PL208666B1 - Środek farmaceutyczny zawierający peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu - Google Patents

Środek farmaceutyczny zawierający peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu

Info

Publication number
PL208666B1
PL208666B1 PL368059A PL36805902A PL208666B1 PL 208666 B1 PL208666 B1 PL 208666B1 PL 368059 A PL368059 A PL 368059A PL 36805902 A PL36805902 A PL 36805902A PL 208666 B1 PL208666 B1 PL 208666B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
peptide
peptides
group
purity
day
Prior art date
Application number
PL368059A
Other languages
English (en)
Other versions
PL368059A1 (pl
Inventor
Wai Ming Wong
Lam Kong
Original Assignee
Cms Peptides Patent Holding Company Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cms Peptides Patent Holding Company Ltd filed Critical Cms Peptides Patent Holding Company Ltd
Publication of PL368059A1 publication Critical patent/PL368059A1/pl
Publication of PL208666B1 publication Critical patent/PL208666B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

Ujawniono zasadniczo czyste i biologicznie czynne peptydy. Ujawniono także kwasy nukleinowe o sekwencjach kodujących biologicznie czynne peptydy oraz wytworzony z nich preparat farmaceutyczny.

Description

Przedmiotem wynalazku jest środek farmaceutyczny zawierającego peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowania peptydu.
Znane są peptydy do leczenia chorób i jako środki farmaceutyczne. Przykładowo w opisie patentowym US nr 6191113 ujawniono peptyd wykazujący aktywność hamującą wzrost komórek mięśni gładkich, a zatem użyteczny w profilaktyce i leczeniu stanów patologicznych związanych ze wzrostem komórek mięśni gładkich, takich jak stwardnienie tętnic, restenoza po plastyce naczyniowej, zwężenie światła po przeszczepie naczynia krwionośnego i mięsak mięśnia gładkiego. W opisie patentowym US nr 6184208 ujawniono inny peptyd, który, jak to stwierdzono, moduluje procesy fizjologiczne, takie jak aktywność przybierania masy nabłonkowej strefy wzrostu i wzrostu włosów.
Zatem celem wynalazku była identyfikacja biologicznie czynnych polipeptydów. Zsyntetyzowano wiele peptydów znanymi metodami chemicznych i przebadano je pod względem aktywności biologicznej. Peptydom nadano kody rozpoczynające się od liter CMS, po których następuje liczba. Łącznie zidentyfikowano 30 peptydów wykazujących aktywność biologiczną in vivo. Sekwencje i odpowiadające im numery ID tych biologicznie czynnych peptydów podano w tabeli A.
T a b e l a A
Wykaz sekwencji ID NO: Nazwa peptydu Sekwencja peptydu
1 2 3
1 CMS001 Pro Thr Thr Lys Thr Tyr Phe Pro His Phe
2 CMS002 Val Val Tyr Pro Trp Thr Gln Arg Phe
3 CMS008 Lys Ala Val Gly His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu
4 CMS010 Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn Pro Lys
5 CMS012 Leu Gly Met Glu Ala Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr
6 CMS013 Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu
7 CMS014 Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val
8 CMS015 Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gln Gly Val Met
9 CMS016 Ile Gly Met Glu Ser Ala Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr
10 CMS018 Val Gly Met Gly Glu Lys Asp Ser Tyr
11 CMS019 Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr
12 CMS020 Val Gly Met Gly Gln Lys Asp Ser Tyr Val
13 CMS021 Met Ala Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu
14 CMS022 Tyr Ser Phe
15 CMS023 Ala Ala Phe
16 CMS024 Tyr Ser Leu
17 CMS026 Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Met
18 CMS027 Phe Glu Glu Asn Met
19 CMS028 Phe Glu Pro Ser Phe
20 CMS029 Phe Asn Glu Glu
21 CMS030 Phe Glu Glu Met
22 CMS032 Phe Glu Glu Glu
PL 208 666 B1 cd. tabeli A
1 2 3
23 CMS033 Phe Glu Ser Phe
24 CMS034 Pro Glu Asn Phe
25 CMS035 Phe Val Asn Asp
26 CMS036 Phe Gln Pro Ser Phe
27 CMS003 Phe Asn Phe Val Pro Pro
28 CMS007 Ala Gly Asp Asp Ala Pro Arg Ala Val Phe
29 CMS009 Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
30 CMS011 Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu
Peptydy mogą modulować, ale nie tylko modulować, jedną lub więcej z poniższych funkcji: aktywność immunologiczną, zakaźne zapalenie wątroby, w tym, lecz nie wyłącznie, zakaźne zapalenie wątroby typu B; zapalenie nerek; wzrost nowotworów, w tym, ale nie tylko, mięsaka, nowotworu wątroby, białaczki i czerniaka; oraz masę ciała.
Wynalazek dotyczy środka farmaceutycznego zawierającego peptyd składający się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 16, przy czym czystość peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych.
Korzystny jest środek według wynalazku, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
Korzystny jest środek według wynalazku, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
Korzystny jest środek według wynalazku, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
Korzystny jest środek według wynalazku, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
Korzystny jest środek według wynalazku, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
Wynalazek dotyczy także sposobu wytwarzania środka farmaceutycznego, polegającego na tym, że dostarcza się peptyd składający się z sekwencji aminokwasów SEQ ID. NO: 16, przy czym czystość peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych; oraz miesza się ten peptyd z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
Korzystnie czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
Korzystnie czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
Korzystnie czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
Korzystnie czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
Korzystnie czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
Wynalazek dotyczy też zastosowania peptydu składającego się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 16 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, przy czym czystość peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym ten lek moduluje wzrost nowotworu.
PL 208 666 B1
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym tym nowotworem jest nowotwór wątroby lub wzrost czerniaka.
Wynalazek dotyczy również zastosowania peptydu składającego się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 16 do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń immunologicznych, przy czym czystość peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym lek moduluje aktywność immunologiczną.
Korzystne jest zastosowanie peptydu, w którym aktywność immunologiczna jest wybrana z grupy obejmującej aktywność cytotoksyczną komórek NK, tworzenie przeciwciała przeciw SRBC po prowokacji antygenem, aktywność fagocytową fagocytów jednojądrzastych, wpływ na masę grasicy i wpł yw na masę ś ledziony.
Środek farmaceutyczny może zawierać peptyd lub polipeptyd składający się zasadniczo z peptydu SEQ ID NO: 16. Stosowane tu określenie „składający się zasadniczo z” dotyczy peptydu lub polipeptydu zawierającego opisaną sekwencją aminokwasową razem z dodatkowymi aminokwasami na końcu karboksylowym i/lub aminowym, który zachowuje aktywność opisanego peptydu. Zatem przykładowo, ale nie wyłącznie, gdy aktywnością peptydu jest modulowanie aktywności immunologicznej, peptyd lub polipeptyd „składający się zasadniczo z” tego peptydu będzie wykazywać działanie modulowania aktywności immunologicznej, jak tutaj opisano w odniesieniu do tego peptydu, oraz nie będzie wykazywać jakichkolwiek cech które istotnie obniżają zdolność peptydu lub polipeptydu do modulowania aktywności immunologicznej lub które stanowią istotną zmianę podstawowych i nowych cech peptydu jako modulatora aktywności immunologicznej. Zatem w powyższym przykładzie, pełnej długości występujący naturalnie polipeptyd, który wykazuje podstawową aktywność inną niż modulowanie aktywności immunologicznej oraz który gdziekolwiek zawiera sekwencję aminokwasową opisanego peptydu, nie będzie stanowić peptydu lub polipeptydu „składającego się zasadniczo z” tego peptydu. Podobnie, w powyższym przykładzie, peptyd lub polipeptyd wytworzony metodami inżynierii genetycznej, który wykazuje podstawową aktywność inną niż modulowanie aktywności immunologicznej, ale zawiera gdziekolwiek sekwencję aminokwasową opisanego peptydu, nie będzie stanowić peptydu lub polipeptydu „składającego się zasadniczo z” tego peptydu.
Oprócz przykładu modulowania aktywności immunologicznej użytego do powyższego zilustrowania, powyższa definicja odnosi się również do wszystkich opisanych peptydów w odniesieniu do aktywności podanych dla takich peptydów. W szczególności powyższa definicja odnosi się do peptydów wykazujących aktywność modulowania stopnia zakażenia wirusowego, modulowania stopnia zakaźnego zapalenia wątroby, modulowania stopnia zapalenia nerek; modulowania wzrostu nowotworów lub modulowania masy ciała, jak to opisano w szczegółowym opisie poniżej.
Fachowcy mogą łatwo ustalić, czy peptyd lub polipeptyd składa się zasadniczo z opisanego peptydu zgodnie z powyższymi definicjami, przez zmierzenie aktywności peptydu lub polipeptydu za pomocą testów do modulacji aktywności immunologicznej, modulacji stopnia zakażenia wirusowego, modulacji stopnia zakaźnego zapalenia wątroby, modulacji stopnia zapalenia nerek; modulacji wzrostu nowotworów lub modulacji masy ciała, jak to opisano tutaj w odniesieniu do konkretnego peptydu.
W korzystniej postaci określenie „składają cy się zasadniczo z” dotyczy peptydów lub polipeptydów zawierających mniej niż 20 reszt aminokwasowych oprócz opisanego peptydu. W korzystniejszej postaci to samo określenie dotyczy peptydów zawierających mniej niż 15 reszt aminokwasowych oprócz opisanego peptydu. W jeszcze korzystniejszej postaci to samo określenie dotyczy peptydów zawierających mniej niż 10 reszt aminokwasowych oprócz opisanego peptydu. W kolejnej korzystnej postaci to samo określenie dotyczy peptydów lub polipeptydów zawierających mniej niż 6 reszt aminokwasowych oprócz opisanego peptydu. W innej korzystnej postaci to samo określenie dotyczy peptydów lub polipeptydów zawierających mniej niż 4 reszty aminokwasowe oprócz opisanego peptydu.
PL 208 666 B1
W najkorzystniejszej postaci to samo okreś lenie dotyczy peptydów lub polipeptydów zawierają cych mniej niż 2 reszty aminokwasowe oprócz opisanego peptydu.
Poniżej szczegółowo opisano peptydy i ich działanie.
Peptydy można łatwo syntetyzować znanymi metodami syntezy z L-aminokwasów, ale można je także syntetyzować metodami inżynierii genetycznej, z użyciem kwasów nukleinowych o sekwencjach kodujących poszczególne peptydy.
I. Aktywność biologiczna
Aby zbadać możliwą aktywność biologiczną peptydów, zbadano działanie immunologiczne peptydów na modelu zwierzęcym, z użyciem procedur zgodnych z „Principles of Pre-clinical Research of New Drugs”, publikacją wydaną przez Ministerstwo Zdrowia Chińskiej Republiki Ludowej[1].
Test transformacji limfocytów T, test aktywności cytotoksycznej komórek NK oraz test wydzielania IL-2 i IFN-γ przez limfocyty T zastosowano do wykrycia jakiegokolwiek możliwego działania peptydów na specyficzną komórkową funkcję immunologiczną. Test klirensu cząstek węgla zastosowano do wykrycia jakiegokolwiek możliwego działania peptydów na niespecyficzną komórkową funkcję immunologiczną. Test hemolizy owczych czerwonych ciałek krwi (SRBC) zastosowano do wykrycia jakiegokolwiek możliwego działania peptydów na humoralną funkcję immunologiczną. Test masy narządów odpornościowych zastosowano do wykrycia jakiegokolwiek możliwego działania peptydów na poziomie narządów.
W tych badaniach jako kontrolę negatywną zastosowano grupę otrzymującą roztwór soli, podczas gdy grupy, którym podawano IL-2 i IFN-γ, zastosowano jako kontrole pozytywne, gdyż IL-2 i IFN-γ są dobrze zbadanymi immunostymulantami[10]. W badaniach tych zastosowano cztery arbitralnie wybrane stężenia peptydów, pokrywające 1000-krotny zakres dawki. Ze względu na wewnętrzną złożoność odpowiedzi immunologicznej in vivo oraz brak wcześniejszej wiedzy na temat zależności pomiędzy dawką i odpowiedzią, jakąkolwiek istotną statystycznie różnicę względem kontroli negatywnej w którejkolwiek grupie dawki oceniano jako pozytywną aktywność biologiczną.
Wyniki tych badań były następujące.
1. Stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021, CMS029 i CMS034 są zdolne do zwiększania transformacji limfocytów T z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli. Stwierdzono także, że peptydy CMS014 i CMS036 są zdolne do hamowania transformacji limfocytów T z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli.
2. Stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS002, CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 są zdolne do zwiększania aktywności cytotoksycznej komórek NK z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli. Stwierdzono także, że peptydy CMS008 i CMS012, w odpowiednich stężeniach, są zdolne do obniżania aktywności cytotoksycznej komórek NK z istotną statystycznie różnicą względem normalnej kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli.
3. Stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS020, CMS022 i CMS034 są zdolne do zwiększania wydzielania interleukiny IL-2 i IFN-γ przez limfocyty T z istotną statystycznie różnicą względem normalnej kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli.
4. Stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS016, CMS021, CMS022 i CMS028 są zdolne do zwiększania wydzielania IFN przez limfocyty T z istotną statystycznie różnicą względem normalnej kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli.
5. Stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 są zdolne do zwiększania syntezy przeciwciała przeciw-SRBC po prowokacji antygenowej z istotną statystycznie różnicą względem normalnej kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli. Stwierdzono także, że peptydy CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034 i CMS036, w odpowiednim stężeniu, są zdolne do hamowania syntezy przeciwciała przeciw-SRBC po prowokacji antygenowej z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli.
PL 208 666 B1
6. Stwierdzono, że peptydy CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS024, CMS027, CMS030, CMS035, CMS036 są zdolne do zwiększania aktywności fagocytowej fagocytów jednojądrzastych z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli.
7. Stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 są zdolne do zwiększania masy grasicy z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli.
8. Stwierdzono, że peptydy CMS019, CMS020 i CMS030 są zdolne do zwiększania masy śledziony z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli. Stwierdzono także, że peptydy CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, CMS029 i CMS036, w odpowiednich stężeniach, są zdolne do zmniejszania masy śledziony z istotną statystycznie różnicą względem normalnej grupy kontrolnej otrzymującej roztwór soli.
Materiały i metody zastosowane do analizy działania peptydów na myszach opisano poniżej.
Materiały
1. Zwierzęta doświadczalne
Myszy BALB/c, masa 18-22 g, 50% samic i 50% samców, dostarczone przez Experimental Animal Center, National Institute of Medical Science, ChRL.
2. Podawanie grupa otrzymująca zrekombinowany mysi IFN-γ (rmIFN-γ): 3 x 105 lU/kg/dzień grupa otrzymująca zrekombinowaną ludzką IL(rhIL)-2: 3 x 105 IU/kg/dzień grupa otrzymująca roztwór soli: 0,5 ml/osobnik/dzień grupa otrzymująca dawkę peptydu I: 500 μg/kg/dzień grupa otrzymująca dawkę peptydu II: 50 μg/kg/dzień grupa otrzymująca dawkę peptydu III: 5 μg/kg/dzień grupa otrzymująca dawkę peptydu IV: 0,5 μg/kg/dzień
Wszystkie powyższe substancje rozpuszczono w 0,5 ml roztworu soli i wstrzykiwano śródotrzewnowo (i.p.) przez 15 kolejnych dni, raz dziennie.
3. Główne odczynniki
Peptydy zostały wytworzone na zamówienie w American Peptide Company, Inc., USA
Płodowa surowica bydlęca i pożywka do hodowli komórkowych RPMI-1640, Gibco, USA
MTT i ConA, Sigma, USA rmIFN-γ Beijing Biotech Inc., Chiny rhIL-2, Shanghai Huaxin Biotech Inc., Chiny
Roztwór do rozdzielania limfocytów, Research Institute of Hematologie Disease, National Institute of Medical Science, ChRL
Wirus pęcherzykowego zapalenia jamy ustnej (VSV), znormalizowana próbka IFN-γ i IL-2, National Institute For The Control Of Pharmaceutical And Biological Products, ChRL
Komórki HT-2 i komórki L929, otrzymano od prof. WF Chen z Beijing University Department of Immunology, ChRL
Metody
1. Wpływ peptydów na odporność komórkową
1.1. Przygotowanie zawiesiny komórek śledziony[1,2]
Myszy BALB/c losowo podzielono na grupy otrzymujące peptyd, IFN, IL-2 i roztwór soli, po 10 myszy na grupę. Dzień po ostatnim podaniu badanej substancji myszy uśmiercono przez zwichnięcie szyi. Śledzionę wyizolowano aseptycznie i ręcznie zdyspergowano w zimnym roztworze D-Hanka za pomocą igły do zastrzyków. Rozproszoną zawiesinę komórek dalej przesiano przez sito nr 100 o średnicy oczek 150 μm z nierdzewnej stali. Po odwirowaniu przy 200 g przez 10 minut odrzucono supernatant. Osad komórek ponownie przeprowadzano w zawiesinę w 10 objętościach buforu TrisNH4Cl, a następnie odstawiano na 10 minut w temperaturze pokojowej. Komórki z zawiesiny zebrano przez odwirowanie przy 150 g przez 10 minut. Komórki przemyto 2-4-krotnie zimnym roztworem D-Hanka przez ponowne przeprowadzenie w zawiesinę i zebranie przez odwirowanie w warunkach powyżej opisanych. Następnie przemyte komórki rozcieńczono do wymaganych gęstości komórek pożywką hodowlaną RPMI-1640, zawierającą 10% płodowej surowicy bydlęcej.
PL 208 666 B1
1.2. Wpływ peptydów na transformację limfocytów T[1,2]
Komórki śledziony o gęstości 1 x 106/ml umieszczono w 96-studzienkowej płytce do hodowli komórkowych, 100 μΐ/studzienkę, po trzy równoległe studzienki dla każdej badanej próbki i próbki kontrolnej, dla każdej myszy. Do studzienek testowych dodano 100 μl/studzienkę ConA o 100 μg/ml w RPMI-1640 i 100 μl/studzienkę czystego RPMI-1640 jako kontroli. Komórki inkubowano przez 66 godzin w 37°C, 5% CO2. Następnie komórki sprowadzono do osadu przez wirowanie przy 150 g przez 10 minut. Supernatant zebrano i przechowywano w - 20°C do oznaczania cytokin IL-2 i IFN.
Do osadu komórek dodano 50 μl MTT/studzienkę o stężeniu 1 mg/ml w RPMI-1640 i komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny przez wytrząsanie przez 2 minuty. Inkubację kontynuowano przez 4 godziny. Supernatant odrzucono po odwirowaniu przy 150 g przez 10 minut. Do osadu komórek dodano 120 μl 40 mM HCl w 2-propanolu i wytrząsano przez 3 minuty aby uzyskać OD570 nm dla każdej studzienki przy referencyjnej długości fali 630 nm. Zastosowano czytnik ELISA.
Obliczenia
Dla każdej myszy przygotowano trzy studzienki testowe i trzy studzienki kontrolne. Wskaźnik stymulacji (SI) dla każdej myszy otrzymano wyprowadzając najpierw średnią OD dla trzech równoległych studzienek, a następnie dzieląc wartość dla studzienek testowych przez wartość dla studzienek kontrolnych.
1.3. Wpływ peptydów na aktywność komórek NK[3,4]
Komórki śledziony myszy o gęstości 4 x 106/ml przygotowano jak opisano powyżej w części 1.1. Docelowe komórki YAC-1 doprowadzono do fazy logarytmicznej i doprowadzono do 1 x 105/ml. Stosując 96-studzienkowe płytki do hodowli komórkowych, dodano 100 μl komórek śledziony myszy i 100 μl pożywki hodowlanej do studzienki kontrolnej zawierającej tylko komórki śledziony; 100 μl komórek docelowych i 100 μl pożywki hodowlanej do studzienki kontrolnej zawierającej tylko komórki docelowe; 100 μl komórek śledziony myszy i 100 μl komórek docelowych do studzienki testu dla aktywności NK. Dla każdej myszy przygotowano trzy równoległe zestawy powyższych studzienek.
Próbki odwirowano przy 150 g przez 10 minut aby zebrać komórki. Supernatant odrzucono i dodano 50 μl MTT/studzienkę o stężeniu 1 mg/ml. Następnie mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 2 minuty, a potem inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 4 godziny. Supernatant odrzucono po odwirowaniu przy 150 g przez 10 minut. Do osadu komórek dodano 120 μl 40 mM HCl w 2-propanolu i wytrząsano przez 3 minuty. Czytnik ELISA zastosowano do wyznaczania OD570 nm dla każdej studzienki przy referencyjnej długości fali 630 nm.
Obliczenia
Dla każdej myszy przygotowano 9 studzienek: trzy studzienki kontrolne tylko z komórkami śledziony, trzy studzienki kontrolne tylko z komórkami docelowymi oraz trzy studzienki testowe zarówno z komórkami śledziony, jak i docelowymi. Wskaźnik aktywności NK komórek dla każdej myszy wyznaczono wyprowadzając najpierw średnią OD z trzech równoległych studzienek z każdej kombinacji, a następnie stosując tę średnią wartość OD w następującym wzorze:
Wskaźnik aktywności komórek NK = [1-(średnia OD dla studzienek z komórkami śledziony i docelowymi - średnia OD dla studzienek tylko z komórkami śledziony) (średnia OD dla studzienek tylko z komórkami docelowymi)] x 100%
1.4. Wpływ peptydów na aktywność limfocytów T w wydzielaniu IL-2[5]
Komórki HT-2 w fazie logarytmicznej zebrano przez odwirowanie przy 150 g przez 10 minut, a następnie trzykrotnie przemyto zimnym roztworem Hanka przez przeprowadzanie w stan zawiesiny i odwirowywanie. Zebrane komórki HT-2 ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w RPMI-1640 i inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 30 minut. Komórki następnie dwukrotnie przemyto RPMI-1640 przez ponowne przeprowadzanie w stan zawiesiny i odwirowywanie i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w końcowym stężeniu 2 x 105/ml w RPMI-1640.
Supernatant otrzymany w części 1.2 rozcieńczono do następujących stężeń procentowych w RPMI-1640: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% i 3,125%.
rIL-2 rozcieńczono do następującego stężenia w RPMI-1640: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 31,25 IU/ml i 15,5 IU/ml.
Przygotowano 96-studzienkową płytkę do hodowli komórkowych z trzema równoległymi studzienkami dla kombinacji:
Kontrola negatywna: 100 μl RPMI-1640 + 100 μl zawiesiny komórek HT-2
Wzorcowa rIL-2: 100 μl roztworu rIL-2 + 100 μl zawiesiny komórek HT-2
Studzienka testowa: 100 μl rozcieńczonego supernatantu + 100 μl zawiesiny komórek HT-2
PL 208 666 B1
Płytkę inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 68 godzin, następnie odwirowano przy 150 g przez 15 minut, a potem supernatant usunięto. Do każdej studzienki dodano 100 μl 0,5 mg/ml MTT w RPMI1640 bez fenolosulfonoftaleiny. Po wytrząsaniu przez 3-4 minuty w celu ponownego przeprowadzenia w stan zawiesiny komórek kontynuowano inkubację przez kolejne 4 godziny. Następnie próbki odwirowano przy 150 g przez 15 minut i supernatant usunięto. Do każdej studzienki dodano 40 mM HCl w 2-propanolu, mieszano przez 3-4 minuty i analizowano OD przy 570 nm, przy referencyjnej długości fali 630 mn za pomocą czytnika do płytek ELISA.
Obliczenia
Średnie wartości OD z trzech równoległych studzienek dla każdego stężenia wykreślono względem stężenia na papierze półlogarytmicznym, stężenia na osi X. Stężenie przy 50% wysycenia OD uzyskano zarówno dla badanego supernatantu, jak i rIL-2.
Aktywność IL-2 w próbce = (rozcieńczenie próbki przy 50% maksymalnego działania * rozcieńczenie wzorca rIL-2 przy 50% maksymalnego działania) x aktywność wzorca rIL-2 przy 50% maksymalnego działania (IU/ml)
1.5. Wpływ peptydów na aktywność limfocytów T w wydzielaniu interferonu (IFN)[6]
Supernatant z części 1.2 rozcieńczono pożywką hodowlaną RPMI-1640 do następujących stężeń procentowych: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25% i 3,125%.
Wzorzec zrekombinowanego interferonu (rlFN) rozcieńczono RPMI-1640 do poniższych stężeń: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 31,25 IU/ml i 15,5 IU/ml.
Docelowe komórki L929 w fazie logarytmicznej doprowadzono do 2 x 105/ml w RPMI-1640, w sposób opisany dla komórek HT-2 w części 1.4. Preparat podstawowy VSV także doprowadzono do 100 TCID50 w RPMI-1640.
Następnie nastawiono 96-studzienkową płytkę do hodowli komórkowych z trzema równoległymi studzienkami dla kombinacji:
Kontrola negatywna: 150 μl RPMI-1640 + 100 μl L929
Kontrola pozytywna: 100 μl RPMI-1640 + 100 μl L929 + 50 μl VSV
Studzienka aktywności rlFN: 100 μl wzorca rlFN + 100 μl L929 + 50 μl VSV
Studzienka testowa: 100 μl rozcieńczonego supernatantu + 100 μl + L929 + 50 μl VSV
Próbki inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 24 godziny. Studzienki kontroli pozytywnych obserwowano okresowo pod odwróconym mikroskopem aby potwierdzić lizę komórek, a następnie zebrano, przemyto i zmierzono OD studzienek tak samo jak opisano w części 1.4.
Obliczenia
Stężenia 50% maksymalnego działania uzyskano w ten sam sposób jak w części 1.4. Aktywność IFN próbki obliczono w następujący sposób:
Aktywność IFN próbki = (rozcieńczenie próbki przy 50% maksymalnego działania * rozcieńczenie wzorca rlFN przy 50% maksymalnego działania) x aktywność wzorca rlFN przy 50% maksymalnego działania (IU/ml)
2. Wpływ peptydów na tworzenie przeciwciał[7]
Owcze czerwone ciałka krwi (SRBC) przygotowano przez zebranie krwi z żyły szyjnej i umieszczenie jej w jałowej kolbie ze szklanymi kulkami. Następnie kolbę wytrząsano przez 3 minuty i krew zmieszano z roztworem Alsever (glukoza 2,05 g, NaCl 0,4 g, cytrynian sodu 0,8 g, doprowadzone do 100 ml destylowaną wodą) i przechowywano w 4°C. Bezpośrednio przed użyciem próbki odwirowano przy 130 g, 5 minut, w celu zebrania SRBC. Komórki przemyto dwukrotnie przez przeprowadzanie w stan zawiesiny i odwirowywanie w izotonicznym roztworze soli. Następnie osad komórek zebrano przez odwirowanie przy 180 g przez 10 minut i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze soli, aby uzyskać końcową zawiesinę roboczą SRBC 2% (obj.).
Dopełniacz przygotowano przez dodanie 10 objętości świeżej surowicy świnki morskiej do jednej objętości osadzonych przez wirowanie SRBC, a następnie łagodne wytrząsanie przez 30 minut w 4°C. SRBC usunięto przez wirowanie przy 200 g przez 10 minut. Dodano 10 objętości izotonicznego roztworu soli aby uzyskać roboczy roztwór dopełniacza.
Myszy BALB/c losowo podzielono na grupy otrzymujące peptyd, IFN, IL-2 i roztwór soli, po 10 myszy na grupę. Badane substancje podawano jak opisano w części 1.1, plus śródotrzewnowe zastrzyki 0,2 ml SRBC na mysz dnia 12. Dzień po ostatnim podaniu badanej substancji (dzień 16), krew zebrano z kąta oka i zostawiono w temperaturze pokojowej na 1 godzinę w celu wydzielenia się surowicy. Po odwirowaniu przy 200 g przez 10 minut, surowicę rozcieńczono 500 razy izotonicznym roztworem soli.
PL 208 666 B1
Do 1 ml rozcieńczonej surowicy mysiej dodano 0,5 ml zawiesiny SRBC. Mieszaninę umieszczono w lodzie. Następnie dodano 1 ml roboczego roztworu dopełniacza i inkubowano w 37°C w łaźni wodnej przez 10 minut. Reakcje przerwano przez umieszczenie w lodzie. Następnie próbki odwirowano przy 200 g przez 10 minut aby uzyskać supernatant.
Do 1 ml tego supernatantu dodano 3 ml roztworu Drabkina i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 10 minut. Zmierzono OD540 nm.
Obliczenia
OD540 nm odniesienia uzyskano przez zmieszanie 0,25 ml zawiesiny SRBC z roztworem Drabkina do 4 ml i umieszczenie na 10 minut w temperaturze pokojowej przed pomiarem OD540 nm.
Wskaźnik surowiczy próbki = (OD540 nm badanej próbki - OD540 nm próbki odniesienia) x 500
3. Wpływ peptydów na funkcje fagocytarne jednojądrzastych fagocytów i masę narządów immunologicznych[8,9]
Następnego dnia po ostatnim podaniu badanej substancji (dzień 16) myszom wstrzyknięto 0,1 ml/kg masy ciała tuszu (5 razy rozcieńczonego w izotonicznym roztworze soli) do żyły ogonowej.
W minutę i pięć minut po wstrzyknięciu tuszu pobrano 20 μl krwi z kąta oka za pomocą heparynizowanej rurki. Krew zmieszano z 2 ml 0,1% (wag./obj.) Na2CO3, a następnie zmierzono OD680. Wstępny wskaźnik przezroczystości K obliczono z następującego wzoru:
K = (lgA1-lgA2) - (t2-t1)
Klucz
A1: OD680 nm w pierwszej minucie
A2: OD680 nm w piątej minucie t2: 5 minut t1: 1 minuta
Następnego dnia po ostatnim podaniu badanej substancji (dzień 16) usunięto wątrobę, śledzionę i grasicę, po czym wysuszono przy użyciu bibuły filtracyjnej i zważono. Wskaźnik fagocytozy α obliczono jak poniżej:
α = (VK)(( : WLS)
Klucz
W: masa ciała
WLS: masa wątroby plus śledziony
Wskaźnik grasicy (%) = (masa grasicy/masa ciała) x 100%
Wskaźnik śledziony (%) = (masa śledziony/masa ciała) x 100%
Wyniki
Ze względu na dużą ilość surowych danych przedstawiono tylko zebrane wyniki końcowe. Grupy bez istotnych statystycznie różnic względem grupy kontroli negatywnej otrzymującej roztwór soli pominięto.
1. Wpływ peptydów na transformację limfocytów T
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS002, CMS007, CMS008, CMS010, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021 i CMS029 były zdolne do zwiększania transformacji limfocytów T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS010 i CMS015 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 1 poniżej.
T a b e l a 1
Grupa N X ± SD (wskaźnik stymulacji)
1 2 3
CMS002 8 1,8 ± 0,3*
CMS007 9 1,6 ± 0,1*
CMS008 9 1,7 ± 0,1*
CMS009 10 1,7 ± 0,2*
CMS010 9 2,0 ± 0,3*@λ
CMS012 9 1,6 ± 0,2*
PL 208 666 B1 cd. tabeli 1
1 2 3
CMS015 9 1,9 ± 0,3*@Λ
CMS019 9 1,8 ± 0,3*
CMS021 10 1,6 ± 0,1*
CMS029 9 1,7 ± 0,3*
IFN-γ 10 1,6 ± 0,2*
IL-2 10 1,7 ± 0,2*
Roztwór soli 10 1,3 ± 0,1
* w porównaniu do grupy otrzymują cej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS001, CMS002 i CMS003 były zdolne do zwiększania transformacji limfocytów T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli, grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono, że peptydy CMS014 i CMS036 były zdolne do hamowania transformacji limfocytów T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane szczegółowe przedstawiono w tabeli 2.
T a b e l a 2
Grupa N X ± SD (wskaźnik stymulacji)
CMS001 10 2,2 ± 0,5*@Λ
CMS002 10 2,6 ± 0,3*@Λ
CMS003 8 2,2 ± 0,5*@Λ
CMS014 9 1,0 ± 0,1*
CMS036 9 1,0 ± 0,1*
IFN-γ 9 1,7 ± 0,2*
IL-2 10 1,8 ± 0,2*
Roztwór soli 10 1,3 ± 0,1
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS001, CMS003, CMS007 i CMS034 były zdolne do zwiększania transformacji limfocytów T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05), jak podano w tabeli 3.
T a b e l a 3
Grupa N X ± SD (wskaźnik stymulacji)
CMS001 10 1,7 ± 0,2*
CMS003 10 1,6 ± 0,2*
CMS007 8 1,7 ± 0,1*
CMS034 9 1,5 ± 0,2*
IFN-γ 10 1,6 ± 0,2*
IL-2 9 1,6 ± 0,1*
Roztwór soli 10 1,3 ± 0,1
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
PL 208 666 B1
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS008, CMS010 i CMS011 były zdolne do zwiększania transformacji limfocytów T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05), jak podano w tabeli 4.
T a b e l a 4
Grupa N X ± SD (wskaźnik stymulacji)
CMS008 10 1,7 ± 0,3*
CMS010 9 1,7 ± 0,3*
CMS011 10 1,6 ± 0,4*
IFN-γ 10 1,6 ± 0,2*
IL-2 10 1,6 ± 0,1*
Roztwór soli 10 1,3 ± 0,1
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
2. Wpływ peptydów na aktywność cytotoksyczną komórek NK
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS010, CMS013, CMS016, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 były zdolne do zwiększania aktywności cytotoksycznej komórek NK, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS010, CMS016 i CMS030 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 5 poniżej.
T a b e l a 5
Grupa N X ± SD (%)
CMS010 9 91 ± 4*Λ
CMS013 8 84 ± 9*
CMS016 9 91 ± 7*@Λ
CMS023 10 79 ± 12*
CMS024 10 89 ± 8*
CMS026 10 89 ± 7*
CMS027 10 88 ± 8*
CMS028 10 90 ± 5*
CMS029 10 87 ± 4*
CMS030 10 91 ± 5*@Λ
CMS032 10 87 ± 5*
CMS033 9 89 ± 8*
CMS034 11 85 ± 9*
CMS035 8 90 ± 10*
CMS036 10 88 ± 7*
IFN-γ 10 77 ± 8*
IL-2 10 77 ± 8*
Roztwór soli 8 63 ± 9
w porównaniu do grupy otrzymują cej roztwór soli P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 A w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
PL 208 666 B1
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS001, CMS003, CMS015, CMS021, CMS026 i CMS035 były zdolne do zwiększania aktywności cytotoksycznej komórek NK, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS021 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono, że CMS012 był zdolny do hamowania aktywności cytotoksycznej komórek NK, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono w tabeli 6 poniżej.
T a b e l a 6
Grupa N X ± SD (%)
CMS001 10 85 ± 10*
CMS003 10 85 ± 6*
CMS012 9 40 ± 9*
CMS015 8 78 ± 8*
CMS021 8 88 ± 12*@Λ
CMS026 10 76 ± 9*
CMS035 10 72 ± 9*
IFN-γ 10 73 ± 10*
IL-2 10 74 ± 8*
Roztwór soli 10 56 ± 8
* w porównaniu do grupy otrzymują cej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS020, CMS024, CMS034 i CMS036 były zdolne do zwiększania aktywności cytotoksycznej komórek NK, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS008 i CMS009 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 7.
T a b e l a 7
Grupa N X ± SD (%)
CMS008 10 92 ± 4*@λ
CMS009 8 92 ± 6*@λ
CMS010 10 82 ± 9*
CMS011 10 76 ± 10*
CMS012 10 85 ± 7*
CMS020 9 91 ± 6*
CMS024 9 78 ± 3*
CMS034 8 90 ± 5*
CMS036 10 75 ± 9*
IFN-γ 10 80 ± 8*
IL-2 10 80 ± 8*
Roztwór soli 10 60 ± 9
w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
PL 208 666 B1
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS002, CMS011, CMS012, CMS022, CMS028 i CMS035 były zdolne do zwiększania aktywności cytotoksycznej komórek NK, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS008 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 8.
T a b e l a 8
Grupa N X ± SD (%)
CMS002 8 76 ± 9*
CMS008 10 46 ± 12*
CMS011 9 79 ± 3*
CMS012 9 77 ± 6*
CMS022 10 73 ± 11*
CMS028 8 79 ± 3*
CMS035 10 76 ± 10*
IFN-γ 10 72 ± 9*
IL-2 10 74 ± 10*
Roztwór soli 11 58 ± 7
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
3. Wpływ peptydów na aktywność limfocytów T w wydzielaniu IL-2
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS007, CMS009, CMS010 i CMS015 były zdolne do wywoływania wydzielania IL-2 przez limfocyty T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS007 i CMS015 wykazywały istotną statystycznie różnicę w stosunku do grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS009 i CMS010 wykazywały istotną statystycznie różnicę zarówno względem grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 9.
T a b e l a 9
Grupa N X ± SD (IU)
CMS007 9 86 ± 15*Λ
CMS009 10 114 ± 13*@Λ
CMS010 9 125 ± 17*@Λ
CMS015 9 85 ± 17*Λ
IFN-γ 10 100 ±18*
IL-2 10 70 ± 13*
Roztwór soli 10 39 ± 10
* w porównaniu do grupy otrzymują cej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS001 i CMS003 były zdolne do wywoływania wydzielania IL-2 przez limfocyty T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS003 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 10.
PL 208 666 B1
T a b e l a 10
Grupa N X ± SD (IU)
CMS001 10 60 ± 10*
CMS003 8 86 ± 9*Λ
IFN-γ 9 99 ± 16*
IL-2 10 72 ± 12*
Roztwór soli 10 39 ± 10
* w porównaniu do grupy otrzymują cej roztwór soli P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS007, CMS012 i CMS020 były zdolne do wywoływania wydzielania IL-2 przez limfocyty T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05), jak w tabeli 11.
T a b e l a 11
Grupa N X ± SD (IU)
CMS007 8 64 ± 12*
CMS012 9 65 ± 16*
CMS020 8 63 ± 11*
IFN-γ 10 96 ± 14*
IL-2 10 77 ± 13*
Roztwór soli 10 37 ± 9
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS010, CMS011, CMS012, CMS022 i CMS034 były zdolne do wywoływania wydzielania IL-2 przez limfocyty T, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS034 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS011 i CMS022 wykazywały istotną statystycznie różnicę zarówno względem grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 12.
T a b e l a 12
Grupa N X ± SD (IU)
CMS010 9 66 ± 11*
CMS011 10 101 ± 19*@Λ
CMS012 8 59 ± 13*
CMS022 9 109 ± 14*@Λ
CMS034 10 85 ± 10*Λ
IFN-γ 10 87 ± 15*
IL-2 10 73 ± 13*
Roztwór soli 10 38 ± 13
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
4. Wpływ peptydów na aktywność limfocytów T w wydzielaniu IFN
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS010, CMS013 i CMS016 były zdolne do wywoływania wydzielania przez limfocyty T interferonu (IFN), przy istotnej statystycznie różnicy wzglęPL 208 666 B1 dem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05), grupy otrzymującej IFN-γ grupy i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 13.
T a b e l a 13
Grupa N X ± SD (IU)
CMS010 9 167 ± 13*@Λ
CMS013 9 154 ± 15*@Λ
CMS016 6 162 ± 19*@Λ
IFN-γ 10 139 ±16*
IL-2 10 120±13*
Roztwór soli 10 65 ± 11
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS001, CMS003 i CMS021 były zdolne do wywoływania wydzielania przez limfocyty T interferonu (IFN), przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS021 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 i grupy otrzymującej IFN-γ (P < 0,05), jak podano w tabeli 14.
T a b e l a 14
Grupa N X ± SD (IU)
CMS001 10 110±15*
CMS003 8 106 ± 16*
CMS021 8 143 ± 17*@Λ
IFN-γ 9 125 ±18*
IL-2 10 113±17*
Roztwór soli 10 61 ± 11
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 A Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS009 i CMS012 były zdolne do wywoływania wydzielania przez limfocyty T interferonu (IFN), przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS009 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 15.
T a b e l a 15
Grupa N X ± SD (IU)
CMS009 10 121 ± 15*Λ
CMS012 9 86 ± 9*
IL-2 9 105 ±14*
Roztwór soli 10 66 ± 10
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS010, CMS011, CMS022 i CMS028 były zdolne do wywoływania wydzielania przez limfocyty T interferonu (IFN), przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS010
PL 208 666 B1 i CMS022 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 16.
T a b e l a 16
Grupa N X ± SD (IU)
CMS010 9 142 ± 18*@Λ
CMS011 10 89 ± 18*
CMS022 9 145 ± 13*@Λ
CMS028 10 96 ± 13*
IFN-γ 10 124 ±16*
IL-2 10 107±13*
Roztwór soli 10 64 ± 13
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
5. Wpływ peptydów na tworzenie przeciwciał
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS029, CMS033 i CMS035 były zdolne do wywoływania tworzenia przeciwciał przeciw-SRBC, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS013, CMS019, CMS024 i CMS035 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS014, CMS015, CMS016, CMS020, CMS023, CMS029 i CMS033 wykazywały istotną statystycznie różnicę zarówno względem grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 17.
T a b e l a 17
Grupa N X ± SD (IU)
1 2 3
CMS002 10 87 ± 18*@
CMS003 10 96 ±18*@
CMS007 10 69 ± 17*@
CMS008 10 82 ±15*@
CMS009 10 113 ± 22*@Λ
CMS010 10 112 ± 30*@Λ
CMS011 8 188 ± 16*@Λ
CMS012 8 141 ± 21*@λ
CMS013 10 80 ± 16*@
CMS014 10 130 ± 24*@Λ
CMS015 10 136 ± 22*@Λ
CMS016 8 143 ± 38*@Λ
CMS018 10 66 ± 16*
CMS019 10 91 ± 26*@
CMS020 6 155 ± 35*@Λ
CMS022 8 68 ± 31*
PL 208 666 B1 cd. tabeli 17
1 2 3
CMS023 9 110 ± 45*@λ
CMS024 8 75 ± 29*@
CMS029 8 115 ± 22*@λ
CMS033 10 143 ± 27*@λ
CMS035 10 88 ± 16*@
IFN-γ 9 37 ± 10
IL-2 10 71 ± 11*
Roztwór soli 10 32 ± 7
* w porównaniu do grupy otrzymują cej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS003, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 były zdolne do wywoływania tworzenia przeciwciał przeciw-SRBC, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS011, CMS013 i CMS015 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 wykazywały istotną statystycznie różnicę zarówno względem grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono, że CMS009 hamował tworzenie przeciwciał przeciw-SRBC przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono w tabeli 18.
T a b e l a 18
Grupa N X ± SD (IU)
1 2 3
CMS003 10 52 ± 11*
CMS009 8 13 ± 5*
CMS011 9 67 ± 9*@
CMS012 8 50 ± 14*
CMS013 8 70 ± 9*@
CMS015 10 54 ± 9*@
CMS021 9 94 ± 20*@λ
CMS022 9 110 ± 16*@λ
CMS023 8 84 ± 11 *@λ
CMS026 9 98 ± 9*@λ
CMS027 9 93 ± 11*@λ
CMS029 10 143 ± 13*@λ
CMS030 10 141 ± 33*@λ
CMS032 9 131 ± 24*@λ
CMS033 8 112 ± 15*@λ
PL 208 666 B1 cd. tabeli 18
1 2 3
CMS034 10 136 ± 11*@Λ
CMS035 8 97 ± 10*@Λ
CMS036 10 118 ± 11*@Λ
IFN-γ 9 37 ± 10
IL-2 10 71 ± 11*
Roztwór soli 10 32 ± 7
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS019, CMS020, CMS021, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 były zdolne do wywoływania tworzenia przeciwciał przeciw-SRBC, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS003, CMS008, CMS009, CMS012, CMS015, CMS016, CMS020 i CMS021 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS001, CMS007, CMS011, CMS019, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 wykazywały istotną statystycznie różnicę zarówno względem grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 19.
T a b e l a 19
Grupa N X ± SD (IU)
1 2 3
CMS001 9 110 ± 24*@
CMS003 9 91 ± 24*@
CMS007 9 122 ± 12*@Λ
CMS008 9 97 ± 26*@
CMS009 8 79 ± 18*@
CMS011 10 115 ± 27*@Λ
CMS012 10 81 ± 22*@
CMS013 10 93 ± 28*@
CMS015 8 94 ± 37*@
CMS016 9 93 ± 32*@
CMS019 10 118 ± 20*@Λ
CMS020 10 89 ± 24*@
CMS021 9 82 ± 30*@
CMS023 10 166 ± 27*@Λ
CMS024 7 171 ± 39*@Λ
CMS026 9 191 ± 17*@Λ
CMS027 9 117 ± 45*@Λ
CMS028 10 121 ± 48*@Λ
CMS029 9 147 ± 23*@Λ
CMS030 9 158 ± 37*@Λ
PL 208 666 B1 cd. tabeli 19
1 2 3
CMS032 9 157 ± 37*@Λ
CMS033 7 128 ± 39*@Λ
CMS034 8 172 ± 37*@Λ
CMS035 9 176 ± 39*@Λ
CMS036 8 179 ± 34*@Λ
IFN-γ 9 37 ± 10
IL-2 10 71 ± 11*
Roztwór soli 10 32 ± 7
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS021, CMS023, CMS024, CMS027 i CMS033 były zdolne do wywoływania tworzenia przeciwciał przeciw-SRBC, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS021 i CMS033 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS023, CMS024 i CMS027 wykazywały istotną statystycznie różnicę zarówno względem grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034 i CMS036 były zdolne do hamowania tworzenia przeciwciał przeciw-SRBC przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono w tabeli 20 poniżej.
T a b e l a 20
Grupa N X ± SD (IU)
1 2 3
CMS002 9 4 ± 1*
CMS003 9 2 ± 1*
CMS009 9 2 ± 1*
CMS010 10 10 ± 3*
CMS011 10 5 ± 3*
CMS013 10 7 ± 1*
CMS014 10 15 ± 6*
CMS015 9 13 ± 4*
CMS018 9 3 ± 1*
CMS019 9 12 ± 3*
CMS020 9 10 ± 3*
CMS021 9 57 ± 9*@
CMS023 10 108 ± 21*@Λ
CMS024 10 98 ± 6*@λ
CMS026 10 19 ± 6*
CMS027 10 99 ± 14*@Λ
CMS028 10 18 ± 5*
CMS029 9 18 ± 7*
CMS030 9 19 ± 7*
PL 208 666 B1 cd. tabeli 20
1 2 3
CMS033 9 78 ± 12*@
CMS034 10 20 ± 2*
CMS036 9 20 ± 6*
IFN-γ 9 37 ± 10
IL-2 10 71 ± 11*
Roztwór soli 10 32 ± 7
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
6. Wpływ peptydów na aktywność fagocytową fagocytów jednojądrzastych
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS003, CMS008, CMS020, CMS022 i CMS024 były zdolne do zwiększania aktywności fagocytowej fagocytów jednojądrzastych, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS022 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05) jak podano w tabeli 21.
T a b e l a 21
Grupa N X ± SD (wskaźnik fagocytozy)
CMS003 10 6,6 ± 0,7*
CMS008 10 6,5 ± 1,2*
CMS020 10 6,4 ± 0,6*
CMS022 10 7,4 ± 0,6*@Λ
CMS024 10 6,4 ± 1,0*
IFN-γ 10 6,4 ± 0,9*
IL-2 9 5,7 ± 0,8
Roztwór soli 10 5,1 ± 0,6
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS019, CMS024 i CMS030 były zdolne do zwiększania aktywności fagocytowej fagocytów jednojądrzastych, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS019 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 22.
T a b e l a 22
Grupa N X ± SD (wskaźnik fagocytozy)
CMS019 9 6,7 ± 0,9*Λ
CMS024 8 6,6 ± 0,7*
CMS030 10 6,3 ± 0,5*
IFN-γ 10 6,4 ± 0,9*
IL-2 9 5,7 ± 0,8
Roztwór soli 10 5,1 ± 0,6
*Λ w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
PL 208 666 B1
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS003*, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019 i CMS035 były zdolne do zwiększania aktywności fagocytowej fagocytów jednojądrzastych, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS003, CMS009, CMS010, CMS016, CMS019 i CMS035 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 23.
T a b e l a 23
Grupa N X ± SD (wskaźnik fagocytozy)
CMS003 9 6,9 ± 0,9*Λ
CMS008 9 6,4 ± 0,5*
CMS009 9 6,9 ± 0,9*Λ
CMS010 10 7,1 ± 0,7*Λ
CMS011 10 6,4 ± 1,1*
CMS013 10 6,7 ± 0,2*
CMS016 9 6,9 ± 0,8*Λ
CMS018 8 6,7 ± 1,2*
CMS019 8 6,8 ± 0,6*Λ
CMS035 9 6,9 ± 0,9*Λ
IFN-γ 10 6,4 ± 0,9*
IL-2 9 5,7 ± 0,8
Roztwór soli 10 5,1 ± 0,6
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS024, CMS027 i CMS036 były zdolne do zwiększania aktywności fagocytowej fagocytów jednojądrzastych, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS024 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 24.
T a b e l a 24
Grupa N X ± SD (wskaźnik fagocytozy)
CMS024 10 6,7 ± 0,5*Λ
CMS027 10 6,4 ± 0,6*
CMS036 9 6,2 ± 0,3*
IFN-γ 10 6,4 ± 0,9*
IL-2 9 5,7 ± 0,8
Roztwór soli 10 5,1 ± 0,6
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 A Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
7. Wpływ peptydów na masę narządu immunologicznego
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS008, CMS010, CMS016, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 były zdolne do zwiększania masy grasicy, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS027 i CMS034 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS008, CMS022, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033 i CMS035 wykazywały także
PL 208 666 B1 istotną statystycznie różnicę względem zarówno grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 25.
T a b e l a 25
Grupa N X ± SD (%)
CMS008 8 0,21 ± 0,03*@Λ
CMS010 10 0,19 ± 0,04*
CMS016 9 0,18 ± 0,05*
CMS019 10 0,19 ± 0,02*
CMS020 10 0,19 ± 0,04*
CMS022 9 0,26 ± 0,05*
CMS026 10 0,20 ± 0,03*
CMS027 8 0,20 ± 0,03*Λ
CMS028 10 0,19 ± 0,02*
CMS029 10 0,22 ± 0,04*@Λ
CMS030 8 0,30± 0,03*@Λ
CMS032 8 0,25 ± 0,03*@Λ
CMS033 9 0,25 ± 0,04*@Λ
CMS034 9 0,20 ± 0,05*Λ
CMS035 10 0,21 ± 0,03*@Λ
CMS036 9 0,18 ± 0,02*
IFN-γ 10 0,15 ± 0,04
IL-2 9 0,14 ± 0,03
Roztwór soli 9 0,12 ± 0,02
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 500 μg/kg/dzień CMS019 był zdolny do zwiększania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05), jak podano w tabeli 26. Stwierdzono, że CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027 i CMS036 były zdolne do obniżania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono szczegółowo w tabeli 26 poniżej.
T a b e l a 26
Grupa N X ± SD (%)
1 2 3
CMS001 10 0,43 ± 0,07*
CMS003 8 0,40 ± 0,04*
CMS007 9 0,32 ± 0,05*
CMS009 9 0,41 ± 0,03*
CMS011 9 0,41 ± 0,04*
CMS013 10 0,44 ± 0,07*
PL 208 666 B1 cd. tabeli 26
1 2 3
CMS014 10 0,40 ± 0,03*
CMS015 9 0,36 ± 0,07*
CMS019 9 0,63 ± 0,08*
CMS021 9 0,36 ± 0,04*
CMS023 9 0,36 ± 0,06*
CMS024 9 0,34 ± 0,05*
CMS027 10 0,37 ± 0,03*
CMS036 10 0,40 ± 0,03*
Roztwór soli 10 0,53 ± 0,05
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034 i CMS036 były zdolne do zwiększania masy grasicy, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS034 wykazywał istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS030, CMS032 i CMS036 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem zarówno grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 27.
T a b e l a 27
Grupa N X ± SD (%)
1 2 3
CMS002 10 0,21 ± 0,02*@Λ
CMS008 10 0,20 ± 0,04*@Λ
CMS012 10 0,26 ± 0,02*@Λ
CMS014 10 0,21 ± 0,02*@Λ
CMS016 10 0,20 ± 0,03*@Λ
CMS018 10 0,23 ± 0,02*@Λ
CMS019 10 0,20 ± 0,03*@Λ
CMS020 10 0,27 ± 0,03*@Λ
CMS022 10 0,30 ± 0,03*@Λ
CMS023 10 0,20 ± 0,02*@Λ
CMS024 10 0,27 ± 0,02*@Λ
CMS026 10 0,27 ± 0,02*@Λ
CMS027 8 0,21 ± 0,03*@Λ
CMS028 10 0,18 ± 0,04*
CMS029 9 0,18 ± 0,05*
CMS030 10 0,25 ± 0,04*@Λ
CMS032 10 0,27 ± 0,03*@Λ
PL 208 666 B1 cd. tabeli 27
1 2 3
CMS033 9 0,18 ± 0,03*
CMS034 8 0,19 ± 0,04*Λ
CMS036 9 0,22 ± 0,02*@Λ
IFN-γ 10 0,15 ± 0,04
IL-2 9 0,14 ± 0,04
Roztwór soli 9 0,12 ± 0,02
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 50 μg/kg/dzień CMS008, CMS010 i CMS029 były zdolne do obniżania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono szczegółowo w tabeli 28 poniżej.
T a b e l a 28
Grupa N X + SD (%)
CMS008 10 0,39 ± 0,08*
CMS010 10 0,38 ± 0,05*
CMS029 10 0,42 ± 0,04*
IFN-γ 10 0,50 ± 0,04
IL-2 9 0,62 ± 0,07
Roztwór soli 9 0,53 ± 0,05
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS001, CMS002, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034 i CMS036 były zdolne do zwiększania masy grasicy, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS002, CMS014, CMS024 i CMS030 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS010, CMS012, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS032, CMS034 i CMS036 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem zarówno grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 29.
T a b e l a 29
Grupa N X ± SD (%)
1 2 3
CMS001 10 0,22 ± 0,05*
CMS002 9 0,24 ± 0,05*Λ
CMS010 9 0,27 ± 0,05*@Λ
CMS011 10 0,22 ± 0,04*
CMS012 10 0,27 ± 0,06*@Λ
CMS013 10 0,21 ± 0,05*
CMS014 10 0,23 ± 0,06*Λ
PL 208 666 B1 cd. tabeli 29
1 2 3
CMS015 9 0,20 ± 0,08*
CMS016 10 0,22 ± 0,06*
CMS018 10 0,24 ± 0,04*@λ
CMS019 10 0,24 ± 0,02*@λ
CMS020 10 0,24 ± 0,07*@λ
CMS021 9 0,20 ± 0,06*
CMS022 9 0,25 ± 0,04*@λ
CMS023 10 0,23 ± 0,06*
CMS024 9 0,23 ± 0,06*λ
CMS026 10 0,31 ± 0,05*@λ
CMS028 10 0,28 ± 0,06*@λ
CMS029 10 0,21 ± 0,03*
CMS030 10 0,23 ± 0,07*λ
CMS032 10 0,29 ± 0,04*@λ
CMS033 10 0,20 ± 0,02*
CMS034 9 0,27 ± 0,06*@λ
CMS035 10 0,21 ± 0,04*
CMS036 10 0,25 ± 0,04*@λ
IFN-γ 10 0,15 ± 0,04
IL-2 9 0,14 ± 0,04
Roztwór soli 9 0,12 ± 0,02
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 5 μg/kg/dzień CMS030 był zdolny do zwiększania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Stwierdzono, że CMS015 był zdolny do obniżania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono szczegółowo w tabeli 30 poniżej.
T a b e l a 30
Grupa N X ± SD (%)
CMS015 9 0,38 ± 0,15*
CMS030 10 0,64 ± 0,09*
Roztwór soli 10 0,53 ± 0,05
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS014, CMS018, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS030 i CMS032 były zdolne do zwiększania masy grasicy, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05).
PL 208 666 B1
Stwierdzono, że wśród tych peptydów CMS008 i CMS012 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono także, że CMS002, CMS020 i CMS030 wykazywały istotną statystycznie różnicę względem zarówno grupy otrzymującej IFN-γ, jak i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05), jak podano w tabeli 31.
T a b e l a 31
Grupa N X ± SD (%)
CMS002 8 0,26 ± 0,06*@Λ
CMS008 10 0,22 ± 0,07*Λ
CMS010 9 0,21 ± 0,03*
CMS012 10 0,22 ± 0,06*Λ
CMS014 10 0,20 ± 0,04*
CMS018 10 0,20 ± 0,03*
CMS020 9 0,23 ± 0,05*@Λ
CMS022 10 0,21 ± 0,06*
CMS026 9 0,21 ± 0,05*
CMS028 10 0,20 ± 0,06*
CMS030 8 0,24 ± 0,05*@Λ
CMS032 10 0,21 ± 0,06*
IFN-γ 10 0,15 ± 0,04
IL-2 9 0,14 ± 0,04
Roztwór soli 9 0,12 ± 0,02
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
Stwierdzono, że przy dawce 0,5 μg/kg/dzień CMS020 był zdolny do zwiększania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05) grupy otrzymującej IFN-γ i grupy otrzymującej IL-2 (P < 0,05). Stwierdzono, że CMS001 był zdolny do obniżania masy śledziony, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Dane przedstawiono szczegółowo w tabeli 32 poniżej.
T a b e l a 32
Grupa N X ± SD (%)
CMS001 10 0,40 ± 0,05*
CMS020 8 0,68 ± 0,09*@Λ
Roztwór soli 10 0,53 ± 0,05
IFN-γ 10 0,50 ± 0,04
IL-2 10 0,62 ± 0,07
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli P < 0,05 @ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IL-2 P < 0,05
W skrócie, stwierdzono, że peptydy CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009,
CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020,
CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032,
PL 208 666 B1
CMS033, CMS034, CMS035 i CMS036 wykazują aktywność biologiczną in vivo w badanych modelach zwierzęcych.
II. Działanie przeciwwirusowe peptydów in vivo
W celu stwierdzenia, czy peptydy te wykazują możliwe działanie terapeutyczne na zakażenia wirusowe w badaniach zastosowano kaczy model zwierzęcy zakażenia wirusem zapalenia wątroby typu B aby zbadać działanie in vivo powyższych peptydów na chore zwierzęta.
Ustalono model zapalenia wątroby typu B u kaczek Chongqing i podawano im peptydy w zastrzykach śródotrzewnowych (50 μg/kg/dzień, raz na dzień), przez 4 tygodnie. Poziom DHBV DNA w surowicy analizowano metodą hybrydyzacji surowicy typu dot-blot. Jako kontrolę pozytywną i negatywną zastosowano odpowiednio podawanie lamiwudyny i izotonicznego roztworu soli. Stwierdzono, że peptyd CMS001 był zdolny do obniżania poziomu DHBV DNA w surowicy w czwartym tygodniu leczenia, przy istotnej statystycznie różnicy względem grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Wywnioskowano, że CMS001 w odpowiednich dawkach można stosować jako część lub samodzielnie w leczeniu zakażeń wirusem zakażenia wątroby.
Materiały i metody
Peptydy zsyntetyzowano na zamówienie w American Peptide Company, Inc., USA, z L-aminokwasów.
2. Model zwierzęcy[1]
Jednodniowe kaczki Chongqing zaszczepiono drogą iniekcji śródotrzewnowej 0,1 ml podstawowej surowicy pozytywnej pod względem DNA wirusa zapalenia wątroby typu B kaczek (DHBV) (5 x 107 kopii/ml) w zastrzyku śródotrzewnowym. Po tygodniu zebrano próbki krwi z zewnętrznej żyły szyjnej i potwierdzono zakażenie metodą hybrydyzacji dot-blot z sondą DHBV DNA znakowaną digoksyną[2]. Kaczki hodowano przez 2 tygodnie przed rozpoczęciem badań.
3. Podział na grupy i leczenie
Kaczki zakażone DHBV podzielono losowo na poniższe grupy:
a) Grupa kontroli negatywnej (n=9): Izotoniczny roztwór soli podawano w 1 ml na kaczkę w zastrzykach śródotrzewnowych, raz na dzień.
b) Grupa otrzymująca lamiwudynę (n=8): Grupa kontroli pozytywnej. Lamiwudynę[4] podawano w ilości 50 mg/kg/dzień doustnie, raz na dzień.
c) Grupa otrzymująca peptyd (n=9): 50 μg/kg/dzień peptydu (doprowadzonego do końcowej objętości 0,5 - 1 ml izotonicznym roztworem soli) podawano raz dziennie drogą iniekcji śródotrzewnowej.
Leczenie trwało przez 4 tygodnie i obserwację kontynuowano przez kolejny tydzień po zakończeniu leczenia. Próbki po 1 ml krwi pobierano z zewnętrznej żyły szyjnej kaczek w dniach 0, 7, 14, 21, 28 i 35 od rozpoczęcia leczenia. Surowice próbek krwi izolowano natychmiast[3] i przechowywano w -20°C do czasu analizy.
4. Oznaczanie poziomu DHBV DNA w surowicy
Sondę DNA DHBV, znakowaną fluorescencyjnie zestawem znakującym, zgodnie z procedurą podaną przez producenta zestawu (Amersham Pharmacia Biotech Co.). Porcję 40 μl kaczej surowicy nakroplono (2 krople/próbkę) na błonę nitrocelulozową i hybrydyzowano z fluorescencyjnie znaczoną sondą DNA DHBV do ilościowego oznaczania[2]. Po doprowadzeniu hybrydyzacji do końca bloty wywołano odczynnikiem RPN3690 do fluorymetrii CDP-Star i zeskanowano skanerem Vuego Scan (Brisa-620 st). Oprogramowanie ImageMaster TotalLab wersja 1.11.Ink zastosowano do ilościowej analizy blotów. Analizę statystyczną wykonano zgodnie z parzystym testem t, z użyciem oprogramowania SPSS.
Wyniki
T a b e l a II.1. Miano DNA DHBV w surowicy przed potraktowaniem i po potraktowaniu
Poziom DHBV DNA (Średnia ± Odchylenie standardowe, 103 jednostek)
Dzień 0 Dzień 7 Dzień 14 Dzień 21 Dzień 28 Dzień 35
Izotoniczny roztwór soli 26 ± 12 45 ± 31 49 ± 23 102 ± 66 60 ± 38 50 ± 43
Lamiwudyna 21 ± 9 6 ± 4* 7 ± 6* 8 ± 7* 8 ± 5* 20 ± 19
CMS001 21 ± 18. 11 ± 13 20 ± 18 14 ± 14 5 ± 3* 18 ± 16
Parzysty test t, w porównaniu z dniem 0 dla tych samych zwierząt: * P < 0,05
PL 208 666 B1
Dla grupy kontroli negatywnej (izotoniczny roztwór soli) i grupy kontroli pozytywnej (lamiwudyna) potwierdzono pomyślne założenie zwierzęcego modelu zapalenia wątroby. Stwierdzono, że przy 50 μg/kg/dzień peptyd CMS001 był w stanie obniżyć miano DHBV DNA w surowicy po 4 tygodniach leczenia, przy istotnej statystycznie różnicy (p < 0,05) względem wartości przed leczeniem dla tych samych zwierząt. Po zakończeniu leczenia, miano DHBV DNA w surowicy wróciło do wartości bez istotnej statystycznie różnicy względem wartości przed leczeniem, co wskazuje, że działanie peptydu CMS001 może być odwracalne i/lub potrzebny jest dłuższy okres leczenia w celu usunięcia wirusa.
Dyskusja
Zwierzęcy model zapalenia wątroby u kaczek[1] jest ustalonym modelem doświadczalnym w badaniach patogenezy ludzkiego zapalenia wątroby typu B oraz w poszukiwaniu środków terapeutycznych przeciw zapaleniu wątroby typu B. W tych badaniach stwierdzono, że CMS001 był zdolny do obniżania miana DHBV DNA w surowicy po czterech tygodniach leczenia, co wskazuje, że peptyd CMS001 w odpowiedniej dawce oraz przy odpowiednim schemacie podawania może być użyteczny sam lub w połączeniu z innymi substancjami jako środek do leczenia zapalenia wątroby typu B u ludzi.
W tych badaniach sprawdzano podawanie drogą iniekcji śródotrzewnowej, jednakże nie wyklucza to możliwości skuteczności peptydu przy podawaniu innymi alternatywnymi drogami. Peptydy można także podawać drogą iniekcji dożylnej, iniekcji domięśniowej, iniekcji podskórnej i wszczepiania podskórnego, ewentualnie z użyciem środka ułatwiającego podawanie, takiego jak liposomy, chroniące środki spowalniające uwalnianie itd. Peptyd można także podawać w jakiejkolwiek postaci do podawania doustnego, takiej jak tabletka, kapsułka, zawiesina, roztwór itd., w zwykłej postaci bez modyfikacji lub w postaci o powolnym uwalnianiu ewentualnie z chroniącą powłoczką żołądkowojelitową. Ponadto peptyd można stosować w jakiejkolwiek postaci do podawania miejscowego, takiej jak maść, krem, żel itp., ewentualnie ze środkiem ułatwiającym podawanie przezskórne lub w postaci środka do inhalacji w proszku, rozpuszczonego lub w postaci chronionej liposomami. Peptyd może być także przetranslatowany do jego sekwencji genetycznej i wklonowany do układu ekspresyjnego, sam lub w połączeniu z innymi sekwencjami peptydowymi, w celu wytworzenia powstającej cząsteczki peptydowej do wykorzystania aktywności peptydu w sposób opisany w tym raporcie, po ewentualnym oczyszczaniu powstałego peptydu.
T a b e l a II.2. Peptydy skuteczne w zapaleniu wątroby typu B
Kod CMS SEQ ID NO:
CMS001 1
Literatura
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng i in., Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993; 1(2): 89-91
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, Chen Xuehua. Preparation and application of DHBV DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994; 19(4): 295-297
3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua i in. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(1): 13-15
4. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan i in. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journal of Hepatology. 2001; 9(4): 209-211
III. Działanie peptydów na zapalenie nerek
W celu stwierdzenia czy te peptydy wykazują możliwe działanie terapeutyczne na zapalenie nerek w badaniach zastosowano szczurzy model zwierzęcy zapalenia nerek Masugi aby zbadać działanie in vivo powyższych peptydów na chore zwierzęta[3,4].
Celem doświadczenia było zbadanie działania terapeutycznego peptydów in vivo na przewlekłe zapalenie kłębuszków nerkowych. Szczurzy model zwierzęcy zapalenia kłębuszków nerkowych Masugi zrealizowano przez wstrzyknięcie króliczych IgG przeciw szczurzej korze nerek zdrowym szczurom Sprague Dawley, a następnie leczono je natychmiast śródotrzewnowymi zastrzykami 50 μg/kg/dzień, raz na dzień przez 3 tygodnie. Hydrokortyzon zastosowano jako kontrolę pozytywną. Stwierdzono, że białkomocz, poziom kreatyniny w surowicy oraz wskaźnik śledzionowy przy leczeniu z użyciem CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 były obniżane w porównaniu z grupą kontrolną z istotną statystycznie różnicą (p < 0,05). Badanie mikroskopowe nerek po śmierci ujawniło, że działaPL 208 666 B1 nie terapeutyczne tych peptydów było podobne do leczenia hydrokortyzonem. Wywnioskowano, że CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 można stosować do leczenia przewlekłego zapalenia nerek.
Materia ły
Samce szczurów Sprague Dawley (SD), o masie 120 ± 20 g, pochodziły z Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, a także z First Military Medical University. Króliki Chinchilla o masie 3 kg pochodziły z Center of Experimental Animal, Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine.
Peptydy, pochodzące z L-aminokwasów, zsyntetyzowano na zamówienie w American Peptide Company, Inc, USA i rozcieńczono do 10 μg/ml w jałowym izotonicznym roztworze soli. Hydrokortyzon uzyskano z Yangzhou Pharmaceutical Factory, Chiny.
Zestaw do oznaczania kreatyniny w surowicy uzyskano z Shanghai Rongsheng Biological Technique Company, ChRL.
Metody
1. Przygotowanie króliczej surowicy przeciw szczurzej korze nerek[1]: 20 zdrowych szczurów SD uśpiono przez dożylne wstrzyknięcie 3% pentobarbitalu sodu, 40 mg/kg. Aortę brzuszną odsłonięto i nerki perfundowano izotonocznym roztworem soli do czasu oczyszczenia z krwi. Wyizolowano korę nerek, zhomogenizowano ją w 5 objętościach 0,01M buforu TrisHCl, pH 8,1, a następnie przesączono przez sito z nierdzewnej stali o średnicy oczek 140. Filtrat zebrano i zmieszano z kompletnym albo niekompletnym adiuwantem Freunda GIBCO-RRE w stosunku 1:1 i zemulgowano do uzyskania roboczego roztworu do immunizacji.
zdrowych królików immunizowano roztworami immunizacyjnymi, pierwszy raz z kompletnym adiuwantem Freunda, a następnie z niekompletnym. Antygen wstrzykiwano podskórnie w 6 losowych punktach, po 0,1 ml na punkt, raz na 10 dni. Od szóstego tygodnia krew pobierano z żyły usznej i miano przeciwciał oznaczono metodą podwójnej dyfuzji[2]. W ósmym tygodniu od rozpoczęcia immunizacji króliki uśpiono przez dożylne wstrzyknięcie 3% pentobarbitalu sodu, 20 mg/kg i krew zebrano z tętnicy szyjnej. Następnie wydzielono surowicę odpornościową i oddzielono ją.
Pełną krew zebrano od 15 zdrowych szczurów SD. Czerwone ciałka krwi wyizolowano i przemyto trzykrotnie do oczyszczenia izotonicznym roztworem soli. Czyste czerwone ciałka krwi zmieszano z 250 ml króliczej surowicy odpornościowej i inkubowano w 4°C przez noc. Po inkubacji komórki krwi usunięto przez odwirowanie i supernatant dodatkowo zdezaktywowano w 56°C przez 30 minut. Po odwirowaniu w celu usunięcia jakiegokolwiek osadu, surową IgG wyizolowano i częściowo oczyszczono z supernatantu przez trzykrotne wytrącenie (NH4)2SO4 (50%, 33% i ponownie 33%)[5]. Surową IgG ponownie rozpuszczono w 125 ml podwójnie destylowanej wody i dializowano do oczyszczenia od siarczanu amonu. Miano przeciwciał przeciw szczurzej korze wyznaczono metodą podwójnej dyfuzji[2].
2. Indukcja szczurzego zapalenia kłębuszków nerkowych[5]: 0,25 ml roztworu inicjującego (zawierającego około 4 mg nie specyficznych króliczych IgG w kompletnym adiuwancie Freunda) wstrzyknięto śródotrzewnowo zdrowym szczurom SD w celu uczulenia szczurów 5 dni przed indukcją. Następnie, z wyjątkiem normalnej zdrowej grupy kontrolnej, która otrzymywała tylko izotoniczny roztwór soli, wszystkie grupy indukowano przez śródotrzewnowe wstrzyknięcie 1 ml króliczych IgG przeciw szczurzej korze, przygotowanych w sposób opisany w metodzie 1.
3. Podział na grupy i podawanie: samce szczurów SD losowo podzielono na grupy: normalną zdrową kontrolną (normalna), kontrolną zapalenia nerek leczonego placebo (placebo), zapalenia nerek leczonego peptydami oraz kontrolną zapalenia nerek leczonego hydrokortyzonem (hydrokortyzon), po 12 na grupę. Leczenie rozpoczęto w dniu indukcji. Peptydy, 50 μg/kg/dzień, hydrokortyzon 3,3 mg/kg/dzień i izotoniczny roztwór soli jako placebo, podawano śródotrzewnowo raz na dzień przez 3 tygodnie.
4. Monitorowane parametry[4] (a) poziom białek w moczu: każdego szczura trzymano pojedynczo w klatce. Dostarczono im odpowiednią wodę do picia. Mocz zbierano raz na tydzień, przez 24 godziny na raz. Zawartość białka w moczu oznaczono metodą z błękitem Coomassie.
(b) poziom kreatyniny w surowicy: krew zebrano po trzech tygodniach leczenia i oznaczono poziom kreatyniny w surowicy. Zestaw do oznaczania kreatyniny uzyskano z Shanghai Rongsheng Biological Technique Company.
(c) wskaźnik masowy śledziony: wskaźnik masowy śledziony wyznaczono z następującego wzoru:
Wskaźnik masowy śledziony = średnia masa śledziony: średnią masę ciała
PL 208 666 B1 (d) Patologiczne badanie mikroskopowe nerek: 6 najcięższych nerek wybrano z każdej grupy do badania patologicznego.
Analiza statystyczna
Do porównań pomiędzy grupami zastosowano test t, wartość odcięcia ustawiono przy p < 0,05. Dla wszystkich grup, dwa szczury z najniższym poziomem białka w moczu odrzucono z analizy statystycznej.
Wynik
1. Wpływ leczenia peptydami na poziom białka w moczu
T a b e l a III.1. Wpływ leczenia peptydami w moczu (jednostki: mg)
Grupy n Tydzień 1 Tydzień 2 Tydzień 3
CMS014 10 5,5 ± 4,0* 6,3 ± 6,8* 2,8 ± 1,9*
CMS018 10 7,0 ± 3,7* 5,5 ± 7,9* 3,3 ± 3,4*
CMS030 10 5,4 ± 3,4* 9,5 ± 16,2 2,4 ± 1,5*
CMS036 10 7,9* ± 5,8* 5,0 ± 7,1* 1,3 ± 0,9*
hydrokortyzon 10 3,1 ± 2,0* 7,5 ± 7,7 7,6 ± 7,1*
placebo 10 22,9 ± 22 17,2 ± 14,5 20,2 ± 29,0
normalna 9 1,7 ± 1,3* 2,3 ± 1,1* 0,4 ± 0,2*
w porównaniu z placebo, * p < 0,05 na poziom białka
Stwierdzono, że peptydy CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 podawane raz dziennie w ilości 50 μg/kg/dzień mogą obniżyć poziom białka w moczu w szczurzym modelu zapalenia nerek Masugi, z istotną statystycznie różnicą względem kontrolnej grupy leczonej placebo, p < 0,05. Zauważono także, że w grupach CMS014, CMS030, CMS036 i hydrokortyzonu szybkość wzrostu była mniejsza niż normalna. Szybkość wzrostu grupy hydrokortyzonu była tak zmniejszona, że po pierwszym tygodniu trzeba było obniżyć dawkę leczniczą o połowę aby zapobiec poważnej nietolerancji.
2. Wpływ leczenia peptydami na poziom kreatyniny w surowicy
T a b e l a III.2. Wpływ leczenia peptydami na poziom kreatyniny w surowicy
Grupy n Poziom kreatyniny w surowicy (pmol/l)
CMS014 10 159 ± 1
CMS018 10 67 ± 1*
CMS030 10 93 ± 1*
CMS036 10 80 ± 1*
Placebo 10 265±212
hydrokortyzon 10 239±107
normalna 9 80 ± 1*
w porównaniu ze szczurami z zapaleniem nerek otrzymującymi leczenie placebo (placebo), * p < 0,05
Poziom kreatyniny w surowicy u szczurów z zapaleniem nerek Masugi otrzymujących leczenie placebo był znacznie wyższe w porównaniu z normalną grupą kontrolną, co wskazywało, że działanie nerek u szczurów z zapaleniem nerek było nieprawidłowe. Stwierdzono, że peptydy CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 podawane raz dziennie w ilości 50 μg/kg/dzień były zdolne do obniżenia poziomu kreatyniny w surowicy, z istotną statystycznie różnicą względem kontrolnej grupy szczurów z zapaleniem nerek leczonych placebo.
PL 208 666 B1
3. Wpływ peptydów na wskaźnik śledzionowy
T a b e l a III.3. Wpływ peptydów na wskaźnik śledzionowy (x10-3)
Grupy n Wskaźnik śledzionowy
CMS014 10 3,6 ± 1,3*
CMS018 10 3,3 ± 0,8*
CMS030 10 3,0 ± 0,5*
CMS036 10 3,4 ± 0,8*
placebo 10 4,8 ± 1,1
hydrokortyzon 10 4,5 ± 1,4
normalna 9 2,4 ± 0,1*
w porównaniu ze szczurami z zapaleniem nerek otrzymującymi leczenie placebo (placebo), * p < 0,05
Śledziony wszystkich indukowanych szczurów były powiększone w porównaniu z normalnymi szczurami, co wskazywało, że wywołanie zapalenia nerek było związane z odpowiedzią immunologiczną. Stwierdzono, że peptydy CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 podawane raz dziennie w ilości 50 μg/kg/dzień były zdolne obniżyć wskaźnik śledzionowy, z istotną statystycznie różnicą względem kontrolnej grupy leczonej placebo, p < 0,05. Sugerowało to, że peptydy mogą wywierać swoje działanie korygujące przeciw zapaleniu nerek przez mechanizmy immunosupresji.
4. Działanie peptydów stwierdzone w patologicznym badaniu mikroskopowym nerek
W porównaniu z normalnymi szczurami, szczury z zapaleniem nerek otrzymujące leczenie placebo (grupa placebo) wykazywały oznaki tworzenia tkanki włóknistej w torebce kłębuszków, rozrostu nabłonka kłębuszków, tworzenia struktur zwanych półksiężycami, rozszerzenia się i przekrwienia włośniczek kłębkowych, obrzęku nabłonka kanalików bliższych oraz tworzenia wałeczków nerkowych w dystalnych kanalikach i przewodzie zbierającym. Te zmiany patologiczne potwierdziły pomyślne wywołanie zapalenia nerek. Zaobserwowano, że w grupie CMS014, był tylko jeden szczur wykazujący tworzenie tkanki włóknistej w torebce kłębuszków i rozrost nabłonka kłębuszków. Inne parametry tego samego szczura i innych szczurów z tej samej grupy miały zasadniczo taką samą histologię nerek jak normalne szczury. W grupach CMS018, CMS030 i CMS036, wszystkie parametry patologiczne wszystkich szczurów były normalne.
Wnioski
Wyciągnięto wnioski, że peptydy CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 w dawce 50 pg//kg/dzień podawanej raz dziennie śródotrzewnowo mogą wywierać działanie terapeutyczne w szczurzym modelu zapalenia nerek Masugi. Peptydy te zapewniały poprawę w odniesieniu do białkomoczu, wydzielania kreatyniny oraz histologii nerek u leczonych szczurów, z istotną statystycznie różnicą względem kontrolnej grupy leczonej placebo. Peptydy te mogą działać przez mechanizmy immunologiczne, co wskazano przez ich wpływ na wskaźnik masowy śledziony, ale nie wyklucza się możliwości ich działania na drodze innych mechanizmów.
Dyskusja
Peptydy CMS014, CMS018, CMS030 i CMS036 mogą być użyteczne jako część terapii, lub samodzielnie, w leczeniu zapalenia nerek u ludzi. Przykładowo peptydy można stosować do skorygowania białkomoczu lub przywracania funkcji wydzielniczych u pacjentów z zapaleniem nerek. Peptydy można także stosować samodzielnie, w połączeniu dwóch lub większej liczby peptydów lub w połączeniu z innymi lekami lub dodatkami do żywności przez cały czas leczenia zapalenia nerek.
T a b e l a III.4. Peptydy skuteczne w zapaleniu nerek
Kod CMS SEQ ID NO:
CMS014 7
CMS018 10
CMS030 21
CMS036 26
PL 208 666 B1
Literatura
1. SDA (State Drug Administration, ChRL). The guideline of preclinical researches of new drugs. 1994, wyd. 1, str. 96
2. Xu Shuyun i in., The methodology of pharmacological experiment, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, wyd. 2; 1991: 1071.
3. Chen Qi i in., The methodology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, wyd. 1; 1993: 390.
4. Du Guanhua. The guideline for pharmacological experiment - the discovery and pharmacological evaluation of new drugs, Science Publishing Company, Beijing, wyd. 1; 2001: 598.
5. Wang Shuxian. Nephrology, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, wyd. 11, 1987: 244.
IV. Wpływ peptydów CMS na nowotwory
Aby stwierdzić czy peptydy te wywierają ewentualne działanie terapeutyczne w chorobie nowotworowej, w badaniach zastosowano różne wzorcowe modele zwierzęce nowotworów, aby zbadać działanie biologiczne powyższych peptydów na chore zwierzęta.
Materiały
1. Zwierzęta doświadczalne
Myszy BALB/c, myszy C57BL/6 i myszy DBA/2, o masie 18-22 g, z China Medical Science Institute, ChRL.
2. Linie komórkowe
Mysie komórki mięsaka S180, komórki B16 i komórki L1210, z Cancer Research Department, China Medical Science Institute.
Komórki YAC-1, dar prof. Yao Zhi, Tianjin Medical University.
3. Główne leki i odczynniki
Peptydy zastosowane w tym doświadczeniu wytworzono na zamówienie w American Peptide Company, Inc, USA.
Płodowa surowica bydlęca, pożywka do hodowli komórkowych RPMI-1640, z Gibco, USA.
MTT, ConA, z Sigma, USA.
Rekombinowany mysi interferon γ (rmlFN-γ), z Beijing Biotech Inc., ChRL.
Rekombinowana ludzka interleukina-2 (rhIL-2), z Shanghai Huaxin Biotech Inc., ChRL.
Roztwór do rozdzielania limfocytów, z Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, ChRL
Cyklofosfamid, z The 12th pharmaceutical factory of Shanghai, ChRL.
Metody
1. Podawanie badanej substancji
Zastrzyki śródotrzewnowe raz na dzień. Z wyjątkiem grupy otrzymującej cyklofosfamid, leczenie wszystkich grup rozpoczynano 5 dni przed przeszczepieniem komórek nowotworowych. Grupy otrzymujące cyklofosfamid leczono od następnego dnia po przeszczepieniu komórek nowotworowych. Leczenie wszystkich grup badaną substancją trwało przez 30 dni lub do czasu śmierci zwierzęcia, chyba, że wskazano inaczej.
2. Wpływ peptydów na szybkość wzrostu przeszczepionych komórek mięsaka S180 u myszy BALB/c oraz na funkcje immunologiczne gospodarza
Myszy BALB/c losowo podzielono na grupy: grupę otrzymującą peptyd, grupę otrzymującą cyklofosfamid, grupę otrzymującą rmIFN-γ, grupę otrzymującą rhIL-2 i grupę otrzymującą roztwór soli, 20 zwierząt na grupę.
Podstawowe komórki mięsaka S180 inkubowano w pożywce DMEM/F12 wzbogaconej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 37°C, 5% CO2 przez 72 godziny, następnie przemyto 3-4 krotnie roztworem Hanka w temperaturze pokojowej. Doprowadzono stężenie komórek do 1-2 x 109 na litr roztworem Hanka. 0,2 ml zawiesiny komórek wszczepiano kilku myszom BALB/c przez dół pachowy przez 10-12 dni. Myszy uśmiercono przez zwichnięcie kręgu szyjnego. Szybko rosnące i nie rozbite lite guzy zebrano i przemyto do czysta jałowym roztworem soli. Tkankę zdyspergowano w roztworze soli do otrzymania jednorodnej zawiesiny komórek, w stosunku 1 g tkanki na 4 ml roztworu soli. Modelowe myszy niosące mięsaka otrzymano przez wstrzyknięcie 0,2 ml zawiesiny komórek przez dół pachowy[1]. Terapię badaną substancją rozpoczęto jak opisano w części 1 metody.
2.1 Wpływ peptydów na fagocytotoksyczne działanie fagocytów jednojądrzastych u myszy z mięsakiem S180[2,3] analizowano przez wstrzyknięcie myszom do żyły ogonowej 0,1 ml/10 g masy
PL 208 666 B1 ciała tuszu (w rozcieńczeniu 1:5 w izotonicznym roztworze soli) w drugim dniu po ostatnim podaniu badanej substancji. W minutę i pięć minut po wstrzyknięciu tuszu pobrano 20 pl krwi z kąta oka za pomocą heparynizowanej rurki. Krew zmieszano z 2 ml 0,1% (wag./obj.) Na2CO3, a następnie zmierzono OD680. Wynikowy wskaźnik przezroczystości K obliczono z następującego wzoru:
K = (lgA1-lgA2) t (t2-t1)
Klucz
A1: OD680 nm w pierwszej minucie
A2: OD680 nm w piątej minucie t2: 5 minut t1: 1 minuta
Po badaniach wskaźnika fagocytozy, myszy uśmiercono przez zwichnięcie kręgu szyjnego. Usunięto wątrobę, śledzionę i grasicę oraz tkankę nowotworową wysuszono przy użyciu bibuły filtracyjnej i zważono.
Wskaźnik fagocytozy α obliczono jak poniżej: α = (JK)((t WLS)
Klucz
W: masa ciała
WLS: masa wątroby plus śledziony
2.2 Wskaźnik hamowania wzrostu nowotworu obliczono według następującego wzoru
Wskaźnik zahamowania wzrostu nowotworu = (średnia masa nowotworu w grupie kontrolnej - średnia masa nowotworu w grupie leczonej) t średnia masa nowotworu w grupie kontrolnej
3. Wpływ peptydów na przeżycie myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22
Myszy BALB/c losowo podzielono na grupy: grupę otrzymującą peptyd, grupę otrzymującą cyklofosfamid, grupę otrzymującą rmlFN-γ, grupę otrzymującą rhIL-2 i grupę otrzymującą roztwór soli, 20 zwierząt na grupę.
Podstawowe komórki H22 inkubowano w pożywce DMEM/F12 wzbogaconej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 37°C, 5% CO2 przez 72 godziny, następnie przemyto 3-4 krotnie roztworem Hanka w temperaturze pokojowej. Doprowadzono stężenie komórek do 1-2 x 109 na litr roztworem Hanka. 0,2 ml zawiesiny komórek wszczepiano kilku myszom BALB/c do jamy brzusznej przez 6-8 dni[1]. Myszy uśmiercono przez zwichnięcie kręgu szyjnego. Płyn puchlinowy myszy zebrano aseptycznie i stężenie komórek doprowadzono do 1 x 106 na ml roztworem Hanka. 0,2 ml zawiesiny komórek wszczepiono do jamy brzusznej zdrowych myszy w celu wytworzenia mysiego modelu nowotworu wątroby typu płynu puchlinowego niosącego H22. Podawanie badanej substancji rozpoczęto w sposób podany w części 1 metody. Rejestrowano dane odnośnie przeżycia myszy. Gdy zwierzę przeżyło dłużej niż czas trwania doświadczenia, dni przeżycia zanotowano jako czas trwania doświadczenia. Średni dzień przeżycia wyznaczano metodą Kaplana-Meiera w opcji Survival oprogramowania SPSS. Wskaźnik przeżycia obliczono według poniższego wzoru:
Wskaźnik przeżycia = (średnia liczba przeżytych dni w grupie leczonej - średnia liczba przeżytych dni w grupie kontrolnej) t średnia liczba przeżytych dni grupy kontrolnej x 100%
4. Wpływ peptydów na odporność komórkową myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22
4.1. Przygotowanie zawiesiny komórek śledziony[1,4]
Zdrowe myszy BALB/c losowo podzielono na grupy: grupę z peptydem, grupę z rmINF-γ, grupę z rhIL-2 i grupę otrzymującą roztwór soli, 15 myszy na grupę i przygotowano według modelu myszy niosących H22, jak opisano w części 3 metody. Po wszczepieniu komórek nowotworowych badane substancje podawano przez 15 dni i myszy uśmiercono przez zwichnięcie szyi. Śledzionę wydzielono w warunkach aseptycznych i ręcznie dyspergowano w zimnym roztworze D-Hanka za pomocą igły do zastrzyków. Zdyspergowaną zawiesinę komórek przesiano przez sito nr 100 o średnicy oczek 150 pm z nierdzewnej stali. Po odwirowaniu przy 200 g przez 10 minut odrzucono supernatant. Osad komórek ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 10 objętościach buforu Tris-NH4Cl, a następnie pozostawiono na 10 minut w temperaturze pokojowej. Zawieszone komórki zebrano przez odwirowanie przy 150 g przez 10 minut. Komórki przemyto 2-4-krotnie zimnym roztworem D-Hanka przez ponowne przeprowadzanie w stan zawiesiny i zebranie przez odwirowanie w warunkach powyżej opisanych.
PL 208 666 B1
Następnie przemyte komórki rozcieńczono do wymaganych gęstości komórek pożywką hodowlaną RPMI-1640, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej.
4.2. Wpływ peptydów na transformację limfocytów T u myszy z nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22 [1,4]
Komórki śledziony o gęstości 1 x 106/ml umieszczono w 96-studzienkowej płytce do hodowli komórkowych, 100 μl/studzienkę, po trzy równoległe studzienki dla każdej badanej próbki i próbki kontrolnej na mysz. Do studzienek testowych dodano 100 μl/studzienkę ConA o 100 μg/ml w RPMI1640 oraz 100 μl/studzienkę czystego RPMI-1640 jako kontroli. Komórki inkubowano przez 66 godzin w 37°C, 5% CO2. Następnie komórki sprowadzono do osadu przez odwirowanie przy 150 g przez 10 minut. Supernatant zebrano i przechowywano w -20°C do oznaczania cytokin IL-2 i IFN.
Do osadu komórek dodano 50 μl/studzienkę MTT o stężeniu 1 mg/ml w RPMI-1640 i komórki ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny przez wytrząsanie przez 2 minuty. Inkubację kontynuowano przez 4 godziny. Supernatant odrzucono po odwirowaniu przy 150 g przez 10 minut. Do osadu komórek dodano 120 μl 40 mM HCl-2-propanolu i wytrząsano przez 3 minuty. Zastosowano czytnik ELISA do oznaczania wartości OD570 nm dla każdej studzienki przy referencyjnej długości fali nm.
Dla każdej myszy przygotowano trzy studzienki testowe i trzy studzienki kontrolne. Wskaźnik stymulacji (SI) dla każdej myszy otrzymano przez wyprowadzenie najpierw średniej OD z trzech równoległych studzienek, a następnie podzielenie wartości dla studzienek testowych przez wartość dla studzienek kontrolnych.
4.3. Wpływ peptydów na aktywność komórek NK u myszy z nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22 [5,6]
Komórki śledziony myszy o gęstości 4 x 106/ml przygotowano jak opisano powyżej w części 4.1. Docelowe komórki YAC-1 doprowadzono do fazy logarytmicznej i doprowadzono do 1 x 105/ml. Stosując 96-studzienkowe płytki do hodowli komórkowych, dodano 100 μl komórek śledziony myszy i 100 μl pożywki hodowlanej do studzienki kontrolnej zawierającej tylko komórki śledziony; 100 μl komórek docelowych i 100 μl pożywki hodowlanej do studzienki kontrolnej zawierającej tylko komórki docelowe; 100 μl komórek śledziony myszy i 100 μl komórek docelowych do studzienki testu aktywności NK. Dla każdej myszy przygotowano trzy równoległe zestawy powyższych studzienek. Następnie 96-studzienkowe płytki do hodowli komórkowych inkubowano przez 4 godz. w 37°C, 5% CO2.
Próbki odwirowano przy 150 g przez 10 minut aby zebrać komórki. Supernatant odrzucono i dodano 50 μl/studzienkę MTT o stężeniu 1 mg/ml. Następnie mieszaninę reakcyjną wytrząsano przez 2 minuty, a potem inkubowano w 37°C, 5% CO2 przez 4 godziny. Supernatant odrzucono po odwirowaniu przy 150 g przez 10 minut. Do osadu komórek dodano 120 μl 40 mM HCl w 2-propanolu i wytrząsano przez 3 minuty. Zastosowano czytnik ELISA do oznaczania wartości OD570 nm dla każdej studzienki przy referencyjnej długości fali 630 nm.
Dla każdej myszy przygotowano 9 studzienek: trzy studzienki kontrolne tylko z komórkami śledziony, trzy studzienki kontrolne tylko z komórkami docelowymi oraz trzy studzienki testowe zarówno z komórkami śledziony, jak i docelowymi. Wskaźnik aktywności NK komórek dla każdej myszy przez wyprowadzenie najpierw średniej OD z trzech równoległych studzienek dla każdej kombinacji, a następnie wstawienie średnich wartości OD do poniższego wzoru:
Wskaźnik aktywności komórek NK = [1-(średnie OD studzienek z komórkami śledziony i docelowymi - średnie OD studzienek tylko z komórkami śledziony) * (średnie OD studzienek tylko z komórkami docelowymi)] x 100%
5. Wpływ peptydów na przeżycie myszy DBA/2 z przeszczepioną białaczką L1210
Zdrowe myszy DBA/2, 6-8 tygodniowe, losowo podzielono na grupy: grupę z peptydem, grupę z rmlNF-γ, grupę z rhIL-2 i grupę otrzymującą roztwór soli, 20 myszy na grupę.
Wyjściowe komórki L1210 inkubowano w pożywce DMEM/F12 wzbogaconym 10% płodowej surowicy bydlęcej, 37°C, 5% CO2 przez 72 godziny, następnie przemyto 3-4 krotnie roztworem Hanka i doprowadzono do 1 x 105 komórek na litr. Porcję 0,1 ml zawiesiny komórek wszczepiano kilku myszom DBA do jamy brzusznej przez 6-8 dni. Myszy uśmiercono przez zwichnięcie kręgu szyjnego i zebrano aseptycznie ich płyn puchlinowy. Stężenie komórek w zebranym płynie puchlinowym doprowadzono do 1 x 105 na ml roztworem Hanka. 0,1 ml zawiesiny komórek wszczepiono każdemu ze zwierząt testowych i rejestrowano dane odnośnie przeżycia zwierząt. Leczenie rozpoczęto u zwierząt testowych w sposób opisany w części 1 metody. Średni dzień przeżycia wyznaczano metodą Kaplana-Meiera w opcji Survival oprogramowania SPSS. Gdy zwierzę przeżyło dłużej niż czas trwania doPL 208 666 B1 świadczenia, dni przeżycia zanotowano jako czas trwania doświadczenia. Wskaźnik przeżycia obliczono według poniższego wzoru:
Wskaźnik przeżycia = (średnia liczba przeżytych dni w grupie leczonej - średnia liczba przeżytych dni w grupie kontrolnej) : liczba przeżytych dni grupy kontrolnej x 100%
6. Wpływ peptydów na odporność humoralną myszy C57BL/6 niosących przeszczepiony czerniak B16 oraz potencjał przerzutowania wszczepionych komórek czerniaka
Zdrowe myszy C57BL/6, 6-8 tygodniowe, masa ciała 18-22 g, losowo podzielono na grupy: grupę z peptydem, grupę z rmlNF-γ, grupę z rhIL-2 i grupę otrzymującą roztwór soli, 20 myszy na grupę.
Wyjściowe komórki B16 inkubowano w pożywce DMEM/F12 wzbogaconej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 37°C, 5% CO2 przez 72 godziny, następnie przemyto 3-4 krotnie roztworem Hanka. Stężenie komórek doprowadzono do 1 x 105 komórek na litr roztworem Hanka i 0,1 ml zawiesiny komórek wszczepiano przez żyłę ogonową myszom testowym aby stworzyć model zwierzęcy z czerniakiem B16[7,8]. Leczenie rozpoczęto u zwierząt testowych w sposób opisany w części 1 metody.
6.1. Wpływ peptydów na odporność humoralną myszy C57BL/6 niosących przeszczepiony czerniak B16 [9]
Owcze czerwone ciałka krwi (SRBC) przygotowano przez zebranie krwi z żyły szyjnej i umieszczenie jej w jałowej kolbie ze szklanymi kulkami. Kolbę wytrząsano przez 3 minuty i krew zmieszano z roztworem Alsever (glukoza 2,05 g, NaCl 0,4 g, cytrynian sodu 0,8 g, doprowadzone do 100 ml destylowaną wodą) i przechowywano w 4°C. Bezpośrednio przed użyciem, próbki odwirowano przy 130 g, 5 minut, w celu zebrania SRBC. Komórki przemyto dwukrotnie przez przeprowadzanie w stan zawiesiny i odwirowywanie w izotonicznym roztworze soli. Następnie osad komórek zebrano przez odwirowanie przy 180 g przez 10 minut i ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w roztworze soli, aby otrzymać końcową zawiesinę roboczą SRBC 2% (obj.).
Dopełniacz przygotowano przez dodanie 10 objętości świeżej surowicy świnki morskiej do jednej objętości osadzonych przez wirowanie SRBC, a następnie łagodne wytrząsanie przez 30 minut w 4°C. SRBC usunięto przez wirowanie przy 200 g przez 10 minut. Dodano 10 objętości zotonicznego roztworu soli aby uzyskać roboczy roztwór dopełniacza.
Badanym zwierzętom, w 27 dniu leczenia, 0,2 ml roboczej zawiesiny komórek SRBC wstrzyknięto każdemu zwierzęciu aby wywołać powstanie przeciwciał. Dzień po ostatnim podaniu badanej substancji, krew zebrano z kąta oka i zostawiono w temperaturze pokojowej na 1 godzinę w celu wydzielenia surowicy. Po odwirowaniu przy 200 g przez 10 minut, surowicę rozcieńczono 500 razy zotonicznym roztworem soli.
Do 1 ml rozcieńczonej surowicy mysiej dodano 0,5 ml zimnej zawiesiny SRBC. Schłodzono w lodzie. Następnie i dodano 1 ml roboczego roztworu dopełniacza i inkubowano w 37°C w łaźni wodnej przez 10 minut. Reakcje przerwano przez umieszczenie w lodzie. Następnie próbki odwirowano przy 200 g przez 10 minut aby uzyskać supernatant.
Do 1 ml tego supernatantu dodano 3 ml roztworu Drabkina i pozostawiono w temperaturze pokojowej na 10 minut. Zmierzono OD540 nm.
Obliczenia
OD540 nm odniesienia uzyskano przez zmieszanie 0,25 ml zawiesiny SRBC z roztworem Drabkina do 4 ml i umieszczenie na 10 minut w temperaturze pokojowej przed pomiarem OD540 nm.
Wskaźnik hemolizy = (OD540 nm badanej próbki : OD540 nm próbki odniesienia) x 500
6.2 Po zbadaniu odporności humoralnej myszy uśmiercono przez zwichnięcie kręgu szyjnego. Przeprowadzono pośmiertne badanie zwierząt. Zanotowano zmiany patologiczne i policzono liczbę ognisk przerzutowych czerniaka w płucach.
Wyniki
1. Wpływ peptydu na fagocytozę komórkową u myszy BALB/c z przeszczepionym mięsakiem S180 (Metoda 2.1)
T a b e l a IV.1. Wpływ peptydów na wskaźnik fagocytozy myszy BALB/c z przeszczepionym mięsakiem S180
Grupa Dawka N Wskaźnik fagocytozy
1 2 3 4
CMS001 50 pg/kg 20 6,24 ± 0,33*λ
CMS001 5 pg/kg 19 6,67 ± 0,43*λ
CMS034 5 pg/kg 19 6,20 ± 0,44*λ
PL 208 666 B1 cd. tabeli IV.1
1 2 3 4
CMS034 0,5 pg/kg 20 6,35 ± 1,02*
IL-2 3 x 105 IU/kg 19 6,96 ± 1,37*
IFN-γ 3 x 105 IU/kg 17 5,45 ± 0,71
Cyklofosfamid 20 mg/kg 19 5,92 ± 2,47
Roztwór soli 0,5 ml 19 5,38 ± 0,85
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05 Λ w porównaniu do grupy otrzymującej IFN-γ, P < 0,05
Stwierdzono, że CMS001 przy 50 μg/kg/dzień i 5 μg/kg/dzień oraz CMS034 przy 5 μg/kg/dzień i 0,5 μg/kg/dzień są w stanie podwyższyć wskaźnik fagocytozy z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli.
2. Wpływ peptydów na szybkość wzrostu przeszczepionego mięsaka S180 u myszy BALB/c (Metoda 2.2)
T a b e l a IV.2. Wpływ peptydów na wzrost przeszczepionego nowotworu S180
Grupa Dawka N Masa nowotworu (g) Wskaźnik zahamowania nowotworu (%)
CMS010 500 pg/kg 20 0,67 ± 0,35* 48,4
CMS034 0,5 pg/kg 20 0,83 ± 0,48* 35,9
CMS035 5 pg/kg 20 0,71 ± 0,37* 44,6
IL-2 3 x 105 IU/kg 20 0,69 ± 0,37* 46,2
IFN-γ 3 x 105 IU/kg 18 0,96 ± 0,45 25,3
cyklofosfamid 20 mg/kg 20 0,68 ± 0,32* 47,3
Roztwór soli 0,5 ml 20 1,29 ± 0,50
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05
Stwierdzono, że CMS010 przy 500 μg/kg/dzień, CMS034 przy 0,5 μg/dzień i CMS035 przy 5 μg/kg/dzień są w stanie zmniejszyć wzrost przeszczepionego mięsaka S180, z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05).
3. Wpływ peptydów na przeżycie myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22 (Metoda 3)
T a b e l a IV.3. Wpływ peptydów na przeżycie myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22
Grupa Dawka N Dni przeżycia Wskaźnik przeżycia (%)
CMS008 5 pg/kg 20 50,7 ± 20,9*& 67,8
CMS011 5 pg/kg 20 36,4 ± 22,2*& 60,2
CMS024 50 pg/kg 20 36,3 ± 12,7*&$ 38,4
CMS024 5 pg/kg 19 40,6 ± 14,6*&$ 54,8
CMS024 0,5 pg/kg 19 46,4 ± 14,8*λ&$ 76,9
CMS032 0,5 pg/kg 20 42,8 ± 12,2*λ&$ 63,3
rhIL-2 3 x 105 IU/kg 18 13,6 ± 0,5
rmIFN-γ 3 x 105 IU/kg 20 27,8 ± 7,5 6,1
Cyklofosfamid 20 mg/kg 20 24,7 ± 10,2
Roztwór soli 0,5 ml 19 26,2 ± 6,8
&
$ w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej rmIFN-γ, P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej rhIL, P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej cyklofosfamid, P < 0,05
PL 208 666 B1
Stwierdzono, że CMS008 przy 5 μg/kg/dzień, CMS011 przy 5 μg/kg/dzień, CMS024 przy 50 μg/kg/dzień, CMS024 przy 0,5 μg/kg/dzień i CMS032 przy 0,5 μg/kg/dzień są w stanie przedłużyć przeżycie myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22, z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05). Zaobserwowano także, że w grupie CMS024 0,5 μg/kg/dzień, ponad 30% (n=6) myszy mogło przeżyć dłużej niż 90 dni (dwa miesiące po zakończeniu doświadczenia). Badanie pośmiertne tych myszy nie ujawniło znaków utworzenia się nowotworu. Zatem CMS024 przy 0,5 μg/kg/dzień może oddziaływać na wzrost przeszczepionego H22 przez wpływ na jego utworzenie lub wywołanie całkowitego wyleczenia rozwiniętego nowotworu.
4. Wpływ peptydów na transformację limfocytów T u myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22 (Metoda 4.2)
T a b e l a IV.4. Wpływ peptydów na transformację limfocytów T
Grupa Dawka N Wskaźnik stymulacji
CMS010 500 pg/kg 20 1,45 ± 0,21*$
CMS019 0,5 pg/kg 19 1,50 ± 0,19*$
CMS024 0,5 pg/kg 19 1,46 ± 0,19*$
CMS024 5 pg/kg 20 1,45 ± 0,21*$
CMS034 0,5 pg/kg 20 1,37 ± 0,10*$
CMS035 0,5 pg/kg 20 1,40 ± 0,13*$
CMS035 5 pg/kg 20 1,46 ± 0,16*$
rhIL-2 3 x 105 IU/kg 19 1,46 ± 0,21*
rmlFN-γ 3 x 105 IU/kg 18 1,27 ± 0,14
Cyklofosfamid 20 mg/kg 19 1,01 ± 0,23*
Roztwór soli 0,5 ml 20 1,25 ± 0,07
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05 $ w porównaniu do grupy otrzymującej cyklofosfamid, P < 0,05
Stwierdzono, że CMS010 przy 500 μg/kg/dzień, CMS019 przy 0,5 μg/kg/dzień, CMS024 przy 0,5 μg/kg/dzień i 5 μg/kg/dzień, oraz CMS035 przy 0,5 μg/kg/dzień i 5 μg/kg/dzień są w stanie podwyższyć wskaźnik stymulacji limfocytów T, z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05).
5. Wpływ peptydu na aktywność komórek NK u myszy BALB/c z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22 (Metoda 4.3)
T a b e l a IV.5. Wpływ peptydu na aktywność wskaźnika aktywności cytotoksycznej komórek NK
Grupa Dawka N Wskaźnik aktywności NK (%)
1 2 3 4
CMS003 500 pg/kg 17 37,9 ± 14,5*λ$
CMS014 0,5 pg/kg 17 40,7 ± 19,7*$
CMS024 0,5 pg/kg 18 39,3 ± 18,7*$
CMS024 5 pg/kg 20 34,9 ± 12,1*λ$
CMS024 50 pg/kg 20 43,6 ± 13,9*λ$&
CMS032 5 pg/kg 20 52,6 ± 12,5*λ$&
PL 208 666 B1 cd. tabeli IV.5
1 2 3 4
CMS032 50 pg/kg 19 41,0 ± 18,7*Λ$&
CMS034 50 pg/kg 20 57,3 ± 17,9*Λ$&
IL-2 3 x 105 IU/kg 19 26,0 ± 9,0
IFN-γ 3 x 105 IU/kg 18 20,9 ± 3,3
Cyklofosfamid 20 mg/kg 19 16,5 ± 7,2*
Roztwór soli 0,5 ml 20 24,0 ± 8,2
&
$ w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej rmIFN-γ, P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej rhIL, P < 0,05 w porównaniu do grupy otrzymującej cyklofosfamid, P < 0,05
Stwierdzono, że CMS003 przy 500 pg/kg/dzień, CMS014 przy 0,5 pg/kg/dzień, CMS024 przy 0,5 pg/kg/dzień, 5 pg/kg/dzień i 50 pg/kg/dzień oraz CMS034 przy 50 pg/kg/dzień były zdolne zwiększyć aktywność cytotoksyczną komórek NK w testowym modelu zwierzęcym, z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05).
6. Wpływ peptydu na przeżycie myszy DBA/2 z przeszczepioną białaczką L1210 (Metoda 5)
T a b e l a IV.6. Wpływ peptydu na wskaźnik przeżycia badanych zwierząt
Grupa Dawka N Dni przeżycia Wskaźnik przeżycia (%)
CMS019 0,5 pg/kg 20 21,1 ± 5,8* 26,8
CMS035 0,5 pg/kg 20 29,3 ± 15,4* 76,1
IL-2 3 x 105 IU/kg 20 32,0 ± 13,7* 92,3
IFN-γ 3 x 105 IU/kg 20 15,6 ± 2,2
Cyklofosfamid 20 mg/kg 20 24,0 ± 5,3* 44,2
Roztwór soli 0,5 ml 21 16,6 ± 5,6
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05
Stwierdzono, że CMS019 przy 0,5 pg/kg/dzień i CMS035 przy 0,5 pg/kg/dzień były zdolne do przedłużania przeżycia myszy DBA/2 z przeszczepioną białaczką L1210, z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05).
7. Wpływ peptydów na odporność humoralną myszy C57BL/6 z przeszczepionym czerniakiem B16 (Metoda 6.1)
T a b e l a IV.7. Wpływ peptydów na wskaźnik hemolizy myszy C57BL/6 z przeszczepionym czerniakiem B16
Grupa Dawka N Wskaźnik hemolizy
1 2 3 4
CMS001 0,5 pg/kg 20 51,0 ± 16,2*$
CMS001 5 pg/kg 20 41,3 ± 17,7*$
CMS001 50 pg/kg 19 45,0 ± 31,9*$
CMS001 500 pg/kg 20 36,0 ± 10,2*$
CMS003 0,5 pg/kg 20 61,6 ± 26,9*$
CMS003 5 pg/kg 20 37,2 ± 15,9*$
CMS003 50 pg/kg 20 38,7 ± 13,5*$
CMS003 500 pg/kg 20 35,9 ± 13,0*$
PL 208 666 B1 cd. tabeli IV.7
1 2 3 4
CMS008 0,5 pg/kg 19 42,7 ± 18,4*$
CMS008 5 pg/kg 20 38,9 ± 12,0*$
CMS008 50 pg/kg 20 37,1 ± 16,7*$
CMS008 500 pg/kg 20 50,1 ± 17,8*$
CMS010 0,5 pg/kg 18 34,9 ± 10,5*$
CMS010 5 pg/kg 20 51,0 ± 14,6*$
CMS010 50 pg/kg 20 39,6 ± 7,7*$
CMS010 500 pg/kg 20 50,1 ± 16,7*$
CMS011 0,5 pg/kg 20 32,0 ± 14,7*
CMS011 500 pg/kg 20 34,4 ± 19,4*
CMS016 500 pg/kg 20 43,3 ± 29,9*
CMS019 0,5 pg/kg 20 42,0 ± 12,0*$
CMS019 5 pg/kg 20 35,4 ± 15,1*$
CMS019 50 pg/kg 20 28,3 ± 7,6*
CMS024 0,5 pg/kg 20 43,0 ± 10,7*$
CMS024 5 pg/kg 20 42,2 ± 11,8*$
CMS024 50 pg/kg 20 27,8 ±9,1*
CMS024 500 pg/kg 18 30,1 ± 10,0*
CMS034 0,5 pg/kg 18 50,8 ± 18,4*$
CMS034 5 pg/kg 19 43,0 ± 11,7*$
CMS034 50 pg/kg 20 30,2 ± 10,9*
CMS035 5 pg/kg 20 38,9 ± 21,2*$
CMS035 50 pg/kg 20 44,7 ± 22,7*$
CMS035 500 pg/kg 19 40,5 ± 25,8*
rhIL-2 3 x 105 IU/kg 19 49,3 ± 24,7*
rmlFN-γ 3x 105 IU/kg 19 60,5 ± 17,4*
Cyklofosfamid 20 mg/kg 19 20,7 ± 19,1
Roztwór soli 0,5 ml 20 19,0 ± 9,1
* w porównaniu do grupy otrzymującej roztwór soli, P < 0,05 λ w porównaniu do grupy otrzymującej rmIFN-γ, P < 0,05 & w porównaniu do grupy otrzymującej rhIL, P < 0,05 $ w porównaniu do grupy otrzymującej cyklofosfamid, P < 0,05
Stwierdzono, że CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 i CMS035 są w stanie zwiększyć odpowiedź humoralną (zwiększyć wskaźnik hemolizy) myszy C57BL/6 z przeszczepionym czerniakiem B16 w dawkach przedstawionych w tabeli IV.7, z istotną statystycznie różnicy względem kontrolnej grupy otrzymującej roztwór soli (P < 0,05).
8. Wpływ peptydów na przeżycie komórek czerniaka B16 wszczepionych myszy C57BL/6 (Metoda 6.2)
Badania pośmiertne zwierząt po zakończeniu leczenia badanymi substancjami nie wykazało znaków istnienia ognisk przerzutowych B16 w płucach myszy leczonych CMS008 przy 0,5 μg/kg/dzień, 5 μg/kg/dzień i 50 μg/kg/dzień oraz CMS016 przy 5 μg/kg/dzień i 500 μg/kg/dzień.
PL 208 666 B1
Wnioski
Badano wpływ peptydów na myszy z przeszczepionymi komórkami nowotworowymi zgodnie z Preclinical New Drug Research Guidelines wydanym przez Branch of Drug Administration, Department of Health, ChRL w 1993. Wywnioskowano, że:
1. CMS010, CMS034 i CMS035 w odpowiednich dawkach mogą istotnie hamować rozwój przeszczepionego mięsaka S180 u myszy;
2. CMS001 i CMS034 w odpowiednich dawkach mogą zwiększać immunologiczne aktywności fagocytarne myszy z przeszczepionym mięsakiem S180;
3. CMS008, CMS011, CMS024 i CMS032 w odpowiednich dawkach mogą przedłużać przeżycie myszy z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22;
4. CMS010, CMS019, CMS024, CMS034 i CMS035 w odpowiednich dawkach mogą zwiększać transformację limfocytów T u myszy z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22;
5. CMS003, CMS014, CMS024, CMS032 i CMS034 w odpowiednich dawkach mogą zwiększać aktywność cytotoksyczną komórek NK myszy z przeszczepionym nowotworem wątroby typu płynu puchlinowego H22;
6. CMS019 i CMS035 w odpowiednich dawkach mogą przedłużać przeżycie myszy z przeszczepioną białaczką L1210;
7. CMS008 i CMS016 w odpowiednich dawkach mogą hamować rozwój przeszczepionego czerniaka B16 u myszy;
8. CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 i CMS035 w odpowiednich dawkach mogą wzmacniać odpowiedź humoralną u myszy z przeszczepionym czerniakiem B16.
Dyskusja
CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 mogą być użyteczne jako część składowa terapii lub samodzielnie w leczeniu nowotworów u ludzi. Przykładowo CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034 i CMS035 można stosować do zwiększenia odporności pacjentów nowotworowych. CMS008, CMS010, CMS016, CMS034 i CMS035 można stosować do oddziaływania na wzrost komórek nowotworowych u pacjentów. CMS008, CMS011, CMS019, CMS024, CMS032 i CMS035 można stosować do wydłużania średniej długości życia pacjentów z nowotworami. Peptydy można stosować samodzielnie lub w połączeniach dwóch lub większej liczby peptydów lub w połączeniach z innymi lekami lub dodatkami do żywności, w całkowitym przebiegu leczenia nowotworu.
T a b e l a IV.8. Peptydy skuteczne w chorobie nowotworowej
Kod CMS SEQ ID NO:
CMS001 1
CMS003 27
CMS008 3
CMS010 4
CMS011 30
CMS014 7
CMS016 9
CMS019 11
CMS024 16
CMS032 22
CMS034 24
CMS035 25
PL 208 666 B1
Literatura
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, ChRL. 1993, 7: 137-143
2. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, ChRL. 1993, 7: 128-129
3. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (wyd. drugie). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
4. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234
5. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, ChRL. 1993, 7: 140
6. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
7. Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Tao i in. The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hyperthermia-Experimental studies of mouse melanoma. Cancer Research on Prevention and Treatment. 1999, 26(4): 8-12
8. Jian Fu, Jie Zheng, Weigang Fang i in. Interleukin-12 gene transfection into murine B16 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic potential. National Medical Journal of China. 1998, 78(8): 627-629
9. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483
10. Qichao Pan, Bin Xu. Cancer pharmacology and chemotherapy. Henan medical university Publishing House. 2000, 66-69
11. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (wyd. drugie). People's Health Publishing House. 1998, 131.
V. Wpływ na masę ciała
Zdrowe szczury karmiono wysoko odżywczą dietą przez 5 tygodni, ewentualnie z równoczesnym podawaniem peptydu (domięśniowo 300 μg/kg/dzień). Szczury na normalnej diecie z zastrzykami z roztworu soli zastosowano jako kontrole negatywne. Po 5 tygodniach leczenia podawanie zastrzyków przerwano i utrzymywano tę samą dietę przez kolejne trzy tygodnie. Dane odnośnie masy ciała zbierano raz na tydzień. Obserwowano także zachowanie szczurów. U szczurów otrzymujących peptyd CMS015 stwierdzono istotny statystycznie mniejszy wzrost masy ciała w porównaniu z kontrolą podczas podawania peptydu. Ta tendencja obniżonej masy ciała stopniowo zanikała po przerwaniu leczenia CMS015. Wyciągnięto wniosek, że CMS015 w odpowiednich dawkach może odwracalnie regulować rozwój otyłości wywołany przekarmieniem.
Materia ły
Szczury Sprague-Dawley (SD), o masie 145 ± 10 g, otrzymano z Center of Experimental Animal of Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine, ChRL (certyfikat Nr: 2000A019). Peptydy zsyntetyzowano na zamówienie (z L-aminokwasów) w American Peptide Company, Inc., USA i rozcieńczono do 10 μg/ml w izotonicznym roztworze soli. Diety wysokoodżywczą i normalną przygotowano zgodnie z wytycznymi przedklinicznych badań leków na otyłość, wydanymi przez SDA (State Drug Administration), ChRL[1].
Metody
Zdrowe szczury losowo podzielono na grupy doświadczalną, pozytywnej kontroli i negatywnej kontroli; po 10 szczurów na grupę, połowa samców i połowa samic. Grupy doświadczalne szczurów karmiono dietą wysokoodżywczą przez 5 tygodni z równoczesnym dożylnym wstrzykiwaniem 300 μg/kg/dzień peptydu, raz na dzień. Grupa pozytywnej kontroli otrzymywała taką samą dietę wysokoodżywczą, ale zastrzyki placebo z roztworu soli, podczas gdy grupa kontroli negatywnej, stosowana do potwierdzenia pomyślnego wytworzenia modelu otyłości, otrzymywała normalną dietę i zastrzyki placebo z roztworu soli. Po 5 tygodniach leczenia, wstrzykiwanie przerwano i taką samą dietę utrzymywano przez kolejne 3 tygodnie. Szczury ważono raz na tydzień. Obserwowano także zachowanie szczurów.
Statystyka
Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Parzysty test t lub jednoczynnikowa ANOVA zastosowano do porównań między grupami i wewnątrz grup. Wartość odcięcia dla istotności statystycznej wynosiła P < 0,05.
Wyniki
1. Wpływ peptydu na masę ciała szczurów SD
PL 208 666 B1
T a b e l a V.1. Wpływ peptydu na masę ciała szczurów SD
Grupa pozytywnej kontroli (g) Grupa leczona CMS015 (g)
Samce n = 5 Samice n = 5 Samce n = 5 Samice n = 5
Wstępne leczenie 145,6 ± 13,6 133,6 ± 4,6 145,6 ± 8,5 129,2 ± 3,3
Tydzień 1 194,4 ± 14,5 164,4 ± 8,7 183,8 ± 10,6 157,8 ± 8,3
Tydzień 2 239,6 ± 13,4 188,0 ± 6,4 220,6 ± 12,2* 176,0 ± 11,2*
Tydzień 3 265,0 ± 11,8 208,8 ± 8,2 239,0 ± 16,0* 196,0± 10,5*
Tydzień 4 287,4 ± 17,7 227,2 ± 8,2 258,2 ± 18,1* 212,0 ± 13,5*
Tydzień 5 299,4 ± 21,2 236,6 ± 10,9 268,8 ± 17,7* 221,4 ± 13,2*
Tydzień 6 333,4 ± 27,1 249,4 ± 16,3 299,4 ± 21,2* 235,6 ± 16,3
Tydzień 7 349,2 ± 28,9 261,2 ± 13,4 310,4 ± 25,9* 242,2 ± 18,8*
Tydzień 8 374,4 ± 37,2 255,6 ± 11,5 337,4 ± 30,6 252,8 ± 22,5
w porównaniu z grupą pozytywnej kontroli: * p < 0,05
Stwierdzono, że w dawce 300 pg/kg/dzień, CMS015 jest zdolny do ograniczania przybierania na wadze w otyłości szczurów wywołanej przekarmieniem, z istotną statystycznie różnicą względem grupy kontrolnej (p < 0,05). Różnice pomiędzy grupą leczoną a kontrolną zwiększały się wraz z wydłużaniem leczenia. Po zakończeniu leczenia grupy leczonej peptydem CMS015 różnice pomiędzy grupą leczoną i kontrolną stopniowo zmniejszały się i stały się nieistotne statystycznie po trzech tygodniach, co wskazywało, że wpływ peptydu na masę ciała szczurów SD jest odwracalny.
Podczas całego przebiegu doświadczenia zaobserwowano, że apetyt i aktywność wszystkich grup szczurów pozostała normalna.
Dyskusja
Wywnioskowano, że CMS015 w odpowiednich dawkach może ograniczyć rozwój otyłości wywołanej przez przekarmienie. Peptyd można zacząć stosować u ludzi w celu kontrolowania otyłości. Peptydy można stosować samodzielnie, w połączeniu dwóch lub większej liczby peptydów lub w połączeniu z innymi lekami lub dodatkami do żywności w całym przebiegu leczenia otyłości.
W badaniach zastosowano podawanie w zastrzykach domięśniowych, ale nie wyklucza to możliwej skuteczności peptydu przy podawaniu innymi alternatywnymi drogami. Peptydy można podawać w zastrzykach dożylnych, zastrzykach domięśniowych, zastrzykach śródotrzewnowych, zastrzykach podskórnych lub implantach podskórnych ewentualnie ze środkiem ułatwiającym, takim jak liposomy, chroniące środki spowalniające uwalnianie itd. Peptyd można także podawać w jakiejkolwiek postaci do podawania doustnego, takiej jak tabletka, kapsułka, zawiesina, roztwór itd., w normalnej postaci bez modyfikacji lub w postaci do uwalniania spowolnionego, ewentualnie z chroniącą powłoczką żołądkowo-jelitową. Peptyd można dalej stosować w jakiejkolwiek postaci do podawania miejscowego, takiej jak maść, krem, żel itp., ewentualnie ze środkiem ułatwiającym podawanie przezskórne lub w postaci środka do inhalacji w proszku, rozpuszczonego lub w postaci chronionej liposomami. Peptyd może być także przetranslatowany do jego sekwencji genetycznej i wklonowany do układu ekspresyjnego, sam lub w połączeniu z innymi sekwencjami peptydowymi, w celu wytworzenia powstającej cząsteczki peptydowej do wykorzystania aktywności peptydu w sposób opisany w tym raporcie, po ewentualnym oczyszczaniu powstałego peptydu.
T a b e l a V.2. Peptydy skuteczne w otyłości
Kod CMS SEQ ID NO:
CMS015 8
Literatura
1. SDA, ChRL. The guideline for pre-clinical research of new drugs. 1993
Należy rozumieć, że może być możliwe dodanie dodatkowych aminokwasów do końca aminowego lub karboksylowego powyżej ujawnionych peptydów w jeszcze jednym sposobie realizacji wynalazku. Przykładowo jeden lub dwa aminokwasy można dodać do ujawnionego peptydu bez wpływu na
PL 208 666 B1 jego działanie biologiczne. Możliwe może być także dodanie trzech lub czterech aminokwasów i nadal utrzymanie działania peptydów. Wszystkie one nazywane są wariantami tego samego peptydu. Alternatywnie, jeden lub dwa aminokwasy można wydeletować z peptydu bez wpływu na jego aktywność biologiczną. Ponadto możliwe jest wydeletowanie trzech lub czterech aminokwasów bez wpływu na działanie biologiczne peptydów. Określa się je jako fragmenty opisanego peptydu. Ponadto pochodne peptydów, takie jak z konserwatywnym zastąpieniem aminokwasu innym w tej samej klasie działania, można zastosować w realizacji innej postaci wynalazku. Przykładowo w peptydach zawierających niepolarne lub hydrofobowe łańcuchy boczne można zamienić jedną grupą boczną na inną bez obniżania aktywności biologicznej. Dalej przykładowo, do peptydu można wstawić łącznik/grupę rozdzielającą z wytworzeniem wariantów, z tym że warianty nadal zachowują swoje ugrupowanie aktywne takie jak oryginalny peptyd stosowany w tych badaniach. Rozważa się także warianty peptydów. Analog peptydu w stosowanym tutaj znaczeniu obejmuje peptydy zawierające cząsteczki aminokwasowe naśladujące strukturę naturalnych aminokwasów, np. analog o innej strukturze szkieletu lub podstawienie D-aminokwasem. Dalej przykładowo, pomimo tego, że aminokwasy zastosowane do syntezy peptydów są w postaci ich izomerów optycznych L, peptydy z jednym lub większą liczbą aminokwasów w sekwencji podstawionych formą D mogą wykazywać podobne aktywności biologiczne. Określenie „funkcjonalna pochodna” stosowane w opisie i w zastrzeżeniach patentowych obejmuje fragmenty, warianty, analogi lub chemiczne pochodne peptydu.
Stosowane tu określenie „peptyd hybrydowy” odnosi się do peptydów zawierających dodatkowe peptydy wstawione do oryginalnych biologicznie czynnych peptydów o SEQ. ID NO: 1 - 30 lub ich funkcjonalnych pochodnych, ale nadal zachowujących zasadniczo podobną aktywność. Dodatkowe peptydy obejmują peptydy liderowe, które zawierają np. sekwencję aminokwasów rozpoznawaną przez jedną lub większą liczbę komórek prokariotycznych lub eukariotycznych jako sygnał do wydzielania peptydu hybrydowego na zewnątrz komórki. Wydzielanie może być wydzieleniem bezpośrednim lub pośrednim przez pęcherzyki wydzielnicze.
„Zasadniczo czysty peptyd” dotyczy peptydów, które są co najmniej w 10% (wag.) czyste, korzystniej w 20%, jeszcze korzystnej w 40% oraz jeszcze korzystniej w 60%, a jeszcze znacznie korzystniej w 90% czyste. W najkorzystniejszej postaci czystość wynosi ponad 99%. Zasadniczo czysty peptyd można stosować do wytwarzania środków farmaceutycznych i odżywczych, które mogą być złożonymi mieszankami, jak opisano poniżej.
Wyżej zidentyfikowane peptydy, zastosowane w środkach farmaceutycznych, można ewentualnie stosować w leczeniu immunologicznych zaburzeń lub chorób wywierających wtórne działanie na odporność, np. nowotworów lub zakażeń lub jakichkolwiek z wyżej wymienionych stanów. Środki mogą zawierać jeden ze zidentyfikowanych peptydów zmieszany z innymi aktywnymi lub nieaktywnymi składnikami, włącznie z innymi peptydami. Przykładowo od dwóch do kilku (np. 3-5) z wymienionych peptydów można dodać do tego samego środka, ewentualnie z innymi dodatkami. Alternatywnie, jeden z powyższych peptydów można stosować do wytwarzania środka razem z peptydami nie wymienionymi tutaj. Można je podawać w postaci dożylnej, domięśniowej, śródskórnej, podskórnej lub doskórnej. Sposobem podawania może być także iniekcja do tętnicy prowadzącej bezpośrednio do narządu, w którym występuje problem. Inne sposoby podawania obejmują podawanie przezskórne, inhalacje proszku lub rozpylonego płynu oraz inne sposoby podawania znane fachowcom. Środki można także przyjmować doustnie oraz mogą one zawierać nośniki, które można stosować do zapobiegania strawieniu peptydu w żołądku po doustnym przyjęciu lub inne nośniki znane w dziedzinie wynalazku (do podawania przezskórnego takie jak liposomy).
Środek farmaceutyczny może zawierać dowolny ze znanych nośników farmaceutycznych. Do przykładowych odpowiednich nośników należy dowolny ze zwykłych farmaceutycznie zaakceptowanych nośników, znanych fachowcom. Obejmują one, ale nie tylko, roztwór soli, wodę, emulsje, włącznie z mieszaninami olejowymi i wodnymi oraz emulsje triglicerydowe, a także inne rodzaje środków, wypełniaczy, powlekanych tabletek, kapsułek. Odpowiedni nośnik można wybrać w oparciu o sposób podawania środka farmaceutycznego.
Peptydy można podawać w zastrzykach dożylnych, zastrzykach domięśniowych, zastrzykach śródotrzewnowych, zastrzykach podskórnych lub implantach podskórnych. Peptyd można także podawać w jakiejkolwiek postaci do podawania doustnego, takiej jak tabletka, kapsułka, zawiesina, roztwór itd., w zwykłej postaci bez modyfikacji lub w postaci o powolnym uwalnianiu, ewentualnie z ochronną powłoczką żołądkowo-jelitową. Peptyd można ponadto stosować w dowolnej postaci do podawania miejscowego, takiej jak maść, krem, żel itd., ewentualnie ze środkiem ułatwiającym poda44
PL 208 666 B1 wanie przezskórne. Peptyd może być także przetranslatowany do swojej sekwencji genetycznej i wklonowany do układu ekspresyjnego, sam lub w połączeniu z innymi sekwencjami peptydowymi, w celu wytworzenia powstającej cząsteczki peptydowej do wykorzystania aktywności peptydu w sposób opisany w tym raporcie.
Dawka każdego peptydu może wynosić 1 ng - 10 g na kg masy ciała. Korzystną dawką jest 10 ng - 10 mg na kg, korzystniej 1 μg - 1 mg na kg przy podawaniu w zastrzykach. Jednakże, skuteczna dawka może wynosić zaledwie 1 ng/kg masy ciała, gdyż jeden lub większą liczba peptydów może działać przez receptory indukujące kaskadę normalnej odpowiedzi fizjologicznej. Alternatywnie, jeden lub większą liczba peptydów może być inicjatorem całej kaskady reakcji. Przy podawaniu doustnym, dawką może wynosić 1 ng - 10 g na dzień na kg masy ciała, korzystniej 0,1 μg - 1 g na dzień na kg masy ciała, korzystniej 1 μg - 10 mg na dzień.
VI. Terapia genowa i sposób leczenia
Terapię genową opartą na odkrytych sekwencjach peptydowych przeprowadza się przez zaprojektowanie sekwencji kwasu nukleinowego kodującej jeden z peptydów. Kwas nukleinowy można zsyntetyzować chemiczne i funkcjonalnie zligować z promotorem oraz wklonować do wektora ekspresyjnego. Następnie wektor ekspresyjny podaje się do organizmu pacjenta w terapii genowej do ekspresji w komórkach ludzkich. Stosowane tu określenie „wektory genetyczne” obejmuje te wektory ekspresyjne. Wektory, które można stosować w terapii genowej obejmują wirus adenosatelitarny (Mizuno M. i in., (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), wektory LNSX (Miller A. D. i in., (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) oraz lentiwirusy (Goldman M. J. i in. (1997), Hum Gene Ther 8, 2261-2268).
Inne nośniki do dostarczania peptydów obejmują wektory ekspresyjne kodujące wymagany peptyd, które mogą być wtransfekowane do organizmu, który może replikować się w organizmie gospodarza, do którego pożądane jest podanie peptydu, bez znaczącego szkodliwego działania na zdrowie organizmu gospodarza. Przykładowo wektory ekspresyjne można przenieść do organizmu, który nie jest patogenem dla organizmu gospodarza do którego korzystne jest podanie peptydu. W pewnych postaciach wektor ekspresyjny wytwarza wymagany peptyd w organizmie bakteryjnym lub grzybowym, co nie wywołuje żadnego szkodliwego działania na zdrowie organizmu gospodarza do którego ma być podany peptyd. Przykładowo wektor ekspresyjny kodujący wymagany peptyd może być wektorem ekspresyjnym wytwarzającym wymagany peptyd w organizmie, takim jak bakteria kwasu mlekowego, E. coli lub drożdże. W jednej postaci wektor ekspresyjny wytwarza wymagany peptyd w mikroorganizmie normalnie znajdywanym w jelicie ssaków lub mikroorganizmie tolerowanym przez przewód pokarmowy ssaków. Niektóre gatunki mikroorganizmów w których może być eksprymowany wymagany peptyd obejmują, ale nie tylko, gatunki Lactobacillus, takie jak L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus lub inne; gatunki Bifidobacterium, takie jak B. adolescentis, B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum oraz inne; Enterococcus faecalis lub Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis lub Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; lub Saccharomyces cerevisiae lub Saccharomyces boulardii.
Sekwencje kwasów nukleinowych kodujące opisane peptydy, zsyntetyzowane chemiczne lub wytworzone w inny sposób, włącznie z, ale nie tylko, odwrotną transkrypcją mRNA z wytworzeniem cząsteczek cDNA, wprowadza się do wektorów ekspresyjnych do przenoszenia genów do wymaganych organizmów metodami inżynierii genetycznej, znanymi fachowcom. Wektory ekspresyjne mogą być wektorami DNA lub wektorami RNA. Przykładowo wektory ekspresyjne mogą być oparte na plazmidowych lub wirusowych elementach genetycznych. Wektory ekspresyjne mogą być wektorami replikującymi się poza chromosomem lub wektorami, które integrują się do chromosomu.
Wektory ekspresyjne zawierają promotor funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym kodującym opisany peptyd. Promotorem może być regulowany promotor, taki jak indukowalny promotor lub konstytutywny promotor. W pewnych postaciach promotor może być wybrany tak by dostarczył wymagany poziom ekspresji peptydu. Ponadto, gdy jest to wymagane, wektory ekspresyjne mogą zawierać inne sekwencje pomagające w wytwarzaniu, prezentacji i/lub wydzielaniu peptydów. W pewnych postaciach kwas nukleinowy kodujący opisany peptyd jest funkcjonalnie połączony z sekwencją kwasu nukleinowego kierującą wydzielaniem peptydu. Przykładowo kwas nukleinowy kodujący opisany peptyd może być funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym kodującym peptyd sygnałowy.
W pewnych postaciach, wektory ekspresyjne, które wytworzono metodami inżynierii genetycznej, tak by eksprymowały opisane peptydy, mogą być wektorami ekspresyjnymi zaadaptowanymi do ekspresji opisanego peptydu w gatunku bakterii tworzącym normalną florę jelita ssaków, takim jak
PL 208 666 B1 gatunki Lactobacillus i Bacillus subtilis. Przykłady takich wektorów ekspresyjnych można znaleźć w opisach patentowych odpowiednio US nr 6100388 (Casas) i US nr 5728571 (Bellini). Należy zdawać sobie sprawę, że można zastosować dowolny wektor ekspresyjny ułatwiający ekspresję opisanego peptydu w organizmie, który nie jest szkodliwy dla zdrowia organizmu gospodarza któremu ma być podany peptyd.
W pewnych postaciach, wektorami ekspresyjnymi zmodyfikowanymi metodami inżynierii genetycznej, tak by kodowały opisane peptydy, mogą być wektory ekspresyjne zaadaptowane do ekspresji opisanego peptydu w gatunku drożdży, który jest dobrze tolerowany w jelicie ssaków, takim jak Saccharomyces cerevisiae; lub, korzystnie, Saccharomyces boulardii, który może kolonizować ludzkie jelito i jest stosowany w leczeniu pewnych postaci biegunki. Można stosować drożdżowe wektory ekspresyjne, które konstytutywnie eksprymują heterologiczne białka i peptydy i są wysoce stabilne, zatem są dobrze przenoszone do komórek potomnych podczas mitozy i mejozy i mogą zawierać sekwencję kodującą peptyd lub peptydy sygnałowe kierujące wydzielaniem dużych ilości zrekombinowanego białka. Przykład takiego drożdżowego wektora podano w opisie patentowym US nr 6391585 (Jang i in).
Wektory ekspresyjne kodujące opisane peptydy można wprowadzać znanymi sposobami do organizmu, w którym mają ulegać ekspresji peptydy. Sposoby te obejmują tradycyjne metody transformacji bakterii, drożdży i innych mikroorganizmów, przy zastosowaniu, np., chemiczne kompetentnych komórek bakteryjnych, elektroporacji lub transformacji octanem litu (w przypadku drożdży), a także ostatnich osiągnięć w transformacji gatunków bakterii opornych względem tych metod. W pewnych postaciach, wektory ekspresyjne wprowadza się do bakterii kwasu mlekowego, które są znane jako oporne na transformację, metodą ujawnioną przez Leer'a i in. (WO 95/35389). Wprowadzone sekwencje mogą być wprowadzone do DNA chromosomalnego mikroorganizmu lub mogą pozostać jako pozachromosomalne elementy DNA.
Następnie ten genetycznie modyfikowany mikroorganizm zawierający wektor ekspresyjny może być wszczepiony do przewodu pokarmowego, pochwy, tchawicy itd. w celu osiągnięcia przedłużonej immunoterapii. W pewnych postaciach, organizmy eksprymujące opisane peptydy spożywa się w postaci nieaktywnej lub, korzystnie, w postaci żywej. W jelicie te mikroorganizmy wytwarzają wspomniane peptydy, uwalniają je do światła przez wydzielanie lub przez lizę mikroorganizmu lub w inny sposób prezentują peptydy gospodarzowi, przy czym peptydy wywierają swe zamierzone działanie na organizm gospodarza. W innych postaciach, peptydy są prezentowane gospodarzowi na błonie śluzowej przewodu nosowego, pochwy lub jelita cienkiego.
Innym sposobem leczenia jest stosowanie liposomów jako środków do dostarczania specyficznych kwasów nukleinowych do komórek w ludzkim organizmie. Kwas nukleinowy (taki jak wektor ekspresyjny zawierający sekwencję nukleinową kodująca peptydy o SEQ ID NO: 1 do SEQ ID NO: 30) dostarcza się w środowisku pobudzającym pobieranie przez komórki i włączanie do chromosomu, jak opisano w Gao X. i Huang L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 oraz opisie patentowym US nr 6207456. Alternatywnie, sam peptyd może być zamknięty w liposomie i podawany bezpośrednio, metodą opisaną w opisie patentowym US nr 6245427.
Sekwencje kwasów nukleinowych użyteczne w wymienionej powyżej terapii genowej oraz sposobie leczenia obejmują sekwencje kodujące te peptydy oraz ich funkcjonalne pochodne. Dowolna z wielu sekwencji kwasu nukleinowego może być zastosowana do kodowania tych peptydów i ich pochodnych w oparciu o system zdegenerowanych kodonów.
Literatura
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, ChRL. 1993, 7: 134-135
2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234
3. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, ChRL. 1993, 7: 140
4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
5. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483
6. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, ChRL. 1993, 7: 141
7. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, ChRL. 1993, 7: 132-133
8. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, ChRL. 1993, 7: 128-129
9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Phamalogical experiment (wyd. drugie). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
PL 208 666 B1
10. Jiatai Li, Clinical pharmacology (wyd. drugie). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.
P r z y k ł a d 1
Dostarczanie peptydów przez genetycznie modyfikowane gatunki bakterii Lactobacillus
Poniżej przedstawiono jeden przykładowy sposób dostarczania opisanych peptydów gospodarzowi, jak opisano powyżej. Sekwencję DNA kodującą jeden z peptydów wymienionych w powyższej tabeli A syntetyzuje się drogą chemiczną i tę sekwencję DNA wstawia się do wektora ekspresyjnego z zastosowaniem zwykłych metod inżynierii genetycznej znanych fachowcom. Wybrany wektor ekspresyjny zawiera konstytutywny promotor działający u Lactobacilli, miejsce wielokrotnego klonowania do wprowadzenia sekwencji DNA w specyficznej orientacji 5' do 3', a także gen kodujący marker selekcyjny niosący oporność na antybiotyk (aby ułatwić procedury klonowania), a ponadto może zawierać inne sekwencje pomagające w wytwarzaniu i/lub wydzielaniu peptydów, takie jak sekwencje peptydu sygnałowego. Przykład takiego wektora podano w opisie patentowym US nr 5592908 (Pavla). W skrócie, w tym opisie patentowym opisano kilka znanych promotorów działających w gatunkach Lactobacillus, a także sposób odkrywania nowych promotorów we wspomnianych bakteriach, z których dowolny może być funkcjonalnie połączony z kwasem nukleinowym kodującym opisany peptyd do ekspresji peptydu w Lactobacilli. Kwas nukleinowy kodujący peptyd sygnałowy, taki jak peptydy zawierające 16 - 35 głównie hydrofobowych aminokwasów, które są aktywne w Lactobacillus lactis, opisano w opisie patentowym US nr 5529908, przytoczonym powyżej, wstawia się pomiędzy promotor i kwas nukleinowy kodujący opisany peptyd, tak że kwas nukleinowy kodujący peptyd sygnałowy jest w ramce odczytu z kwasem nukleinowym kodującym ten peptyd.
Dodatkowo oprócz sekwencji kodującej peptyd, syntetyzowana sekwencja DNA może zawierać sekwencje ułatwiające ligację i wklonowanie wspomnianego DNA do wektora ekspresyjnego. Przykładowo miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne odpowiadające takim, które znajdują się w miejscu wielokrotnego klonowania wektora, mogą być wprowadzone do syntetyzowanego DNA na 5' i 3' końcu sekwencji, tak aby sekwencja mogła być wklonowana do wektora w prawidłowej orientacji. Zarówno wektor, jak i zsyntetyzowany DNA trawi się konkretnymi enzymami restrykcyjnymi, a następnie oczyszcza. Po reakcjach ligacji wektora z zsyntetyzowanym DNA przeprowadza się transformację do odpowiedniego szczepu E. coli. Transformowane bakterie wysiewa się na pożywkę zawierającą antybiotyk na który wektor niesie oporność. Kolonię transformowanych bakterii wybiera się do hodowli wzrostowych i oczyszczania plazmidu; potwierdza się obecność zsyntetyzowanego DNA w poprawnej orientacji.
Następnie wektor ekspresyjny transformuje się do bakteryjnej komórki gospodarza gatunku Lactobacillus, takiego jak L. acidophilus. Transformowane komórki selekcjonuje się za pomocą markera selekcyjnego znajdującego się w sekwencji wektora i wydzielanie peptydu można potwierdzić przez wykonanie analizy western blot, przeprowadzenie elektroforezy w żelu peptydów obecnych w pożywce hodowlanej lub innymi zwykłymi metodami. Transformowane kolonie bakterii wybiera się i stosuje do przygotowania hodowli na dużą skalę genetycznie modyfikowanych bakterii. Prowadzi się hodowlę genetycznie modyfikowanych bakterii eksprymujących wymagany peptyd i co najmniej jej część podaje się do przewodu pokarmowego, pochwy, tchawicy lub innego obszaru organizmu gospodarza w którym bakterie są zdolne do replikacji. Gdy jest to wymagane, hodowle bakteryjne można traktować w różnoraki sposób, w celu wytworzenia dodatku do jelitowego przyjmowania przez gospodarza. To traktowanie obejmuje liofilizację lub inne metody konserwacji bakterii, dodatkowo oprócz łączenia bakterii ze środkami nośnikowymi, takimi jak roztwory, rozpuszczalniki, środki dyspergujące, środki opóźniające, emulsje itd. Zastosowanie tych środków do przygotowywania dodatków jest dobrze znane. Przykładowo bakterie można stosować do produkcji produktów mlecznych z kulturami bakterii lub innych artykułów spożywczych do spożywania dla ludzi tak, że organizm eksprymujący peptyd kolonizuje jelito organizmu gospodarza. Wiele różnych sposobów wprowadzania określonych szczepów bakterii kwasu mlekowego do artykułów spożywczych, takich jak jogurt, kimczi, ser i masło, ujawniono w opisie patentowym US nr 6036952 (Oh). Po spożyciu bakterii jedną z jakiejkolwiek liczby dróg, zmodyfikowane genetycznie organizmy mogą kolonizować jelito i umożliwiać prezentację i/lub absorpcję opisanych peptydów przez błonę śluzową jelita.
P r z y k ł a d 2
Dostarczanie peptydów przez genetycznie modyfikowane Bacillus subtilis
Poniżej przedstawiono kolejny przykładowy sposób dostarczania opisanych peptydów gospodarzowi, jak opisano powyżej. Sekwencję DNA kodującą jeden z peptydów wymienionych powyżej w tabeli A syntetyzuje się na drodze chemicznej i tę sekwencję DNA wstawia się do wektora eksprePL 208 666 B1 syjnego zwykłymi metodami inżynierii genetycznej, przy czym wszystkie te metody są znane. Wybrany wektor ekspresyjny zawiera wektor wahadłowy, taki jak pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), który może być propagowany zarówno w E. coli, jak i B. subtilis, zawierający gen oporności antybiotykowej do selekcji kolonii transformowanych bakterii. Wektor ten może zawierać konstytutywny promotor aktywny w B. subtilis, taki jak promotor wyprowadzony z genu Sac B B. subtilis, a także sekwencję nukleotydów kodującą peptyd sygnałowy lub peptyd liderowy aktywny w B. subtilis, który kieruje wydajnym eksportem eksprymowanych heterologicznych białek z komórki bakteryjnej. Przykład takiego wektora ujawniono w opisie patentowym US nr 6268169 (Fahnestock). W skrócie, jak opisano szczegółowo powyżej, DNA kodujący opisany peptyd syntetyzuje się z miejscami dla enzymów restrykcyjnych i/lub innymi sekwencjami ułatwiającymi klonowanie DNA, metodami znanymi fachowcom. Po transformacji do E. coli, wysianiu, selekcji i propagacji plazmidu do wytworzenia podstawowego plazmidu, plazmid transformuje się do B. subtilis i transformanty selekcjonuje się pod względem odporności na antybiotyk w podłożu do wysiewania.
Wytwarzanie peptydów w genetycznie modyfikowanych B. subtilis oraz ich wydzielanie potwierdza się metodami dobrze znanymi fachowcom, takimi jak znakowanie radioaktywne peptydów do autoradiograficznego wykrywania po analizie SDS-PAGE lub na podstawie analizy Western blotting.
Hodowlę genetycznie modyfikowanych bakterii hoduje się i co najmniej ich część podaje się do przewodu pokarmowego, pochwy, tchawicy lub innego obszaru organizmu gospodarza w którym bakterie mogą się replikować.
P r z y k ł a d 3
Dostarczanie peptydów przez genetycznie modyfikowane gatunki drożdży Saccharomyces
Poniżej przedstawiono kolejny przykładowy sposób dostarczania opisanych peptydów gospodarzowi, jak opisano powyżej. Sekwencję DNA kodującą jeden z peptydów wymienionych powyżej w tabeli A syntetyzuje się na drodze chemicznej i tę sekwencję DNA wstawia się do wektora ekspresyjnego zwykłymi metodami inżynierii genetycznej, z których wszystkie znane są w dziedzinie wynalazku. Wybrany wektor ekspresyjny stanowi wektor stabilnie utrzymywany w drożdżach wektor do ekspresji białek, zawierający konstytutywny promotor drożdżowy, taki jak pADH1, miejsca do replikowania wektora zarówno w drożdżach, jak i E. coli, gen lub geny przywracające prototrofię auksotroficznym mutantom drożdży w celu selekcji, miejsce wielokrotnego klonowania (MCS) oraz, gdy jest to wymagane, sekwencje kodujące peptyd sygnałowy. Wektory tego typu są dostępne w handlu i są dobrze znane lub mogą być łatwo konstruowane zwykłymi metodami. Po wstawieniu zsyntetyzowanego DNA do wektora drożdżowego, transformacji do E. coli, wysianiu transformowanych E. coli na podłożu selekcyjnym, selekcji transformowanej kolonii bakteryjnej oraz wypreparowaniu DNA plazmidowego z hodowli wzrostowej bakterii ze wspomnianej kolonii, wektor transformuje się do Saccharomyces cerevisiae dobrze znanymi metodami, takimi jak transformacja z użyciem octanu litu lub elektroporacja. Szczep Saccharomyces cerevisiae wybrany do transformacji jest szczepem auksotroficznego mutanta, który wymaga genu na plazmidzie do wzrostu na płytkach z podłożem minimalnym. Transformowane kolonie drożdży izoluje się przez wysianie drożdży do podłoża wzrostowego, w którym brak jest produktu kodowanego przez gen dostarczany na wektorze. Tylko te drożdże, które otrzymały wektor i jego gen selekcyjny oraz eksprymują produkt tego genu będą zdolne do wzrostu do kolonii na podłożu minimalnym. Potwierdzenie wydzielania peptydu można uzyskać przez przeprowadzenie analizy Western blot, przeprowadzenie elektroforezy w żelu peptydów obecnych w podłożu wzrostowym lub innymi zwykłymi metodami.
Transformowaną kolonię drożdży wybiera się i stosuje do przygotowania hodowli na dużą skalę. Hodowlę genetycznie modyfikowanych drożdży eksprymujących wymagany peptyd hoduje się i co najmniej jej część podaje się do przewodu pokarmowego, pochwy, tchawicy lub innego obszaru organizmu gospodarza w którym bakterie mogą się replikować. Gdy jest to wymagane hodowle drożdżowe można traktować w różnoraki sposób w celu wytworzenia dodatku do jelitowego przyjmowania przez gospodarza. To traktowanie obejmuje liofilizację lub inne metody konserwacji drożdży, dodatkowo oprócz łączenia bakterii ze środkami nośnikowymi, takimi jak roztwory, rozpuszczalniki, środki dyspergujące, środki opóźniające, emulsje itd. Zastosowanie tych środków do wytwarzania dodatków jest dobrze znane. W innej postaci, transformowane drożdże stosuje się do wytwarzania produktów spożywczych, takich jak produkty z fermentowanego mleka, jak jogurt i kefir, metodami znanymi fachowcom. Tak jak żywe hodowle bakterii kwasu mlekowego w tych artykułach spożywczych, transformowane drożdże mogą kolonizować jelito co najmniej przejściowo i służyć do prezentowania peptydów gospodarzowi przez światło jelita.
PL 208 666 B1
Wykaz sekwencji <110> Wong, Wai Ming Lin, Gang <120> Środek farmaceutyczny zawierający peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu <130> WILKG3.001CP1 <140> Nieznany <141>.2002-06-20 <150> 09/904,492 <151> 2001-07-13 <160> 30 <170> FastSEQ dla Windows wersja 4.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 1
Pro Thr Thr Lvs Thr Tvr Phe Pro His Phe ‘ J 5 10 <210> 2 <211> 9 <212> PR?
<213> Sas scrofa <400> 2
Val Val Tvr Pro Trp Thr Gin Arg Phe 1 ' 5 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 3
Lys Ala Val Glv His Leu Asp Asp Leu Pro Gly Ala Leu 1 ‘5 10 <210> 4
PL 208 666 B1 <211> 18 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 4
Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu Leu Thr Glu Ala Pro Leu Asn 15 10 15
Pro Lys <210> 5 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400 5
Leu Gly Met Glu Ala Cys Gly Ile His Glu Thr Thr Tyr 15 10 <210> 6 <211> 11 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 6
Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Val Leu 15 10 <210> 7 <211> 12 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 7
I*
Ala Ala His His Pro Asp Asp Phe Asn Pro Ser Val. 1 5 ' 10 <210 8 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400 8
Pro Ser Ile Val Gly Arg Pro Arg His Gin Gly Val Met 15 10 <210> 9
PL 208 666 B1 <211> 13 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 9
Ile Gly Met Glu Ser Ala Gly Ile His Glu 10
1 5
<210> 10
<211> 9
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 10
Val Gly Met Gly Glu Lys Asp Ser Tyr
1 5
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 11
Val Gly Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<4C0> 12
Val C-l .y Met Gly Gin Lys Asp Ser Tyr Val
1 5 10
<210> 13
<211> 10
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 13
Met Al .a Thr Ala Ala Ser Ser Ser Ser Leu
5 10 <210> 14 <211> 3 <212> PRT
PL 208 666 B1 <213> Sus scrofa <400> 14 Tyr Ser Phe <210> 15 <211> 3 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 15 Ala Ala Phe <210> 16 <211> 3 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 16 Tyr Ser Leu <210> 17 <211> 7 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 17
Thr Thr Tyr Asn Ser Ile Me
1 5
<210> 13
<211> 5
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400> 18
Phe Glu Glu Asn Met
5 <210> 19 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa
PL 208 666 B1 <400> 19
Phe Glu Pro Ser Phe 1 5 <210> 20 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 20
Phe Asn Glu Glu <210> 21 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 21
Phe Glu Glu Met <210> 22 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 22
Phe Glu Glu Glu <210> 23 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 23
Phe Glu Ser Phe <210> 24 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 24
Pro Glu Asn Phe
PL 208 666 B1 <210 25 <211> 4 <212> PRT <213> Sus scrofa <400 25
Phe Val Asn Asp . 1 <210 26 <211> 5 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 26
Phe Gin Pro Ser Phe
1 5
<210> 27
<211> 6
<212> PRT
<213> Sus scrofa
<400 27
Phe Asn Phe Val Pro
5 <210> 28 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 28
Ala Gly Aso Asp Ala Pro Arg Ala 7al Ph 1*5 10 <210 29 <211> 11 <212> PRT <213> Sus scrofa <400 29
Leu Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu 15 10
PL 208 666 B1 <210> 30 <211> 10 <212> PRT <213> Sus scrofa <400> 30
Arg Val Ala Pro Glu Glu His Pro Thr Leu

Claims (28)

1. Środek farmaceutyczny, znamienny tym, że zawiera peptyd składający się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 16, przy czym czystość tego peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych.
2. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
3. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
4. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
5. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
6. Środek farmaceutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
7. Sposób wytwarzania środka farmaceutycznego, znamienny tym, że dostarcza się peptyd składający się z sekwencji aminokwasów SEQ ID. NO: 16, przy czym czystość tego peptydu wynosi co najmniej 10% wag.; oraz miesza się ten peptyd z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
9. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
11. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
12. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
13. Zastosowanie peptydu składającego się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 16 do wytwarzania leku do leczenia nowotworu, przy czym czystość tego peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych.
14. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
15. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
16. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
17. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
18. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
19. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym ten lek moduluje wzrost nowotworu.
20. Zastosowanie według zastrz. 13, w którym nowotworem jest nowotwór wątroby lub wzrost czerniaka.
PL 208 666 B1
21. Zastosowanie peptydu składającego się z sekwencji aminokwasów SEQ ID NO: 16 do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń immunologicznych, przy czym czystość tego peptydu wynosi co najmniej 10% wagowych.
22. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 20% wagowych.
23. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 40% wagowych.
24. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 60% wagowych.
25. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 90% wagowych.
26. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym czystość peptydu wynosi co najmniej 99% wagowych.
27. Zastosowanie według zastrz. 21, w którym lek moduluje aktywność immunologiczną.
28. Zastosowanie według zastrz. 27, w którym aktywność immunologiczna jest wybrana z grupy obejmującej aktywność cytotoksyczną komórek NK, tworzenie przeciwciała przeciw SRBC po prowokacji antygenem, aktywność fagocytową fagocytów jednojądrzastych, wpływ na masę grasicy i wpływ na masę śledziony.
PL368059A 2001-07-13 2002-07-11 Środek farmaceutyczny zawierający peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu PL208666B1 (pl)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90449201A 2001-07-13 2001-07-13
PCT/GB2002/003203 WO2003006492A2 (en) 2001-07-13 2002-07-11 Biologically active peptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL368059A1 PL368059A1 (pl) 2005-03-21
PL208666B1 true PL208666B1 (pl) 2011-05-31

Family

ID=25419251

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL368059A PL208666B1 (pl) 2001-07-13 2002-07-11 Środek farmaceutyczny zawierający peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu
PL383101A PL211884B1 (pl) 2001-07-13 2002-07-11 Peptyd, środek farmaceutyczny zawierający ten peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL383101A PL211884B1 (pl) 2001-07-13 2002-07-11 Peptyd, środek farmaceutyczny zawierający ten peptyd, sposób wytwarzania środka farmaceutycznego i zastosowanie peptydu

Country Status (24)

Country Link
EP (3) EP1790655B1 (pl)
JP (3) JP4213581B2 (pl)
KR (2) KR100889993B1 (pl)
AT (2) ATE466871T1 (pl)
AU (1) AU2002319423B2 (pl)
BR (1) BR0210252A (pl)
CA (2) CA2452417C (pl)
DE (2) DE60229883D1 (pl)
DK (2) DK1478659T3 (pl)
ES (2) ES2345842T3 (pl)
HK (2) HK1066552A1 (pl)
IL (2) IL159827A0 (pl)
MX (1) MXPA03011190A (pl)
MY (1) MY138219A (pl)
NO (2) NO332061B1 (pl)
NZ (3) NZ553507A (pl)
PL (2) PL208666B1 (pl)
PT (2) PT1790655E (pl)
RU (2) RU2425053C2 (pl)
SA (1) SA04240478B1 (pl)
SG (2) SG185137A1 (pl)
UA (1) UA83989C2 (pl)
WO (1) WO2003006492A2 (pl)
ZA (2) ZA200401108B (pl)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1216069C (zh) 2001-07-13 2005-08-24 一泰医药研究（深圳）有限公司 序列号25的生物活性肽
WO2004055042A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-01 Pepharm R & D Limited Biologically active peptide conjugates
TWI322815B (en) * 2003-06-26 2010-04-01 Cms Peptides Patent Holding Company Ltd Biologically active peptide comprising tyrosyl-seryl-valine (ysv)
TWI353252B (en) * 2004-04-28 2011-12-01 Cms Peptides Patent Holding Company Ltd Biologically active peptide vapeehptllteaplnpk der
CN1799623B (zh) * 2005-01-05 2011-01-26 康哲医药研究(深圳)有限公司 生物活性肽在制备用于防治关节炎的药物中的用途
US8586525B2 (en) 2005-07-26 2013-11-19 Cms Peptides Patent Holding Company Limited Biologically active peptides and their new uses
GB0918579D0 (en) * 2009-10-22 2009-12-09 Imp Innovations Ltd Gadd45beta targeting agents
RU2615908C1 (ru) * 2016-05-16 2017-04-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы В16 у белых нелинейных крыс

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242821A (en) 1989-07-10 1993-09-07 Valio, Finnish Co-Operative Dairies' Association Lactococcus promoter and signal sequences for expression in bacteria
IT1231156B (it) 1989-07-19 1991-11-19 Eniricerche Spa Espressione e secrezione di interleuchina 1 beta umana matura in bacillus subtilis e mezzi e metodi per il suo ottenimento.
AU7142391A (en) * 1989-12-22 1991-07-24 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Synthetic peptides as modulators of functional responses of intact cells
US5556744A (en) * 1992-05-29 1996-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients
WO1994029450A2 (en) 1993-06-15 1994-12-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Novel, recombinantly produced spider silk analogs
JP3286420B2 (ja) 1993-09-28 2002-05-27 株式会社ユニシアジェックス 内燃機関の吸排気弁駆動制御装置
JPH10503643A (ja) 1994-06-17 1998-04-07 ネーデルランセ オルハニサチエ フォール トゥーヘパスト−ナツールウェーテンシャッペルック オンデルズク テーエヌオー 微生物中に遺伝物質を導入する方法およびその方法によってえられる形質転換体
US6184208B1 (en) 1994-06-29 2001-02-06 Immunotech Developments Inc. Peptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the peptide
US5958416A (en) * 1994-12-16 1999-09-28 Regents Of The University Of Minnesota Heat shock protein peptides and methods for modulating autoimmune central nervous system disease
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
DE69633133T2 (de) 1995-10-24 2005-07-28 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute TFPI-verwandte Peptide die das Wachstums von glatten Muskelzellen inhibieren
GB9606016D0 (en) * 1996-03-22 1996-05-22 Smithkline Beecham Plc Novel use
US5861483A (en) * 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
SE9603468D0 (sv) * 1996-09-23 1996-09-23 Astra Ab New compounds
GB9710762D0 (en) * 1997-05-23 1997-07-23 Cancer Res Inst Royal Binding complexes
EP1015612B1 (en) 1997-05-27 2005-01-26 Hanil Synthetic Fiber Co., Ltd. Process for preparing recombinant proteins using highly efficient expression vector from saccharomyces cerevisiae
KR19990024297A (ko) 1997-08-07 1999-04-06 오종석 인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균
US6100388A (en) 1998-03-16 2000-08-08 Biogaia Biologies Ab Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US6653076B1 (en) * 1998-08-31 2003-11-25 The Regents Of The University Of Washington Stable isotope metabolic labeling for analysis of biopolymers
US6413530B1 (en) * 1999-04-21 2002-07-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Pesticidal peptides
FR2794370B1 (fr) * 1999-06-03 2003-10-17 Biovector Therapeutics Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
WO2001032853A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-10 Institute For Applied Biomedicine B cell clonal toxins and methods for using the same

Also Published As

Publication number Publication date
IL184227A (en) 2010-06-16
KR20040019058A (ko) 2004-03-04
SA04240478B1 (ar) 2007-07-31
JP4213581B2 (ja) 2009-01-21
NO20073914L (no) 2004-03-10
UA83989C2 (ru) 2008-09-10
DE60229883D1 (de) 2008-12-24
ZA200401108B (en) 2006-05-31
MXPA03011190A (es) 2004-10-28
NO20040134L (no) 2004-03-10
DK1790655T3 (da) 2010-08-23
EP1790655B1 (en) 2010-05-05
CA2452417A1 (en) 2003-01-23
IL184227A0 (en) 2007-10-31
RU2305107C2 (ru) 2007-08-27
EP1947109A3 (en) 2008-10-01
EP1478659B1 (en) 2008-11-12
ZA200509838B (en) 2007-11-28
RU2425053C2 (ru) 2011-07-27
RU2004104335A (ru) 2005-03-27
IL159827A0 (en) 2004-06-20
ES2345842T3 (es) 2010-10-04
HK1098767A1 (en) 2007-07-27
PT1478659E (pt) 2009-01-02
EP1790655A2 (en) 2007-05-30
BR0210252A (pt) 2004-09-14
AU2002319423B2 (en) 2008-02-14
KR20070070258A (ko) 2007-07-03
JP2008263993A (ja) 2008-11-06
RU2007108896A (ru) 2008-09-20
CA2707767A1 (en) 2003-01-23
CA2452417C (en) 2013-08-20
NZ553507A (en) 2008-07-31
JP2004533846A (ja) 2004-11-11
ES2316586T3 (es) 2009-04-16
JP2007312785A (ja) 2007-12-06
ATE466871T1 (de) 2010-05-15
PT1790655E (pt) 2010-07-09
EP1790655A3 (en) 2007-10-10
MY138219A (en) 2009-05-29
DK1478659T3 (da) 2009-01-05
NO332061B1 (no) 2012-06-11
ATE414099T1 (de) 2008-11-15
HK1066552A1 (en) 2005-03-24
DE60236330D1 (de) 2010-06-17
EP1947109A2 (en) 2008-07-23
WO2003006492A2 (en) 2003-01-23
PL368059A1 (pl) 2005-03-21
KR100889993B1 (ko) 2009-03-25
SG185137A1 (en) 2012-11-29
NZ529879A (en) 2007-12-21
PL211884B1 (pl) 2012-07-31
SG142165A1 (en) 2008-05-28
KR100889992B1 (ko) 2009-03-25
JP4316651B2 (ja) 2009-08-19
EP1478659A2 (en) 2004-11-24
CA2707767C (en) 2013-09-03
WO2003006492A3 (en) 2003-12-31
NZ544079A (en) 2007-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4316651B2 (ja) 生物学的に活性なペプチド
US7402653B2 (en) Biologically active peptides
AU2002319423A1 (en) Biologically active peptides
US7718764B2 (en) Biologically active peptide VAPEEHPTLLTEAPLNPK derivatives
US20080146510A1 (en) Biologically active peptide vapeehptllteaplnpk derivatives
AU2007211899B2 (en) Biologically active peptides
TW200844232A (en) Biologically active peptides

Legal Events

Date Code Title Description
RECP Rectifications of patent specification