzii Seisakusho Ltd·製造），接著利用 A 液（0.1¾ TFA/10%乙腈）與B液（0.09 4% TFA/60%乙腈），而以梯度B 40%—80%/20分鐘通經該管柱。該hGLP_l (7-37)之量傺 以hGLP-1 (7-37)該尖峰面積與具已知濃度之標準hGLP-1 (7-37)的尖峰面積之比率決定之該等尖峰藉決定在220nm 之吸收度被檢測。該回收見於表3。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 袈_ 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（36) 表3 步驟 容積/ Π ] hGLP-1/ [g] 回收/U] 與Kex2_660反應 4.0 4.8 100 獲得自酸沉澱之上清液 7.8 3.3 68 陽離子交換管柱 0.5 2.8 60 低壓逆相管柱 2.8 40 序列明細表 序列辨識號碼第1號 序列長度：40 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
AATTCATGAA ATCTGTTAAA AAGCGTTCTG TTTCTGAAAT 序列辨識號碼第2號 序列長度：41 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列
TCAGCTGATG CATAACCTGG GCAAACACCT GAATAGCATG G 39 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明k明（37) 序列辨識號碼第3號 序列長度：41 序列類型：核酸 股數（strandedness) ··單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y) ··線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 AACGCGTCGA GTGGCTGCGT AAGAAACTGC AGGACGTCCA C 序列辨識號碼第4號 序列長度：41 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t q ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 AACTTCGTTG CGCTGGGTGC ACCGCTGGCT CCACGTGATG C 序列辨識號碼第5號 序列長度：39 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
AGGATCCCAA CGTCCGCGTA AGAAAGAAGA TAACGTACT ~ 40 - 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明k明（38) 序列辨識號碼第6號 序列長度：40 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列
GGTTGAATCT CATGAGAAAT CCCTGGGCGA AGCTGACAAA 序列辨識號碼第7號 序列長度：40 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 GCCGATGTTA ACGTGCTGAC CAAAGCGAAA AGCCAGTAAG 序列辨識號碼第8號 序列長度：33 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
TCGACTTACT GGCTTTTCGC TTTGGTCAGC ACG 41 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
A7 B7五、發明說明（39) 序列辨識號碼第9號 序列長度：40 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核Si核酸 序列 TTAACATCGG CTTTGTCAGC TTCGCCCAGG GATTTCTCAT 序列辨識號碼第10號 序列長度：40 序列類型：核酸 股數（s t r a n d e d n e s s):單股 形態（t q ρ ο 1 o g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 GAGATTCAAC CAGTACGTTA TCTTCTTTCT TACGCGGACG 序列辨識號碼第11號 序列長度：41 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 TTGGGATCCT GCATCACGTG GAGCCAGCGG TGCACCCAGC G (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装- 訂 42 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明（40 ) 序列辨識號碼第12號 序列長度：41 序列類型：核酸 股數（s t r a n d e d n e s s ):單股 形態（t ο p ο 1 o g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 CAACGAAGTT GTGGACGTCC TGCAGTTTCT TACGCAGCCA C 序列辨識號碼第13號 序列長度：41 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο.ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氣核_核酸 序列
TCGACGCGTT CCATGCTATT CAGGTGTTTG CCCAGGTTAT G 序列辨識號碼第14號 序列長度：46 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y:):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列
CATCAGCTGA ATTTCAGAAA CAGAACGCTT TTTAA CAGAT TTCATG 43 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210 X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明（41 ) 序列辨識號碼第15號 序列長度：24 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 TCGAGGTCGA CGGTACCGAG CTCG 序列辨識號碼第16號 序列長度：24 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 AATTCGAGCT CGGTACCGTC GACC 序列辨識號碼第17號 序列長度：45 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
AAACTGCAGG ACGTCCACAA CTTCTAAGCG CTGGGTGCAC CGCGT -44 — 本纸張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明（42) 序列辨識號碼第1δ號 序列長度：24 序列類型：核酸 股數（s t r a n d e d n e s s ):單股 形態（t ο p ο 1 o g y ) ··線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 CATTAAAGCT TTGCGATGAT AAGC 序列辨識號碼第19號 序列長度：26 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 'CGCACCGATC GCCCTTCCCA ACAGTT 序列辨識號碼第20號 序列長度：35 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
TTTCCCGGGC CTCCGTGGGA ACAAACGGCG GATTG -45 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝_
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明铣明（43 ) 序列辨識號碼第21號 序列長度：42 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 TTTC.CCGGGA GGCCTTCTGT TAAAAAGCGG TCTGTTTCTG AA 序列辨識號碼第22號 序列長度：18 ' 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t q ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 CACCATCATC ACCCTGGA 序列辨識號碼第23號 序列長度：18 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
TCCAGGGTGA TGATGGTG -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明（44 ) 序列辨識號碼第24號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 CACCACCATC ATCCTGGACA CCATCATCAC CCTGGA 序列辨識號碼第25號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο I 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 TCCAGGGTGA TGATGGTGTC CAGGATGATG GTGGTG 序列辨識號碼第26號 序列長度：18 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y) ··線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
AAGAAGAAGA AGCCTGGA 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明（45 ) 序列辨識號碼第27號 序列長度：18 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 TCCG.GACTTC TTCTTCTT 序列辨識號碼第28號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTNCAAA GCTTTCTGTT TCTGAA 序列辨識號碼第29號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（s t r a n d e d n e s s ) ··單股 形態（t ο ρ ο I o g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTNATAA GCTTTCTGTT TCTGAA -48 一 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 s一 __ 五、發明説明（46 ) 序列辨識號碼第30號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y) ··線性 分子類型：合成去氯核_核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTNTTAA GCTTTCTGTT TCTGAA 序列辨識號碼第31號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 GGGAGGCCTT CTGTTBGGAA GCTTTCTGTT TCTGAA 序列辨識號碼第32號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTSAAAA GCTTTCTGTT TCTGAA (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
49 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS )八4規格（210X 297公慶） 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
A7 B7五、發明説明（47 ) 序列辨識號碼第33號 序列長度：33 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 GGGAGGCCTT CTADTCATAA GCTTTCTGTT TCT 序列辨識號碼第34號 序列長度：33 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 GGGAGGCCTT CTAHGCATAA GCTTTCTGTT TCT 序列辨識號碼第35號 序列長度：33 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氯核醣核酸 序列 GGGAGGCCTT CTGHGCATAA GCTTTCTGTT TCT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝_ 訂 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明k明（48 ) 序列辨識號碼第36號 序列長度：33 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο i 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 GGGAGGCCTT CTTKKCATAA GCTTTCTGTT TCT 序列辨識號碼第37號 序列長度：34 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氣核_核酸 序列
GGGAGGCCTT CTCVACATAA GCTTTCTGTT TCTG 序列辨識號碼第38號 序列長度：34 序列類型：核酸 股數（s t r a n d e d n e s s) ··單股 形態（t ο ρ ο 1 o g y) ··線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列
GGGAGGCCTT CTBATCATAA GCTTTCTGTT TCTG -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明（49 ) 序列辨識號碼第39號 序列長度：27 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 AATTAATGTG AGTTAGCTCA CCATTAG 序列辨識號碼第40號 序列長度：24 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 ATCCCAGTCT TTAGCTTGTA AAAC 序列辨識號碼第41號 序列長度：24 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 GTTTTACAAC GTAAAGACTG GGAT -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） m ^m-i —an.— 1_>1 ai·—^ 11__1 Hal - a— - emir lmaMaa§ --裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
-Λ— I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明說明（50 ) 序列辨識號碼第42號 序列長度：31 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο I 〇 g y):線性 分子類型：合成去氣核醣核酸 序列 TTTAGATCTG ACTCCAGCAA GCTGTCCGGC A 序列辨識號碼第43號 序列長度：57 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型：合成去氧核_核酸 序列 CGGAAGGTAC CTTTACCAGC GATGTGAGCT CGTATCTGGA AGGTCAGGCG GCAAAG 序列辨識號碼第44號 序列長度：48 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 -53 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明（51 )
ACCTTCCAGA TACGAGCTCA CATCGCTGGT AAAGGTACCT TCCTGCATG 序列辨識號碼第45號 序列長度：36 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 AATTCATCGC GTGGCTGGTG AAAGGCCGTG GTTAAG 序列辨識號碼第46號 序列長度：53 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型：合成去氧核醏核酸 序列
TCGACTTAAC CACGGCCTTT CACCAGCCAC
GCGATGAATT CTTTTGCCGC CTG 序列辨識號碼第47號 序列長度：38 序列類型：核酸 股數（s t r a n d e d n e s s ):單股 形態（t ο ρ ο 1 o g y ):線性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
54 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格（210X 297公釐） 480270 A7 B7 五、發明説明（52 ) 分子類型：合成去氧核醣核酸 序列 TGAATTTCAG AAGCATGCCG CTTATGTCGA GAAGGCCT 序列辨識號碼第48號 序列長度：24 序列類型：核酸 股數（strandedness):單股 形態（topo 1 ogy):線性 分子類型：合成去氧核醏核酸 序列
GACTCAGATC TTCCTGAGGC CGAT (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝-
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) Α4規格（210X 297公釐）

Claims (1)

  1. 89^ 480270 申請專利範圍 « A8修Us! 補
    Ί 本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第086102706號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期：89年7月 1· 一種具有下述通式之嵌合型蛋白質： A - L - B 其中A係為一種保護性胜肽；b係為一標的蛋白質；以 及L係為一聯結性胜肽，其具有Xi_x：r(Pr〇、Lys或 Arg)-Arg之序列位於其c-端區域與一富含His之領域 位於其N-端區域，其中乂〗可為除了 Asp與Glu以外的任 何胺基酸，而X2可為除了 Pro以外的任何胺基酸。 2·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質，其中該位於 端區域之富含His之領域具有序列：[(His)4_Pro-Gly]n其 中η可為1至6。 3.如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質，其中於該Ν•端 區域的胺基酸序列與該C-端序列的胺基酸序列之間存 在有任意1至5個胺基酸。 4·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質，其中於該C-端 區域内，Xi係為Arg、Lys或是His，且Χ2係為His或是 Phe 〇 5·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質，其中a係代表 一不含有下列胺基酸序列的多胜肽：Pro-Arg、Arg-Arg 以及 Lys-Arg 〇 6·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質，其中當A代表 一含有下述胺基酸序列的多胜肽時：Pro-Arg、Arg-Arg 或Lys-Arg，至少一位在該胺基酸序列中的胺基酸 已 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 0 本紙張尺度適用中國國家標準（CNS ) A4規格(210X297公釐） 480270 申請專利範圍 為一不同的胺基酸所取代，以使A不含有該胺基酸序 列。 7·如申睛專利範圍第1項之欲合型蛋白質，其中a代表一 不具有超過220個胺基酸殘基的多胜肽。 8·如申請專利範圍第7項之嵌合型蛋白質，其中a係代表 具有位在源自於大腸桿菌之β_半乳糖苷峰之端上 的胺基酸1-97、1-117或1-139之胜肽。 9·如申請專利範圍第丨項之嵌合型蛋白質，其中位在八中 的任何半胱胺酸殘基已為一不同的胺基酸所取代。 1〇·如申請專利範圍第9項之嵌合型蛋白質，其中該不同的 胺基酸係為一絲胺酸。 U•如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質，其中B代表一 人類Μ甲狀腺激素或是一具有人類副甲狀腺激素生物 活性的衍生物。 12·如申請專利範圍第η項之嵌合型蛋白質，其中該人類 田1J甲狀腺激素衍生物包含有一源自位在天然發生的人 類副甲狀腺素之Ν-端的第1或3至31、34、37、38或84 個的胺基酸殘基的片段，或一包含該等胺基酸殘基並 另於C -端被加有Gly的片段。 13.如申請專利範圍第丨項之嵌合型蛋白質，其中b係代表 類升血糖胜肽1或是具有類升血糖胜肽丨生物活性之衍 生物。 14· 一種用以生成如申請專利範圍第丨至^項中任一項之嵌 合型蛋白質的方法，其包含下列步驟：以一含有編碼 t ( CNS ) A4^' ( 210X297^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 48U270
    申請專利範圍 該嵌合型蛋白之DNA的表現載體來轉型一宿主細胞； 培養所形成之轉型株；以及由培養物中收獲該嵌合型 蛋白質。 15. —種用以生成一標的胜肽的方法，其中令一加工酵 素作用於如申請專利範圍第1至13項中任一項之嵌合型 蛋白質’俾切割介於聯結胜肽（L)之C-端與標的胜肽（B) 之N-端之間的胜肽鍵，以獲得該標的胜肽。 16·如申請專利範圍第15項之方法，其中該加工酵素係擇 自於下列群組中之一者：Kex2蛋白酶、芙琳（furin)、 别激素轉化酶1/3 (PC1/3)、前激素轉化酶2 (PC2)，以 及具有該等加工酵素之酵素活性的衍生物。 17·如申請專利範圍第15項的方法，其中該標的胜肽⑺）係 藉由等電位沉澱法來回收。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
TW086102706A 1996-03-04 1997-03-04 Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme TW480270B (en)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP7090696 1996-03-04

Publications (1)

Publication Number Publication Date
TW480270B true TW480270B (en) 2002-03-21

Family

ID=13445041

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW086102706A TW480270B (en) 1996-03-04 1997-03-04 Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5891671A (zh)
EP (1) EP0794255B1 (zh)
JP (1) JP3925982B2 (zh)
KR (1) KR100468268B1 (zh)
CN (1) CN1216901C (zh)
AT (1) ATE290088T1 (zh)
AU (1) AU734397B2 (zh)
CA (1) CA2198966C (zh)
DE (1) DE69732583T2 (zh)
DK (1) DK0794255T3 (zh)
TW (1) TW480270B (zh)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2284847A1 (en) * 1998-01-30 1999-08-05 Suntory Limited Process for producing peptides using a helper peptide
CN1170932C (zh) * 1998-07-10 2004-10-13 赛欧斯公司 生产等电点高于8或低于5的多肽的方法
PT1197496E (pt) 1999-07-23 2007-08-29 Kenji Kangawa Novos péptidos
EP1234038A1 (en) * 1999-11-19 2002-08-28 Transkaryotic Therapies, Inc. Nucleic acid construct for optimized production of products
US6730306B1 (en) * 2000-03-08 2004-05-04 Large Scale Biology Corporation Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions
CA2472235C (en) 2002-04-11 2012-05-22 Daiichi Suntory Pharma Co., Ltd. A method for producing a modified peptide
GB0308734D0 (en) * 2003-04-15 2003-05-21 Axcess Ltd Uptake of macromolecules
GB0308732D0 (en) * 2003-04-15 2003-05-21 Axcess Ltd Absorption enhancers
JP6817939B2 (ja) 2014-12-01 2021-01-20 フェネックス インク． ペプチド産生のための融合パートナー
CN110305223B (zh) * 2019-06-26 2022-05-13 重庆派金生物科技有限公司 重组串联融合蛋白制备目标多肽的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60217894A (ja) * 1984-04-14 1985-10-31 Suntory Ltd 新規プロテア−ゼ及びその製造方法
RU2091490C1 (ru) * 1985-10-25 1997-09-27 Зимодженетикс, Инк. Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов
DE3805150A1 (de) * 1987-04-11 1988-10-20 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden
DE3725320A1 (de) * 1987-07-30 1989-02-09 Biotechnolog Forschung Gmbh Expressionsvektoren und verfahren unter deren verwendung zur gewinnung von cro/ss-galaktosidase/pth-fusionsproteinen und von pth
JPH07108232B2 (ja) * 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
JPH05328492A (ja) * 1992-05-21 1993-12-10 Matsushita Electric Ind Co Ltd スピーカ用ダンパー
CA2198968C (en) * 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives

Also Published As

Publication number Publication date
AU1503697A (en) 1997-09-11
AU734397B2 (en) 2001-06-14
JPH09296000A (ja) 1997-11-18
EP0794255B1 (en) 2005-03-02
EP0794255A3 (en) 1999-01-27
DE69732583D1 (de) 2005-04-07
EP0794255A2 (en) 1997-09-10
DK0794255T3 (da) 2005-06-27
ATE290088T1 (de) 2005-03-15
CN1167155A (zh) 1997-12-10
KR100468268B1 (ko) 2005-06-27
CA2198966C (en) 2011-06-21
JP3925982B2 (ja) 2007-06-06
CA2198966A1 (en) 1997-09-04
DE69732583T2 (de) 2006-01-19
KR970065554A (ko) 1997-10-13
CN1216901C (zh) 2005-08-31
US5891671A (en) 1999-04-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4856177B2 (ja) アミド化生成物の調製に有用な酵素を発現させるための細胞株
JP3730255B2 (ja) イーストにおいて発現されたｎ末端に伸長した蛋白質
RU2441019C2 (ru) Способ синтеза рекомбинантного паратиреоидного гормона человека
JP4243104B2 (ja) 重要なタンパク質の細菌培養上清中への分泌のための融合タンパク質
CA2623547C (en) Method for amidating polypeptides with basic aminoacid c-terminals by means of specific endoproteases
TW480270B (en) Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme
JPH01199578A (ja) Ｋｅｘ２エンドプロテアーゼ及びその製造方法
JPH02500876A (ja) 組換えポリペプチドの製品およびその製造、単離および精製方法
WO1996020724A1 (en) Generation of human insulin
JP2001513638A (ja) 修飾されたカルボキシペプチダーゼ
US8426566B2 (en) Basic protein purification tags from thermophilic bacteria
AU728703B2 (en) A recombinant expression vector of human parathyroid hormone using phosphoribulokinase as a fusion partner
Polyak et al. Introduction of spacer peptides N-terminal to a cleavage recognition motif in recombinant fusion proteins can improve site-specific cleavage.
HU216335B (hu) Eljárás peptidek előállítására
WO2004015111A1 (en) Staphylococcal nuclease fusion proteins for the production of recombinant peptides
CN101172996A (zh) 用于多肽融合表达的连接肽及多肽融合表达方法
WO1986003779A1 (en) Polypeptide secretion-causing vector, microorganisms transformed by said vector, and process for preparing polypeptide using said microorganisms
KR101077783B1 (ko) 재조합 인간성장호르몬 단백질, 이의 발현 벡터, 및 이를 이용한 인간성장호르몬 단백질의 제조방법
NZ514657A (en) Production of pancreatic procarboxy-peptidase B, isoforms and muteins thereof, and their use
WO2013149729A2 (en) Proinsulin with enhanced helper sequence
JPH06253862A (ja) 新規発現ベクタ−、該発現ベクタ−を保有 する微生物、該微生物を用いる有用物質の 製造法
JPH05244954A (ja) ウサギコルチコスタチンをコードするｄｎａ配列
JPH0698790A (ja) 無細胞蛋白質合成系によるポリペプチド の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
GD4A Issue of patent certificate for granted invention patent
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees