ES2316586T3 - Peptidos biologicamente activos. - Google Patents

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ES2316586T3 ES02749008T ES02749008T ES2316586T3 ES 2316586 T3 ES2316586 T3 ES 2316586T3 ES 02749008 T ES02749008 T ES 02749008T ES 02749008 T ES02749008 T ES 02749008T ES 2316586 T3 ES2316586 T3 ES 2316586T3
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Abstract

Una composición farmacéutica que comprende un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos YSL (SEC ID Nº 16).

Description

Péptidos biológicamente activos.
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Campo de la invención
La presente invención se refiere al campo de la inmunología. En particular, la presente invención se refiere a péptidos y sus composiciones farmacéuticas que son capaces de modular las respuestas inmunes.
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Antecedentes de la invención
Los péptidos se conocen en la técnica para el tratamiento de enfermedades y como composiciones farmacéuticas. Por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.191.113 describe un péptido que tiene actividad inhibidora para el crecimiento de las células del músculo liso y por lo tanto es útil para prevenir y tratar afecciones patológicas asociadas con el crecimiento de las células del músculo liso tales como arteriosclerosis, reestenosis después de angioplastia, estenosis luminal después de injertar vaso sanguíneo y sarcoma de músculo liso. El documento US 6.184.208 describe otro péptido que se ha descubierto que modula los procesos fisiológicos tales como la actividad de ganancia de peso de la zona de crecimiento epitelial y crecimiento del cabello.
Se sabe que los péptidos portan otras funciones biológicas, tales como actividad neurotransmisora. Por ejemplo, un neurotransmisor, el péptido celular \alpha-bag (V-BCP(1-9), que se libera por las células bag (con forma de bolsa) en el ganglio abdominal del caracol marino Apysia, se describe por Squire y colaboradores (Squire et al., J. Biol. Chem, vol. 266, nº 33, 1991, pág. 22366-22363).
Están presentes muchos métodos para sintetizar y explorar péptidos. Por ejemplo, se ha sugerido un método para preparar bibliotecas peptídicas combinatorias por Furka y colaboradores (Furka et al., J. Comb. Chem. 2000, 2, 220-223). No obstante, siguen sin conocerse las funciones farmacéuticas de estos péptidos descritos y muchos otros péptidos no descritos.
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Sumario de la invención
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es identificar polipéptidos biológicamente activos. Se sintetizaron muchos péptidos por métodos químicos convencionales y se exploraron para su actividad biológica. A los péptidos se les dan códigos que tienen las letras CMS seguidas de un número. Se ha identificado un total de 30 péptidos que tienen actividad biológica in vivo. Las secuencias los números ID correspondientes de estos péptidos biológicamente activos se muestran en la Tabla A.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA A
1
2
Por consiguiente, en este documento se describen péptidos que tienen secuencias identificadas como la secuencia ID Nº 1 a la secuencia ID Nº 30.
Además en este documento se describen ácidos nucleicos que tienen secuencias que codifican los péptidos identificados anteriormente como secuencia ID Nº 1 a 30 y vectores de expresión que contienen las secuencias de ácido nucleico de los péptidos mostrados a continuación como secuencia ID Nº 1 a 30.
En este documento también se describen péptidos híbridos que contienen un péptido líder o señal adyacente a un péptido, comprendiendo el péptido una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 1-30 o un derivado funcional de un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 1-30.
También se describe un vector genético que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos líder adyacente a un péptido seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 1-30.
Los péptidos producidos en cualquiera de los vectores genéticos descritos anteriormente puede modular, pero sin limitación a la modulación, uno o más de los siguientes: actividad inmune; infección por hepatitis, incluyendo, aunque sin limitación, infección por hepatitis B; nefritis; el crecimiento de un cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, sarcoma, cáncer hepático, leucemia y melanoma; y el peso corporal.
Se describe adicionalmente un microorganismo con un genoma que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 1-30.
Péptido exógeno como se usa en este documento se refiere a un péptido que tiene una secuencia de aminoácidos que es diferente de cualquier otro péptido expresado normalmente por el microorganismo en su forma natural, no modificada.
Se describe adicionalmente un microorganismo con una composición genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido híbrido exógeno que comprende una secuencia de aminoácidos líder adyacente a un péptido, comprendiendo el péptido una secuencia de aminoácidos seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 1-30.
También se describe un microorganismo con una composición genética que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido híbrido exógeno que comprende una secuencia de aminoácidos líder adyacente a un péptido, seleccionada entre el grupo compuesto por las SEC ID Nº 1-30.
Los péptidos producidos en cualquier microorganismo descrito anteriormente puede modular, pero sin limitación a la modulación, uno o más de los siguientes: actividad inmune; infección por hepatitis, incluyendo, aunque sin limitación, infección por hepatitis B; nefritis; el crecimiento de un cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, sarcoma, cáncer hepático, leucemia y melanoma; y el peso corporal.
Un primer aspecto de la presente invención se refiere a una composición farmacéutica que comprende un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos YSL (SEC ID Nº 16).
En una realización específica, los péptidos presentes en la composición farmacéutica descrita anteriormente pueden modular, pero sin limitación a la modulación, uno o más de los siguientes: la actividad inmune y el crecimiento de un cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, cáncer hepático y melanoma.
Un aspecto adicional más de la presente invención se refiere a un método para preparar una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 16 y mezclar dicho péptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
En relación al método descrito anteriormente, el péptido puede modular, pero sin limitación a la modulación, uno o más de los siguientes: la actividad inmune y el crecimiento de un cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, cáncer hepático, y melanoma.
Un aspecto adicional más de la presente invención se refiere a un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº 16 para uso en el tratamiento de una enfermedad.
En una realización específica, el péptido usado para el tratamiento de una enfermedad descrito anteriormente puede usarse para modular, pero sin limitación a la modulación, uno o más de las siguientes afecciones humanas: la actividad inmune, y el crecimiento de un cáncer, incluyendo, aunque sin limitación, cáncer hepático y melanoma.
Descripción detallada
Los péptidos pueden sintetizarse fácilmente por métodos sintéticos convencionales a partir de L-aminoácidos, pero también pueden sintetizarse por métodos de ingeniería genética usando ácidos nucleicos que tienen secuencias que codifican los péptidos individuales.
I. Actividad Biológica
Para investigar la posible actividad biológica de los péptidos, se examinó el efecto inmunológico de los péptidos sobre un modelo animal, con procedimientos que acatan los "Principios de Investigación Preclínica de Nuevos Fármacos" (Principles of Pre-clinical Research of New Drugs) presentados por el Ministerio de Salud de la República Popular de China ^{[1]}.
Se usaron el ensayo de transformación de linfocitos T, el ensayo de actividad citotóxica de células NK, y el ensayo de secreción de IL-2 e IFN-\gamma por linfocitos T para detectar cualquier posible efecto de los péptidos sobre la función inmune celular específica. Se usó el ensayo de eliminación de partículas de carbono para detectar cualquier efecto posible de los péptidos sobre la función inmune celular no específica. Se usó el ensayo de hemólisis de glóbulos rojos de oveja (SRBC) para detectar cualquier efecto posible de los péptidos sobre la función inmune humoral. Se usó el ensayo de peso del órgano inmunitario para detectar cualquier efecto posible de los péptidos a nivel orgánico.
En este estudio, se usó el grupo de solución salina como control negativo, mientras que se usaron los grupos IL-2 e IFN-\gamma como controles positivos, ya que IL-2 e IFN-\gamma son inmunoestimulantes bien estudiados ^{[10]}. Se usaron cuatro concentraciones arbitrarias de los péptidos de muestra en este estudio, para cubrir un intervalo de dosificación de factor 1.000. Debido a la complejidad intrínseca de la respuesta inmunológica in vivo, y la ausencia de conocimiento previo sobre la función de la dosificación frente a la respuesta, por lo tanto, se ha valorado cualquier diferencia estadísticamente significativa sobre el control negativo en cualquier grupo de dosificación como actividad biológica positiva.
Los resultados de este estudio fueron los siguientes:
1.
Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021, CMS029, y CMS034 eran capaces de potenciar la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS014 y CMS036 eran capaces de inhibir la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
2.
Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS008 y CMS012, a concentración adecuada, eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
3.
Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS020, CMS022, y CMS034 eran capaces de potenciar la secreción de interleuquina-2 (IL-2) por linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
4.
Se descubrió que los péptidos CMS001', CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS016, CMS021, CMS022, y CMS028 eran capaces de potenciar la secreción de IFN por linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
5.
Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de potenciar la síntesis de anticuerpo anti-SRBC tras la estimulación antigénica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034, y CMS036, a concentración adecuada, eran capaces de inhibir la síntesis de anticuerpo anti-SRBC tras la estimulación antigénica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
6.
Se descubrió que los péptidos CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019; CMS020, CMS022, CMS024, CMS027, CMS030, CMS035, CMS036 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de control normal de solución salina.
7.
Se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
8.
Se descubrió que los péptidos CMS019, CMS020, y CMS030 eran capaces de aumentar el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina. También se descubrió que los péptidos CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, CMS029, y CMS036, a concentración adecuada, eran capaces de disminuir el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de control normal de solución salina.
Los materiales y métodos usados para analizar el efecto de los péptidos sobre ratones se describen a continuación:
Materiales 1. Animal Experimental
Ratones BALB/c, de 18-22 g de peso, 50% hembras y 50% machos, proporcionados por Experimental Animal Center, National Institute of Medical Science, RP de China.
2. Administración
Grupo de IFN-\gamma de ratón recombinante (rmIFN-\gamma): 3 x 10^{5} IU/kg/día
Grupo de IL humana recombinante (rhlL)-2: 3 x 10^{5} IU/kg/día
Grupo de solución salina: 0,5 ml/cada uno/día
Grupo I de dosis de péptido: 500 \mug/kg/día
Grupo II de dosis de péptido: 50 \mug/kg/día
Grupos III de dosis de péptido: 5 \mug/kg/día
Grupo IV de dosis de péptido: 0,5 \mug/kg/día
Las sustancias anteriores se disolvieron todas en 0,5 ml de solución salina y se inyectaron por vía intraperitoneal (i.p.) durante 15 días continuos, una vez al día.
3. Reactivos Principales
Los péptidos se fabricaron a petición del cliente por American Peptide Company, Inc., USA
Suero bovino fetal, y medio de cultivo celular RPMI-1640, Gibco, USA
MTT, y ConA, Sigma, USA
rmlFN-\gamma, Beijing Biotech Inc., China
rhIL-2, Shanghai Huaxin Biotech Inc., China
Solución de separación de linfocitos, Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, RR de China
Virus de la Estomatitis Vesicular (VSV), muestra convencional de IFN-\gamma y IL-2, National Institute For The Control Of Pharmaceutical And Biological Products, RP de China
Células HT-2 y células L929, cedidas por el Prof. WF Chen de Beijing University Department of Immunology, RP de China
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Método 1. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad celular 1.1 Preparación de suspensión celular esplénica ^{[1,2]}
Los ratones BALB/c se dividieron aleatoriamente en los grupos de péptido, IFN, IL-2, y solución salina. Diez ratones por grupo. El día después de la última administración de sustancia de ensayo, se sacrificó a los ratones por dislocación cervical. Se aisló el bazo asépticamente y se dispersó manualmente en solución de D-Hank fría usando una aguja de inyección. La suspensión celular dispersada se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 150 \mum de diámetro calibre 100. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento celular en 10 volúmenes de tampón Tris-NH_{4}Cl y después se mantuvo en reposo aún durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células suspendidas se recogieron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Las células se lavaron 2-4 veces con solución de D-Hank fría resuspendiendo y recogiendo por centrifugación con las condiciones que se han descrito anteriormente. Después las células lavadas se diluyeron a las densidades celulares deseadas por medio de cultivo RPMI-1640, que contenía suero bovino fetal al 10%.
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1.2 El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T ^{[1,2]}
Se colocaron células esplénicas de densidad 1 x 10^{6}/ml en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 100 \mul/pocillos, tres pocillos paralelos cada una de la muestra de ensayo y muestra de control por ratón. A los pocillos de ensayo se añadieron 100 \mul/pocillos de ConA de 100 \mug/ml en RPMI-1640, y se usó 100 \mul/pocillo de RPMI-1640 sencillo para los controles. Los pocillos se incubaron durante 66 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Después las células se sedimentaron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -20ºC para la determinación de citoquinas IL-2 e IFN.
Se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml en RPMI-1640 al sedimento celular y las células se re-suspendieron agitando durante 2 minutos. La incubación se continuó durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de la centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM al sedimento celular y se agitó durante 3 minutos, para obtener una OD_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm. Se usó un lector ELISA
Cálculo:
Cada ratón formó tres pocillos de ensayo y tres pocillos de control. El Índice de Estimulación (SI) de cada ratón se obtuvo derivando primero la OD promedio de los tres pocillos paralelos, después dividiendo el valor de los pocillos de ensayo por los pocillos de control.
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1.3 El efecto de los péptidos sobre la actividad de células NK ^{[3,4]}
Se prepararon células esplénicas de ratón a 4x10^{6}/ml como se ha descrito en la sección 1.1 anterior. Las células YAC-1 diana se llevaron a fase log y se ajustaron a 1x10^{5}/ml. Usando una placa de cultivo celular de 96 pocillos, se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente las células esplénicas; se añadieron 100 \mul de células diana y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente células diana; se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de células de diana al pocillo de ensayo de la actividad NK. Se prepararon tres series paralelas de lo anterior por ratón.
Las muestras se centrifugaron a 150 g durante 10 minutos para recoger las células. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml. Después se agitó la mezcla de reacción durante 2 minutos, y se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM y se agitaron durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA para obtener la OD_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm.
Cálculo:
Cada ratón tenía 9 pocillos: tres de control solamente con células esplénicas, tres de control solamente con células diana, y tres pocillos de ensayo con células tanto esplénicas como diana. El índice de actividad de células NK de cada ratón se obtuvo derivando primero la OD promedio de los tres pocillos paralelos de cada combinación, después aplicando esta OD promedio a la siguiente fórmula:
Índice de actividad de células NK = [1-(OD promedio del pocillos de células esplénicas y diana - OD promedio del pocillo solamente de células esplénicas) \div (OD promedio del pocillo solamente de células diana)] x 100%
1.4 El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de IL-2 ^{[5]}
Se recogieron células HT-2 en fase log por centrifugación a 150 g durante 10 minutos, y se lavaron tres veces con solución de Hank fría por resuspensión y centrifugación. Las células HT-2 recogidas se resuspendieron en RPMI-1640 y se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 30 minutos. Las células se lavaron adicionalmente dos veces con RPMI-1640 por resuspensión y centrifugación, y se resuspendieron a una concentración final de 2x10^{5}/ml con RPMI-1640.
El sobrenadante obtenido en la sección 1.2 se diluyeron al siguiente porcentaje con RPMI-1640: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, y 3,125%.
Se diluyó rlL-2 a la siguiente concentración con RPMI-1640: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 31,25 IU/ml, y 15,5 IU/ml.
Se preparó una placa de cultivo celular de 96 pocillos con tres pocillos paralelos por combinación:
Control negativo:
100 \mul de RPMI-1640 + 100 \mul de suspensión celular HT-2
Patrón rlL-2:
100 \mul de solución de rlL-2 + 100 \mul de suspensión celular HT-2
Pocillo de ensayo:
100 \mul de sobrenadante diluido + 100 \mul de suspensión celular HT-2
La placa se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 68 horas, después se centrifugó a 150 g durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante. Se añadieron 100 \mul de 0,5 mg/ml de MTT en RPMI-1640 sin fenolsulfonftaleína en cada pocillo. Después de agitar durante 3-4 minutos para resuspender las células, se continuó incubado durante otras 4 horas. Después se centrifugaron las muestras a 150 g durante 15 minutos y se retiró el sobrenadante. A cada pocillo, se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM, se mezclaron durante 3-4 minutos y se analizó la OD a 570 nm, con referencia a 630 nm con un lector de placa ELISA.
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Cálculo:
Se tomó la OD promedio de los tres pocillos paralelos de cada dilución y se representó frente a la concentración en un papel semi-log, concentración en el eje X. Se obtuvo la concentración a la saturación de OD al 50% para el ensayo tanto del sobrenadante como de rlL-2.
Actividad de IL-2 de muestra = (dilución de la muestra a la acción máxima al 50% \div la dilución de patrón de rlL-2 a la acción máxima al 50%) x la actividad del patrón de rlL-2 a la acción máxima al 50% (lU/ml)
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1.5 El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de interferón (IFN) ^{[6]}
El sobrenadante de la sección 1.2 se diluyó con medio de cultivo RPMI-1640 a los siguientes porcentajes: 100%, 50%, 25%, 12,5%, 6,25%, y 3,125%.
El patrón de interferón recombinante (rIFN) se diluyó con RPMI-1640 a las siguientes concentraciones: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62,5 IU/ml, 31,25 IU/ml, y 15,5 IU/ml.
Las células L929 diana en fase log se ajustaron a 2x10^{5}/ml con RPMI-1640, con el mismo tratamiento que las células HT-2 descrito en la sección 1.4. También se ajustó el VSV de reserva a 100 TCID_{50} con RPMI-1640.
Se preparó lo siguiente en una placa de cultivo de 96 pocillos, tres pocillos paralelos por combinación:
Pocillo de control negativo:
150 \mul de RPMI-1640 + 100 \mul de L929
Pocillo de control positivo:
100 \mul de RPMI-1640 + 100 \mul de L929 + 50 \mul de VSV
Pocillo de actividad rIFN:
100 \mul de patrón de rIFN + 100 \mul de L929 + 50 \mul de VSV
Pocillo de ensayo:
100 \mul de sobrenadante diluido + 100 \mul de L929 + 50 \mul de VSV
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Las muestras se incubaron a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 24 horas. Los pocillos de control positivo se observaron periódicamente en un microscopio invertido para confirmar la lisis celular, después se recogieron, se lavaron, y se leyó la OD de todos los pocillos igual que se ha descrito en la sección 1.4.
Cálculo:
Las concentraciones a la acción máxima al 50% se obtuvieron del mismo modo que la sección 1.4. La actividad IFN de la muestra se calcula del siguiente modo:
Actividad IFN de la muestra = (dilución de la muestra a la acción máxima al 50% \div dilución del patrón de rIFN a la acción máxima al 50%) x actividad rIFN del patrón a la acción máxima al 50% (IU/ml)
2. El efecto de los péptidos sobre la formación de anticuerpos ^{[7]}
Se prepararon glóbulos rojos de oveja (SRBC) recogiendo sangre de la vena cervical y se pusieron en un matraz estéril con perlas de vidrio. El matraz se agitó durante 3 minutos y después se mezcló la sangre con solución de Alsever (glucosa 2,05 g, NaCl 0,4 g, limonada Na 0,8 g, ajustada a 100 ml con agua destilada) y se almacenó a 4ºC. Inmediatamente antes de su uso, se centrifugaron las muestras a 130 g, 5 minutos para recoger los SRBC. Las células se lavaron dos veces por resuspensión y centrifugación en solución salina normal. Después se recogió el sedimento celular por centrifugación a 180 g durante 10 minutos y se resuspendió en solución salina para preparar la suspensión de SRBC de trabajo final, al 2% (v/v).
Se preparó el complemento añadiendo 10 volúmenes de suero de cobaya fresco en un volumen de SRBC compactados en centrífuga, y después se agitaron suavemente durante 30 minutos a 4ºC. Los SRBC se retiraron por centrifugación a 200 g durante 10 minutos. Se añadieron 10 volúmenes de solución salina normal para obtener la solución del complemento de trabajo.
Los ratones BALB/c se dividieron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de IFN, el grupo de IL-2, y el grupo de solución salina, 10 ratones por grupo. Las sustancias de ensayo se administraron como se ha descrito en la sección 1.1, más inyección intraperitoneal de 0,2 ml de SRBC por ratón en el día 12. En el día después de la última administración de sustancia de ensayo (día 16), se recogió la sangre del canthus ocular y se dejó a temperatura ambiente durante una hora para la exudación del suero. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se diluyó el suero por un factor 500 con solución salina normal.
A 1 ml de suero de ratón diluido de cada ratón, se añadieron 0,5 ml de suspensión de SRBC. Refrigeración en hielo. Después se añadió 1 ml de solución del complemento de trabajo y se incubó en un baño de agua a 37ºC durante 10 minutos. Las reacciones se terminaron por refrigeración en hielo. Las muestras después se centrifugaron a 200 g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante.
A 1 ml de este sobrenadante, se añadieron 3 ml de solución de Drabkin y se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se obtuvo la OD_{540 \ nm}.
Cálculo:
La OD_{540 \ nm} de referencia se obtuvo mezclando 0,25 ml de suspensión de SRBC con solución de Drabkin a 4 ml y se pusieron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de que se tomara la OD_{540 \ nm}.
Índice sérico de la muestra = (OD_{540 \ nm} de la muestra de ensayo \div OD_{540 \ nm} de referencia) x 500
3. El efecto de los péptidos sobre la función de fagocitosis de fagocitos mononucleados y el peso de órganos inmunes ^{[8,9]}
Al siguiente día después de la última administración de sustancia de ensayo (día 16), se inyectó a los ratones 0,1 ml/kg de peso corporal de tinta india (dilución de factor 5 con solución salina normal) de la vena de la cola.
Un minuto y cinco minutos después de la inyección de tinta india, se obtuvieron 20 \mul de sangre del canthus ocular con un catéter para entubado heparinizado. La sangre se mezcló con 2 ml de Na_{2}CO_{3} al 0,1% p/v y después se obtuvo la OD_{680 \ nm}. Se calculó el índice K inequívoco por la siguiente fórmula:
K = (lg A_{1} - lg A_{2}) \div (t2 - t1)
Calve:
A1: OD a 680 nm en el primer minuto
A2: OD a 680 nm en el quinto minuto
t2: 5 minutos
t2: 1 minuto
Un día después de la última administración de sustancia de ensayo (día 16), se separaron el hígado, el bazo, y la glándula tímica y se transfirieron en seco con papel de filtro y se pesaron. Se calculó en índice de fagocitosis \alpha del siguiente modo:
\alpha = (^{3}\surd K)(W \div W_{LS})
Calve:
W: peso corporal
W_{LS}: peso del hígado más el bazo
Índice de la glándula tímica (%) = (peso del timo/peso corporal) x 100%
Índice del bazo (%) = (peso del bazo/peso corporal) x 100%
Resultados
Debido a la gran cantidad de datos sin procesar implicados, solamente se presentan los resultados finales reunidos. Los grupos sin diferencia estadísticamente significativa del control negativo de solución salina también se omiten.
1. El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS007, CMS008, CMS010, CMS012, CMS015, CMS019,
CMS021, y CMS029 eran capaces de potenciar la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS010 y CMS015 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la siguiente Tabla 1.
TABLA 1
3
A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS002 y CMS003 eran capaces de estimular la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina, el grupo de IFN-\gamma, y el grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS014 y CMS036 eran capaces de inhibir la transformación de linfocitos T, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 2.
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TABLA 2
4 
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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, CMS007, y CMS034 eran capaces de estimular la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 3.
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TABLA 3
6 
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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS010, y CMS011 eran capaces de estimular la transformación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 4.
TABLA 4
7
8
2. El efecto del péptido sobre la actividad citotóxica de células NK
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS013, CMS016, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027,
CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos, se descubrió que CMS010, CMS016, y CMS030 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 5.
TABLA 5
9
A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, CMS015, CMS021, CMS026, y CMS035 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS021 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS012 era capaz de inhibir la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 6.
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TABLA 6
10 
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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS020, CMS024, CMS034, y CMS036 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS008 y CMS009 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la
Tabla 7.
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TABLA 7
11 
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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS011, CMS012, CMS022, CMS028, y CMS035 eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Se descubrió que CMS008 era capaz de inhibir la actividad citotóxica de células NK, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 8.
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TABLA 8
13 
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3. El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de IL-2
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS007, CMS009, CMS010, y CMS015 eran capaces de promover la secreción de IL-2 por linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS007 y CMS015 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS009 y CMS010 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 9.
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TABLA 9
14 
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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001 y CMS003 eran capaces de promover la actividad de linfocitos T en la secreción de IL-2, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS003 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 10.
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TABLA 10
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16 
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A 5 \mug/día, se descubrió que CMS007, CMS012, y CMS020 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IL-2, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 11.
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TABLA 11
17 
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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS011, CMS012, CMS022; y CMS034 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IL-2, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS034 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS011 y CMS022 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 12.
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TABLA 12
18
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4. El efecto de los péptidos sobre la actividad de linfocitos T en la secreción de IFN
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS013, y CMS016 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de interferón (IFN), que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina, el grupo de IFN-\gamma, y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 13.
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TABLA 13
20 
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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, y CMS021 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IFN que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS021 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 14.
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TABLA 14
21
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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS009 y CMS012 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IFN que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS009 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 15.
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TABLA 15
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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS010, CMS011, CMS022, y CMS028 eran capaces de promover los linfocitos T en la secreción de IFN, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS010 y CMS022 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 16.
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TABLA 16
24 
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5. El efecto de los péptidos sobre la formación de anticuerpos
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011,
CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024,
CMS029, MS033, y CMS035 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS013, CMS019, CMS024, y CMS035 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS014, CMS015, CMS016, CMS020, CMS023, CMS029, y CMS033 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 17.
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TABLA 17
26
27
A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS003, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS011, CMS013, y CMS015 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 tienen diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS009 era capaz de inhibir la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene diferencia estadística significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 18.
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TABLA 18
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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS019, CMS020, CMS021, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029,
CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS003, CMS008, CMS009, CMS012, CMS015, CMS016, CMS020, y CMS021 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS001, CMS007, CMS011, CMS019, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033,
CMS034, CMS035, y CMS036 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 19.
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TABLA 19
31
A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, y CMS033 eran capaces de promover la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS021 y CMS033 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS023, CMS024, y CMS027 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05). Además, se descubrió que CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034, y CMS036 eran capaces inhibir la formación de anticuerpos anti-SRBC, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 20.
TABLA 20
32
6. El efecto de péptidos sobre la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS003, CMS008, CMS020, CMS022, y CMS024 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS022 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IFN-\gamma y el grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 21.
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TABLA 21
34 
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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS019, CMS024, y CMS030 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS019 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 22.
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TABLA 22
35
36 
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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS003*, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019, y CMS035 son capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS003, CMS009, CMS010, CMS016, CMS019, y CMS035 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 23.
TABLA 23
37 
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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS024, CMS027, y CMS036 eran capaces de potenciar la actividad fagocítica de fagocitos mononucleados, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS024 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 24.
TABLA 24
38
7. El efecto de los péptidos sobre el peso de los órganos inmunes
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS010, CMS016, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026,
CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS027 y CMS034, tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS008, CMS022, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, y CMS035 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 25.
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TABLA 25
39 
\newpage
A 500 \mug/kg/día, se descubrió que CMS019 era capaz de aumentar el peso del bazo, con diferencia estadísticamente significativa de los grupos de control de solución salina (P<0,05) como se muestra en la Tabla 26. Se descubrió que CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, y CMS036 eran capaces de disminuir el peso del bazo, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de control de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 26.
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TABLA 26
41 
\newpage
A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CM019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS034 tenía diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS030, CMS032, y CMS036 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 27.
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TABLA 27
43 
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A 50 \mug/kg/día, se descubrió que CMS008, CMS010, y CMS029 eran capaces de disminuir el peso del bazo, con diferencia estadísticamente significativa del grupo de control de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 28.
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TABLA 28
45 
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A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS001, CMS002, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS028, CMS029,
CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, y CMS036 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS002, CMS014, CMS024, y CMS030 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS010, CMS012, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS032, CMS034, y CMS036 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 29.
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TABLA 29
46
A 5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS030 era capaz de aumentar el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Se descubrió que CMS015 era capaz de disminuir el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 30.
TABLA 30
48 
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A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS014, CMS018, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS030, y CMS032 eran capaces de aumentar el peso de la glándula tímica, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Entre estos péptidos, se descubrió que CMS008 y CMS012 tenían diferencia estadísticamente significativa del grupo de IL-2 (P<0,05). Y, también se descubrió que CMS002, CMS020, y CMS030 tenían diferencia estadísticamente significativa tanto del grupo de IFN-\gamma como del grupo de IL-2 (P<0,05) como se muestra en la Tabla 31.
TABLA 31
49
50
A 0,5 \mug/kg/día, se descubrió que CMS020 era capaz de aumentar el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina, el grupo de IFN-\gamma, y el grupo de IL-2 (P<0,05). Se descubrió que CMS001 era capaz de disminuir el peso del bazo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). Los datos se detallan en la siguiente Tabla 32.
TABLA 32
51
En resumen, se descubrió que los péptidos CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022,
CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035, y CMS036 tenían actividades biológicas in vivo en el modelo animal ensayado.
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IV Efecto de los péptidos CMS sobre el cáncer
Para descubrir si estos péptidos tienen posible efecto terapéutico sobre el cáncer, se usaron diversos modelos animales de cáncer convencionales en este estudio para ensayar los efectos biológicos de los anteriores péptidos sobre animales enfermos.
Materiales 1. Animales experimentales
Ratones BALB/c, ratones C_{57}BL/6, y ratones DBA/2, que pesan 18-22 g, del China Medical Science Institute, RP de China.
2. Líneas celulares
Células S_{180} de sarcoma de ratón, células B_{16}, y células L_{1210}, del Cancer Research Department, China Medical Science Institute.
Células YAC-1, como obsequio del Prof. Yao Zhi, Tianjin Medical University.
3. Fármaco y reactivo principales
Los péptidos usados en este estudio se fabricaron a petición del cliente por American Peptide Company, Inc., USA.
Suero bovino fetal, medio de cultivo celular RPMI-1640, de Gibco, USA.
MTT, ConA, de Sigma, USA.
Interferón \gamma de ratón recombinante (rmlFN-\gamma), de Beijing Biotech Inc., RP de China.
Interleuquina-2 humana recombinante (rhIL-2), de Shanghai Huaxin Biotech Inc., RP de China.
Solución de separación de linfocitos, del Research Institute of Hematologic Disease, National Institute of Medical Science, RP de China.
Ciclofosfamida, de The 12the pharmaceutical factory of Shanghai, RP de China.
Métodos 1. Administración de sustancia de ensayo
Inyección intraperitoneal, una vez al día. Con la excepción del grupo de ciclofosfamida, todos los grupos empezaron el tratamiento 5 días antes del transplante de las células cancerosas. Los grupos de ciclofosfamida se trataron el siguiente día después del transplante de las células cancerosas. El tratamiento de todos los grupos con sustancia de ensayo duró 30 días o hasta que el animal murió a menos que se indique otra cosa.
2. El efecto de los péptidos sobre la velocidad de crecimiento de células de sarcoma S_{180} transplantadas en ratones BALB/c, y sobre la función inmunológica del hospedador
Los ratones BALB/c se asignaron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmlFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.
Se incubaron células de sarcoma S_{180} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 37ºC, CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank a temperatura ambiente. La concentración celular se ajustó a 1-2 x 10^{9} por litro con solución de Hank. Se implantaron 0,2 ml de suspensión celular a varios ratones BALB/c a través de la pata delantera durante 10-12 días. Los ratones se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical. Se recogieron masas tumorales de crecimiento vigoroso y no alteradas y se limpiaron por lavado con solución salina estéril. El tejido se dispersó en solución salina hasta una suspensión celular homogénea, en una proporción de 1 g de tejido a 4 ml de solución salina. El modelo de ratón que alberga sarcoma se preparó con una inyección de 0,2 ml de suspensión celular a través de la pata delantera [1]. La administración del tratamiento con sustancia de ensayo empezó como se ha descrito en el método de la sección 1.
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2.1 El efecto de los péptidos sobre la función fagocítica de fagocitos mononucleados en ratones con sarcoma S_{180} [2,3] se analizó inyectando a los ratones desde la vena de la cola 0,1 ml/10 g de peso corporal de tinta india (dilución 1:5 con solución salina normal) en el segundo día después de la última administración de sustancia de ensayo. A un minuto y cinco minutos después de la inyección, se obtuvieron 20 \mul de sangre del canthus ocular con un catéter para entubado heparinizado. La sangre se mezcló con 2 ml de Na_{2}CO_{3} al 0,1% p/v y después se obtuvo la OD_{680 \ nm}. El índice K inequívoco se calculó por la siguiente fórmula:
K = (Ig A_{1} - Ig A_{2}) + (t2 - t1)
Clave:
A1: OD_{680 \ nm} en el primer minuto
A2: OD_{680 \ nm} en el quinto minuto
t2: 5 minutos
t2: 1 minuto
Después del estudio del índice de fagocitosis, los ratones se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical. Se diseccionaron el hígado, el bazo, y el tejido canceroso, se transfirieron en seco, y se pesaron.
El índice de fagocitosis \alpha se calculó del siguiente modo:
\alpha = (^{3}\surd K) x (W \div W_{LS})
Clave:
W: peso corporal
W_{LS}: peso del hígado más el bazo
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2.2 El índice de inhibición del crecimiento tumoral se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:
Índice de inhibición del crecimiento tumoral = (peso medio del tumor del grupo de control - peso medio del tumor del grupo de tratamiento) \div peso medio del tumo del grupo de control
3. El efecto de los péptidos sobre la supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico
Los ratones BALB/c se asignaron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmlFN-\gamma, el grupo de rhIL-2 y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.
Se incubaron células H_{22} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 37ºC/CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank a temperatura ambiente. La concentración celular se ajustó a 1-2 x 10^{9} por litro con solución de Hank. Se implantaron 0,2 ml de la suspensión celular en la cavidad abdominal de varios ratones BALB/c durante 6-8 días [1]. Los ratones se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical. Se recogió el fluido ascítico de los ratones asépticamente y la concentración celular se ajustó a 1 x 10^{6} por ml con solución de Hank. Se implantaron 0,2 ml de la suspensión celular en la cavidad abdominal de ratones sanos para generar el modelo de ratón que porta H_{22} para el cáncer hepático de tipo fluido ascítico. La administración de sustancia de ensayo empezó como se ha descrito en el método de la sección 1. Se registraron los datos de supervivencia de los ratones. Si el animal sobrevivía más tiempo que el experimento, los días de supervivencia se registraban como la duración del experimento. Se obtuvo la media de días de supervivencia por el método de Kaplan-meier en la opción de Supervivencia del software SPSS. El índice de supervivencia se calculó de acuerdo con la siguiente
fórmula:
Índice de supervivencia = (días de supervivencia media en el grupo de tratamiento - días de supervivencia media del grupo de control) \div días de supervivencia media del grupo de control x 100%
4. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad celular de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico 4.1 Preparación de suspensión celular esplénica ^{[1,4]}
Ratones BALB/c sanos se asignaron aleatoriamente en el grupo de péptido, el grupo de rmIFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 15 ratones por grupo, y se prepararon en el modelo de ratón portador de H_{22} como se ha descrito en el método de la sección 3. Después del implante de las células cancerosas, se administraron las sustancias de ensayo durante 15 días, los ratones se sacrificaron por dislocación cervical. Se aisló el bazo asépticamente y se dispersó manualmente en solución de D-Hank fría usando una aguja de inyección. La suspensión celular dispersada se tamizó adicionalmente a través de un tamiz de acero inoxidable de 150 \mum de diámetro de calibre 100. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se desechó el sobrenadante. Se resuspendió el sedimento celular en 10 volúmenes de tampón Tris-NH_{4}Cl y después se mantuvo en reposo durante 10 minutos a temperatura ambiente. Las células suspendidas se recogieron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Las células se lavaron 2-4 veces con solución de D-Hank fría resuspendiendo y recogiendo por centrifugación con las condiciones como se ha descrito anteriormente. Después las células lavadas se diluyeron a las densidades celulares deseadas por medio de cultivo RPMI-1640, que contenía suero bovino fetal al 10%.
4.2 El efecto de los péptidos sobre la transformación de linfocitos T en ratones con cáncer hepático H_{22} de tipo fluido ascítico ^{[1,4]}
Se colocaron células esplénicas de densidad 1 x 10^{6}/ml en una placa de cultivo celular de 96 pocillos, 100 \mul/pocillo, tres pocillos paralelos cada uno de la muestra de ensayo y la muestra de control por ratón. A los pocillos de ensayo, se añadieron 100 \mul/pocillo de ConA de 100 \mug/ml en RPMI-1640, y se usaron 100 \mul/pocillo de RPMI-1640 sencillo para los controles. Las células se incubaron durante 66 h a 37ºC, CO_{2} al 5%. Las células después se sedimentaron por centrifugación a 150 g durante 10 minutos. El sobrenadante se recogió y se almacenó a -20ºC para la determinación de citoquinas IL-2 e IFN.
Se añadieron 50 \mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml en RPMI-1640 al sedimento celular y las células se resuspendieron por agitación durante 2 minutos. La incubación se continuó durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM al sedimento celular y se agitó durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA para obtener la OD_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm.
Cada ratón formó tres pocillos de ensayo y tres pocillos de control. El Índice de Estimulación (SI) de cada ratón se obtuvo derivando primero la OD promedio de los tres pocillos paralelos, después dividiendo el valor de los pocillos de ensayo por los pocillos de control.
4.3 El efecto de los péptidos sobre la actividad de células NK en ratones con cáncer hepático H_{22} de tipo fluido ascítico ^{[5,6]}
Se prepararon células esplénicas de ratón a 4x10^{6}/ml como se ha descrito en la sección 4.1 anterior. Las células YAC-1 diana se llevaron a fase log y se ajustaron a 1x10^{5}/ml. Usando una placa de cultivo celular de 96 pocillos, se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente las células esplénicas; se añadieron 100 \mul de células diana y 100 \mul de medio de cultivo al pocillo de control que contenía solamente células diana; se añadieron 100 \mul de células esplénicas de ratón y 100 \mul de células diana al pocillo de ensayo de la actividad NK. Se prepararon tres series paralelas de lo anterior por ratón. Después de eso las placas de cultivo celular de 96 pocillos se incubaron durante 4 h a 37ºC, CO_{2} al 5%.
Las muestras se centrifugaron a 150 g durante 10 minutos para recoger las células. Se desechó el sobrenadante y se añadieron 50\mul/pocillo de MTT de 1 mg/ml. La mezcla de reacción después se agitó durante 2 minutos, y se incubó a 37ºC, CO_{2} al 5% durante 4 horas. Se desechó el sobrenadante después de centrifugación a 150 g durante 10 minutos. Se añadieron 120 \mul de HCl-2-propanol 40 mM y se agitaron durante 3 minutos. Se usó un lector ELISA para obtener la OD_{570 \ nm} de cada pocillo con referencia a 630 nm.
Cada ratón tiene 9 pocillos: tres de control solamente con células esplénicas, tres de control solamente con células diana, y tres pocillos de ensayo tanto con células esplénicas como células diana. El índice de actividad de células NK de cada ratón se obtuvo derivando primero la OD promedio de los tres pocillos paralelos de cada combinación, después aplicando esta OD promedio a la siguiente fórmula:
Índice de actividad de células NK = [1-(OD promedio del pocillo de células esplénicas y diana - OD promedio del pocillo de células esplénicas solamente) \div (OD promedio del pocillo de células diana solamente)] x 100%
5. El efecto de los péptidos sobre la supervivencia de ratones DBA/2 con leucemia L_{1210} transplantada
Se asignaron aleatoriamente ratones DBA/2, de 6-8 semanas de edad, en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmIFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.
Se incubaron células L_{1210} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 37ºC/CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank, y se ajustaron a 1 x 10^{5} células por litro. Se implantó 0,1 ml de la suspensión celular en la cavidad abdominal de varios ratones DBA sanos durante 6-8 días. Los ratones después se sacrificaron por dislocación de la vértebra cervical y se recogió su fluido ascítico asépticamente. La concentración celular del fluido ascítico recogido se ajustó a 1 x 10 por ml con solución de Hank. Se implantó 0,1 ml de la suspensión celular en cada uno de los animales de ensayo y se registraron los datos de supervivencia de los animales. El tratamiento empezó en los animales de ensayo como se ha descrito en el método de la sección 1. La media de días de supervivencia se obtuvo por el método de Kaplan-meier en la opción de Supervivencia del software SPSS. Si el animal sobrevivía más tiempo que el experimento, los días de supervivencia se introducían como la duración del experimento. El índice supervivencia se calculó de acuerdo con la siguiente fórmula:
Índice de supervivencia = (días de supervivencia media del grupo de tratamiento - días de supervivencia media del grupo de control) \div días de supervivencia media del grupo de control
6. El efecto de los péptidos sobre la inmunidad humoral de ratones C_{57}BL/6 portadores de melanoma B_{16} transplantado, y sobre el potencial metastásico de las células de melanoma inoculadas
Se asignaron aleatoriamente ratones C_{57}BL/6, de 6-8 semanas de edad, 18-22 g de peso corporal, en el grupo de péptido, el grupo de ciclofosfamida, el grupo de rmIFN-\gamma, el grupo de rhIL-2, y el grupo de solución salina, 20 animales por grupo.
Se incubaron células de melanoma de ratón B_{16} de reserva en medio DMEM/F12 suplementado con suero bovino fetal al 10%, 37ºC/CO_{2} al 5% durante 72 h, después se lavaron 3-4 veces con solución de Hank. La concentración celular se ajustó a 1 x 10^{5} por ml con solución de Hank y se inyectó 0,1 ml de la suspensión celular mediante la vena de la cola en los ratones de ensayo para generar el modelo animal que alberga melanoma B_{16} [7,8]. El tratamiento con sustancia de ensayo empezó como se ha descrito en el método de la sección 1.
6.1 El efecto de los péptidos sobre la inmunidad humoral de ratones C_{57}BL/6 que albergan melanoma B_{16} transplantado ^{[9]}
Se prepararon glóbulos rojos de oveja (SRBC) recogiendo sangre de la vena cervical y se pusieron en un matraz estéril como perlas de vidrio. El matraz se agitó durante 3 minutos y la sangre después se mezcló con solución de Alsever (glucosa 2,05 g, NaCl 0,4 g, limonada Na 0,8 g, ajustada a 100 ml con agua destilada) y se almacenó a 4ºC. Inmediatamente antes de su uso, las muestras se centrifugaron a 130 g, 5 minutos para recoger los SRBC. Las células se lavaron dos veces por resuspensión y centrifugación en solución salina normal. Después se recogió el sedimento celular por centrifugación a 180 g durante 10 minutos y se resuspendió en solución salina para hacer la suspensión de SRBC de trabajo final, al 2% (v/v).
El complemento se preparó añadiendo 10 volúmenes de suero de cobaya fresco en un volumen de SRBC compactados en centrífuga, y después se agitó suavemente durante 30 minutos a 4ºC. Los SRBC se retiraron por centrifugación a 200 g durante 10 minutos. Se añadieron 10 volúmenes de solución salina normal para obtener la solución del complemento de trabajo.
En los animales de ensayo, en el día 27 del tratamiento con sustancia de ensayo, se inyectaron 0,2 ml de la suspensión celular de SRBC de trabajo en cada animal para producir anticuerpos. En el día después de la última administración de sustancia de ensayo, se recogió la sangre del canthus ocular y se dejó a temperatura ambiente durante una hora para la exudación del suero. Después de centrifugación a 200 g durante 10 minutos, se diluyó el suero recogido a un factor 500 con solución salina normal.
A 1 ml de suero de ratón diluido de cada ratón, se añadieron 0,5 ml de suspensión de SRBC. Refrigeración en hielo. Después se añadió 1 ml de solución del complemento de trabajo y se incubó en un baño de agua a 37ºC durante 10 minutos. Las reacciones se terminaron por refrigeración en hielo. Las muestras después de centrifugaron a 200 g durante 10 minutos para obtener el sobrenadante.
A 1 ml de este sobrenadante, se añadieron 3 ml de solución de Drabkin y se dejó a temperatura ambiente durante 10 minutos. Se obtuvo la OD_{540 \ nm}.
La OD_{540 \ nm} de referencia se obtuvo mezclando 0,25 ml de suspensión de SRBC con solución de Drabkin a 4 ml y se colocaron a temperatura ambiente durante 10 minutos antes de que se tomara la OD_{540 \ nm}.
Índice de hemólisis = (OD_{540 \ nm} de la muestra de ensayo \div OD_{540 \ nm} de referencia) x 500
6.2 Después del estudio de inmunidad humoral, se sacrificaron los ratones por dislocación de la vértebra cervical. Se realizó el examen post-mortem de los animales. Se registraron los cambios patológicos, y se contaron las cantidades de focos de metástasis pulmonar de melanoma.
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Resultados 1. El efecto del péptido sobre la fagocitosis celular en ratones BALB/c con sarcoma S_{180} transplantado (Método 2.1) 
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TABLA IV.1 El efecto del péptido sobre el índice de fagocitosis de ratones BALB/c con sarcoma S_{180} transplantado
56 
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Se descubrió que CMS001 a 50 \mug/kg/día y 5 \mug/kg/día, y CMS034 a 5 \mug/kg/día y 0,5 \mug/kg/día eran capaces de aumentar el índice de fagocitosis, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina.
2. El efecto del péptido sobre la velocidad de crecimiento de sarcoma S_{180} transplantado en ratones BALB/c (Método 2.2) 
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TABLA IV.2 El efecto del péptido sobre el crecimiento tumoral de S_{180} transplantado
57 
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Se descubrió que CMS010 a 500 \mug/kg/día, CMS034 a 0,5 \mug/día, y CMS035 a 5 \mug/kg/día eran capaces de reducir el crecimiento del sarcoma S_{180} transplantado, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).
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3. El efecto del péptido sobre la supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico (Método 3) 
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TABLA IV.3 El efecto del péptido sobre el índice de supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico 
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59
Se descubrió que CMS008 a 5 \mug/kg/día, CMS011 a 5 \mug/kg/día, CMS024 a 50 \mug/kg/día, CMS024 a 0,5 \mug/kg/día, y CMS032 a 0,5 \mug/kg/día eran capaces de prolongar la supervivencia de ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05). También se observó que en el grupo de CMS024 a 0,5 \mug/kg/día, más del 30% (n=6) de los ratones podía sobrevivir más de 90 días (dos meses después de finalizar el experimento). El examen post-mortem de los ratones no mostró signos de establecimiento de tumor. CMS024 a 0,5 \mug/kg/día por lo tanto puede impedir el crecimiento de H_{22} transplantado impidiendo su establecimiento o induciendo la curación completa del cáncer establecido.
4. El efecto del péptido sobre la transformación de linfocitos T en ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico (Método 4.2) TABLA IV.4 El efecto del péptido sobre la transformación de linfocitos T
60
61
Se descubrió que CMS010 a 500 \mug/kg/día, CMS019 a 0,5 \mug/kg/día, CMS024 a 0,5 \mug/kg/día y 5 \mug/kg/día, y CMS035 a 0,5 \mug/kg/día y 5 \mug/kg/día eran capaces de aumentar el índice de estimulación de linfocitos T, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).
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5. El efecto del péptido sobre la actividad de células NK en ratones BALB/c con cáncer hepático H_{22} transplantado de tipo fluido ascítico (Método 4.3) 
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TABLA IV.5 El efecto del péptido sobre el índice de actividad citotóxica de células NK
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Se descubrió que CMS003 a 500 \mug/kg/día, CMS014 a 0,5 \mug/kg/día, CMS024 a 0,5 \mug/kg/día, 5 \mug/kg/día, y 50 \mug/kg/día, y CMS034 a 50 \mug/kg/día eran capaces de aumentar la actividad citotóxica de células NK en el modelo animal de ensayo, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).
6. El efecto del péptido sobre la supervivencia de ratones DBA/2 con leucemia L_{1210} transplantada (Método 5) 
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TABLA IV.6 El efecto del péptido sobre el índice de supervivencia de animales de ensayo 
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Se descubrió que CMS019 a 0,5 \mug/kg/día y CMS035 a 0,5 \mug/kg/día eran capaces de prolongar la supervivencia de ratones DBA/2 con leucemia L_{1210} transplantada, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).
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7. El efecto del péptido sobre la inmunidad humoral de ratones C_{57}BL/6 con melanoma B_{16} transplantado (Método 6.1) 
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TABLA IV.7 El efecto del péptido sobre el índice de hemólisis de ratones C57B/6 con melanoma B16 transplantado 
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Se descubrió que CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034, y CMS035 eran capaces de potenciar la respuesta humoral (aumento en el índice de hemólisis) de ratones C_{57}BL/6 con melanoma B_{16} transplantado a dosificaciones que se muestran en la Tabla IV.7, que tiene una diferencia estadísticamente significativa del grupo de solución salina (P<0,05).
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8. El efecto del péptido sobre la supervivencia de células de melanoma B16 inoculadas en ratones C_{57}BL/6 (Método 6.2)
El examen post-mortem de los animales después de finalizar el tratamiento con sustancia de ensayo no mostró ningún signo de existencia de focos metastásicos B16 en el pulmón de ratones tratados con CMS008 a 0,5 \mug/kg/día, 5 \mug/kg/día, y 50 \mug/kg/día, y CMS016 a 5 \mug/kg/día y 500 \mug/kg/día.
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Conclusión
De conformidad con las Directrices de Investigación Preclínica de Nuevos Fármacos (Preclinical New Drug Research Guidelines) presentadas por la División de Administración de Fármacos del Departamento de Salud de la RP de China en 1993, se estudiaron los efectos del péptido sobre ratones con células cancerosas transplantadas. Se concluyó que
1.
CMS010, CMS034, y CMS035 a la dosificación adecuada podían inhibir significativamente el desarrollo de sarcoma S_{180} transplantado en ratones;
2.
CMS001 y CMS034 a la dosificación adecuada podían potenciar las actividades inmunes fagocíticas de ratones transplantados con sarcoma S_{180};
3.
CMS008, CMS011, CMS024, y CMS032 a la dosificación adecuada podían prolongar la supervivencia de ratones transplantados con cáncer hepático H22 de tipo fluido ascítico;
4.
CMS010, CMS019, CMS024, CMS034, y CMS035 a la dosificación adecuada podían potenciar la transformación de linfocitos T en ratones transplantados con cáncer hepático H22 de tipo fluido ascítico;
5.
CMS003, CMS014, CMS024, CMS032, y CMS034 a la dosificación adecuada podían aumentar la actividad citotóxica de células NK de ratones transplantados con cáncer hepático H22 de tipo fluido ascítico;
6.
CMS019 y CMS035 a la dosificación adecuada podían prolongar la supervivencia de ratones transplantados con leucemia L1210;
7.
CMS008 y CMS016 a la dosificación adecuada podían inhibir el desarrollo de melanoma B16 transplantado en ratones;
8.
CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034, y CMS035 a la dosificación adecuada podían potenciar la respuesta inmune humoral de ratones transplantados con melanoma B16.
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Discusión
CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 pueden ser útiles como parte, o en sí mismos, en el tratamiento del cáncer en seres humanos. Por ejemplo, CMS001, CMS003, CMS008, CMS010, CMS011, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, y CMS035 pueden usarse para aumentar la inmunidad de pacientes con cáncer. CMS008, CMS010, CMS016, CMS034, y CMS035 pueden usarse para impedir el crecimiento de células cancerosas en pacientes. CMS008, CMS011,
CMS019, CMS024, CMS032, y CMS035 pueden usarse para prolongar la expectativa de vida de pacientes con cáncer. Los péptidos pueden usarse en sí mismos, en combinaciones de dos o más péptidos, o en combinación con otros compuestos farmacéuticos o suplementos alimenticios como un transcurso total para el tratamiento del
cáncer.
TABLA IV.8 Péptidos Eficaces para el Cáncer
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Referencias
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11. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 131
El uso del péptido identificado anteriormente, en formulaciones farmacéuticas puede emplearse como posible tratamiento para trastornos inmunológicos o enfermedades que tienen efectos secundarios sobre la inmunidad, por ejemplo, cáncer. Las formulaciones pueden contener el péptido mezclado con otro constituyente activo o inactivo, incluyendo otros péptidos. Por ejemplo, pueden añadirse de dos varios (por ejemplo, 3-5) de los péptidos enumerados a la misma formulación con o sin otros ingredientes. Como alternativa, el péptido puede usarse para preparar la formulación junto con péptidos no enumerados en este documento. Pueden administrarse en forma intravenosa, intramuscular, intracutánea, subcutánea o intradérmica. El modo de administración también puede ser inyección intraarterial que conduce directamente al órgano del problema. Otros modos de administración son transdérmico, por inhalación en forma de polvo o pulverización, y otras formas de suministro conocidas por los especialistas en la técnica. La formulación también puede tomarse por vía oral, y puede contener vehículos que pueden usarse para evitar la digestión gástrica del péptido después de la ingesta oral o cualquier otro vehículo conocido en la técnica (para la vía transdérmica tal como liposomas).
La formulación farmacéutica puede incluir cualquiera de los vehículos farmacéuticos conocidos. Los ejemplos de vehículos adecuados incluyen cualquiera de los vehículos farmacéuticamente aceptados convencionales conocidos para los especialistas en la técnica. Éstos incluyen, aunque sin limitación, solución salina fisiológica, agua, emulsiones que incluyen mezclas de aceite y agua o emulsiones de triglicéridos, y otros tipos de agentes, cargas, comprimidos recubiertos y cápsulas. El vehículo apropiado puede seleccionarse en base al modo de administración de la composición farmacéutica.
El péptido puede administrarse por inyección intravenosa, inyección intramuscular, inyección intraperitoneal, inyección subcutánea, e implante subcutáneo. El péptido también puede administrarse en cualquier forma de administración oral como comprimido, cápsula, suspensión, solución etc., en la forma habitual sin modificación o en forma de liberación lenta, o con o sin protección gastro-entérica. El péptido puede aplicarse adicionalmente en cualquier forma de aplicación tópica como pomada, crema, gel etc. con o sin un dispositivo de facilitación transdérmica. El péptido también puede interpretarse en su secuencia génica y clonarse en un sistema de expresión, en sí mismo o en combinación con otras secuencias peptídicas, para generar una molécula peptídica resultante para hacer uso de la actividad del péptido descrito en esta memoria.
La dosis de cada péptido puede ser de 1 ng - 10 g por kg de peso corporal. Una dosis preferida es de 10 ng - 10 mg por kg, y más preferiblemente de 1 \mug - 1 mg por kg para un modo de administración por inyección. Sin embargo, la dosis eficaz puede ser tan baja como 1 ng por kg de peso corporal, ya que uno o más de los péptidos pueden funcionar a través de receptores que inducirán a una cascada de respuesta fisiológica normal. Como alternativa, uno o más de los péptidos puede ser justo un iniciador para una cascada completa de reacción. Para un ingesta oral, la cantidad puede ser de 1 ng - 10 g por día por kg de peso corporal, más preferiblemente de 0,1 \mug - 1 g por día por kg de peso corporal e incluso más preferiblemente de 1 \mug - 10 mg por día.
III Terapia Génica y Método de Tratamiento
La terapia génica basada en las secuencias peptídicas descubiertas se realiza diseñando una secuencia de ácido nucleico que codifica el péptido. El ácido nucleico puede sintetizarse químicamente y ligarse de forma funcional a un promotor, y clonarse en un vector de expresión. El vector de expresión después se administra en el cuerpo humano como forma de terapia génica para la expresión en la célula humana. La expresión "vectores genéticos" como se usa en este documento incluye estos vectores de expresión. Los vectores que pueden usarse para terapia génica incluyen virus adeno-asociados (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89, 76-80), vectores LNSX (Miller, A.D. et al. (1993) Methods Enzymol 217, 581-599) y lentivirus (Goldman, M.J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268).
Otros vehículos para el suministro del péptido incluyen vectores de expresión que codifican el péptido deseado que puede transferirse en un organismo que puede replicarse en el organismo hospedador al que se desea administrar el péptido sin efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo hospedador. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden transferirse en un organismo que no es patogénico para el organismo hospedador al que se desea administrar el péptido. El vector de expresión produce el péptido deseado en un organismo bacteriano o fúngico que no tiene efectos perjudiciales significativos sobre la salud del organismo hospedador al que se tiene que administrar el péptido. Por ejemplo, el vector de expresión que codifica el péptido deseado puede ser un vector de expresión que produce el péptido deseado en un organismo tal como bacterias ácido lácticas, E. coli, o levaduras. El vector de expresión produce el péptido deseado en un microbio normalmente encontrado en el intestino de mamíferos o un microbio tolerado por el tracto digestivo de mamíferos. Algunas de las especies microbianas en que puede expresarse el péptido deseado incluyen, aunque sin limitación especies de Lactobacillus, tales como L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gasseri, L. johnsonii, L. paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus u otros; especies de Bifidobacterium, tales como B. adolescentis, B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum u otros; Enterococcus faecalis o Ent. facium; Sporolactobacillus inulinus; Bacillus subtilis o Bacillus cereus; Escherichia coli; Propionibacterium freudenreichii; o Saccharomyces cerevisiae o Saccharomyces boulardii.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican el péptido usado en la presente invención, sintetizadas químicamente o producidas por otros medios, incluyendo, aunque sin limitación, la transcripción inversa de ARNm para producir moléculas de ADNc, se incorporan en vectores de expresión para la transferencia génica en los organismos deseados por métodos de ingeniería genética familiares para los especialistas en la técnica. Los vectores de expresión pueden ser vectores ADN o vectores ARN. Por ejemplo, los vectores de expresión pueden basarse en elementos genéticos plasmídicos o virales. Los vectores de expresión pueden ser vectores que se replican extra-cromosómicamente o vectores que se integran en el cromosoma.
Los vectores de expresión comprenden un promotor unido funcionalmente a un ácido nucleico que codifica un péptido usado en la presente invención. El promotor puede ser un promotor regulable, tal como un promotor inducible, o un promotor constitutivo. El promotor puede seleccionarse para proporcionar un nivel deseado de expresión peptídica. Además, si se desea, los vectores de expresión pueden comprender otras secuencias para promover la producción, presentación y/o secreción de péptidos. Por ejemplo, un ácido nucleico que codifica un péptido usado en la presente invención está unido de forma funcional a una secuencia de ácido nucleico que dirige la secreción del péptido, ejemplificada por, aunque sin limitación, un ácido nucleico que codifica un péptido señal.
Los vectores de expresión que están modificados para codificar el péptido usado en la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido usado en la presente invención en una especie bacteriana que compone la flora intestinal normal de mamíferos, tal como especies de Lactobacillus y Bacillus subtilis. Pueden encontrarse ejemplos de dichos vectores de expresión en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.100.388, de Casas, y Nº 5.728.571, de Bellini, respectivamente. Se apreciará que puede usarse cualquier vector de expresión que facilite la expresión de un péptido usado en la presente invención en un organismo que no es perjudicial para la salud del organismo hospedador al que tiene que administrarse el péptido.
Los vectores de expresión que están modificados para codificar el péptido usado en la presente invención pueden ser vectores de expresión que están adaptados para expresar el péptido en una especie de levadura que se tolera bien por el intestino de mamíferos, tal como Saccharomyces cerevisiae; o, preferiblemente, Saccharomyces boulardii, que puede colonizar el intestino humano y se usa para tratar ciertas formas de diarrea. Pueden usarse vectores de expresión de levaduras que expresan constitutivamente proteínas y péptidos heterólogos, son altamente estables, por tanto se transmiten bien a las células descendientes durante la mitosis y meiosis y pueden comprender la secuencia codificante para un péptido o péptidos señal que dirigen elevados niveles de secreción de proteína recombinante. Un ejemplo de dicho vector de levaduras se da en la Patente de Estados Unidos Nº 6.391.585, de Jang et al.
Los vectores de expresión que codifican el péptido útil en la presente invención pueden introducirse en el organismo en que se pretende que exprese los péptidos a través de técnicas conocidas en la técnica. Estas técnicas incluyen métodos tradicionales para transformar bacterias, levaduras, u otros microbios, a través del uso de electroporación con células bacterianas químicamente competentes o transformación con acetato de litio (para levaduras), por ejemplo, así como avances recientes en la transformación de especies bacterianas recalcitrantes a estos procedimientos. Los vectores de expresión se introducen en bacterias ácido lácticas que se sabe que son recalcitrantes a la transformación usando el método descrito por Leer et al. (documento WO 95/35389). Las secuencias introducidas pueden incorporarse en ADN cromosómico microbiano o pueden permanecer como elementos de ADN extracromosómicos.
Este microbio modificado genéticamente que contiene el vector de expresión después puede inocularse en el conducto alimentario, la vagina, la tráquea etc. para conseguir inmunoterapia sostenida. Los organismos que expresan los péptidos se ingieren en una forma inactiva o, preferiblemente, en forma viva. En el intestino estos microorganismos producen dichos péptidos, los liberan en la luz por secreción o por lisis del microorganismo o presentan de otro modo los péptidos al hospedador, por lo cual los péptidos producen su efecto pretendido sobre el organismo hospedador. Los péptidos se presentan al hospedador en la membrana mucosa de los conductos nasales, la vagina o el intestino delgado.
Otro método de tratamiento es el uso de liposomas como un medio para suministrar el ácido nucleico específico a las células en el cuerpo humano. El ácido nucleico (tal como un vector de expresión que contiene una secuencia nucleica que codifica péptidos de la secuencia ID Nº 16) se suministra en un entorno que fomenta la captación celular y la incorporación cromosómica como se describe en Gao, X. y Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 y el documento US 6.207.456. Como alternativa, el propio péptido puede encapsularse en el liposoma y suministrarse directamente, usando un método descrito en el documento US 6.245.427.
Las secuencias de ácido nucleico útiles para la terapia génica mencionada anteriormente y el método de tratamiento incluyen secuencias que codifican estos péptidos. Puede usarse una cualquiera de las numerosas secuencias de ácido nucleico para codificar estos péptidos en base al sistema de codones degenerados.
Referencias
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, People's Republic of China. 1993, 7:134-135
2. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment. People's Health Publishing House. 1991, 1221-1234
3. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:140
4. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of testing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996, 1(6): 356-358
5. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483
6. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7:141
7. Principle of new drug research in pre-clinic issued by Ministry of Health, People's Republic of China. 1993, 7: 132-133
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9. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Phamalogical experiment (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 137-138
10. Jiatai Li, clinical pharmacology (second edition). People's Health Publishing House. 1998, 1338-1339.
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Ejemplo 1
Suministro de péptidos a través de especies bacterianas de Lactobacillus modificadas genéticamente
Lo siguiente se proporciona como un método ejemplar para suministrar los péptidos usados en esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica el péptido por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión usando técnicas convencionales de ingeniería genética familiares para los especialistas en la técnica. El vector de expresión seleccionado contiene un promotor constitutivo funcional en Lactobacilli, un sitio de clonación múltiple para la introducción de secuencias de ADN en una orientación 5' a 3' específica así como un gen marcador de selección que confiere resistencia a un antibiótico (para ayudar en procedimientos de clonación) y puede comprender otras secuencias para ayudar en la producción y/o secreción de los péptidos, tales como secuencias peptídicas señal. Un ejemplo de dicho vector se proporciona por la Patente de Estados Unidos Nº 5.592.908, de Pavla. En resumen, esta patente analiza varios promotores conocidos que funcionan en especies de Lactobacillus, así como un método para descubrir nuevos promotores en dichas bacterias, cualquiera de los cuales puede unirse de forma funcional a un ácido nucleico que codifica un péptido usado en la presente invención para expresar el péptido en Lactobacilli. Un ácido nucleico que codifica un péptido señal, tal como péptidos que comprenden de 16 a 35 aminoácidos principalmente hidrófobos que son activos en Lactobacillus lactis descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 5.529.908, citados anteriormente se intercala entre el promotor y el ácido nucleico que codifica el péptido usado en la presente invención de modo que el ácido nucleico que codifica el péptido señal está en fase con el ácido nucleico que codifica el péptido.
Además de la secuencia codificante del péptido, la secuenciad e ADN sintetizada puede comprender secuencias para ayudar en el ligamiento y clonación de dicho ADN en el vector de expresión. Por ejemplo, pueden incorporarse sitios de reconocimiento de enzimas de restricción que corresponden con los encontrados en el sitio de clonación múltiple del vector en el ADN sintetizado en los extremos 5' y 3' de la secuencia, de modo que la secuencia pueda clonarse en la orientación apropiada dentro del vector. Tanto el vector como el ADN sintetizado se digieren con las enzimas de restricción particulares, después se purifican. Las reacciones de ligamiento con el vector y el ADN sintetizado están seguidas de la introducción por transformación en una cepa adecuada de E. coli. Las bacterias transformadas se siembran en placas en medios que contienen el antibiótico al que el vector confiere resistencia. Se selecciona una colonia de bacterias transformadas para procedimientos de cultivo de crecimiento y preparación de plásmidos; se confirma la presencia del ADN sintetizado en la orientación correcta.
Este vector de expresión después se introduce por transformación en una célula hospedadora bacteriana de una especie de Lactobacillus, tal como L. acidophilus. Las células transformadas se seleccionan en virtud del marcador de selección encontrado dentro de la secuencia del vector y la secreción del péptido puede verificarse realizando una transferencia de western, realizando electroforesis en gel de los péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales. Se elige una colonia transformada de bacterias y se usa para preparar cultivos a gran escala de las bacterias modificadas genéticamente. Se hace crecer un cultivo de las bacterias modificadas genéticamente que expresan el péptido deseado y al menos una parte del mismo se administra en el conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos bacterianos pueden tratarse en una diversidad de modos para producir un suplemento para el consumo entérico por el hospedador. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos para conservar las bacterias, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos es bien conocido en la técnica. Por ejemplo, las bacterias pueden usarse para preparar productos lácteos cultivados u otros productos alimenticios para consumo humano, de modo que el organismo que expresa el péptido colonice el intestino del organismo hospedador. Se describen varios métodos diferentes para incorporar cepas específicas de bacterias ácido lácticas en productos alimenticios tales como yogurt, kimchi, queso y mantequilla en la Patente de Estados Unidos Nº 6.036.952, de Oh. Tras el consumo de las bacterias a través de una de cualquiera de las vías, los organismos modificados pueden colonizar el intestino y permitir la presentación y/o absorción de los péptidos de esta invención mediante la capa mucosa del intestino.
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Ejemplo 2
Suministro de péptidos a través de una forma modificada genéticamente de Bacillus subtilis
Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para suministrar el péptido útil en esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuenciad de ADN que codifica el péptido por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector lanzadera, tal como pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), capaz de propagarse tanto en E. coli como en B. Subtilis y que contiene un gen de resistencia a antibióticos para seleccionar colonias de bacterias transformadas. Este vector puede contener un promotor constitutivo activo en B. subtilis, tal como un promotor derivado del gen Sac B de B. subtilis así como una secuencia de nucleótidos que codifica un péptido señal o líder activo en B. subtilis que dirige la exportación eficaz de proteínas heterólogas expresadas desde la célula bacteriana. Un ejemplo de dicho vector se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 6.268.169, de Fahnestock. En resumen, como se ha detallado anteriormente, se sintetizará el ADN que codifica un péptido con sitios de enzimas de restricción y/u otras secuencias para facilitar la clonación del ADN a través de técnicas familiares para los especialistas en la técnica. Después de la introducción por transformación en E. coli., la siembra en placa, la selección y la propagación del plásmido para crear una reserva de plásmido, después el plásmido se introduce por transformación en B. subtilis y los transformantes se seleccionan en virtud de su resistencia a un antibiótico en el medio de siembra.
La producción de péptido y la secreción desde B. subtilis modificado genéticamente se verifica usando técnicas bien conocidas para los especialistas en la técnica, tales como radiomarcaje de péptidos para la detección auto-radiográfica después de análisis por SDS-PAGE o transferencia de Western.
Se hace crecer un cultivo de bacterias modificadas genéticamente y se administra al menos una parte del mismo al conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse.
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Ejemplo 3
Suministro de péptidos a través de especies de levaduras Saccharomyces modificadas genéticamente
Lo siguiente se proporciona como otro método ejemplar para suministrar el péptido usado en esta invención a un hospedador como se ha descrito anteriormente. Se sintetiza una secuencia de ADN que codifica el péptido por medios químicos y esta secuencia de ADN se inserta en un vector de expresión mediante técnicas de ingeniería genética, siendo todas las técnicas conocidas en la técnica. El vector de expresión seleccionado comprende un vector de expresión de proteínas de levaduras mantenido estable, que comprende un promotor de levaduras constitutivo tal como pADH1, sitios para la replicación del vector tanto en levaduras como en E. coli, un gen o genes que confieren prototrofia a un mutante de levadura auxotrófico para propósitos de selección, un sitio de clonación múltiple (MCS) y, si se desea, secuencias que codifican un péptido señal. Los vectores tales como éste están disponibles en el mercado y son bien conocidos en la técnica o pueden construirse fácilmente usando técnicas convencionales. Después de la inserción del ADN sintetizado en el vector de levaduras, la introducción por transformación en E. coli, la siembra en placa de E. coli transformada en medios selectivos, la selección de una colonia bacteriana transformada y la preparación de ADN plasmídico a partir de un cultivo de crecimiento de las bacterias a partir de dicha colonia, el vector se introduce por transformación en Saccharomyces cerevisiae mediante técnicas bien conocidas tales como transformación con acetato de litio o electroporación. La cepa de Saccharomyces cerevisiae seleccionada para la transformación es una cepa auxotrófica mutante que requerirá un gene en el plásmido para crecer en placas de medio mínimo. Las colonias de levadura transformadas se aíslan sembrando en placa la levadura en medios de cultivo que carecen del gen proporcionado en el vector. Solamente aquellas levaduras que han recibido el vector y su gen de selección y que expresen ese producto génico serán capaces de crecer en colonias en el medio mínimo. La verificación de la secreción del péptido puede obtenerse realizando una transferencia de Western, realizando electroforesis en gel de los péptidos presentes en el medio de cultivo u otras técnicas convencionales.
Se elige una colonia transformada de levaduras y se usa para preparar cultivos a escala mayor. Se hace crecer un cultivo de la levadura modificada genéticamente que expresa el péptido deseado y se administra al menos una parte del mismo al conducto alimentario, la vagina, la tráquea u otra área del organismo hospedador en que las bacterias son capaces de replicarse. Si se desea, los cultivos de levaduras pueden tratarse en una diversidad de modos para producir un suplemento para el consumo entérico por el hospedador. Estos tratamientos incluyen liofilización u otros métodos para conservar las levaduras, además de combinar las bacterias con agentes portadores, tales como soluciones, disolventes, medios de dispersión, agentes de retardo, emulsiones y similares. El uso de estos agentes para preparar suplementos es bien conocido en la técnica. La levadura transformada también puede usarse en la creación de productos alimenticios, tales como productos lácteos fermentados como yogurt y kefir, por técnicas conocidas para los especialistas en la técnica. Como con cultivos de bacterias ácido lácticas vivas en estos productos alimenticios, la levadura transformada coloniza el intestino de forma al menos transitoria y sirve para presentar los péptidos al hospedador mediante la luz del intestino.
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Lin, Gang 
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<120> PÉPTIDOS BIOLÓGICAMENTE ACTIVOS
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<170> FastSEQ para Windows Versión 4.0
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98

Claims (6)

1. Una composición farmacéutica que comprende un péptido que consta de una secuencia de aminoácidos YSL (SEC ID Nº 16).
2. Un método para fabricar una composición farmacéutica que comprende proporcionar un péptido definido en la reivindicación 1; y mezclar dicho péptido con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
3. Un péptido definido en la reivindicación 1 para su uso en el tratamiento de una enfermedad.
4. Uso de un péptido definido en la reivindicación 1 en la fabricación de un medicamento para modular al menos una de las siguientes afecciones: la actividad inmune y el crecimiento de un cáncer.
5. Un péptido definido en la reivindicación 1 para su uso en la modulación de al menos una de las siguientes afecciones: la actividad inmune y el crecimiento de un cáncer.
6. El uso de acuerdo con la reivindicación 4 ó 5, donde dicho cáncer es cáncer hepático o crecimiento de melanoma.
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