NO332061B1 - Renset peptid for bruk som medikament, farmasoytisk sammensetning samt fremgangsmate for fremstilling - Google Patents

Renset peptid for bruk som medikament, farmasoytisk sammensetning samt fremgangsmate for fremstilling Download PDF

Info

Publication number
NO332061B1
NO332061B1 NO20040134A NO20040134A NO332061B1 NO 332061 B1 NO332061 B1 NO 332061B1 NO 20040134 A NO20040134 A NO 20040134A NO 20040134 A NO20040134 A NO 20040134A NO 332061 B1 NO332061 B1 NO 332061B1
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
peptide
peptides
group
day
found
Prior art date
Application number
NO20040134A
Other languages
English (en)
Other versions
NO20040134L (no
Inventor
Wai Ming Wong
Lam Kong
Original Assignee
Cms Peptides Patent Holding Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Cms Peptides Patent Holding Co Ltd filed Critical Cms Peptides Patent Holding Co Ltd
Publication of NO20040134L publication Critical patent/NO20040134L/no
Publication of NO332061B1 publication Critical patent/NO332061B1/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/06—Linear peptides containing only normal peptide links having 5 to 11 amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/04—Anorexiants; Antiobesity agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4716—Muscle proteins, e.g. myosin, actin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
    • C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0806—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1016—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1024—Tetrapeptides with the first amino acid being heterocyclic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K7/00—Peptides having 5 to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K7/04—Linear peptides containing only normal peptide links
    • C07K7/08—Linear peptides containing only normal peptide links having 12 to 20 amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Child & Adolescent Psychology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Vascular Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

30 vesentlig rene og biologisk aktive peptider er beskrevet. Nukleinsyrer som har sekvenser som koder for de biologisk aktive peptidene og farmasøytiske formnulering som produseres derfra, er også beskrevet.

Description

Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse angår peptider for bruk som medikament, spesielt for modulering av minst en av de følgende tilstander: immunaktivitet, hepatittinfeksjon, hepatitt B-infeksjon, omfanget av nefritt og vekst av kreft. Videre vedrører oppfinnelsen farmasøy-tisk sammensetning som omfatter nevnte peptider samt fremgangsmåte for fremstilling av nevnte farmasøytiske sammensetning.
Oppfinnelsens bakgrunn
Peptider er kjent innen teknikken til behandling av sykdommer og som farmasøytiske preparater. For eksempel beskriver US patent 6,191,113 et peptid som har inhibitorisk aktivitet på veksten av glatte muskelceller og som derfor er nyttige til forebygging og behandling av patologiske tilstander som er forbundet med vekst av glatte muskelceller slik som arteriosklerose, restenose etter angioplastikk, luminal stenose etter transplantasjon ("grafting") av blodkar og glatt muskelsarkom. US 6,184,204 beskriver et annet peptid som er funnet å modulere fysiologiske prosesser slik som vektøkningsaktivitet i epitelvekstsonen samt hårvekst. Videre er det i WO0063233 beskrevet polypeptidpesti-cider til bruk i forbindelse med bekjemping av skadedyr herav skadelige insekter i jord-bruk. Preparering av et tripeptidbibliotek på 125 medlemmer er beskrevet i Furka Årpåd et al., Journal of Combinatorial Chemistry, vol. 2, no. 3,2000, s. 220-223.
Oppsummering av oppfinnelsen
Det er derfor et formål ved foreliggende oppfinnelse å identifisere biologisk aktive polypeptider. Mange peptider syntetiseres ved standard kjemiske fremgangsmåter og screenes mht. biologisk aktivitet. Peptidene er gitt koder som har bokstavene CMS et-terfulgt av et tall. Totalt 30 peptider er identifisert å ha en in vivo biologisk aktivitet. Sekvensene og de korresponderende ID nummerne til disse biologisk aktive peptidene er vist i tabell A.
Et første aspekt ved foreliggende oppfinenlse vedrører et renset peptid som omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16 for bruk som et medikament, spesielt for bruk som et medikament for modulering av minst en av de følgende tilstander: immunaktivitet, hepatittinfeksjon, hepatitt B-infeksjon, omfanget av nefritt og vekst av kreft.
Et andre aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører anvendelse av peptidet ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen, for fremstilling av et medikament for modulering av minst en av de følgende tilstander: : immunaktivitet, hepatittinfeksjon, hepatitt B-infeksjon, omfanget av nefritt og vekst av kreft.
Et tredje aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk sammensetning som omfatter peptidet ifølge det første aspekt ved oppfinnelsen.
Et fjerde aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for å fremstille en farmasøytisk sammensetning kjennetegnet ved at den omfatter å tilveiebringe et renset peptid som definert i det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse og blande nevnte peptid med en farmasøytisk akseptabel bærer.
Et femte aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid, hvor peptidet er som definert i det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse, til et menneske ved behandling av kreft.
Et sjette aspekt ved foreliggende oppfinnelse vedrører en farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid, hvor peptidet er som definert i det første aspekt ved foreliggende oppfinnelse, til et menneske for bruk i behandling av en immunologisk lidelse.
Terminologien "hovedsaklig bestående av" slik den anvendes her, refererer til et peptid eller polypeptid som omfatter aminosyresekvensen til peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse sammen med ytterligere aminosyrer i karboksi og/eller aminoterminalende-ne og som opprettholder aktiviteten til peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, som er tilveiebragt heri. Derfor, i et ikke-begrensende eksempel, der hvor aktiviteten til peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse er å modulere immunaktivitet, vil et peptid eller polypeptid "hovedsaklig bestående av" peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse ha aktiviteten til å modulere immunaktivitet slik som forutsatt heri med hensyn til det peptidet, og vil ikke ha noen kjennetegn som i vesentlig grad reduserer peptidets eller polypepti-dets evne til å modulere immunaktivitet eller som i vesentlig grad utgjør en endring av grunnleggende og nye kjennetegn ved peptidet som en modulator av immunaktivitet. Følgelig vil i det foregående eksempelet, et naturlig forekommende fullengde-polypeptid som har en primær aktivitet annen enn å modulere immunaktivitet og som inneholder aminosyresekvensen til et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse et eller annet sted deri, ikke utgjøre et peptid eller polypeptid "hovedsaklig bestående av" et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse. På liknende måte som i det foregående eksemplet, vil et genetisk konstruert peptid eller polypeptid som har en primæraktivitet annen enn å modulere en immunaktivitet, men som omfatter aminosyresekvensen til et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse et eller annet sted deri, ikke utgjøre et peptid eller polypeptid "hovedsaklig bestående av" et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse.
I tillegg til eksemplet med modulering av immunaktivitet som anvendes for å illustrere over, passer den foregående definisjonen også på alle peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse med hensyn til aktivitetene som er forutsatt for slike peptider. Spesielt passer den tidligere nevnte definisjonen på peptider ifølge oppfinnelsen som har aktivitet til å i modulere graden av virusinfeksjon, modulere graden av en hepatittinfeksjon, modulere graden av nefritt, modulere veksten av kreft eller modulere kroppsvekten slik som vist i den detaljerte beskrivelsen nedenfor.
En fagmann på området kan enkelt bestemme hvorvidt et peptid eller polypeptid hovedsaklig består av et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse ifølge den tidligere nevnte definisjonen, ved å måle aktiviteten til peptidet eller polypeptidet ved anvendelse av analyser for modulering av immunaktivitet, modulere graden av en virusinfeksjon, modulere graden av en hepatittinfeksjon, modulere graden av nefritt, modulere veksten av kreft eller modulere kroppsvekten, som er tilveiebragt heri med hensyn til et bestemt peptid ifølge foreliggende oppfinnelse.
Foretrukket refererer terminologien "hovedsaklig bestående av" til peptider eller polypeptider som har mindre enn 20 aminosyreresidier i tillegg til peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse. I en mer foretrukket utførelsesform refererer den samme terminologien til et peptid med mindre enn 15 aminosyreresidier i tillegg til peptidet ifølge den aktuelle ("instant") oppfinnelsen. I en enda mer foretrukket utførelsesform refererer den samme terminologien til et peptid med mindre enn 10 aminosyreresidier i tillegg til peptidet ifølge den foreliggende oppfinnelsen. I en annen foretrukket utførelsesform refererer den samme terminologien til peptider eller polypeptider med mindre enn 6 aminosyrer i tillegg til et av peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. I en annen foretrukket utførelsesform refererer den samme terminologien til peptider eller polypeptider med mindre enn 4 aminosyrer i tillegg til et av peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. I den mest foretrukne utførelsesformen refererer samme terminologien til peptider eller polypeptider med mindre enn 2 aminosyrer i tillegg til et av peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse
Detaljert beskrivelse
Peptidene kan enkelt syntetiseres ved standard fremgangsmåter fra L-aminosyrer, men kan også syntetiseres ved hjelp av genteknologiske fremgangsmåter ved anvendelse av nukleinsyrer som har sekvenser som koder for de individuelle peptidene.
I. Biologisk aktivitet
For å undersøke den mulige biologiske aktiviteten til peptidene, ble den immunologiske effekten til peptidene undersøkt på dyremodeller, med metoder som retter seg etter "Principles of Pre-clinical Research of New Drugs" som er utgitt av Helseministeren i Folkereplikken Kina
T-lymfocytt transformasjonstesten, NK-cellecytotoksisitets aktivitetstesten og T-lymfocytt IL-2 og IFN-y sekresjonstesten ble anvendt for å detektere enhver mulig effekt av peptidene på spesifikke cellulære funksjoner. Karbonpartikkel-spaltings ("clea-rance") testen ble anvendt for å detektere enhver mulig effekt av peptidene på ikke-spesifikk cellulær immunfunksjon. "Sheep Red Blood Cell (SRBC)" hemolyse-
testen ble anvendt for å detektere enhver mulig effekt av peptidene på humoral immunfunksjon. Immunitetsorganvekt-testen ble anvendt for å detektere enhver mulig effekt av peptider på organnivået.
I dette studiet ble saltoppløsningsgruppen anvendt som negativ kontroll, mens IL-2 og IFN-y gruppene ble anvendt som positive kontroller, da IL-2 og IFN-y er godt studerte immunostimulatorer[10]. 4 vilkårlige konsentrasjoner av peptidprøvene ble anvendt i dette studiet for å dekke et 1000-gangers doseringsområde. På grunn av den indre kompleksiteten i immunologiske responser in vivo og mangelen på tidligere kunnskap om dosering versus responsfunksjon, har enhver statistisk signifikant forskjell over den negative kontrollen i samtlige doseringsgrupper blitt regnet som positiv biologisk aktivitet.
Resultatene av dette studiet er som følger:
1. Peptidene CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021, CMS029 og CMS034 ble funnet å være istand til å forsterke T-lymfocytt transformasjon, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløs-ning. Peptidene CMS0014 og CMS036 ble også funnet å være istand til å inhibere T-lymfocytt transformasjon med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. 2. Peptidene CMS001, CMS002, CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 ble funnet å være istand til å øke den cytotoksiske aktiviteten til NK-celler, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. Peptidene CMS008 og CMS012, i hensiktsmessig konsentrasjon, ble også funnet å være istand til å nedsette den cytotoksiske aktiviteten til NK-celler, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. 3. Peptidene CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS015, CMS020, CMS022 og CMS034 ble funnet å være istand til
å forsterke sekresjonen av interleukin-2 (IL-2) fra T-lymfocytter, med statistisk
signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning.
4. Peptidene CMS001, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS016, CMS021, CMS022 og CMS028 ble funnet å være istand til å forsterke sekresjonen av IFN fra T-lymfocytter, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. 5. Peptidene CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 ble funnet å være istand til å forsterke syntesen av anti-SRBC antistoff etter provokasjon med antigen, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. Peptidene CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034 og CMS036, i egnet konsentrasjon, ble også funnet å være istand til å inhibere syntesen av anti-SRBC antistoff etter antigen-provokasjonen, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. 6. Peptidene CMS003, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS024, CMS027, CMS030, CMS035, CMS036 ble funnet å være istand til å forsterke den fagocytotiske aktiviteten til mononukleær fagocytt, med statistisk signifikant forskjell
fra den normale kontrollgruppen med saltløsning.
7. Peptidene CMS001, CMS002, CMS008, CMS010, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 ble funnet å være istand til å øke vekten av thymuskjertelen, med statistisk signifikant forskjell fra
den normale kontrollgruppen med saltløsning.
8. Peptidene CMS019, CMS020 og CMS030 ble funnet å være istand til å øke vekten til milten, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning. Peptidene CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS013, CMS014, CMS015, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027, CMS029 og CMS036 i hensiktsmessig konsentrasjon, ble også funnet å være istand til å senke vekten til milten, med statistisk signifikant forskjell fra den normale kontrollgruppen med saltløsning.
Materialene og fremgangsmåtene som er anvendt for å analysere effekten av peptidene på mus er beskrevet nedenfor.
Materialer
1. Forsøksdyr
BALB/c mus, vekt 18-22 g, 50% hunner og 50% hanner, tilveiebragt av Senter for for-søksdyr, Nasjonalt Institutt for Medisinsk Vitenskap, FR Kina.
2. Administrering
rekombinant mus IFN-y (rmIFN-y) gruppe: 3 x 105 IU/kg/døgn rekombinant humant IL (rhIL)-2 gruppe: 3 x IO<5>IU/kg/ døgn
saltløsningsgruppe: 0.5 ml/hver/døgn
peptiddose I gruppe: 500 jxg/kg/døgn
peptiddose II gruppe: 50 ng/kg/døgn
peptiddose III gruppe: 5 |ig/kg/døgn
peptiddose IV gruppe: 0.5 jig/kg/døgn
Samtlige av de ovenfor nevnte substansene ble løst i 0.5 ml saltløsning og injisert intraperitonealt (i.p.) i 15 sammenhengende dager, en gang pr. døgn.
Hovedreagenser
Peptidene er produsert laget på bestilling av American Peptide Company, Inc., USA Fetalt bovinserum og RPMI-1640 cellekulturmedium, Gibco, USA
MTT og ConA, Sigma, USA
rmIFN-y, Beijing Biotech Inc., Kina
rhIL-2, Shanghai Huaxin Biotech Inc., Kina
Lymfocytt separasjonsløsning, Research Institute of Hematologic Disease, Nasjonalt Institutt for Medisinsk Vitenskap, FR Kina
Vesikulært Stomatitt Virus (VSV), IFN-y og IL-2 standardprøve, Nasjonalt Institutt for Kontroll av Farmasøytiske og Biologiske Produkter, FR Kina
HT-2 celle og L929 celle, gave fra Prof WF Chen ved Beiling Universitetet, Avdeling for Immunologi, FR Kina
Fremgangsmåte
1. Effekten av pe<p>tidene på cellulær immunitet
1.1 Fremstillin<g>av cellesuspension fra milt ^
BALB/c musene ble vilkårlig delt i peptid, IFN, IL-2 og saltløsningsgruppene. 10 mus pr. gruppe. Dagen etter administrering av siste testsubstans avlives musene ved cervikal dislokasjon. Milten isoleres sterilt og dispergeres manuelt i kald D-Hanks løsning ved anvendelse av en injeksjonsnål. Den dispergerte cellesuspensjonen siles videre gjennom en 100 "gauge" rustfri stålsil med en diameter på 150 um. Etter sentrifugering ved 200g i 10 minutter kastes supernatanten. Cellepelletten resuspenderes i 10 volumer Tris-NH4CI buffer og far stå stille i 10 minutter ved romtemperatur. De suspenderte cellene samles ved sentrifugering ved 150g i 10 minutter. Cellene vaskes 2-4 ganger med kald D-Hanks løsning ved resuspendering og samles med sentrifugering ved betingelser slik som beskrevet over. De vaskede cellene fortynnes deretter til ønsket celletetthet med RPMI-1640 kulturmedium som inneholder 10% fetalt bovint serum.
1. 2 Peptidenes effekt på T- lvmfocytt- transformasjon
Miltceller med en tetthet på lxl0<6>/ml plasseres på en 96 brønners cellekulturplate, 100 ul/brønn, 3 parallelle brønner av hver av analyseprøvene og kontrollprøve pr. mus. Til analysebrønnene tilsettes 100 ul/brønn ConA av 100 ug/ml i RPMI-1640 og 100 ug/brønn ren RPMI-1640 anvendes som kontroller. Cellene inkuberes i 66 timer ved 37°C, 5% CO2. Cellene pelletteres deretter med sentrifugering ved 150g i 10 minutter. Supernatanten samles og oppbevares ved -20°C- for bestemmelse av IL-2 og IFN. 50 ul/brønn MTT av 1 mg/ml i RPMI-1640 tilsettes til cellepelletten og cellene resuspenderes med rysting i 2 minutter. Inkubasjonen fortsetter i 4 timer. Supernatanten kastes etter sentrifugering ved 150g i 10 minutter. 120 ul 40 mM HCl-2-propanol tilsettes til cellepelletten og rystes i 3 minutter. Det anvendes en ELISA-leser for å oppnå OD57onm fra hver brønn med 630nm som referanse.
Beregning:
Hver mus dannet 3 analysebrønner og 3 kontrollbrønner. Stimuleringsindeksen (SI) til hver mus ble oppnådd ved først å utlede gjennomsnittlig OD fra de 3 parallelle brønne-ne og deretter dividere verdien til analysebrønnene med kontrollbrønnene.
1. 3 Peptidenes effekt på NK- celleaktivitet[ 3' 4]
Miltceller fra mus klargjøres til 4 x 106/ml slik som beskrevet i avsnitt 1.1 over. Målcellene YAC-1 bringes til log-fase og justeres til lxl05/ml. Ved anvendelse av 96 brønners cellekulturplater tilsettes 100 ul miltceller fra mus og 100 ul kulturmedium til kontroll-brønnen som kun inneholdt miltcellene, 100fal målceller og 100 ul kulturmedium tilsettes til kontrollbrønnen som kun inneholdt målceller, 100 ul miltceller fra mus og 100 ul målceller tilsettes til NK-aktivitetsanalysebrønnen. 3 parallelle serier av det ovennevnte fremstilles pr. mus.
Prøvene sentrifugeres ved 150g i 10 minutter for å samle cellene. Supernatantene kastes og 50 ul/brønn MTT med 1 mg/ml tilsettes. Reaksjonsblandingen rystes deretter i 2 minutter og inkuberes ved 37°C, 5% CO2i 4 timer. Supernatantene kastes etter sentrifugering ved 150g i 10 minutter. 120 ul 40 mM HCl-2-propanol tilsettes og rystes i 3 minutter. Det anvendes en ELISA-leser for å oppnå ODs7onm fra hver brønn med 630nm som referanse.
Beregning:
Hver mus har 9 brønner: 3 miltceller kun kontroll, 3 målceller kun kontroll og 3 analy-sebrønner både med milt og målceller. NK-celleaktivitetsindeksen for hver mus oppnås ved først å utlede gjennomsnittlig OD til de 3 parallelle brønnene fra hver kombinasjon og deretter benytte denne gjennomsnittlige OD i følgende formel: NK-celleaktivitetsindeks = [1-(gjennomsnittlig OD fra milt og målceller - gjennomsnittlig OD fra brønnen med kun miltceller) + (gjennomsnittlig OD fra brønnen med kun målceller) x 100%
1. 4 Peptidenes effekt på T- lvmfocvttaktiviteten i utskilling av IL- 2[ 5]
HT-2 celler i log-fase høstes med sentrifugering ved 150g i 10 minutter og vaskes 3 ganger med kald Hanks-løsning ved resuspendering og sentrifugering. De høstede HT-2 cellene ble resuspendert i RPMI-1640 og inkuberes ved 37°C, 5% CO2i 30 minutter. Cellene vaskes ytterligere to ganger med RPMI-1640 ved resuspendering og sentrifugering, og resuspenderes til sluttkonsentrasjon på 2 x 105/ml med RPMI-1640.
Supernatanten som oppnås i avsnitt 1.2 fortynnes til følgende prosent med RPMI-1640: 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25% og 3.125%.
rIL-2 fortynnes til følgende konsentrasjon med RPMI-1640: 500 IU/ml, 250 IU/ml, 125 IU/ml, 62.5 IU/ml, 31.25 IU/ml og 15.5 IU/ml.
En 96 brønners cellekulturplate settes opp med 3 parallelle brønner pr. kombinasjon: Negativ kontroll: 100 ul RPMI-1640 + 100 ul HT-2 cellesuspensjon
rIL-2 standard: 100 ul rIL-2 løsning + 100 (J.1 HT-2 cellesuspensjon Analysebrønn: 100 ul fortynnet supernatant + 100 ul HT-2 cellesuspensjon
Platen inkuberes ved 37°C, 5%C02i 68 timer og sentrifugeres deretter ved 150g i 15 minutter og supernatanten fjernes. 100 ul 0.5 mg/ml MTT i RPMI-1640 uten fenolsul- fonfthalein tilsettes til hver brønn. Etter rysting i 3-4 minutter, resuspenderes cellene, og inkuberingen fortsetter i ytterligere 4 timer. Prøver sentrifugeres deretter ved 150g i 15 minutter og supernatanten fjernes. Til hver brønn tilsettes 120 ul 40mM HC1-2-propanol, blandes i 3-4 minutter og OD analyseres ved 570nm, med 630nm som referanse med en ELISA-plateleser.
Beregning:
Gjennomsnittlig OD for de 3 parallelle brønnene fra hver fortynning ble plottet mot konsentrasjon på et semi-log papir, konsentrasjon på X-aksen. Konsentrasjonen ved 50% ODmetning ble fremstilt for både testsupernatanten og rIL-2.
IL-2 aktivitet i prøve = (prøvefortynning ved 50% maksimum virkning -s- rIL-2 standard fortynning ved 50% maksimum virkning) x aktivitet til rIL-2 standard ved 50% maksimum virkning (IU/ml)
1.5 Effekten av peptider på T- lymfocyttenes aktivitet til å utskille interferon ( IFN)[ 6] Supernatanten fra avsnitt 1.2 fortynnes med RPMI-1640 kulturmedium til følgende prosent: 100%, 50%, 25%, 12.5%, 6.25% og 3.125%.
Den rekombinante interferon (rIFN) standarden fortynnes med RPMI-1640 til følgende konsentrasjoner: 500IU/ml, 250IU/ml, 125IU/ml, 62.5IU/ml, 31.25IU/ml og 15.5 IU/ml.
Målcellene L929 i log-fase justeres til 2 x 10<5>/ml med RPMI-1640, og behandles på samme måte som HT-2 cellene som er beskrevet i avsnitt 1.4. Stamløsning VS V justeres også til 100 TCIDsomed RPMI-1640.
Følgende settes opp på en 96 brønners kulturplate, i 3 parallelle brønner pr. kombinasjon:
Negativ kontrollbrønn: 150 ul RPMI-1640 + 100 ul L929
Positiv kontrollbrønn: 100 ul RPMI-1640 + 100 ul L929 + 50 ul VS V
rIFN aktivitetsbrønn: 100 ul rIFN standard + 100 ul L929 + 50 ul VS V Analysebrønn: 100 ul fortynnet supernatant + 100 ul L929 + 50 ul VS V
Prøvene inkuberes ved 37°C, 5% CO2i 24 timer. De positive kontrollbrønnene observeres periodisk under invertert mikroskop for å bekrefte cellelysering, samles deretter, vaskes og OD for alle brønnene avleses på samme måte som beskrevet i avsnitt 1.4.
Beregning:
Konsentrasjoner ved 50% maksimum virkning oppnås på samme måte som i avsnitt 1.4. IFN-aktivitet i prøven beregnes på følgende måte: IFN-aktivitet i prøven = (prøvefortynning ved 50% maksimum virkning - rIFN stan-dardfortynning ved 50% maksimum virkning) x standard rIFN aktivitet ved 50% maksimum virkning (IU/ml)
2. Effekten av pe<p>tidene på dannelse av antistoff^
Røde blodceller fra sau ("Sheep red blood cells", SRBC) fremstilles ved å samle blod fra cervikalvenen og samles i en steril kolbe med glasskuler. Kolben rystes i 3 minutter og deretter blandes blodet med Alsever-løsning (2.05g glukose, 0.4g NaCl, 0.8g Na lemonade, justert til lOOml med destillert vann) og oppbevares ved 4°C. Umiddelbart før anvendelse sentrifugeres prøvene ved 130g i 5 minutter for å høste SRBC. Cellene vaskes to ganger ved resuspensjon og sentrifugering i normal saltløsning. Deretter høs-tes cellepelletten med sentrifugering ved 180g i 10 minutter og resuspenderes i saltløs-ning for å lage den endelige effektive fungerende ("working") SRBC suspensjonen, 2%
(v/v).
Komplement fremstilles ved å tilsette 10 volumer ferskt Cavy-serum til ett volum sent-rifuge-pakket SRBC, og deretter rystet forsiktig i 30 minutter ved 4°C. SRBC fjernes ved sentrifugering ved 200g i 10 minutter. 10 volumer normal saltløsning ble tilsatt for å oppnå en fungerende komplement løsning.
BALB/c musene deles vilkårlig i peptidgruppe, IFN-gruppe, IL-2 gruppe og salingruppe, 10 mus pr. gruppe. Testsubstansene administreres slik som beskrevet i avsnitt 1., pluss intraperitoneal injeksjon av 0.2ml SRBC pr mus på dag 12. Dagen etter admi-nistreringen av siste testsubstans (dag 16), samles blod fra øyekantus og far stå ved romtemperatur i 1 time for serumeksudasjon. Etter sentrifugering ved 200g i 10 minutter fortynnes serumet 500 ganger med normal saltløsning.
Til 1 ml fortynnet museserum fra hver mus tilsettes O.Sml SRBC suspensjon. Iskald. Deretter tilsettes 1 ml fungerende komplementløsning og inkuberes på 37°C vannbad i 10 minutter. Reaksjonene stoppes iskaldt. Prøvene sentrifugeres ved 200g i 10 minutter for å oppnå supernatanten.
Til 1 ml av denne supernatanten tilsettes 3ml Drabkin-løsing og settes ved romtemperatur i 10 minutter. OD54onm oppnås.
Beregning:
Referanse OD54onmoppnås ved å blande 0.25ml SRBC suspensjon med Drabkin-løsning til 4ml og plasseres ved romtemperatur i 10 minutter før ODs40nm avleses.
3. Effekten av peptidene på fagocvtosefunksion i mononukleær fagocvtt og vekt av
immunorgan1 [8.9].
Dagen etter administrering av siste testsubstans (dag 16), injiseres musene 0.1 ml/kg kroppsvekt "Indian ink" (5 ganger fortynnet med normal saltløsning) fra halevenen.
1 minutt og 5 minutter etter injiseringen av "Indian ink" samles 20 ul blod fra øyekantus med en heparinisert slange. Blodet blandes med 2ml 0.1 % w/v Na2C03og deretter oppnås OD680nm- "Outline clear" indeksen K beregnes med følgende formel:
Tegnforklaring:
Al: OD680nm første minutt
A2: OD680nm femte minutt
t2: 5 minutter
t2: 1 minutt
Dagen etter administrering av siste testsubstans (dag 16) fjernes lever, milt og thymus kjertel, tørkes med filterpapir og veies. Fagocytoseindeksen a beregnes slik som vist nedenfor:
Tegnforklaring:
W: kroppsvekt
Wls: vekten til lever pluss milt
Resultater
På grunn av den store mengden rådata som er involvert, presenteres kun de kompilerte sluttresultatene. Gruppene uten statistisk signifikant forskjell fra den negativ saltløs-ningskontrollen er også utelatt.
1. Effekt av peptidene på T- lvmfocvttransformasion
Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS002, CMS007, CMS008, CMS010, CMS012, CMS015, CMS019, CMS021 og CMS029 funnet å være istand til å forsterke T-lymfocytt-transformasjon som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS010 og CMS015 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 1 nedenfor.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS001, CMS002 og CMS003 funnet å være istand til å stimulere T-lymfocyttransformasjon som har en statistisk signifikant forskjell fra saltløs-ningsgruppen, IFN-y gruppen, IL-2-y gruppen (P<0.05). CMS014 og CMS036 ble funnet å være istand til å inhibere T-lymfocyttransformasjon med en statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (PO.05). Data er vist i detalj i tabell 2 nedenfor.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS001, CMS003, CMS007 og CMS034 funnet å være istand til å stimulere T-lymfocyttransformasjon med en statistisk signifikant forskjell fra saltløs-ningsgruppen, (P<0.05) slik som vist i tabell 3.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS008, CMS010 og CMS011 funnet å være istand til å stimulere T-lymfocyttransformasjon med en statistisk signifikant forskjell fra saltløs-ningsgruppen, (P<0.05) slik som vist i tabell 4.
2. Effekt av pe<p>tidene på NK- cellenes c<y>totoksiske aktivitet Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS010, CMS013, CMS016, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 funnet å være istand til å øke NK-cellenes cytotoksiske aktivitet som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS010, CMS016 og CMS030 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 5.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS001, CMS003, CMS015, CMS021, CMS026 og CMS035 funnet å være istand til å øke NK-cellenes cytotoksiske aktivitet som har en statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS021 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen og IL-2-y gruppen (PO.05). CMS012 ble funnet å være istand til å inhibere NK-cellenes cytotoksiske aktivitet som har en statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05)
(P<0.05). Data er vist i detalj i tabell 6 nedenfor.
Ved 5Mg/kg/døgn ble CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS020, CMS024, CMS034 og CMS036 funnet å være istand til å øke NK-cellenes cytotoksiske aktivitet med en statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen, (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS008 og CMS009 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 7.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS002, CMS011, CMS012, CMS022, CMS028 og CMS035 funnet å være istand til å øke NK-cellenes cytotoksiske aktivitet med en statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen, (P<0.05). CMS008 ble funnet å være istand til å inhibere NK-cellenes cytotoksiske aktivitet som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Detaljerte data er vist i tabell 8 nedenfor.
3. Effekt av peptidene på T- lvmfocvttenes aktivitet i utskilling av IL- 2
Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS007, CMS009, CMS010 og CMS015 funnet å være istand til å fremme IL-2 sekresjon fra T-lymfocytter som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS007 og CMS015 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IL-2 gruppen (PO.05). Og CMS009 og CMS010 ble også funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra både IFN-y og IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 9.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS001 og CMS003 funnet å være istand til å fremme T-lymfocyttenes aktivitet til å utskille IL-2, som er statistisk signifikant forskjellig fra salt-løsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS003 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 10.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS007, CMS012 og CMS020 funnet å være istand til å fremme T-lymfocyttenes aktivitet til å utskille IL-2 som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 11.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS010, CMS011, CMS012, CMS022, og CMS034 funnet å være istand til å fremme T-lymfocyttenes aktivitet til å utskille IL-2 som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS034 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IL-2 gruppen (P<0.05). Og CMS011 og CMS022 ble også funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra både IFN-y og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 12.
4. Effekt av pe<p>tidene på T- lymfocyttenes aktivitet i utskillin<g>av IFN
Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS010, CMS013 og CMS016 funnet å være istand til å fremme interferon (IFN) sekresjon fra T-lymfocytter som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen, IFN-y gruppen, IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 13.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS001, CMS003 og CMS021 funnet å være istand til å fremme IFN-sekresjon fra T-lymfocytter, som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløs-ningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS021 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 14.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS009 og CMS012 funnet å være istand til å fremme IFN-sekresjon fra T-lymfocytter, som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsnings-gruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS009 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 15.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS010, CMS011, CMS022 og CMS028 funnet å være istand til å fremme IFN-sekresjon fra T-lymfocytter, som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS010 og CMS021 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 16.
5. Effekt av peptidene på dannelsen av antistoffer
Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS029, MS033 og CMS035 funnet å være istand til å fremme dannelse anti-SRBC antistoffer som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (PO.05). Blant disse peptidene ble CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS013, CMS019, CMS024 og CMS035 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen (PO.05). Og CMS009, CMS010, CMS011, CMS012, CMS014, CMS015, CMS016, CMS020, CMS023, CMS029 og CMS033 ble også funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 17.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS003, CMS011, CMS012, CMS013, CMS015, CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 funnet å være istand til å fremme dannelse anti-SRBC antistoffer som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (PO.05). Blant disse peptidene ble CMS011, CMS013 og CMS015 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen (PO.05). Og CMS021, CMS022, CMS023, CMS026, CMS027, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 ble også funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05). CMS009 ble funnet å være istand til å inhibere dannelse av anti-SRBC antistoff, som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (PO.05). Detaljerte data er vist i tabell 18 nedenfor.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS001, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMSOl 1, CMS012, CMS013, CMS015, CMS016, CMS019, CMS020, CMS021, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 funnet å være istand til å fremme dannelse av anti-SRBC antistoffer som er statistisk signifikant forskjellig fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS003, CMS008, CMS009, CMSOl2, CMSOl 5, CMS016, CMS020 og CMS021 funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra IFN-y gruppen (PO.05). Og CMS001, CMS007, CMSOl 1, CMS019, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 ble også funnet å være statistisk signifikant forskjellig fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 19.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS021, CMS023, CMS024, CMS027 og CMS033 funnet å være istand til å fremme dannelse av anti-SRBC antistoffer med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (PO.05). Blant disse peptidene ble CMS021 og CMS033 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IFN-y gruppen (PO.05). Og CMS023, CMS024 og CMS027 ble også funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05). CMS002, CMS003, CMS009, CMS010, CMSOl 1, CMS013, CMS014, CMS015, CMS018, CMS019, CMS020, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS034 og CMS036 ble også funnet å være istand til å inhibere dannelse av anti-SRBC antistoffer som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Detaljerte data er vist i tabell 20 nedenfor.
6. Effekten av peptider på den fagocytotiske aktiviteten til mononukleær fagocytt Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS003, CMS008, CMS020, CMS022 og CMS024 funnet å være istand til å forsterke den fagocytotiske aktiviteten til mononukleære fagocytter som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS002 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05) slik som vist i tabell 21.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMSOl9, CMS024 og CMS030 funnet å være istand til å forsterke den fagocytotiske aktiviteten til mononukleære fagocytter som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (PO.05). Blant disse peptidene ble CMSOl9 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 22.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS003<*>, CMS008, CMS009, CMS010, CMSOl 1, CMSOl 3, CMS016, CMS018, CMS019 og CMS035 funnet å være istand til å forsterke den fagocytotiske aktiviteten til mononukleære fagocytt, som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS003, CMS009, CMS010, CMS016, CMS019 og CMS035 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 23.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS024, CMS027 og CMS036 funnet å være istand til å forsterke den fagocytotiske aktiviteten til mononukleære fagocytter som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (PO.05). Blant disse peptidene ble CMS024 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 24.
7. Effekt av peptidene på vekten av et immunorgan
Ved 500 ug/kg/døgn ble CMS008, CMS010, CMS016, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 funnet å være istand til å øke vekten til thymus-kjertelen som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS027 og CMS034 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05). Og CMS008, CMS022, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033 og CMS035 ble også funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 25.
Ved 500 ug/kg/døgn ble CMSOl9 runnet å være istand til å øke vekten til milten som har statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppene av saltløsning (P<0.05) slik s om vist i tabell 26. CMS001, CMS003, CMS007, CMS009, CMSOl 1, CMS013, CMS014, CMSOl5, CMS021, CMS023, CMS024, CMS027 og CMS036 funnet å være istand til å senke vekten til milten med statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppene av salt-løsning (PO.05). Detaljerte data er vist i tabell 26 nedenfor.
Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034 og CMS036 funnet å være istand til å øke vekten til thymus-kjeitelen som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsnings-gruppen (PO.05). Blant disse peptidene ble CMS034 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05). Og CMS002, CMS008, CMS012, CMS014, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS030, CMS032 og CMS036 ble også funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 27. Ved 50 ug/kg/døgn ble CMS008, CMSOl 0 og CMS029 funnet å være istand til å senke vekten til milten som har statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen av saltløs-ning (P<0.05). Detaljerte data er vist i tabell 28 nedenfor.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS001, CMSOIO, CMSOl 1, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034 og CMS036 runnet å være istand til å øke vekten til thymus-kjeitelen som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS002, CMS014, CMS024 og CMS030 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05). Og CMSOIO, CMS012, CMS018, CMS019, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS032, CMS034 og CMS036 ble også funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 29.
Ved 5 ug/kg/døgn ble CMS030 funnet å være istand til å øke vekten til milten som har statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen av saltløsning (P<0.05). CMSOl 5 ble funnet å være istand til å senke vekten til milten, som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Detaljerte data er vist i tabell 30 nedenfor.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS002, CMS008, CMSOIO, CMSOl2, CMS014, CMSOl8, CMS020, CMS022, CMS026, CMS028, CMS030 og CMS032 funnet å være istand til å øke vekten til thymus-kjertelen som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsnings-gruppen (P<0.05). Blant disse peptidene ble CMS008 og CMS012 funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra IL-2 gruppen (PO.05). Og CMS002, CMS020 og CMS030 ble også funnet å ha statistisk signifikant forskjell fra både IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (PO.05) slik som vist i tabell 31.
Ved 0.5 ug/kg/døgn ble CMS020 funnet å være istand til å øke vekten til milten som har statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen av saltløsning, IFN-y gruppen og IL-2 gruppen (P<0.05). CMS001 ble funnet å være istand til å senke vekten til milten, som har statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Detaljerte data er vist i tabell 32 nedenfor.
Til oppsummering; vi fant at peptidene CMS001, CMS002, CMS003, CMS007, CMS008, CMS009, CMSOIO, CMSOl 1, CMS012, CMS013, CMS014, CMS015, CMS016, CMS018, CMS019, CMS020, CMS021, CMS022, CMS023, CMS024, CMS026, CMS027, CMS028, CMS029, CMS030, CMS032, CMS033, CMS034, CMS035 og CMS036 har in vivo biologisk aktivitet i dyreforsøksmodellen som ble testet.
II. PEPTIDENES ANTIVIRALE EFFEKT IN VIVO
For å finne ut hvorvidt disse peptidene har mulig terapeutisk effekt på virale infeksjoner, benyttet vi dyremodellen and ("duck") hepatitt B infeksjon i dette studiet for å teste ut in vivo effektene til de ovenfor nevnte peptidene på syke dyr.
Chongqing and hepatitt B-modellen ble satt opp og behandlet med peptider ved intraperitoneal injeksjon (50 ug/kg/døgn, en gang daglig) i 4 uker. Serumnivået av DHBV
DNA ble analysert ved serum dot-blot hybridisering. Behandling med lamivudin og normal saltløsning ble anvendt som henholdsvis positiv og negativ kontroll. Peptidet CMS001 ble funnet å være istand til å redusere serumnivået av DHBV DNA den 4. uken av behandlingen, med statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen med salt-løsning (P<0.05). Det konkluderes med at CMS001 i egnet doseringsnivå kan anvendes som en del av eller alene til behandling av viral hepatittinfeksjon.
Materialer og fremgangsmåter
1. Peptidene ble syntetisert på bestilling av American Peptide Company, Inc., USA fra L-aminosyrer.
2. Dyremodell<[l]>
En dag gamle Chongqing ender inokkuleres med 0.1 ml stamserum som er posi-tivt for Duck Hepatitt B Virus (DHBV) DNA (5 x 10<7>kopier/ml) ved intraperitoneal injeksjon. En uke senere tas blodprøver fra den eksterne jugulæråren ("ex-ternal jugular vein") og infeksjonen bekreftes ved dot-blot hybridisering med DHBV DNA probe som er merket med digoksin<1->^. Endene ales opp til 2 uker før de deltar i studiet.
3. Gruppering og behandling
DHBV-infiserte ender deles vilkårlig i følgende grupper:
a) Negativ kontrollgruppe (n=9): Normal saltløsning gis 1 ml pr. and ved intraperitoneal injeksjon, én gang daglig. b) Lamivudin gruppen (n=8): Som positiv kontrollgruppe. Lamivudin<[4]>gis 50 mg/kg/døgn ved oral administrering,
én gang daglig.
c) Peptidgruppe (n=9): 50 ug/kg/døgn peptid (justeres til et sluttvo-lum på 0.5 ml til 1 ml med normal saltløs-ning) gis én gang daglig ved intraperitoneal injeksjon.
Behandlingen varte 4 uker og observasjonen fortsatte i ytterligere 1 uke etter at behandlingen ble avsluttet. 1 ml blodprøver ble tatt fra den eksterne jugulæråren hos endene på dag 0, 7,14, 21,28 og 35 når behandling startet. Sera fra blodprøvene ble isolert umiddelbart<1>^ og oppbevart ved -20°C for analyse.
4. Bestemmelse av DHBV DNA nivå i serum
DHBV DNA probe fluorescensmerkes i overensstemmelse med anvisningen fra produ-senten av kittet (Amersham Pharmacia Biotech Co.). 40 ul sera fra and dot-blottes (1 duplikatdot pr. prøve) på nitrocellulosemembran og hybridiseres med fluorescens-merket DHBV DNA-probe for kvantiteirng<1-21>. Etter at hybridiseringen var fullført, ble blottene fremkalt i CDP-Star fluorimetri reagens RPN3690 og scannet med Vuego Sean (Brisa-620st) skanner. ImageMaster TotalLab vi. 11 .Ink software ble anvendt til kvanti-tativ analyse av blottene. Statistisk analyse ble utført i overensstemmelse med par t-test ("pair t-test") med SPSS software.
Resultater
Den negative (normal saltløsning) og positive (lamivudin) kontrollgruppen viste vellykket etablering av hepatitt-dyremodellen. Ved 50 ug/kg/dag ble peptidet CMS001 funnet å være istand til å senke serum DHBV DNA-titer etter 4 ukers behandling med statistisk signifikant forskjell (p<0.05) fra verdien før behandling for de samme dyrene. Ved avsluttet behandling falt serum DHBV DNA-titeren til en verdi som ikke har statistisk signifikant forskjell fra den før behandling, og viser at effekten av peptidet CMS001 kan være reversibel og/eller trenger lenger behandlingsperiode for å utrydde viruset.
Diskusjon
And hepatitt dyremodellen[l] er en etablert forsøksmodell for patogenesestudier av human hepatitt B og til screeningen av terapeutiske midler for hepatitt B. I dette studiet ble CMS001 funnet å være istand til å senke serumtiteren av DHBV DNA etter 4 ukers behandling, og indikerer at peptidet CMS001 i hensiktsmessig dosenivå og med hensiktsmessig anvendelsesskjema, kan være nyttig i seg selv eller i kombinasjon med andre substanser som et middel for behandling av human hepatitt B.
I foreliggende studie ble administrering ved intraperitoneal injeksjon testet, men dette utelukker ikke en mulig effektivitet av peptidet dersom det administreres ved andre alternative måter. Peptidene kan også administreres ved intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, subkutan injeksjon og subkutan implantasjon med eller uten leverings-fremmende middel slik som liposom, beskyttelse som gir forlenget frigivning etc. Peptidet kan også administreres i hvilken som helst form for oral administrering slik som tablett, kapsel, suspensjon, løsning etc. i vanlig formen uten modifisering eller i forlenget frigivningsform eller med eller uten gastroenterisk-beskyttelse. Peptidet kan videre anvendes til hvilken som helst form for topisk applisering slik som salve, krem, gel etc. med eller uten middel som fremmer transdermal transport eller ved inhalasjonspulver, oppløst eller i liposom-beskyttet form. Peptidet kan også være oversatt til sin genetiske sekvens og klonet i et ekspresjonssytem alene eller i kombinasjon med andre peptidsekvenser, for å generere et resulterende peptidmolekyl for å dra nytte av peptidaktiviteten som er beskrevet i denne rapporten, med eller uten rensing av det resulterende peptidet.
Referanser:
1. Chen Yaxi, Guo shuhua, Zhang Dingfeng, et al. Foundation and application of Chongqing duck hepatitis B model. Chinese Journal of Hepatology. 1993,1(2): 89-91
2. Chen Yaxi, Guo shuhua, ChenXuehua. Preparation and application of DHBV
DNA probe labeled with digoxin. Journal of Chongqing University of Medical Sciences. 1994,19(4): 295-297 3. Tang Ni, Huang Ailong, Guo shuhua, et al. Systemic foundation and application of serological parameters of humoral immunity to duck hepatitis B virus. Chinese Journal of Hepatology. 2001, 9(1):13-15 4. Chen Yaxi, Guo shuhua, Qi Zhenyuan, et al. An experimental study of lamivudine against duck hepatitis B virus in combination with famciclovir. Chinese Journalof Hepatology. 2001,9 (4): 209-211
III. EFFEKT AV PEPTIDENE PÅ NEFRITT
For å finne ut hvorvidt disse peptidene har mulig terapeutisk effekt på nefritt, anvendte vi dyremodellen "Masugi nefrittrotte" i dette studiet for å teste ut in vivo effektene av de ovenfor nevnte peptidene på syke dyr.
Hensikten med dette studiet er å undersøke in vivo terapeutisk effekt av peptidene på kronisk glomerulonefritt. Masugi nefrittrotte-modellen ble konstruert ved å injisere kanin anti-rotte-nyrebark IgG i friske Sprague Dawley rotter, og deretter umiddelbart behandlet med intraperitoneal injeksjon av peptider med 50 ug/kg/døgn, en gang daglig i 3 uker. Hydrokortison ble anvendt som positiv kontroll. Det ble funnet at proteinurea, serum kreatininnivå og miltindeks ("splenic index") til rottene som var behandlet med CMSOl 4, CMSOl 8, CMS030 og CMS036, sank sammenlignet med kontrollgruppen, med statistisk signifikans (p<0.05). Postmortum mikroskopisk undersøkelse av nyrene viste at den terapeutiske effekten av disse peptidene var tilsvarende som for behandling med hydrokortison. Det konkluderes med at CMS014, CMSOl8, CMS030 og CMS036 kan anvendes som et middel til behandling av kronisk nefritt.
Materialer
Sprague Dawley (SD) rotter, hanner som veier 120±20 g var fra Senter for Forsøksdyr, Guangzhou Universitetet for Tradisjonell Kinesisk Medisin og først også fra Første Mi-litærmedisinske Universitet. Chinchillakaniner som veide 3 kg kom fra Senter for For-søksdyr, Guangzhou Universitetet for Tradisjonell Kinesisk Medisin.
Peptidene av L-aminosyre opprinnelse, ble syntetisert på bestilling ved American Peptide Company, Inc, USA og ble fortynnet til 10 ug/ml i steril normal saltløsning. Hydrokortison er fra Yangzhou Pharmaceutical Factory, Kina.
Kit til bestemmelse av kreatininnivået i serum er fra Shanghai Rongsheng Biological Technique Company, PR, Kina.
Fremgangsmåter
1. Fremstilling av kanin anti-rotte-nyrebark antiserum<[1]>: 20 friske SD-rotter bedø-ves ved intravenøs injeksjon av 40 mg/kg 3 % natriumpentobarbital. Aorta abdominalis eksponeres og nyrene perfuseres med normal saltløsning til rent blod. Nyrebarken isoleres, homogeniseres i 5 volumer 0.10 M Tris-HCl buffer, pH 8.1 og filtreres gjennom et 140-gauge rustfritt stålnett. Filtratet samles og blandes enten med GIBCO-RRE komplett eller ikke-komplett Freuds adjuvans i 1: 1 og emulgeres for å oppnå den fungerende immuniseringsløsningen. 10 friske kaniner immuniseres med immuniseringsløsningen, første gangen med komplett Freuds adjuvans og deretter med ikke-komplett. Antigenet injiseres hypodermalt gjennom 6 vilkårlige punkter, 0.1 ml pr. punkt, en gang hvert 10. døgn. Fra 6. uke og fremover samles blod fra aurikulærvenen og antistofftiter bestemmes ved dobbeldiffu-sjonsmetoden<[2]>. 18. uke etter immuniseirngsstart bedøves kaninene ved intravenøs injeksjon av 20 mg/kg 3% natriumpentobarbital, og blod samles fra halsarterien. Anti-serum ekstruderes og isoleres deretter. Fullblod samles fra 15 friske SD rotter. Røde blodceller isoleres og vaskes rene tre ganger med normal saltløsning. De rene røde blodcellene blandes med 250 ml kaninan-ti-serum og inkuberes ved 4°C over natten. Etter inkubasjonen fjernes blodcellene ved sentrifugering og supernatanten inaktiveres ved 56°C i 30 minutter. Etter sentrifugering for å fjerne ethvert presipitat isoleres rå IgG og renses delvis fra supernatanten ved pre-sipitering med (NH4)2S04tre ganger (50%, 33% og deretter 33%)<[5]>. Rå IgG gjenopplø-ses i 125 ml dobbeltdestillert vann og dialyseres fritt for ammoniumsulfat. Anti-rotte-nyrebark antistofftiter bestemmes ved dobbeldiffusjonsmetoden<[2]>. 2. Induksjon av glomerulonefritt i rotte<[5]>: 0.25 ml primingsløsning (som inneholder omkring 4 mg ikke-spesifikk kanin IgG med komplett Freuds adjuvans) injiseres intraperitonealt i friske SD rotter for å prime rottene 5 dager før induksjon. Med unntak av normal frisk kontrollgruppe som får normal saltløsning, induseres alle gruppene deretter ved intraperitoneal injeksjon av 1 ml kanin anti-rotte-nyrebark IgG som fremstilles slik som beskrevet i avsnittet Fremgangsmåte 1. 3. Gruppering og administrering: SD-hanner fordeles vilkårlig i grupper med normal frisk kontroll (normal), nefritt placebo behandlingskontroll (placebo), nefritt peptidbehandling og nefritt hydrokortison behandlingskontroll (hydrokortison), 12 pr. gruppe. Behandlingen startes på induksjonsdagen. 50 (j.g/kg/døgn peptider, 3.3 mg/kg/døgn hydrokortison og normal saltløsning ble anvendt som placebo, alt administreres intraperitonealt en gang daglig og varte i 3 uker.
4. Parametre som overvåkes<[4]>:
(a) proteinnivå i urinen: hver rotte holdes adskilt i et bur. Det gis tilstrekkelig drikkevann. Urin samles en gang pr. uke, 24 timer pr. gang. Proteininnhold i urinen bestemmes med Coomassie-blå metoden. (b) Kreatininnivået i serum: blod samles etter 3 ukers behandling og kreatininnivået i serum bestemmes. Kreatinin-kitet var fra Shanghai Rongsheng Biological Technique Company. (c) Miltvekt-indeks: Miltvekt-indeksen bestemmes ved følgende formel: (d) patologisk mikroskopisk undersøkelse av nyrene: 6 av de tyngste nyrene ble plukket ut fra hver gruppe til patologisk undersøkelse.
Statistisk analyse
t-test ble anvendt for sammenligning mellom gruppene, cut-off ble satt til p<0.05. I samtlige grupper ble de to rottene med lavest proteinnivå i urinen utelatt fra de statistis-ke analysene.
Resultater
1. Effekten av peptidbehandling på proteinnivået i urinen
Det ble funnet at peptidene CMS014, CMSOl 8, CMS030 og CMS036 med 50Ug/kg/døgn en gang daglig kan senke proteinnivået i urinen i Masugi nefritt-rottemodellen, med statistisk signifikant forskjell fra den placebo-behandlede kontrollgruppen, p<0.05. Det ble også lagt merke til at veksthastigheten til gruppene CMSOl4, CMS030, CMS036 og hydrokortison har langsommere veksthastighet enn normalen. Veksthastigheten til hydrokortisongruppen sank til en slik størrelse, at etter første uken måtte behandlingsdosen halveres for å unngå alvorlig intoleranse.
2. Effekten av peptidbehandling på kreatininnivået i serum
Serumkreatininnivået hos Masugi nefritt-rotter som fikk placebo-behandling var mye høyere enn i den normale kontrollgruppen, og viser at nyrefunksjonen i nefritt-rottene er abnormal. Det ble funnet at peptidene CMS014, CMS018, CMS030 og CMS036 ved 50 ug/kg/døgn en gang daglig var istand til å senke serumkreatininnivået med statistisk signifikant forskjell fra nefritt-rotter som er behandlet med placebo.
3. Effekten av peptidene på miltindeksene
Milten til alle induserte rotter var forstørret sammenlignet med normale rotter, og viser at induksjonen av nefritt er relatert til immunrespons. Det ble funnet at peptidene CMS014, CMSOl 8, CMS030 og CMS036 ved 50 ug/kg/døgn én gang daglig var istand til å senke miltindeksen med statistisk signifikant forskjell fra gruppen av nefritt-rotter som fikk placebo-behandling, p<0.05. Dette tyder på at peptidene kan utøve sin korrige-rende effekt mot nefritt gjennom immunosupressjonsmekanismen. 4. Effekten av peptidene på patologisk mikroskopisk undersøkelse av nyrene Sammenlignet med normale rotter viste nefritt-rottene som fikk placebo-behandling (placebo-gruppen) tegn på dannelse av fibervev ("fibrous tissue") i glomerulærkapselen, hyperplasi i glomerulærepitelet, dannelse av crescenter, utvidelse og økt blodtilførsel i glomerulærkapillærene, ødem i proksimal epiteltubulus og formdannelse ("east forma-tion") i distaltubulusen og samlekanal. Disse patologiske endringene bekreftet den vel-lykkede induksjonen av nefritt. Det ble observert at i gruppen CMS014 var det kun en rotte viste tegn på dannelse av fibervev i glomerulærkapselen og hyperplasi i glomerulærepitelet. Andre parametre fra samme rotte og andre rotter fra samme gruppe har vesentlig samme nyrehistologi som normale rotter. I gruppene CMSOl 8, CMS030 og CMS036 var alle de patologiske parametrene til alle rottene normale.
Konklusjon
Det konkluderes med at peptidene CMS014, CMSOl 8, CMS030 og CMS036 med 50 ug/kg/døgn en gang daglig, administrert intraperitonealt kan ha terapeutisk effekt på forsøksmodellen av Masugi nefrititt-rotter. Proteinuri, kreatininekskresjon og histologi av nyrene i de behandlede rottene ble korrigert med disse peptidene, med statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen som fikk placebo-behandling. Disse peptidene kan virke gjennom immunologiske mekanismer slik som indikert ved sin innflytelse på miltvekstindeksen, men utelukker ikke muligheten til at de virker via andre mekanismer.
Diskusjon
Peptidene CMS014, CMSOl 8, CMS030 og CMS036 kan være nyttig som en del av eller alene, i behandling av nefritt i mennesker. For eksempel kan peptidene anvendes til å korrigere proteinuri eller til å gjenopprette utskillingsfunksjonene i nefrittpasienter. Peptidene kan også anvendes for å forebygge videre svekkelse av nyrefunksjon i nefrittpasienter. Peptidene kan også anvendes alene, i kombinasjon med to eller flere peptider eller i kombinasjon med andre farmasøytika eller kosttilskudd som et totalt forløp i behandling av nefritt.
Referanser
1. SDA (State Drug Administration, F. R. Kina). The guideline of preclinical researches of new drugs. 1994,1. utgave, side 96 2. Xu Shuyun, et al. The methodology of pharmacological experiment, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 2. utgave, 1991:1071. 3. Chen Qi, et al. The methodology of pharmacological researches of traditional Chinese medicine, the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 1. utgave. 1993:390. 4. Du Guanhua. The guideline for pharmacological experiment—the discovery and pharmacological evaluation of new drugs, Science Publishing Company, Beijing, 1. utgave, 2001: 598. 5. Wang Shuxian. Nephrology the People's Sanitation Publishing Company, Beijing, 1. utgave, 1987: 244.
IV. EFFEKT AV CMS- PEPTIDER PÅ KREFT
For å finne ut hvorvidt disse peptidene har mulig terapeutisk effekt på kreft, anvendte vi ulike standard dyrekreft-modeller i dette studiet for å teste ut de biologiske effektene av de ovenfor nevnte peptidene på syke dyr.
Materialer
1. Forsøksdyr
BALB/c mus, C57BL/6 mus og DBA/2 mus som veierl 8-22g, fra Kinesiske Medisinsk Vitenskapslnstitutt, FR Kina.
2. Cellelinjer
Musesarkom Stsoceller, Bi6celler og L1210celler fra Kreftforskningsavdelingen, Kinas, Kinesiske Medisinsk Vitenskapslnstitutt.
YAC-1 celler var en gave fra Prof Yao Zhi, Tianjin Medisinsk Universitet.
3. Hovedlegemiddel og reagens
Peptidene som anvendes i dette studiet ble fremstilt på bestilling av American Peptide Company, Inc., USA.
Fetal bovint serum, RPMI-1640 cellekulturmedium, fra Gibco, USA.
MTT, ConA, fra Sigma, USA.
Rekombinant mus interferon-y (rmIFN-y), fra Beijing Biotech Inc., FR Kina.
Rekombinant human interleukin-2(rhIL-2), fra Shanghai Huaxin Biotech Inc., FR Kina.
Lymfocytt separasjonsløsning fra Forskningsinstituttet for Hematologiske Sykdommer, Nasjonalt Institutt for Medisinsk Vitenskap, FR Kina
Syklofosfamid fra Thel2th pharmaceutical factory of Shanghai, FR Kina.
Fremgangsmåter
1. Administrering av testsubstans
Intrapentoneal injeksjon en gang daglig. Med unntak av syklofosfamidgruppen startet alle gruppene behandling 5 dager før transplantasjon av kreftcellene. Syklofosfa-midgruppene ble behandlet dagen etter transplantasjon av kreftcellene. Behandling av alle gruppene med testsubstansen varte i 30 dager eller til dyret døde, dersom annet ikke er spesifisert.
2. Effekten av peptidene på veksthastigheten til trans<p>lanterte Si an sarkomaceller i BALB/ c mus og på den immunologiske funksjonen til verten
BALB/c mus fordeles vilkårlig i peptidgruppe, syklofosfamidgruppe, rmIFN-y gruppe, rhIL-2 gruppe og salingruppe, 20 dyr pr. gruppe.
Stamløsning av Sigosarkomaceller inkuberes i DMEM/F12 medium som er supplert med 10% fetalt bovint serum, 37°C, 5%CC>2 i 72 timer, vaskes deretter 3-4 ganger med Hanks-løsning ved romtemperatur. Juster cellekonsentrasjonen til 1-2 x IO<9>pr liter med Hanks-løsning. 0.2ml cellesuspensjon ble implantert i flere BALB/c mus gjennom armhulen i 10-12 dager. Musene avlives ved cervikal vertebra dislokasjon. Kraftig voksen-de og ikke-ødelagte tumormasser høstes og vaskes rene med steril saltløsning. Vevet dispergeres i saltløsning til en homogen cellesuspensjon, i et forhold på lg vev til 4 ml saltløsning. Den sarkoma-bærende musemodellen fremstilles med en injeksjon av 0.2ml cellesuspensjon gjennom armhulen [1]. Administrering av testsubstans-behandlingen startet slik som beskrevet i avsnittet Fremgangsmåte 1.
2.1 Effekten av peptidene på den fagocytotiske funksjonen til mononukleær fagocytt 1 mus med Suo sarkoma [2,3] analyseres ved å injisere mus i halevenen med 0.1ml/10g kroppsvekt med tusjblekk ("indian ink") (1:5 fortynning med normal saltløsning) på dag
2 etter administrering av siste testsubstans. 1 minutt og 5 minutter etter injeksjonen ble 20 ul blod samlet fra øyekantus i heparinisert rør. Blodet blandes med 2ml 0.1% w/v Na2C03og deretter oppnås OD680nm- Den angitte klar ("clear") indeksen K beregnes med følgende formel:
Tegnforklaring:
Al: OD68onm første minutt
A2: ODésonm femte minutt
t2: 5 minutter
t2: 1 minutt
Etter studiet av fagocytose-indeksen, ble musene avlivet ved cervikal vertebra dislokasjon. Leveren, milten og kreftvev ble dissekert, strøket tørr og veid.
Fagocytose-indeksen a beregnes slik som vist nedenfor:
Tegnforklaring:
W: kroppsvekt
Wls: vekten av lever pluss milt 2.2 Tumorvekstinhiberings- indeksen beregnes i overensstemmelse med følgende
formel:
Tumorvekstinhiberings-indeksen = (gjennomsnittlig tumorvekt i kontrollgruppe - gjennomsnittlig tumorvekt i behandlingsgruppen) + gjennomsnittlig tumorvekt i kontrollgruppe
3. Effekten av peptider på overlevelse av BALB/ c mus med transplantert ascites (" ascitic")- væske leverkreftt<y>pe Hoi
BALB/c mus deles vilkårlig i peptidgruppe, syklofosfamidgruppe, rmIFN-y gruppe, rhIL-2 gruppe og saltløsning gruppe, 20 dyr pr. gruppe.
Stamløsning av H22-celler inkuberes i DMEM/F12 medium som er tilsatt 10% fetalt bovint serum, 37°C/5% C02i 72 timer, vaskes deretter 3-4 ganger med Hanks-løsning ved romtemperatur. Cellekonsentrasjonen justeres til 1-2 x IO<9>pr. liter med Hanks-løsning. 0.2 ml av cellesuspensjonen implanteres i bukhulen hos flere BALB/c mus i 6-8 dager [1]. Musene avlives deretter ved cervikal vertebra dislokasjon. Ascitesvæske fra musene samles aseptisk og cellekonsentrasjonen justeres til 1 x IO<6>pr. ml med Hanks-løsning. 0.2 ml av cellesuspensjonen implanteres i bukhulen hos friske mus for å generere den H22-bærenede musemodellen for ascitesvæske leverkrefttype. Administrering av testsubstans startet slik som beskrevet i avsnittet Fremgangsmåte 1. Overlevelsesdata for musene ble registrert. Dersom dyrene overlevde lenger enn forsøket, ble antall dager de overlevd registrert som varigheten av forsøket. Gjennomsnittlig overlevelsesdager ble oppnådd ved Kaplan-meier fremgangsmåten i Overlevelsesmuligheten til SPSS softwaren. Overlevelses-indeksen beregnes i samsvar med følgende formel: Overlevelsesindeks = (gjennomsnittlig overlevelsesdager for behandlet gruppe - gjennomsnittlig overlevelsesdager for kontrollgruppe) — gjennomsnittlig overlevelsesdager i kontrollgruppe x 100% 4. Effekten av peptidene på cellulær immunitet i BALB/ c mus med transplantert ascitesvæske leverkrefttype H??
4. 1 Fremstilling av miltcellesuspension[ 1' 4]
Friske BALB/c mus deles vilkårlig i peptidgruppe, rm-IFN-y gruppe, rhIL-2 gruppe og saltløsningsgruppe, 15 mus pr. gruppe og prepareres i H22-bærende musemodell slik som beskrevet i avsnittet Fremgangsmåte 3. Etter implantering av kreftcellene, admi nistreres testsubstansen i 15 dager, musene avlives ved cervikal dislokasjon. Milten isoleres sterilt og dispergeres manuelt i kald D-Hanks løsning ved anvendelse av en injeksjonsnål. Den dispergerte cellesuspensjonen siles ytterligere gjennom en 100-gauge rustfri stålsil med en diameter på 150 (am. Etter sentrifugering ved 200 g i 10 minutter kastes supernatanten. Cellepelletten resuspenderes i 10 volum Tris-NHziCl-buffer og får deretter stå stille i 10 minutter ved romtemperatur. De suspenderte cellene samles ved sentrifugering ved 150 g i 10 minutter. Cellene vaskes 2-4 ganger med kald D-Hanks løsning ved resuspendering og samles ved sentrifugering med betingelsene som er beskrevet over. De vaskede cellene fortynnes deretter til ønsket celletetthet med RPMI-1640 kulturmedium som inneholder 10% fetalt bovint serum.
4.2 Effekten av peptidene på T- lvmfocvttransformasion i mus med ascitesvæske leverkrefttype Hg<[1>'<4]>
Miltceller med tetthet lxl0<6>/ml settes på en 96 brønners cellekulturplate, 100 ul/brønn, 3 parallelle brønner av hver analyseprøve og kontrollprøve pr. mus. Til analysebrønnene tilsettes 100 ul/brønn ConA med 100 ug/ml i RPMI-1640 og 100 ul/brønn ordinær RPMI-1640 anvendes som kontroll. Cellene inkuberes 66 timer ved 37°C, 5% C02. Cellene pelletteres deretter med sentrifugering ved 150 g i 10 minutter. Supernatanten samles og oppbevares ved -20°C for bestemmelse av cytokinene IL-2 og IFN. 50 ug/brønn MTT med 1 mg/ml i RPMI-1640 settes til cellepelletten og cellene resuspenderes ved rysting i 2 minutter. Inkubasjonen fortsatte i 4 timer. Supernatanten kastes etter sentrifugering ved 150 g i 10 minutter. 120ul 40 mM HCl-2-propanol settes til cellepelletten og rystes i 3 minutter. En ELISA-leser anvendes for å få ODs7onm for hver brønn med referanse til 630nm.
Hver mus hadde 3 analysebrønner og 3 kontrollbrønner. Stimuleringsindeksen (SI) for hver mus oppnås ved først å avlede gjennomsnittlig OD for de 3 parallelle brønnene og deretter dividere verdien fra analysebrønnene med kontrollbrønnene.
4.3 Effektene av peptidene på NK- celleaktivitet i mus med ascitesvæske leverkrefttype
H22™
Miltceller fra mus fremstilles til 4 x 106/ml slik som beskrevet i avsnitt 4.1 over. Målcellene YAC-1 dyrkes til log-fase og justeres til 1 x 10<5>/ml. Ved anvendelse av 96 brønner cellekulturplate tilsettes 100 ul miltceller fra mus og 100 ul kulturmedium til kontrollbrønnen som kun inneholder miltcellene, 100 ul målceller og 100 ul kulturmedium tilsettes til kontrollbrønnen som kun inneholder målceller, 100 ul miltceller fra mus og 100 ul målceller tilsettes til NK-aktivitetsanalysebrønnen. 3 parallelle serier av ovennevnte fremstilles pr. mus. Deretter inkuberes de 96 brønners cellekulturplatene i 4 timer ved 37°C, 5% C02.
Prøvene sentrifugeres ved 15Og i 10 minutter for å samle cellene. Supernatanten kastes og 50 ug/brønn MTT med 1 mg/ml tilsettes. Reaksjonsblandingen rystes deretter i 2
minutter og inkuberes ved 37°C, 5% CO? i 4 timer. Supernatanten kastes etter sentrifugering ved 150g i 10 minutter. 120 ul 40 raM HCl-2-propanol tilsettes og rystet i 3 minutter. En ELISA-leser anvendes for å oppnå ODs7onm fra hver brønn med 630nm som referanse.
Hver mus har 9 brønner: 3 miltceller kun kontroll, 3 målceller kun kontroll og 3 analy-sebrønner med både milt og målceller. NK-celleaktivitetindeks for hver mus ble oppnådd ved først å utlede gjennomsnittlig OD for de 3 parallelle brønnene for hver kombinasjon, og deretter benytte denne gjennomsnittlige OD i følgende formel: NK celleaktivitetsindeks = [1-(gjennomsnittlig OD for milt og målcelle brønn - gjennomsnittlig OD for kun miltbrønn) (gjennomsnittlig OD for kun målcellebrønn)] x 100% 5. Effekten av peptidene på overlevelse av DBA/ 2 mus med transplantert Li?. in leukemi
DBA/2 mus, 6-8 uker gamle deles vilkårlig i peptidgruppe, syklofosfamidgruppe, rmIFN-y gruppe, rhIL-2 gruppe og saltløsningsgruppe, 20 dyr pr. gruppe.
Stamløsning av L1210celler inkuberes i DMEM/F12 medium som er tilsatt 10% fetalt bovint serum, 37°C, 5% C02i 72 timer, vaskes deretter 3-4 ganger med Hanks-løsning og justeres til 1 x 10<5>celler pr. liter. 0.1 ml av cellesuspensjon implanteres i bukhulen hos flere friske DBA mus i 6-8 dager. Musene avlives deretter ved cervikal vertebra dislokasjon og ascitesvæske samles sterilt. Cellekonsentrasjonen i den oppsamlede asci-tesvæsken justeres til 1 x IO<5>pr. ml med Hanks-løsning. 0.1 ml av cellesuspensjonen implanteres i hvert av forsøksdyrene og overlevelsesdata til dyrene registreres. Behandlingen startes i testdyrene slik som beskrevet i avsnittet Fremgangsmåte 1. Gjennomsnittlig overlevelsesdag oppnås med Kaplan-meier metoden i Overlevelsesmulighet til SPSS softwaren. Dersom dyrene overlevde lenger enn forsøket, sattes varigheten av forsøket inn som antall overlevelsesdager. Overlevelsesindeksen beregnes ifølge føl-gende formel:
6. Effekten av peptidene på humoral immunitet i GgBL/ 6- mus som bærer trans-<p>lantert Bjfi- melanom samt på det metastatiske potensialet i de inokkulerte mela-nomcellene
Cs7BL/6-mus, 6-8 uker gamle, kroppsvekt 18-22g, deles vilkårlig i peptidgruppe, syklofosfamidgruppe, rmIFN-y gruppe, rhIL-2 gruppe og saltløsningsgruppe, 20 dyr pr. gruppe.
Stamløsning av Bi6musemelanomceller inkuberes i DMEM/F12 medium som er tilsatt 10% fetalt bovint serum, 37°C, 5% CO2i 72 timer, vaskes deretter 3-4 ganger med Hanks-løsning. Cellekonsentrasj onen justeres til 1 x IO<5>celler pr. ml og 0.1 ml av cellesuspensjon injiseres i halevenen i forsøksdyrene for å generere den Bi6-melanom-bærende dyremodellen [7,8]. Behandling med testsubstansen startet slik som beskrevet i avsnittet Fremgangsmåte 1.
6.1 Effekten av peptidene på den humorale immuniteten til CS7BL/ 6 mus som bærer
transplantert Bu Hnelanom^
Røde blodceller fra sau (SRBC) fremstilles ved å samle blod fra cervikalvenen i en steril kolbe med glasskuler. Kolbene rystes i 3 minutter og blodet blandes deretter med Alsever-løsning (2.05 g glukose, 0.4 g NaCl, 0.8 g Na lemonade, justeres til 100 ml med destillert vann) og oppbevares ved 4°C. Umiddelbart før bruk sentrifugeres prøvene ved 13 Og i 5 minutter for å samle SRBC. Cellene vaskes to ganger ved resuspendering og sentrifugering i normal saltløsning. Deretter samles cellepelletten ved sentrifugering ved 180g i 10 minutter og resuspenderes i saltløsning for å få den endelige fungerende SRBC suspensjonen 2% (v/v).
Komplement fremstilles ved å tilsette 10 volumer fersk Cavy-serum i ett volum sentri-fuge-pakket SRBC og rystes deretter forsiktig i 30 minutter ved 4°C. SRBC fjernes ved sentrifugering ved 200g i 10 minutter. 10 volumer normal saltløsning tilsettes for å oppnå funksjonell komplementløsning.
På forsøksdyrene injiseres 0.2 ml fungerende SRBC-cellesuspensjon i hvert dyr på dag 27 av behandling med testsubstans for å reise antistoff. Dagen etter administrering av siste testsubstans, samles blod fra øyekantus og far stå ved romtemperatur i 1 time for serum-eksudasjon. Etter sentrifugering ved 200g i 10 minutter, fortynnes serumet 500 ganger med normal saltløsning.
0.5 ml SRBC-suspensjon settes til 1 ml fortynnet museserum fra hver mus. Iskald. Deretter tilsettes 1 ml fungerende komplementløsning og inkuberes ved 37°C på vannbad i 10 minutter. Reaksjonen stoppes ved å sette på is. Prøvene sentrifugeres deretter ved 200g i 10 minutter for å oppnå supernatanten.
Til 1 ml av denne supernatanten tilsettes 3 ml Drabkin-løsning og far stå ved romtemperatur i 10 minutter. ODs4onmavleses.
Referanse ODs^nm fås ved å blande 0.25 ml SRBC-suspensjon med Drabkin-løsning til 4 ml og plassere 10 minutter ved romtemperatur før ODs40nmavleses.
6.2 Etter studiet av humoral immunitet avlives musene ved cervikal vertebra dislokasjon. Postmortum undersøkelse av dyrene utføres. De patologiske endringene registreres og antall melanom lungemetastasefoci telles.
Resultater
1. Effektene av peptid på cellulær fagocytose i BALB/c-mus med transplantert Si so sarkoma (fremgangsmåte 2.1)
CMS001 ved 50 ug/kg/døgn og 5 ug/kg/døgn og CMS034 ved 5 ug/kg/døgn og 0.5 ug/kg/døgn ble funnet å være istand til å øke fagocytose-indeksen med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen.
2. Effekten av peptid på veksthastigheten til transplantert S^n sarkoma i BALB/c-mus
(fremgangsmåte 2.2)
CMSOIO med 500 ug/kg/døgn, CMS034 med 0.5 ug/kg/døgn og CMS035 med
5 ug/kg/døgn ble funnet å være istand til å redusere veksten av transplantert Siso sarkoma med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). 3. Effekten av peptid på overlevelsen av BALB/c-mus med transplantert ascitesvæske leverkrefttype H22(fremgangsmåte 3) CMS008 med 5 ug/kg/døgn, CMSOl 1 med 5 ug/kg/døgn, CMS024 med 50 ug/kg/døgn, CMS024 med 0.5 ug/kg/døgn og CMS032 med 0.5 ug/kg/døgn ble funnet å være istand til å forlenge overlevelsen av BALB/c-mus med transplantert ascitesvæske leverkrefttype H22, med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05). Det ble også observert at mer enn 30% (n=6) av musene i gruppe CMS024 0.5 (ag/kg kunne overleve lenger enn 90 dager (2 måneder etter at forsøket var avsluttet). Postmortum-undersøkelse av musene viste ikke tegn på etablering av tumor. CMS024 ved 0.5 ug/kg kan derfor interferere med veksten av den transplanterte H22ved å interferering med etableringen derav eller indusere den komplette legingen av den etablerte kreften. 4. Effekten av peptid på T-lymfocyttransformasjon i BALB/c-mus med transplantert ascitesvæske leverkrefttype H22(Fremgangsmåte 4.2)
CMSOIO med 500 ug/kg/døgn, CMS019 med 0.5 ug/kg/døgn, CMS024 med 0.5 ug/kg/døgn og 5 ug/kg/døgn og CMS035 med 0.5 ug/kg/døgn og 5 ug/kg/døgn ble funnet å være istand til å øke stimuleringsindeks for T-lymfocytter med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05).
5. Effekten av peptid på NK-celleaktiviteten i BALB/c-mus med transplantert ascitesvæske leverkrefttype H22(Fremgangsmåte 4.3)
CMS003 med 500 ug/kg/døgn, CMS014 med 0.5 ug/kg/døgn, CMS024 med 0.5 ug/kg/døgn, 5 ug/kg/døgn og 50 ug/kg/døgn samt CMS034 med 50 ug/kg/døgn ble funnet å være istand til å øke NK-cellecytotoksisk aktivitet i dyreforsøksmodellen med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05).
6. Effekten av peptid på overlevelsen av DBA/2-mus med transplantert L^in-leukemi
(Fremgangsmåte 5)
CMSOl9 med 0.5 ug/kg/døgn og CMS035 med 0.5 ug/kg/døgn ble funnet å være istand til å forlenge overlevelsen av DBA/2 mus med transplantert LI 210 leukemi, med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (P<0.05).
7. Effekten av peptid på den humorale immuniteten til C57BL/ 6- mus med transplantert B^- melanom ( Fremgangsmåte 6. 1)
CMS001, CMS003, CMS008, CMSOIO, CMSOl 1, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 og CMS035 ble funnet å være istand til å forsterke den humorale responsen (økning i hemolyseindeks) i C57BL/6-mus med transplantert Bi6-melanom ved dosene som er vist i tabell IV.7 med statistisk signifikant forskjell fra saltløsningsgruppen (PO.05).
8. Effekten av peptid på overlevelsen av inokkulert B16- melanomaceller i Cj? BL/ 6 mus ( Fremgangsmåte 6. 2)
Postmortum-undersøkelse av dyrene etter avsluttet behandling med testsubstans viste ingen tegn på tilværelse av B16 metastatiske foci i lungene hos mus som ble behandlet med CMS008 med 0.5 ug/kg/døgn, 5 ug/kg/døgn og 50 ug/kg/døgn og CMSOl6 med 5 ug/kg/døgn og 500 p,g/kg/døgn.
Konklusjon
Ved å følge Preclinical New Drug Research Guidelines som er utgitt av Avdeling for Legemiddel Administrering, Helsedepartementet, FR Kina i 1993, ble effektene av peptid på mus med transplanterte kreftceller studert. Det konkluderes med at
1. CMSOl0, CMS034 og CMS035 kan i hensiktsmessig dose signifikant inhibere utviklingen av transplantert Siso-sarkoma i mus, 2. CMS001 og CMS034 kan i hensiktsmessig dose forsterke de fagocytotiske im-munaktivitetene i mus som er transplantert med Si8o-sarkoma, 3. CMS008, CMSOl 1, CMS024 og CMS032 kan i hensiktsmessig dose forlenge overlevelsen for mus som er transplantert med ascitesvæske leverkrefttype H22, 4. CMSOIO, CMSOl9, CMS024, CMS034 og CMS035 kan i hensiktsmessig dose forsterke T-lymfocyttransformasjon i mus som er transplantert med ascitesvæske
leverkrefttype H22,
5. CMS003, CMSOl4, CMS024, CMS032 og CMS034 kan i hensiktsmessig dose øke NK-cellecytotoksisk aktivitet hos mus som er transplantert med ascitesvæske leverkrefttype H22, 6. CMSOl9 og CMS035 kan i hensiktsmessig dose forlenge overlevelsen hos mus som er transplantert med L1210-leukemi, 7. CMS008 og CMSOl 6 kan i hensiktsmessig dose inhibere utviklingen av transplantert B16-melanoma i mus, 8. CMS001, CMS003, CMS008, CMSOIO, CMSOll, CMS016, CMS019, CMS024, CMS034 og CMS035 kan i hensiktsmessig dose forsterke den humorale responsen hos mus som er transplantert med B16-melanom.
Diskusjon
CMS001, CMS003, CMS008, CMSOIO, CMSOl 1, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034, CMS035 kan være nyttig som en del av eller alene, i behandling av kreft i mennesker. For eksempel kan CMS001, CMS003, CMS008, CMSOIO, CMSOl 1, CMS014, CMS016, CMS019, CMS024, CMS032, CMS034 og CMS035 anvendes for å øke immuniteten hos kreftpasienter. CMS008, CMSOIO, CMSOl6, CMS034 og CMS035 kan anvendes for å interferere med veksten av kreftceller i pasienter. CMS008, CMSOl 1, CMS019, CMS024, CMS032 og CMS035 kan anvendes for å forlenge forventet levetid for kreftpasienter. Peptidene kan anvendes alene eller i kombinasjon med to eller flere peptider eller i kombinasjon med andre farmasøy-tika eller kosttilskudd som et totalt forløp for behandling av kreft.
Referanser
1. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, Folkerepublikken Kina. 1993, 7: 137-143 2. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, Folkerepublikken Kina. 1993, 7:128-129 3. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (andre utgave). Folkerepublikken Kina. 1998,137-138 4. Shuyun Xu, Rulian Bian, Xiu Chen. Methodology of pharmacological experiment.
People's Health Publishing House. 1991,1221-1234
5. Principles of Pre-clinical Research of New Drugs, Folkerepublikken Kina. 1993, 7: 140 6. Jinsheng He, Ruizhu Li, Tingyi Zong. The study on MTT reduction method of test-ing NK cell activity. China Immunology Journal. 1996,1 (6): 356-358 7. Yaoqin Yang, Huchuan Yang, Huihong Tao, et al. The synergic effect of Tween-80 on the antitumor of hyperthermia - Experimental studies of mouse melanoma. Cancer Research on Prevention and Treatment.1999, 26 (4):8-12 8. Jian Fu, Jie Zheng, Weigang Fang, et al. Interleukin-12 gene transfection into mur-ine Bl6 melanoma cells suppresses tumorigenicity and decreases metastatic poten-tial. National Medical Journal of China. 1998,78 (8): 627-629 9. Qian Wang. Modern medical experiment method. People's Health Publishing House. 1998, 482-483 10. Qichao Pan, Bin Xu. Cancer pharmacology and chemotherapy. Henan medical university Publishing House. 2000, 66-69 11. Yuanpei Zhang, Huaide Su. Pharmacological experiment (andre utgave). People's Health Publishing House. 1998,131
V. EFFEKTEN PÅ KROPPSVEKTEN
Friske rotter ble matet med diett med høyt næringsinnhold i 5 uker med eller uten simultan peptidbehandling (intramuskulært 300 ug/kg/døgn). Rotter på ordinær diett med injeksjon av saltløsning ble anvendt som negativ kontroll. Etter 5 ukers behandling ble injeksjonen stanset og den samme dietten ble opprettholdt i ytterligere 3 uker. Kropps-vektsdata ble samlet en gang pr. uke. Rottenes oppførsel ble også observert. Rotter som fikk peptidet CMSOl 5 ble funnet å ha statistisk signifikant lavere vektøkning sammenlignet med kontrollen i løpet av peptidbehandlingen. Denne trenden med nedsatt kroppsvekt ble gradvis redusert etter at behandlingen med CMSOl5 stanset. Det konkluderes med at CMSOl5 i hensiktsmessig dosenivå reversibelt kan kontrollere utvikling av overvekt som er indusert av for mye mat.
Materialer
Sprague-Dawley (SD) rotter som veidel45±10g ble gitt av Senter for forsøksdyr i Guangzhou Universitet for Tradisjonell Kinesisk Medisin, FR Kina (sertifikatnr.: 2000A019). Peptidene ble syntetisert på bestilling (fra L-aminosyre opprinnelse) av American Peptide Company, Inc., USA, og ble fortynnet til 10ug/ml i normal saltløs-ning. Diettene med høy og normal ernæring ble fremstilt i overensstemmelse med ret-ningslinjene for pre-klinisk forskning på antifedme-legemidler som er utgitt av SDA (State Drug Administration), PR Kina<[1]>.
Fremgangsmåter
Friske rotter deles vilkårlig under forsøket i positiv kontroll og negative kontrollgrup-per. 10 rotter pr. gruppe, halvparten hanner og halvparten hunner. Forsøksgruppen med rotter ble matet med høy-ernæirngsdiett i 5 uker med simultan intramuskulær injeksjon av 300 ug/kg/døgn peptid, en gang daglig. Den positive kontrollgruppen fikk den samme høy-ernæirngsdiett, men injeksjon av placebo saltløsning, mens den negative kontrollgruppen, som ble anvendt til å bevise vellykket etablering av overvektmodellen, fikk normal ernæringsdiett og injeksjon av placebo saltløsning. Etter 5 ukers behandling stoppes injeksjonen og den samme dietten opprettholdes i ytterligere 3 uker. Rottene veies en gang pr. uke. Rottenes oppførsel observeres også.
Statistikk
Dataene er presentert som gjennomsnitt ± standardavvik. Parret t-test eller enkeltfaktor ANOVA ble anvendt til inter- og intra-gruppesammenligning. Statistisk signifikant "cut-off var på P<0.05.
Resultater
1. Effekt av peptid på kroppsvekten hos SD-rotte
Ved en dose på 300 ug/kg/døgn ble CMSOl 5 runnet å være istand til å begrense vekt-økningen hos rotter med fedme som er indusert av over-mating, med statistisk signifikant forskjell fra kontrollgruppen (p<0.05). Forskjellen mellom behandlings- og kontrollgruppene økte med lengden av behandlingen. Ved opphør av behandling med peptidet CMSOl5 i behandlingsgruppen, redusertes forskjellen mellom behandlings og kontrollgruppene gradvis og ble statistisk signifikant etter 3 uker, hvilket viser at effekten av peptidet på SD rottenes kroppsvekt er reversibel.
Gjennom hele forsøksforløpet ble det observert at apetitten og aktiviteten til alle rotte-gruppene forble normal.
Diskusjon
Det konkluderes med at CMSOl 5 ved hensiktsmessig dosenivå kan begrense utviklingen av fedme som er indusert av overmating. Peptidet kan anvendes hos mennesker for å kontrollere fedme. Peptidene kan anvendes alene eller i kombinasjoner på to eller flere peptider eller i kombinasjon med andre farmasøytika eller kosttilskudd som en totalt forløp for behandling av fedme.
I foreliggende studie ble administrering ved intramuskulær injeksjon testet, men dette utelukker ikke mulig effektivitet av peptider som administreres ved andre alternative måter. Peptidene kan administreres via intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, intraperitoneal injeksjon, subkutan injeksjon og subkutan implantasjon med eller uten middel som fremmer levering slik som liposom, beskyttelse som gir forlenget frigivning etc. Peptidet kan også administreres i hvilken som helst form for oral administrering slik som tablett, kapsel, suspensjon, løsning etc. i vanlig form uten modifisering eller i en form som gir forlenget frigivning eller med eller uten gastroenterisk-beskyttelse. Peptidet kan videre anvendes til hvilken som helst form for topisk applisering, slik som salve, krem, gele etc. med eller uten middel som fremmer transdermal transport eller som inhalasjonspulver, oppløst eller i liposom-beskyttet form. Peptidet kan også oversettes til sin genetiske sekvens og klones i et ekspresjonssystem, alene eller i kombinasjon med andre peptidsekvenser for å generere et resulterende peptidmolekyl for å gjøre nytte av peptidaktiviteten slik som beskrevet i denne rapporten, med eller uten rensing av det resulterende peptidet.
Referanser
1. SDA, FR Kina. Retningslinjer for pre-klinisk forskning med nye legemidler.
1993
Det skal forstås at det er mulig å addere flere aminosyrer til amino eller karboksitermi-nalen i de ovenfor beskrevne peptidene. For eksempel kan en eller to aminosyrer adderes til de beskrevne peptidene uten å påvirke dets biologiske funksjon. Det kan også være mulig å addere tre eller fire aminosyrer og fremdeles opprettholde peptidenes funksjon. Disse refereres alle til som varianter av det samme peptidet. Alternativt kan en eller to aminosyrer deleteres fra peptidet uten å påvirke dets biologiske aktivitet. Det kan videre være mulig å deletere tre eller fire aminosyrer uten å påvirke den biologiske funksjonen til peptidene. Disse refereres til som fragmenter av det aktuelle ("instant") peptidet. Dessuten kan derivater av peptidet slik som konservert erstatning av en aminosyre med en annen innen samme funksjonelle klasse, anvendes for å utøve et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse. For eksempel kan det for peptider som har ikke-polare eller hydrofobe sidekjeder, være mulig å substituere en sidegruppe med en annen uten å redusere biologisk aktivitet. Som et ytterligere eksempel kan linker/spacer settes inn i peptidet for å danne varianter, men variantene beholder fremdeles sin aktive moiety som det originale peptidet som anvendes i dette studiet. Disse betraktes som varianter av peptidet. En peptidanalog slik det anvendes heri, omfatter peptider som har aminosyre-molekyler som etterligner strukturen til de naturlige aminosyrene f. eks. en analog med en annen skjelettstruktur, eller D-aminosyre substitusjon. Som et ytterligere eksempel kan, selv om aminosyrene som anvendes til syntese av peptidene er i sin L-optiske iso-mere form, peptidene som har en eller flere aminosyrer i sekvensen substituert med D-formen, ha tilsvarende biologiske aktiviteter. Betegnelsen "funksjonelt derivat" er ment å omfatte fragmenter, varianter, analoger eller kjemiske derivater av peptidet.
Slik det anvendes heri, anvendes betegnelsen "hybridpeptid" for å referere til peptider som inneholder ekstra peptider innsatt i de opprinnelig biologisk aktive peptidene som har SEQ. ID nr. 1-30 eller deres funksjonelle derivater, men som fremdeles beholder vesentlig den samme aktiviteten. De ekstra peptidene omfatter leder-peptidene som for eksempel inneholder en aminosyresekvens som gjenkjennes av en eller flere prokaryote eller eukaryote celler som et signal for sekresjon av hybridproteinet ut av cellen. Sekresjonen kan være direkte eller indirekte gjennom sekretoriske vesikler.
"Vesentlig rent peptid" refererer til peptider som er minst 10% w/w rene, mer foretrukket 20%, enda mer foretrukket 40% og mye mer foretrukket 60% og enda mer foretrukket mer enn 90% rent. Mest foretruket er renheten større enn 99%. Det vesentlig rene peptidet kan anvendes for å fremstille farmasøytiske- og ernæringsformuleringer som kan være komplekse blandinger, slik som beskrevet nedenfor.
Anvendelsen av de ovenfor-identifiserte peptidene i farmasøytiske formuleringer kan benyttes som mulig behandling for immunologiske forstyrrelser eller sykdommer som har sekundær effekt på immunitet f. eks. kreft eller infeksjoner eller hvilken som helst av tilstandene som er nevnt over. Formuleringene kan inneholde et av de identifiserte peptidene blandet med andre aktive eller inaktive bestanddeler, inkludert andre peptider. F. eks. kan to til flere (f. eks. 3-5) av peptidene som er listet, adderes til samme formule-ring med eller uten andre bestanddeler. Alternativt kan et av de listede peptidene anvendes til å fremstille formuleringen sammen med peptidene som ikke er listet her. De kan administreres intravenøst, intramuskulært, intrakutant, subkutant eller intradermalt. Administreirngsmåten kan også være ved intra-arterial injeksjon som fører direkte til problemorganet. Andre administreirngsmåter er transdermalt, inhalasjonspulver eller spray, og andre former for levering som er kjent for en fagmann på området. Formuleringen kan også tas oralt, og kan inneholde bærere som kan anvendes til å forebygge gastrisk fordøying av peptidet etter oralt inntak, eller hvilken som helst bærer som er kjent innen fagområdet (for transdermal slik som liposom).
Den farmasøytiske formuleringen kan også omfatte hvilken som helst av de kjente far-masøytiske bærerene. Eksempler på egnede bærere omfatter enhver standard farmasøy-tisk akseptabel bærer som er kjent for en fagmann på området. Disse omfatter, men er ikke begrenset til fysiologisk saltløsning, vann, emulsjoner inkludert olje og vann blandinger eller triglyceridemulsjoner og andre typer midler, fyllmasser, belagte tabletter og kapsler. Den hensiktsmessige bæreren kan selekteres basert på administreirngsmåten av den farmasøytiske sammensetningen.
Peptidene kan administeres via intravenøs injeksjon, intramuskulær injeksjon, intraperitoneal injeksjon, subkutan injeksjon og subkutan implantasjon. Peptidet kan også administeres i enhver form for oral administrering slik som tablett, kapsel, suspensjon, løs-ning etc, i den vanlige formen uten modifisering eller i en form for forlenget frigivning eller med eller uten gastro-enterisk beskyttelse. Peptidet kan videre anvendes til hvilken som helst form for topisk applisering slik som salve, krem, gele etc med eller uten middel som fremmer transdermal transport. Peptidet kan også oversettes til den genetiske sekvens og klones i et ekspresjonssystem, alene eller i kombinasjon med andre peptidsekvenser for å generere et resulterende peptidmolekyl for å gjøre nytte av aktiviteten til peptidet slik det er beskrevet i denne rapporten.
Dosen av hvert peptid kan være Ing - 10g pr kg kroppsvekt. En foretrukket dose er 10ng - lOmg pr kg, og mer foretrukket lug - lmg pr kg til administrering ved injeksjon. Den effektive dosen kan dessuten være så lav som Ing pr kg kroppsvekt, da en eller flere av peptidene kan virke gjennom reseptorer som vil indusere en kaskade av normale fysiologiske responser. Alternativt kan et eller flere av peptidene kun være en initiator av en hel reaksjonskaskade. For oralt inntak kan mengden være Ing- 10g pr døgn pr kg kroppsvekt, mer foretrukket 0.1 ug-lg pr døgn pr kg kroppsvekt og enda mer foretrukket lug-10mgprdøgn.
VI. Genterapi og fremgangsmåte til behandling
Genterapi basert på de oppdagde peptidsekvensene utføres ved å designe en nukleinsyresekvens som koder for et av disse peptidene. Nukleinsyren kan syntetiseres kjemisk og operabelt ligeres til en promoter, og klones i en ekspresjonsvektor. Ekspresjonsvektoren administreres deretter i kroppen til et menneske i form av genterapi for ekspresjon i den humane celle. Betegnelsen "genetiske vektorer" slik den anvendes heri, omfatter disse ekspresjonsvektorene. Vektorene som kan anvendes til genterapi omfatter adeno-assosiert virus (Mizuno, M. et al. (1998). Jpn J Cancer Res 89,76-80), LNSX vektorer (Miller, A. D. et al. (1993) Methods Enzymol 217,581-599) og lentivirus (Goldman, M. J. et al. (1997) Hum Gene Ther 8, 2261-2268).
Andre verktøy for peptid-levering omfatter ekspresjonsvektorer som koder for det ønskede peptidet som kan overføres til en organisme, som kan replikere i vertsorganismen som det er ønskelig å administrere peptidet til uten signifikant ugunstige effekter på helsen til vertsorganismen. For eksempel kan ekspresjonsvektorene overføres til en organisme som ikke er patogen for vertsorganismen, som det er ønskelig å administrere peptidet til. Ekspresjonsvektoren kan produsere det ønskede peptidet i en bakterie eller sopp som ikke har signifikant ugunstige effekter på helsen til vertsorganismen som peptidet skal administreres til. For eksempel kan ekspresjonsvektoren som koder for det ønskede peptidet være en ekspresjonsvektor som produserer det ønskede peptidet i en organisme slik som melkesyrebakterie, E. coli eller gjær. Ekspresjonsvektoren kan pro dusere det ønskede peptidet i en mikrobe som normalt finnes i den mammalske tarmen eller en mikrobe som tolereres av den mammalske fordøyelseskanalen. Noen av mikro-beartene som det ønskede peptidet kan ekspresseres i omfatter, men er ikke begrenset til Lactobacillus arter slik som L. acidophilus, L. amylovorus, L. casei, L. crispatus, L. gallinarum, L. gassen, L. johnsonii, L.paracasei, L. plantarum, L. reuteri, L. rhamnosus eller andre, Bifidobakteriearter, slik som B.adolescentis, B. animalus, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. lactis, B. longum eller andre, Enterococcus faecalis eller Ent. Fa-cium, Sporolactobacillus inulinus, Bacillus subtilis eller Bacillus cereus, Escherichia coli, Propionibacterium freudenreichii eller Saccharomyces cerevisiae eller Saccharomyces boulardii.
Nukleinsyresekvenser som koder for peptidene ifølge foreliggende beskrivelse, som er kjemisk syntetisert eller som er fremstilt på andre måter, inkludert men ikke begrenset til revers transkripsjon av mRNA for å produsere cDNA molekyler, inkorporeres i ekspresjonsvektorene for genoverføring til den ønskede organismen, ved fremgangsmåter for genteknologisk fremstilling som er velkjent for en fagmann på området. Ekspresjonsvektorene kan være DNA vektorer eller RNA vektorer. For eksempel kan ekspresjonsvektorene være basert på plasmid eller virale genetiske elementer. Ekspresjonsvektorene kan være vektorer som replikerer ekstrakromosomalt eller vektorer som integre-rer i kromosomet.
Ekspresjonsvektorene omfatter en promoter som er operabelt bundet til en nukleinsyre som koder for et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse. Promoteren kan være en regu-lerbar promoter slik som en induserbar promoter eller en kostitutiv promoter. Promoteren kan selekteres for å gi et ønsket peptidekspresjonsnivå. I tillegg, dersom ønskelig, kan ekspresjonsvektorene omfatte andre sekvenser som fremmer produksjon, presentasjon og/eller sekresjon av peptider. En nukleinsyre som koder for et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse kan være operabelt bundet til en nukleinsyresekvens som dirigerer sekresjonen av peptidet. For eksempel kan nukleinsyren som koder for peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse være operabelt bundet til en nukleinsyre som koder for et signalpeptid.
Ekspresjonsvektorene som er konstruert for å kode peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ekspresjonsvektorer som er tilpasset for ekspresjon av peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, i en bakterieart som utgjør den normale mammalske tarmflo-raen, slik som Lactobacillus-arter og Bacillus subtilis. Eksempler på slike ekspresjonsvektorer finnes i henholdsvis US patentnr. 6,100,388 til Casas og nr. 5,728,571 til Belli- ni. Det skal forstås at enhver ekspresjonsvektor som muliggjør ekspresjonen av et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse i en organisme som ikke er skadelig for helsen til vertsorganismen som peptidet skal administreres til, kan anvendes.
Ekspresjonsvektorene som er konstruert for å kode peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være ekspresjonvektorer som er tilpasset for ekspresjon av peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse i en gjærart som tåles godt av den mammalske tarmen, slik som Saccharomyces cerevisiae eller fortrinnsvis Saccharomyces boulardii, som kan kolonisere den human tarmen, og anvendes til å behandle visse former for diaré. Det kan anvendes gjærekspresjonsvektorer som konstitutivt ekspresserer heterologe proteiner og peptider, er svært stabile og således overføres godt til avkom-celler iløpet av mi-tose og meiose, og som kan omfatte en kodende sekvens for et signalpeptid eller peptider som dirigerer høye nivåer av rekombinant proteinsekresjon. Et eksempel på en slik gjærvektor er gitt i US patentnr. 6,391,585 til Jang et al.
Ekspresjonsvektorene som koder for peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan fø-res inn i organismen som det er tenkt å ekspressere peptidene i, ved teknikker som er kjent innen fagområdet. Disse teknikkene omfatter tradisjonelle fremgangsmåter for transformering av bakterier, gjær eller andre mikrober ved anvendelse av kjemisk kom-petente bakterieceller, elektroporering eller litiumacetat transformasjon (for gjær) for eksempel, så vel som nyere fremgang i transformasjon av bakteriearter som er gjenstri-dig til disse prosedyrene. Ekspresjonsvektorene kan innføres i melkesyrebakterier som er kjent å være gjenstridige for transformasjon, ved anvendelse av fremgangsmåtene som er beskrevet av Leer et al. (WO 95/35389). De innførte sekvensene kan inkorporeres i mikrobielt kromosomalt DNA eller kan forbli som ekstrakromosomale DNA-elementer.
Denne genetisk konstruerte mikroben som inneholder ekspresjonsvektoren, kan deretter inokkuleres i fordøyelseskanalen, vagina, luftrøret etc. for å oppnå forlenget immunote-rapi. Organismene som ekspresserer peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan inn-tas i en inaktiv form eller fortrinnsvis i levende form. I tarmen produserer disse mikro-organismene nevnte peptider, frigir dem til lumen ved sekresjon eller lysering av mik-roorganismene eller presenterer peptidene for verten, hvorved peptidene produserer deres tiltenkte effekt på vertsorganismen. Peptidene kan presetneres for verten på slimhin-nen i nesegangene ("nasal passages"), vagina eller tynntarmen.
En annen fremgangsmåte er anvendelsen av liposomer som et middel til levering av den spesifikke nukleinsyren til cellene i menneskekroppen. Nukleinsyren (slik som en ekspresjonsvektor som inneholder en nukleinsyresekvens som koder for peptider med sekvens ID nr. 1 til ID nr. 30) leveres i omgivelser som fremmer cellulært opptak og kro-mosomal inkorporering, slik som beskrevet i Gao, X. og Huang, L. (1995) Gene Ther 2, 710-722 og US 6,207,456. Alternativt kan peptidet i seg selv innkapsles i liposomet og leveres direkte ved anvendelse av fremgangsmåten som er beskrevet i US 6,245,427.
Nukleinsyresekvensene som er nyttige i den ovenfor nevnte genterapien omfatter sekvenser som koder for disse peptidene og funksjonelle derivater derav. Enhver av det store antallet nukleinsyresekvenser kan anvendes for å kode disse peptidene og deres derivater basert på det degenererte kodonsystemet.
EKSEMPEL 1
Levering av peptidene med genteknologisk fremstilte Lactobacillus bakteriearter Følgende gis som et eksempel på en fremgangsmåte for å levere peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse, til en vert slik som beskrevet over. En DNA-sekvens som koder for et av peptidene som er listet i tabell A over syntetiseres ved kjemiske fremgangsmåter og denne DNA-sekvensen settes inn i en ekspresjonsvektor ved anvendelse av standard genteknologiske teknikker som er velkjent for fagmannen på området. Den selek-terte ekspresjonsvektoren inneholder en konstitutiv promoter som er funksjonell i Lactobacilli, et multippelt kloningssete for innføring av DNA-sekvensene i en spesifikk 5' til 3'-orientering, så vel som et selekterbart markørgen som gir resistens for et antibiotikum (for å hjelpe i kloningprosedyrer) og kan omfatte andre sekvenser slik som signal-peptidsekvenser, for å hjelpe i produksjon og/eller sekresjon av peptidene. Et eksempel på en slik vektor finnes i US Patent Nr. 5,592,908 til Pavla. Kort sagt diskuterer dette patentet flere kjente promoterer som fungerer i Lactobacillus-arter, så vel som en fremgangsmåte for å oppdage nye promoterer i nevnte bakterie som kan være operabelt bundet til en nukleinsyre som koder for et peptid ifølge foreliggende oppfinnelse, for å ekspressere peptidet i Lactobacilli. En nukleinsyre som koder for et signalpeptid, slik som peptider omfattende 16 til 35 overveiende hydrofobe aminosyrer som er aktive i Lactobacillus lactis, og er beskrevet i US Patent Nr. 5,529,908, angitt over, er innskutt mellom promoteren og nukleinsyren som koder for peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse, slik at nukleinsyren som koder for signalpeptidet er i ramme med nukleinsyren som koder for peptidet ifølge foreliggende oppfinnelse.
I tillegg til den kodende sekvensen til peptidet, kan DNA-sekvensen som syntetiseres omfatte sekvenser som er til hjelp i ligering og kloning av nevnte DNA i ekspresjonsvektoren. For eksempel kan gjenkjenningsseter for restriksjonsenzymer som korrespon-der til de som finnes i det multiple kloningssetet i vektoren, inkorporeres i det syntetiserte DNA i 5' og 3'-endene i sekvensen, slik at sekvensen kan klones i riktig orientering i vektoren. Både vektoren og det syntetiserte DNA fordøyes med de bestemte rest-riksjonsenzymene, deretter renses de. Ligeringsreaksjoner med vektoren og det syntetiserte DNA etterfølges av transformasjon i en egnet E. coli stamme. De transformerte bakteriene plates på media som inneholder antibiotika som vektoren gir resistens mot. En koloni transformert bakterie selekteres for vekstkulturer og plasmid-preparerings prosedyrer, tilstedeværelsen av det syntetiserte DNA i riktig orientering bekreftes.
Denne ekspresjonsvektoren transformeres til en bakterievertscelle av Lactobacillus ar-ten, slik som L. acidophilus. Transformerte celler selekteres for i kraft av den selekter-bare markøren som finnes i vektorsekvensen og sekresjon av peptidet verifiseres ved å utføre et western blot, utføre gelelektroforese av peptidene som er tilstede i dyrkningsmediet eller andre standard teknikker. En transformert bakteriekoloni velges og anvendes for å fremstilles stor-skala kulturer av genmodifiserte bakterier. En kultur av de genmodifiserte bakteriene som ekspresserer det ønskede peptidet dyrkes opp og minst en del derav administreres til fordøyelseskanal, vagina, luftrøret eller andre områder i vertsorganismen hvor bakterien er istand til å replikere. Dersom ønskelig kan bakterie-kulturene behandles på forskjellige måter for å produsere et supplement for enterisk konsumpsjon i verten. Disse behandlingene omfatter lyofilisering eller andre fremgangmåter til preservering av bakterien, i tillegg til å kombinere bakterien med bærere, slik som løsninger, løsningsmidler, dispersjonsmedia, forsinkelsesmidler, emulgeringer og liknende. Anvendelse av disse midlene for å fremstille supplementer er velkjent innen fagområdet. For eksempel kan bakterien anvendes for å lage kultiverte ("cultured") melkeprodukter eller andre matvarer til human konsumpsjon, slik at organismen som ekspresserer peptidet koloniserer tarmen i vertsorganismen. Et uttall forskjellige fremgangsmåter for å inkorporere spesifikke melkesyrebakteriestammer i matvarer slik som yoghurt, "kimchee", ost og smør er beskrevet i US patent nr. 6,036,952, til Oh. Ved konsumering av bakterien gjennom en av de mange måtene for administrering, kan de konstruerte organismene kolonisere tarmen og sørge for presentasjon og/eller absorp-sjon av peptidene ifølge foreliggende oppfinnelse via slimhinnelaget i tarmen.
EKSEMPEL 2
Levering av peptider med en genteknologisk fremstilt form av Bacillus subtilis Følgende gis som et annet eksempel på en fremgangsmåte til levering av peptidene iføl-ge foreliggende oppfinnelse, til en vert slik som beskrevet over. En DNA-sekvens som koder for et av peptidene som er listet i tabell A over syntetiseres kjemisk, og denne DNA-sekvensen settes inn i en ekspresjonsvektor ved hjelp av genteknologiske teknikker som er kjent innen fagområdet. Ekspresjonsvektoren som selekteres omfatter en skyttel vektor slik som pTZ18R (Pharmacia, Piscataway, NJ), som er istand til å propa-gere både i E. coli og B. subtilis og som inneholder et antibiotika-resistensgen for selek-tering av kolonier av transformerte bakterier. Denne vektoren kan inneholde en konstitutiv promoter som er aktiv i B. subtilis, slik som en promoter som er avledet fra Sac B-genet fra B. subtilis, så vel som en nukleotidsekvens som koder for et signal eller et le-derpeptid som er aktivt i B. subtilis, som effektivt dirigerer eksport av ekspresserte heterologe proteiner fra bakteriecellen. Et eksempel på en slik vektor er beskrevet i US patent nr. 6,268,169 til Fahnestock. Kort sagt, slik som vist i detalj over, vil DNA som koder for et peptid ifølge denne oppfinnelsen, syntetiseres med restriksjonsenzymseter og/eller andre sekvenser for å muliggjøre kloning av DNA ved hjelp av teknikker som er velkjent for en fagmann på området. Etter transformasjon av E. coli., plating, seleksjon og propagering av plasmidet for å lage stamløsning av plasmid, transformeres plasmidet deretter til B. subtilis og transformantene selekteres i kraft av resistens mot et antibiotikum i platingsmediumet.
Peptidproduksjon i og sekresjon fra den genteknologisk fremstilte B. subtilis verifiseres ved anvendelse av teknikker som er velkjent for en fagmann på området, slik som ra-diomerking av peptider for autoradiografisk deteksjon etter SDS-PAGE analyse eller Western blotting.
En kultur av genteknologisk fremstilte bakterier dyrkes opp og minst en del derav administreres til fordøyelseskanalen, vagina, luftrøret eller andre områder i vertsorganismen hvor bakterien er istand til å replikere.
EKSEMPEL 3
Levering av peptider med genteknologisk fremstilte Saccharomyces gjærarter Følgende gis som et annet eksempel på en fremgangsmåte til levering av peptidene iføl-ge foreliggende oppfinnelse til en vert slik som beskrevet over. En DNA-sekvens som koder for et av peptidene som er listet i tabell A over, syntetiseres kjemisk og denne DNA-sekvensen settes inn i en ekspresjonsvektor ved hjelp av genteknologiske teknik ker, hvor alle teknikkene er kjent innen fagområdet. Ekspresjonsvektoren som selekteres omfatter en stabilt bevart gjærproteinekspresjonsvektor som omfatter en konstitutiv gjærpromoter slik som pADHl, replikasjonsseter for vektoren både i gjær og E. coli, et gen eller gener som gir prototrofi til en auxotrof gjærmutant til seleksjonsformål, et multippelt kloningssete (MCS) og, dersom ønskelig, sekvenser som koder for et signalpeptid. Vektorer slik som disse, er kommersielt tilgjengelige og velkjent innen fagområdet eller kan enkelt konstrueres ved anvendelse av standard teknikker. Etter innskudd av det syntetiserte DNA i gjærvektoren, transformasjon av E. coli, utplating av transformert E. coli på seleksjonsmedia, seleksjon av en transformert bakteriekoloni og fremstilling av plasmid-DNA fra dyrkningskulturen av bakterier fra nevnte koloni, transformeres Saccharomyces cerevisiae med vektoren ved hjelp av velkjente teknikker slik som litiumacetat-transformasjon eller elektroporering. Saccharomyces cerevisiae-stammen som velges til transformasjon, er en mutant auxotrof stamme som vil kreve et gen på plasmidet for å vokse på plater med minimalmedia. Transformerte gjærkolonier isoleres ved å plate gjæren på dyrkningsmedia som mangler genet som sitter på vektoren. Kun de gjærene som har mottatt vektoren og dets seleksjonsgen og som ekspresserer genproduktet, vil være istand til å vokse til kolonier på minimal mediet. Verifisering av peptidsekresjon kan oppnås ved å gjennomføre et Western blot, gel elektroforese av peptidene som er tilstede i dyrkningsmediet eller andre standard teknikker.
En transformert gjærkoloni velges og anvendes til fremstilling av stor-skala kulturer. En kultur av den genteknologisk fremstilte gjæren som ekspresserer det ønskede peptidet, dyrkes opp og minst en del derav administreres til fordøyelseskanalen, vagina, luftrøret eller andre områder i vertsorganismen hvor bakterien er istand til å replikere. Dersom ønskelig kan gjærkulturene behandles på forskjellige måter for å produsere et supplement for enterisk konsumpsjon i verten. Disse behandlingene omfatter lyofilisering eller andre fremgangmåter til preservering av gjær, i tillegg til å kombinere bakterien med bærere, slik som løsninger, løsningsmidler, dispersjonsmedia, forsinkelsesmidler, emulgeringer og liknende. Anvendelse av disse midlene for å fremstille tilskudd er velkjent innen fagområdet. Den transformerte gjæren kan anvendes for å lage næringsmidler, slik som fermenterte melkeprodukter som yoghurt og kefir ved teknikker som er kjent for en fagmann på området. Som for levende melkesyrebakteriekulturer i disse nær-ingsmidlene, koloniserer den transformerte gjæren tarmen, i det minste forbigående, og presenterer peptidene for verten via tarmlumen.

Claims (17)

1. Renset peptid som omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16 for bruk som et medikament.
2. Peptid ifølge krav 1, for bruk som et medikament for modulering av minst en av de føl-gende tilstander: immunaktivitet, hepatittinfeksjon, hepatitt B-infeksjon, omfanget av nefritt og vekst av kreft.
3. Peptid ifølge krav 1, hvor nevnte peptid hovedsaklig består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
4. Peptid ifølge krav 1, hvor nevnte peptid består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
5. Anvendelse av peptidet ifølge krav 1, for fremstilling av et medikament for modulering av minst en av de følgende tilstander:: immunaktivitet, hepatittinfeksjon, hepatitt B-infeksjon, omfanget av nefritt og vekst av kreft.
6. Farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter et renset peptid som omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
7. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 6,karakterisertv e d at nesvnte peptid hovedsaklig består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
8. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 6,karakterisertved at nevnte peptid består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
9. Fremgangsmåte for å fremstille en farmasøytisk sammensetning,karakterisert vedat den omfatter å tilveiebringe et renset peptid som omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16; og blande nevnte peptid med en farmasøytisk akseptabel bærer.
10. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat nevnte peptid hovedsaklig består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 9,karakterisert vedat nevnte peptid består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
12. Farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid som omfatter en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16 til et menneske ved behandling av kreft.
13. Farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid ifølge krav 12, hvor nevnte peptid hovedsaklig består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
14. Farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid ifølge krav 12, hvor nevnte peptid består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
15. Farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid, som omfatter en aminosyresekvens iføl-ge SEQ ID NR: 16, til et menneske for bruk i behandling av en immunologisk lidelse.
16. Farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid ifølge krav 15, hvor nevnte peptid hovedsaklig består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
17. Farmasøytisk effektiv dose av et renset peptid ifølge krav 15, hvor nevnte peptid består av en aminosyresekvens ifølge SEQ ID NR: 16.
NO20040134A 2001-07-13 2004-01-12 Renset peptid for bruk som medikament, farmasoytisk sammensetning samt fremgangsmate for fremstilling NO332061B1 (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US90449201A 2001-07-13 2001-07-13
PCT/GB2002/003203 WO2003006492A2 (en) 2001-07-13 2002-07-11 Biologically active peptides

Publications (2)

Publication Number Publication Date
NO20040134L NO20040134L (no) 2004-03-10
NO332061B1 true NO332061B1 (no) 2012-06-11

Family

ID=25419251

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20040134A NO332061B1 (no) 2001-07-13 2004-01-12 Renset peptid for bruk som medikament, farmasoytisk sammensetning samt fremgangsmate for fremstilling
NO20073914A NO20073914L (no) 2001-07-13 2007-07-25 Biologisk aktive peptider

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20073914A NO20073914L (no) 2001-07-13 2007-07-25 Biologisk aktive peptider

Country Status (24)

Country Link
EP (3) EP1790655B1 (no)
JP (3) JP4213581B2 (no)
KR (2) KR100889993B1 (no)
AT (2) ATE466871T1 (no)
AU (1) AU2002319423B2 (no)
BR (1) BR0210252A (no)
CA (2) CA2452417C (no)
DE (2) DE60229883D1 (no)
DK (2) DK1478659T3 (no)
ES (2) ES2345842T3 (no)
HK (2) HK1066552A1 (no)
IL (2) IL159827A0 (no)
MX (1) MXPA03011190A (no)
MY (1) MY138219A (no)
NO (2) NO332061B1 (no)
NZ (3) NZ553507A (no)
PL (2) PL208666B1 (no)
PT (2) PT1790655E (no)
RU (2) RU2425053C2 (no)
SA (1) SA04240478B1 (no)
SG (2) SG185137A1 (no)
UA (1) UA83989C2 (no)
WO (1) WO2003006492A2 (no)
ZA (2) ZA200401108B (no)

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1216069C (zh) 2001-07-13 2005-08-24 一泰医药研究（深圳）有限公司 序列号25的生物活性肽
WO2004055042A1 (en) * 2002-12-18 2004-07-01 Pepharm R & D Limited Biologically active peptide conjugates
TWI322815B (en) * 2003-06-26 2010-04-01 Cms Peptides Patent Holding Company Ltd Biologically active peptide comprising tyrosyl-seryl-valine (ysv)
TWI353252B (en) * 2004-04-28 2011-12-01 Cms Peptides Patent Holding Company Ltd Biologically active peptide vapeehptllteaplnpk der
CN1799623B (zh) * 2005-01-05 2011-01-26 康哲医药研究(深圳)有限公司 生物活性肽在制备用于防治关节炎的药物中的用途
US8586525B2 (en) 2005-07-26 2013-11-19 Cms Peptides Patent Holding Company Limited Biologically active peptides and their new uses
GB0918579D0 (en) * 2009-10-22 2009-12-09 Imp Innovations Ltd Gadd45beta targeting agents
RU2615908C1 (ru) * 2016-05-16 2017-04-11 Федеральное государственное бюджетное учреждение "Ростовский научно-исследовательский онкологический институт" Министерства здравоохранения Российской Федерации Способ моделирования лимфогенного и гематогенного метастазирования мышиной меланомы В16 у белых нелинейных крыс

Family Cites Families (23)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5242821A (en) 1989-07-10 1993-09-07 Valio, Finnish Co-Operative Dairies' Association Lactococcus promoter and signal sequences for expression in bacteria
IT1231156B (it) 1989-07-19 1991-11-19 Eniricerche Spa Espressione e secrezione di interleuchina 1 beta umana matura in bacillus subtilis e mezzi e metodi per il suo ottenimento.
AU7142391A (en) * 1989-12-22 1991-07-24 United States of America, as represented by the Secretary, U.S. Department of Commerce, The Synthetic peptides as modulators of functional responses of intact cells
US5556744A (en) * 1992-05-29 1996-09-17 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods and compositions for diagnosing and treating certain HIV infected patients
WO1994029450A2 (en) 1993-06-15 1994-12-22 E.I. Du Pont De Nemours And Company Novel, recombinantly produced spider silk analogs
JP3286420B2 (ja) 1993-09-28 2002-05-27 株式会社ユニシアジェックス 内燃機関の吸排気弁駆動制御装置
JPH10503643A (ja) 1994-06-17 1998-04-07 ネーデルランセ オルハニサチエ フォール トゥーヘパスト−ナツールウェーテンシャッペルック オンデルズク テーエヌオー 微生物中に遺伝物質を導入する方法およびその方法によってえられる形質転換体
US6184208B1 (en) 1994-06-29 2001-02-06 Immunotech Developments Inc. Peptide, a method for its preparation and a pharmaceutical composition containing the peptide
US5958416A (en) * 1994-12-16 1999-09-28 Regents Of The University Of Minnesota Heat shock protein peptides and methods for modulating autoimmune central nervous system disease
IL115199A (en) 1995-09-07 2005-05-17 Opperbas Holding Bv Composition comprising a polynucleic acid molecule in a liposome and method using said composition
DE69633133T2 (de) 1995-10-24 2005-07-28 Juridical Foundation The Chemo-Sero-Therapeutic Research Institute TFPI-verwandte Peptide die das Wachstums von glatten Muskelzellen inhibieren
GB9606016D0 (en) * 1996-03-22 1996-05-22 Smithkline Beecham Plc Novel use
US5861483A (en) * 1996-04-03 1999-01-19 Pro-Neuron, Inc. Inhibitor of stem cell proliferation and uses thereof
SE9603468D0 (sv) * 1996-09-23 1996-09-23 Astra Ab New compounds
GB9710762D0 (en) * 1997-05-23 1997-07-23 Cancer Res Inst Royal Binding complexes
EP1015612B1 (en) 1997-05-27 2005-01-26 Hanil Synthetic Fiber Co., Ltd. Process for preparing recombinant proteins using highly efficient expression vector from saccharomyces cerevisiae
KR19990024297A (ko) 1997-08-07 1999-04-06 오종석 인체 구강내 치태형성을 억제하는 신규한 유산균
US6100388A (en) 1998-03-16 2000-08-08 Biogaia Biologies Ab Lactobacilli harboring aggregation gene as a vaccine delivery vehicle
US6245427B1 (en) 1998-07-06 2001-06-12 DüZGüNES NEJAT Non-ligand polypeptide and liposome complexes as intracellular delivery vehicles
US6653076B1 (en) * 1998-08-31 2003-11-25 The Regents Of The University Of Washington Stable isotope metabolic labeling for analysis of biopolymers
US6413530B1 (en) * 1999-04-21 2002-07-02 University Of Florida Research Foundation, Inc. Pesticidal peptides
FR2794370B1 (fr) * 1999-06-03 2003-10-17 Biovector Therapeutics Fragments proteiques polyepitopiques, leur obtention et leurs utilisations notamment en vaccination
WO2001032853A1 (en) * 1999-10-29 2001-05-10 Institute For Applied Biomedicine B cell clonal toxins and methods for using the same

Also Published As

Publication number Publication date
IL184227A (en) 2010-06-16
KR20040019058A (ko) 2004-03-04
SA04240478B1 (ar) 2007-07-31
JP4213581B2 (ja) 2009-01-21
NO20073914L (no) 2004-03-10
UA83989C2 (ru) 2008-09-10
DE60229883D1 (de) 2008-12-24
ZA200401108B (en) 2006-05-31
MXPA03011190A (es) 2004-10-28
NO20040134L (no) 2004-03-10
DK1790655T3 (da) 2010-08-23
EP1790655B1 (en) 2010-05-05
CA2452417A1 (en) 2003-01-23
IL184227A0 (en) 2007-10-31
RU2305107C2 (ru) 2007-08-27
EP1947109A3 (en) 2008-10-01
EP1478659B1 (en) 2008-11-12
ZA200509838B (en) 2007-11-28
RU2425053C2 (ru) 2011-07-27
RU2004104335A (ru) 2005-03-27
IL159827A0 (en) 2004-06-20
ES2345842T3 (es) 2010-10-04
HK1098767A1 (en) 2007-07-27
PT1478659E (pt) 2009-01-02
EP1790655A2 (en) 2007-05-30
BR0210252A (pt) 2004-09-14
AU2002319423B2 (en) 2008-02-14
KR20070070258A (ko) 2007-07-03
JP2008263993A (ja) 2008-11-06
RU2007108896A (ru) 2008-09-20
CA2707767A1 (en) 2003-01-23
CA2452417C (en) 2013-08-20
NZ553507A (en) 2008-07-31
JP2004533846A (ja) 2004-11-11
PL208666B1 (pl) 2011-05-31
ES2316586T3 (es) 2009-04-16
JP2007312785A (ja) 2007-12-06
ATE466871T1 (de) 2010-05-15
PT1790655E (pt) 2010-07-09
EP1790655A3 (en) 2007-10-10
MY138219A (en) 2009-05-29
DK1478659T3 (da) 2009-01-05
ATE414099T1 (de) 2008-11-15
HK1066552A1 (en) 2005-03-24
DE60236330D1 (de) 2010-06-17
EP1947109A2 (en) 2008-07-23
WO2003006492A2 (en) 2003-01-23
PL368059A1 (en) 2005-03-21
KR100889993B1 (ko) 2009-03-25
SG185137A1 (en) 2012-11-29
NZ529879A (en) 2007-12-21
PL211884B1 (pl) 2012-07-31
SG142165A1 (en) 2008-05-28
KR100889992B1 (ko) 2009-03-25
JP4316651B2 (ja) 2009-08-19
EP1478659A2 (en) 2004-11-24
CA2707767C (en) 2013-09-03
WO2003006492A3 (en) 2003-12-31
NZ544079A (en) 2007-10-26

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP4316651B2 (ja) 生物学的に活性なペプチド
US7402653B2 (en) Biologically active peptides
US8703695B2 (en) Biologically active peptides and their new uses
AU2002319423A1 (en) Biologically active peptides
AU2007211899B2 (en) Biologically active peptides

Legal Events

Date Code Title Description
MM1K Lapsed by not paying the annual fees