DE69433299T2 - Rekombinante spinnerseide analoge - Google Patents

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Description

  • GEBIET DER ERFINDUNG
  • Gegenstand der Erfindung sind neue Spinnenseiden-Proteinanaloga, die sich von der Aminosäure-Konsensus-Sequenz von Wiederholungseinheiten herleiten, die im natürlichen Spinnentragfaden von Nephila clavipes gefunden wird. Der synthetische Spinnentragfaden wurde spezifischer aus rekombinanten Expressionssystemen von E. coli und Bacillus subtilis produziert, worin die Expression aus E. coli in Anteilen stattfindet, die größer als 1 mg Polypeptid voller Länge pro Gramm Zellmasse sind.
  • HINTERGRUND
  • Die ständig zunehmende Nachfrage nach Materialien und Textilstoffen, die ohne die Festigkeit und Haltbarkeit zu beeinträchtigen, sowohl leicht als auch flexibel sind, hat einen Bedarf an neuen Fasern aufkommen lassen, die höhere Toleranzen für solche Eigenschaften, wie zum Beispiel Elastizität, Denier, Zugfestigkeit und Modul, besitzen. Die Suche nach einer besseren Faser hat zur Untersuchung von in der Natur produzierten Fasern geführt, von denen einige bemerkenswerte Qualitäten besitzen. Die Vorteile der von Bombyx mori (der Seidenraupe) produzierten natürlichen Seide sind seit Jahren weithin bekannt gewesen, es wurde jedoch erst kürzlich damit begonnen, auch andere natürlich produzierte Seiden zu untersuchen.
  • Es wurde nachgewiesen, dass Spinnenseiden mehrere wünschenswerte Merkmale aufweisen. Die Radnetz-spinnenden Spinnen können Seide aus sechs verschiedenen Drüsentypen produzieren. Jede der sechs Fasern weist verschiedene mechanische Eigenschaften auf. Sie haben jedoch alle mehrere Merkmale gemein. Sie setzen sich (i) überwiegend oder vollkommen aus Protein zusammen; (ii) unterliegen einem Übergang aus einer löslichen in eine unlösliche Form, die nahezu irreversibel ist; (iii) setzen sich aus Aminosäuren zusammen, die von Alanin, Serin und Glycin dominiert sind und weisen erhebliche Mengen anderer Aminosäuren, wie zum Beispiel Glutamin, Tyrosin, Leucin und Valin, auf. Es wurde vorgeschlagen, dass die Spinnentragfaden-Seidenfaser aus pseudokristallinen Regionen aus einer antiparallelen β-Faltblattstruktur mit dazwischen verteilten elastischen amorphen Segmenten besteht.
  • Die Spinnenseiden reichen von denen, die eine Zugfestigkeit größer als Stahl (7,8 vs. 3,4 g/Denier) aufweisen und denen mit einer größeren Elastizität als Wolle, bis zu anderen, gekennzeichnet durch Grenzen der bis zum Bruch benötigten Energie, die größer als KEVLAR® (1 × 105 vs. 3 × 104 Jkg–1) sind. Liegen diese Charakteristika vor, könnte Spinnenseide als eine leichte Faser von hoher Festigkeit für verschiedene Textilapplikationen verwendet werden.
  • Beim Versuch des Löslichmachens und Reinigens natürlicher Spinnenseide, begegnete man erheblichen Schwierigkeiten, während die Molekulargewichtsintegrität der Faser erhalten bleibt. Die Seidenfasern sind außer in sehr harschen Mitteln, wie zum Beispiel LiSCN, LiClO4 oder 88%iger (v/v) Ameisensäure, unlöslich. Sobald es aufgelöst ist, präzipitiert das Protein, wenn es dialysiert oder mit typischen Puffern verdünnt wird. Ein anderer Nachteil von Spinnenseiden-Protein besteht darin, dass nur kleine Mengen von kultivierten Spinnen zur Verfügung stehen, wobei kommerziell nützliche Seidenproteinmengen zu angemessenen Kosten nicht erreichbar sind. Außerdem werden von jedweder gegebenen Spinne mehrfache Spinnenseidenformen simultan produziert. Das resultierende Gemisch weist weniger Applikationszwecke als eine einzelne isolierte Seide auf, weil die verschiedenen Spinnenseiden- Proteine verschiedene Eigenschaften aufweisen und aufgrund von Solubilisationsproblemen mittels auf ihren physikalischen Merkmalen basierenden Verfahren nicht leicht zu trennen sind. Folglich ist die Produktion kommerzieller Spinnenseidenmengen aus natürlichen Quellen praktisch nicht sehr aussichtsreich, und es bleibt ein Bedarf an einer alternativen Produktionsweise bestehen. Die Technologie der rekombinanten Genetik stellt eine derartige Weise bereit.
  • Durch Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie ist es nun möglich, DNA zum Zweck der Expression erwünschter Proteine in kommerziell nützlichen Mengen zwischen verschiedenen Organismen zu transferieren. Ein derartiger Transfer beinhaltet im Allgemeinen das Verknüpfen geeigneter DNA-Fragmente mit einem Vektor-Molekül, welches dann mittels Transformation in einen Empfängerorganismus eingeführt wird. Transformanten werden durch einen bekannten Marker am Vektor oder durch genetisches oder biochemisches Screening zur Identifikation des klonierten Fragmentes ausgewählt. Vektoren enthalten Sequenzen, die eine autonome Replikation in der Wirtszelle ermöglichen oder die Integration in ein Chromosom im Wirt erlauben.
  • Wenn die klonierte DNA-Sequenz ein Protein kodiert, müssen eine Reihe von Ereignissen auftreten, um eine Synthese dieses Fremdproteins in einer aktiven Form in der Wirtszelle zu erhalten. Es müssen Promotor-Sequenzen anwesend sein, um die Transkription des Gens durch RNA-Polymerase zu erlauben, und in der transkribierten mRNA müssen ein Ribosomen-Bindungsort und ein Initiationscodon zur Translation durch Ribosomen anwesend sein. Diese transkriptionalen und translationalen Erkennungssequenzen werden im Allgemeinen zur wirksamen Bindung durch die Wirts-RNA-Polymerase und -Ribosomen optimiert, und durch die umsichtige Wahl von Vektoren ist es oft möglich, eine wirksame Expression vieler Fremdgene in einer Wirtszelle zu erhalten.
  • Während viele der Probleme einer effizienten Transkription und Translation im Allgemeinen erkannt wurden und ihnen größtenteils begegnet wurde, stellt die Synthese faserbildender Fremdpolypeptide, die eine hohe Anzahl an Wiederholungseinheiten enthalten, einzigartige Probleme dar. Gene, die Proteine dieses Typs kodieren, neigen aufgrund der sich wiederholenden Nukleinsäuresequenzen zur genetischen Instabilität. Sie kodieren idealerweise Proteine von hohem Molekulargewicht, die aus mindestens 800 Aminosäureresten und im Allgemeinen mit beschränkten Aminosäurezusammensetzungen bestehen. Während E. coli endogene Proteine mit über 1000 Resten produziert, scheint die Produktion langer Proteine von beschränkter Aminosäurezusammensetzung eine unausgeglichene Belastung auf das biosynthetische System aufzuerlegen, was – wahrscheinlich aufgrund einer abortiven Translation – in der Produktion trunkierter Produkte resultiert.
  • Trotz der vorstehend erwähnten Schwierigkeiten ist die rekombinante Expression faserbildender Proteine aus dem Stand der Technik bekannt. Chatellard et al., Gene, 81, 267, (1989) lehren das Klonieren und die Expression des trimeren Faserproteins des humanen Adenovirus Typ 2 aus E. coli. Das Genexpressionssystem verließ sich auf die RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7, und die optimale Genexpression wurde bei 30°C erhalten, wenn das Fremdprotein Konzentrationen von 1% bezogen auf das des Gesamtwirtsprotein erreichte.
  • Goldberg et al., Gene, 80, 305, (1989) offenbaren das Klonieren und die Expression in E. coli eines synthetischen Gens, kodierend ein Kollagen-Analogon (Poly-(Gly-Pro-Pro)). Das größte DNA-Insert lag in der Größenordnung von 450 Basenpaaren, und es wurde vorgeschlagen, dass große Segmente einer hoch repetitiven DNA in E. coli instabil sein könnten.
  • Ferrari et al. (WO 8803533) offenbaren Verfahren und Zusammensetzungen zur Produktion von Polypeptiden mit repetitiven Oligomereinheiten, wie zum Beispiel diejenigen, die in seiden- und elastinähnlichen Proteinen durch die Expression synthetischer Strukturgene gefunden werden. Die DNA-Sequenzen von Ferrari kodieren Peptide, enthaltend eine Oligopeptid-Wiederholungseinheit, die mindestens 3 verschiedene Aminosäuren und insgesamt 4–30 Aminosäuren enthalten, wobei mindestens 2 Wiederholungseinheiten im Peptid und mindestens 2 identische Aminosäuren in jeder Wiederholungseinheit vorliegen.
  • Cappello et al. (WO 9005177) lehren die Produktion eines proteinartigen Polymers aus transformierten prokaryotischen Wirten, umfassend Stränge aus Wiederholungseinheiten, die in ausgerichteten Strängen und DNA-Sequenzen, kodierend dieselben, assembliert werden können. Die Wiederholungseinheiten leiten sich von natürlichen Polymeren, wie zum Beispiel Fibroin, Elastin, Keratin oder Kollagen her.
  • Das Klonieren und die Expression seidenähnlicher Proteine ist auch bekannt. Ohshima et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5363, (1977) berichteten das Klonieren des Seidenfibroin-Gens komplett mit flankierenden Sequenzen von Bombyx mori in E. coli. Petty-Saphon et al. ( EP 230702 ) offenbaren die rekombinante Produktion von Seidenfibroin und Seidensericin aus einer Varietät von Wirten, einschließlich E. coli, Saccharomyces cerevisiae, Pseudomonas sp., Rhodopseudomonas sp., Bacillus sp. und Streptomyces sp. In den bevorzugten Ausführungsformen wird die Expression sich von Bombyx mori herleitenden Seidenproteinen besprochen.
  • Fortschritte wurden auch beim Klonieren und bei der Expression von Spinnenseiden-Proteinen gemacht. Xu et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA., 87, 7120, (1990) berichten die Bestimmung der Sequenz für einen Anteil der repetitiven Sequenz eines Tragfaden-Seidenproteins, Spidroin 1, von der Spinne Nephila clavipes, basierend auf einem partialen cDNA-Klon. Die Wiederholungseinheit ist maximal 34 Aminosäuren lang und ist nicht rigide konserviert. Die Wiederholungseinheit setzt sich aus zwei unterschiedlichen Segmenten zusammen: (i) einem aus 10 Aminosäuren bestehenden Segment, das von einer Polyalanin-Sequenz von 5–7 Resten dominiert wird; (ii) aus einem aus 24 Aminosäuren bestehenden Segment, das in Sequenz konserviert ist, das aber Deletionen von Vielfachen von 3 Aminosäuren in vielen der Wiederholungen aufweist. Die letztere Sequenz besteht vorwiegend aus GlyXaaGly-Motiven, wobei Xaa Alanin, Tyrosin, Leucin oder Glutamin darstellt. Die Codon-Verwendung für diese DNA ist hoch selektiv, wobei die Verwendung von Cytosin oder Guanin in der dritten Position vermieden wird.
  • Hinman und Lewis, J. Biol. Chem. 267, 19320 (1992) berichten über die Sequenz eines partialen cDNA-Klons, kodierend einen Anteil der Wiederholungssequenz eines zweiten Fibroin-Proteins, Spidroin 2, aus der Tragfaden-Seide von Nephila clavipes. Die Wiederholungseinheit von Spidroin 2 ist maximal 51 Aminosäuren lang und ist auch nicht rigide konserviert. Die Frequenz der Codon-Verwendung von Spidroin 2-cDNA ist der von Spidroin 1 sehr ähnlich.
  • Lewis et al. ( EP 452925 ) offenbaren die Expression von Spinnenseiden-Proteinen, einschließlich Proteinfragmenten und -varianten von Nephila clavipes aus transformierten E. coli. Zwei distinkte Proteine wurden unabhängig identifiziert und kloniert und wurden als Seidenprotein 1 (Spidroin 1) und Seidenprotein 2 (Spidroin 2) voeinander unterschieden.
  • Lombardi et al. (WO 9116351) lehren die Produktion von rekombinantem Spinnenseiden-Protein, umfassend eine amorphe Domäne oder Untereinheit und eine kristalline Domäne oder Untereinheit, worin die Domäne oder Untereinheit auf einen Anteil des Proteins verweist, der eine sich wiederholende Aminosäuresequenz enthält, die eine bestimmte mechanisch-strukturelle Eigenschaft bereitstellt.
  • Die vorstehend erwähnten Expressionssysteme sind zur Produktion rekombinanter Seiden und Seidevarianten nützlich, alle verlassen sich jedoch auf das spezifisch klonierte Gen eines Seide produzierenden Organismus. Eine nachteilige Wirkung dieser Systeme besteht darin, dass die Verwendung von Codonen zur Produktion von Fremdproteinen in einem rekombinanten Wirt nicht optimiert ist. Es ist im Fach weithin bekannt, dass die Expression eines Fremdgens effizienter ist, wenn Codonen, die nicht vom Organismus begünstigt werden, in dem Expression erwünscht ist, vermieden werden. In rekombinante Wirte klonierte Fremdgene verlassen sich häufig auf die Verwendung eines Codons, das im Wirt typischerweise nicht gefunden wird. Dies führt häufig zu schlechten Ausbeuten des Fremdproteins.
  • Folglich bleibt ein Bedarf an einem Verfahren zur Herstellung eines Spinnenseiden-Proteins in kommerziell nützlichen Mengen bestehen. Es ist eine erfindungsgemäße Aufgabe, diesen Bedarf durch Bereitstellung neuer DNA-Sequenzen, kodierend Varianten von Konsensus-Sequenzen, die sich von Seidenproteinen herleiten, die in einem Fremdwirt mit der Fähigkeit zur Herstellung synthetischer Proteine in kommerziell nützlichen Mengen von 1% bis 30% bezogen auf das Gesamtwirtsprotein exprimiert werden können, zufriedenzustellen.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Es wird erfindungsgemäß ein Spinnentragfaden-variantes Protein bereitgestellt, definiert durch eine Formel, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus:
    • A) [AGQGGYGGLGXQGAGRGGLGGQGAGAnGG]z worin X = S, G oder N; n = 0–7 und z = 1–75; und worin der Wert von z die Anzahl von Wiederholungen in dem varianten Protein bestimmt und worin die Formel Variationen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus:
    • (a) wenn n = 0, die Sequenz, die AGRGGLGGQGAGAnGG umfasst, deletiert ist;
    • (b) AGQGGYGGLGSQGAGRG-GQGAGAAAAAA-GG
    • (e) die Deletion von GYG in jedweder Wiederholung von der Deletion von GRG in der gleichen Wiederholung begleitet ist; und
    • (d) worin eine erste Wiederholung, worin n = 0 vorhanden ist, der ersten Wiederholung eine zweite Wiederholung vorausgeht, worin n = 6; und
    • B) [GPGGYGPGQQGPGGYGPGQQGPGGYGPGQQGPSGPGSAn] z worin n = 6–10 und z = 1–75 und worin sich individuelle Wiederholungen der Konsensus-Wiederholungssequenz durch Deletionen von ganzen Vielfachen von fünf konsekutiven Resten, bestehend aus einer oder beiden der Pentapeptid-Sequenzen GPGGY oder GPGQQ, unterscheiden.
  • Es wird erfindungsgemäß weiter ein Verfahren zur Produktion eines erfindungsgemäßen synthetischen Spinnentragfaden-varianten Proteins bereitgestellt, umfassend die Schritte von:
    • (i) Design einer DNA-Monomersequenz von zwischen ca. 50 bp und 1000 bp, die für ein Polypeptid-Monomer kodiert, bestehend aus einer Variante einer Konsensus-Sequenz, hergeleitet aus den faserbildenden Regionen des Spinnentragfaden-Proteins und definiert durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 18;
    • (ii) Assemblieren des DNA-Monomers von Schritt (i);
    • (iii) Polymerisieren des DNA-Monomers von Schritt (ii) zur Bildung eines synthetischen Gens, kodierend ein Seiden-variantes Protein voller Länge;
    • (iv) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, enthaltend das synthetische Gen von Schritt (iii);
    • (v) Exprimieren des synthetischen Gens, wobei das durch das synthetische Gen kodierte Protein (a) in Anteilen zwischen 1 mg und 300 mg Protein der vollen Länge pro Gramm Zellmasse produziert oder (b) in das extrazelluläre Medium sezerniert wird; und
    • (vi) Wiedergewinnen des in Schritt (v) exprimierten Proteins in einer Form, die zu einer Faser gebildet werden kann.
  • Es werden erfindungsgemäß neue Plasmide, enthaltend DNA-Zusammensetzungen bereitgestellt, die Spinnenseide-variante Proteine kodieren und neue transformierte Wirtszellen, enthaltend diese Plasmide, die zum Exprimieren des Seide-varianten Proteins in Anteilen von größer als 1 mg Polypeptid voller Länge pro Gramm Zellmasse fähig sind.
  • Im erfindungsgemäßen Umfang eingeschlossen sind auch transformierte Wirtszellen, die zur Sekretion von Spinnentragfaden-Proteinanaloga voller Länge in das Zellwachstumsmedium fähig sind.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform wird ein artifizielles Gen zum Kodieren eines Analogons von einem Spinnenseiden-Protein, einem der Proteine der Tragfadenfaser von Nephila clavipes konstruiert. Es sind Mittel vorgesehen, wodurch ein derartiges artifizielles Gen zum Kodieren eines Proteins von ca. der gleichen Länge wie das natürliche Protein assembliert und polymerisiert werden kann. Es sind weiter Mittel vorgesehen, wodurch ein derartiges artifizielles Gen auf eine regulierte Art und Weise in einem Bakterienwirt exprimiert werden kann, wobei große Mengen seines Proteinprodukts produziert werden können. Dieses Proteinprodukt kann in gereinigter Form hergestellt werden, die zur Bildung zu einer Faser geeignet ist. Während es sich bei dem erfindungsgemäßen Gegenstand um ein Spinnenseide-variantes Protein handelt, ist zur Kenntnis zu nehmen, dass die Erfindung erweitert werden kann, um andere hoch repetitive faserbildende Proteine oder variante Formen dieser natürlichen Proteine einzuschließen.
  • Es werden erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung kommerziell nützlicher Mengen von Spinnenseiden-Proteinen in Mikroorganismen unter Verwendung rekombinanter DNA-Technologie bereitgestellt. Mikrobielle Verfahren zur Herstellung derartiger Proteine würden mehrere Vorteile bereitstellen. So würden zum Beispiel mikrobielle Quellen die Basis zur Produktion faserbildender Proteine in großen Mengen bei ausreichend niedrigen Kosten für kommerzielle Applikationen bereitstellen. Mikrobielle Wirte würden sowohl die Applikation rekombinanter DNA-Technologie zur Konstruktion und Produktion varianter Formen faserbildender Proteine als auch neue Proteine bereitstellen, welche die Verwendungszwecke dieser Fasern erweitern könnten. Die mikrobielle Produktion würde darüber hinaus die rasche Herstellung von Proben varianter Proteine zum Testen erlauben. Derartige Proteine wären frei von anderen in der natürlichen Faser gefundenen Proteinen, wobei ermöglicht wird, die Eigenschaften der einzelnen Proteine getrennt zu untersuchen.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • SEQUENZPROTOKOLL UND BIOLOGISCHE HINTERLEGUNGEN
  • 1 erläutert die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 19) des natürlichen Spinnentragfaden-Proteins, Spidroin 1, wie von Xu et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA., 87, 7120, (1990), offenbart.
  • 2 erläutert die Aminosäuresequenzen für das Monomer (SEQ ID NO: 20) und Polymer (SEQ ID NO: 21) des Spinnenseiden-DP-1A.9-Analogons (SEQ ID NO: 80).
  • 3 erläutert die Aminosäuresequenzen für das Monomer (SEQ ID NO: 22) und Polymer (SEQ ID NO: 23) des Spinnenseiden-DP-1B.9-Analogons (SEQ ID NO: 81).
  • 4 erläutert die bei der Konstruktion des DNA-Monomers für die DP-1-Proteinexpression verwendeten synthetischen Oligonukleotide L (SEQ ID NO: 24–26), M1 (SEQ ID NO: 27–29), M2 (SEQ ID NO: 30–32) und S (SEQ ID NO: 33–35).
  • 5 stellt eine Plasmidkarte dar, welche die Konstruktion von Plasmid pFP510 aus pA126i erläutert. Plasmid pFP510 wird zur Konstruktion von Plasmiden zum Assemblieren und Polymerisieren von DNA-Monomeren und Genen verwendet, die DP-1A-Analoga kodieren.
  • 6 stellt eine Plasmidkarte von Plasmid pFP202 dar, welche zur Konstruktion von Expressionsvektoren in großem Umfang verwendet wird.
  • 7 erläutert die sechs doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotide, A (SEQ ID NO: 41–43), B (SEQ ID NO.: 44–46), C (SEQ ID NO: 47–49), D (SEQ ID NO: 50–52), E (SEQ ID NO: 53–55) und F (SEQ ID NO: 56–58), die bei der Konstruktion des DNA-Monomers für die DP-2-Protein-Expression verwendet werden.
  • 8 erläutert die Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 59) des natürlichen Spinnenseiden-Proteins, Spidroin 2, wie von Lewis et al. ( EP 452925 ) beschrieben.
  • 9 erläutert die Aminosäuresequenzen des Aminosäure-Monomers (SEQ ID NO: 60) und Polymers (SEQ ID NO: 61) des Analogons des Spinnentragfaden-Proteins 2, DP-2A (SEQ ID NO: 83).
  • 10 erläutert die Aminosäuresequenzen des Aminosäure-Monomers (SEQ ID NO: 62) und Polymers (SEQ ID NO: 63) des Analogons des Spinnentragfaden-Proteins 1, DP-1B.16 (SEQ ID NO: 82).
  • 11 erläutert die vier doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotide 1 (SEQ ID NO: 64–66), 2 (SEQ ID NO: 67–69), 3 (SEQ ID NO: 70–72) und 4 (SEQ ID NO: 73–75), die zur Konstruktion der synthetischen Gene, kodierend DP-1B.16 (SEQ ID NO: 82), verwendet werden.
  • 12 stellt eine Plasmidkarte dar, welche die Konstruktion des Plasmids pFP206 aus pA126i erläutert. Plasmid pFP206 wurde zur Konstruktion von Plasmiden verwendet, die zur Assemblierung und Polymerisation des DNA-Monomers und Gene, kodierend DP-1B-Analoga, verwendet werden.
  • 13 erläutert die vollständige Nukleinsäuresequenz (SEQ ID NO: 78) von Plasmid pA126i.
  • 14 erläutert die vollständige DNA-Sequenz (SEQ ID NO: 79) von pBE346.
  • 15 stellt eine Plasmidkarte dar, welche die Konstruktion des Plasmids pFP191 erläutert, das zur Transformation von B. subtilis-Zellen für die DP-1A-analoge Protein-Expression und -Sekretion verwendet wird.
  • 16 erläutert die vier synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotide P1, P2, P3 und P4, die zur Konstruktion der synthetischen Gene, kodierend DP-1B.33, verwendet werden.
  • P1 entspricht SEQ ID NO: 84, 85 und 86.
  • P2 entspricht SEQ ID NO: 87, 88 und 89.
  • P3 entspricht SEQ ID NO: 90, 91 und 92.
  • P4 entspricht SEQ ID NO: 93, 94 und 95.
  • 17 stellt eine Plasmidkarte von Plasmid pHIL-D4 dar, die zur Konstruktion von Vektoren zur intrazellulären Protein-Expression in Pichia pastoris verwendet wird.
  • 18 stellt eine Plasmidkarte von Plasmid pPIC9 dar, die zur Konstruktion von Vektoren zur extrazellulären Protein-Produktion in P. pastoris verwendet wird.
  • 19 erläutert die DNA-Sequenz eines Anteils von Plasmid pFO734, einem Intermediärprodukt bei der Konstruktion von Vektoren zur extrazellulären Protein-Produktion in P. pastoris.
  • 20 erläutert die DP-1B-Produktion durch den P. pastoris-Stamm YFP5028.
  • 21 erläutert die DP-1B-Produktion durch den P. pastoris-Stamm YFP5093.
  • Die Anmelder haben Sequenzprotokolle 1–107 unter Befolgung der „Regelung für die Standard-Darstellung von Nukleotid- und Aminosäuresequenzen in Patentanmeldungen" (Anhänge I und II zur Entscheidung des Präsidenten des EPA, veröffentlicht in Supplement Nr. 2 zu OJ EPA 12/1992), bereitgestellt.
  • Die Anmelder haben unter den Bedingungen des Budapester Vertrags die folgenden biologischen Hinterlegungen vorgenommen.
  • Figure 00070001
  • Die Kennzeichnung „ATCC", wie hierin verwendet, verweist auf die American Type Culture Collection Hinterlegungsstelle in Rockville, Maryland, in 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA. Die „ATCC-Nr." stellt die Zugriffsnummer auf die bei der ATCC hinterlegten Kulturen dar.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die folgenden Definitionen werden hierin verwendet, und es sollte auf sie zwecks Interpretation der Ansprüche und der Patentschrift Bezug genommen werden.
  • Die Begriffe „Promotor" und „Promotor-Region", wie hierin verwendet, verweisen auf eine DNA-Sequenz, gewöhnlich oberstromig (5' bis zu) der Protein kodierenden Sequenz eines Strukturgens, das die Expression der Kodierregion durch Bereitstellung der Erkennung der RNA-Polymerase und/oder anderer Faktoren, die zur Transkription zum Start am korrekten Ort erforderlich sind, kontrolliert. Promotor-Sequenzen sind notwendig, aber nicht immer ausreichend, um die Expression des Gens anzutreiben.
  • Ein „Fragment" konstituiert eine Fraktion der DNA-Sequenz der speziellen Region.
  • „Nukleinsäure" verweist auf ein Molekül, das einzel- oder doppelsträngig sein kann, sich aus Monomeren (Nukleotiden) mit einem Zucker, Phosphat und entweder einem Purin oder Pyrimidin zusammensetzt. In Bakterien, niederen Eukaryoten und in höheren Tieren und Pflanzen verweist „Desoxyribonukleinsäure (DNA) auf das genetische Material, während „Ribonukleinsäure" (RNA) an der Translation der Information aus der DNA in Proteine beteiligt ist.
  • Die Begriffe „Peptid", „Polypeptid" und „Protein" werden miteinander auswechselbar verwendet.
  • „Regulation" und „regulieren" verweisen auf die Modulation der Genexpression, die von den DNA-Sequenzelementen, die primär, aber nicht ausschließlich oberstromig von (5' bis zum) Transkriptionsbeginn eines Gens lokalisiert ist, kontrolliert wird. Die Regulation kann auf eine Stimulation in einer vollkommenen oder keiner Reaktion resultieren, oder sie kann in Variationen des Umfangs der Genexpression resultieren.
  • Der Begriff „kodierende Sequenz" verweist auf den Anteil eines Gens, kodierend ein Protein, Polypeptid oder einen Anteil davon, und schließt die regulierenden Sequenzen, welche die Initiierung der Transkription antreiben, aus. Die kodierende Sequenz kann eine ununterbrochene Kodierungsregion konstituieren, oder sie kann ein oder mehrere Intron(en) einschließen, die durch geeignete Splice-Verbindungen gebunden sind. Die kodierende Sequenz kann ein Verbund von Segmenten sein, die sich von verschiedenen Quellen, die natürlich vorkommen oder synthetisch sind, herleiten.
  • Der Begriff „Konstruktion" oder „Konstrukt" oder Konstruieren verweist auf ein Plasmid, ein Virus, eine autonome Replikationssequenz, einen Phagen oder eine Nukleotidsequenz, linear oder ringförmig, aus einer einzel- oder doppelsträngigen DNA oder RNA, die sich von jedweder Quelle herleiten, worin eine Anzahl von Nukleotidsequenzen verknüpft oder zu einer einzigartigen Konstruktion rekombiniert wurden, die zum Einführen eines Promotor-Fragmentes und einer DNA-Sequenz für ein ausgewähltes Genprodukt zusammen mit der entsprechenden 3'-untranslatierten Sequenz in eine Zelle fähig ist.
  • Wie hierin verwendet, stellt „Transformation" die Akquisition neuer Gene in einer Zelle durch die Inkorporation von Nukleinsäure dar.
  • Der Begriff „funktionsfähig verknüpft" verweist auf die chemische Fusion zweier DNA-Fragmente in einer vorschriftsmäßigen Orientierung und einem Leserahmen, um zur Transkription von funktioneller RNA zu führen.
  • Unter dem Begriff „Expression", wie hierin verwendet, versteht man die Transkription und Translation zum Genprodukt aus einem Gen, kodierend für die Sequenz des Genprodukts. Bei der Expression wird eine DNA-Kette, kodierend für die Sequenz des Genprodukts zuerst zu einer komplementären RNA, bei der es sich häufig um eine Messenger-RNA handelt, transkribiert, und dann wird die auf diese Weise transkribierte Messenger-RNA in das vorstehend erwähnte Genprodukt translatiert, wenn das Genprodukt ein Protein ist.
  • Der Begriff „Translationsinitiationssignal" verweist auf eine Einheit aus drei Nukleotiden (Codon) in einer Nukleinsäure, welche die Initiierung der Proteinsynthese spezifiziert.
  • Der Begriff „Signalpeptid" verweist auf ein Amino-terminales Polypeptid, das dem sezernierten maturen Protein vorausgeht. Das Signalpeptid wird von dem maturen Protein gespalten und liegt deshalb nicht darinnen vor. Signalpeptide weisen die Funktion des Richtens und der Translokation sezernierter Proteine über die Zellmembranen auf. Auf das Signalpeptid wird auch als auf die Signalsequenz verwiesen.
  • Der Begriff „matures Protein" verweist auf das endgültig sezernierte Proteinprodukt ohne jedweden daran gebundenen Teil des Signalpeptids.
  • Der Begriff „Plasmid" oder „Vektor", wie hierin verwendet, verweist auf ein extra-chromosomales Element, das häufig Gene trägt, die keinen Teil des zentralen Metabolismus der Zelle bilden und gewöhnlich in der Form ringförmiger doppelsträngiger DNA-Moleküle vorliegen.
  • Der Begriff „Restriktionsendonuklease" verweist auf ein Enzym, das hydrolytische Spaltung in einer spezifischen Nukletotidsequenz in doppelsträngiger DNA katalysiert.
  • Der Begriff „kompatible Restriktionsorte" verweist auf verschiedene Restriktionsorte, die – wenn gespalten – Nukleotidenden ergeben, die ohne jedwede zusätzliche Modifikation ligiert werden können.
  • Der Begriff „geeigneter Promotor" verweist auf jedweden eukaryotischen oder prokaryotischen Promotor, der zum Antreiben der Expression eines synthetischen Spinnenseide-varianten Gens fähig ist.
  • Der Begriff „Spinnenseide-variantes Protein" verweist auf ein Protein-Design, dessen Aminosäuresequenz auf repetitiven Sequenzmotiven und -variationen davon basiert, die in einer bekannten natürlichen Spinnenseide gefunden werden.
  • Der Begriff „variantes Protein voller Länge" verweist auf jedwedes Spinnenseide-variante Protein, kodiert durch ein synthetisches Gen, das durch die Assemblierung und Polymerisation eines DNA-Monomers konstruiert wurde.
  • Der Begriff „DNA-Monomer" verweist auf ein DNA-Fagment, bestehend aus zwischen 300 und 400 bp, die eine oder mehrere Wiederholungsaminosäuresequenz(en) eines Spinnenseide-varianten Proteins kodieren. Beispiele von DNA-Monomeren, die erfindungsgemäß geeignet sind, sind in 2, 3, 9 und 10 erläutert.
  • Der Begriff „Peptidmonomer", „Polypeptidmonomer" oder „Aminosäure-Monomer" verweist auf die durch ein DNA-Monomer kodierte Aminosäuresequenz.
  • Der Begriff „kommerzielle Mengen" verweist auf Mengen rekombinant produzierter erwünschter Proteine, bei denen mindestens 1% des durch eine mikrobielle Kultur produzierten Gesamtproteins das gewünschte Protein ist.
  • Der Begriff „gewünschtes Protein" verweist auf jedwedes Protein, das für ein aus genetisch manipulierten Bakterien zu erhaltendes wertvolles Produkt gehalten wird.
  • Der Begriff „DP-1-Analogon" verweist auf jedwede Spinnenseide-Variante, die sich von der Aminosäuresequenz des natürlichen Proteins 1 (Spidroin 1) von Nephila calvipes, wie in 1 erläutert, herleitet.
  • Der Begriff „DP-2-Analogon" verweist auf jedwede Spinnenseide-Variante, die sich von der Aminosäuresequenz des natürlichen Proteins 2 (Spidroin 2) von Nephila calvipes, wie in 8 erläutert, herleitet.
  • Wie hierin verwendet, werden die folgenden Abkürzungen zur Identifikation spezifischer Aminosäuren verwendet:
    Figure 00100001
  • Es sind erfindungsgemäß auch neue DNA-Sequenzen bereitgestellt, die Spinnenseide-Protein-Varianten kodieren, die zur Expression kommerzieller Seiden-Proteinmengen in einem rekombinanten Wirt geeignet sind.
  • Es wird erkannt werden, dass die Vorteile eines derartigen Proteins und eines derartigen Verfahrens vielfältig sind. Spinnenseide, besonders Tragfaden-Seide weist eine Zugfestigkeit von über 200 ksi mit einer Elastizität von nahezu 35% auf, wodurch es schwieriger zu zerreißen ist als entweder KEVLAR oder Stahl. Wenn sie zu Fasern gesponnen wird, kann die erfindungsgemäße Spinnenseide Applikationszwecke bei der Massenanfertigung in den Bekleidungsindustrien aufweisen und ebenso für bestimmte Arten von Verwendungen von hoher Festigkeit, wie zum Beispiel Seilen, chirurgischen Nahtmaterialien, flexiblen Bindungen zum Festbinden bestimmter elektrischer Komponenten und selbst als ein Biomaterial zur Implantation (z. B. künstlicher Ligamente oder Aortabändelung) anwendbar sein. Außerdem können diese Fasern mit verschiedenen Kunststoffen und/oder Harzen zur Herstellung eines faserverstärkten Kunststoffs und/oder Harzproduktes gemischt werden. Da Spinnenseide überdies bis zu 100°C stabil ist, können diese Fasern zur Verstärkung thermisch injizierter Kunststoffe verwendet werden. Diese Proteine können auch in der Form von Folien oder Beschichtungen wertvoll sein. Es wird von einem Fachmann erkannt werden, dass die Eigenschaften der Seidenfasern durch Veränderung der Aminosäuresequenz des Proteins verändert werden können.
  • Es wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Analoga natürlicher Spinnenseiden-Proteine und -Varianten unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie bereitgestellt. Das Verfahren besteht aus: (1) dem Design analoger Proteinsequenzen, basierend auf der Aminosäuresequenz der faserbildenden Regionen natürlicher Proteine; (2) dem Design von DNA-Sequenzen zum Kodieren dieser analogen Proteinsequenzen, basierend auf einem DNA-Monomer von mindestens 50 bp mit minimaler interner Repetitivität, und präferenzieller Verwendung von Codonen, die den Präferenzen eines spezifischen Wirtsorganismus angepasst sind; (3) Assemblieren des DNA-Monomers aus klonierten synthetischen Oligonukleotiden; (4) Polymerisation des DNA-Monomers zu Längen von mindestens 800 bp und bevorzugt zu Längen, die sich der Länge des Gens, kodierend das natürliche Protein, annähern; (5) Insertion des polymerisierten artifiziellen Gens in einen geeigneten Vektor, der zur Replikation im Wirtsorganismus auf eine derartige Weise fähig ist, dass das Gen funktionsfähig an die Expressionssignale gebunden wird, wobei seine Expression reguliert werden kann; (6) Produktion des Proteins im vorstehend erwähnten mikrobiellen Wirt, der einen derartigen Expressionsvektor trägt; (7) Reinigen des Proteins aus der Biomasse und seine Herstellung in einer Form, die zur Bildung zu Fasern, Folien oder Beschichtungen geeignet ist.
  • Die Expression des gewünschten Seide-varianten Proteins in Escherichia coli ist bevorzugt, da dieser Wirt große Mengen Fremdprotein zuverlässig produziert und das Fach mit geeigneten Transformations- und Expressionsvektoren reichlich versehen ist. Die Bereitstellung alternativer Wirte und insbesondere Wirte, welche die Sekretion des gewünschten Proteins in das Wachstumsmedium erleichtern, liegt jedoch nicht außerhalb des erfindungsgemäßen Rahmens. Derartige alternative Wirte können Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Aspergillus spp., Hansenula spp., und Streptomyces spp. einschließen, sind aber nicht beschränkt darauf. Der für die Sekretion von Seide-variantem Protein bevorzugte Expressionswirt ist Bacillus subtilis.
  • Es werden erfindungsgemäß eine Reihe verschiedener Plasmide oder Vektoren bereitgestellt, die zum Klonieren von Anteilen der DNA, die zum Assemblieren und zur Expression des Seide-varianten Proteingens in E. coli erforderlich sind, geeignet ist. Zur Konstruktion geeignete Vektoren enthalten einen auswählbaren Marker und Sequenzen, die eine autonome Replikation oder chromosomale Integration enthalten. Zur Expression geeignete Vektoren enthalten außerdem Sequenzen, welche die Transkription und Translation des heterologen DNA-Fragments richten. Diese Vektoren umfassen eine Region 5' des heterologen DNA-Fragmentes, in dem die transkriptionalen Initiationskontrollen untergebracht sind und optional eine Region 3' des DNA-Fagmentes, welches die transkriptionale Termination kontrolliert. Es ist am bevorzugtesten, wenn sich beide Kontrollregionen von zu E. coli homologen Genen herleiten, obwohl man zur Kenntnis nehmen sollte, dass diese Kontrollregionen sich nicht von den Genen herzuleiten brauchen, die zu den als einen Produktionswirt gewählten spezifischen Spezies nativ sind. Geeignete Vektoren können zum Beispiel von einem Bakterium, einem Virus (wie zum Beispiel Bakteriophagen T7 oder einem M-13 hergeleiteten Phagen), einem Cosmid, einer Hefe oder einer Pflanze hergeleitet werden. Protokolle zum Erhalt und zur Verwendung dieser Vektoren sind dem Fachmann bekannt. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual – Bände 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989}).
  • Beispiele sich von Bakterien herleitenden Vektoren schließen Plasmid-Vektoren, wie zum Beispiel pBR322, pUC19, pSP64, pUR278 und pORF1 ein. Beispielhafte geeignete Virusvektoren sind die, die sich von Phagen, Vaccinia, Retrovirus, Baculovirus oder einem bovinen Papillomvirus herleiten. Beispiele von Phagenvektoren schließen λ+, λEMBL3, 12001, λgt10, λgt11, Charon 4a, Charon 40 und λZAP/R ein. pXB3 und pSC11 sind beispielhaft für Vaccinia-Vektoren (Chakrabarti et al., Molec. Cell. Biol. 5: 3401-9 (1985) und Mackett et al., J. Virol. 49: 857864 (1984). Ein Beispiel eines filamentösen Phagenvektors ist ein sich von M13 herleitender Vektor wie M13mp18 und M13mp19.
  • Für die Expression von Spinnenseide-varianten Proteinen in E. coli sind sich von Bakterien herleitende Vektoren bevorzugt, wobei sich von pBR322 herleitende Plasmide am bevorzugtesten sind.
  • Optional kann die Herstellung des Seide-varianten Proteins als ein Sekretionsprodukt eines transformierten Wirts, wie zum Beispiel B. subtilis, erwünscht sein. Sekretion erwünschter Proteine in die Wachstumsmedien weist den Vorteil vereinfachter und weniger kostspieliger Reinigungsverfahren auf. Es ist dem Fachmann weithin bekannt, dass die Sekretionssignal-Sequenzen oft bei der Erleichterung des aktiven Transports von exprimierbaren Proteinen über die Zellmembranen nützlich sind. Die Schaffung eines transformierten Bacillus-Wirtes, der zur Sekretion fähig ist, kann durch die Inkorporation einer DNA-Sequenz, die für ein Sekretionssignal kodiert, das im Bacillus-Produktionswirt auf der Expressionskassette funktional ist, zwischen der Expressions-kontrollierenden DNA und der DNA, kodierend das Seide-variante Protein und im Leserahmen mit dem Letzteren, erreicht werden. Beispiele von Vektoren, welche die Sekretion einer Anzahl verschiedener heterologer Proteine durch B. subtilis ermöglichen, wurden gelehrt und sind in Nagarajan et al., US-Patent 4,801,537; Stephens et al., US-Patent 4,769,327; und Biotechnology Handbook 2, Bacillus, C. R. Harwood, Hrsg., Plenum Press, New York (1989) beschrieben.
  • Erfindungsgemäße Sekretionsvektoren schließen eine regulierbare Promotor-Sequenz, welche die Transkription kontrolliert, eine Sequenz für einen Ribosomen-Bindungsort, der die Translation kontrolliert, und eine Sequenz für ein Signalpeptid, welches die Translokation des Peptids durch die Bakterienmembran und die Spaltung des Signalpeptids aus maturen Protein ermöglicht, ein. Geeignete Vektoren sind die, die mit dem eingesetzten Bakterium kompatibel sind. So schließen solche für B. subtilis geeignete Vektoren E. coli-B. subtilis-Shuttle-Vektoren ein. Sie weisen kompatible Regulationssequenzen und Replikationsstartpunkte ein. Sie weisen bevorzugt eine hohe Kopienzahl und ein selektives Markergen, wie zum Beispiel ein Gen, kodierend für Antibiotikum-Resistenz auf. Ein Beispiel eines derartigen Vektors ist ein pTZ18R-Phagemid, das von Pharmacia, Piscataway, NJ 08854 erhältlich ist, das Resistenz gegen Ampicillin in E. coli verleiht. Die DNA-Sequenzen, kodierend den Promotor, den Ribosomenbindungsort und das Signalpeptid, können aus jedwedem einzelnen Gen stammen, das ein sezerniertes Produkt kodiert.
  • Die DNA-Sequenzen, kodierend den Promotor und Ribosomen-Bindungsort, können auch von einem anderen Gen als dem sein, welches das Signalpeptid kodiert. Die DNA-Sequenzen, kodierend den Promotor, den Ribosomenbindungsort und das Signalpeptid, können mittels dem Fachmann weithin bekannter Verfahren isoliert werden, und erläuternde Beispiele sind in der Literatur dokumentiert. Siehe Biotechnology Handbook 2, Bacillus, C. R. Harwood, Hrsg., Plenum Press, New York, New York (1989). Die Promotoren in den DNA-Sequenzen können entweder konstitutiv oder induzierbar sein und folglich den resultierenden Sekretionsvektoren erlauben, unterschiedlich reguliert zu werden.
  • Promotoren, die zum Antreiben der Expression heterologer DNA-Fragmente in E. coli und Bacillus nützlich sind, sind zahlreich und dem Fachmann vertraut. Nahezu jeder Promotor, der zum Antreiben des Gens, kodierend ein Seide-variantes Protein, fähig ist, ist erfindungsgemäß geeignet, wobei die T7-Promotoren in E. coli bevorzugt sind und sich vom SacB-Gen herleitende Promotoren in Bacillus bevorzugt sind.
  • Terminationskontrollregionen können sich auch von verschiedenen für E. coli- oder Bacillus-Wirte nativen Genen oder optional anderen Bakterienwirten herleiten. Es wird vom Fachmann erkannt werden, dass die Terminationskontrollregion unnötig sein könnte.
  • Zum Einführen eines erfindungsgemäßen Polynukleotids in eine Bakterienzelle können bekannte erfindungsgemäße Verfahren, wie zum Beispiel durch Transformation, z. B. unter Verwendung von Calcium-permeabilisierten Zellen, Elektroporation oder durch Transfektion unter Verwendung eines rekombinanten Phagenvirus verwendet werden. (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual – Bände 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989)). Andere bekannte Verfahren können, wie vom Fachmann erkannt werden wird, auch zum Erhalt einer rekombinanten Wirtszelle, die ein erfindungsgemäßes heterologes Spinnenseiden-Protein exprimiert, eingesetzt werden.
  • DESIGN SPINNENSEIDE-VARIANTER AMINOSÄURESEQUENZEN:
  • Das Design der Spinnenseide-varianten Proteine wurde auf Konsensus-Aminosäuresequenzen, die sich von den faserbildenden Regionen der natürlichen Spinnenseide-Tragfaden-Proteine von Nephila clavipes herleiten, basiert. Ein natürlicher Spinnentragfaden besteht aus zwei verschiedenen Proteinen, die von der großen ampullenförmigen Drüse der Spinne gemeinsam gesponnen werden. Die Aminosäuresequenz von beiden Tragfaden-Proteinen wurde von Xu et al., Proc. Natl, Acad. Sci. USA, 87, 7120, (1990) und Hinman und Lewis, J. Biol. Chem. 267, 19320 (1992) offenbart und wird hierin nachstehend als Tragfaden-Protein 1 (Dragline-Protein 1; DP-1) und Tragfaden-Protein 2 (Dragline-Protein 2; DP-2) identifiziert.
  • Die Aminosäuresequenz eines DP-1-Fragmentes ist repetitiv und reich an Glycin und Alanin, ist anderweitig aber anders als jedwede zuvor bekannt gewesene Aminosäuresequenz. Die repetitive Natur des Proteins und das Variationsmuster unter den einzelnen Wiederholungen werden durch Umschreiben der Sequenz wie in 1 hervorgehoben. Die „Konsensus"-Sequenz einer auf diese Weise angesehenen einzelnen Wiederholung ist:
    Figure 00140001
    worin X für S, G oder N stehen kann.
  • Eine Untersuchung von 1 zeigt, dass sich individuelle Wiederholungen vom Konsensus gemäß einem Muster unterscheiden, das wie folgt verallgemeinert werden kann: (1) Die Polyalaninsequenz variiert bezüglich der Länge von null bis sieben Resten. (2) Wenn die gesamte Polyalanin-Sequenz deletiert ist, so wird auch die umgebende Sequenz, die AGRGGLGGQGAGAnGG (SEQ ID NO: 2) umfasst, deletiert. (3) Außer der Polyalanin-Sequenz umfassen Deletionen im Allgemeinen ganze Vielfache von drei konsekutiven Resten. (4) Deletion von GYG ist im Allgemeinen von einer Deletion von GRG in der gleichen Wiederholung begleitet. (5) Eine Wiederholung, in der die gesamte Polyalanin-Sequenz deletiert ist, geht im Allgemeinen einer Wiederholung, enthaltend sechs Alaninreste, voraus.
  • Es wurden synthetische Analoga von DP-1 geschaffen, um sowohl die sich wiederholende Konsensus-Sequenz des natürlichen Proteins als auch das Variationsmuster unter individuellen Wiederholungen zu mimicken. Es wurden zwei Analoga von DP-1 geschaffen und als DP-1A und DP-1B bezeichnet. DP-1A setzt sich aus einer in 2 aufgelisteten Tandem-Wiederholungssequenz mit 101 Aminosäuren zusammen. Das aus 101 Aminosäuren bestehende „Monomer" umfasst vier Wiederholungen, die sich gemäß dem vorstehenden Muster (1)–(5) unterscheiden. Dieses 101 Aminosäuren lange Peptid-Monomer wird von 1- bis 16-mal in einer Reihe analoger Proteine wiederholt. DP-1B wurde durch Umordnung der vier Wiederholungen im Monomer von DP-1A geschaffen. Diese Monomersequenz, die in 3 ersichtlich ist, weist alle die vorstehenden Regelmäßigkeiten von (1)–(5) auf. Außerdem weist sie eine Regelmäßigkeit der natürlichen Sequenz auf, die vom DP-1A nicht geteilt wird, nämlich, dass einer Wiederholung, in der sowohl GYG als auch GRG deletiert sind, im Allgemeinen eine Wiederholung, der die gesamte Polyalanin-Sequenz mangelt, mit einer intervenierenden Wiederholung vorausgeht. Die DP-1B-Sequenz stimmt über ein mehr vergrößertes Segment enger mit der natürlichen Sequenz überein, als dies mit DP-1A der Fall ist.
  • Die Aminosäuresequenz eines DP-2-Fragments ist auch repetitiv und auch reich an Glycin und Alanin, ist aber anderweitig anders als jedwede zuvor bekannt gewesene Aminosäuresequenz und ausgenommen einer Region konsekutiver Alaninreste, anders als DP-1. Die repetitive Natur des Proteins und das Variationsmuster unter den individuellen Wiederholungen werden durch Umschreiben der Sequenz wie in 8 hervorgehoben. Die „Konsensus"-Sequenz einer einzelnen auf diese Weise angesehenen Wiederholung ist:
    [GPGGY GPGQQ]3 GPSGPGS A10 (SEQ ID NO: 18)
  • Die Untersuchung von 8 zeigt, dass sich individuelle Wiederholungen vom Konsensus gemäß einem Muster unterscheiden, das wie folgt verallgemeinert werden kann: (1) Die Polyalanin-reiche Sequenz variiert längenmäßig von sechs bis zehn Resten. (2) Außer der Polyalanin-Sequenz unterschieden sich individuelle Wiederholungen von der Konsensus-Wiederholungssequenz durch Deletionen von ganzen Vielfachen von fünf konsekutiven Resten, bestehend aus einer oder beiden der Pentapeptid-Sequenzen) GPGGY (SEQ ID NO: 3) oder GPGQQ (SEQ ID NO: 4).
  • Synthetische Analoga von DP-2 wurden geschaffen, um sowohl die Wiederholungskonsensus-Sequenz des natürlichen Proteins als auch das Variationsmuster unter individuellen Wiederholungen zu mimicken. Das analoge DP-2A setzt sich aus einer in 9 aufgelisteten Tandemwiederholung einer Aminosäuresequenz mit 119 Aminosäuren zusammen. Das aus 119 Aminosäuren bestehende „Peptid-Monomer" umfasst drei Wiederholungen, die sich gemäß dem Muster (1)–(2) vorstehend unterscheiden. Dieses 119 Aminosäuren lange Peptid-Monomer wird in einer Reihe analoger Proteine von 1- bis 16-mal wiederholt.
  • DESIGN VON DNA, KODIEREND SPINNENSEIDE-VARIANTE PROTEINE:
  • DNA-Sequenzen, kodierend die geschaffenen analogen Aminosäuresequenzen, wurden gemäß den folgenden Kriterien ausgearbeitet: (1) Das DNA-Monomer musste mindestens 300 bp lang sein; (2) im Monomer wurde die Repetitivität der Sequenzen mit keiner wiederholten Sequenz von länger als 17 bp und minimaler Repetitivität von Sequenzen länger als 10 bp minimiert; (3) wo möglich, wurden Codonen unter den Codonen gewählt, die präferenziell in hoch exprimierten Genen des beabsichtigten Wirtsorganismus (E. coli) gefunden werden, mit Präferenz für Codonen, die ausgeglichene A + T/G + C-Basenverhältnisse bereitstellen; und (4) die vorhergesagte Sekundärstruktur der mRNA im Monomer wurde durch weitreichende Interaktionen anstelle von Basenpaarung über kürzere Bereiche dominiert. Es wurde kein Versuch unternommen, die sekundäre Struktur der mRNA zu minimieren.
  • ASSEMBLIEREN VON DP-1- UND DP-2-ANALOGEN GENEN:
  • Assemblieren der synthetischen Tragfaden-analogen Gene wurde zuerst durch Assemblieren der entsprechenden DNA-Monomere, gefolgt von Polymerisation dieser Monomere zur Bildung des kompletten Gens erreicht.
  • Synthetische DNA-Monomere, basierend auf den vorstehend beschriebenen Konsensus-Peptid-Monomeren, wurden aus vier bis sechs klonierten doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotiden assembliert. Jedes Oligonukleotid wurde zum Kodieren eines anderen Anteils des Peptid-Monomers geschaffen. Die Oligonukleotide wurden, kurz gefasst, jeweils in getrennte geeignete Plasmid-Vektoren, enthaltend ein Ampicillin-Resistenzgen kloniert. Ein geeigneter E. coli-Wirt wurde mit den Plasmiden transformiert und auf das Vorliegen des korrekten Vektors mittels Standardverfahren gescreent. Nachdem die Oligonukleotide kloniert waren, wurde das DNA-Monomer sequenziell assembliert. Vektoren, die individuelle Oligonukleotide enthalten, wurden aufgeschlossen, und die Plasmid-DNA wurde mittels Gelelektrophorese gereinigt. Gereinigte Plasmid-DNA, die zwei verschiedene Oligonukleotid-Sequenzen enthält, wurde dann unter Ligationsbedingungen inkubiert, und die Ligationsprodukte wurden zur Transformation eines geeigneten E. coli-Wirts verwendet. Diese Transformanten umfassten zwei der in Tandem verknüpften Oligonukleotid-Sequenzen. Ein ähnliches Verfahren wurde zur Schaffung des vollständigen DNA-Monomers, umfassend vier bis sechs der Oligonukleotide, befolgt. Zusätzliche Bestätigung des Vorliegens der korrekten DNA-Insertionen wurde durch direkte DNA-Sequenzierung erhalten. Es werden erfindungsgemäß mehrere DNA-Monomere bereitgestellt, die zur Herstellung von DP-1A- und DP-1B-Analoga nützlich sind. Im Allgemeinen sind zur Herstellung des analogen DP-1B.16 verwendete DNA-Monomere bevorzugt, da dieses Konstrukt vom E. coli-Produktionswirt selten verwendete Codonen vermeidet.
  • Das assemblierte DNA-Monomer wurde dann durch ein Verfahren, im Wesentlichen wie von Kempe et al. (Gene 39, 239, (1985) beschrieben, polymerisiert. Dieses Verfahren besteht aus einer Reihe aufeinanderfolgender Verdopplungen der Sequenz von Interesse. Das DNA-Monomer, das die klonierten Oligonukleotide enthält, wurde kurz gefasst, mit geeigneten Restriktionsenzymen aufgeschlossen und unter Annealing-Bedingungen, gefolgt von Ligation zur Herstellung einer Reihe von Konstrukten, die mehrfache Wiederholungen des Monomers enthalten, inkubiert. Die Ligationsprodukte wurden zur Transformation eines geeigneten E. coli-Wirtes verwendet, und intakte Plasmide wurden auf der Basis der Ampicillin-Resistenz ausgewählt. Die sich anschließende Analyse der Plasmid-DNA mittels Gelelektrophorese resultierte in der Identifikation von Transformanten, enthaltend Plasmide mit 2, 4, 8 und 16 Tandemwiederholungen des DNA-Monomers. Diese Proteinprodukte wurden mittels SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese analysiert und nachgewiesen und mittels immunchemischer Färbung unter Verwendung eines in Kaninchen gebildeten polyklonalen Antiserums gegen ein synthetisches Peptid analog zu einem Fragment des natürlichen Proteins quantifiziert.
  • EXPRESSION UND REINIGUNG VON PROTEIN:
  • Eine hochgradige Expression der Spinnen-Tragfaden-Proteinanaloga in E. coli wurde durch Insertion der synthetischen Gene in die Plasmid-Vektoren pFP202 und pFP204 erreicht, die sich vom weithin bekannten Vektor pET11a herleiteten. In diesen Vektoren wird das Tragfaden-Protein-kodierende Gen auf eine solche Weise insertiert, dass es funktionsfähig an einen sich vom Bakteriophagen T7 herleitenden Promotor gebunden wird. Dieser Promotor ist mit Sequenzen verbunden, die sich vom lac-Operator von E. coli herleitet, der Regulation durch Lactose oder Analoga (IPTG) verleiht. Der E. coli-Wirtsstamm BL21 (DE3) enthält einen λ-Prophagen, der ein Gen trägt, kodierend die RNA-Polymerase des Bakteriophagen T7. Dieses Gen wird von einem Promotor kontrolliert, der auch durch Lactose oder Analoga reguliert wird. Zusätzlich zu dem Phagen-T7-Promotor stellen die Vektoren pFP202 und pFP204 Sequenzen bereit, welche einen C-terminalen Schwanz kodieren, der sechs konsekutive Histidinreste enthält, die an die Tragfaden-Protein-kodierenden Sequenzen angehängt ist. Dieser Schwanz stellt ein Mittel zur Affinitätsreinigung des Proteins unter Denaturierungsbedingungen durch seine Adsorption an Harze, die immobilisierte Ni-Ionen tragen, bereit.
  • Das DP-1-analoge Protein wurde durch E. coli bei Konzentrationen von ca. 5–20% bezogen auf das Gesamtprotein produziert. Von diesem wurden ca. 20–40% in gereinigter Form als ein Protein voller Länge wiedergeworinen. Das DP-2-analoge Protein wurde bei ca. 5% bezogen auf das Gesamtzellprotein, von dem ca. 30% in gereinigter Form als Protein in voller Länge wiedergeworinen wurden, produziert.
  • Die folgenden Beispiele sind zur erfindungsgemäßen Erläuterung bestimmt, dürfen aber nicht als sie in irgendeiner Weise einschränkend ausgelegt werden.
  • BEISPIELE
  • ALLGEMEINE VERFAHREN
  • Die Position der neu manipulierten Restriktionsorte ist in den Figuren angezeigt, und jeder Fachmann kann diese Konstrukte mit der zur Verfügung gestellten Information wiederholen.
  • Die in dieser Anmeldung beschriebene Quelle der Gene und der verschiedenen Vektoren ist wie folgt.
  • Die Anti-DP-1- und Anti-DP-2-Antiseren wurden von Multiple Peptide Systems, San Diego, CA, hergestellt.
  • Die Restriktionsenzym-Aufschlüsse, Phosphorylierungen, Ligationen, Transformationen und andere geeignete Verfahren der hierin eingesetzten genetischen Manipulation werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual – Bände 1, 2, 3 (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, New York, 1989) und in den Anleitungen beschrieben, die im Handel erhältlichen Kits zur genetischen Manipulation beiliegen.
  • Bakterienkulturen und Plasmide zur erfindungsgemäßen Durchführung sind entweder im Handel (von Novagen, Inc., Madison, WI) oder vom E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT, dem Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University, Columbus, OH oder dem ATCC erhältlich und werden, zusammen mit ihren Quellen, im Text und in den folgenden Beispielen identifiziert. Sofern nicht anderweitig angegeben, wurden die in den folgenden Beispielen verwendeten Standardreagenzien und Lösungen von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen.
  • Zur Isolation von Restriktionsfragmenten aus Agarosegelen wurde das GENECLEAN®-Verfahren (Bio 101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) verwendet und wurde wie vom Hersteller angegeben durchgeführt.
  • BEISPIEL 1
  • KONSTRUKTION DER SYNTHETISCHEN GENE DP-1A.9 UND DP-1B.9
  • OLIGONUKLEOTID-DESIGN UND -KLONIERUNG:
  • Synthetische Gene, die DP-1A.9 und DP-1B.9 kodieren, wurden aus vier doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotiden, gekennzeichnet als L (SEQ ID NO: 24, 25 und 26), M1 (SEQ ID NO: 27, 28 und 29), M2 (SEQ ID NO: 30, 31 und 3) und S (SEQ ID NO: 33, 34 und 35) assembliert, deren Sequenzen in 4 ersichtlich sind. Die Oligonukleotide wurden vom Hersteller (Midland Certified Reagents, Midland, TX) in doppelsträngiger Form mit 5'-OH-Gruppen phosphoryliert bereitgestellt. Verfahren zur Synthese, Reinigung, Phosphorylierung und zum Annealing von Oligonukleotid zur doppelsträngigen Form sind dem Fachmann bekannt.
  • Die vier doppelsträngigen Oligonukleotide wurden durch ihre Insertion in einen Plasmid-Vektor pFP510 getrennt kloniert (5). Dieser Vektor leitete sich vom Plasmid pA126i (siehe 13) her, dessen komplette Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 78 und in 13 bereitgestellt ist. Ausführliche Einzelheiten zur Struktur von pA126i sind, ausgenommen der folgenden wesentlichen Merkmale, zur Konstruktion nicht wichtig: (a) Ein in E, coli aktiver Replikationsstartpunkt; (b) ein auswählbarer genetischer Marker, in diesem Fall ein Gen, das Resistenz gegen das antibiotische Ampicillin verleiht; (c) Orte für die Restriktionsendonukleasen BamHI und BglII mit keinen wesentlichen Sequenzen zwischen ihnen; und (d) ein dritter Restriktionsort (PstI), der sich im selektierbaren Marker befindet, der kohäsive Enden produziert, die mit den von BamHI und BglII produzierten inkompatibel sind. Zur Konstruktion von pFP510 wurde DNA von Plasmid pA126i mit den Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen, dann durch Adsorption an Glasperlen in Anwesenheit von NaI mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio 101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Ca. 0,1 pmol der eluierten Plasmid-DNA wurden 10 pmol des doppelsträngigen, phosphorylierten Oligonukleotids SF4/5 zugefügt (5). Das Gemisch wurde unter Ligationsbedingungen mit T4-Polynukleotidligase 19 h bei 4°C inkubiert. Ligierte DNA wurde dann mit Endonuklease Xmal zur Linearisierung jedweder zurückbleibenden Eltern-pA126i aufgeschlossen und zur Transformation von E. coli SK2267 (bezogen vom E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT) verwendet, das durch Calcium-Behandlung, wie von Sambrook et al., op. cit., beschrieben, kompetent gemacht wurde. Aus Ampicillin-resistenten Transformanten isolierte Plasmid-DNA wurde durch Aufschluss getrennt mit Endonukleasen ApaI und BamHI charakterisiert, und es wurde ein Transformant, welcher das gewünschte Plasmid enthält, identifiziert und als pFP510 bezeichnet.
  • DNA von Plasmid pFP510 wurde mit Endonukleasen SfiI und DraIII aufgeschlossen und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) gereinigt. Ca. 0,1 pmol der eluierten Plasmid-DNA wurden 10 pmol eines der doppelsträngigen, phosphorylierten Oligonukleotide L, M1, M2, oder S zugefügt (4). Die vier Plasmid-Oligonukleotid-Gemische wurden unter Ligationsbedingungen 15 h bei 4°C, dann 20 min bei 23°C inkubiert, und die Ligation wurde schließlich durch 3-minütige Inkubation bei 65°C terminiert. Aliquote ligierter DNA wurden zur Transformation von E. coli SK2267 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. In 4 gezeigte Klone, die Oligonukleotide L, M1 und M2 enthalten, wurden durch Screening aus individuellen Transformanten mit Endonuklease AlwNI isolierter Plasmid-DNA, für die ein Erkennungsort in den Oligonukleotiden vorhanden ist, identifiziert. Klone, die Oligonukleotid S enthalten, wurden durch Screening von Plasmid-DNA identifiziert, die aus individuellen Transformanten mit Endonukleasen BglI und DraIII isoliert wurde. Plasmid-DNA aus mutmaßlichen Klonen wurde weiter durch Aufschluss mit Endonukleasen EcoRI, SfiI und DraIII zur Ermittlung charakterisiert, dass die Oligonukleotidsequenzen korrekt im Plasmid ausrichtet waren. Die Inserts wurden mit den Endonukleasen BamHI und BglII exzidiert und mithilfe der Elektrophorese in 4% NuSieve-Agarose (FMC) zur Verifikation analysiert, dass das Plasmid nur eine einzelne Kopie des Oligonukleotids erworben hatte. Korrekte Klone wurden identifiziert, und ihre Plasmide wurden als pFP521 (Oligonukleotid L), pFP533 (Oligonukleotid M1), pFP523 (Oligonukleotid M2) und pFP524 (Oligonukleotid S) bezeichnet. DNA-Sequenzen von allen vier klonierten Oligonukleotiden wurden mittels DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • Die DNA-Sequenzierung wurde im Wesentlichen gemäß den vom Lieferanten (U.S. Biochemicals) bereitgestellten Verfahren mit dem Sequenase 2.0-Kit zur DNA-Sequenzierung mit 7-Deaza-GTP durchgeführt. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung des Magic Minipreps-Kits (Promega) hergestellt. Die Matrizen-DNA wurde mittels Inkubation von 20 μl Miniprep-DNA in 40 μl (Gesamtvolumen) 0,2 M NaOH 5 min bei 23°C denaturiert. Das Gemisch wurde durch Zufügen von 6 μl 2 M Ammoniumacetat (eingestellt auf pH 4,5 mit Essigsäure) neutralisiert, und die DNA wurde durch Zufügen von 0,15 ml Ethanol präzipitiert, durch Zentrifugation wiedergeworinen, mit kaltem 70%igem Ethanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Primer zum Sequenzieren waren wie folgt:
    Figure 00180001
    Figure 00190001
  • Die Primer SI1 und SI5 annealen an Orten an gegenüberliegenden Strängen in pA126i. SI5 primt die Synthese zu den Sequenzen von Interesse von 31 bp über den BamHI-Ort hinausgehend. SI1 primt die Synthese am gegenüberliegenden Strang zu den Sequenzen von Interesse von 38 bp über den BglII-Ort hinausgehend. Zum Sequenzieren im Vektor pFP206 (siehe unten) wurde der Primer SI20, der 25 bp über den BglII-Ort hinausgehend annealt, für SI1 substituiert (12). Polyacrylamidgele zur DNA-Sequenzierung wurden bei 52°C laufen lassen.
  • ASSEMBLIEREN DES GENS:
  • Zum Assemblieren der Subsequenz M2L wurde das Plasmid pFP523 (M2) mit Endonukleasen PstI und DraIII aufgeschlossen, und das Plasmid pFP521 (L) wurde mit Endonukleasen PstI und SfiI aufgeschlossen. Aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Agarosegel (Low Melt, BioRad) fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, enthaltend die Oligonukleotidsequenzen, identifiziert durch ihre relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA aus der geschmolzenen Agarose mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Die eluierten kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli W3110 (erhältlich vom E. coli Genetic Stock Center, Yale University, New Haven, CT.) verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP525 bezeichnet.
  • Das Assemblieren der Subsequenz M1S wurde auf die gleiche Weise erreicht, wobei mit Plasmiden pFP533 (aufgeschlossen mit PstI und DraIII) und pFP524 (aufgeschlossen mit PstI und SfiI) begonnen wurde. Plasmid, welches die MIS-Subsequenz enthält, wurde identifiziert und als pFP531 bezeichnet.
  • Zum Assemblieren des DNA-Monomers (M2LM1S), wurde das Plasmid pFP525 (M2L) mit Endonukleasen PstI und DraIII aufgeschlossen, und Plasmid pFP531 (M1S) wurde mit Endonukleasen PstI und SfiI aufgeschlossen. Aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Low Melt-Agarosegel fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, welche die M2L- bzw. M1S-Sequenzen enthalten, identifiziert durch ihre relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA aus geschmolzener Agarose mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Die eluierten, kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Das Plasmid-enthaltende Insert der erwarteten Größe wurde identifiziert und als pFP534 bezeichnet. Die DNA-Inserts in Plasmiden pFP523, pFP521, pFP533, pFP524, pFP525, pFP531 und pFP534 wurden mithilfe direkter DNA-Sequenzierung, wie zuvor beschrieben, verifiziert.
  • POLYMERISATION DES GENS:
  • Das synthetische Gen wurde durch sequenzielle Verdopplung vergrößert, beginnend mit der Monomersequenz in pFP534. Zur Verdopplung jedweder Insert-Sequenz wurde ein Aliquot der Plasmid-DNA mit Endonukleasen PstI und DraIII aufgeschlossen, und ein getrenntes Aliquot des gleichen Plasmids wurde mit Endonukleasen PstI und SfiI aufgeschlossen. Die Aufschlüsse wurden mittels Elektrophorese auf Low Melt-Agarose fraktioniert, und mit Ethidiumbromid gefärbte Fragmente, enthaltend Insert-Sequenzen, wurden durch ihre relativen Größen identifiziert. In einigen Fällen wurden die beiden Fragmente nicht angemessen getrennt, deshalb war es notwendig, das Fragment, das kein Insert enthält, mit einem dritten Enzym, gewöhnlich M1uI, zu schneiden.
  • Jedes der beiden die Insert-Sequenz enthaltenden Fragmente weist ein Ende auf, das durch Endonuklease PstI gebildet wird. Annealing dieser kompatiblen einzelsträngigen Enden und Ligation resultiert in der Rekonstitution des Gens, das Ampicillin-Resistenz verleiht, von dem ein Teil auf jedem Fragment getragen wird. Das andere Ende von jedem Fragment weist eine einzelsträngige Sequenz auf, die entweder durch DraIII der SfiI gebildet wird. Diese Sequenzen sind vom Design her komplementär und Annealing und Ligation resultierten in einer Kopf-Schwanz-Kopplung von zwei Insert-Sequenzen zusammen mit dem gleichzeitigen Verlust beider Orte an der Verbindungsstelle. Das Prinzip dieses Verfahrens der Insert-Sequenz-Verdopplung wurde von Kempe et al. (Gene 39, 239–245 (1985)) beschrieben.
  • Die beiden Insert-enthaltenden Fragmente, durch Elektrophorese gereinigt und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen, wurden kombiniert und unter Ligationsbedingungen inkubiert. Ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli W3110 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mithilfe der Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert.
  • Anhand dieses Verfahrens wurde eine Reihe von Plasmiden konstruiert, enthaltend 2, 4, 8 und 16 Tandemwiederholungen der DNA-Monomersequenz M2LM1S, welche die Reihe von DP-1A-Analoga kodiert. Außerdem wurden analoge Verfahren zur Konstruktion von Genen verwendet, welche die Reihe von DP-1B-Analoga kodieren. Zu diesem Zweck wurden die Subsequenzen SL (aus pFP524 und pFP521) und M1M2 (aus pFP533 und pFP523) zuerst konstruiert, dann zur Bildung des Monomers SLM1M2, das wie beschrieben polymerisiert wurde, kombiniert. Es sollte erkannt werden, dass ähnliche Verfahren zum Assemblieren jedweder Kombination von Subseqenzen, die in dem Vektor pFP510 getragen werden oder jedwedem anderen geeigneten Vektor, verwendet werden können, vorausgesetzt, dass die Subsequenzen durch Spaltungsorte für Restriktionsendonukleasen, die kompatible Enden (komplementäre einzelsträngige Enden oder stumpfe Enden) generieren, verwendet werden. Außer den verschiedenen Monomersequenzen können Polymere von jedweder Anzahl von Wiederholungen der Monomersequenz auf die gleiche Weise assembliert werden, beginnend mit Plasmiden, die Inserts verschiedener Größen enthalten.
  • BEISPIEL 2
  • SYNTHETISCHES GEN DP-1B.16
  • Ein zweiter Set von Genen, die DP-1B kodieren, bezeichnet als DP-1B.16 (SEQ ID NO: 82), wurden zur Reduktion der Anzahl von Codonen geschaffen, die selten in hoch exprimierten E. coli-Genen verwendet werden, die jedoch gleichzeitig Proteine der gleichen Wiederholungssequenz kodieren. Die Sequenz des DP-1B.16-Peptid-Monomers ist in 10 und in SEQ ID NO: 82 ersichtlich.
  • OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE UND -KLONIERUNG:
  • Synthetische Gene, die DP-1B.16 (SEQ ID NO: 82) kodieren, wurden aus vier doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotiden, deren Sequenzen (SEQ ID NO: 64, 65, 66; SEQ ID NO: 67, 68, 69; SEQ ID NO: 70, 71, 72; und SEQ ID NO: 73, 74, 75) in 11 ersichtlich sind, assembliert. Die Oligonukleotide wurden vom Hersteller (Midland Certified Reagents, Midland, TX) in einzelsträngiger Form mit nicht phosphorylierten 5'-OH-Gruppen bereitgestellt. Zum Annealing zur doppelsträngigen Form wurden komplementäre einzelsträngige Oligonukleotide (jeweils 667 pmol) in 0,2 ml Puffer, enthaltend 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M MgCl2, 0,05 M NaCl, 0,001 M Dithiothreitol, pH 7,9, gemischt. Das Gemisch wurde 1 Minute in kochendem Wasser erhitzt, dann über ca. 3 h langsam auf 23°C abkühlen lassen.
  • Die vier doppelsträngigen Oligonukleotide wurden durch ihre Insertion in einen Plasmid-Vektor pFP206 getrennt kloniert (12). Dieser Vektor wurde vom Plasmid pA126i, wie in 12 erläutert, hergeleitet. Die DNA von Plasmid pA126i wurde kurzgefasst mit Endonukleasen BamHI und EcoRI aufgeschlossen, und die beiden Fragmente wurden mittels Elektrophorese in einer 1,2%igen Agarose (Low Melt, BioRad) getrennt. Das größere der beiden Fragmente wurde aus dem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel exzidiert und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Ca. 0,1 pmol des eluierten DNA-Fragments wurden 10 pmol des doppelsträngigen, phosphorylierten Oligonukleotids SF31/32 (12) zugefügt. Das Gemisch wurde unter Ligationsbedingungen mit T4-Polynukleotidligase 8,5 h bei 4°C inkubiert. Ligierte DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, die mittels Calcium-Behandlung kompetent gemacht wurde. Aus Ampicillin-resistenten Transformanten isolierte Plasmid-DNA war durch Aufschluss getrennt mit Endonukleasen HindIII, EcoRI, BglII und BamHI gekennzeichnet, und es wurde ein Transformant, der das gewünschte Plasmid enthält, identifiziert und als pFP206 bezeichnet.
  • Die DNA von Plasmid pFP206 wurde mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) gereinigt. Ca. 0,1 pmol der eluierten Plasmid-DNA wurden 10 pmol eines der doppelsträngigen Oligonukleotide 1 (SEQ ID NO: 64, 65, 66) 2 (SEQ ID NO: 67, 68, 69), 3 (SEQ ID NO: 70, 71, 72) oder 4 (SEQ ID NO: 73, 74, 75) zugefügt. Die vier Plasmidoligonukleotid-Gemische wurden 15 h bei 4°C unter Ligationsbedingungen inkubiert, dann wurde die Ligation durch 3-minütige Inkubation bei 70°C terminiert. Die ligierte DNA wurde dann mit Endonuklease HindIII zur Linearisierung jedweder verbleibender Eltern-pFP206 aufgeschlossen. Aliquote von ligierter DNA wurden zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Klone, enthaltend Oligonukleotide 1, 2, 3 oder 4, wurden durch Screening der Plasmid-DNA identifiziert, die aus individuellen Transformanten mit Endonukleasen BamHI und PstI isoliert wurde. In Plasmiden mit Inserts in der gewünschten Orientierung wird das kürzere der beiden BamHI-PstI-Fragmente von pFP206 um die Länge des klonierten Oligonukleotids verlängert. Die Plasmid-DNA aus mutmaßlichen Klonen war weiter gekennzeichnet durch den Aufschluss mit Endonukleasen BamHI und BglII und die Analyse mittels Elektrophorese in 3% NuSieve-Agarose (FMC), 1% Agarose (Sigma Chemical Co.) zur Verifikation, dass das Plasmid nur eine einzelne Kopie des Oligonukleotids in der korrekten Orientierung erworben hatte. Korrekte Klone wurden identifiziert und ihre Plasmide wurden als pFP636 (Oligonukleotid 1), pFP620 (Oligonukleotid 2), pFP641 (Oligonukleotid 3) und pFP631 (Oligonukleotid 4) bezeichnet. Die Sequenzen aller vier klonierter Oligonukleotide wurden mittels DNA-Sequenzierung wie vorstehend beschrieben verifiziert.
  • ASSEMBLIEREN DES GENS:
  • Zum Assemblieren von Subsequenz 1, 2 wurde Plasmid pFP636 (1) mit den Endonukleasen PstI und BamHI aufgeschlossen, und das Plasmid pFP620 wurde (2) mit den Endonukleasen PstI und BglII aufgeschlossen. Die aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Agarosegel (Low Melt, BioRad) fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, enthaltend die Oligonukleotidsequenzen, identifiziert durch ihre relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert, und die DNA mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Die eluierten kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP647 bezeichnet.
  • Das Assemblieren der Subsequenz 3, 4 wurde auf die gleiche Weise erreicht, beginnend mit den Plasmiden pFP641 (aufgeschlossen mit PstI und BamHI) und pFP631 (aufgeschlossen mit PstI und BglII). Plasmid, welches die 3, 4-Subsequenz enthält, wurde identifiziert und als pFP649 bezeichnet.
  • Zum Assemblieren des DNA-Monomers (1, 2, 3, 4) wurde Plasmid pFP647 (1, 2) mit den Endonukleasen PstI und BamHI aufgeschlossen, und Plasmid pFP640 (3, 4) wurde mit den Endonukleasen PstI und BglII aufgeschlossen. Die aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Low Melt-Agarosegel fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, enthaltend die 1, 2- bzw. 3, 4-Sequenzen, identifiziert anhand ihrer relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA aus der geschmolzenen Agarose mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Die eluierten, kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen, und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP652 bezeichnet. Das DNA-Insert in Plasmid pFP652 wurde durch direkte DNA-Sequenzierung, wie vorstehend beschrieben, verifiziert.
  • POLYMERISATION DES GENS:
  • Das synthetische Gen wurde durch sequenzielle Verdopplung vergrößert, beginnend mit der Monomersequenz in pFP652. Zur Verdopplung jedweder Insert-Sequenz wurde ein Aliquot aus Plasmid-DNA mit den Endonukleasen PstI und BamHI aufgeschlossen, und ein getrenntes Aliquot des gleichen Plasmids wurde mit den Endonukleasen PstI und BglII aufgeschlossen. Die Aufschlüsse wurden mittels Elektrophorese auf Low Melt-Agarose fraktioniert, und die mit Ethidiumbromid gefärbten Fragmente, enthaltend Insert-Sequenzen wurden mittels ihrer relativen Größen identifiziert. Die beiden Insert-enthaltenden Fragmente, mittels Elektrophorese gereinigt und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen, wurden kombiniert und unter Ligationsbedingungen inkubiert. Bei der dritten Verdopplung wurden die beiden Fragmente im BamHI-Aufschluss nicht ausreichend getrennt, deshalb enthielt die eluierte Bande beide Fragmente. In diesem Fall wurde ein zweifacher Überschuss des BglII-PstI-Fragmentes in der Ligation verwendet. Ein Aliquot der ligierten DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert.
  • Anhand dieses Verfahrens wurde eine Reihe von Plasmiden konstruiert, enthaltend 2, 4, 8 und 16 Tandemwiederholungen der DNA-Monomersequenz 1 (SEQ ID NO: 64, 65, 66), 2 (SEQ ID NO: 67, 68, 69), 3 (SEQ ID NO: 70, 71, 72), 4 (SEQ ID NO: 73, 74, 75), kodierend die Reihe von DP-IB.16-Analoga. Diese Plasmide wurden als pFP656 (2 Wiederholungen), pFP661 (4 Wiederholungen), pFP662 (8 Wiederholungen) bzw. pFP665 (16 Wiederholungen) bezeichnet.
  • BEISPIEL 3
  • SYNTHETISCHES GEN DP-2A
  • OLIGONUKLEOTIDSYNTHESE UND -KLONIERUNG:
  • Synthetische Gene, kodierend DP-2A, wurden aus sechs doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotiden assembliert, deren Sequenzen in 7 ersichtlich sind. Die Oligonukleotide wurden vom Hersteller (Midland Certified Reagents, Midland, TX) in doppelsträngiger Form mit nicht phosphorylierten 5'-OH-Gruppen bereitgestellt. Die sechs doppelsträngigen Oligonukleotide wurden durch ihre Insertion in den Plasmid-Vektor pFP206 getrennt kloniert.
  • DNA von Plasmid pFP206 wurde mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) gereinigt. Ca. 0,1 pmol der eluierten Plasmid-DNA wurden 10 pmol eines der doppelsträngigen Oligonukleotide A (SEQ ID NO: 41, 42, 43), B (SEQ ID NO: 44, 45, 46), C (SEQ ID NO: 47, 48, 49), D (SEQ ID NO: 50, 51, 52), E (SEQ ID NO: 53, 54, 55) oder F (SEQ ID NO: 56, 57, 58) zugefügt. Die sechs Plasmidoligonukleotid-Gemische wurden 15 h bei 4°C unter Ligationsbedingungen inkubiert, dann wurde die Ligation durch 3-minütige Inkubation bei 70°C terminiert. Die ligierte DNA wurde dann mit Endonuklease HindIII zum Linearisieren jedweder zurückbleibenden Eltern-pFP206 aufgeschlossen. Aliquote von ligierter DNA wurden zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Klone, enthaltend Oligonukleotide A, B, C, D, E oder F, wurden mittels Screening der Plasmid-DNA, die mit Endonukleasen BamHI und PstI aus individuellen Transformanten isoliert wurde, identifiziert. In Plasmiden mit Inserts in der gewünschten Orientierung wird das kürzere der beiden BamHI-PstI-Fragmente von pFP206 um die Länge des klonierten Oligonukleotids verlängert. Die Plasmid-DNA aus mutmaßlichen Klonen war weiter gekennzeichnet durch Aufschluss mit den Endonukleasen BamHI und BglII und Analyse mittels Elektrophorese in 3% NUSIEVE-Agarose (FMC), 1% Agarose (Sigma Chemical Co.) zur Verifikation, dass das Plasmid nur eine einzelne Kopie des Oligonukleotids in der korrekten Orientierung erworben hatte. Die korrekten Klone wurden identifiziert, und ihre Plasmide wurden als pFP 193 (Oligonukleotid A), pFP 194 (Oligonukleotid B), pFP 195 (Oligonukleotid C), pFP196 (Oligonukleotid D), pFP197 (Oligonukleotid E) und pFP198 (Oligonukleotide F) bezeichnet.
  • ASSEMBLIEREN DES GENS:
  • Zum Assemblieren der Subsequenz AB wurde Plasmid pFP193 (A) mit Endonukleasen PstI und PvuII aufgeschlossen, und Plasmid pFP194 (B) wurde mit Endonukleasen PstI und SmaI aufgeschlossen. Die aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Agarosegel (Low Melt, BioRad) fraktioniert. Die mit Ethidiumbromid gefärbten Banden, enthaltend die Oligonukleotidsequenzen, identifiziert durch ihre relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA aus der geschmolzenen Agarose mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Die eluierten, kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP300 (AB) bezeichnet.
  • Das Assemblieren der Subsequenz CD wurde, beginnend mit Plasmiden pFP195 (aufgeschlossen mit PstI und SnaBI) und pFP196 (aufgeschlossen mit PstI und SmaI) auf die gleiche Weise erreicht. Plasmid, welches die CD-Subsequenz enthält, wurde identifiziert und als pFP578 bezeichnet. Das Assemblieren der Subsequenz EF wurde auf die gleiche Weise erreicht, beginnend mit Plasmiden pFP197 (aufgeschlossen mit PstI und SnaBI) und pFP 198 (aufgeschlossen mit PstI und SmaI). Plasmid, welches die EF-Subsequenz enthält, wurde identifiziert und als pFP583 bezeichnet. Die DNA-Inserts in Plasmiden pFP300, pFP578 und pFP583 wurden durch direkte DNA-Sequenzierung, wie vorstehend beschrieben, verifiziert.
  • Das Assemblieren von Subsequenz CDEF wurde auf ähnliche Weise erreicht, beginnend mit Plasmiden pFP578 (aufgeschlossen mit PstI und PvuII) und pFP583 (aufgeschlossen mit PstI und SmaI). Plasmid, welches die CDEF-Subsequenz enthält, wurde identifiziert und als pFP588 bezeichnet.
  • Zum Assemblieren des DNA-Monomers (ABCDEF) wurde Plasmid pFP300 (AB) mit Endonukleasen PstI und PvuII aufgeschlossen, und Plasmid pFP588 (CDEF) wurde mit den Endonukleasen PstI und SmaI aufgeschlossen. Die aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Low Melt-Agarosegel fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, enthaltend die AB- bzw. CDEF-Sequenzen, identifiziert durch ihre relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA aus geschmolzener Agarose mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Die eluierten, kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Tansformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP303 bezeichnet. Das DNA-Insert in Plasmid pFP303 wurde mittels direkter DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • POLYMERISATION DES GENS:
  • Das synthetische Gen wurde durch sequenzielle Verdopplung vergrößert, beginnend mit der Monomersequenz in pFP303. Zur Verdopplung jedweder Insert-Sequenz wurde ein Aliquot der Plasmid-DNA mit Endonukleasen PstI und PvuII aufgeschlossen, und ein separates Aliquot des gleichen Plasmids wurde mit den Endonukleasen PstI und SmaI aufgeschlossen. Die Aufschlüsse wurden mittels Elektrophorese auf Low Melt-Agarose fraktioniert, und mit Ethidiumbromid gefärbte Fragmente, enthaltend Insert-Sequenzen, wurden anhand ihrer relativen Größen identifiziert. Die beiden ein Insert enthaltenden Fragmente, gereinigt mittels Elektrophorese und wiedergeworinen mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA), wurden kombiniert und unter Ligationsbedingungen inkubiert. Ein Aliquot der ligierten DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert.
  • Anhand dieses Verfahrens wurden eine Reihe von Plasmiden konstruiert, die 2, 4, 8 und 16 Tandemwiederholungen der DNA-Monomersequenz ABCDEF enthalten, kodierend die Reihe der DP-2A Analoga. Diese Plasmide wurden als pFP304 (2 Wiederholungen), pFP596 (4 Wiederholungen), pFP597 (8 Wiederholungen) bzw. pFP598 (16 Wiederholungen) bezeichnet.
  • BEISPIEL 4
  • EXPRESSION VON DP-1- UND DP-2-ANALOGEN GENEN IN E. COLI
  • IMMUNOASSAY
  • Zum Nachweis der DP-1-analogen Aminosäuresequenzen wurden in Kaninchen mittels Immunisation mit einem synthetischen Peptid, das dem am höchsten konservierten Segment der Konsensus-Wiederholungssequenz des natürlichen Proteins angepasst wurde, polyklonale Antiseren gebildet. Das Peptid (Sequenz CGAGQGGYGGLGSQGAGRG-NH2) (SEQ ID NO: 8) wurde mittels Standardfestphasenverfahren (Multiple Peptide Systems, San Diego, CA) synthetisiert und durch sein terminales Cys-Thiol über Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester an Keyhole Lympet Hämocyanin gekoppelt. Auf ähnliche Weise wurden zum Nachweis von DP-2-analogen Aminosäuresequenzen Antiseren gegen ein Peptid der Sequenz CGPGQQGPGGYGPGQQGPS-NH2 (SEQ ID NO: 9) gebildet, welches die Konsensus-Wiederholungssequenz des natürlichen Proteins DP-2 widerspiegelt.
  • Zum Wachstum von Kulturen zur Beurteilung der Produktionsmenge wurden 20 ml L-Bouillon (pro Liter: 10 g Bacto-Trypton (Difco), 5 g Bacto-Hefeextrakt (Difco), 5 g NaCl, mit NaOH auf pH 7,0 eingestellt), in einem 125 ml fassenden mit Schikanen versehenen Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 0,1 mg/ml Ampicillin bei einer Absorption (A600nm) von ca. 0,05 mit von einer L-Agarplatte mit 0,1 mg/ml Ampicillin, die über Nacht bei 37°C gezüchtet wurde, inokuliert. Die Kultur wurde bei 37°C geschüttelt, bis die A600nm ca. 1,0 erreichte, zu welchem Zeitpunkt einer Endkonzentration von 1 mM IPTG zugefügt wurde. Sofort vor der IPTG-Zugabe und nach weiteren 3 h bei 37°C wurden Proben (0,5 ml) entnommen. Die Zellen wurden sofort durch Zentrifugation in einer Mikrofuge wiedergeworinen, der Überstand wurde entfernt, und das Zellpellet wurde in Trockeneis eingefroren und bei –70°C gelagert.
  • Zur Analyse mittels Polyacrylamid-Gelelektrophorese wurden die Zellpellets aufgetaut, in 0,2 ml Probenherstellungspuffer (0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% (w/v) Na-dodecylsulfat, 0,0025% (w/v) Bromphenolblau, 10% (v/v) Glycerol, 2,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol) suspendiert und in einem siedenden Wasserbad 5 min inkubiert. Aliquote (15 pl) wurden auf ein 4–12%iges Gradienten-Polyacrylamidgel (Novex) aufgetragen und der Elektrophorese unterzogen, bis die Farbstoff-Front weniger als 1 cm vom Boden des Gels entfernt war. Das Gel wurde mit Coomassie-Brillantblau gefärbt. Ein zweites Gel (6% Acrylamid) wurde mit ähnlichen Proben laufen lassen, dann wurden die Proteinbanden unter Verwendung eines von Idea Scientific hergestellten Gerätes elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosefolie transferiert. Der Puffer für den Transfer enthielt (pro Liter): 3,03 g Trishydroxymethylaminomethan, 14,4 g Glycin, 0,1% (w/v) SDS, 25% (v/v) Methanol.
  • Der Nitrocellulose-Blot wurde immunchemisch wie folgt gefärbt. Die Proteinbindungsorte auf der Folie wurden durch Inkubation mit „Blotto" (3% Magermilchpulver, 0,05% TWEEN 20 in Tris-Salzlösung (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,9% (w/v) NaCl)) 30 min bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform blockiert. Der Blot wurde dann 1 h mit Anti-DP-1-Serum oder Anti-DP-2-Serum inkubiert, 1 : 1000 in „Blotto" verdünnt, mit Tris-Salzlösung gewaschen und 1 h mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Serum (Kierkegaard and Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), verdünnt 1 : 1000 in „Blotto", inkubiert. Nach erneutem Waschen mit Tris-Salzlösung wurde der Blot einer Lösung aus 18 mg 4-Chloro-1-naphthol in 6 ml Methanol ausgesetzt, dem 24 ml Tris-Salzlösung und 30 μl 30%iges H2O2 zugefügt wurde.
  • Zur Quantifizierung der DP-1-Antigen-Produktion wurden Zellextrakte nach einem von zwei Verfahren hergestellt.
  • Verfahren 1: Das Zellpellet aus 0,5 ml Kultur wurde in 0,084 ml 50 mM EDTA, pH 8,0, dem dann 10 μl 10 mg/ml Eiweiß-Lysozym im gleichen Puffer, 1 μl 2 mg/ml bovine Pankreas-Ribonuklease und 5 μl 0,1 M Phenylmethansulfonylfluorid in Ethanol zugefügt wurde, resuspendiert. Nach 15 nun bei 37°C wurden 1 μl 1 mg/ml DNase I zusammen mit 3 μl 1 M MgCl2, 1 M MgSO4 zugefügt, und die Inkubation wurde 10 min bei 37°C fortgesetzt. Das sich ergebende Lysat wurde durch 5-minütige Zentrifugation in einer Mikrofuge geklärt, und der Überstand wurde mit Tris-Salzlösung auf 0,5 ml verdünnt.
  • Verfahren 2: Das Zellpellet wurde in 0,5 ml Puffer 8,0 G mit 6 M Guanidin-HCl, 0,1 M NaHP2O4, 0,01 M Tris-HCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, mit NaOH auf pH 8,0 eingestellt, resuspendiert. Nach gründlichem Mischen und 1-stündiger Inkubation bei 23°C wurden die Zelltrümmer durch 15-minütige Zentrifugation in einer Mikrofuge entfernt.
  • Aliquote (1 μl) von Reihenverdünnungen in Tris-Salzlösung (Verfahren 1) oder Puffer 8,0 G (Verfahren 2) wurden zusammen mit verschiedenen Konzentrationen einer Standardlösung aus gereinigtem DP-1-8-mer (8 Wiederholungen von 101 Aminosäureresten) auf Nitrocellulose punktförmig aufgetragen. Die Nitrocellulosefolie wurde dann wie vorstehend für den Western Blot beschrieben behandelt. Die Konzentration von DP-1-Antigen in jeder Probe wurde mittels Abmustern der Farbintensität von einem der Standard-Spots bestimmt.
  • PRODUKTIONSSTÄMME:
  • VEKTOREN:
  • Zur Konstruktion von Bakterienstämmen zur Produktion von DP-1 wurden klonierte synthetische DP-1-kodierende DNA-Sequenzen in den Plasmid-Vektor, pFP202 (6) oder pFP204 insertiert, die von Plasmid pFP200 hergeleitet wurden, das sich wiederum von den Plasmiden pET11a und pET9a von Studier et al., Methods in Enzymology, 185, 60 (1990) herleitete. Plasmide pET9a und pET11a und Wirtsstämme BL21, BL21(DE3), HMS174 und HMS174 (DE3) wurden von Novagen, Madison, WI, bezogen.
  • Zur Konstruktion des Plasmids pFP200 wurde die DNA von Plasmiden pET9a und pET11a mit Endonukleasen EcoRI und AlwNI aufgeschlossen und die Aufschlüsse mittels Elektrophorese in Low Melt-Agarose getrennt fraktioniert. Die entsprechenden mit Ethidiumbromid gefärbten Banden (von pET9a, der Bande, welche das Gen trägt, das Resistenz gegen Kanamycin verleiht, und von pET11a, der Bande, welche den T7-Promotor trägt) wurden anhand der Größe identifiziert, exzidiert und aus geschmolzenen Gelscheiben mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Äquivalente Mengen der gereinigten DNA-Banden wurden kombiniert und unter Ligationsbedingungen inkubiert. Ein Aliquot der ligierten DNA wurde zur Transformation von E. coli BL21 verwendet, und Transformanten wurden auf Resistenz gegen Kanamycin (50 μg/ml) ausgewählt. Die Plasmid-DNA von individuellen Transformanten wurde nach dem Aufschluss mit der Endonuklease C1aI analysiert, und es wurde eine korrekte identifiziert und als pFP200 bezeichnet.
  • Die nächsten DNA-Sequenzen, kodierend sechs konsekutive Histidinreste wurden in pFP200 insertiert. Diese Sequenzen wurden an einem synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotid (SF25/26) mit der folgenden Sequenz getragen:
    Figure 00270001
  • Die Aminosäuresequenz, kodiert durch dieses Oligonukleotid, wenn es in der korrekten Orientierung in den BamHI-Ort von pFP200 insertiert wird, wird als ein Einbuchstaben-Code über der DNA-Sequenz gezeigt. DNA von pFP200 wurde mit Endonuklease BamHI aufgeschlossen und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Ein Aliquot dieser aufgeschlossenen DNA (ca. 0,02 pmol) wurde mit dem Oligonukleotid SF25/26 (10 pmol), dessen 5'-Termini nicht phosphoryliert wurden, gemischt. Nach 5-stündiger Inkubation bei 4°C und 20-minütiger bei 23°C unter Ligationsbedingungen wurde ein Aliquot zur Transformation von E. coli BL21 verwendet. Die Transformanten wurden auf Kanamycin-Resistenz ausgewählt, und die Plasmid-DNA individueller Transformanten wurde nach Aufschluss mit Endonukleasen EcoRI und BamHI analysiert. Ein korrektes Plasmid wurde durch die Anwesenheit im Aufschluss einer DNA-Bande identifiziert, die für die Wiederherstellung des BamHI-Ortes am proximalen Ende des Promotors der Oligonukleotidsequenz Indikativ ist, was sich aus der Insertion in der gewünschten Orientierung ergibt. Dieses Plasmid wurde als pFP202 bezeichnet. Die korrekte Insertion des Oligonukleotids wurde mittels direkter DNA-Sequenzierung, wie vorstehend beschrieben, verifiziert.
  • Der Plasmid-Vektor pFP204 wurde auf eine analoge Weise durch Insertion in pFP200 eines synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotids (SF29/30) mit der folgenden Sequenz konstruiert:
    Figure 00280001
  • Dieses Oligonukleotid setzt unmittelbar nach den sechs Tandem-His-Resten ein Terminationscodon.
  • DP-1A.9-STÄMME:
  • Als Nächstes wurden Sequenzen, kodierend DP-1A in pFP202 am BamHI-Ort, der sich zwischen dem T7-Promotor und den Sequenzen befindet, kodierend das His6-Oligomer, insertiert. Die DNA von Plasmiden pFP534 (kodierend DP-1A mit 101 aa), pFP538 (kodierend 2 Wiederholungen von DP-1A mit 101 aa) und pFP541 (8 Wiederholungen von DP-1A mit 101 aa) wurden mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen, und pFP546 (16 Wiederholungen von DP-1 mit 101 aa) wurden mit BamHI, BglII und EcoRI aufgeschlossen. Die Aufschlüsse wurden mittels Elektrophorese in Low Melt-Agarose fraktioniert, und die mit Ethidiumbromid gefärbte Bande, welche die DP-1-kodierenden Sequenzen trägt, wurde anhand der Größe identifiziert und exzidiert. Die exzidierten Gelbanden wurden geschmolzen, und jeder wurde ein Aliquot der pFP202-DNA, die mit der Endonuklease BamHI aufgeschlossen wurde, zugefügt. Die DNA wurde mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen und 2 h bei 4°C unter Ligationsbedingungen, gefolgt von 20 min bei 23°C inkubiert. Ein Aliquot ligierter DNA wurde zur Transformation von E. coli BL21(DE3) verwendet, und die Transformanten wurden auf Resistenz gegen Kanamycin ausgewählt.
  • Individuelle Transformanten wurden auf eine Celluloseacetatfolie auf die Oberfläche von LB-Agar mit Kanamycin aufgesetzt. Nach Wachstum über Nacht wurde das Celluloseacetat an eine zweite Platte transferiert, auf die eine Nitrocellulosefolie auf die Oberfläche von LB-Agar mit 1 mM IPTG platziert wurde. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37°C wurde die sich unter dem Celluloseacetat befindende Nitrocellulosefolie entfernt, mit „Blotto" blockiert und mittels immunchemischer Färbung mit Anti-DP-1-Serum, wie nachstehend beschrieben, entwickelt. Die in diesem Kolonien-Immunoassay durch eine blaue Farbe identifizierten positiven Transformanten wurden von einer Replika-Masterplatte ausgewählt, die zur gleichen Zeit wie die Immunoassay-Platte mit den gleichen Transformanten-Kolonien inokuliert wurde. Die korrekte Struktur der Plasmid-DNA von positiven Transformanten wurde nach Aufschluss mit Endonukleasen BamHI und BglII verifiziert. Transformanten, in denen das DP-1-kodierende Insert rückwärts (wie anhand der Bildung von größenmäßig angemessenen Banden im Aufschluss identifiziert) insertiert wurden, ergaben anhand des Kolonien-Immunoassays eine positive Reaktion, die Farbausbeute war jedoch deutlich weniger intensiv als in der korrekten Orientierung. Transformanten, die Plasmid mit korrekt orientierten Inserts enthalten, wurden identifiziert und als FP3211 (1 Wiederholung von 101 aa), FP3217 (2 Wiederholungen), FP3203 (8 Wiederholungen) und FP3206 (16 Wiederholungen) bezeichnet.
  • Das durch Stämme FP3217, FP3203, und FP3206 produzierte DP-1-Protein wurde anhand der Western Blot-Analyse, wie nachstehend beschrieben, bestimmt. Von allen wurde gezeigt, dass sie ein Protein voller Länge der erwarteten Größe produzieren, das anhand des Anti-DP-1-Serums nachgewiesen wurde. Außerdem wurde ein regelmäßiges Array von Anti-DP-1-färbenden Proteinbanden, hauptsächlich bei höheren Gelmobilitäten, beobachtet.
  • DP-1B.9-STÄMME:
  • E. coli-Stämme zur Produktion von DP-1B.9 wurden auf ähnliche Weise durch Transferieren von DNA-Fragmenten, kodierend DP-1B.9 (SEQ ID NO: 81) (hergeleitet vom Aufschluss mit BamHI und BglII von Plasmiden pFP 156 und pFP 158, enthaltend 8 bzw. 16 Wiederholungen des DNA-Monomers mit 303 bp) in Plasmid pFP202, konstruiert. Die resultierenden Produktionsstämme wurden als FP2121 (8 Wiederholungen) und FP2123 (16 Wiederholungen) bezeichnet. Es wurde anhand der Western Blot-Analyse gezeigt, dass beide Stämme ein Protein voller Länge der erwarteten Größe produzieren.
  • DP-1B.16-STÄMME:
  • E. coli-Stämme zur Produktion von DP-1B.16 (SEQ ID NO: 82) wurden auf eine ähnliche Weise durch Transferieren von DNA-Fragmenten, kodierend DP-1B.16 (hergeleitet vom Aufschluss mit BamHI und BglII von Plasmiden pFP662 und pFP665, enthaltend 8 bzw. 16 Wiederholungen des DNA-Monomers mit 303 bp) in Plasmid pFP204, konstruiert. Die resultierenden Produktionsstämme wurden als FP3350 (8 Wiederholungen) und FP3356 (16 Wiederholungen) bezeichnet. Anhand der Western Blot-Analyse wurde gezeigt, dass beide Stämme ein Protein voller Länge der erwarteten Größe produzieren. Wirtszelle FP3350 wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der ATCC hinterlegt und wird durch die ATCC-Nummer ATCC 69328 (hinterlegt am 15. Juni 1993) identifiziert.
  • DP-2A-STÄMME:
  • E. coli-Stämme zur Produktion von DP-2A wurden auf ähnliche Weise durch Transferieren von DNA-Fragmenten, kodierend DP-2A (hergeleitet vom Aufschluss mit BamHI und BglII von Plasmiden pFP597 und pFP598, enthaltend 8 bzw. 16 Wiederholungen des DNA-Monomers mit 357 bp) in Plasmid pFP204 konstruiert. Die resultierenden Produktionsstämme wurden als FP3276 (8 Wiederholungen) und FP3284 (16 Wiederholungen) bezeichnet. Anhand der Western Blot-Analyse wurde gezeigt, dass beide Stämme ein Protein voller Länge der erwarteten Größe produzierten.
  • BEISPIEL 5
  • PRODUKTION IM GROSSEN MASSSTAB. REINIGUNG UND QUANTIFIZIERUNG DER REKOMBINANTEN SEIDE-VARIANTEN PROTEINE
  • REINIGUNG VON DP-1A.9 (SEQ ID NO: 80):
  • Stamm FP3203 wurde bei 36°C in einem Fermgen-Fermenter (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) in 10 l eines Mediums gezüchtet, enthaltend:
    (NH4)2SO4 3,0 g
    MgSO4 4,5 g
    Na-Citrat·2H2O 0,47 g
    FeSO4·7H2O 0,25 g
    CaCl2·2H2O 0,26 g
    Thiamin-HCl 0,6 g
    Casaminosäuren 200 g
    Biotin 0,05 g
    K2HPO4 19,5 g
    NaH2PO4 9,0 g
    Glycerol 100 g
    L-Alanin 10,0 g
    Glycin 10,0 g
    Glucose 200 g
    PPG 5 ml
    ZnSO4·7H2O 0,08 g
    CuSO4·5H2O 0,03 g
    MnSO4·H2O 0,025 g
    H3BO3 0,0015 g
    (NH4)nMOx 0,001 g
    CoCl2·6H2O 0,0006 g
  • Der Fermenter wurde mit 500 ml einer über Nacht erhaltenen Kultur von FP3203 im gleichen Medium inokuliert. Der pH wurde durch das Zufügen von 5 N NaOH oder 20%iger HP3O4 bei 6,8 aufrechterhalten. Aufgelöstes O2 wurde bei ca. 50% aufrechterhalten. Wenn die Absorption bei 600 nm 10–15 erreicht hatte, wurde die Produktion von DP-1 durch Zufügen von 5 g IPTG induziert. Nach 3 h wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet und eingefroren. Die Ausbeute war eine Zellpaste von 314 g. Aufgetaute Zellen (100 g Paste) wurden in 1000 ml Puffer 8,0 G, enthaltend 6 M Guanidin-HCl, 0,1 M NaHP2O4, 0,01 M Tris-HCl, 5 mM 2-Mercaptoethanol, mit NaOH auf pH 8,0 eingestellt, suspendiert.
  • Nach 1-stündigem Rühren bei 23°C wurde das Lysat durch 30-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g geklärt, und der Überstand wurde durch Whatman Nr. 3 Papier filtriert. Dem Filtrat wurden 200 ml gepacktes Volumen von Ni-Nitrilotriessigsäure-(NTA)-Agarose (Qiagen, Inc.) zugefügt, das mit Puffer 8,0 G äquilibriert, durch Filtration wiedergeworinen und drainiert wurde. Die Lysat-Harz-Aufschlämmung wurde 24 h bei 23°C gerührt, dann wurde das Harz durch Filtration auf Whatman Nr. 3 Papier wiedergeworinen. Das drainierte Harz wurde in 500 ml Puffer 8,0 G suspendiert und in eine Chromatographie-Säule (5 cm Durchmesser) gepackt. Die Säule wurde mit 500 ml Puffer 8,0 G, dann mit aufeinanderfolgenden Puffervolumina von 320 ml der gleichen Zusammensetzung wie Puffer 8,0 gewaschen, wobei der pH mit NaOH auf die folgenden Werte eingestellt wurde: pH 6,3; 6,1; 5,9; 5,7 und 5,5. Ablaufende Fraktionen von 40 ml wurden gesammelt. DP-1-Protein wurde, wie vorstehend beschrieben, mittels Immunoassay lokalisiert. Positive Fraktionen wurden gepoolt, und der pH wurde mit NaOH auf 8,0 eingestellt. Der Immunoassay und die Western Blot-Analyse gaben zu erkennen, dass ca. 50% des die DP-1-Sequenzen enthaltenden Materials an das Harz adsorbiert und in den gepoolten Fraktionen wiedergeworinen wurde. Dem übrigen Material mangelt scheinbar der C-terminale Oligohistidin-Affinitätsschwanz, vermutlich als Ergebnis der prämaturen Termination der Proteinsynthese.
  • Die Konzentration von 2-Mercaptoethanol wurde auf 17 mM angeglichen, und das gepoolte Material wurde 5 h bei 23°C gerührt. Dieses Material wurde wieder auf die gleiche Ni-NTA-Agarose-Säule aufgebracht, die erneut mit Puffer 8,0 G äquilibriert wurde. Die Säule wurde dann mit 200 ml Puffer 8,0 G und 400 ml Puffer mit einer ähnlichen Zusammensetzung, aber mit einem pH von 6,5, gefolgt von 400 ml eines Puffers, zusammengesetzt aus 0,1 M Essigsäure, mit Triethylamin auf pH 6,5 eingestellt, einschließlich 5 mM 2-Mercaptoethanol gewaschen. DP-1-Protein wurde mit 800 ml eines Puffers, zusammengesetzt aus 0,1 M Essigsäure, mit Triethylamin auf pH 5,0 eingestellt, eluiert, während 40 ml Eluenten-Fraktionen gesammelt wurden. Das DP-1-Protein wurde durch den Immunoassay lokalisiert. Positive Fraktionen wurden gepoolt, und der Puffer wurde durch Lyophilisierung entfernt. Die Ausbeute des lyophilisierten Materials betrug 100 mg, was ca. 1% des in der Zellpaste von 100 g vorliegenden Gesamtproteins darstellt, von der es sich herleitete.
  • Die Aminosäure-Analyse des gereinigten DP-1 wird in Tabelle I gezeigt und ist konsistent mit der vorausgesagten Aminosäuresequenz mit Verunreinigungen (als Proteine der Aminosäure-Zusammensetzung, welche die Gesamtzusammensetzung von E. coli (Schaechter, M. et al., in Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt, F. C. (Hrsg.) Washington D.C., American Association for Microbiology, S. 5, (1987)) von weniger als 7% widerspiegelt.
  • TABELLE I Aminosäure-Analyse von DP-1A. 8-mer. Wiedergewonnen aus FP3203
    Figure 00310001
  • Reinheit: 93%
  • REINIGUNG VON DP-1B.16 (SEQ ID NO: 82):
  • Stamm FP3350 wurde in 5 Litern unter wie vorstehend angemerkten Bedingungen gezüchtet. Die aufgetaute Zellpaste (154 g) wurde in 1000 ml Puffer 8,0 G suspendiert und 2 h bei 23°C gerührt. Das Lysat wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g geklärt. Dem Überstand wurden 300 ml (gepacktes Volumen) Ni-NTA-Agarose, äquilibriert mit Puffer 8,0 G, zugefügt. Das Gemisch wurde 18 h bei 23°C gerührt, dann wurde das Harz durch 30-minütige Zentrifugation bei 1 000 × g wiedergeworinen. Das Harz wurde mit Puffer 8,0 G auf 800 ml verdünnt, gemischt und absetzen lassen. Der Überstand wurde entfernt und das Absetzverfahren wurde wiederholt. Das abgesetzte Harz wurde dann mit einem gleichen Volumen Puffer 8,0 G verdünnt und in eine Chromatographie-Säule (5 cm Durchmesser) gepackt. Die Säule wurde dann nacheinander mit (a) 1300 ml Puffer 8,0 G, (b) 500 ml Puffer 8,0 G, enthaltend 8 mM Imidazol, (c) 100 ml Puffer 8 0 G und (d) 500 ml Puffer 6,5 G (gleiche Zusammensetzung wie Puffer 8,0 G, aber mit dem pH mit NaOH auf 6,5 eingestellt) gewaschen. DP-1B.16-Protein wurde schließlich mit Puffer 5,5 G (gleiche Zusammensetzung wie Puffer 8,0 G, aber mit dem pH mit NaOH auf 5,5 eingestellt) eluiert. Fraktionen, die DP-1B.16 enthalten, wurden mittels des Spot-Immunoassays identifiziert, gepoolt und um das ca. 40fache durch Ultrazentrifugation unter Verwendung von Centriprep 30 Zentrifugalkonzentratoren (Amicon) konzentriert. Das Protein wurde durch das Zufügen von 5 Volumina Methanol präzipitiert, 16 h bei 4°C inkubiert, durch Zentrifugation wiedergeworinen, zweimal mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet.
  • Die Ausbeute des getrockneten Materials betrug 287 mg, was ca. 2% des in der Zellpaste von 154 g vorliegenden Gesamtproteins, von dem es sich herleitete, darstellt. Die Aminosäureanalyse ist in Tabelle II ersichtlich und ist mit der vorausgesagten Aminosäuresequenz, mit Verunreinigungen (als Proteine der Aminosäurezusammensetzung, welche die Gesamtzusammensetzung von E. coli widerspiegeln) konsistent, welche ca. 21% des Gesamtproteins in der Probe darstellen.
  • TABELLE II Aminosäureanalyse DP-1B16. 8-mer. Wiedergewonnen aus FP3350
    Figure 00330001
  • Reinheit: 79%
  • REINIGUNG VON DP-2A (SEQ ID NO: 83):
  • Stamm FP3276 wurde in 5 Litern unter den vorstehend angemerkten Bedingungen gezüchtet, außer dass das Wachstumsmedium bei der Inokulation mit 0,375 g/l L-Prolin und bei der Induktion mit 0,1 g/l Glycin und L-Alanin und 0,0375 g/l L-Prolin ergänzt wurde. Aufgetaute Zellpaste aus zwei dieser Fermentationen (150 g bzw. 140 g) wurde in jeweils 1000 ml Puffer 8,0 G suspendiert und 1 h bei 23°C gerührt. Das Lysat wurde durch 30-minütige Zentrifugation bei 10 000 × g geklärt. Die Überstände wurden kombiniert und mit 300 ml (gepacktes Volumen) Ni-NTA-Agarose, äquilibriert mit Puffer 8,0 G, gemischt. Das Gemisch wurde 18 h bei 23°C gerührt, dann wurde das Harz durch 30-minütige Zentrifugation bei 1 000 × g wiedergeworinen. Das Harz wurde mit Puffer 8,0 G auf 800 ml verdünnt, gemischt und absetzen lassen. Der Überstand wurde entfernt und das Absetzverfahren wurde zweimal wiederholt. Das abgesetzte Harz wurde dann mit einem gleichen Puffervolumen 8,0 G verdünnt und in eine Chromatographie-Säule (5 cm Durchmesser) gepackt. Die Säule wurde nacheinander mit (a) 1350 ml Puffer 8,0 G, (b) 400 ml Puffer 8,0 G, enthaltend 8 mM Imidazol, (c) 100 ml Puffer 8,0 G und (d) 750 ml Puffer 6,5 G gewaschen. DP-2A-Protein wurde schließlich mit Puffer 5,5 G eluiert. Fraktionen, die DP-1B.16 enthalten, wurden durch den Spot-Immunoassay identifiziert und gepoolt.
  • Von insgesamt 240 ml gepoolten Fraktionen, wurden 150 entfernt und um das ca. 40fache durch Ultrafiltration unter Verwendung von Centriprep 30 Zentrifugalkonzentratoren (Amicon) konzentriert. Das Protein wurde durch das Zufügen von 5 Volumina Methanol präzipitiert, 16 h bei 4°C inkubiert, durch Zentrifugation wiedergeworinen, zweimal mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die Ausbeute des getrockneten Materials betrug 390 mg.
  • Die übrigen gepoolten Säulenfraktionen von 90 ml wurden unter Verwendung von Centriprep 30-Konzentratoren um das 8fache konzentriert, mit Wasser auf das Originalvolumen verdünnt und wieder konzentriert. Dieses Verfahren wurde drei weitere Male wiederholt, um Guanidin auf weniger als 5 mM zu entfernen. Das Material wurde schließlich lyophilisiert. Das Gewicht des lyophilisierten Materials betrug 160 mg. Folglich betrug die Gesamtausbeute von gereinigtem DP-2A 550 mg, was ca. 2% des Gesamtproteins darstellte, das in der Zellpaste von 290 g, von dem es sich herleitete, anwesend war.
  • Die Aminosäure-Analyse einer Probe des lyophilisierten Materials ist in Tabelle III ersichtlich und ist konsistent mit der vorhergesagten Aminosäuresequenz, mit Verunreinigungen (als Proteine der Aminosäure-Zusammensetzung, welche die Gesamtzusammensetzung von E. coli widerspiegelt), was weniger als 4% des Gesamtproteins in der Probe darstellt.
  • TABELLE III Aminosäure-Analyse DP-2A. 8-mer. Wiedergewonnen aus Stamm FP3276
    Figure 00340001
  • Reinheit: 96%
  • Erfindungsgemäß wird die Konstruktion mehrerer spezifischer Expressionssysteme offenbart, die für die Herstellung von Spinnenseide-varianten Proteinen nützlich sind. Um keinen Zweifel aufkommen zu lassen, dass ein Fachmann fähig sein könnte, die erfindungsgemäßen Elemente zur Herstellung der Myriade anderer nicht spezifisch besprochener Spinnenseide-varianten Proteinen zu verwenden, wurden E. coli- Bakterien, die mit einem Expressionsvektor (pFP204), dem die synthetische Spinnenseide-variante DNA fehlte, transformiert, bei der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt und wird anhand der ATCC-Nummer ATCC 69326 identifiziert. Das in der Wirtszelle E. coli HB101 enthaltene Expressions-pFP204 umfasst alle die notwendigen Restriktionsorte, die zum Klonieren der erfindungsgemäßen synthetischen Spinnenseide-DNA erforderlich sind und zum Exprimieren von jedwedem Spinnenseide-varianten Protein verwendet werden können. Außerdem wurde der Expressions-Wirtsstamm E. coli BL21 (DE3), der mit einem Plasmid pFP674, tragend DP-1B.16-kodierende Sequenzen (SEQ ID NO: 82), transformiert wurde, bei der ATCC unter den Bedingungen des Budapester Vertrags hinterlegt und wird durch die ATCC-Nummer ATCC 69328 identifiziert. Dieser Stamm kann erfindungsgemäß zur Produktion von DP-1B verwendet oder durch dem Fachmann bekannte Verfahren von Plasmid befreit und mit anderen sich von pFP204 herleitenden Expressionsvektoren transformiert werden.
  • BEISPIEL 6
  • SYNTHESE UND EXPRESSION EINES DP-1-ANALOGONS IN BACILLUS SUBTILIS
  • Zur Expression in Bacillus subtilis wurde ein DP-1-Analogon-kodierendes Gen aus Plasmid pFP141 in einen Plasmid-Vektor platziert, der zur Replikation in B. subtilis fähig ist. DP-1-kodierende Sequenzen wurden funktionsfähig an einen Promotor gebunden, der sich vom Lävansucrase-(lvs)-Gen von Bacillus amyloliquefaciens auf eine solche Weise herleitet, dass die N-terminale Aminosäuresequenz, die durch das Lävansucrase-Gen kodiert ist, das eine Sekretionssignal-Sequenz umfasst, an die DP-1-Sequenz an ihrem N-Terminus fusioniert wurde. Es wurde gezeigt, dass Genfusionen dieses Typs in einigen Fällen die Produktion und Sekretion in das extrazelluläre Medium von Fremdproteinen förderten (Nagarajan et al., US-Patent 4,801,537).
  • Wie in 15 erläutert, wurde zur Herstellung des DP-10-analogen Gens zum Transfer in den entsprechenden Vektor für B. subtilis der Endonuklease-BglII-Ort am proximalen Ende der DP-1-kodierenden Sequenz in Plasmid pFP541 zuerst durch Insertion eines synthetischen Oligonukleotids in einen EcoRV-Ort umgewandelt. Die DNA von Plasmid pFP541 wurde mit Endonuklease BglII aufgeschlossen. Ca. 0,1 pmol der linearisierten Plasmid-DNA wurde dann unter Ligationsbedingungen mit 10 pmol eines synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotids (SI9/10) mit der folgenden Sequenz inkubiert:
    5'HO-GATCAGATATCG (SEQ ID NO: 16)
    TCTATAGCCTAG-OH 5' (SEQ ID NO: 17)
  • Ampicillin-resistente Transformanten von E. coli HMS174 wurden auf Plasmid-DNA, enthaltend einen durch die synthetische Oligonukleotidsequenz bereitgestellten EcoRV-Ort, gescreent. Ein Plasmid, das einen EcoRV-Ort enthält, wurde identifiziert und als pFP169b bezeichnet (15). Als Nächstes wurde das DNA-Fragment, das die DP-1-kodierenden Sequenzen trägt, nach Aufschluss mit Endonukleasen EcoRV und BamHI und Trennung der resultierenden DNA-Fragmente durch Agarose-Gelelektrophorese aus pFP169b isoliert. Eine Bande der geeigneten Größe wurde aus dem mit Ethidiumbromid gefärbten Gel exzidiert, und die DNA wurde mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen.
  • Der Plasmid-Vektor pBE346 enthält Replikationsausgangspunkte, die sowohl in E. coli als auch B. subtilis autonome Replikation ebenso wie in E. coli (Ampicillin) und B. subtilis (Kanamycin) auswählbare antibiotische Resistenz-Marker verleihen. Das Plasmid enthält außerdem den lvs-Promotor und das Sekretionssignal, das funktionsfähig an ein Staphylokokken-Protein-A-Gen gebunden ist. Das Protein-A-Gen ist durch einen EcoRV-Ort an seinem proximalen Ende gebunden, wobei es von der lvs-Signalsequenz, und einem BamHI-Ort an seinem distalen Ende getrennt ist. Die komplette DNA-Sequenz von pBE346 (14) wird in SEQ ID NO: 79 und in 14 gezeigt. Um das Protein-A-Gen zu entfernen und seinen Ersatz durch das DP-1-Gen zu ermöglichen, wurde die DNA von Plasmid pBE346 mit Endonukleasen EcoRV und BamHI aufgeschlossen, und das Fragment geeigneter Größe wurde nach der Agarose-Gelelektrophorese isoliert. Die DNA wurde aus der mit Ethidiumbromid gefärbten Gelbande mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen.
  • Das aus pFP169b (vorstehend) gereinigte DNA-Fragment wurde mit dem DNA-Fragment aus pBE346 gereinigt und unter Ligationsbedingungen inkubiert. Die ligierte DNA wurde zur Transformation von E. coli HMS174 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden durch Untersuchung der Plasmid-DNA auf das Vorliegen von Fragmenten geeigneter Größe nach Aufschluss mit Endonukleasen EcoRV und BamHI gescreent. Ein korrektes Plasmid wurde identifiziert und als pFP191 bezeichnet ( 15).
  • Die DNA von Plasmid pFP191 wurde zur Transformation kompetenter Zellen von B. subtilis BE3010 (trp lys apr npr sacB) verwendet. Die Transformanten wurden auf Resistenz gegen Kanamycin ausgewählt. BE3010 wurde von B. subtilis BE1500 (trpC2, metB10, lys3, delta-aprE, delta-npr, sacB::ermC), das von Nagarajan et al., Gene 114, 121, (1992) beschrieben wurde, durch Transformation kompetenter BE1500-Zellen mit DNA von B. subtilis 1S53 (Bacillus Genetic Stock Center, Ohio State University) und Auswahl auf Methionin-Prototrophen hergeleitet. Die Transformation kompetenter Zellen wurde im Wesentlichen, wie von Nagarajan et al. in US-Patent 4,801,537 beschrieben, durchgeführt.
  • Kanamycin-resistente Transformanten von BE3010 wurden anhand des Kolonien-Inununoassays auf die Fähigkeit zur Produktion von DP-1 gescreent. Die Kolonien wurden auf einer Celluloseacetat-Scheibe gezüchtet, die auf die Oberfläche einer Platte gelegt wurde, die TBAB-Agar einschließlich 5 Mikrogramm pro ml Kanamycin enthielt. Nachdem sich bei 37°C Kolonien entwickelt hatten, wurde die Celluloseacetat-Scheibe an eine frische Platte überführt, die das gleiche Medium einschließlich 0,8% Saccharose enthielt und über eine Nitrocellulose-Scheibe gebracht, die auf die Oberfläche des Altars platziert wurde. Nach 3-stündiger Inkubation bei 37°C wurde die Nitrocellulose-Scheibe entfernt und mit Anti-DP-1-Serum, Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG und 4-Chloro-1-naphthol einschließlich Wasserstoffperoxid, wie vorstehend beschrieben, gefärbt. Es wurden positiv färbende Images der Kolonien beobachtet, was auf die Produktion und Exkretion von DP-1, im Vergleich zu einer negativen Kontrollfärbung, die ein Plasmid mit keinen DP-1-kodierenden Sequenzen enthält, hindeutet. Der positive Stamm wurde als FP2193 bezeichnet. FP2193 wurde unter den Bedingungen des Budapester Vertrags bei der ATCC hinterlegt und wird durch die ATCC-Nummer ATCC 69327 identifiziert.
  • Die Produktion und Exkretion von DP-1 durch FP2193 wurde in flüssiger Kultes bestimmt. Stamm FP2193 wurde in Medium B gezüchtet, das pro Liter 33 g Bacto-Trypton (Difco), 20 g Hefeextrakt, 7,4 g NaCl, 12 ml 3 N NaOH, 0,8 g Na2HPO4, 0,4 g KH2PO4, 0,2% Casaminosäuren (Difco), 0,5% Glycerol, 0,06 mM MnCl2, 0,5 nM FeCl3, pH 7,5, enthielt. Nach 3,5-stündigem Wachstum bei 37°C wurde durch die Zugabe von Saccharose bis zu 0,8% die Produktion von DP-1 induziert. Nach 4-stündiger zusätzlicher Inkubation bei 37°C wurde eine Probe von 0,5 ml analysiert. Die Zellen wurden mittels Zentrifugation entfernt. Die oberen 0,4 ml des Überstandes wurden entfernt, und Phenylmethansulfonylfluorid (PMSF) wurde bis zu 2 mM zugefügt. Der restliche Überstand wurde entfernt und verworfen. Das Zellpellet wurde in 0,32 ml 50 mM EDTA, pH 8,0 und durch das Zufügen von 0,08 ml 10 mg/ml Eiweiß-Lysozym im gleichen Puffer plus 2 mM PMSF suspendiert. Nach 60-minütiger Inkubation bei 37°C wurden 0,01 ml 2 M MgCl2 und 0,001 ml 1 mg/ml Desoxyribonuklease I zugefügt und die Inkubation 5 min bei 37°C fortgesetzt. Aliquote (5 Mikroliter) von jeder Fraktion, Zelllysat und Überstand wurden mittels der SDS-Gelelektrophorese und Elektroblotting, wie vorstehend beschrieben, analysiert. Der Blot wurde mit Anti-DP-1-Serum gefärbt. Mehrere positiv färbende Banden wurden in der Überstandsfraktion und nur eine Spur einer positiven Bande im Zelllysat beobachtet. Der Wirtsstamm BE3010, der keine DP-1-kodierende DNA-Sequenzen enthielt, produzierte keine positiv färbenden Banden. Es wurde folglich gezeigt, dass der B. subtilis-Stamm FP2193 das DP-1-analoge Protein produzierte und es effizient in das extrazelluläre Medium ausschied.
  • BEISPIEL 7
  • DP-1B-PRODUKTION IN PICHIA PASTORIS
  • 1. SYNTHETISCHES GEN DP-1B.33
  • Ein Set von Genen, kodierend DP-1B, die als DP-1B.33 bezeichnet werden, wurden zum Kodieren von Proteinen der gleichen Wiederholungssequenz wie DP-1B.9 und DP-1B.16 geschaffen, aber vorwiegend zur Verwendung von Codonen, die in den hoch exprimierten Alkoholoxidase-Genen von Pichia pastoris bevorzugt sind.
  • a. OLIGONUKLEOTIDE
  • Synthetische Gene, kodierend DP-1B.33, wurden aus vier doppelsträngigen synthetischen Oligonukleotiden assembliert, deren Sequenzen wie in 16 gezeigt sind. Die Oligonukleotide wurden vom Hersteller (Midland Certified Reagents, Midland, TX) in einzelsträngiger Form mit nicht phosphorylierten 5'-OH-Gruppen bereitgestellt. Zum Annealen der doppelsträngigen Form wurden komplementäre einzelsträngige Oligonukleotide (jeweils 667 pmol) in 0,2 ml Puffer, der 0,01 M Tris-HCl, 0,01 M MgCl2, 0,05 M NaCl, 0,001 M Dithiothreitol, pH 7,9 enthielt, gemischt. Das Gemisch wurde 1 min in kochendem Wasser erhitzt, dann über ca. 3 h langsam auf 23°C abkühlen lassen.
  • Die vier doppelsträngigen Oligonukleotide wurden durch ihre Insertion in einen Plasmid-Vektor pFP206 getrennt kloniert. Die DNA von Plasmid pFP206 wurde mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) gereinigt. Ca. 0,1 pmol der eluierten Plasmid-DNA wurden 10 pmol eines der doppelsträngigen Oligonukleotide P1, P2, P3 oder P4 zugefügt. Die vier Plasmid-Oligonukleotid-Gemische wurden unter Ligationsbedingungen 20 h bei 4°C inkubiert, dann wurde die Ligation durch eine 2-minütige Inkubation bei 70°C terminiert. Die ligierte DNA wurde dann mit Endonuklease HindIII aufgeschlossen, um jedwedes zurückbleibende Eltern-pFP206 zu linearisieren. Aliquote von ligierter DNA wurden zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, und Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Klone, die Oligonukleotide P1, P2, P3 oder P4 enthalten, wurden durch Screening der Plasmid-DNA identifiziert, die aus individuellen Transformanten mit Endonukleasen BamHI und PstI isoliert wurden. In Plasmiden mit Inserts in der gewünschten Orientierung wird das kürzere der beiden BamHI-PstI-Fragmente von pFP206 um die Länge des klonierten Oligonukleotids verlängert. Plasmid-DNA aus mutmaßlichen Klonen wurden durch Aufschluss mit Endonukleasen BamHI und BglII und Analyse mittels Elektrophorese in 3,8%iger MetaPhor-Agarose (FMC) zur Verifizierung, dass das Plasmid eine einzelne Kopie des Oligonukleotids in der korrekten Orientierung erworben hatte, weiter gekennzeichnet. Korrekte Klone wurden identifiziert und ihre Plasmide wurden als pFP685 (Oligonukleotid P1, SEQ ID NO: 84, 85, und 86), pFP690 (Oligonukleotid P2, SEQ ID NO: 87, 88 und 89), pFP701 (Oligonukleotid P3, SEQ ID NO: 90, 91 und 92) und pFP693 (Oligonukleotid P4, SEQ ID NO: 93, 94 und 95) bezeichnet. Die Sequenzen von allen vier klonierten Oligonukleotiden wurden anhand der DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • b. ASSEMBLIEREN DES GENS
  • Zum Assemblieren der Subsequenz P1, P2 wurde Plasmid pFP685 (P1, SEQ ID NO: 84, 85 und 86) mit Endonukleasen PstI und BamHI aufgeschlossen, und Plasmid pFP690 (P2, SEQ ID NO: 87, 88 und 89) wurde mit Endonukleasen PstI und BglII aufgeschlossen. Die aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Agarose-Gel (Low Melt, BioRad, Hercules, CA) fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, welche die Oligonukleotidsequenzen enthalten, wurden anhand ihrer relativen Größen identifiziert, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) aus der geschmolzenen Agarose wiedergeworinen. Die eluierten, kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Plasmid, welches das Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP707 bezeichnet.
  • Assemblieren der Subsequenz P3, P4 wurde auf die gleiche Weise wie die Subsequenz P1, P2 erreicht, wobei jedoch mit den Plasmiden pFP701 (aufgeschlossen mir PstI und BamHI) und pFP693 (aufgeschlossen mit PstI und BglII) begonnen wird. Plasmid, das die P3, P4-Subsequenz enthält, wurde identifiziert und als pFP709 bezeichnet.
  • Zum Assemblieren des DNA-Monomers (P1, P2, P3, P4) wurde Plasmid pFP707 (P1, P2) mit Endonukleasen PstI und BamHI aufgeschlossen, und Plasmid pFP709 (P3, P4) wurde mit Endonukleasen PstI und BglII aufgeschlossen. Die aufgeschlossene Plasmid-DNA wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Low Melt-Agarosegel fraktioniert. Mit Ethidiumbromid gefärbte Banden, welche die P1, P2- bzw. P3, P4-Sequenzen enthalten, identifiziert durch ihre relativen Größen, wurden exzidiert, die exzidierten Banden kombiniert und die DNA mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) aus der geschmolzenen Agarose wiedergeworinen. Die eluierten, kombinierten DNA-Fragmente wurden unter Ligationsbedingungen inkubiert, und ein Aliquot wurde zur Transformation von E. coli HB 101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonuklease BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, das ein Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert und als pFP711 bezeichnet. Das DNA-Insert in Plasmid pFP711 wurde durch direkte DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • c. POLYMERISATION DES GENS
  • Das synthetische Gen wurde durch sequenzielle Verdopplung vergrößert, beginnend mit der Monomersequenz in pFP711. Zur Verdopplung jedweder Insert-Sequenz wurde ein Aliquot der Plasmid-DNA mit Endonukleasen PstI und BamHI aufgeschlossen, und ein getrenntes Aliquot des gleichen Plasmids wurde mit Endonukleasen PstI und BglII aufgeschlossen. Die Aufschlüsse wurden mittels Elektrophorese auf Low Melt-Agarose (BioRad, CA) fraktioniert, und mit Ethidiumbromid gefärbte Fragmente, welche Insert-Sequenzen enthalten, wurden anhand ihrer relativen Größen identifiziert. Die beiden Insert-enthaltenden Fragmente, gereinigt mittels Elektrophorese und wiedergeworinen mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA), wurden kombiniert und unter Ligationsbedingungen inkubiert. Bei der dritten Verdopplung wurden die beiden Fragmente im BamHI-Aufschluss nicht angemessen getrennt, folglich enthielt die eluierte Bande beide Fragmente. In diesem Fall wurde ein zweifacher Überschuss des BglII-PstI-Fragmentes bei der Ligation verwendet. Ein Aliquot der ligierten DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten wurden ausgewählt. Die Plasmid-DNA wurde aus mehreren Transformanten isoliert, mit Endonukleasen BamHI und BglII aufgeschlossen und mittels Agarosegel-Elektrophorese analysiert. Plasmid, das ein Insert der erwarteten Größe enthält, wurde identifiziert.
  • Anhand dieses Verfahrens wurde eine Reihe von Plasmiden konstruiert, die 2, 4, 8 und 16 Tandemwiederholungen der DNA-Monomersequenz P1, P2, P3, P4, kodierend die Reihe der DP-1B.16-Analoga enthielt. Diese Plasmide wurden als pFP713 (2 Wiederholungen), pFP715 (4 Wiederholungen), pFP717 (8 Wiederholungen) und pFP719 (16 Wiederholungen) bzw. p723 (16 Wiederholungen) bezeichnet.
  • 2. EXPRESSION VON DP-1- UND DP-2-ANALOGEN GENEN IN PICHIA PASTORIS
  • a. WACHSTUM UND ASSAYS
  • Zum Wachstum der Kulturen zur Beurteilung der Produktionsmenge wurden 20 ml BMGY (pro Liter: 13,4 g Hefe-Stickstoff-Basis mit Ammoniumsulfat (Difco), 10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, 0,4 mg Biotin, 100 ml 1 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,0, 10 ml Glycerol) in einem 125 ml fassenden mit Schikanen versehenen Erlenmeyer-Kolben bei einer Absorption (A600nm) von ca. 0,1 mit Zellen von einer YPD-Agarplatte (enthaltend pro Liter: 10 g Hefeextrakt (Difco), 20 g Pepton, 20 g Bacto-Agar (Difco), 20 g D-Glucose) eluiert, die 2 Tage bei 30°C gezüchtet wurden, inokuliert. Die Kultur wurde bei 30°C geschüttelt, bis A600nm ca. 25 erreichte (2 Tage), zu welchem Zeitpunkt die Zellen durch Zentrifugation (5 min bei 1500 × g) geerntet wurden. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen wurden in 6 ml BMMY (identisch mit BMGY, abgesehen von 5 ml Methanol pro Liter anstelle von Glycerol) resuspendiert. Die Kultur, wie bei 30°C geschüttelt, und 0,005 ml Methanol pro ml Kultur wurden alle 24 h zugefügt. Proben (1 ml) wurden sofort nach der Resuspension und in Intervallen entnommen. Die Zellen wurden sofort durch Zentrifugation in einer Mikrofuge (2 min bei 6000 × g) wiedergeworinen. Wenn die Sekretion bestimmt werden sollte, wurden die oberen 0,7 ml des Überstandes entfernt und in Trockeneis gefroren (Fraktion mit dem „Kulturüberstand"). Das drainierte Zellpellet wurde in Trockeneis gefroren und bei –70°C gelagert.
  • Die Zellen wurden durch Schütteln mit Glasperlen lysiert. Das aufgetaute Pellet wurde mit 1 ml kaltem Abbruchpuffer (50 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 1 mM EDTA, 5% (v/v) Glycerol, 1 mM Phenylmethan-sulfonylfluorid) gewaschen und in 0,1 ml des gleichen Puffers resuspendiert. Glasperlen (in Säure gewaschen, 425–600 Mikron; Sigma Chemical Co.) wurden zugefügt, bis über den Perlen nur ein Meniskus sichtbar war und die Röhrchen während zwei Intervallen von 4 min, wobei dazwischen auf Eis gekühlt wurde, dem Mischen auf einem Mischer des Vortex-Typs ausgesetzt. Der Zellbruch wurde mittels mikroskopischer Untersuchung verifiziert. Nach dem vollständigen Bruch wurden 0,5 ml Abbruchpuffer zugefügt und gemischt. Trümmer und Perlen wurden in der Mikrofuge (10 min) pelletiert und 0,5 ml Überstand (löslicher Zellextrakt) entfernt. Die Trümmer wurden dann zweimal mit zusätzlichen 0,5-ml-Portionen des Abbruchpuffers extrahiert und die 0,5-ml-Überstände mit dem ersten Extrakt kombiniert („lösliche Zellextrakt"-Fraktion). Die Trümmer wurden dann dreimal mit 0,5-ml-Portionen von Puffer 6.5 G, enthaltend 0,1 M Natriumphosphat, 0,01 M Tris-HCl, 6 M Guanidin-HCl, pH 6,5, extrahiert. Die kombinierten Überstände umfassten die „unlösliche Zellextrakt"-Fraktion.
  • Die Extrakte wurden zur Analyse mittels der Polyacrylamidgel-Elektrophorese um das ca. 1000fache in Probenherstellungspuffer (0,0625 M Tris-HCl, pH 6,8, 2% (w/v) Na-dodecylsulfat, 0,0025% (w/v) Bromphenolblau, 10% (v/v) Glycerol, 2,5% (v/v) 2-Mercaptoethanol) verdünnt und in einem kochenden Wasserbad 5 min inkubiert. Aliquote (5–15 μl) wurden auf ein 8%iges Polyacrylamidgel (Novex) aufgetragen und der Elektrophorese unterzogen, bis sich die Farbstoff-Front weniger als 1 cm vom Boden des Gels entfernt befand. Die Proteinbanden wurden unter Verwendung eines von Idea Scientific, Inc. hergestellten Gerätes elektrophoretisch an eine Nitrocellulosefolie überführt. Der Puffer zum Transfer enthielt (pro Liter) 3,03 g Trishydroxymethylaminomethan, 14,4 g Glycin, 0,1% (w/v) SDS, 25% (v/v) Methanol.
  • Der Nitrocellulose-Blot wurde immunchemisch wie folgt gefärbt. Die Proteinbindungsorte auf der Folie wurden durch Inkubation mit „Blotto" (3% Magermilchpulver, 0,05% Tween 20, in Tris-Salzlösung (0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,9% (w/v) NaCl)) 30 min bei Raumtemperatur auf einer Schaukelplattform blockiert. Der Blot wurde dann 1 h mit Anti-DP-1-Serum inkubiert, 1 : 1000 in „Blotto", verdünnt, mit Tris-Salzlösung gewaschen und 1 h mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziegen-Antikaninchen-IgG-Serum (Kierkegaard und Perry Laboratories, Gaithersburg, MD), verdünnt 1 : 1000 in „Blotto" inkubiert. Nach erneutem Waschen mit Tris-Salzlösung wurde der Blot einer Lösung aus 18 mg 4-Chloro-1-naphthol in 6 ml Methanol ausgesetzt, der 24 ml Tris-Salzlösung und 30 μl 30%ige H2O2 zugefügt wurden.
  • Zur Quantifizierung der DP-1-Antigenmenge in verschiedenen Fraktionen wurden Aliquote (1 μl) von Reihenverdünnungen in Puffer 6.5 G, zusammen mit verschiedenen Konzentrationen einer Standardlösung aus gereinigtem DP-1-8-mer (8 Wiederholungen von 101 Aminosäureresten) punktförmig auf Nitrocellulose aufgetragen. Die Nitrocellulosefolie wurde dann wie vorstehend für den Western Blot beschrieben behandelt. Die Konzentration von DP-1-Antigen in jeder Probe wurde mittels Abmustern der Farbintensität von einem der Standard-Spots bestimmt.
  • b. PRODUKTIONSSTÄMME
  • (1) VEKTOREN
  • Zur Konstruktion von Hefestämmen zur Produktion von DP-1 wurden klonierte synthetische DP-1-kodierende DNA-Sequenzen in Plasmid-Vektoren insertiert, die sich von den Plasmiden pHIL-D4 (bezogen von Phillips Petroleum Co.) oder pPIC9 (bezogen von Invitrogen Corp.) herleiteten. Die Struktur von pHIL-D4 wird in 17 erläutert. Das Plasmid schließt einen in E. coli (aber nicht in Hefe) aktiven Replikationsausgangspunkt und Ampicillin- und Kanamycin-Resistenz-Marker ein, die in E. coli selektierbar sind. Der Kanamycin-Resistenz-Marker verleiht auch Resistenz gegen das Antibiotikum G418 in Hefe. Das Plasmid schließt Regionen ein, die homolog zu beiden Enden des AOX1-Gens von Pichia pastoris sind. Die oberstromige Region schließt den AOX1-Promotor ein, dessen Expression durch Methanol induzierbar ist. Die zu exprimierenden Sequenzen werden benachbart zu dem AOX1-Promotor insertiert. Unterstromig befinden sich Sequenzen, welche den AOX1-Polyadenylierungsort und Transkriptionsterminator, den Kanamycin-Marker und das HIS4-Gen von Pichia pastoris kodieren. In pHIL-D4 sind keine translatierten Sequenzen oberstromig von den zu exprimierenden Sequenzen vorgesehen. Der Vektor pPIC9 (18) ist ähnlich dem von pHIL-D4, außer dass er, benachbart zu dem AOX1-Promotor, Sequenzen, kodierend die Signalsequenz und Prosequenz des alpha-paarenden Faktorgens von Saccharomyces cerevisiae einschließt. Dem pPIC9 mangelt außerdem auch das Kanamycin-Resistenzgen von pHIL-D4.
  • Ein BamHI-Ort in pPIC9, lokalisiert unmittelbar oberstromig vom 5'-Ende des alpha-paarenden Faktorgens, wurde entfernt und die Sequenzen zu denen, welche dem natürlichen AOX1-Gen ähneln, durch die Polymerasekettenreaktion (PCR) (Perkin Elmer Cetus, CA) wiederhergestellt. Die Fragmente von pPIC9 wurden unter Verwendung der folgenden Primer-Paare getrennt amplifiziert:
    Figure 00410001
  • Die PCR-Reaktionen wurden in einem Perkin Elmer Cetus DNA Thermocycler unter Verwendung des Perkin Elmer Cetus GeneAmp-Kits mit AmpliTaq®-DNA-Polymerase durchgeführt. Es wurden die vom Hersteller bereitgestellten Anleitungen befolgt. Die Matrizen-DNA betrug ca. 0,2 ng pPIC9-DNA, aufgeschlossen mit Endonukleasen BglII und PvuII und anschließend mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Das PCR-Programm schloss (a) 1 min bei 94°C; (b) 4 Zyklen bestehend aus 1 min bei 94°C, 2 min bei 45°C, 1 min bei 72°C; (c) 25 Zyklen, bestehend aus 1 min bei 94°C, 1 min bei 60°C, 1 min bei 72°C (verlängert um 10 sec je Zyklus und (d) 7 min bei 72°C ein. Die Produkte wurden aus den beiden getrennten PCR-Reaktionen mithilfe des GENECLEAN-Verfahrens (P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen und in ca. äquimolaren Mengen gemischt. Dieses Gemisch wurde als Matrize für eine zweite PCR-Runde unter Verwendung von Primern LB5 und LB6 verwendet. Für diese Reaktion schloss das PCR-Programm (a) 1 min bei 94°C; (b) 25 Zyklen, bestehend aus 1 min bei 90°C, 1 min bei 60°C, 1 min bei 72°C (verlängert 10 sec pro Zyklus) und (d) 7 min bei 72°C ein. Das PCR-Produkt wurde mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen, dann mit Endonukleasen NsiI und EcoRI aufgeschlossen und wiederum mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Das Fragment wurde mittels Elektrophorese in 1,5% Low Melt-Agarose (BioRad) gereinigt. Die DNA wurde aus der exzidierten Gelbande mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Dieses Fragmert wurde für das analoge Fragment in pPIC9 substituiert. Zu diesem Zweck wurde pPIC9 mit Endonukleasen NsiI und EcoRI aufgeschlossen. Das größere Fragment wurde mittels Elektrophorese in einem 1,2%igen Low Melt-Agarosegel gereinigt und aus der exzidierten Gelbande mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Das PCR-Fragment und das große pPIC9-Fragment wurden unter Standardbedingungen ligiert, und die Ligation zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Ampicillin-resistente Transformanten, enthaltend das korrekte Plasmid wurden mittels Screening der Plasmid-DNA auf Abwesenheit des BamHI-Ortes identifiziert. Das korrekte Plasmid wurde als pFP734 bezeichnet. Die DNA-Sequenz von pFP734 in der betroffenen Region, welche durch DNA-Sequenzierung verifiziert wurde, ist in 19 (SEQ ID NO: 96 und 97) ersichtlich.
  • DNA-Sequenzen, kodierend sechs konsekutive Histidinreste wurden in pHIL-D4 insertiert. Solche Sequenzen wurden an einem synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotid (SF47/48) mit der folgenden Sequenz durchgeführt:
    Figure 00420001
  • Die Aminosäuresequenz, kodiert durch dieses Oligonukleotid, wenn es in der korrekten Orientierung in den EcoRI-Ort von pHIL-D4 insertiert wird, wird in einem Einbuchstaben-Code über der DNA-Sequenz gezeigt. Die DNA von pHILD4 wurde mit Endonuklease EcoRI aufgeschlossen und mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Ein Aliquot dieser aufgeschlossenen DNA (ca. 0,02 pmol) wurde mit dem Oligonukleotid SF47/48 (10 pmol), dessen 5'-Termini nicht phosphoryliert wurden, gemischt. Nach 19-stündiger Inkubation bei 4°C unter Ligationsbedingungen, wurde ein Aliquot zur Transformation von E. coli HB101 verwendet. Die Transformanten wurden anhand der Ampicillin-Resistenz ausgewählt, und die Plasmid-DNA individueller Transformanten wurde nach Aufschluss mit Endonuklease PvuII and BamHI analysiert. Ein korrektes Plasmid wurde durch die Anwesenheit einer DNA-Bande im Aufschluss identifiziert, die für den BamHI-Ort am Promotor-proximalen Ende der Oligonukleotid-Sequenz indikativ ist, die aus der Insertion in der gewünschten Orientierung resultiert. Dieses Plasmid wurde als pFP684 bezeichnet. Die korrekte Insertion des Oligonukleotids wurde mittels direkter DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • Der Plasmid-Vektor pFP743 wurde auf analoge Weise durch Substitution für Sequenzen zwischen NotI- und EcoRI-Orten in pFP734 eines synthetischen doppelsträngigen Oligonukleotids (SF55/56) mit der folgenden Sequenz konstruiert:
    Figure 00420002
    Figure 00430001
  • Die DNA von pFP734 wurde mit Endonukleasen NotI und EcoRI aufgeschlossen, dann mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen. Das Oligonukleotid SF55/56 wurde, wie vorstehend beschrieben, mittels Ligation insertiert. Ein korrektes Plasmid wurde durch die Anwesenheit eines neuen Fragmentes nach Aufschluss der Plasmid-DNA mit Endonukleasen BamHI und BglII identifiziert und als pFP743 bezeichnet. Die korrekte Oligonukleotid-Insertion wurde durch direkte DNA-Sequenzierung verifiziert.
  • (2) DP-1B.33-STÄMME
  • Als Nächstes wurden Sequenzen, kodierend DP-1B, in pFP684 und pFP743 an den entsprechenden einzigartigen BamHI-Orten, die sich zwischen dem AOX1-Promotor und Sequenzen befinden, kodierend das His6-Oligomer, insertiert. DNA (ca. 2 Mikrogramm) von Plasmiden pFP717 (kodierend 8 Wiederholungen von DP-1B mit 101 aa) und pFP719 (kodierend 16 Wiederholungen von DP-1B mit 101 aa) wurden mit Endonuklease BamHI und BglII aufgeschlossen. Die Aufschlüsse wurden durch Elektrophorese in Low Melt-Agarose fraktioniert, und die mit Ethidiumbromid gefärbte Bande, welche die DP-1B-kodierenden Sequenzen trägt, wurde anhand der Größe identifiziert und exzidiert. Die exzidierten Gelbanden wurden geschmolzen, und jedem wurde ein Aliquot von pFP684- oder pFP743-DNA zugefügt, die mit der Endonuklease BamHI aufgeschlossen wurde. Die DNA wurde mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio101, Inc., P.O.Box 2284, La Jolla, CA) wiedergeworinen und 3 h unter Ligationsbedingungen bei 13°C inkubiert. Ein Aliquot der ligierten DNA wurde zur Transformation von E. coli HB101 verwendet, und Transformanten wurden auf Resistenz gegen Ampicillin ausgewählt.
  • Individuelle Transformanten wurden mittels Aufschluss der Plasmid-DNA mit Endonukleasen BamHI und BglII gescreent. Korrekte Plasmide wurden mittels Vorliegen eines Fragmentes der erwarteten Größe, enthaltend das DP-1B.33-Gen identifiziert. Sich vom Vektor pFP684 herleitende Plasmide wurden als pFP728 (kodierend 8 Wiederholungen von DP-1B mit 101 Aminosäuren) und pFP732 (kodierend 16 Wiederholungen von DP-1B mit 101 Aminosäuren) bezeichnet. Diejenigen, die sich vom Vektor pFP743 herleiten, wurden als pFP748 (kodierend 8 Wiederholungen von DP-1B mit 101 Aminosäuren) und pFP752 (kodierend 16 Wiederholungen von DP-1B mit 101 Aminosäuren) bezeichnet.
  • Jedes dieser Plasmide wurde zum Transfer des DP1B-Gens an den Pichia pastoris-Stamm GS115 (his4) durch Sphäroplasten-Transformation im Wesentlichen gemäß Cregg et al. (Mol. Cell. Biol. 5, 3376– 3385 (1985)) verwendet. Der Pichia-Stamm wurde in 200 ml YPD-Medium in einem 500 ml fassenden mit Schikanen versehenen Kolben bei 30°C bis A600nm von 0,3 bis 0,4 gezüchtet. Die Zellen wurden mittels 5-minütiger Zentrifugation bei 1500 × g bei Raumtemperatur geerntet, dann mit 20 ml sterilem Wasser, gefolgt von 20 ml frischem SED (1 M Sorbitol, 25 mM EDTA, pH 8,0, 50 mM DTT) und 20 ml 1 M Sorbitol gewaschen. Die Zellen wurden in 20 ml SCE (1 M Sorbitol, 1 mM EDTA, 10 mM Natriumcitrat, pH 5.8) resuspendiert, und Zymolyase (15 ml Stammlösung, enthaltend 3 mg/ml hefelytisches Enzym aus Arthrobacter luteus (ICN Corp.; spezifische Aktivität 100 000 U/g)) wurde zugefügt. Das Sphäroplasting wurde durch Verdünnung von 0,2-ml-Aliquoten in 0,8 ml 5% SDS und Messen bei A600nm überwacht. Der Aufschluss wurde fortgesetzt, bis 70– 80% Sphäroplasting erreicht wurde. Die Sphäroplasten wurden dann durch 10-minütige Zentrifugation bei 750 × g bei Raumtemperatur geerntet, einmal mit 10 ml 1 M Sorbitol und einmal mit 10 ml CAS (1 M Sorbitol, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl2) gewaschen und schließlich in 0,6 ml CAS resuspendiert. 0,1 ml Sphäroplasten-Suspension wurden 1–5 Mikrogramm lineare DNA-Fragmente in CAS, die durch Aufschluss von Plasmid-DNA mit Endonuklease BglII und Wiedergewinnen der Fragmente mithilfe des GENECLEAN®-Verfahrens (Bio 101, Inc., P.O. Box 2284, La Jolla, CA) hergestellt wurden, zugefügt. Die PEG-Lösung (1 ml enthaltend 20% (w/v) PEG 3350 (Fisher Scientific Co.) in 10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM CaCl2) wurde zugefügt, vorsichtig gemischt und 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation wie vorstehend wiedergeworinen. Das drainierte Pellet wurde in 0,15 ml SOS (1 M Sorbitol, 0,3 vol/vol YPD-Medium, 10 mM CaCl2 resuspendiert, 20 min bei Raumtemperatur inkubiert und mit 0,85 ml 1 M Sorbitol verdünnt. Die gewaschenen Sphäroplasten wurden mit 15 ml RD-Agarose enthaltend pro Liter: 186 g Sorbitol, 10 g Agarose, 20 g D-Glucose, 13,4 g Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren (Difco), 0,4 mg Biotin, je 50 mg L-Glutaminsäure, L-Methionin, L-Lysin, L-Leucin, L-Isoleucin und 20 ml 50x His-Assay-Medium, gemischt. Die Zusammensetzung von 50x His-Assay-Medium war wie folgt (pro Liter): 50 g D-Glucose, 40 g Natriumacetat, 6 g Ammoniumchlorid, 0,4 g D,L-Alanin, 0,48 g L-Arginin-HCl, 0,8 g L-Asparagin-Monohydrat, 0,2 g L-Asparaginsäure, 0,6 g L-Glutaminsäure, 0,2 g Glycin, 0,2 g D,L-Phenylalanin, 0,2 g L-Prolin, 0,1 g D,L-Serin, 0,4 g D,L-Threonin, 0,5 g D,L-Valin, 20 mg Adeninsulfat, 20 mg Guanin-HCl, 20 mg Uracil, 20 mg Xanthin, 1 mg Thiamin-HCl, 0,6 mg Pyridoxin-HCl, 0,6 mg Pyridoxamin-HCl, 0,6 mg Pyridoxal-HCl, 1 mg Ca-pantothenat, 2 mg Riboflavin, 2 mg Nicotinsäure, 0,2 mg para-Aminobenzoesäure, 0,002 mg Biotin, 0,002 mg Folsäure, 12 g Monokaliumphosphat, 12 g Dikaliumphosphat, 4 g Magnesiumsulfat, 20 mg Eisensulfat, 4 mg Mangansulfat, 20 mg Natriumchlorid, 100 mg L-Cystin, 80 mg D,L-Tryptophan, 200 mg L-Tyrosin. Sphäroplasten in RD-Agarose (5 ml Aliquote) wurden mit der gleichen Zusammensetzung wie RD, aber mit 20 g Agar (Difco) pro Liter anstelle von Agarose auf RDB-Platten ausplattiert.
  • Die Platten wurden 3–4 Tage bei 30°C inkubiert. Histidin-prototrophe Transformanten wurden ausgewählt und auf MGY-Platten aufgebracht, enthaltend (pro Liter) 15 g Agar, 13,4 g Hefe-Stickstoff-Basis ohne Aminosäuren, 0,4 mg Biotin, 10 ml Glycerol. Replika wurden auf eine Celluloseacetatfolie auf die Oberfläche von MGY-Agar gegeben. Nach 2-tägigem Wachstum bei 30°C wurde das Celluloseacetat auf eine zweite Platte transferiert, auf die eine Nitrocellulosefolie auf die Oberfläche von MM-Agar mit der gleichen Zusammensetzung wie MGY, abgesehen von 0,5% (v/v) Methanol anstelle von Glycerol aufgelegt wurde. Nach 1 – bis 3-tägiger Inkubation bei 30°C wurde die Nitrocellulosefolie unter dem Celluloseacetat entfernt, mit „Blotto" blockiert und durch immunchemisches Färben mit Anti-DP-1-Serum, wie vorstehend beschrieben, gefärbt. Positive Transformanten, in diesem Kolonien-Immunoassay durch die blaue Farbe identifiziert, wurden von der MGY-Masterplatte gewählt. Transformanten wurden außerdem auch auf MM-Agar auf Wachstum getestet. Das von im Immunoassay positiven Stämmen produzierte DP-1-Protein wurde mittels der Western Blot-Analyse wie vorstehend beschrieben bestimmt. Von mehreren wurde gezeigt, dass sie ein Protein der vollen Länge der erwarteten Größe produzieren, das anhand des Anti-DP-1-Serums nachgewiesen wurde.
  • (2) DP-1B-PRODUKTION
  • Die DP-1B-Produktion durch zwei dieser Transformanten wird in 20 und 21 erläutert. 20 zeigt intrazelluläre Produktion, nach verschiedenen Zeiten der Methanol-Induktion, durch Stamm YFP5028, der sich von transformierendem Pichia pastoris GS115 mit Plasmid pFP728 herleitete. Dieser Stanzen produziert DP-1B-Spezies 5 verschiedener Größen, wie durch die Western Blot-Analyse angezeigt, bestehend aus 8, 11, 13, 15 bzw. größer als 20 Wiederholungen des Monomers mit 101 Aminosäureresten. Er wurde unter Transformanten von Pichia durch seine Fähigkeit identifiziert, auf YPD-Medium mit 0,5 mg/ml Antibiotikum G418 zu wachsen, was vermutlich Indikativ für das Vorliegen multipler Kopien des pFP728-hergeleiteten Inserts ist. Die Gesamtproduktion von DP-1B lag bei über 1 g pro Liter Kultur. 21 zeigt die infra- und extrazelluläre Produktion von DP-1B durch Stanzen YFP5093, der sich von der Transformation von Pichia pastoris GS115 mit Plasmid pFP748 herleitete. Eine signifikante Fraktion des produzierten DP-1B wurde aus dem extrazellulären Überstand der Kultur wiedergeworinen.
  • BEISPIEL 8
  • NACHWEIS DER LÖSLICHMACHUNG UND EXTRUSION VON FASERN AUS EINEM REKOMBINANT SYNTHETISIERTEN ANALOGON ZUM SPINNEN-TRAGFADEN-PROTEIN
  • DP-1B wurde zum Faserspinnen durch Ionenaustausch-Chromatographie gereinigt. Die gefrorene Zellpaste von E. coli FP3350 wurde aufgetaut, in 0,02 M Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 (Puffer A) suspendiert und mittels Passage durch einen Mantin-Gaulin-Homogenisator (3–4 Durchgänge) lysiert. Die Zelltrümmer wurden durch Zentrifugation entfernt, und der lösliche Extrakt wurde 15 min auf 60°C erhitzt. Unlösliches Material wurde wieder durch Zentrifugation entfernt, und der lösliche wärmebehandelte Extrakt wurde auf pH 8,0 eingestellt und auf Konduktivität von weniger als 0,025 M verdünnt, auf eine SP-Sepharose Fast Flow-Säule (Pharmacia, Piscataway, NJ) aufgebracht, die mit Puffer A äquilibriert wurde verdünnt. Die Säule wurde mit Puffer A gewaschen und mit einem linearen Gradienten von 0 bis 0,5 M NaCl in Puffer A eluiert. DP-1B-enthaltende Fraktionen wurden mittels Gelelektrophorese und Immunoblotting wie vorstehend beschrieben, identifiziert, gepoolt, und DP-1B wurde durch Präzipitation mit 4 Volumina Methanol bei 0°C und Zentrifugation wiedergeworinen. Die Pellets wurden dreimal mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet, Es wurde festgestellt, dass dieses Material, wie durch die Aminosäure-Analyse bestimmt, mehr als 95% reines DP-1B war.
  • Kurz gefasst beinhaltete das Verfahren zum Herstellen nützlicher Fasern aus gereinigtem DP-1-Protein die Schritte der Auflösung in HFIP, gefolgt von Spinnen der Lösung durch eine Spinndüsenöffnung zum Erhalt der Fasern. Physikalische Eigenschaften, wie zum Beispiel Reißlänge, Dehnung und initiales Modul wurden unter Verwendung von Verfahren und Instrumenten gemessen, die der ASTM-Norm D 2101-82 entsprachen, außer dass die Testprobenlänge einen Inch betrug. Für jeden Test wurden fünf Brüche pro Probe vorgenommen.
  • NASSSPINNEN VON SEIDENFASERN AUS HFIP-LÖSUNG:
  • DP-1 wurde dem Hexafluorisopropanol (HFIP) in einer Polyethylen-Spritze zugefügt, um eine 20%ige Lösung aus DP-1 in HFIP herzustellen. Die Lösung wurde durch Vor- und Zurückpumpen zwischen zwei Spritzen gründlich gemischt und über Nacht stehen lassen.
  • Die Lösung mit 20% Feststoffen aus DP-1 in HFIP wurde an eine Spritze überführt, die mit einem gesinterten Edelstahl-DYNALLOG-Filter (X7) ausgerüstet war. Die Spritze wurde mit einer Kappe verschlossen und periodisch zum Lösen von in der Lösung eingeschlossenen Luftbläschen entlüftet. Eine Spritzenpumpe wurde dann zum Forcieren der Lösung durch das Filter und aus der Spritze durch eine Öffnung von 5 mit Durchmesser mal 4 mit Länge in einer Edelstahl-Spinndüse durch eine 3,5 Inch große Luftlücke in den Behälter mit Isopropanol bei 20°C verwendet. Das Filament, das sich bildete, als die Lösung bei 8,3 fpm in das Isopropanol extrudiert und bei 11 fpm auf eine Spule gewickelt wurde.
  • Das gesponnene Filament wurde über Nacht in Isopropanol stehen lassen. Dann wurde das Filament, während es noch nass war, um das 2fache seiner Länge bei 150°C in einem Rohrofen gezogen. Die gezogene Faser wurde dann bei Raumluft trocknen lassen.
  • Das physikalische Testen von Proben der Trockenfaser zeigte, dass sie 16,7 Denier betrugen, mit Reißlängen von 1,22 gpd, Dehnungen von 103,3% und initialen Moduli von 40,1 gpd. Diese Zahlenangaben weisen darauf hin, dass sich die Reißlänge und der Modul der gesponnenen DP-1-Spinnenseide-varianten Faser mit denen kommerzieller Textilfasern vorteilhaft vergleichen lässt und deshalb als nützliche Fasern erachtet werden.
  • SEQUENZPROTOKOLL
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Claims (13)

  1. Spinnentragfaden-variantes Protein, definiert durch eine Formel, die aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: A)
    Figure 01020001
    worin X = S, G oder N; n = 0–7 und z = 1–75; und worin der Wert von z die Anzahl von Wiederholungen in dem varianten Protein bestimmt und worin die Formel Variationen umfasst, die aus der Gruppe ausgewählt sind, bestehend aus: (a) wenn n = 0, die Sequenz, die AGRGGLGGQGAGAnGG umfasst, deletiert ist; (b)
    Figure 01020002
    (c) die Deletion von GYG in jedweder Wiederholung von der Deletion von GRG in der gleichen Wiederholung begleitet ist; und (d) worin eine erste Wiederholung, worin n = 0, vorhanden ist, der ersten Wiederholung eine zweite Wiederholung vorausgeht, worin n = 6; und B)
    Figure 01020003
    worin n = 6–10 und z = 1–75 und worin sich individuelle Wiederhoungen der Konsensus-Wiederholungssequenz durch Deletionen von ganzen Vielfachen von fünf konsekutiven Resten, bestehend aus einer oder beiden der Pentapeptid-Sequenzen GPGGY oder GPGQQ, unterscheiden.
  2. Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Protein nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus (a) der Sequenz:
    Figure 01020004
    worin die Sequenz als SEQ ID NO: 80 bezeichnet ist und die Nukleinsäuresequenz das DP-1A.9-Aminosäure-Monomer kodiert; (b) der Sequenz:
    Figure 01030001
    worin die Sequenz als SEQ ID NO: 81 bezeichnet ist und die Nukleinsäuresequenz das DP-1B.9-Aminosäure-Monomer kodiert; (c) der Sequenz:
    Figure 01030002
    worin die Sequenz als SEQ ID NO: 82 bezeichnet ist und die Nukleinsäuresequenz das DP-1B.16-Aminosäure-Monomer kodiert und (d) der Sequenz:
    Figure 01030003
    worin die Sequenz als SEQ ID NO: 83 bezeichnet ist und die Nukleinsäuresequenz das DP-2A-Aminosäure-Monomer kodiert.
  3. Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Protein nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus: (a) einer Nukleinsäuresequenz, die ein faserbildendes Spinnenseide-variantes Protein kodiert, umfassend von 1 bis 16 Tandemwiederholungen des DP-1A.9-Aminosäure-Monomers; (b) einer Nukleinsäuresequenz, die ein faserbildendes Spinnenseide-variantes Protein kodiert, umfassend von 1 bis 16 Tandemwiederholungen des DP-1B.9-Aminosäure-Monomers; (c) einer Nukleinsäuresequenz, die ein faserbildendes Spinnenseide-variantes Protein kodiert, umfassend von 1 bis 16 Tandemwiederholungen des DP-1B.16-Aminosäure-Monomers und (d) einer Nukleinsäuresequenz, die ein faserbildendes Spinnenseide-variantes Protein kodiert, umfassend von 1 bis 16 Tandemwiederholungen des DP-2A-Aminosäure-Monomers.
  4. Nukleinsäuresequenz, kodierend ein Protein nach Anspruch 1, worin die Nukleinsäuresequenz aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus 1 bis 16 Tandemwiederholungen der Nukleinsäuresequenz, identifiziert als: (a) SEQ ID NO: 80; (b) SEQ ID NO: 81 (e) SEQ ID NO: 82 und (d) SEQ ID NO: 83.
  5. Plasmid, umfassend eine Nukleinsäuresequenz nach Anspruch 3, die funktionsfähig und expressionsfähig mit einem geeigneten Promotor verknüpft ist, worin das Plasmid zum Transformieren einer Wirtszelle zur Expression eines Spinnenseide-varianten Proteins in Anteilen zwischen 1 mg und 300 mg Protein voller Länge pro Gramm Zellmasse fähig ist.
  6. Plasmid nach Anspruch 5, worin die Nukleinsäuresequenzen entweder am 5-Ende oder am 3-Ende durch ein DNA-Fragment, kodierend eine Reihe zwischen 4 und 20 Histidinresten, flankiert ist.
  7. Transformierte Wirtszelle, umfassend: (1) das Plasmid nach Anspruch 5, das zum Exprimieren eines Spinnenseide-varianten Proteins in Anteilen zwischen 1 mg und 300 mg Protein voller Länge pro Gramm Zellmasse fähig ist oder (2) das Plasmid nach Anspruch 6, das zum Exprimieren eines Spinnenseide-varianten Proteins in Anteilen zwischen 1 mg und 300 mg Protein voller Länge pro Gramm Zellmasse fähig ist, worin die Nukleinsäuresequenz entweder am 5-Ende oder am 3-Ende durch ein DNA-Fragment, kodierend eine Reihe zwischen 4 und 20 Histidinresten, flankiert ist.
  8. Wirtszelle nach Anspruch 7, worin die Wirtszelle aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus E. coli, Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Aspergillus sp. und Streptomyces sp.
  9. Wirtszelle, transformiert mit einem Plasmid, das die Nukleinsäuresequenzen nach Anspruch 3 umfasst, wobei die Wirtszelle zum Sezernieren des Spinnenseide-varianten Proteins in das Zellwachstumsmedium fähig ist.
  10. Transformierter E. coli-Wirt FP3350, identifiziert durch die ATCC-Nummer ATCC 69328.
  11. Transformierter Bacillus subtilis-Wirt FP2193, identifiziert durch die ATCC-Nummer ATCC 69327.
  12. Universeller Expressionsvektor pFP204, der für die Expression von Spinnenseide-varianten Proteinen nützlich ist, wobei der Vektor frei von jeglicher synthetischen Spinnenseide-varianten DNA ist, worin der universelle Expressionsvektor pFP204 in einem Bakterienstamm enthalten und durch die ATCC-Nummer ATCC 69326 identifizier ist.
  13. Verfahren zur Herstellung eines synthetischen Spinnentragfaden-varianten Proteins nach Anspruch 1, umfassend die Schritte von: (i) Design einer DNA-Monomersequenz zwischen ca. 50 bp und 1000 bp, die für ein Poplypeptid-Monomer kodiert, bestehend aus einer Varianten einer Konsensus-Sequenz, hergeleitet von den faserbildenden Regionen des Spinnentragfaden-Proteins und definiert durch SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 18; (ii) Assemblieren des DNA-Monomers von Schritt (i); (iii) Polymerisieren des DNA-Monomers von Schritt (ii) zur Bildung eines synthetischen Gens, kodierend ein Seide-variantes Protein voller Länge; (iv) Transformieren einer geeigneten Wirtszelle mit einem Vektor, enthaltend das synthetische Gen von Schritt (iii); (v) Expression des synthetischen Gens, wobei das durch das synthetische Gen kodierte Protein, (a) in Anteilen zwischen 1 mg und 300 mg Protein voller Länge pro Gramm Zellmasse produziert oder (b) in das extrazelluläre Medium sezerniert wird und (vi) Wiedergewinnen des in Schritt (v) exprimierten Proteins in einer Form, die zu einer Faser gebildet werden kann.
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