ES2253212T3 - Metodos mejorados para la produccion de peptidos recombinantes. - Google Patents
Metodos mejorados para la produccion de peptidos recombinantes.Info
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Abstract
Un método mejorado para obtener un péptido de células bacterianas después de la expresión dentro de las células de una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende el péptido, una proteína transportadora y un sitio escindible con ácido entre el péptido y la proteína transportadora, caracterizado porque el método comprende tratar las células bacterianas con ácido para romper o lisar las células y liberar el péptido de la proteína de fusión en una única etapa.
Description
Métodos mejorados para la producción de péptidos
recombinantes.
La presente invención se refiere de manera
general a métodos mejorados para la producción de péptidos
recombinantes a partir de células bacterianas.
A pesar de que los péptidos bioactivos se pueden
producir químicamente mediante distintas estrategias de síntesis,
la producción recombinante de péptidos, incluyendo aquellos que
están en el intervalo de tamaño de 5-50 aminoácidos,
ofrece la posibilidad de producción a gran escala a un coste
razonable. Sin embargo, la expresión de cadenas de polipéptidos muy
cortas puede ser a veces problemática en sistemas microbianos,
incluso en células bacterianas tales como la Escherichia
coli. Esto es cierto incluso cuando la secuencia peptídica se
expresa como parte de una proteína de fusión. Como parte de una
proteína de fusión, los péptidos pueden redirigirse a compartimentos
celulares específicos, por ejemplo el citoplasma, el periplasma o
los medios, con el fin de lograr un alto rendimiento de expresión y
evitar los procesos de degradación celular.
La preparación de un péptido a partir de una
proteína de fusión en forma pura requiere que el péptido se libere
y se recupere de la proteína de fusión mediante algún mecanismo y
luego que este se obtenga mediante aislamiento o purificación. Se
han identificado métodos para la escisión de proteínas de fusión.
Cada método reconoce un sitio de escisión químico o enzimático que
une la proteína transportadora a la proteína o péptido deseados
[Forsberg et al., I. J. Protein Chem. 11,
201-211, (1992)]. Los reactivos de escisión química
por lo general reconocen residuos de aminoácidos únicos o pareados
que pueden suceder en múltiples sitios a lo largo de la secuencia
primaria y que por lo tanto, pueden tener una utilidad limitada para
la liberación de péptidos o dominios de proteínas grandes que
contienen múltiples sitios de reconocimiento interno. Sin embargo,
los sitios de reconocimiento para la escisión química pueden ser
útiles en la unión de péptidos cortos y proteínas transportadoras.
Los reactivos de escisión química incluyen el bromuro de cianógeno,
que escinde en residuos metionina [Piers et al., Gene,
134, 7, (1993)],
N-cloro-succinimida [Forsberg et
al., Biofactors 2, 105-112, (1989)] o
BNPS-escatol [Knott et al., Eur. J.
Biochem. 174, 405-410, (1988); Dykes et
al., Eur. J. Biochem. 174, 411-416,
(1988)] que escinde en residuos triptófano, el ácidos diluido que
escinde enlaces aspartilo-prolilo [Gram et
al., Bio/Technology 12, 1017-1023,
(1994); Marcus, Int. J. Peptide Protein Res., 25,
542-546, (1985)], y la hidroxilamida que escinde
enlaces asparagina-glicina a un pH de 9,0 [Moks
et al., Bio/Technology 5,
379-382, (1987)].
Es interesante la Patente de los Estados Unidos
No. 5.851.802 que describe una serie de vectores de expresión de
péptidos recombinantes que codifican secuencias peptídicas derivadas
de una proteína bactericida/incrementadora de la permeabilidad
(BPI, por sus siglas en inglés) unidos en forma de fusión a
secuencias de proteínas transportadoras mediante secuencias de
sitios de escisión de aminoácidos. En algunas construcciones de
proteínas de fusión, se ubicó un enlace
aspartilo-prolilo lábil en presencia de ácido en la
unión entre las secuencias de los péptidoas y de las proteínas
transportadoras. Los péptidos derivados de BPI se liberaron de las
proteínas de fusión mediante el tratamiento con ácido diluido de los
cuerpos de inclusión aislados, sin la previa solubilización de los
cuerpos de inclusión. Los péptidos liberados fueron solubles en el
entorno ácido acuoso. Asimismo, los péptidos derivados de BPI se
obtuvieron a partir de proteínas de fusión en condiciones en las que
las proteínas de fusión se secretaron en el medio de cultivo.
Entonces esas proteínas de fusión secretadas se purificaron y
trataron con ácido diluido para liberar el
péptido.
péptido.
Las divulgaciones de las siguientes referencias,
que tratan de péptidos y proteínas de fusión recombinantes, tienen
un interés adicional.
Shen, Proc. Nat'l. Acad. Sci. (USA), 281,
4627 (1984) describe la expresión bacteriana como cuerpos de
inclusión insolubles de una proteína de fusión que codifica
proinsulina y \beta-galactosidasa; los cuerpos de
inclusión se aislaron en primer lugar y luego se solubilizaron con
ácido fórmico antes de la escisión con bromuro de cianóge-
no.
no.
Kempe et al., Gene, 39, 239 (1985)
describen la expresión como cuerpos de inclusión insolubles en
E. coli de una proteína de fusión que codifica múltiples
unidades de la sustancia P neuropeptídica y
\beta-galactosidasa; los cuerpos de inclusión se
aislaron en primer lugar y luego se solubilizaron con ácido fórmico
antes de la escisión con bromuro de cianógeno.
Lennick et al., Gene, 61, 103
(1987) describen la expresión como cuerpos de inclusión insolubles
en E. coli de una proteína de fusión que codifica múltiples
unidades (8) del péptido natriurético atrial humano de tipo
\alpha; los cuerpos de inclusión se aislaron en primer lugar y
luego se solubilizaron con urea antes de la escisión con
endoproteinasa.
Dykes et al., Eur. J. Biochem.,
174, 411 (1988) describen la expresión intracelular soluble en
E. coli de una proteína de fusión que codifica el péptido
natriurético atrial humano de tipo \alpha y cloranfenicol
acetiltransferasa; la proteína de fusión se escindió proteolítica o
químicamente con
2-(2-nitrofenilsulfenil)-E-metil-3'-bromoindolenina
para liberar el péptidos.
Ray et al., Bio/Technology,
11, 64 (1993) describen la expresión intracelular soluble en
E. coli de una proteína de fusión que codifica calcitonina de
salmón y glutation-S-transferasa;
la proteína de fusión se escindió con bromuro de cianógeno.
Schellenberger et al., Int. J. Peptide
Protein Res., 41, 326 (1993) describe la expresión como cuerpos
de inclusión insolubles de una proteína de fusión que codifica un
péptido de la sustancia P (11 a.a.) y
\beta-galactosidasa; los cuerpos de inclusión
fueron aislados en primer lugar y luego se trataron con
quimiotripsina para escindir la proteína de fusión.
Hancock et al., en el documento WO94/04688
(PCT/CA93/00342) y Piers et al. (Hancock), Gene, 134,
7 (1993) describen (a) expresiones como cuerpos de inclusión
insolubles en E. coli de una proteína de fusión que codifica
un péptido defensina denominado péptido neutrófilo humano 1
(HNP-1 por sus siglas en inglés) o un péptido
híbrido cecropina/melitina (CEME) y
glutatión-5-transferasa (GST); los
cuerpos de inclusión se aislaron en primer lugar y luego: (i) se
extrajeron con octil-polioxietileno al 3% antes de
la solubilización con urea y antes del tratamiento de la proteína de
fusión HNP1-GST con la proteasa del factor X_{a} o
(ii) se solubilizaron con ácido fórmico antes de la escisión con
bromuro de cianógeno de la proteína de fusión
CEME-GST; (b) la expresión en el sobrenadante
extracelular de S. aureus de una proteína de fusión que
codifica el péptido CEME y la proteína A; (c) la degradación
proteolítica de determinadas proteínas de fusión con algunas
proteínas de fusión purificadas; y (d) la degradación proteolítica
de otras proteínas de fusión y la incapacidad para recuperar y
purificar la proteína de fusión.
Lai et al., Patente de los Estados Unidos
No. 5.206.154 y Callaway, Lai et al. Antimicrob. Agents
& Chemo., 37:1614 (1993) describen la expresión como cuerpos
de inclusión insolubles de una proteína de fusión que codifica un
péptido cecropina y la proteína codificada por el extremo 5' del
gen de la L-ribulocquinasa; los cuerpos de inclusión
se aislaron en primer lugar y luego se solubilizaron con ácido
fórmico antes de la escisión con bromuro de cianóge-
no.
no.
Gramm et al., Bio/Technology,
12:1017 (1994) describen la expresión como cuerpos de inclusión
insolubles en E. coli de una proteína de fusión que codifica
un péptido de la hormona paratiroidea humana y una proteína gp55
codificada en el bacteriófago T4; los cuerpos de inclusión se
aislaron en primer lugar (6% p/v) y luego se trataron con ácido para
hidrolizar el sitio de escisión Asp-Pro.
Kuliopulos et al., J. Am. Chem. Soc.,
116:4599 (1994) describen la expresión como cuerpos de
inclusión insolubles en E. coli de una proteína de fusión que
codifica múltiples unidades de un péptido del tipo que se aparea en
\alpha relacionado con el tipo sexual de levaduras y una proteína
isomerasa cetoesteroide; los cuerpos de inclusión se aislaron en
primer lugar y luego se solubilizaron con guanidina antes de la
escisión con bromuro de cianógeno.
Pilon et al., Biotechnol. Prog.,
13, 374-379 (1997) describen la expresión
intracelular soluble en E. coli de una proteína de fusión
que codifica un péptido y ubiquitina; la proteína de fusión se
escindió con una proteasa específica de ubiquitina, la
UCH-L3.
Haugh et al., Biotechnol. Bioengineer.,
57, 55-61 (1998) describen la expresión como
cuerpos de inclusión insolubles en E. coli de una proteína de
inclusión que codifica un péptido antimicrobiano denominado P2 y
proquimosina bovina; los cuerpos de inclusión se aislaron en primer
lugar y luego se solubilizaron con ácido fórmico antes de la
escisión con bromuro de cianógeno.
Las referencias anteriores indican que la
producción de péptidos pequeños a partir de bacterias ha sido
problemática por varias razones. La proteólisis de algunos péptidos
ha sido particularmente problemática, incluso cuando el péptido se
prepara como parte de una proteína de fusión mayor. Tales proteínas
de fusión que comprenden una proteína transportadora y un péptido no
pueden no ser expresadas por las células hospedadoras o pueden ser
expresadas pero ser escindidas por proteasas bacterianas. En
particular, las dificultades para expresar péptidos antimicrobianos
catiónicos en bacterias han sido descritas por Hancock et
al. en la patente WO94/04688 (PCT/CA93/00342) referida
anteriormente, debido, según su opinión, a la susceptibilidad de
tales péptidos policatiónicos a la degradación por proteasas
bacterianas.
La producción de péptidos para evaluaciones
preclínicas y clínicas a menudo requiere cantidades de multigramos
[Kelley, Bio/Technology 14, 28-31
(1996)]. Si la producción de péptidos recombinantes se puede lograr
a esta gran escala, tal producción es posible que sea beneficiosa
económicamente. Sin embargo, las etapas de procesamiento
posteriores para la producción de péptidos yo proteínas a partir de
bacterias a menudo pueden llegar a representar una parte
significativa del costeo total de producción. Por ejemplo, la
recuperación inicial de péptidos a partir de cuerpos de inclusión
bacterianos de proteínas de fusión, por ejemplo, generalmente
requiere múltiples etapas de procesamiento diferenciadas, que
incluyen las cuatro etapas siguientes: (1) ruptura/lisis celular,
(2) aislamiento de cuerpos de inclusión de las células
rotas/lisadas, (3) solubilización de los cuerpos de inclusión
aislados en una agente desnaturalizante o detergente para obtener
proteínas de fusión solubilizadas, y (4) escisión de la proteínas de
fusión y separación de péptidos y proteínas transportadoras. Es
deseable que se mejoren y/u optimicen aspectos de los procesos de
producción recombinante para lograr que la producción a gran escala
de péptidos por medios recombinantes sea más viable
económicamente.
En la técnica, continúa existiendo la necesidad
de métodos mejorados para la producción recombinante de péptidos a
partir de células bacterianas, en particular de métodos más simples
que no requieran múltiples etapas, incluyendo, por ejemplo, la etapa
de aislamiento o purificación de las proteínas de fusión con
péptidos o la etapa de aislamiento o purificación de los cuerpos de
inclusión que comprenden las proteínas de fusión para obtener el
péptido recombinante.
La presente invención proporciona métodos
mejorados para la producción de péptidos recombinantes a partir de
células bacterianas. Los métodos mejorados excluyen la necesidad de
aislamiento y solubilización de cuerpos de inclusión o de
aislamiento y purificación de proteínas de fusión conde péptidos.
Los métodos mejorados logran la ruptura/lisis celular y la
liberación del péptido de células bacterianas o cultivos de células
bacterianas en una única etapa único paso. Las proteínas de fusión
útiles en los métodos de la invención comprenden al menos una
secuencia de un péptido, una secuencia de una proteína
transportadora y al menos una secuencia de un sitio de escisión de
aminoácidos sensible a ácidos ubicada entre la secuencia del péptido
y la secuencia de la proteína transportadora. La invención
proporciona métodos mejorados para la producción microbiana de
péptidos a partir de tales proteínas de fusión expresadas
intracelularmente en células bacterianas. Los péptidos recombinantes
recuperados conforme a la invención se liberan mediante la escisión
ácida en el sitio o los sitios de escisión sensibles a ácidos en la
proteína de fusión. Así, los péptidos recombinantes se producen de
manera eficiente y económica conforme a la invención.
De esta manera, la invención proporciona un
método mejorado para obtener un péptido de células bacterianas
después de la expresión intracelular de una proteína de fusión, en
donde la proteína de fusión comprende el péptido, una proteína
transportadora y un sitio escindible con ácido entre el péptido y
la proteína transportadora, comprendiendo el mejoramiento tratar las
células bacterianas con ácido en condiciones suficientes para, en
una única etapa único paso, para romper o lisar las células y
liberar el péptido de la proteína de fusión. Un método mejorado
puede incluir la etapa el paso adicional de obtener el péptido
liberado separado de las células rotas o lisadas. Conforme a la
invención, el péptido liberado se puede separar de las células rotas
o lisadas mediante un dispositivo de separación, tal como un
dispositivo de centrifugación o un dispositivo de filtración. La
invención también proporciona un método mejorado para obtener un
péptido de células bacterianas después de la expresión intracelular
de una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende
el péptido, una proteína transportadora y un sitio escindible con
ácido entre el péptido y la proteína transportadora y tal
mejoramiento comprende las siguientes etapas: (a) tratar las
células bacterianas con ácido en condiciones suficientes para
romper o lisar las células y liberar el péptido de la proteína de
fusión; (b) separar el material soluble del material insoluble
después de la etapa (a); y (c) recuperar el péptido liberado en el
material soluble después de la etapa (b). Conforme a la invención,
el material soluble se puede separar del material insoluble
mediante un dispositivo de separación, tal como un dispositivo de
centrifugación o un dispositivo de filtración. Los métodos
mejorados de la invención se pueden utilizar cuando las células
bacterianas están en medios de cultivo celular para el tratamiento
con ácidos, o cuando las células bacterianas han sido separadas de
los medios de cultivo celular para el tratamiento con ácidos, o
cuando las células bacterianas están en medios de cultivo celular
en un recipiente de fermentación para el tratamiento con ácidos.
Conforme a los métodos de la invención, los sitios escindibles con
ácidos preferidos en la proteína de fusión incluyen un sitio de
escisión Asp-Pro. Preferentemente, la proteína
transportadora se expresa como una proteína insoluble dentro de las
células bacterianas.
Los métodos mejorados de la invención para la
producción microbiana recombinante de péptidos a partir de
proteínas de fusión se basan en el sorprendente descubrimiento de
que la ruptura/ o lisis de las células bacterianas y la liberación
del péptido pueden lograrse simultáneamente en una única etapa.
Conforme a la invención, no se requiere ninguna etapa de proceso
para aislar de las células los cuerpos de inclusión y solubilizar
tales cuerpos de inclusión antes de la liberación y recuperación de
los péptidos. De forma similar, no se requiere ninguna etapa de
proceso para la purificación de las proteínas de fusión expresadas
en grandes cantidades intracelularmente como proteínas solubles o
insolubles en células hospedadoras bacterianas antes de la
liberación y recuperación del péptido. Notablemente, los péptidos
producidos eficientemente como componentes de proteínas de fusión
por las células hospedadoras bacterianas se escinden y liberan
eficientemente de las proteínas de fusión mediante una única etapa
de ruptura/lisis celular y liberación de péptido. Es
particularmente sorprendente el hecho de que los péptidos conforme a
la invención, efectivamente sintetizados en E coli, se
liberan en forma soluble en esta única etapa de ruptura/lisis
celular y escisión del péptido y se recuperan con facilidad del
material celular insoluble. A modo de ejemplo, los péptidos
recombinantes derivados de BPI recombinantes que tienen una o más
de las actividades biológicas de las BPI (por ejemplo, unión a LPS,
neutralización de LPS, unión a heparina, neutralización de
heparina, actividad antimicrobiana) se han producido y recuperado
conforme a los métodos de la invención. Así, la invención
proporciona métodos mejorados de producción celular bacteriana de
péptidos recombinantes funcionales.
La presente invención proporciona métodos
mejorados de producción de péptidos recombinantes. Los péptidos
recombinantes codificados por las proteínas de fusión y liberados de
estas se recuperan conforme a estos métodos mejorados. Las
proteínas de fusión útiles en los métodos conforme a la invención
comprenden una secuencia de un péptido, una secuencia de proteína
transportadora y una secuencia de sitio de escisión de aminoácidos
sensible a ácidos ubicado entre la secuencia del péptido y la
secuencia de la proteína transportadora. Los métodos mejorados
conforme a la invención logran la ruptura/lisis celular y la
liberación de péptidos de las células en una única etapa único paso
utilizando células bacterianas o cultivos celulares bacterianos
(por ejemplo, cultivos de fermentación). Los métodos mejorados
excluyen la necesidad de ruptura/lisis seguida de aislamiento y
solubilización de cuerpos de inclusión de las proteínas de fusión a
partir de las células bacterianas antes de la liberación y
recuperación del péptido. Inesperadamente, el tratamiento en una
única etapa de células bacterianas o cultivos celulares bacterianos
en condiciones de pH ácido y temperatura, suficientes para escindir
y liberar los péptidos simultáneamente con la ruptura/lisis celular,
permite la recuperación directa de péptidos solubles del material de
lisis celular insoluble. Las proteínas de fusión que contienen
péptidos derivados de BPI con actividad antimicrobiana se expresaron
intracelularmente en grandes cantidades sin proteólisis
significativa, hasta la acidificación de las células bacterianas. Se
pueden producir distintos péptidos derivados de BPI, incluyendo los
que comprenden las secuencias enumeradas en la Tabla 4 de la
Patente de los Estados Unidos No. 5.851.802 que se incorpora por
referencia a la presente memoria en su totalidad, mediante métodos
recombinantes conformes a la invención.
Una ventaja proporcionada por la presente
invención es la capacidad de producir péptidos de proteínas de
fusión de manera más eficiente y económica a partir de células
hospedadoras bacterianas. Las ventajas adicionales incluyen la
capacidad de recuperar y obtener péptidos homogéneos en grandes
cantidades por medio de métodos mejorados que son particularmente
adecuados para ser objeto de un aumento en la escala de producción
en grandes recipientes de fermentación.
Los términos "péptido derivado de BPI" o
"péptido de BPI" tal y como se utilizan en este documento
hacen referencia a un péptido derivado de una proteína
bactericida/incrementadora de la permeabilidad (BPI) o un péptido
basado en tal proteína, incluyendo los péptidos derivados del
Dominio I (aminoácidos 17-45), Dominio II
(aminoácidos 65-99) y Dominio III (aminoácidos
142-169) de BPI (secuencias de identidad
identificadas como SEQ ID NOS: 15 y 16), donde cada péptido tiene
una secuencia de aminoácidos que es la secuencia de aminoácidos de
un dominio funcional de BPI o una subsecuencia de la misma ésta y
variantes de la secuencia o subsecuencia con al menos una de las
actividades biológicas de BPI. La secuencia de aminoácidos de la
proteína BPI humana completa y la secuencia de ácidos nucleicos del
ADN que codifican la proteína han sido divulgadas en la Figura 1
de Gray et al., J. Biol. Chem., 264, 9505 (1989), que
se incorpora a este documento por referencia. Las secuencias de
aminoácidos y ADN de Gray et al. están reflejada\betae
establecen en las secuencias identificadas como SEQ ID NOS: 15 y 16
de este documento. Se ha producido un fragmento del extremo amino de
BPI de terminal N de aproximadamente 23 kD, al que se hace
referencia denominado rBPI_{23}, [Gazzano-Santoro
et al., Infect. Immun. 60, 4754-4761
(1992)], un análogo designado denominado rBPI_{21} o
rBPI21\Deltacis (Patente de los Estados Unidos No. 5.420.019, que
se incorpora a este documento por referencia) así como una
holoproteína recombinante, a la que también se hace referencia como
rBPI, con las secuencias que reflejadas en SEQ ID NOS: 15 y 16, con
la excepción de que la valina en la posición 151 se especifica
mediante GTG en vez de GTC y el residuo 185 es ácido glutámico
(especificado mediante GAG) en vez de lisina (especificada mediante
AAG). El término una "actividad biológica de BPI", tal y como
se utiliza en este documento, se refiere a unión a LPS,
neutralización de LPS, unión a heparina, neutralización de heparina
o actividad antimicrobiana (incluyendo actividad antibacteriana o
antifúngica). Tales péptidos derivados de BPI con al menos una de
las actividades de BPI pueden ser útiles como agentes
antimicrobianos (incluyendo los agentes antibacterianos y
antifúngicos), como agentes de unión a y neutralizantes de
endotoxinas, y como agentes de unión a y neutralizantes de
heparina, incluyendo para neutralizar los efectos anticoagulantes
de la heparina administrada, para el tratamiento de condiciones
patológicas de inflamación crónica, y para la inhibición de la
angiogénesis normal o patológica. El término "péptido de BPI
catiónico" se refiere a un péptido de BPI con un pI > 7,0.
Tal y como se usa en este documento, el término
"célula hospedadora bacteriana transformada" se refiere a una
célula bacteriana que contiene material genético recombinante o a
una célula bacteriana que contiene material genético requerido para
la expresión de un producto recombinante. El material genético se
puede introducir mediante cualquier método conocido en la técnica
incluyendo la transformación, la transducción, la electroporación y
la infección.
Tal y como se usa en este documento, el término
"vector" o "construcción de vector" se refiere a ADN de
plásmido que contiene material genético recombinante que puede
codificar (un) producto(s) recombinante(s) y que
puede ser capaz de replicarse autónomamente en una bacterias.
Tal y como se usa en este documento, el término
"proteína transportadora" se refiere a una proteína que se
puede expresar en bacterias y que se puede utilizar como un
compañero de fusión de un péptido o proteína enlazado. Las
proteínas transportadoras preferidas son las que se pueden expresar
con un alto rendimiento y cuando se utilizan como compañero de
fusión pueden conferir un alto nivel de expresión a una proteína o
un péptido enlazado. Se prefieren particularmente aquellas proteínas
que se expresan intracelularmente como proteínas solubles o
insolubles, tales como la subunidad D de una proteína osteogénica
humana (denominada "Bone D Ósea"). Cualquier proteína
transportadora conocida se puede utilizar como proteína compañera
de fusión; incluyendo, por ejemplo, la ubiquitina, [véase por
ejemplo, Pilon et al., Biotechol. Prog. 13,
374-379 (1997)]; la proteína A estafilocócica,
[véase por ejemplo, Uhlén et al., Gene 23, 369:378
(1983) y Piers et al., Gene 134, 7-13
(1993)]; la tiorredeoxina, [véase por ejemplo, LaVallie et
al., Bio/Technology 11, 187-193
(1993)]; la proteína de unión a maltosa, [véase por ejemplo, Tsao
et al., Gene 169, 59-64 (1996)]; la
glutactión-s-transferasa, [véase por
ejemplo, Ray et al., Bio/Technoloty 11
64-70 (1993) y Piers et al., Gene 134,
7-13 (1993)]; la proquimosina, [veáse por ejemplo,
Haught et al., Biotechnology and Bioengineering 57,
55-61 (1998)]; la
\beta-galactosidasa, [véase por ejemplo, Kempe
et al., Gene 39, 239-245 (1985)]; y la
gp 55 de T4, [veáse por ejemplo, Gram et al.,
Bio/Technology 12, 1017-1023 (1994)].
Tal y como se usa en este documento, el término "proteína
transportadora catiónica" se refiere a una proteína
transportadora que tiene un pI (calculado en base a la secuencia de
aminoácidos o medido en solución) mayor que 7,0 y preferentemente
mayor que 8,0. Tales proteínas incluyen (1) la proteína D Ósea (pI
8,18) (SEQ ID NOS: 1 y 2) y (2) la gelonina (pI 9,58) (veánse por
ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.416.202 y
5.851.802, incorporadas en su totalidad a este documento por
referencia).
Tal y como se usa en este documento, el término
"sitio de escisión de aminoácidos" se refiere a uno o más
aminoácidos que sirven como un sitio de reconocimiento para una
reacción química o enzimática de manera que la cadena péptidica se
escinde en ese sitio mediante el agente químico o la enzima. Los
sitios de escisión de aminoácidos incluyen los sitios ubicados en
ácido aspártico - prolina (Asp-Pro), metionina
(Met), triptófano (Trp) o ácido glutámico (Glu). Tal y como se usa
en este documento, el término "sitio de escisión de aminoácidos
sensible a ácidos" se refiere a uno o más aminoácidos que sirven
como un sitio de reconocimiento de manera que la cadena péptidica
se escinde en ese sito mediante ácidos. Se prefieren
particularmente el sitio de escisión Asp-Pro que se
puede escindir entre Asp y Pro mediante hidrólisis ácida.
Los péptidos derivados de BPI o basados en BPI
(péptidos derivados de BPI), se describen en la Patente de Estados
Unidos de propiedad conjunta No. 5.858.974 [WO 97/04008
(PCT/US96/03845)]; las Solicitudes de Patente de Estados Unidos con
Nos. de Serie 08/504.841 y 09/119.858 [WO 96/08509
(PCT/US95/09262)]; las Patentes de Estados Unidos Nos. 5.652.332 y
5.856.438 [WO 95/19372 (PCT/US94/10427)]; las Patentes de Estados
Unidos Nos. 5.733.872 y 5.763.567 [WO 94/20532 (PCT/US94/10427)];
las Patentes de Estados Unidos Nos. 4.348.942; 5.639.727;
5.807.818; 5.837.678; y 5.854.214 [WO 94/20128 (PCT/US94/02401)];
las descripciones de todas ellas se incorporan a este documento por
referencia.
Otros aspectos y ventajas de la presente
invención se entenderán mejor después de considerar los siguientes
ejemplos ilustrativos, en donde el Ejemplo 1 trata la construcción
de construcciones de vectores de expresión de proteínas de fusión;
el Ejemplo 2 trata la expresión de proteínas de fusión
recombinantes; el Ejemplo 3 trata la hidrólisis ácida de células
bacterianas o cultivos de células bacterianas y la liberación del
péptido recombinante; el Ejemplo 4 trata la hidrólisis ácida de
cultivos de células bacterianos en recipientes de fermentación; el
Ejemplo 5 trata la hidrólisis ácida de células bacterianas después
de retirar el medio de cultivo celular; el Ejemplo 6 trata la
recuperación y purificación de péptidos recombinantes de células
bacterianas hidrolizadas con ácidos; y el Ejemplo 7 trata los
ensayos de actividad biológica de péptidos recombinantes.
Se construyó un vector de expresión bacteriana
que codificaba una proteína de fusión con un péptido. Este vector
contiene una secuencia para codificar el génica que codifica la
subunidad D de una proteína osteogénica humana ("D Ósea")
(veánse los aminoácidos 23 a 161 de SEQ ID NOS: 1 y 2), unida a una
secuencia que codifica una secuencia enlazante que incluye el
dipéptido Asp-Pro y una secuencia que codifica un
péptido derivado de la secuencia de BPI (SEQ ID NO: 3). Esta
construcción de vector, pING4702, se preparó en varias etapas como
se describe a continuación.
En primer lugar, se sintetizaron dos
oligonucleótidos sintéticos que codifican un péptido derivado de
BPI, un dipéptido Asp-Pro y sitios apropiados de
reconocimiento enzimas de restricción para la clonación. Los
oligonucleótidos que codificaban esta secuencia fueron:
Se aparearon dieciséis \mug de cada
oligonucleótido en una reacción de 50 \muL en NaCl 100 mM, Tris
10 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM durante 10 minutos a 68ºC, 30 minutos a
57ºC, y seguidos de un enfriamiento lento hasta temperatura
ambiente. El fragmento oligonucleotídico apareado resultante
codifica una secuencia Asp-Pro-Pro
seguida de una secuencia que codifica un péptido con la secuencia de
12 aminoácidos de XMP.391, tal y como se describe en la Patente de
los Estados Unidos No. 5.851.802:
El fragmento oligonucleotídico apareado también
contiene sitios de enzimas de restricción para la escisión mediante
BamHI en el extremo 5' y mediante XhoI en el extremo
3' de la secuencia. El oligonucleótido apareado resultante se
purificó mediante centrifugación en una columna Chroma Spin 10
(Clontech, Palo Alto, CA).
En segundo lugar, se prepararon fragmentos de ADN
de dos vectores plasmídicos. El plásmido pIC100, un derivado de
pBR322 y que incluye la secuencia líder del gen de E. carotovora
pelB, descrito en la Patente de los Estados Unidos No.
5.416.202 (véase, por ejemplo, el Ejemplo 10) que se incorpora a
este documento por referencia, se digirió con EcoRI y
XhoI y se purificó el fragmento de vector grande de
aproximadamente 2836 pb. El plásmido pING3353, descrito en la
Patente de los Estados Unidos No. 5.851.802, que se incorpora por
referencia, se digirió con EcoRI y BamHI y se purificó
el fragmento de aproximadamente 550 pb que codifica la proteína
pelB:D Ósea.
En tercer lugar, el oligonucleótido apareado, el
fragmento comprendido entre las secuencias EcoRI y
XhoI de pING100 y el fragmento comprendido entre las
secuencias EcoRI y BamHI de pING3353 se ligaron en 20
\muL de Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM,
PEG-8000 al 5% con tres Unidades de Ligasa de ADN
de T4 durante 16 horas a 4ºC para generar el vector intermedio
pING4700. El plásmido pING4700 confiere resistencia a la ampicilina
y codifica la proteína de fusión D
Ósea-Asp-Pro-péptido.
El plásmido pING4700 se digirió con EcoRI
y XhoI y el fragmento de 604 pb que codifica la proteína de
fusión se ligó al fragmento de vector de aproximadamente 5500 pb de
pING3217, según se describe en la Patente de los Estados Unidos
5.851.802, (véase el Ejemplo 1), que había sido digerido con
EcoRI y XhoI en \muL de Tris 50 mM, pH 7,6,
MgCl_{2} 10 mM, ATP 1 mM, DTT 1 mM, PEG-8000 al 5%
con 3 Unidades de Ligasa de ADN de T4 durante 16 horas a 4ºC. El
plásmido resultante, pING4702, codifica la proteína de fusión D
Ósea-Asp-Pro-Pro-péptido
(SEQ ID NOS: 7 y 8) bajo el control de transcripción del promotor
araB. El plásmido pING4702 confiere resistencia al
antibiótico tetraciclina.
Se construyó un segundo vector de expresión
bacteriana que codifica una proteína de fusión con un péptido que
contiene la D Ósea (véanse los aminoácidos 23 a 161 de SEQ ID NOS: 1
y 2), el dipéptido Asp-Pro y un péptido de 25
aminoácidos derivado de la secuencia de BPI (SEQ ID NO: 9). Esta
construcción de vector, pING4703, se preparó según se describe a
continuación.
En primer lugar, se sintetizaron dos
oligonucleótidos sintéticos que codifican un péptido derivado de
BPI, una secuencia Asp-Pro-Pro y
sitios apropiados de reconocimiento por enzimas de restricción para
la clonación. Los oligonucleótidos que codificaban esta secuencia
fueron:
Se aparearon dieciséis \mug de cada
oligonucleótido en una reacción de 50 \muL en NaCl 100 mM, Tris
10 mM, pH 7,8, EDTA 1 mM durante 10 minutos a 68ºC, 30 minutos a
57ºC, seguidos de un enfriamiento lento hasta temperatura ambiente.
Una alícuota de los oligonucleótidos apareados se diluyó en Tris 10
mM, pH 8,3, KCl 50 mM (300 \muL de volumen total) y se completó
con una mezcla de reacción que contenía AmpliTaq (Perkin Elmer,
Norwalk, CT), dATP, dGTP, dCTP y dTTP a 72ºC. El fragmento de doble
cadena resultante codificaba los sitios de restricción BamHI
y XhoI en los extremos 5' y 3', respectivamente y codificaba
una secuencia Asp-Pro-Pro seguida de
una secuencia que codificaba un péptido con la secuencia de 24
aminoácidos de XMP.102, según se describe en la Patente de los
Estados Unidos No. 5.851.802:
El fragmento de doble cadena doble se digirió con
BamHI y XhoI y se ligó tanto al fragmento de vector
EcoRI a XhoI de aproximadamente 5500 pb de pING3217
como al fragmento EcoRI a BamHI de aproximadamente
550 pb de pING3353 en 20 \muL de Tris 50 mM, pH 7,6, MgCl_{2} 10
mM, ATP 1 mM, ditiotreitol 1 mM, PEG-8000 al 5% con
1 Unidad de Ligasa de ADN de T4 durante 16 horas a 4ºC. El plásmido
resultante, pING4703, codifica la proteína de fusión D
Ósea-Asp-Pro-Pro-péptido
(SEQ ID NOS: 13 y 14) bajo el control de transcripción del promotor
araB. El plásmido pING4703 confiere resistencia al
antibiótico tetraciclina.
Se evaluó la expresión de un producto
recombinante bajo el control del promotor araB de la
siguiente manera. Las construcciones de vector de expresión se
transformaron en E. coli E104 (depositadas como ATCC 69009;
ATCC 69008; ATCC 69101; ATCC 69102; ATCC 69103; ATCC 69104; ATCC
69331; ATCC 69332; ATCC 69333, que contienen cada una un plásmido
que codifica gelonina) y se seleccionaron las colonias resistentes
a la tetraciclina. Se hicieron crecer cultivos bacterianos de estas
colonias a 37ºC en medio TYE (15 g de Triptona, 10 g de Extracto de
Levadura, 5 g de NaCl por litro) suplementados con 15 \mug/mL de
tetraciclina. Para el almacenamiento de células bacterianas antes de
hacerse crecer en un fermentador, se congelaron los cultivos
bacterianos (1 a 2 mL) en medio TYE suplementado con glicerol al
15% y se almacenaron a -20ºC. Para iniciar la producción del
producto recombinante, se descongeló un vial de células que
contenía el vector de expresión del producto y se inoculó en 100 mL
de medio de cultivo GMM según se describe a continuación y se hizo
crecer hasta aproximadamente 200 Unidades Klett; luego se
inocularon en un fermentador de 14 L o de 35 L. Cada fermentador
contenía un medio con un mínimo con sales con glicerol como fuente
de carbono (Medio Mínimo de Glicerol, GMM por sus siglas en inglés).
El recipiente fermentador de 14 L o 35 L contenía al comienzo
aproximadamente 7 L o 20 L, respectivamente, de GMM que contenía
los siguientes ingredientes por litro:
Ingredientes Autoclavados | |
(NH_{4})_{2}SO_{4} | 2 g |
KH_{2}PO_{4} | 1,57 g |
K_{2}HPO_{4} | 14,1 g |
MgSO_{4}.7H_{2}O | 0,28 g |
H_{3}PO_{4} (Conc.) | 3 mL |
Antiespumante | 1 mL |
Biotina | 0,0012 g |
Extracto de levadura | 4,6 g |
Glicerol | 18,5 g |
\vskip1.000000\baselineskip
Ingredientes esterilizados por filtración | |
CaCl_{2}.2H_{2}O (10% p/v) | 1 mL |
Solución rastreadora D* | 16 mL |
HCl de tiamina (10% p/v) | 0,1 mL |
Ácido nicotínico (1% p/v) | 2 mL |
\vskip1.000000\baselineskip
\text{*}La solución rastreadora D está
compuesta de:
\vskip1.000000\baselineskip
FeCl_{3}.6H_{2}O | 6,480 g |
ZnSO_{4}.7H_{2}O | 1,680 g |
MnCl_{2}.4H_{2}O | 1,200 g |
Na_{2}MoO_{4}.2H_{2}O | 0,576 g |
CuSO_{4}.5H_{2}O | 0,240 g |
CoCl_{2}.6H_{2}O | 0,240 g |
H_{3}BO_{3} | 0,720 g |
H_{3}PO_{4} (Conc.) | 96,0 mL |
H_{2}O (Volumen de lote) | 2,0 L |
Luego se inoculó en el fermentador el cultivo
bacteriano de siembra y se mantuvo a pH 6,0 y a 32ºC con 10 L/min.
de aire y agitación a 1000 rpm. Cuando los nutrientes se tornaron
limitantes (según se juzga por un incremento en el oxígeno disuelto,
OD, hasta aproximadamente 100%), se alimentó con nutrientes
adicionales el cultivo hasta que el cultivo alcanzó una densidad
óptica (DO_{600}) de aproximadamente 100. La velocidad de
alimentación del cultivo se controló para mantener el OD en un
valor fijado del 20%. Específicamente, el cultivo se alimentó con
la primera alimentación:
Ingredientes autoclavados por litro de alimentación: | |
Glicerol | 700 g |
MgSO_{4}.7H_{2}O | 10 g |
Biotina | 0,01 g |
\vskip1.000000\baselineskip
Ingredientes filtrados por litro de alimentación: | |
CaCl_{2}.2H_{2}O (10% p/v) | 35 mL |
HCl de tiamina (10% p/v) | 3,5 mL |
Ácido nicotínico (1% p/v) | 7 mL |
El cultivo se indujo mediante inducción por
gradiente a una DO de aproximadamente 100 con una segunda
alimentación que contenía el agente inductor
L-arabinosa. Específicamente, la segunda
alimentación fue:
Ingredientes autoclavados por litro de alimentación: | |
Glicerol | 700 g |
MgSO_{4}.7H_{2}O | 10 g |
Biotina | 0,01 g |
Arabinosa | 60 g/L |
\vskip1.000000\baselineskip
Ingredientes filtrados por litro de alimentación: | |
CaCl_{2}.2H_{2}O (10% p/v) | 35 mL |
HCl de tiamina (10% p/v) | 3,5 mL |
Ácido nicotínico (1% p/v) | 7 mL |
Los cultivos se cosecharon a las
23-26 horas post-inducción.
Las células se pueden separar del medio de
cultivo con un cartucho de fibra hueca de 0,2 \mum, 0,92910
m^{2} (10 pies^{2}) (Microgon, Laguna Hills, CA) según se
describe en los Ejemplos 3 y 5 a continuación. Alternativamente, el
caldo de fermentación (es decir, el medio de cultivo con células) se
puede utilizar directamente en el recipiente de fermentación o se
puede retirar del fermentador para su acidificación y posterior
procesamiento según se describe a continuación en los Ejemplos 4 y
5. El Ejemplo 6 que figura a continuación describe la recuperación
y purificación de péptidos recombinantes.
Previamente, se aislaron los cuerpos de
inclusión. El tratamiento ácido de los cuerpos de inclusión
aislados dio como resultado la hidrólisis del la enlace unión
aspartilo-prolilo (Asp-Pro) entre la
proteína D Ósea y un péptido recombinante mediante incubación en
ácido diluido a temperaturas elevadas (véase, por ejemplo, el
Ejemplo 3 de la Patente de los Estados Unidos No. 5.851.802). En
estos experimentos, las células bacterianas se acidificaron
directamente en un intento de lisar las células e hidrolizar
directamente los cuerpos de inclusión para liberar el péptido. Esto
se realizó diluyendo las células en ácido diluido a temperatura
elevada. Se hizo crecer E. coli E104 que contenía el plásmido
pING4702 en un fermentador de 10 L y se indujo con arabinosa.
Después de terminar la sesión en el fermentador, las células
bacterianas se separaron de la mayoría del sobrenadante de cultivo
con un cartucho de fibra hueca de 0,2 \mum (Microgon, 0,929
m^{2} (10 pies^{2})) y se congelaron. Las células obtenidas del
fermentador se descongelaron e incubaron en condiciones ácidas
durante 4 horas a 85ºC como figura a continuación en la Tabla 1.
Muestra | Pasta de células | Condición de incubación |
A | 1 gramo | 10 mL de HCl 30 mM |
B | 1 gramo | 10 mL de HCl 30 mM, EDTA 5 mM |
C | 1 gramo | 10 mL de HCl 30 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 1% |
D | 1 gramo | 10 mL de HCl 30 mM, EDTA 5 mM, urea 8 M |
Como control, se lisaron aproximadamente 1 gramo
de células con lisozima y se aislaron los cuerpos de inclusión
antes de la hidrólisis ácida conforme a los métodos anteriores
(véase, por ejemplo, el Ejemplo 3 de la Patente de los Estados
Unidos No. 5.851.802). Estas células se suspendieron en 10 mL de
Tris 100 mM, EDTA 5 mM, pH 8,0. La suspensión espesa se incubó
sobre hielo durante 15 minutos y se agregó 1 mL de lisozima a 10
mg/mL y se incubó sobre hielo durante 20 minutos. Para romper las
células tratadas con lisozima, la suspensión espesa se sometió a
ultrasonidos 4 veces durante 10 segundos cada vez, con el control
del equipo en el punto más alto, utilizando un equipo de
ultrasonidos Sonic U (B. Braun Biotech Inc., Allentown, PA). Las
células lisadas se centrifugaron a 13.000 rpm en un rotor JA20
durante 25 minutos. Luego, el sedimento de cuerpos de inclusión se
incubó en 10 mL de HCl 30 mM durante 4 horas a 85ºC.
Antes de la incubación a 85ºC, se ajustó el pH de
todas las muestras a pH 2,5 con HCl, exceptuando la muestra que
contenía urea que se ajustó a pH 3,0. Después de la incubación, las
muestras se centrifugaron a 13.000 rpm en un rotor JA20 durante 25
minutos para separar el material soluble del insoluble. La cantidad
del péptido liberado en el sobrenadante de cada muestra se evaluó
mediante HPL utilizando un instrumento de Beckman Coulter
(Fullerton, CA) con un autoinyector de Shimadzu Scientific
Instruments (Columbia, MD) y una columna de Vydac (Hesperia, CA)
C18 (#218TP54). El disolvente A fue acetonitrilo al 10%/TFA al 0,1%;
el disolvente B fue acetonitrilo al 90%/TFA al 0,1%. El paso por la
columna se provocó con un gradiente de B al 20-40% a
lo largo de 20 minutos a un caudal de 1 mL/minuto con detección de
péptidos a 229 nm.
La concentración del péptido en el sobrenadante
fue la que figura a continuación en la Tabla 2.
Muestra | Concentración (mg/mL) | % de Control | |
Cuerpos de inclusión purificados (Control) | 0,292 | 100 | |
A | 10 mL de HCl 30 mM | 0,223 | 76,4 |
B | 10 mL de HCl 30 mM, EDTA 5 mM | 0,218 | 74,7 |
C | 10 mL de HCl 30 mM, EDTA 5 mM, Triton X-100 al 1% | 0,287 | 98,3 |
D | 10 mL de HCl 30 mM, EDTA 5 mM, urea 8 M | 0 | 0 |
Estos datos demuestran por primera vez que el
péptido se podría liberar directamente de las células mediante
incubación de las células bacterianas en ácido diluido mientras la
mayoría de las restantes proteínas permanece insoluble.
Los resultados descritos anteriormente
demostraron que el péptido se liberó de una proteína de fusión D
Ósea-péptido que contenía un fragmento enlazante
peptídico Asp-Pro sensible a ácidos mediante la
hidrólisis directa de células en ácido diluido. Se realizaron
estudios para examinar la evolución de la hidrólisis con el tiempo.
Una muestra de las mismas células congeladas y concentradas
descritas anteriormente se utilizó para estudios adicionales.
Aproximadamente 2 gramos de pasta de células se diluyeron con 20 mL
de agua y se agregó HCl concentrado para llevar el pH a 2,5. La
muestra se incubó a 85ºC y se retiraron muestras periódicamente
para su cuantificación. Cada muestra se centrifugó para eliminar el
material insoluble y el sobrenadante se analizó mediante HPLC para
determinar los péptidos liberados. La concentración del péptido en
la fracción soluble fue la figura a continuación en la Tabla 3.
Tiempo (Horas) | Concentración por HPLC (mg/mL) |
0 | 0 |
0,5 | 0,02 |
1 | 0,03 |
2 | 0,056 |
3 | 0,082 |
4 | 0,142 |
5 | 0,184 |
6 | 0,219 |
7 | 0,267 |
Así, tal como se muestra en la Tabla 3, la
cantidad de péptido en la fracción soluble todavía sigue
incrementándose al final de las siete horas de estudio de la
evolución con el tiempo.
En estudios adicionales, una muestra celular de
células bacterianas en medios de cultivo celular se incubó a un pH
de 2,15 para evaluar la evolución con el tiempo de la liberación de
células que no habían sido concentradas y congeladas previamente.
Específicamente, 40 mL de células bacterianas en caldo de
fermentación (cultivo de fermentación de E. coli E104 que
contenía pING4702) al final del proceso de fermentación según se
describe en el Ejemplo 2 se ajustaron directamente a un pH de 2,15
añadiendo 500 \muL de HCl concentrado, hasta una concentración
final de aproximadamente 150 mM. La muestra se incubó a 85ºC y cada
hora se retiró una muestra, se centrifugó y el sobrenadante se
analizó mediante HPLC para determinar los péptidos. La
concentración del péptido liberado a lo largo del tiempo fue la que
figura a continuación en la Tabla 4.
Tiempo (Horas) | Concentración por HPLC (mg/mL) |
0 | 0 |
1 | 0,062 |
2 | 0,218 |
3 | 0,321 |
4 | 0,350 |
5 | 0,366 |
6 | 0,392 |
7 | 0,432 |
8 | 0,401 |
23 | 0,298 |
A pH 2,15 y utilizando células que estaban
directamente en el medio de fermentación, la liberación máxima del
péptido sucedió al rededor de las siete horas a 85ºC, y después de
lo cual la cantidad de péptido liberado disminuyó.
Estudios adicionales demostraron que
H_{2}SO_{4} diluido y HNO_{3} diluidos también podían liberar
el péptido soluble de las células bacterianas y de células
bacterianas en medios de cultivo celular (es decir, cultivos de
fermentación). En estudios con H_{2}SO_{4}, se recogieron dos
muestras de 20 mL de células bacterianas en caldo de fermentación
tal como se describe en el Ejemplo 4 (cultivo de fermentación de
E. coli E104 que contenía pING4702) después de completarse la
fermentación bacteriana y se acidificaron hasta un pH de 2,4. Una
muestra se ajustó hasta un pH de 2,4 con HCl y la otra se ajustó a
un pH de 2,4 con H_{2}SO_{4}. Cada muestra se incubó a 85ºC y
se retiró una muestra cada hora durante siete horas y se analizó la
cantidad de péptido soluble en cada muestra mediante HPLC. La
concentración del péptido en cada alícuota es la que se establece
se muestra a continuación en la Tabla 5.
Tiempo de la muestra (Hora) | Concentración de péptido por HPLC (mg/mL) | |
Hidrólisis con HCl | Hidrólisis con H_{2}SO_{4} | |
0 | 0 | 0 |
1 | 0,034 | 0,036 |
2 | 0,130 | 0,116 |
3 | 0,185 | 0,162 |
4 | 0,231 | 0,209 |
5 | 0,281 | 0,248 |
6 | 0,295 | 0,275 |
7 | 0,303 | 0,273 |
En estudios con HNO_{3}, una muestra de células
en caldo de fermentación bacteriana tal como se describe en el
Ejemplo 4 se incubó con ácido nítrico. Específicamente, 20 mL de
células se ajustaron a un pH de 2,2 con ácido nítrico y se
incubaron a 85ºC. Se retiraron muestras periódicamente y se
determinó la concentración del péptido recombinante en la fracción
soluble mediante HPLC. La concentración del péptido en cada
alícuota se muestra a continuación en la Tabla 6.
Tiempo de la muestra (Hora) | Concentración de péptido por HPLC (mg/mL) después de la hidrólisis con HNO_{3} |
0 | 0 |
1 | 0,093 |
2 | 0,146 |
4,5 | 0,308 |
6 | 0,325 |
Estos estudios adicionales demuestran que ácidos
tales como el ácido nítrico, que son menos corrosivos para los
materiales de acero inoxidable utilizados en los recipientes de
fermentación, son útiles en los métodos mejorados de la
invención.
Dado que el péptido se liberó de células
bacterianas y cultivos celulares mediante incubación directa de las
células en ácido tal como se describe en el Ejemplo 3, se realizaron
estudios para evaluar si el péptido soluble se podía recuperar
directamente de un biorreactor al final del proceso de fermentación
cuando el contenido del fermentador se acidificaban y se calentaba
in situ. En estudios iniciales, se cultivó hizo crecer E.
coli E104 que contenía pING4702 en un fermentador de 35 L según
se describe en el Ejemplo 2. La primera solución de alimentación se
introdujo en el fermentador a las 20,5 horas
post-inoculación y el cultivo se introdujo con la
segunda alimentación cuando la DO600 había llegado a 97,2. A las
62,5 horas después de la inducción, se añadió al fermentador HCl al
10% en alícuotas de 50 mL hasta que el pH del fermentador hubo
alcanzado un valor de aproximadamente 2,28. En total, se añadieron
990 mL de ácido a los aproximadamente 26 L de producto de
fermentación en el fermentador. Después de reducir el pH, el punto
de ajuste de la temperatura del fermentador se incrementó hasta 85ºC
y, después de esto, se retiraron muestras del fermentador
periódicamente durante seis horas. El contenido del recipiente se
mezcló durante la reacción con las aspas del fermentador. El
análisis mediante HPLC del material soluble de las muestras reveló
que la concentración del péptido se estabilizaba entre las cuatro y
cinco horas. La concentración del péptido fue la que se muestra a
continuación en la Tabla 7.
\vskip1.000000\baselineskip
Punto en el tiempo de la muestra (Horas) | Concentración de péptido por HPLC (mg/mL) |
0 | 0 |
1 | 0,185 |
2 | 0,294 |
3 | 0,334 |
4 | 0,353 |
5 | 0,353 |
6 | 0,370 |
\vskip1.000000\baselineskip
En estudios adicionales, se hizo crecer E.
coli E104 que contenía pING4702 en un fermentador de 35 L hasta
una DO600 de 89, y se indujo con la segunda alimentación que
contenía arabinosa y se hizo crecer durante 24 horas. Se añadió una
solución de HCl al 10% para llevar el pH del cultivo hasta
aproximadamente 2,3 y la temperatura se elevó hasta 85ºC durante 5,5
horas. La concentración del péptido en la fracción soluble fue 0,332
mg/mL.
Se hizo crecer E. coli E104 que contenía
pING4703 en un fermentador de 14 L según se describe en el Ejemplo
2 y se ajustaron 10 mL del cultivo de fermentación a pH de 2,2 con
HCl concentrado. La muestra se incubó a 85ºC y se tomaron muestras
cada pocas horas y se analizaron para determinar los péptidos en el
sobrenadante mediante HPLC, utilizando el mismo método que se
describe en el Ejemplo 3 para cuantificar el péptido del producto
codificado por pING4702. Los resultados de este estudio se muestran
a continuación en la Tabla 8.
\vskip1.000000\baselineskip
Tiempo a 85ºC | Concentración de péptido mg/mL |
4 | 0,018 |
6 | 0,011 |
7 | 0,004 |
\vskip1.000000\baselineskip
Los títulos de estos péptidos fueron mucho
menores que los que se obtuvieron con cultivos de E. coli
E104 (pING4702) según se describe en los Ejemplos 3 y 4 y menores
que el título obtenido cuando se lisó E. coli E104
(pING4703) sometiéndola a ultrasonidos después de la incubación con
lisozima mediante el proceso descrito en el Ejemplo 3. La E.
coli E104 (pING4703) lisada mediante ultrasonidos después del
tratamiento con lisozima tuvo un título de aproximadamente 0,46
mg/mL en la fracción soluble.
En estudios adicionales, las muestras del cultivo
celular bacteriano antes y después de la hidrólisis ácida a 85ºC se
analizaron mediante electroforesis con dodecil sulfato de sodio en
gel de poliacrilamida (SDS-PAGE, por sus siglas en
inglés). Los resultados demostraron que la proteína de fusión de D
Ósea y péptido se había hidrolizado mediante ácido. Se realizó un
experimento para determinar si el medio de cultivo celular en la
reacción de hidrólisis tenía alguna influencia sobre la capacidad de
recuperar el péptido recombinante en la fracción soluble, dado que
una banda prominente en la posición de la D Ósea era evidente en la
muestra hidrolizada, mientras se detectaba muy poca proteína de
fusión intacta. Se preparó una pasta de células de fermentación de
E. coli E104 (pING4703) mediante centrifugación y se
suspendió 1 g de la pasta de células en: 7 mL de H_{2}O; 7 mL de
EDTA 5 mM; o 7 mL de caldo de fermentación exento de células del
mismo fermentador bacteriano. El pH de cada muestra se ajustó a 2,2
con HCl concentrado y se incubó a 85ºC. La cantidad de péptido
recombinante en la fracción soluble se midió a lo largo del tiempo
mediante HPLC. Los resultados se muestran a continuación en la
Tabla 9.
\vskip1.000000\baselineskip
Tiempo (Horas) a 85ºC | Muestra con H_{2}O | Muestra con EDTA 5 mM | Muestra de Medio |
Concentración de péptidos por HPLC (mg/mL) | |||
1 | 0,052 | 0,043 | 0 |
2 | 0,184 | 0,187 | 0,011 |
4 | 0,269 | 0,284 | 0,009 |
6 | 0,267 | no determinada | 0,003 |
8 | 0,255 | no determinada | no determinada |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos datos demostraron que el péptido
recombinante era soluble cuando las células se hidrolizaron en agua
o EDTA 5 mM, pero no se volvió soluble en el medio de fermentación
después de la hidrólisis ácida.
Se realizaron estudios adicionales para
determinar si el péptido recombinante era insoluble en ácido
después de la hidrólisis de la D Ósea y podría liberarse del
material insoluble en detergentes o sales caotrópicas. Tres
muestras de 1 gramo de pasta de células de E. coli E104
(pING4703) se suspendieron en 7 mL de Tris 100 mM, EDTA 5 mM, pH
8,0, y una muestra de 1 gramo de pasta de células se suspendió en 7
mL de medio de cultivo exento de células de la fermentación de E.
coli. A una de las muestras suspendida en solución
amortiguadora de Tris se le añadió 1 mL de lisozima a 10 mg/mL, la
muestra se incubó sobre hielo y se sometió a ultrasonidos según se
describe en el Ejemplo 3. El pH de las cuatro muestras se ajustó
con HCl concentrado hasta aproximadamente 2,0 y las muestras se
incubaron a 85ºC durante 4 horas. Por HPLC, la cantidad de péptido
liberado en la fracción soluble de las cuatro muestras fue la que
figura a continuación en la Tabla 10.
\vskip1.000000\baselineskip
Muestra | Solución amortiguadora de suspensión | Concentración de péptido mg/mL |
1 | Tris 100 mM, EDTA 5 mM | 0,594 |
2 | Tris 100 mM, EDTA 5 mM | 0,618 |
3 | Medio | 0 |
4 | Tris 100 mM, EDTA 5 mM + Lisozima y ultrasonidos | 0,519 |
\vskip1.000000\baselineskip
Así, el péptido no apareció en la fracción
soluble en la Muestra 3 después de la hidrólisis ácida. Para
determinar si el péptido podía liberarse del material insoluble, se
lavó secuencialmente el sedimento de la Muestra 3 con 7 mL de
solución amortiguadora que contenía Triton X-100,
urea, hidrocloruro de guanidina o SDS. La cantidad de péptido
liberada del sedimento fue la que figura a continuación en la Tabla
11.
Solución amortiguadora de lavado | Concentración de péptido (mg/mL) en | Total de péptido liberado mg |
la solución amortiguadora de lavado | de péptido/gramo de células | |
Triton X-100 al 1% en fosfato de | 0,01 | 0,08 |
sodio 10 mM, pH 7,0 | ||
Triton S-100 al 3% en citrato de sodio | 0 | 0 |
10 mM, pH 3,0 | ||
Urea 4 M urea en citrato de sodio | 0,04 | 0,29 |
10 mM, pH 3,0 | ||
Urea 8 M en citrato de sodio 10 mM, | 0,08 | 0,55 |
pH 3,0 - primer lavado | ||
Urea 8 M en citrato de sodio 10 mM, | 0,07 | 0,49 |
pH 3,0 - segundo lavado | ||
Urea 8 M en citrato de sodio 10 mM, | 0,06 | 0,39 |
pH 3,0 - tercer lavado durante 15 horas | ||
Hidrocloruro de guanidina 6 M | 0,12 | 0,87 |
SDS al 4% | 0 | 0 |
Total en todos los lavados: 2,67 |
\vskip1.000000\baselineskip
Estos resultados demostraron que el péptido podía
recuperarse del material insoluble mediante lavado en soluciones
amortiguadoras que contengan urea o hidrocloruro de guanidina. Por
lo tanto, el péptido no se degradó por la condición de hidrólisis
pero se vuelve insoluble por los componentes del medio. La cantidad
total de material recuperable en todos los lavados fue 2,67 mg por
gramo de células, en comparación con los 4,16 mg/g y 3,63 mg/g
recuperados directamente del material soluble en las Muestras 1 y 4,
respectivamente. Así, para algunos cultivos celulares bacterianos,
las células bacterianas se pueden retirar preferentemente del medio
y las células bacterianas se pueden acidificar conforme al Ejemplo
3. Para otros cultivos celulares bacterianos, el caldo de
fermentación (células bacterianas en cultivo celular/medios de
fermentación) se puede acidificar directamente conforme a los
Ejemplos 3 y 4.
La invención proporciona métodos para la
recuperación de péptidos en la fracción soluble después de la
hidrólisis ácida de células mientras la gran mayoría de las
restantes proteínas bacterianas, la proteína transportadora y otras
impurezas permanecen en la fracción insoluble. El material soluble e
insoluble se puede separar mediante centrifugación, filtración u
otro método adecuado de separación. Se pueden utilizar distintas
centrífugas para separar estos materiales y también se pueden usar
distintos dispositivos, sistemas y métodos de filtración. Se
utilizaron diferentes dispositivos, sistemas y métodos de filtración
para separar los materiales solubles e insolubles, incluyendo la
filtración de flujo directo (en profundidad) y la filtración de
flujo tangencial. En la Tabla 12 que figura a continuación se
presenta un resumen de los resultados de estudios ejemplarizantes
para separar el material soluble e insoluble mediante
filtración.
filtración.
Método de | Muestra Analizada | Descripción del | Caudal | Descripción | Recuperación |
Filtración | filtro | del permeato | |||
De profundidad | Pasta de células | Seitz 900 SD/SDC, | 1,5 L | Transparente | 72% |
previamente congeladas | 0,929 m^{2} (1 pie^{2}), | ||||
suspendida en agua e | retención nominal | ||||
hidrolizada con ácido | de 8 \mum | ||||
De profundidad | Pasta de células | Seitz SD250, | 5,5 L | Transparente | 94% |
precedido por un | previamente congeladas | 0,929 m^{2} (1 pie^{2}), | |||
filtro de bolsa | suspendida en 4 | retención nominal | |||
de 1 \mum | volúmenes de agua e | de 4 \mum | |||
hidrolizada con ácido | |||||
De profundidad | Hidrolizado ácido | Cuno Zeta Plus 01A, | 1,7 L | Turbio | ND |
preparado directamente | 0,929 m^{2} (1 pie^{2}), | ||||
en un fermentador | retención nominal | ||||
de 35 L | de 7 \mum | ||||
De profundidad | Hidrolizado ácido | Cuno 30 SP, | 1,2 L | Turbio | ND |
precedido por un | preparado directamente | 0,929 m^{2} (1 pie^{2}), | |||
filtro de bolsa | en un fermentador | retención nominal | |||
de 1\mum | de 35 L | de 0,6 \mum | |||
De profundidad, | Pasta de células | Cuno Zeta Plus 01A, | 27 mL sin | Ligeramente | ND |
con y sin ayuda | previamente congeladas | 28 cm^{2} | Celite; > 50 | turbio | |
de filtro de | suspendida en 3,8 | mL con Celite | |||
Celite | volúmenes de agua e | (HP^{3} 1000) | |||
hidrolizada con ácido | |||||
Ayuda con filtro | Hidrolizado ácido | Recubrimiento | 2 L/min | Transparente | 73% |
de Celite en | preparado directamente | previo de Celite | |||
recipiente de hoja | en un fermentador | (Hy-flo), 600 cm^{2} | |||
de presión | de 35 L | ||||
horizontal | |||||
Flujo tangencial | Pasta de células | Filtro Sartorius | ND | Turbio | ND |
previamente congeladas | con unidad de | ||||
suspendida en 3,8 | corte 0,2, 0,1 m^{2} | ||||
volúmenes de agua e | |||||
hidrolizada con ácido | |||||
Flujo tangencial | Pasta de células | MWCO 300 kDa, | 150 mL/min | Transparente | 81% |
previamente congeladas | 0,1 m^{2} | ||||
suspendida en 3,8 | |||||
volúmenes de agua e | |||||
hidrolizada con ácido | |||||
ND - no determinado | |||||
Los filtros Seitz son productos de SWK Filtration Incorporated, Petaluma, CA. | |||||
Los filtros Cuno son productos de Cuno, Meriden, CT. | |||||
Celite es un producto de World Minerals, Lompoc, CA. | |||||
Los filtros Sartorius son productos de Sartorius, Edgewood, NY. |
Estos resultados demuestran que se puede utilizar
con éxito distintos dispositivos, sistemas y métodos de filtración
con éxito para separar el material soluble e insoluble.
Después de la fermentación de E. coli E104
que contenía pING4702 según se describe en el Ejemplo 2, se
hidrolizaron en HCl diluido las células bacterianas en el caldo de
fermentación sin procesar. Específicamente, 40 mL de caldo de
fermentación se ajustaron a un pH de 2,15 con HCl concentrado. La
muestra se incubó a 85ºC durante 5,5 horas. Luego las células
hidrolizadas se centrifugaron para retirar el material insoluble y
el sobrenadante se ajustó a un pH 3,0 añadiendo citrato de sodio 500
mM gota a gota.
Se equilibró una columna de Sefarosa SP
(Amersham-Pharmacia, Piscataway, NJ), de 2,5 x 4,4
cm que contenía 21,6 mL, en 10 mM de citrato de sodio, pH 3,0 y se
cargó la muestra. La columna se lavó con citrato de sodio 10 mM,
solución amortiguadora de pH 3,0 y luego con fosfato de sodio 10 mM,
pH 7,0 hasta que el pH del efluente de la columna llegó a 7. Luego
se lavó la columna en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 150 mM pH 7,0.
La columna se eluyó en fosfato de sodio 10 mM, NaCl 800 mM pH 7,0 y
luego la columna se limpió de restos con fosfato de sodio 10 mM,
NaCl 2 M. El eluato de Sefarosa SP se diluyó con un volumen de
fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 3 M, pH 7,0.
Se equilibró una columna
Butil-Sefpharosa
(Amersham-Pharmacia), de 1 x 4 cm que contenía 3,1
mL, con fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 1,5 M, pH 7,0 y se
cargó la muestra. La columna de Butil-Sefarosa se
lavó con fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 1,1 M, pH 7,0 y
luego se eluyó con fosfato de sodio 10 mM, sulfato de amonio 0,4 M,
pH 7,0. La columna se limpió de restos con 10 mM de fosfato de
sodio 10 mM, pH 7,0
La concentración del péptido en cada una de las
fracciones de las columnas de Separosa SP y
Butil-Sefarosa fue seguida de un análisis mediante
HPLC. Los volúmenes de muestra, las concentraciones de péptido y el
porcentaje de recuperación fueron los que figuran a continuación en
la Tabla 13.
Muestra | Volumen (mL) | Concentración (mg/mL) | mg Totales | % Rendimiento |
Carga en Sefarosa SP | 24 | 0,399 | 9,58 | 100 |
Primer lavado de Sefarosa SP | 75 | 0 | 0 | 0 |
Segundo lavado de Sefarosa SP | 33 | 0 | 0 | 0 |
Eluato de Sefarosa SP | 50 | 0,165 | 8,25 | 86,1 |
Limpieza de restos de Sefarosa SP | 13 | 0,036 | 0,47 | 4,9 |
Carga en Butil-Sefarosa | 94 | ND | ND | ND |
Caudal de flujo a través de Butil-Sefarosa | 95 | 0 | 0 | 0 |
Lavado de Butil-Sefarosa | 13 | 0,008 | 0,1 | 1 |
Eluato de Butil-Sefarosa | 28 | 0,262 | 7,34 | 76,6 |
Limpieza de restos de Butil-Sefarosa | 4 | 0,014 | 0,06 | 0,6 |
ND - No determinado |
Una columna de Superdex 30
(Amersham-Pharmacia), de 1,6 x 53 cm que contení 107
mL, se equilibró en acetato de sodio 5 mM, NaCl 150 mM, pH 5,0. Se
cargaron ocho mL de eluato de Butil-Sefarosa en la
columna de filtración en gel Superdex 30 y se provocó el paso por la
columna con acetato de sodio 5 mM, 150 mM NaCl 150 mM, pH 5,0.
Después de que hubieran fluido 32 mL a través de la columna, se
recogieron fracciones de 3 mL. Las fracciones 12-19
se combinaron y tuvieron un volumen de aproximadamente 20 mL. La
concentración del péptido recombinante en la combinación de Superdex
30 fue de 0,107 mg/mL con una recuperación de un 102% respecto a la
etapa previa y la recuperación global a partir del hidrolizado
ácido fue 76,6%. La pureza final del péptido fue 97,4%.
Se pueden producir distintos péptidos
recombinantes, incluyendo los péptidos derivados de BPI que
comprenden las secuencias enumeradas en la Patente de los Estados
Unidos No. 5.851.802 que se incorpora por referencia, mediante
métodos recombinantes de la invención y se pueden analizar para
determinar la actividad biológica mediante ensayos de actividad
conocidos. Se pueden realizar ensayos para determinar la actividad
antimicrobiana (tanto actividad antifúngica como antibacteriana),
incluyendo ensayos de difusión radial. Los ensayos, con distintas
células fúngicas y bacterianas, incluyendo los descritos en la
Patente de los Estados Unidos No. 5.851.802 (véase el Ejemplo 6),
se pueden realizar utilizando péptidos recombinantes producidos
conforme a la invención.
Por ejemplo, se realizaron estudios para evaluar
la actividad antifúngica del péptido recombinante de pING4702
purificado conforme al Ejemplo 6 en un ensayo de microdilución de
caldo utilizando cuatro cepas de C. albicans, C. glabrata y
S. cerevisiae. Un péptido similar, XMP.391, que fue
sintetizado químicamente, se incluyó en el ensayo como control
positivo. Para realizar el ensayo de microdilución de caldo, los
cultivos fúngicos se hicieron crecer durante una noche a 30ºC en
medio YPD (extracto de levadura al 1%, peptona al 2% y dextrosa al
2%). Luego, se realizó una dilución de 400 veces de cada cultivo en
YPD y se hizo crecer a 30ºC durante 8 horas. Se recolectaron tres
mL de cada cultivo mediante centrifugación y se suspendieron en
NaCl al 0,9% hasta una A600 de aproximadamente 0,3. Estos cultivos
se diluyeron adicionalmente hasta 1 x 10^{4} UFC/mL en caldo de
Sabouraud con dextrosa (6 mL). El péptido recombinante estaba en
acetato 5 mM, NaCl 150 mM, pH 5,0 a una concentración de
aproximadamente 2 mg/mL. El péptido sintético estaba aproximadamente
1 mg/mL. Las muestras se diluyeron en forma seriada y se añadieron a
placas de microtitulación que contenían los cultivos. Las placas
se incubaron a 30ºC durante 48 horas antes de que se midiera la
inhibición del crecimiento. Los resultados de este ensayo fueron los
que figuran a continuación en la Tabla 14.
Cepa | Péptido sintético XMP.391 | Péptido recombinante |
(Concentración que proporciona | (Concentración que proporciona | |
un 95% de inhibición (\muM)) | un 95% de inhibición (\muM)) | |
C. albicans SLU 1 | 13,5 | 16 |
C. albicans 10231 | 16 | 30 |
C. albicans 14053 | 16 | 16 |
C. albicans 26555 | 16 | 30 |
C. glabrata 2001 | 30 | 30 |
S. cerevisiae 9763 | 2,0 | 7,5 |
Adicional o alternativamente, se pueden realizar
ensayos para determinar la actividad de unión a y neutralización de
endotoxina de los péptidos producidos recombinantemente, por medio
de distintos ensayos conocidos, incluyendo los que se describen en
las Patentes de los Estados Unidos de propiedad conjunta Nos.
5.733.872 y 5.763.567 [WO 94/20532 (PCT/US94/02465)]; 5.652.332 y
5.856.438 [WO 95/19372 (PCT/ULTS94/10427)]; 5.858.974 [WO 96/08509
(PCT/US95/09262) y WO 97/04008 (PCT/US96/03845)]; incorporadas por
referencia en su totalidad.
Adicional o alternativamente, se pueden realizar
ensayos para determinar la actividad de unión a y neutralización de
heparina de los péptidos producidos recombinantemente por medio de
distintos ensayos conocidos, incluyendo los ensayos que se
describen en las Patentes de los Estados Unidos Nos. 5.348.942;
5.639.727; 5.807.818; 5.837.678 y 5.854.214 [WO 94/20128
(PCT/US94/02401)]; 5.733.872 y 5.763.567 [WO 94/20532
(PCT/US94/02465)]; 5.652.332 y 5.856.438 [WO 95/19372
(PCT/US94/10427)]; incorporadas por referencia en su totalidad.
Se debe entender que la descripción anterior
enfatiza determinadas realizaciones específicas de la invención y
que todas la modificaciones o alternativas equivalentes a las mismas
están comprendidas dentro del espíritu y el alcance de la invención,
tal como se establece en las reivindicaciones adjuntas. En
particular, se espera que numerosas modificaciones y variaciones en
la práctica de la invención se les ocurran a los expertos en la
técnica tras considerar la descripción anterior respecto a las
realizaciones preferidas de la invención. En consecuencia, las
únicas limitaciones que deberían imponerse al alcance de la presente
invención son las que aparecen en las reivindicaciones
adjuntas.
<110> Better, Marc D.
\hskip1cm Gavit, Patrick D.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Métodos Mejorados para la Producción
de Péptidos Recombinantes
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 1103/11041WO01
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 09/271,970
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1999-03-18
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 557
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)..(548)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta= EcoRI /nota="los
residuos 1-65 comprenden un sitio EcoRI como
comienzo de pel B."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=pel B /nota="pel B es la
secuencia líder del gen de la pectato liasa de Erwinia
carotovora."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta="D Ósea" /nota="D
Ósea es la subunidad de la proteína osteogénica humana (véase,
Patente de EE.UU. No. 5.284.756 p.ej., Fig. 6, Ejemplo 9, Seq ID
Nos: 1 y 2."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (549)..(557)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=XHoI /nota="los residuos
549-557 comprenden el codón de parada y un sitio
XhoI."
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 161
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu Phe His Lys
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatccaccga aagtgggttg gctgatccag ctgttccaca aaaagtaaag c
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 51
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskiptcgagcttta ctttttgtgg aacagctgga tcagccaacc cactttcggt g
\hfill51
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Pro Pro Lys Val Gly Trp Leu Ile Gln Leu
Phe His Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 610
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)..(599)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=EcoRI /nota="los residuos
1-65 comprenden un sitio EcoRI como comienzo de pel
B."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=pel B /nota="pel B es la
secuencia líder del gen de la pectato liasa de Erwinia
caratovora."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta="D Ósea" /nota="D
Ósea es la subunidad de la proteína osteogénica humana (véase,
Patente de EE.UU. No. 5.284.756 p.ej., Fig. 6, Ejemplo 9, Seq ID
Nos: 1 y 2."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (162)..(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=enlazante para escisión
/nota="secuencia enlazante
Ala-Leu-Asp-Pro-Pro
con sitio de escisión Asp-Pro."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (167)..(178)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=secuencia de péptido
/nota="péptido derivado de BPI."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (600)..(610)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=XhoI /nota="los residuos
600-610 comprenden el codón de parada y un sitio
XhoI."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 178
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Lys Trp Lys Ala Gln Phe Arg Phe Leu Lys Lys
Ser Lys Val Gly Trp}
\sac{Leu Ile Leu Leu Phe His Lys Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 61
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 27
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Pro Pro Lys Trp Lys Ala Gln Phe Arg Phe
Leu Lys Lys Ser Lys}
\sac{Val Gly Trp Leu Ile Leu Leu Phe His Lys
Lys}
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 646
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (66)..(635)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(65)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta= EcoRI /nota="los
residuos 1-65 comprenden un sitio EcoRI como
comienzo de pel B."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (1)..(22)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=pel B /nota="pel B es la
secuencia líder del gen de la pectato liasa de Erwinia
caratovora."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (23)..(161)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta="D Ósea" /nota="D
Ósea es la subunidad de la proteína osteogénica humana (véase,
Patente de EE.UU. No. 5.284.756 p.ej., Fig. 6, Ejemplo 9, Seq ID
Nos: 1 y 2."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (162)..(166)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=enlazante para escisión
/nota="secuencia enlazante
Ala-Leu-Asp-Pro-Pro
con sitio de escisión Asp-Pro."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (167)..(190)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=secuencia de péptido
/nota="péptido derivado de BPI."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica_miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (636)..(646)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> /etiqueta=XhoI /nota="los residuos
636-646 comprenden el codón de parada y un sitio
XhoI."
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 190
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1813
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humano
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (31)..(1491)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> péptido_maduro
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (124)..(1491)
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "rBPI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 487
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Humana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<223> "rBPI"
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (29)
1. Un método mejorado para obtener un péptido de
células bacterianas después de la expresión dentro de las células de
una proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende el
péptido, una proteína transportadora y un sitio escindible con ácido
entre el péptido y la proteína transportadora, caracterizado
porque el método comprende tratar las células bacterianas con ácido
para romper o lisar las células y liberar el péptido de la proteína
de fusión en una única etapa.
2. El método de la reivindicación 1, con la etapa
adicional de obtener el péptido liberado separado de las células
rotas o lisadas.
3. El método de la reivindicación 2, en el que el
péptido liberado se separa de las células rotas o lisadas mediante
un dispositivo de separación.
4. El método de la reivindicación 3, en el que el
dispositivo de separación es un dispositivo de centrifugación.
5. El método de la reivindicación 3, en el que el
dispositivo de separación es un dispositivo de filtración.
6. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el sitio escindible con ácido en
la proteína de fusión es Asp-Pro.
7. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la proteína transportadora se
expresa como una proteína insoluble dentro de las células
bacterianas.
8. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la proteína transportadora es una
proteína transportadora catiónica.
9. El método de la reivindicación 8, en el que la
proteína transportadora es la subunidad D de la proteína
osteogénica humana.
10. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en el que la célula bacteriana es E.
coli.
11. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 10, en el que el péptido es un péptido derivado
de BPI.
12. El método de cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que las células bacterianas están en
medios de cultivo celular para el tratamiento con ácido.
13. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 11, en el que las células bacterianas se han
separado de medios de cultivo celular para el tratamiento con
ácido.
14. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 12, en el que las células bacterianas están en
medios de cultivo celular en un recipiente de fermentación para el
tratamiento con ácido.
15. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 14, en el que el ácido es HCl, H_{2}SO_{4}
o HNO_{3}.
16. Un método para obtener un péptido de células
bacterianas después de la expresión dentro de las células de una
proteína de fusión, en el que la proteína de fusión comprende el
péptido, una proteína transportadora y un sitio escindible con ácido
entre el péptido y la proteína transportadora, caracterizado
porque el método compren-
de:
de:
- (a)
- tratar las células bacterianas con ácido para romper o lisar las células y liberar el péptido de la proteína de fusión, en una única etapa,
- (b)
- separar el material soluble del material insoluble después de la etapa (a), y
- (c)
- recuperar el péptido liberado en el material soluble después de la etapa (b).
17. El método de la reivindicación 16, en el que
el material soluble se separa del material insoluble mediante un
dispositivo de separación.
18. El método de la reivindicación 17, en el que
el dispositivo de separación es un dispositivo de
centrifugación.
19. El método de la reivindicación 17, en el que
el dispositivo de separación es un dispositivo de filtración.
20. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 19, en el que el sitio escindible con ácido en
la proteína de fusión es Asp-Pro.
21. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 20, en el que la proteína transportadora se
expresa como una proteína insoluble dentro de la célula
bacteriana.
22. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 21, en el que la proteína transportadora es
una proteína transportadora catiónica.
23. El método de la reivindicación 22, en el que
la proteína transportadora es la subunidad D de la proteína
osteogénica humana.
24. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 23, en el que la célula bacteriana es E.
coli.
25. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 24, en el que el péptido es un péptido
derivado de BPI.
26. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 25, en el que las células bacterianas están en
medios de cultivo celular para el tratamiento con ácido.
27. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 25, en el que las células bacterianas se han
separado de medios de cultivo celular para el tratamiento con
ácido.
28. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 26, en el que las células bacterianas están en
medios de cultivo celular en un recipiente de fermentación para el
tratamiento con ácido.
29. El método de una cualquiera de las
reivindicaciones 16 a 28, en el que el ácido es HCl,
H_{2}SO_{4} o HNO_{3}.
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