TW480270B - Method for cleaving chimeric protein using processing enzyme - Google Patents

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Description

經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(1) 發明背景 本發明傜關於一種生成一可作為受質的具生理活性之 胜肽或其前驅物的嵌合型蛋白質,以及一種生成該具生理 活性之胜或其前驅物的方法。再者,本發明偽關於一種用 於由該嵌合型蛋白質中分離出該具生理活性之胜肽,以純 化該具生理活性之胜肽的方法。 相關桔術 許多利用嵌合型蛋白質之表現的胜肽生成法已被嘗試 。本案偽以化學性或酵素性切割來分離一標的胜肽。使用 於此方法之酵素包括可用於專一性地切割一離胺酸殘基之 c-端胜肽鍵的離胺酸-蛋白内切酶(無色菌蛋白酶I )以 及用於專一性地切割一麩胺酸之〇端的葡萄球菌蛋白酶νδ 。化學法包括以亞硝酸切割天門冬胺酸和以溴化氰切割甲 硫胺酸。 就化學法而言,標的蛋白的修飾是無可避免的,必須 在切割後將標的蛋白自許多類似物中分離出來。另一方面 ,就酵素法而言,其專一性高,且該切割偽在相對緩和之 條件下進行,而有肋於標的蛋白的純化。然而,酵素是否 可被使用傺取決於標的蛋白之胺基酸序列,故現有的蛋白 酶並非皆可被使用,因而需要一種廣用的切割酵素。 當一生物體内生成一胜肽激素或其前驅物時,該胜肽 的前驅多胜會被一酵素(加工酵素.)專一性地切斷。該等 習知於本技藝中的酵素包括前激素酵素1/3 (prohormone e n z y m e 1 / 3 , P C 1 / 3),前激素酵素2 ( P C 2)及芙琳 -4 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨Ox 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装. 訂 480270 IV 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明(2 ) (f ur ί η )。作用於哗酒酵母菌之a -交配因子的生成過程上 的KeX2蛋白酶亦為前述酵素的一種。當將此等加工酵素用 於由嵌合型蛋白質切下標的蛋白時,可預期該胜眈激素不 會受到破壞’且該該加工酵素可供用於廣泛種類之胜肽上 。因此,發展出此等生成方法在本技藝中偽為所欲的,。 本案之發明者曾發表一方法,該方法包含將一源自於 大腸桿菌々-半乳糖苷酶之多胜作為保護性胜肽、擇出適 當之聯結胜肽,並有效地與一標的胜肽共同形成一嵌合型 蛋白質,以形成一不溶性包含體(日本未審查專利公開 (Kokai)案第5-328992號)。此嵌合型蛋白質在具有諸如尿 素之改質劑(mod i f i er)時可被溶解,且被使用作為加工酵 素之受質。 夫發表夕枝術 另一方面,本發明者曽掲露一藉由改變基因而將衍生 自啤酒酵母菌之一膜結合型酵素Kex2蛋白酶製成水溶性酵 素(一Kex2分泌型衍生物)之方法(於1996年3月4日所提申 之該案發明說明書;該發明之標題為“用於生成分泌型 Kex2衍生物的方法”)。該說明書中使用此酵素作為加工 酵素,並未提及以一供作受質之嵌合型蛋白質。 發明簡介 據此,發展一種用以設計與生成一能於大量培養條件 下在大腸桿菌内有效地生成為一包含體,並易於溶解於允 許一加工酵素有效作用的條件之嵌合型蛋白質的方法;以 及一用以設計並生成一位在切割址附近的胺基酸序列,俾 5 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 A7 B7 五、發明説明( 使標的胜肽可藉由一加工酵素而有效地自該嵌合型蛋白質 切下的方法,偽所欲於本技藝中。再者,發展一種用以將 被生成之具生理活性的胜肽純化至不低於99¾之純度的高 度多用途方法亦為本技藝所欲的。 據此,本發明之目的偽提供一種用以設計及生成一在 利用一諸如分泌型Kex2衍生物之加工酵素來生成一具生理 活性之胜肽上,作為受質之嵌合型蛋白質的方法,以及一 種純化該胜肽之方法。 本發明已進行解決上述問題之研究,結果首次蘭明: 1) 一段例如一含有 U:His)4-Pr〇-Gly)n (1 t 〇 6)聯結 請 先 閱 讀 背 意 事 項 再 填‘ 寫 本 頁
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 胜肽之富含組胺酸的序列插入嵌合型蛋白質可導致生成量 增加,亦增加該嵌合型蛋白質在與諸如分泌型KeX2衍生物 之加工酵素反應條件下的溶解度。 2) 對一高反應性受質之需求,即將胺基酸序列乂,-)^-(Lys/Arg/Pro) -Arg用作為聯結子(1 inker )内之該加工酵 素作用址的胺基酸序列,其中Xi傺較佳為離胺酸、精胺酸 或組胺酸,X2傺較佳為組胺酸或苯丙胺酸,以及 3) 在反應後,將反應溶液酸鹼值轉移至酸性側、稀釋變 性劑致使標的胜肽外大部份成份沉澱、離心或加壓過濾使 95¾以上的標的胜胜肽自上清液中回收,以及單獨地或共 同地使用陽離子交換層析及反相HPLC等高回收且高度純化 標的胜肽的一条列步驟,以促使本發明之完成。 因此’根據本發明之一觀點,提供一以下式來表示之 嵌合型蛋白質: -6 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) 見格(210X 297公釐) 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(4 )
A-L-B 其中A偽代表一保護性胜肽; B傜代表一標的胜肽; L偽代表一 C-端具有序列Xi-XrfPro、Lys或Arg)-Ar g而N -端有一富含組胺酸之區域的聯結胜呔,其中χ t與 Xs代表任一胺基酸。該N-端富含組胺酸之區域有[(His) 4-Pr〇-Gly]n序列為佳,其中n為1至6。另外,較佳地,Xi 代表精胺酸、離胺酸或組胺酸,而X2代表組胺酸或苯丙胺 酸。任意1至5個胺基酸可存在於Ν-端區域的胺基酸序列與 C-端區域的胺基酸序列之間。 依據本發明之另一態樣,其提供一種用以生成上述嵌 合型蛋白質的方法,其含下列步驟:以一含有編碼該嵌合 型蛋白質之去氧核醣核酸的表現載體轉形一寄主細胞,培 養所得之轉形株(t r a n s f 〇 r m a n t s)及由培養中獲取該嵌合 型蛋白質。 依據本發明之另一態樣,其傺提供一用以生成上述標 的胜肽(B)之方法,其中令一加工酵素作用於如申請專利 範圍第1至13項中任一項之嵌合型蛋白質,來切割聯結胜 呔(L)之C-端與標的胜呔(B)之N-端間的胜肽鍵,以獲得該 標的胜肽(B)。 根據本發明之一較佳實施例,上述方法包含下列步驟 ••以一能表現一編碼一嵌合型蛋白質的基因之載體轉形一 寄主細胞内;培養所得之轉形菌;分解該轉形麵以提供一 包含體之不溶性分離部份;用一溶解劑(so 1 iib i 1 i z i ng 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項·#填寫本頁)
經濟部中央標準局負工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 五、發明説明(5) agent)來處理不溶性分離部份,以溶解包含體内的嵌合型 蛋白質;藉由一諸如分泌型Kex2-660衍生物的加工酵素, 來切割介於該溶解的嵌合型蛋白質之聯結子胺基酸殘基的 C-端及標的胜肽的N-端之間一胜肽鍵,以分離該標的胜肽 ;以及一藉由沉澱、陽離子交換層析、低壓逆向層析與反 相HPLC純化該標的胜肽。 圖示簡沭 第1圖顯示用於製備合成hProPTH (1-84)基因之合成 寡聚體序列。 第2圔為一顯示合成hProPTH (1-84)基因之製備的圖 譜。 第3圔為一顯示質體PG210S (S/X)之製備的圖譜,其 中P 1 ac偽代表大腸桿菌乳糖操作子(operori )之一起始子, 而TtrP代表大腸桿菌之TrpE減缓子之終結子。 第4圔為一顯示一可表現嵌合型蛋白質/3 Gal-139S (FM)PPH84之質體pGPtfl9的製備之圖譜。 第5圔為一顯示一可表現嵌合型蛋白質Gal-139S (FM) PPH34之質體pGPtfl9PPH34的製備之圖譜。 第6圖為一顯示一種用以生成可表現嵌合型蛋白質 /3 Gal- 117SPPH34 及 /3 Ga 卜117SnHPPH34 (η為 1至 6)之質體 PG117SPPH34及pG117SnHPPH34之方法的前半部之圖譜,其 中PG97SPPH34偽藉由以S04引子取代S05引子來製備,而 PG139SPPH34及pG139SnHPPH34偽藉由以S06引子取代S05引 子來製備。 -8 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0:< 297公釐) ~ (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 A 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明(6) 第7圖為一顯示一種用以生成可表現嵌合型蛋白質 /?〇31-117$??[13 4及/3〇3 1-117$』??[134&為1至6)之質體 PG117SPPH34及pG117SnHPPH34之方法的後半部之圖譜,其 中PG97SPPH34及pG97SnHPPH34像藉由以S04引子取代S05引 子來製備,而PG139SPPH34及pG139SnHPPH34偽藉由以S06 引子取代S05引子來製備。 第8圖為一顯示SDS-PAGE之結果的圖譜,藉此研究寡 組胺酸聯結子{ (H i s) 4 - P r 〇 - G 1 y } η (η為1到6)對一嵌合型 蛋白質生成效率之影響,其中4Η係代表組胺酸殘基的數目 為4,亦即η等於lc 第9圔為一顯示一聚組胺酸聯結子{(H is) 4-Pro -Gly}n (η為1到6)對以Kex2-660切割hPTH (1-34)之效率的影 響之圖譜,其中該撗座標像代表假設/?Gal-117SPPH34之 k c a t值為1時的相對k c a t值。 第10圖為一顯示一位於Kex2蛋白酶辨識址P3之胺基酸 對於以Kex2-660切割hPTH(l-34)之效率的影響之圖譜,該 位於P4址之胺基酸被固定為纈胺酸,且該位於P3址之胺基 酸被置換,其中該橫座標偽代表假設/3Gal-117S4HVKPH34 之k c a t值為1時的相對k c a t值。 第11圖為一顯示一位於Kex2蛋白酶識別址P4之胺基酸 對於以Kex2-660切割hPTH(l-34)之效率的影響之圖譜,該 位於P3址之胺基酸被固定為組胺酸,且位於P4址之胺基酸 被置換,其中該橫座標偽代表假設/3 Ga卜117S4HVKPH34之 kcat值為1時的相對kcat值。 9 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 _ 五、發明説明(7 ) 第12圖為一顯示一用於Gal-117KS4HRHPH34基因之 表現載體PGKSPH34結構的典型圖譜,其中ySGal-117KS為 一藉離胺酸殘基來取代/S Gal-117S中位於第14位置之精胺 酸的胜呔。 第13圖為一顯示質體pG210ShCT(G)之製備的圖譜。 第14圖顯示利用PGKSPH34為模本,而用以構建hGLP-1 (7-37)基因之合成寡核苷酸的核苷酸序列以及PCR引子的 核苷酸序列。 第15圖顯示一用以構建質體PG117S4HGP的方法。 第16圖顯示hGLP-Ι之純化曲線,其中A顯示一樣品與 Kex2反應後之結果,B顯示一來自於酸沉澱之上澄液的結 果,C顯示一樣品經過陽離子交換管柱層析後之結果,D 顯示一試樣經一低壓反相交換管柱層析後之結果;尖峰1 為hGLP-1 (7-37),尖峰2為hGLP-Ι,尖峰3為一保護性胜 肽,尖峰4為嵌合型蛋白質。 詳細説明 依據本發明之該方法,前述之嵌合型蛋白質包含一保 護性胜肽、一聯結子與一可藉一加工酵素切割而生成生理 活性胜肽之具生理活性之胜肽(一標的胜肽)。該等實例包 括人類副甲狀腺激素(hPTH (1-84),)、人類副甲狀腺激素 之衍生物(hPTH (1-34) , hPTH (1-37 )及 hPTH (1-38 ))、其它 人類副甲狀腺激素之衍生物(hPTH( 1-31) Gly,hPTH( 1-34) Gly, hPTH(l-37) Gly, hPTH(l-38) G 1 y,hPTH (3-84), hPTH(3-34), hPTH(3-37)與 hPTH(3-38))細胞生長因子、 -10 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 29?公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央襟準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明說明(8 ) 降血鈣素及其前驅物、與類升血糖素胜肽1 (GLP-υ及其 衍生物(GLP-l(l-37), GLP-l(7-37),GLP-l(7-36) _2等) ,但非僅限於此。 可用於此處之加工酵素包括蛋白酶、芙琳 (furin)、前激素轉化酶1 (PCI)、前激素轉化酶2 (PC2) 或其等之衍生物,但非僅限於此。於本發明内,藉去除 Kex2蛋白酶疏水性區域之C -端製備而成的分泌型Kex2衍 生物是所欲的。 依據本發明,該保護性胜呔#以一大小不超過220個 胺基酸之胜呔為優。譬如一自大腸捍半乳糖苷酶之 N -端的1-位址計算90至210個胺基酸之胜肽為優。一大腸 桿菌/5 _半乳糖苷酶N-端1至97個、且更佳為1至117個或1 至139個胺基酸之胜肽。較佳地,上述胜肽傺藉由絲胺酸 來取代半胱胺酸。較佳地,在上述胜肽中,位於第14-位 置之精胺酸傺以離胺酸所取代。再者’較佳地’保護性胜 肤不含有諸如pr0-Arg,Arg-Arg及Lys-Arg之被加工酵素 所辨識之序列。若保護性胜肽内含該辨識序列,至少將一 前述該辨識序列内之胺基酸以一不同胺基酸取代而令加工 酵素無法辨識該序列,俾可避免被加工酵素切割。 為增進該嵌合型蛋白質之溶解性’聯結子胺基酸以親 水性為佳。某些標的蛋白致使該嵌合型蛋白質電荷改變會 導致該包含體産量降低親水性版基酸以一對於生成包含 體之細_内的生理酸鹼值具有缓衝性質之組胺酸殘基較佳 。此外,由缓和聯結子之二级結構的觀點’變性與溶解後 -11 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公慶) 丨丨ί丨丨 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) __.丁 "口 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 i、發明説明(9 )
Pro-Gly序列之插入為佳。最好能提供一編碼(Hi s)4 -Pro-Gly之合成去氧核_核酸片段並適當地重複插入一編 碼保護性胜肽之去氧核_核酸片段,而設計一 U H i s .) 4 -Pro-GlyU之聯結子,其中η為1到6,以期能與不同之具生 理活性之胜呔相抗衡。此聯結子之Ν -端部份的該序列在 下文稱為LN。 再者,本案發明人已首先闡明:源自於哗酒酵母之 Kex2蛋白酶衍生物(分泌型Kex2衍生物)已可大量製造, 而當使用一嵌合型蛋白質作為一受質時,一位於Kex2蛋白 酶辨識址附近之胺基酸亦會大大地影響活性。本案發明人 特別闡述當位於聯結子C -端之胺基酸序列為Xi -X2 - (Lys/ Arg/Pr〇)-i\rg,其中表任意胺基酸,提供條件: 當Xi.精胺酸、離胺酸或組胺酸,而X2為組Μ酸或苯丙胺 酸,該分泌型Kex2衍生物之活性成為最大。聯結子C -端 部份之該序列在下文稱為“LC” 。 經嵌合型蛋白質方法生成與切割之標的胜肽可藉不同 方法純化之。於本案中,前述該嵌合型蛋白質之利用允許 該嵌合型蛋白質維持不反應性,該保護性胜肽與源於大腸 桿菌之不純物可藉由一簡易沉澱程序有效去除之。待別地 ,已發現在與分泌型(Cex2衍生物反應後,將酸鹼值轉移至 弱酸側,隨後稀釋該反應溶液以降低該變性劑濃度,不僅 能使大部份源於大腸捍麵之不純物,亦可使不低於95%之 該維持不反應性嵌合型蛋白質與保護性胜呔被轉送至沉澱 物内,致使不低於95%之該標的胜肽留於該上清液,可藉 12 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A«4規格(2丨OX 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 五、發明說明(10 ) 離心或加壓過濾而易於取得一含標的胜眈之澄清液體。 經酸鹼值調整及其類似步驟,該上清液直接通過一陽 離子交換層析以吸附標的胜肽,隨後利用一鹽類濃度或酸 鹼值改變洗脱出該標的胜肽,該洗脱物通過一低壓反相層 析以吸附藉一有機溶媒濃度及隨後之該洗脱物濃度變化而 洗脱出之標的胜肽。降低該有機溶媒濃度後,該洗脱物接 受反相HPLC,藉改變該有機溶媒濃度進行分離與分餾以提 供一高純度標的胜肽。 本發明將藉一人類副甲狀腺激素衍生物hPTH (1-34) 為標的胜肽,以實例敘述之。 一 /3 031-2105??1184表現質體卩02103[1?「(^別傜將合成 的去氧核醣核酸寡聚體連接在一起,以製備一hPTH(l-84) 基因,並取代如是製備之一質體pG210ShCT[G]内其編碼 hCT[G]區域製備而成(第3圖)。製備一 pG117SHPPH34,其 一轉譯終止密碼子取代一位於一 hPTH( 1-34)基因距N -端 35-位置之一編碼胺基酸(Val)的密碼,並且其一編碼 /3 Gal_117S之基因(一大腸桿菌召-半乳糖苷酶之N -端第1 至117胺基酸之半胱胺酸殘基以絲胺酸殘基取代之胜肽:)取 代一編碼/3 Gal-210S之基因(一大腸桿® /3 -半乳糖苷酶之 N -端第1至210胺基酸之半胱胺酸殘基以絲胺酸殘基取代) (第6及7圖)。 如前所述可製備PG13 9SHPPH3 4或PG97SHPPH34,唯應 嵌入者為一編碼/3 Gal_139S或一 /3 Gal-97S之基因而非 /3 Ga 卜210S。 -13 一 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A料見格(210X297公釐) — (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央梯準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(11) 在此等質體中,分別編碼/SGal-97S、/?Gal-117S及 /3 Gal_139S之結構基因經由一聯結胜狀Phe-Met-Lys_Ser-Val-Lys-Lys-Arg與一 hPTH (1-34)之結搆基因相連,該編 碼此嵌合型蛋白質之結構基因係由一 1 ac起始子:)來調控 。此外,此質體含有一抗四璟素基因標記。 雖然/SGa卜97SPPH34於尿素溶液中具高溶解度,但其 生成率低。另一方面,/5〇31-11731^評34與/3〇3卜 139SPPH34之生成率雖高,在與分泌型Kex2衍生物反應條 件下之該溶解度極低,以致必須使用大量的分泌型Kex2衍 生物方能自該嵌合型蛋白質切下hPTH( 1-34)。據此理由, 為提供在尿素溶液内具高生成率與高溶解度之一嵌合型蛋 白質,一親水性、在酸鹼值7 (中性)左右表現缓衝性質且 含有能抑制該嵌合型蛋白質二級結構之形成的胺基酸之聯 結子LN被插入保護性胜肽與聯結子Met-Ser-Va 1 -Lys-Lys-Arg之間。 一具有((}]^)4-?「〇-017)«序列之胜肽被用於1^,其 中η為1至6。被引進之{(His)4-Pr〇-Gly)n,其中η為1至6 ,藉合成一編碼(His)4-Pr〇-Gly 或((His)4-Pr〇-Gly)« 之 去氧核醣核酸片段,以一適當的莫耳比例將該去氧核醣核 酸片段嵌入一編碼該保護性胜狀之去氣核_核酸片段的 3 ’ -端。如此,一編碼一包含含有一段或多段上述該胺基 酸序列之聯結胜肽的嵌合塱蛋白質之基因被製備。 一帶有反向嵌入之去氣核醣核酸片段的基因藉去氧核 _核酸定序確任後被剔除。大腸桿菌M25菌株藉編碼嵌合 - 14 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 策·
、1T 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(12) 型蛋白質之質體轉形以測驗該嵌合型蛋白質之生成率(第8 圖)。結果發現在該保護性胜肽/3 Gal_97S與/? Ga卜139S之 例中,η為3時呈現該嵌合型蛋白質之高生成率;然在該保 護性胜肽/3 Ga卜117S之例中,η為1至6時呈現該嵌合型蛋 白質之高生成率。此等嵌合型蛋白質之包含體經細胞破壞 與離心以進行洗滌與分離,以尿素溶解,稀釋而用於與 Kex2-660之反應(第9圖)。 結果發現((His)4-Pr〇-Gly)n之引用增進所有歌合型 蛋白質對Kex2-660之敏感性,其中η為1至6。據此,為了 用於hPTH (1-34)生成之該嵌合型蛋白質,含有作為保護 性胜之Ga卜117S與作為聯結胜肽LN之(His)4-Pro_Gly之 召Ga卜117S4HPPH34,經考慮該嵌合型蛋白質之生成率、 與Kex2-660之反應性,及該保護性胜肽之大小後被採納。 上述結果顯示,在一供分泌型Kex2衍生物切下一生理 活性胜肽之一嵌合型蛋白質的設計中,一段((His) 4-Pro-GlyU之胜肽的嵌入,不僅適於改善大腸捍菌生成率’亦 改善與分泌型Kex2衍生物反應條件下之溶解度,其中η為1 至6。 在本方法中,分泌型衍生物使用時與嵌合型蛋白 質之莫耳數比例以約1比為宜’因此佔了該製造原料 價格之主要部份。因此’需要設計一較易藉分泌型Kex2衍 生物切割之嵌合型蛋白質° 一人類副甲狀腺激素前驅物之 一前序列 Lys-Ser-Val-Lys-Lys-Arg被用於 /3 Gal-117S4HPPH34之該分泌型Kex2衍生物辨識址。然而此序列 15 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210x 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印裂 A7 B7 五、發明説明(13) 是否最適於藉分泌型Kex2衍生物切割為未知,且如同許多 其他蛋白酶最佳化有導致更進一步增加切割效率之可能。 由於hPTH(l_34)以其C -端側與該辨識址相連,不能進行 胺基酸之取代。反之,就没有新産生的辨識址而言,位於 N -端側之序列是可以被自由選擇的。據此,嘗試將該作 為受質之嵌合型蛋白質的P3-址(:X2)轉變成任一胺基酸。 被研究過之1δ段胺基酸序列顯示於第10圖。結果發現組胺 酸或苯丙胺酸引入Χ2允許hPTH( 1-34)以較佳效率自該嵌合 型蛋白質被切下。 因此,顯示於第11圖之20段胺基酸序列被用以研究該 P4址,而未顯現顯著副反應之組胺酸於》2固定不動。結果 發現將精胺酸、離胺酸或組胺酸引入Xi允許hPTH(l-34)以 較高效率自該嵌合型蛋白質被切下。能提供最高切割效率 之 Arg-His-Lys-Arg被選為 LC。 在本研究過程之中,發現藉一分泌型Kex2衍生物可切 割位於/3 Ga卜117S之13與14-址的Arg-Arg序列之C -端的 胜呔鍵。因此,在後續藉酸沉澱純化之步驟中,該産生之 /3 Gal (1 -14)與hPTH (1-34)被回收於上清液分離部份中。 因此,離胺酸取代14精胺酸而抑制了該切割’藉以避免 /3 Gal (1-14)之生成。 基於前述結果,對用於生成hPTH(l-34)之嵌合型蛋白 質而言,14精胺酸以離胺酸取代之/3Gal-117S(/3Gal -117KS)被採納為該保護性胜肽,且一有一胺基酸序列卩「〇-His-His-His-His-Pro-Gly-Gly-Arg-Pro-Ser'Arg-His- 一 16 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公着) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、11 480270 i_I__ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 發明説明(14)
Lys-Arg之胜肽被採納為一聯結胜肽。 本案發明人於大腸桿菌内表現該嵌合型蛋白質/3 Ga卜 117KS4HRHPH34,將所得之包含體予以洗滌、回收、溶解 及令其與一分泌型Kex2衍生物進行反應,接著研究純化方 法。結果,含源自於大腸桿_不純物之一胜肽,未反應之 嵌合型蛋白質與保護性胜呔,可藉利用一將酸鹼值由中性 移至弱酸性,致使溶解度明顯降低之現象而被沉澱,亦即 將適合一分泌型Kex2衍生物反應之酸鹼值7.8至8.2轉移到 6 · 2 至 6 · 5 ° ^ 另外,藉稀釋以降低變性劑(尿素)濃度能令大部份不 純物沉澱。該沉澱物藉離心或加壓過濾去除以自上清液中 有效地回收hPTH( 1-34)。將該上清液調整至酸鹼值5.0後 通過一陽離子交換層析(例如PorosHS,SP ToyoPearl)以 吸附hPTH(l-34),接著以0.3至0.4M NaCl洗脱。在洗脱物 中加入醋酸,接箸該混合溶液通入一低壓反相層析(例如 PorosR2 SokenODS-W)以吸附 hPTH(l-34),接著以約 30% 乙腈(aceton i i le)洗脱以去除對濃縮與逆相HPLC有不利 影響之不純物。 洗脱物中之乙睛以減壓被蒸餾移除,該殘餘物以 0.22揮濾器過濾,通過反相HPLC(例如InertsiliPrepODS ,TSK-0DS-120T)以吸附hPTH (1-34),並藉乙腈之梯度洗 脫(g r a d i e n t e 1 u t i ο η)分離之。一高純度的分離部份被選 出。如此,具有99.5¾之純度的hPTH (1-34)以40至70¾之 回收被分離。上述結果顯示此回收為本技術已報告者中最 17 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Λ4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 s____ 五、發明説明(15) 高,證實本發明之實用性。 窨例 雖不僅限於此等實例,本發明將參照後述實例做較詳 盡之說明。 首先,將説明用於本發明之質體、大腸桿菌以及各實 例共通之基本實驗程序。 質髏 一質體pG210ShCT [G]為一在大腸桿菌乳醣操作子之一 起始子(一 1 ac啓始子)調控下能表現一嵌合型蛋白質,亦 卽Ga卜210S之質體該嵌合型蛋白質含有位於-半乳糖 苷酶之N -端的胺基酸1-210之胜肽,且其76 Cys、122Cys 、與154 Cys由絲胺酸取代之;亦表現經一麩胺酸殘基與 /3 Gal210S鍵結之hCT [G](—在胺基酸32之C -端加入一甘 胺酸殘基之人類降血鈣素的胜呔)。 質體之製備像以一經限制酶Ρνιι 11與EcoR I消化之 pGHcc210(Ser)rop-來製備,含有一部份編碼 /3Gal-210S 之基因的去氧核醣核酸片段,與另一含有經限制酶Pvu II 與EcoRI消化之載體PG97S4DhCT [G]的去氧核_核酸片段 相連接(第13圖)。製備p G H ex 210 ( S e r:) r ο p -之方法見於曰 本未審查專利公開案(Kokoku)第6-87788號。而含有質體 F>G97S4DhCT [G]之大腸桿菌W31100菌株命名為大腸桿菌 SBM323,於1991年8月8日以FERM BP-35 03寄存於國際工商 業部工業科技之生物科學與人類技術所(I n s t i t u t e 〇 f Bioscience and Human Technology Agency of 13 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(16)
Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade & Industry) ° 引進一編碼一標的蛋白之去氧核_核酸區域作為一 EcoRI-Sall去氣核_核酸片段至質體pG210ShCT[G]内,該 讀取架構吻合時能使一嵌合型蛋白質與Ga卜210S進行表 現。該質體被用於一合成人類副甲狀腺激素(hProPTH (1 -84))基因之選殖以及一製備質體pGPtfl9時之原料(第3 圖)。 大腸捍_ 以購自Toy obo公司之大腸桿菌JM1 09菌株作為勝任細 胞(c 〇 m p e t e n t c e 1 1)及用於質體之製備ϋ大腸桿_ Μ 2 5菌 株(W3110/ompT- S u g i m u r a et a 1. B i ο π h e m. B i 〇 p h y s, Rjes_ Commu . 153, 753-759, 1988)被用於嵌合型蛋白質 之表現。 培養基 下列培養基用於大腸捍菌之培養。 S B培養基:〇 · 5 % (w / v)甘油,2 · 4 % (w / v)酵母菌萃取 物,1.2% (w/v)蛋白腺(trypton), 0·1Μ磷酸氫錚緩衝 液(ρΗ7·5)。
NU1合成培養基:0.4% (w/v)酵母菌萃取物、10·« (w/v) K2HP〇4 - 0.4¾ (w/v) KH2P〇4l 0. 27¾ (w/v) Na2HP〇4 、 1,2¾ U/v) (NH4)2S〇4、 0.02¾ U/v) NH4C1、 (K3%(w/V) L-甲硫胺酸、0.2¾ (w/v) MgS〇4*7H2〇、 40mg/L FeS〇4 . 7H2〇 、 40mg/L CaCl2 ♦ 2H2〇 、 lOmg/L 19 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印裝 480270 A7 ___B7 _ 五、發明説明(17)
Aids · 6H2O - lOmg/L C0CI2 * 6H2〇 > 2mg/LZnS〇4 · 7H2〇 、2mg/L Na2M〇4· 2H2O、lmg/L C11CI2· 2H2O、0.5 mg/L H3BO3及 lOmg/L MnSCU· nHsO。 基本實驗程序 若非另有指定,下述實驗程序應用於該等實驗中。 去氧核_核酸引子傺藉磷酸醯胺方法 (phosphoamidite method)以自動合成儀(Model 320 A Applied Biosystems製造)合成。去氧核聽核酸序列藉雙 去氧法(d i deoxy me t hod)決定。 去氧核_核酸傺利用限制酶(3至10倍量)依供應商指 示作用1小時。質體之結構傺以20 /i 1反應溶液中之0 · 5至 1 〃 g去氧核_核酸進行分析,而去氯核醣核酸之製備則以 3至10/i g去氧核醣核酸在50至100,u 1反應溶液中進行。反 應溫度、反應緩衝液及其他條件偽依供應商之指示。 在瓊脂膠體上電泳之試樣製備偽在反應溶液中加入 0.2倍體積的染劑(含0.25% (w/v)溴酚藍(bromophenol blue)之 15% (tf/v)液態 Ficol 1溶液)。以 TAE緩衝液(40mM Tris/醋酸,2mM EDTA)作為在瓊脂膠體上電泳之緩衝液° 分析一質體之結構像用M u p i d - 2 ( C 〇 s m ο B i 〇 C 〇 ·,L t d ·製) 以100V電泳1小時。製備去氧核醣核酸時電泳則在一水平 顧體(20cm X 15cmX 0.7cm)上以150 V進行4小時或以35 V進 行13小時。該膠髏經液態溴化乙基啶溶液(ethidiuin b r 0 m i d e 0 . 5 /i g / m 1)染色2 0分鐘後以紫外光照射撿測去氧 核醣核酸帶。瓊脂膠體濃度視需分離之去氧核醣核酸片段 -20 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝- 訂 480270 A7 B7 五、發明説明(1δ) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 大小由1 · 0 %至2 · 0 %。 瓊脂膠體内之去氧核醣核酸之萃取偽將膠體置於一充 滿0 · 1倍ΤΑΕ緩衝液之透析管中,通入電壓以進行洗脱。去 氧核_核酸溶液以酚與氯仿處理,復用乙醇沉澱以純化去 氧核醣核酸ϋ 接合反應(ligation)偽於30ul含有0.05至lug去氧 核_核酸片段之反應溶液(67mM Tris/HCI (pH7,5), 5raM MgCl2、5niM DTT、ImM ATP)中加入10單位T4接合酶,且令 反應於16°C進行12至18小時,或藉TAKARA試劑組(Takara Shuzo Co·, Ltd♦製造)為之。 大腸桿M JM109菌株偽依供應商之指南進行轉形。大 腸桿_ Μ25菌株依氯化鈣法來轉形。轉形之菌株利用抗藥 性(四環素)篩選之。 SDS-聚丙烯醯胺膠體電泳(SDS-PAGE)試樣之製備傺加 入等量之SDS試樣緩衝液(63mM Tris/HCl (ΡΗ6.8)、10¾ (w/v)甘油、10¾ (tf/v) SDS、10/il/mL溴酚籃)並將混合 物煮沸3分鐘。電泳於16% (w/v) SDS-PAGE迷你(TEFC0)膠 體上以每片膠體20mA之電流進行70分鐘,膠體傺藉考馬斯 氏藍G來染色。 hPTH (1-34)之定量首先傺將一含hPTH (1-34)之溶液 以一試樣緩衝液(1M醋酸鹽/2M尿素)稀釋10至20倍後,將 稀釋液離心以取得上清液,該上清液用於連接了 YMOODS- A302 (d4.6nun X 150fflffl)管柱(IK· Yamamura Kagaku Kenkyujo 製造)之 HPLC (LC10A Shimadzu Seisakusho Ltd 21 一 21 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7 五、發明説明(19) 製造),利用A液(0·1% (v/v)三氟乙酸(TFA)/10% (v/v) 乙睛)及 B 液( 0.094% (v/v) TFA/50% (v/v)乙腈)並以 梯度B40%->80%/20分鐘來進行,並將藉由測量在214 nm 處之吸收所測出的hPTH (1-34)峰域,與具有一已知濃度 之標準hPTH (1-34)峰域予以比較。 其他基本基因操作若未指明偽依據分子選殖(Man iat is , et al, Cold Spring Harbor Laboratory,New York (1982) )一書所述。 實例1 hProPTH (1-84)基因之製備 如第1圖所示,hProPTH (1-84)基因被合成為lil至U7 (序列辨識碼:1至7)與L1至L7 (序列辨識碼:8至14 ) 14個分 開的片段。 此等片段如下述被接合以製備hProPTH (1-84)基因 (第2圖)。 首先,約1/i g去氧核醣核酸片段U1(序列辨識碼1)與 約ly g去氣核_核酸片段L7(序列辨識碼:14)在含有16單 位T4聚核苷酸激Μ與0,5nM (IMBq或以上)[7-32P]dATP之 磷酸溶液中以37°C作用15分鐘,隨後再加入5 v 1含5mM 、 ATP之磷酸化溶液於37 °C繼續作用45分鐘。相同方法重複 用於ϋ2(序列辨識碼:2)及L6(序列辨識碼:13)、U3(序列辨 識碼:3)及L5(序列辨識碼:12)、U4(序列辨識碼:4)及U (序列辨識碼:11)、U5 (序列辨識碼:5 )及L3 (序列辨識碼: 10)、U6(序列辨識碼:6)及L2(序列辨識碼:9)以及U7(序列 辨識碼:7 )及L 1 (序列辨識碼:8 )之組合。 -22 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 _______ B7 五、發明説明(20) 將以上該7組反應反應溶液結合,所得之混合物以乙 醇沉澱回收去氧核_核酸,然後溶於80 y 1 100mMT「is/ HC1 (ρΗ7·6)、6·5πιΜ MgCI2、300mM NaCl。分裝其中 40/i 1置於95¾作用5分鐘,繼而以30分鐘將該溫度降至 43°C ’用冰將其冷卻。加入40 /i 1接合反應B液(Takara Shuzo Co. Ltd.製造),令該混合物置於26°C 15分鐘。 此試樣以5¾聚丙烯醯胺膠體上進行電泳。電泳後,藉 自動放射攝影術撿測接合之去氧核醣核酸。一對應於約 280bp之去氧核醣核酸片段自膠體中被萃取出來,然後藉 傳統方法純化之。 實例2 A Ga卜139S(FM)PPH84之表現質體pGPtfl9的製備 含有一合成hProPTH (1-84)之該約280bp去氧核醣核 酸片段其5’-端具有一限制酶EcoRI址,3’-端具有一 Sail 址。藉由將該EcoRI/Sal I去氧核_核酸片段嵌入 pG210ShCT[G]之 Ec〇RI/Sal I址進行 hProPTH (1-84)之選殖 〇 pG210ShCT[G]以限制酶EcoRI與Sail消化後,一含有 載體部份,長約3 . 5kb去氧核醣核酸片段被製備。此片段 與實例1製備之約280bp去氧核醣核酸片段hProPTH (1-84) 接合而成為 pG210ShProPTH(第 3圖)。pG210ShProPTH 轉形 大腸捍菌JM109菌株内而成為JM109 [pG210ShProPTH]菌株 Ο ' 其次,將引子KM091C序列辨識碼:15)與KM092 (序列 辨識碼:16)嵌入pG210ShProPTH之限制酶Xho I/EcoR I址, -23 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) ▼裝· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7__ 五、發明説明(21) 以製備質體PG210S (S/X)(第3圖)。該上述引子兩端分別 具有限制酶Xhol與EcoRI址,其内並具有SacI址。 將PG210S (S/X)以限制酶SacI與Xhol消化,一編碼 /3 Ga卜210S之去氧核_核酸區域傺使用一用於巨大序列之 移除套件(T a k a r a S h u ζ 〇 C 〇 .,L t d .製造)做專一性刪除^ 末端用KlenowH段修整後藉自我接合(self-ligation)製 備一編碼一含/3 Gal - 139S及經Phe-Met與其鍵結之 hProPTH的嵌合型蛋白質之質體pGPiil9 (第4圖)。將pGPtfl9 引進其内之大腸捍菌JM109_株命名為JM109 [pGPtfl9]。 實例 3 /3 GaW17SiiiHPPH34表現質體 pG117SmHPPH34之製備 本實例中,/SGa 卜 117SmHPPH34 表現質體 pG117SmHPPH34 之製備將藉實例敘述。/3 Ga卜97SjhHPPH34表現質體 , pG97SmHPPH34或 /3 Gai-139SmHPPH34表現質體 pG139SmHPPH 34可用 /? Gal-97S或 /3 Gal-139S而非 /3 Ga 卜139S製備。 1) pGPtfl9PPH34 之製備 pGPtfl9PPH34製備如後。一 35 Val之密碼GTT被轉變為 轉譯停止密碼TAA之hPTH (1-84)去氧核醣核酸片段用 PGPM9為模本,S01 (序列辨識碼:17)及S02(序列辨識碼: 18)為引子,藉PCR進行擴增。一限制酶Aat-Sall去氧核_ 核酸片段藉傳統方法分離及純化,而後藉一與pGPtfl9對應 部份之交換以製備pGPttl9PPH34 (第5圖:)。 2) PG117SPPH34 之製備 以PG210為模本,S03(序列辨識碼:19)與S05(序列辨 識碼:20)為引子,藉PCR進行增幅;隨後藉限制酶Pvu I及 -24 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(2丨0><297公釐Ί (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(22 ) Sma I消化製備一去氧核_核酸片段。其次,以 pGPtfl9PPH34為模本,S07(序列辨識碼:21)與S02為引子, 藉PCR進行擴增。隨後藉限制酶Sail及Smal消化製備另一 去氧核_核酸片段。前述二段去氧核醣核酸片段及一含一 供 PGPtfl9PPH34作為複製原點(rePI ication origin)之限 制酶Pvu I-Sa 1 I去氧核醣核酸片段用T4接合酶接合在一起 ,以製備pG117SPPH34(第6及7圔)。 3) pG117SmHPPH34 (m 為 4至 8)之製備 pG117SmHPPH34 (m為4至8)傺藉將聯結子S08 (序列辨 識碼:22)、編碼(。3)4忏^刊1〃之聯結子309(序列辨識碼 :23)、聯結子S10(序列辨識碼:24)及編碼{(Hish-Pro-Gly) n.之聯結子S11 (序列辨識碼:25)嵌入PG117SPPH34之限 制酶Smal址而製備。於該連結時,應留意一質體(m為12、 16或24)可藉更改聯結子之長度而製備。 其次,PG117S4KPPH34#藉將聯結子S12(序列辨識碼: 26)、編碼(1^3)4-?广〇-017之聯結子313(序列辨識碼:27) 嵌入pG117SPPH_34之限制酶Smal址而製備。同樣地’ pG97S4kPPH34與 pG139S4kPPH34亦可製備。 插入聯結子之數目與方向偽於質體製備後’藉決定去 氧核醣核酸序列來確定,而此實例中製備之嵌合型蛋白質 列示於表1。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
25 本纸張尺度適用中國國家榡準(CMS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 A7 B7 五、發明説明(23 表1 β Gal-97SmHPPH34 β Gal-SmHPPH34 β Gal~139SmHPPH34 - 〇 〇 〇 4H 〇 Ο 8H 〇 〇 〇 2H 〇 〇 〇 6H 〇 4H 〇 4K 〇 〇 〇 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 在該表之内,Η代表一組胺酸殘基,K代表一離胺酸殘 基,附加於Η或Κ的數字代表胺基酸之數目。 實例4 嵌合型蛋白質hPTH( 1-34)之生成 列於表1之該嵌合型蛋白質生成率以SDS-PAGE試驗之。 表1中含有一編碼一嵌合型蛋白質之基因的16個質體分別 被引進大腸桿菌JM109菌株。轉形細胞被培養於一含有2m 1 SB培養基之試管内於37 °C搖動16小時,隨後藉生理食鹽水 將培養濁度(ODwq)稀釋至1〇。在100^ 1懸浮液中加入等 量之SDS試樣緩衝液,將該混合物煮沸3分鐘。該上清液取 l〇ul接受SDS-PAGE以比較每一細菌生成嵌合型蛋白質之量 該結果顯示於第8圖。由第8圖明顯可知,表現嵌合型 蛋白質之量依該/3 -半乳糖苷酶衍生物/組胺酸殘基數目組 合而改變。專一地,對於Ga卜97S,就((His) 4-Pro-GlyU其中 ^ 為 2與 3而言 ,可獲至高生成率; 對於 /?Gal - 26 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明(24 ) 117S,就{(Hish^Pro-Gly}»!其中 π為1、2、3、4與 6而 5 ,可獲至高生成率;對於G a 1 -13 9 S,就((H i s) 4 - P r ο-α 1 y } n 其中 η 為 2 與 3 而言 ,可 獲至高 生成率 ° 特 別地是 ,對 於/3Ga卜117S之衍生物,引進((His)4 - Pro-GlyU其中η為 1至6,導致表現之嵌合型蛋白質量明顯增加’且於此例中 ,表現之嵌合型蛋白質量大於僅藉離胺酸改變電荷者° 實例5 由嵌合型蛋白質切下hPTH( 1-34) 對該高生成嵌合型蛋白質/3 Gal-97SmHPPH34 (m為12) 、/? Ga 卜 117SinHPPH34 (in為 0、4、8、12、16及 24)與 /3〇81-1393111[^?^134(111為0及12,以111為0時作對照組),為 研究作為Kex2-600之受質的適切性,該嵌合型蛋白質包含 體被回收,溶解於8M尿素,並稀釋而成為一反應組合 (20mM Tris/HCl (ρΗ8·2)、ΙΟΟιηΜ NaCl,3.0M尿素、2·0Μ CaCl2,8mg/nil嵌合型蛋白質:)。隨後加入Kex2-660至其最 終濃度達20kU/ml,以切割hPTH (1-34)。在此等條件作 用1小時,90%或更多作為對照組之/?Gal-117SPPH34被切 下0 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 第9圖中,每一衍生物與Kex2-660之反應性以相對於 PG117SPPH34的kcat之比率表示。 hPTH (1-34)之定量偽根據前述基本實驗程序的方法實行。 結果發現在所有例子裡,引進((HiS)4-Pr〇-Gly}n更進一 步改善與Kex2-660之反應性,其中η為1至6。 特別對於yS Ga卜117S4HPPH34,插入一聯結子((^3)4-Pro-G 1 y導致該嵌合型蛋白質生成及與Kex2-660反應性的 27 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 五 經濟'那中央標準局員工消費合作社印製 A7 _B7__ 發明説明(25) 改善,此外,更提供在Kex2反應條件下不低於15g/L之溶 解度,亦即在溶解度上較Gal-139SPPH34(8g/L)之溶解 度改善。 實例6 hPTH (1-34)之大量生成 為了已發現其能以高生成率被表現且適合作為 660之受質的該嵌合型蛋白質召〇3丨_11754卟?[134之大量生 成,以含有一編碼此嵌合型蛋白質的質體PG117S4HPPH34 轉形大腸桿菌M25菌株(W3110/ompT)來製備 M25[pG117S4HPPH34]菌株。該 M25[pG117S4HPPH34]菌株用 一20L培養桶盛裝培養基(2% (w/v)酵母萃取物、1¾蛋白腺 、1·2% K2HP〇4、0.3¾ U/v) KH2P〇4 及 0.5¾ (w/v)甘油) 於37 °C培養。 當細胞濃度達ODsfla為1.0時,加入IPTG至最終濃度 ImM,而後繼續培養至該細胞濃度達〇D〃d為12。該細胞被 收集,懸浮於 TE (lOmM Tris/HCllmM EDTA (ρΗ8·0))。該 懸浮液接受高壓均質(Man ton-Gauli η)以分解該細胞。將 該均質物離心以取得含嵌合型蛋白質之沉澱物,接著以ΤΕ 及去離子水洗滌之。由2 0 L培養可取得約10 0 g含嵌合型蛋 白質之包含體。將 100ml IMTris/HCl (ρΗ8·2)、50ιη1 5M NaCl、50〇11»1去離子水及90(^尿素加入25〇1111該懸浮液中, 置該混合物於一 30°C恆溫室内攪拌30分鐘以溶解該成份, 再於30 °C以溫的去離子水稀釋至5L。 攪拌時緩緩加入50ml 250mM CaCl2溶液,並加入 Kex2-660至20kU/ml。加入Kex2-660二小時後(切割百分率 28 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 —^__ 五、發明説明(26) :不低於9 0 % )’藉添加醋酸調整酸齡值至6.4,隨後藉去 離子水二倍稀釋以凝結及沉降未反應之該嵌合型蛋白質與 該保護性胜狀離心以獲得一含h P T Η (1 - 3 4)之上清液ϋ該 上清液藉添加醋酸調整酸鹼值至5.0,通過一以1 ΟπιΜ醋酸 鈉緩衝液(PH5.0)平衡之陽離子交換樹脂(SP ToyoPearl) 管柱以吸附hPTH (1-34),然後以〇,4M NaCl洗脱 hPTH (卜34)。 .加入醋酸至3¾之最終濃度,該混合物被通過以3¾ (v/v)醋酸平衡之一低壓反相管柱(SokenODS-W)以吸附 hPTH(l-34),繼而以含3% (v/v)醋酸之30% (v/v)乙腈溶 液洗脱hPTH (1-34)。乙腈於低壓被去除,該殘餘物經一 0.22um膜濾器過濾並以一反相HPLC製備管柱 (TSKgel0DS120T<D 55x600)純化之。此例中,洗脱偽在流 速40ml/min,以一具線性密度梯度:A: 5¾ (v/v)醋酸/ 10¾ (v/v)乙腈;B: 5%(v/v)醋酸/40¾ (v/v)乙腈;= 20%—80%/60min)之乙腈來完成。每一步驟該hPTH (1-34) 之回收表列於表2。 表2 步驟 PTH之量(g) 回收(¾) 與Kex2-660反應 7.0 100 獲得自酸沉澱之上清液 6,7 95 陽離子交換管柱 6.0 85 低壓逆相管柱 5.8 82 HPLC 4.0 57 -29 一 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __B7_ 五、發明k明(27) 實例7 位於嵌合型蛋白質之Kex2-660識別址P3胺基酸之 取代 為將位於P3址之胺基酸(Lys)轉變成不同胺基酸,含 一對應於被轉變之P3址之密碼子的寡核苷酸S14至S 18 (序 列辨識碼:28至32)被合成,而一去氧核_核酸片段利用 此等寡核苷酸及S02(序列辨識碼:1δ)為引子, PG117S4HPPH34為模本,藉PCR合成。如此獲得之去氧核醣 核酸片段藉乙醇沉澱純化,以StuI與Sail切割,並在2.0% U/v)瓊脂膠體上電泳以純化一標的0.4Kbp Stu I-Sa 1 I片 段。 此去氧核_核酸片段與一藉StuI及Sail消化,編碼一 PG117S4HPPH34之/3半乳糖苷酶部份的去氧核醣核酸片段 接合,並依前述與該標的Stul-Sa II去氧核醣核酸片段相 同方式進行純化。接合反應完畢後,接合混合物被用於轉 . 形大腸桿菌JM109_株。對每一組合,獲得10個抗四璟素 選殖株,來自該等株之質體藉去氧核醣核酸定序分析以獲 得所欲之表現載體。 換言之,為了一具有一胺基酸序列之嵌合型蛋白質 /3 Gal-117S4HVXPH34,一表現載體 口011734[1〇?}{34被製備 。該序列内含一編碼PG117S4HPPH34之嵌合型蛋白質的 Kex2-660識別址 Ser-Val-Lys-Lys-Arg已被 Ser~VaI - X-Lys-Arg所取代,其中 X為 Giy、Ala、Val、Leu、lie、Ser 、T h r、A s p .、G 1 u、A s n、G i n、L y s、A r g、P h e、T y r、T r p 、H i s Λ P r o 0 -30 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟、那中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 1、發明説明(28) 為研究每一嵌合型蛋白質與Kex2-660之反應性,每一 株均被培養於50ml SB培養基内。當該細胞濃度到逹〇Ds 0〇 為1.0時,藉IPTG誘發表現,再繼續培養4小時。其後,收 集細胞,經TE緩衝液洗滌、懸浮、分解及離心以製備包含 體。包含體用含ΙΟιηΜ EDTA之1¾ Triton X100及TE洗滌以 製備純化之包含體。包含體内90%或更多之胜肽成份為一 標的嵌合型蛋白質。將20/i 1 1M Tris/HCl (PH8.2)、 20ι15Μ NaCl及300 α 1 10Μ尿素加入每一嵌合型蛋白質包 含體之懸浮物中並溶解之,隨後該混合物以650u 1去離子 水稀釋並置於一 30 °C之恆溫室内10分鐘,加入10/i 1之 250inM CaCl2,復加入 Kex2-660 至濃度為 20kU/ml。 在此等條件下歴時1小時,90%或更多作為對照組之 /?Gal-117SPPH34被切割。生成之hPTH (1-34)用前述之 0DS管柱藉HPLC定量。每一衍生物與Kex2-660之反應性以 相對於PG117S4HPPH34的kcat之比率表示(第10圖)。當X為 • Phe或His時,hPTH (1-34)藉Kex2-660切割之效率被改善 ,然而當X為Pro時,大體上沒有hPTH(l-34.)被Kex2-660所 切割。 實例8 位於嵌合型蛋白質之Kex2-660識別址P4胺基酸之 取代 基於實例7之結果與該切割時間内副産物量少的事實., 一 P3址具有一組胺酸殘基之嵌合型蛋白質/?(^1-117S4HVHPH34被挑選出來作為生成hPTH (1-34 )之嵌合型 蛋白質,並嘗試置換位於P4址之該胺基_以改善與Kex2- -31 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明說明(29) 660之反應性。寡核苷酸S19至S24(SEQ ID N0S:33至38) 被合成,一含有被引進的突變之去氧核醣核酸片段利用前 述寡核苷酸及S02為引子,PG117S4HVHPPH34為模本,藉 PCR被合成。 實例7之方法為了一含有該Kex2_660識別址Ser-Va卜 His-Lys-Arg已被Ser-X-His-Lys-Arg取代之結構的嵌合型 蛋白質〇31-11754以[^1]34而重複以製備表現載體 PG11.7S4HXHPH34 〇 其中 X為 Gly、Ala、Leu、lie、Ser、Thr、Asp、Glu、i\sn、Gin、Lys、Arg、Cys、Met、Phe、 Tyr、 Trp、 His、 Pro或Val0 對Kex2-660之敏感性像用該嵌合型蛋白質為受質,在 與實例6相同的條件下判定。結果發現,當X為Lys或Arg ’ 可改善ffKex2-660對hPTH(l-34)之切割,然而當X為一酸 性胺基酸(Asp或Gin),大體上並無hPTH(l-34)被Kex2-660 切下(第11圖)。因此,此為首次掲示Kex2-660蛋白酶在該 P1址需要一精胺酸殘基,該P2址需要一強鹼性胺基酸或一 腩胺酸殘基,同時,P3址以一組胺酸殘基或一苯丙胺酸殘 基而P4址以一強鹼性胺基酸為佳,然P3址出現一脯胺酸或 P4址出現一酸性胺基酸會導致嶔合型蛋白質切割活性明顯 下降。 實例9 保護性胜肽的!Ux2-660切割址之移除 在實例7與8中該Kex2-660切割活性在藉HPLC撿測時間 内為微量。結果發現,一結合於該保護性胜肽Θ Ga卜117S 之13、14位置的序列Arg-A「g之C -端的胜肽被切割。因此 -32 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) Λϋ_— n —Λν 、tr 4·γ>ϋ ϋϋ ·ϋ^ 1 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明k明(3。) 預想在藉酸沉澱hPTH (1-34)之純化時間内所産生的 /3 Gal (1-14)被包含在内。據此,嘗試用Lys取代14 Arg 以抑制Kex2-660切割,藉以抑制々Gal (1-14)之生成。 一編碼一 14 Arg被Lys取代的嵌合型蛋白質(/3 Gal -117KS4HRHPH34)之質體pGKSPH34(第12圖)偽如下述製備 。首先,一被引進突變之去氧核醣核酸片段Ase卜RK利用 一寡核苷酸S25 (序列辨識碼:39)及S26 (序列辨識碼:40 )為引子,以PG117S4HRHPH34為模本,藉PCR被合成。一去 氧核醣核酸片段RK-Bg 1 11利用一寡核苷酸S27 (序列辨識碼 :41)及S28 (序列辨識碼:42)為引子,以相似方法製備。 每一去氧核醣核酸片段均被純化並各量取約1 n g純化 之去氯核醣核酸片段,將該量取之片段共同混合,進行四 次不含引子的PCR以合成一被引進突變之Asel-Bglll片段。 ’ 加入寡核苷酸S25與S28,繼續進行PCR以合成該片段。藉 乙醇沉澱純化該片段,以Asel與Bglll切割,在2.(UU/v) ‘ 瓊脂膠體上電泳以製備一標的〇.35kbp片段。一Asel/SphI (1 · 8kbp)片段與 PG117S4HRHPH34 之一 Sph/Bglll (1.4kbP) Η段在1.0 U/v)瓊脂膠體上電泳以純化此等片段。 前述三片段被接合在一起,該接合混合物被用以轉形 大腸捍菌JM109菌株。取得抗四環素株,藉鹼溶解法製備 質體並以去氧核_核酸定序分析之。一含有一編碼保護性 胜肽14 Arg之去氧核_核酸序列CGG已被AAG取代的基因之 質體PGKSPH34之標的株被選取。嵌合型蛋白質之包含體以 與實例5相同方法獲得。其與Kex2-660進行反應。結果發 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 __ B7_ 五、發明k明(31) 現,該前述取代大體上完全抑制了保護性胜肽之切割,減 輕了加在純化過程的負擔。 實例10 嵌合型蛋白質/5〇31-117!^4[^[^[134之大量生成 及hPTH (1-34)之生成 在該實例中,進行在被認為於試管平階段最適宜作為 Kex2-660受質之大量培養條件下嵌合型蛋白質Gal -117KS4HRHPH34 之生成、藉 Kex2-660 切割,以及 hPTH (1 -3 4)之純化。 PGKSPH34被用於將大腸桿菌M25菌株轉形為具四璟素 抵抗性以獲取抗四環素株,繼而製備一生成菌株 M25[pGKSPH34]。該 M25[pGKSPH34]_ 株被大量培養於一含 有2¾ U/v)M萄糖的NU1合成培養基。 葡萄糖之消耗後,甘油被作為磺來源供給之。培養在 酸鹼值調節至7.0下進行24小時,該最終細胞濃度為150至 200 0D。在大量培養條件下此嵌合型蛋白質穩定的生成, / 不論其高水準表現,並未見該寄主大腸桿菌之生長之明顯 抑制。包含體生成之量約5g/L。細胞粉碎後,不溶物以TE 與去離子水洗去以製備一純化之包含體。 該包含體以尿素溶解並稀釋以提供一 20mM Tr i s/HC 1 (pH8.2)、50mM NaCl、2·5πιΜ CaCl2、2·7Μ 尿素與 8.0mg/ m 1嵌合型蛋白質之反應溶液成份。在30 °C之反應溫度下v 加入Kex2-660至5k(J/nil之濃度以自該嵌合型蛋白質切割hP ΤΗ (1-34),該hPTH (1-34)之生成被定量。結果該反應開 始30分鐘後,切割百分率達90¾以上,相較於/3 Gal-117S4 -34 - (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 一 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明説明(32) HPH34其Kex2-660之量被降低至1/4。 反應結束後,hPTH (1-34)被以與實例5相同的方式純化之。純化程序内之回 收大體與實例5相同。 實例11 /3 GaI-117S4HGP生成質體PG117S4HGP之製備 一生成一含有一人類類升_激素(glucagon)胜肽I (hGLP-1 (7-37))的嵌合型蛋白質(/3 Ga卜117S4HGP)之質 體PG117S4HGP被依後述程序構建。首先,第14(a)圖所示 之四段去氧核醣核酸(GLP-1 (序列辨識碼:43)、GLP-2 (序列辨識碼:44)、GLP-3 (序列辨識碼:45)與GLP-4 (序 列辨識碼:46))被合成。此等去氧核醣核酸於5 f -端被T4 聚核苷酸激酶磷酸化,互相混合並黏結以製備一 hGLP-1(7-37)基因(DNA(l))。另一方面,第14(b)圖所示之二 段合成去氧核醣核酸(117S4H SphI引子(序列辨識碼:47) 與117S4H Bglll引子(序列辨識碼:48))被作為PCR之引子 而進行PCR傺以PGKSPH34為模版。産生的PCR産物以Bglll 與& hi以製備一具有Bglll與SphI黏著端(sticky ends)之 去氧核_核酸片段(DNA (11))。 然後,PGKSPH34以Bgll與SphI消化,在1%瓊脂膠體上 電泳以回收一較大的去氯核醣核酸片段(DMA (111))。如此 獲得的DHA(I)、DNA(II)與DNA(III)藉T4去氧核_核酸接 合酶以製備PG117S4HGP(第15圖)。 實例12 嵌合型蛋白質/3 Ga卜117S4HGP之生成 含有前述製備的PG117S4HGP之大腸捍菌W3110M25菌株 在32 °C及酸鹼值7.0之條件下被培養於一含1 · 0¾¾萄糖、 - 35 一 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 五、發明叙明(33 ) 4g/L K2HP〇4 、 4g/L 〇2P〇4 、 2.7g/L Na2HP〇4 、 0.2g/L NHiCl、1.2g/l (NH4)2S04、4g/l 酵母萃取物、2g/l L-甲硫胺酸、2g/l MgS〇4 * 7H2〇 - 40mg/l CaCls * 2H2〇 ^ 40mg/l FeSCU · 7H2〇、lOmg MnSO 4 · nH 2 0 ^ lOmg/1 AICI3 · H2O、 4mg/l C0CI2 · 6H2〇、 2mg/l ZnSCU · 7H2〇、 2mg/l NS12M0CU · 2H2O、lmg/1 CuCl2 · 2H2〇、0.5mg/l H 3 BO 4及lOmg/Ι四環素之培養基。®萄糖祜竭後,甘油被 用作碳來源,在37°C繼續培養8小時以在細菌内生成 /3 Ga卜117S4HGP之包含體。培養結束後,該培養物藉 Manton-Gaulline均質機(model 15M-8TA,Manton-Gaulline製造)在600 KG/cm2被均質化並離心以回收一沉 澱分離部份。該沉澱物以與該培養物等量之一緩衝液 (lOroM Tris-HCl(pH δ·0),ImM EDTA)懸浮,再次藉離心 回收並以與該培養物等量之去離子水懸浮。其後,再次離 心以回收該沉澱物,隨後以與該沉澱物等量之去離子水懸 浮以用接下來之方法。 實例13 由嵌合型蛋白質上切下hGLP-1 (7-37) 實例12中製備的該嵌合型蛋白質包含體被回收,溶解 於8M尿素,並稀釋以提供一反應成份(20inM Tris/HCl (ρΗ8·2)、100mM NaH、3·0Μ尿素、2·0ιβΜ CaClrS8mg/ml 嵌合型蛋白質)。接著加入Kex2-660至一最終濃度 10,000 U/ml以切割hGLP-1 (7-37)。在此等條件下歷時一 小時,作為對照組之冷Ga卜117S4HGP有90%以上被切割。 實例14 hGLP-1 (7-37)之分離(第16圖,表3.) 36 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 衣· 訂 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明說明(34) 為大量生成該已發現具高生成率且適宜作為((ex2-660 受質之嵌合型蛋白質/3 Ga卜117S4HGP,將編碼此嵌合型蛋 白質之質體轉形大腸桿菌M25菌株(W3110/omPT),接著被 培養於一 20L培養桶内。該培養基含有20g/L酵母萃取物、 10g/L 細菌蛋白腺、12g/L K2HP〇4、3g/L 〇2P〇4 及 5g/L 甘 油。當該細胞濃度達0D660為1.0時,加入IPTG (異丙基 /3 -硫化半乳糖苷)至最終濃度lmM。一抗發泡劑 (DISFOAM CC-222 Nippon Oil & FatsCo·, Ltd.製造)被 使用。該培養於37°C繼續進行至該細胞濃度達0Dsflfl為12 。該細胞被收集並懸浮於TE (lOmMIVis/HCl,ImM EDTA (Ρ Η 8.0))中該懸浮物接受一高壓均質(M a n t ο η - G a u 1 i η)以 粉碎細胞。均質物經離心以獲得含嵌合型蛋白質之沉澱物 ,其隨後以TE與去離子水洗滌。由20L培養可獲得約100g 含嵌合型蛋白質之包含體。250ml該包含體(160g/L)之懸 浮物被加入 100ml 1M Tris/HCl (ρΗ8·2)、50ml 5M NaCl、 '500ml去離子水與900g尿素,將該混合物置於一保持30 °C 之恆溫室内攪拌30分鐘以使該成份溶解,其後於30 °C以溫 的去離子水稀釋至5L。攪拌時緩緩加入50ml 250mM CaCl2 溶液,再加入1^乂2-6(50至20,000 11/1111(約4.0111§几)。加 入Kex2-660二小時後(切割百分率:不低於90¾),藉醋酸 之添加將酸鹼值調整至6 · 4,隨後藉去離子水進行二倍稀 釋以凝結及沉澱未反應之嵌合型蛋白質及保護性胜呔°離 心以獲得一含hGLP-1 (7-37)之上清液。該上清液藉醋酸 之添加將酸鹼值調整至5.0並通過一用2M尿素/lOmM醋酸鈉 -37 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210Χ 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 裝· 訂 480270 A7 B7 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 i、發明説明(35 ) 缓衝液(ρΗ5·0)平衡之陽離子交換樹脂(SP Toyopearl)管 柱以吸附hGLP-1 (7-37),繼而以一2M尿素/ΙΟπιΜ醋酸鈉 缓衝液(pH6 · 2)洗滌及以由〇 Μ至300mM之氯化鈉密度梯度 進行hGLP-1 (7-37)之洗脫。預先將醋酸盛於分離試管 (fraction tube)内提供一 3%之最終濃度以避免hGLP-1 (7-37)之凝結。一含有hGLP-1 (7-37)之分離部份被收集 並通過一用5%醋酸平衡之低壓反相管柱(Soken ODS-tf)吸 附hGLP-1 (7-37),繼而以一含5¾醋酸之50¾乙睛溶液進行 hGLP-1(7-37)之洗脫。乙腈在低壓下被去除,該殘餘物經 一0.22-um膜濾器過濾並冷凍乾燥之。 hGLP-1 (7-37)之定量將被詳述。一含有hGLP-1 (7-37)之溶液接受一試樣緩衝液(1M醋酸鹽/2M尿素)10至 20倍稀釋,該稀釋溶液被離心以獲得一上清液。該上清液 隨後加到已銜接 YMC-C8-A302 (4.6mm I,D. X 150mm)管柱 (Κ· Κ· Yamamura Kagaku Kenkyujo製造.)之 HPLC (LC10A Shimadzii Seisakusho Ltd·製造),接著利用 A 液(0.1¾ TFA/10%乙腈)與B液(0.09 4% TFA/60%乙腈),而以梯度B 40%—80%/20分鐘通經該管柱。該hGLP_l (7-37)之量傺 以hGLP-1 (7-37)該尖峰面積與具已知濃度之標準hGLP-1 (7-37)的尖峰面積之比率決定之該等尖峰藉決定在220nm 之吸收度被檢測。該回收見於表3。 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 袈_ 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 經濟部中央標隼局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(36) 表3 步驟 容積/ Π ] hGLP-1/ [g] 回收/U] 與Kex2_660反應 4.0 4.8 100 獲得自酸沉澱之上清液 7.8 3.3 68 陽離子交換管柱 0.5 2.8 60 低壓逆相管柱 2.8 40 序列明細表 序列辨識號碼第1號 序列長度:40 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
AATTCATGAA ATCTGTTAAA AAGCGTTCTG TTTCTGAAAT 序列辨識號碼第2號 序列長度:41 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列
TCAGCTGATG CATAACCTGG GCAAACACCT GAATAGCATG G 39 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明k明(37) 序列辨識號碼第3號 序列長度:41 序列類型:核酸 股數(strandedness) ··單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y) ··線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 AACGCGTCGA GTGGCTGCGT AAGAAACTGC AGGACGTCCA C 序列辨識號碼第4號 序列長度:41 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t q ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 AACTTCGTTG CGCTGGGTGC ACCGCTGGCT CCACGTGATG C 序列辨識號碼第5號 序列長度:39 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
AGGATCCCAA CGTCCGCGTA AGAAAGAAGA TAACGTACT ~ 40 - 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) -- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 、?τ 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明k明(38) 序列辨識號碼第6號 序列長度:40 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列
GGTTGAATCT CATGAGAAAT CCCTGGGCGA AGCTGACAAA 序列辨識號碼第7號 序列長度:40 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 GCCGATGTTA ACGTGCTGAC CAAAGCGAAA AGCCAGTAAG 序列辨識號碼第8號 序列長度:33 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
TCGACTTACT GGCTTTTCGC TTTGGTCAGC ACG 41 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
A7 B7五、發明說明(39) 序列辨識號碼第9號 序列長度:40 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核Si核酸 序列 TTAACATCGG CTTTGTCAGC TTCGCCCAGG GATTTCTCAT 序列辨識號碼第10號 序列長度:40 序列類型:核酸 股數(s t r a n d e d n e s s):單股 形態(t q ρ ο 1 o g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 GAGATTCAAC CAGTACGTTA TCTTCTTTCT TACGCGGACG 序列辨識號碼第11號 序列長度:41 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 TTGGGATCCT GCATCACGTG GAGCCAGCGG TGCACCCAGC G (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 装- 訂 42 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7 五、發明説明(40 ) 序列辨識號碼第12號 序列長度:41 序列類型:核酸 股數(s t r a n d e d n e s s ):單股 形態(t ο p ο 1 o g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 CAACGAAGTT GTGGACGTCC TGCAGTTTCT TACGCAGCCA C 序列辨識號碼第13號 序列長度:41 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο.ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氣核_核酸 序列
TCGACGCGTT CCATGCTATT CAGGTGTTTG CCCAGGTTAT G 序列辨識號碼第14號 序列長度:46 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y:):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列
CATCAGCTGA ATTTCAGAAA CAGAACGCTT TTTAA CAGAT TTCATG 43 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210 X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明(41 ) 序列辨識號碼第15號 序列長度:24 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 TCGAGGTCGA CGGTACCGAG CTCG 序列辨識號碼第16號 序列長度:24 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 AATTCGAGCT CGGTACCGTC GACC 序列辨識號碼第17號 序列長度:45 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
AAACTGCAGG ACGTCCACAA CTTCTAAGCG CTGGGTGCAC CGCGT -44 — 本纸張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明(42) 序列辨識號碼第1δ號 序列長度:24 序列類型:核酸 股數(s t r a n d e d n e s s ):單股 形態(t ο p ο 1 o g y ) ··線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 CATTAAAGCT TTGCGATGAT AAGC 序列辨識號碼第19號 序列長度:26 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 'CGCACCGATC GCCCTTCCCA ACAGTT 序列辨識號碼第20號 序列長度:35 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
TTTCCCGGGC CTCCGTGGGA ACAAACGGCG GATTG -45 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) _裝_
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明铣明(43 ) 序列辨識號碼第21號 序列長度:42 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 TTTC.CCGGGA GGCCTTCTGT TAAAAAGCGG TCTGTTTCTG AA 序列辨識號碼第22號 序列長度:18 ' 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t q ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 CACCATCATC ACCCTGGA 序列辨識號碼第23號 序列長度:18 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
TCCAGGGTGA TGATGGTG -46 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明(44 ) 序列辨識號碼第24號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 CACCACCATC ATCCTGGACA CCATCATCAC CCTGGA 序列辨識號碼第25號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο I 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 TCCAGGGTGA TGATGGTGTC CAGGATGATG GTGGTG 序列辨識號碼第26號 序列長度:18 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y) ··線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
AAGAAGAAGA AGCCTGGA 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明(45 ) 序列辨識號碼第27號 序列長度:18 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 TCCG.GACTTC TTCTTCTT 序列辨識號碼第28號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTNCAAA GCTTTCTGTT TCTGAA 序列辨識號碼第29號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(s t r a n d e d n e s s ) ··單股 形態(t ο ρ ο I o g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTNATAA GCTTTCTGTT TCTGAA -48 一 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 s一 __ 五、發明説明(46 ) 序列辨識號碼第30號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y) ··線性 分子類型:合成去氯核_核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTNTTAA GCTTTCTGTT TCTGAA 序列辨識號碼第31號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 GGGAGGCCTT CTGTTBGGAA GCTTTCTGTT TCTGAA 序列辨識號碼第32號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列
GGGAGGCCTT CTGTTSAAAA GCTTTCTGTT TCTGAA (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
49 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS )八4規格(210X 297公慶) 480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製
A7 B7五、發明説明(47 ) 序列辨識號碼第33號 序列長度:33 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 GGGAGGCCTT CTADTCATAA GCTTTCTGTT TCT 序列辨識號碼第34號 序列長度:33 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 GGGAGGCCTT CTAHGCATAA GCTTTCTGTT TCT 序列辨識號碼第35號 序列長度:33 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氯核醣核酸 序列 GGGAGGCCTT CTGHGCATAA GCTTTCTGTT TCT (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝_ 訂 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明k明(48 ) 序列辨識號碼第36號 序列長度:33 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο i 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 GGGAGGCCTT CTTKKCATAA GCTTTCTGTT TCT 序列辨識號碼第37號 序列長度:34 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氣核_核酸 序列
GGGAGGCCTT CTCVACATAA GCTTTCTGTT TCTG 序列辨識號碼第38號 序列長度:34 序列類型:核酸 股數(s t r a n d e d n e s s) ··單股 形態(t ο ρ ο 1 o g y) ··線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列
GGGAGGCCTT CTBATCATAA GCTTTCTGTT TCTG -51 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
480270 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 A7 B7五、發明説明(49 ) 序列辨識號碼第39號 序列長度:27 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 AATTAATGTG AGTTAGCTCA CCATTAG 序列辨識號碼第40號 序列長度:24 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 ATCCCAGTCT TTAGCTTGTA AAAC 序列辨識號碼第41號 序列長度:24 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 GTTTTACAAC GTAAAGACTG GGAT -52 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) m ^m-i —an.— 1_>1 ai·—^ 11__1 Hal - a— - emir lmaMaa§ --裝-- (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂
-Λ— I 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明說明(50 ) 序列辨識號碼第42號 序列長度:31 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο I 〇 g y):線性 分子類型:合成去氣核醣核酸 序列 TTTAGATCTG ACTCCAGCAA GCTGTCCGGC A 序列辨識號碼第43號 序列長度:57 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y):線性 分子類型:合成去氧核_核酸 序列 CGGAAGGTAC CTTTACCAGC GATGTGAGCT CGTATCTGGA AGGTCAGGCG GCAAAG 序列辨識號碼第44號 序列長度:48 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 -53 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁)
經濟部中央標準局員工消費合作社印製 480270 A7 B7 五、發明説明(51 )
ACCTTCCAGA TACGAGCTCA CATCGCTGGT AAAGGTACCT TCCTGCATG 序列辨識號碼第45號 序列長度:36 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 AATTCATCGC GTGGCTGGTG AAAGGCCGTG GTTAAG 序列辨識號碼第46號 序列長度:53 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(t ο ρ ο 1 〇 g y ):線性 分子類型:合成去氧核醏核酸 序列
TCGACTTAAC CACGGCCTTT CACCAGCCAC
GCGATGAATT CTTTTGCCGC CTG 序列辨識號碼第47號 序列長度:38 序列類型:核酸 股數(s t r a n d e d n e s s ):單股 形態(t ο ρ ο 1 o g y ):線性 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁)
54 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X 297公釐) 480270 A7 B7 五、發明説明(52 ) 分子類型:合成去氧核醣核酸 序列 TGAATTTCAG AAGCATGCCG CTTATGTCGA GAAGGCCT 序列辨識號碼第48號 序列長度:24 序列類型:核酸 股數(strandedness):單股 形態(topo 1 ogy):線性 分子類型:合成去氧核醏核酸 序列
GACTCAGATC TTCCTGAGGC CGAT (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) >裝-
、1T 經濟部中央標準局員工消費合作社印製 -55 - 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) Α4規格(210X 297公釐)

Claims (1)

  1. 89^ 480270 申請專利範圍 « A8修Us! 補
    Ί 本 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 第086102706號專利申請案申請專利範圍修正本 修正日期:89年7月 1· 一種具有下述通式之嵌合型蛋白質: A - L - B 其中A係為一種保護性胜肽;b係為一標的蛋白質;以 及L係為一聯結性胜肽,其具有Xi_x:r(Pr〇、Lys或 Arg)-Arg之序列位於其c-端區域與一富含His之領域 位於其N-端區域,其中乂〗可為除了 Asp與Glu以外的任 何胺基酸,而X2可為除了 Pro以外的任何胺基酸。 2·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質,其中該位於 端區域之富含His之領域具有序列:[(His)4_Pro-Gly]n其 中η可為1至6。 3.如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質,其中於該Ν•端 區域的胺基酸序列與該C-端序列的胺基酸序列之間存 在有任意1至5個胺基酸。 4·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質,其中於該C-端 區域内,Xi係為Arg、Lys或是His,且Χ2係為His或是 Phe 〇 5·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質,其中a係代表 一不含有下列胺基酸序列的多胜肽:Pro-Arg、Arg-Arg 以及 Lys-Arg 〇 6·如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質,其中當A代表 一含有下述胺基酸序列的多胜肽時:Pro-Arg、Arg-Arg 或Lys-Arg,至少一位在該胺基酸序列中的胺基酸 已 (請先閱讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 0 本紙張尺度適用中國國家標準(CNS ) A4規格(210X297公釐) 480270 申請專利範圍 為一不同的胺基酸所取代,以使A不含有該胺基酸序 列。 7·如申睛專利範圍第1項之欲合型蛋白質,其中a代表一 不具有超過220個胺基酸殘基的多胜肽。 8·如申請專利範圍第7項之嵌合型蛋白質,其中a係代表 具有位在源自於大腸桿菌之β_半乳糖苷峰之端上 的胺基酸1-97、1-117或1-139之胜肽。 9·如申請專利範圍第丨項之嵌合型蛋白質,其中位在八中 的任何半胱胺酸殘基已為一不同的胺基酸所取代。 1〇·如申請專利範圍第9項之嵌合型蛋白質,其中該不同的 胺基酸係為一絲胺酸。 U•如申請專利範圍第1項之嵌合型蛋白質,其中B代表一 人類Μ甲狀腺激素或是一具有人類副甲狀腺激素生物 活性的衍生物。 12·如申請專利範圍第η項之嵌合型蛋白質,其中該人類 田1J甲狀腺激素衍生物包含有一源自位在天然發生的人 類副甲狀腺素之Ν-端的第1或3至31、34、37、38或84 個的胺基酸殘基的片段,或一包含該等胺基酸殘基並 另於C -端被加有Gly的片段。 13.如申請專利範圍第丨項之嵌合型蛋白質,其中b係代表 類升血糖胜肽1或是具有類升血糖胜肽丨生物活性之衍 生物。 14· 一種用以生成如申請專利範圍第丨至^項中任一項之嵌 合型蛋白質的方法,其包含下列步驟:以一含有編碼 t ( CNS ) A4^' ( 210X297^ (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) 訂 #. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製 48U270
    申請專利範圍 該嵌合型蛋白之DNA的表現載體來轉型一宿主細胞; 培養所形成之轉型株;以及由培養物中收獲該嵌合型 蛋白質。 15. —種用以生成一標的胜肽的方法,其中令一加工酵 素作用於如申請專利範圍第1至13項中任一項之嵌合型 蛋白質’俾切割介於聯結胜肽(L)之C-端與標的胜肽(B) 之N-端之間的胜肽鍵,以獲得該標的胜肽。 16·如申請專利範圍第15項之方法,其中該加工酵素係擇 自於下列群組中之一者:Kex2蛋白酶、芙琳(furin)、 别激素轉化酶1/3 (PC1/3)、前激素轉化酶2 (PC2),以 及具有該等加工酵素之酵素活性的衍生物。 17·如申請專利範圍第15項的方法,其中該標的胜肽⑺)係 藉由等電位沉澱法來回收。 (請先閲讀背面之注意事項再填寫本頁) i. 經濟部智慧財產局員工消費合作社印製
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Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2284847A1 (en) * 1998-01-30 1999-08-05 Suntory Limited Process for producing peptides using a helper peptide
CN1170932C (zh) * 1998-07-10 2004-10-13 赛欧斯公司 生产等电点高于8或低于5的多肽的方法
PT1197496E (pt) 1999-07-23 2007-08-29 Kenji Kangawa Novos péptidos
EP1234038A1 (en) * 1999-11-19 2002-08-28 Transkaryotic Therapies, Inc. Nucleic acid construct for optimized production of products
US6730306B1 (en) * 2000-03-08 2004-05-04 Large Scale Biology Corporation Parvovirus vaccine as viral coat protein fusions
CA2472235C (en) 2002-04-11 2012-05-22 Daiichi Suntory Pharma Co., Ltd. A method for producing a modified peptide
GB0308734D0 (en) * 2003-04-15 2003-05-21 Axcess Ltd Uptake of macromolecules
GB0308732D0 (en) * 2003-04-15 2003-05-21 Axcess Ltd Absorption enhancers
JP6817939B2 (ja) 2014-12-01 2021-01-20 フェネックス インク. ペプチド産生のための融合パートナー
CN110305223B (zh) * 2019-06-26 2022-05-13 重庆派金生物科技有限公司 重组串联融合蛋白制备目标多肽的方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS60217894A (ja) * 1984-04-14 1985-10-31 Suntory Ltd 新規プロテア−ゼ及びその製造方法
RU2091490C1 (ru) * 1985-10-25 1997-09-27 Зимодженетикс, Инк. Способ получения гетерологичного полипептида в эукариотических микроорганизмов
DE3805150A1 (de) * 1987-04-11 1988-10-20 Hoechst Ag Gentechnologisches verfahren zur herstellung von polypeptiden
DE3725320A1 (de) * 1987-07-30 1989-02-09 Biotechnolog Forschung Gmbh Expressionsvektoren und verfahren unter deren verwendung zur gewinnung von cro/ss-galaktosidase/pth-fusionsproteinen und von pth
JPH07108232B2 (ja) * 1990-10-09 1995-11-22 エム・ディ・リサーチ株式会社 ペプチド又は蛋白質の製造方法
JPH05328492A (ja) * 1992-05-21 1993-12-10 Matsushita Electric Ind Co Ltd スピーカ用ダンパー
CA2198968C (en) * 1996-03-04 2010-02-09 Toyofumi Masuda Process for production of secretory kex2 derivatives

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