JP4638223B2 - ポリペプチド切断方法 - Google Patents
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Description
(ポリペプチドは、本明細書中にてアミノ酸略号で表記され、N末端アミノ酸が左側、C末端アミノ酸が右側で左から右へ記載され、例えばNH2-Ala-Ala-Cys-His-Gly-Gly-Gly-COOH (配列番号:6)と記載される。)
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:1)前駆体ペプチドの発現:
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:1)は、以下のように大腸菌中で組換え的に発現される。リーダー-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:23)ポリペプチド(図7)をコードする発現プラスミドを含む大腸菌を、トリプトン、酵母、グルコース、バッチ塩類(ナトリウムおよびカリウム、モノリン酸塩およびジリン酸塩、ならびに硫酸アンモニウム)および抗生物質を含む500mLの振とうフラスコで増殖させた。植菌した振とうフラスコを回転振とうした(200rpm、37℃)。培養液が540nmで0.8〜1.8の吸光度(OD)に達した時点でインキュベーションを終了した。
封入体、T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:1)前駆体ペプチドの単離:
生じた発酵槽の細胞を遠心により発酵ブロスから採取した。細胞ペレットを集め、溶菌緩衝液(lysis buffer)(993gの水に6g トリス遊離塩基と0.93g EDTA)の適量(例えば、5Lの発酵槽由来の物質に対し2Lの溶菌緩衝液)に再懸濁し、高圧ホモジナイザー中で溶解した。
パラジウム酸切断プロモーターの調製:
以下の化学物質の略号を本明細書にて用いた:en=エチレンジアミン;pic=ピコリルアミン(または2-アミノメチルピリジン);aep=2(2-アミノエチル)ピリジン;dien=ジエチレントリアミン。
Na2PdCl4およびK2PdCl4は、Aldrich Chemical Co.とStrem Chemical Co.から購入した。
テトラクロロパラジウム酸の固形試料を適当な水性溶媒中に溶解し、約250mM濃度にした。その後、一部を反応混合液により適切な濃度まで希釈した。溶媒を、検討中の反応の酸性溶液と同様になるように選択した。
分析方法:
以下の分析方法および装置を用いた。
HPLC 方法1:
Microsorb-MV Cyano-C8 100 Å、5μm、4.6×150 mmカラムを用いる、逆相クロマトグラフィー(Catalog #R0086800D5)。
移動相系は以下の通りであった。A=5%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸;B=95%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸。
封入体試料を定量するために用いた勾配は、以下の通りであった(t=0、時間):10〜100%B (10.8分)、100%B (0.6分)、100〜10%B (0.6分);流速1 mL/分;室温。
クエンチした反応を分析するための勾配は、以下の通りであった: 20〜30%B (3分)、30〜40%B (6分)、40〜100%B (1.5分)、100〜20%B (0.6分)、20%B (3分);流速1mL/分;30℃。
吸光度を210−320nmで測定した。
Waters Symmetry C18、100 Å、3.5μm、4.6×150 mmカラムを用いた逆相HPLC。移動相系は以下の通りであった:A=5%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸;B=95%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸。勾配は、25〜33%B(24 分)、33〜60%B(6 分)、60〜90%B(1分)、90〜25%B(0.5 分)、25%B(4 分);流速1mL/分;40℃。吸光度を210−320nmで測定した。
Waters Symmetry C18カラム、100Å、3.55μm、2.1×150 mmカラムを用いる、LC/MS法。移動相系は以下の通りであった:A=10%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸;B=60%(v/v)アセトニトリル、0.1%(v/v)トリフルオロ酢酸。勾配は、20〜30%B(1分)、30〜50%B(25 分)、50〜100%B(4分)、100〜20%B(1 分)、20%B (7 分);流速0.25 mL/分;40℃。吸光度を210〜320nmで測定した。LCQ Duo MS検出器を、7〜19分と24〜30分の間、ソースに設定した。走査(scan)を、700−2000 m/zユニットに設定し行った。
クエン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala(配列番号:2)のPdにより促進される加水分解的切断:
T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala (配列番号:2)前駆体ペプチド(図6)を実施例1に記載した手順で調製し、封入体を実施例2のように単離し、封入体1g(湿潤重量)を3M クエン酸50mLに溶解した(ペプチド濃度3mg/mL)。その溶液を等量の2液に分け、それぞれにテトラクロロパラジウム酸を付加し、5.56mM濃度とした。一方の溶液に11mM エチレンジアミンを付加した。その溶液を60℃で5時間インキュベートし、一部を1時間毎に採取し、クエンチし、実施例4の方法1を用いるHPLCにより分析した。結果を、GRF(1-44)-Alaの理論的最大予想収率(maximum theoretically expected yield)に対する割合として表1に示した。
表1:エチレンジアミンの有無にて、クエン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-Ala (配列番号:2)を用いた、テトラクロロパラジウム酸の反応の時間コース
3Mクエン酸、3M 酒石酸、3M マレイン酸、3M マロン酸、3M リンゴ酸および80%ピルビン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:1)のテトラクロロパラジウム酸により促進される加水分解的切断
マロン酸および酒石酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:1)のテトラクロロパラジウム酸により促進される加水分解的切断における温度の効果
マロン酸および酒石酸中におけるテトラクロロパラジウム酸切断をさらに検討するために実験マトリクスを設計した。マトリクスを以下のように調製した: 5M マロン酸と4mM テトラクロロパラジウム酸、それぞれ50℃および60℃。3M 酒石酸に対し、4mM テトラクロロパラジウム酸を用いた。試料をddtc処理し、実施例4の方法2および3を用いて分析した。図3は50℃と比較し、60℃の試料がかなり早く切断したことを示す。マロン酸は、2時間以内に約55%の最大切断率に達した。同様の結果が酒石酸で見られたが、収率はかなり低かった。より低温での反応は速度が遅く、有効収率を達するために実用的でない。
マロン酸中T7tag-Vg-D4K-CH-GRF(1-44)-CH (配列番号:1)の切断のためのテトラクロロパラジウム酸およびマロン酸濃度の最適化
マロン酸とテトラクロロパラジウム酸両方の濃度の効果を測定するためにマトリクスを設計した。それぞれの反応を約5mg/mLの構築物にて行った。マロン酸シリーズは、2、3、4、5および6M マロン酸と共に、5mM テトラクロロパラジウム酸および10mM エチレンジアミンを含む。第二のシリーズは、それぞれ6M マロン酸と、2、3、5および10mM テトラクロロパラジウム酸および4、6、10ならびに20mM エチレンジアミン中で行った。反応液を、60℃で2、4、6および18時間の時間点で採取した。それぞれの時間点を、8M 尿素、20mM ddtcおよびTCEPで10倍に希釈した。分析は、実施例4の方法1を用いた。図4は、至適マロン酸濃度が5Mであることを示し、図5は、3〜5mM テトラクロロパラジウム酸が同等であり高収率を供することを示す。
T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号:3)の生産
実施例1に記載の方法を用い、PTH(1-34)をコードするDNAを、バクテリア発現ベクターにおけるリーダー配列、T7tag-Vg-G5PR (配列番号:8)の下流にクローンし、T7tag-Vg- G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号:3)を作製した。基本的に実施例2のGRF(1-44)-CHの生産に関して記載したようにして、発現構築物で形質転換した大腸菌より、封入体調製液を得た。沈殿した封入体を水に懸濁し超音波処理して洗浄し、遠心してペレットを得た。
テトラクロロパラジウム酸によるT7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号:3)の切断
実施例9からのペレットを、表1に示したようにクエン酸とパラジウム酸複合体の混合液中に6mg/mLの濃度で溶解した。
溶液を、60℃〜70℃の温度で表2に示した時間インキュベートした。以下に示したように、反応液はさらに、テトラクロロパラジウム酸より約2倍モル過剰に付加した物質を含み、産物PTH(1-34)の収率に影響し得るかどうかを測定した。規定のインキュベーション時間後、反応液を0.2mM HCl中に1:10に希釈し、16時間室温で保存した。その後、混合液を2mM チオシアン酸カリウムで処理し、未反応のPd複合体と封入体を沈殿させた。
表2:T7tag-Vg-G5PR-CH-PTH(1-34) (配列番号:3)のテトラクロロパラジウム酸により促進された切断によるPTH (1-34)の収率
T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84) (配列番号:4)の生産
PTH(1-84)をコードするDNAを、実施例1に開示の技術を用いて、バクテリア発現ベクター中のリーダー配列T7tag-Vg-D4K(配列番号:9)の下流にクローンし、T7tag-Vg-D4K-CH-PTH(1-84)(配列番号:4)を作製した。全細胞調製液を、基本的に実施例1のGRF(1-44)-CHの生産に関する上述のように発現構築物で形質転換した大腸菌から得た。全細胞を遠心により集め、凍結保存した。少量の液を超音波処理により細胞を破壊して調べた時、前駆体ペプチドは封入体と上清液の間に分布していた。
Claims (66)
- パラジウム複合体により促進される加水分解的ポリペプチド切断方法であって、酢酸、プロピオン酸、酪酸、ピルビン酸、乳酸、酒石酸、クエン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マレイン酸、マロン酸、フマル酸、グルタル酸、アジピン酸、コハク酸、ピメリン酸、トリカルバリル酸、グルクロン酸、グルコン酸および糖酸からなる群から選択される、反応混合液中の濃度が1〜22モルである有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム複合体を含む反応混合液中にポリペプチドを可溶化することを含む、ヒスチジン残基とC末端側でヒスチジンに直接隣接する残基との間のカルボキシアミド結合で起こる切断にて、ポリペプチドをCys-His切断部位で選択的に切断する方法。
- ポリペプチドが、封入体の形態で組換え的に発現されるキメラタンパク質であって、反応混合液中封入体に対するパラジウム複合体のモル比が2:1〜20:1である、請求項1に記載の方法。
- 反応混合液の温度が50℃〜70℃に維持されている、請求項1または2に記載の方法。
- 切断反応を1〜6時間続行させる、請求項1、2または3に記載の方法。
- キメラタンパク質が、切断部位のCysに隣接するリンカーを含む、請求項2に記載の方法。
- リンカーが、DDDD(配列番号:10)、DDDK(配列番号:11)、DTRL(配列番号:12)およびGGPR(配列番号:13)からなる群から選択される、請求項5に記載の方法。
- 有機酸溶媒が、エチレンジアミン;プロピレンジアミン;2-アミノメチルピリジン;2(2-アミノエチル)ピリジン;2(2-メチルアミノエチル)ピリジン;2,2’−ビピリジル;1,10-フェナントロリン:3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン;3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン;3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール;1,2-ジフェニルホスフィンエタン;トリフェニルホスフィン;ジフェニルホスフィンフェロセン;および、ジエチレントリアミンからなる群から選択されるリガンドを有する1つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項1または2に記載の方法。
- パラジウム複合体が、Na2PdCl4;シス−[Pd(en)Cl2];シス−[Pd(bp)Cl2];シス−[Pd(phen)Cl2];シス−[Pd(pn)Cl2];シス−[Pd(pic)Cl2];シス−[Pd(dtco-OH)Cl2;シス−[Pd(en)(OH2)2]2+;シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+;シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+;シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+;シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+;シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項1または2に記載の方法。
- キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項2に記載の方法。
- ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の方法。
- ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:3または配列番号:4のアミノ酸配列を有する、請求項9に記載の方法。
- 有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項1または2に記載の方法。
- 有機溶媒がマロン酸である、請求項1、2または9に記載の方法。
- 有機溶媒が5Mマロン酸または6Mマロン酸であって、パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸塩である、請求項9に記載の方法。
- パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸塩であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸塩のモル比が10:1である、請求項1、2、9または14に記載の方法。
- キメラタンパク質が配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項14に記載の方法。
- 有機溶媒がクエン酸である、請求項11に記載の方法。
- キメラペプチドが、GLP-1、GLP-2、PTH、GRF、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン5、ゲーグリン6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項2に記載の方法。
- ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドY、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチドまたはインスリンである、請求項2に記載の方法。
- キメラタンパク質が合成的に作製される、請求項18および19に記載の方法。
- キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項18および19に記載の方法。
- キメラタンパク質が大腸菌で組換え的に発現される、請求項21に記載の方法。
- 切断反応の温度が60℃である、請求項1または9に記載の方法。
- クエン酸が3M クエン酸であり、パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸ナトリウムであり、反応混合液がpic(ピコリルアミン)、メチオニンまたはヒスチジンからなる群から選択されるパラジウム酸リガンドを含む、請求項17に記載の方法。
- ペプチド精製方法であって、以下の工程:
(a)酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸、トリカルバリル酸からなる群から選択される、反応混合液中の濃度が1〜22モルである有機酸溶媒中に溶解されたパラジウム複合体を含む反応混合液中にキメラタンパク質を可溶化することにより、Cys-His切断部位で、ヒスチジン残基とC末端側でヒスチジンに直接隣接する残基との間のカルボキシアミド結合で起こる切断にて、ペプチドのN末端と結合されたリーダー配列を含むキメラタンパク質からペプチドを切断し;そして、
(b)限外ろ過、ろ過またはイオン交換クロマトグラフィーにより工程(a)の反応混合液から切断されたペプチドを回収すること
を含む方法。 - 反応混合物中における封入体に対するパラジウム複合体のモル比が2:1〜20:1である、請求項25に記載の方法。
- 反応混合液の温度が50℃〜70℃に維持されている、請求項25または26に記載の方法。
- 切断反応を1〜6時間続行させる、請求項25、26または27に記載の方法。
- 組換えキメラタンパク質が、切断部位のCysに隣接するリンカーを含む、請求項25に記載の方法。
- リンカーが、DDDD(配列番号:10)、DDDK(配列番号:11)、DTRL(配列番号:12)およびGGPR(配列番号:13)からなる群から選択される、請求項29に記載の方法。
- 有機酸溶媒が、エチレンジアミン;プロピレンジアミン;2-アミノメチルピリジン;2(2-アミノエチル)ピリジン;2(2-メチルアミノエチル)ピリジン;2,2’-ビピリジル;1,10-フェナントロリン:3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン;3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン;3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール;1,2-ジフェニルホスフィンエタン;トリフェニルホスフィン;ジフェニルホスフィンフェロセン;および、ジエチレントリアミンから選択されるリガンドを有する1つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項24または25に記載の方法。
- パラジウム複合体が、Na2PdCl4;シス−[Pd(en)Cl2];シス−[Pd(bp)Cl2];シス−[Pd(phen)Cl2];シス−[Pd(pn)Cl2];シス−[Pd(pic)Cl2];シス−[Pd(dtco-OH)Cl2;シス−[Pd(en)(OH2)2]2+;シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+;シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+;シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+;シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+;シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項26に記載の方法。
- キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態で宿主細胞から回収されたものである、請求項26に記載の方法。
- ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項26に記載の方法。
- ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:3のアミノ酸配列を有する、請求項26に記載の方法。
- ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:4のアミノ酸配列を有する、請求項26に記載の方法。
- 有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項26に記載の方法。
- 有機溶媒がマロン酸である、請求項26に記載の方法。
- 有機溶媒が5Mマロン酸または6Mマロン酸であって、パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸塩である、請求項26に記載の方法。
- パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸塩であって、キメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸塩のモル比が10:1である、請求項26に記載の方法。
- キメラタンパク質が配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項26に記載の方法。
- 有機溶媒がクエン酸である、請求項26に記載の方法。
- ペプチドがGLP-1、GLP-2、GRF、PTH、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン 5、ゲーグリン 6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項26に記載の方法。
- ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドY、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチドまたはインスリンである、請求項26に記載の方法。
- キメラタンパク質が合成的に作製される、請求項26に記載の方法。
- キメラタンパク質が、宿主細胞中で組換え的に発現され、封入体の形態にて宿主細胞から回収されたものである、請求項26に記載の方法。
- 宿主細胞が大腸菌である、請求項46に記載の方法。
- 切断反応の温度が60℃である、請求項26に記載の方法。
- クエン酸が3M クエン酸であり、パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸ナトリウムであり、反応混合液がpic、メチオニンまたはヒスチジンからなる群から選択されるパラジウム酸リガンドを含む、請求項26に記載の方法。
- ペプチドを生成する方法であって、以下の工程:
(a)Cys-His切断部位でペプチドのN末端と結合されたリーダー配列を含むキメラタンパク質を宿主細胞中で組換え的に発現し、封入体の形態で宿主細胞からキメラタンパク質を回収し;
(b)酢酸、クエン酸、ジカルボン酸、乳酸、マレイン酸、マロン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、酒石酸およびトリカルバリル酸からなる群から選択される、反応混合液中の濃度が1〜22モルである有機酸溶媒に溶解されたパラジウム複合体を含む反応混合液中に工程(a)で回収した封入体を可溶化することによって、ヒスチジン残基とC末端側でヒスチジンに直接隣接する残基との間のカルボキシアミド結合で起こる切断にて、キメラタンパク質からペプチドを切断し;そして、
(c)限外ろ過、ろ過またはイオン交換クロマトグラフィーによって工程(b)の反応混合液から切断されたペプチドを回収すること
を含む方法。 - 反応混合物中における封入体に対するパラジウム複合体のモル比が2:1〜20:1である、請求項50に記載の方法。
- 反応混合液の温度が50℃〜70℃に維持されている、請求項50に記載の方法。
- 切断反応を1〜6時間続行させる、請求項50に記載の方法。
- 組換えキメラタンパク質が、切断部位のCysに隣接するリンカーを含む、請求項50に記載の方法。
- リンカーが、DDDD(配列番号:10)、DDDK(配列番号:11)、DTRL(配列番号:12)およびGGPR(配列番号:13)からなる群から選択される、請求項54に記載の方法。
- 有機酸溶媒が、エチレンジアミン;プロピレンジアミン;2-アミノメチルピリジン;2(2-アミノエチル)ピリジン;2(2-メチルアミノエチル)ピリジン;2,2’-ビピリジル;1,10-フェナントロリン:3-ヒドロキシ-2(ジメチルアミノメチル)ピリジン;3-ヒドロキシ-1,5-ジチアシクロオクタン;3,6-ジチアオクタン-1,8-ジオール;1,2-ジフェニルホスフィンエタン;トリフェニルホスフィン;ジフェニルホスフィンフェロセン;および、ジエチレントリアミンからなる群から選択されるリガンドを有する1つまたはそれ以上のパラジウム複合体と併用される、請求項51に記載の方法。
- パラジウム複合体が、Na2PdCl4;シス−[Pd(en)Cl2];シス−[Pd(bp)Cl2];シス−[Pd(phen)Cl2];シス−[Pd(pn)Cl2];シス−[Pd(pic)Cl2];シス−[Pd(dtco-OH)Cl2;シス−[Pd(en)(OH2)2]2+;シス−[Pd(pn) (OH2)2]2+;シス−[Pd(pic) (OH2)2]2+;シス−[Pd(bp) (OH2)2]2+;シス−[Pd(phen) (OH2)2]2+;シス−[Pd(dtco-OH) (OH2)2]2+;および、[Pd(OH2)3(OH)](NO3)からなる群から選択されるパラジウム(II)複合体である、請求項51に記載の方法。
- ペプチドがrGRFであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:1のアミノ酸配列を有する、請求項51に記載の方法。
- ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:3のアミノ酸配列を有する、請求項51に記載の方法。
- ペプチドがrPTHであり、宿主細胞が大腸菌であり、キメラタンパク質が配列番号:4のアミノ酸配列を有する、請求項51に記載の方法。
- 有機溶媒が、HCl、H3PO4、H2SO4またはHClO4からなる群から選択される無機酸と併用される、請求項51に記載の方法。
- 有機溶媒がマロン酸である、請求項51に記載の方法。
- 有機溶媒が5Mマロン酸または6Mマロン酸であって、パラジウム複合体がテトラクロロパラジウム酸塩である、請求項62に記載の方法。
- 反応混合物中のキメラタンパク質に対するテトラクロロパラジウム酸塩のモル比が10:1である、請求項63に記載の方法。
- ペプチドがGLP-1、GLP-2、GRF、PTH、副甲状腺ホルモン関連タンパク質、ACTH、エンケファリン、エンドルフィン、エキセンディン、アミリン、多様なオピオイドペプチド、ゲーグリン 5、ゲーグリン 6、ブレビニン1、ラナテリン1〜9からなる群から選択されるラナテリン、エスクレチン、GIP、グルカゴン、モチリン、サイモポエチン、サイモシン、ユビキチン、血清胸腺因子、胸腺液性因子、ニューロテンシンまたはタフトシンである、請求項51に記載の方法。
- ペプチドが、ガストリン、カルシトニン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、膵臓ポリペプチド、エンドセリン、副腎皮質刺激ホルモン放出因子、神経ペプチドY、心房性ナトリウム利尿ペプチド、アミリン、ガラニン、ソマトスタチン、血管作動性小腸ペプチドまたはインスリンである、請求項51に記載の方法。
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