FI101720B

FI101720B - Synteettisen DNA:n konstruointi ja sen käyttö suurten polypeptidien sy nteesissä

Info

Publication number: FI101720B
Application number: FI883082A
Authority: FI
Inventors: Franco A Ferrari; Charles Richarrdson; James Chambers; Stuart C Causey; Thomas J Pollock
Original assignee: Protein Polymer Tech Inc
Priority date: 1986-11-04
Filing date: 1988-06-28
Publication date: 1998-08-14
Also published as: JP3250968B2; DE3752363T2; JP2000135092A; NO311982B1; DK369788A; NZ222450A; EP0293443A4; AU612340B2; NO882946L; DE3752363D1; ATE233273T1; FI101720B1; FI883082A; FI883082A0; AU1052888A; JPH1014586A; DK369788D0; JPH01501755A; EP0293443A1; WO1988003533A1

Description

101720 SYNTEETTISEN DNA:N KONSTRUOINTI JA SEN KÄYTTÖ SUURTEN POLY-PEPTIDIEN SYNTEESISSÄ US-hallituksella on tietyt oikeudet tähän keksintöön johtuen siitä tuesta, jonka laivasto-osasto antoi tähän keksintöön johtavalle työlle.

RISTIVIITE ASIAA KOSKEVIIN HAKEMUKSIIN

Tämä hakemus on jatko-osa hakemukselle, jonka sarjanro on 927.528, jätetty 4.11.1986.

JOHDANTO

Tekninen alue Tämä alue liittyy suurimolekyylipainoisten polymeerien valmistukseen, joko nukleiinihappojen tai peptidien, jotka ovat nukleiinihappojen ilmentymistuotteita, ja liittyy erityisesti toistuvia sekvenssejä sisältävien suurimolekyylipainoisten peptidien valmistukseen biokemiallisilla menetelmillä, peptidin ollessa käytetty rakennemateriaaleina.

Tausta

Yhdistelmä-DNA-tekniikkaa on käytetty luonnon geenien eristyksessä ja näiden geenien ilmentämisessä erilaisissa isäntä-soluissa. Tyypillisesti on tätä tekniikkaa käytetty hyväksi valmistettaessa biologisesti aktiivisia polypeptideitä, kuten interferoneja tai peptidihormoneja, joita oli epäkäytännöllistä valmistaa käyttökelpoisina määrinä muilla tavoin. Oli myös mahdollista valmistaa muunnettuja proteiineja eristämällä luonnongeenejä ja käyttämällä hyväksi paikkaspesifistä, in vitro-mutaatiotekniikkaa näiden geenien muuttamiseksi ja näin tuotettujen polypeptidien vaihtamiseksi. Muita polypeptideitä on valmistettu yhdistämällä jaksoja erilaisista luonnollista alkuperää olevista geeneistä uusien polypeptidien valmistamiseksi, jotka ovat uesiden luonnossa esiintyvien molekyylien kimeerisiä molekyylejä.

2 101720

Tehokkaiden ja automaattisten menetelmien kehittyessä DNA:n kemialliseen synteesiin on tullut mahdolliseksi syntetisoida kokonaisia geenejä ja muunnella näitä synteettisiä geenejä synteesin kulun aikana. Näitä eri menetelmiä on kuitenkin käytetty luonnon polypeptidien luonnollisten tai muunneltujen versioiden tuotantoon. Hyvin harvoin on näitä menetelmiä yritetty käyttää olennaisesti uusien polypeptidien luomiseksi. Luonnossa polypeptideillä on suuri joukko kemiallisia, fysikaalisia ja fysiologisia ominaisuuksia. Silti on kaupallisia sovellutuksia, joihin tunnetut, luonnossa esiintyvät polypep-tidit eivät sovellu.

Vaikka biotekniikka on monipuolista, sen sovellutukset usein rajoittuvat luonnossa esiintyviin tuotteisiin tai luonnossa esiintyvien molekyylien muunnoksiin. Eräs orgaanisen kemiallisen synteesin vahva kohta, vertailun vuoksi, on ollut kyky muuttaa halpoja hiilimateriaaleja moniksi erilaisiksi polymeerisiksi molekyyleiksi, mukaan lukien luonnossa esiintyvät molekyylit, mutta tärkeimmin kokonaan uusiksi kemiallisiksi rakenteiksi, kuten polypropyleeni ja polyakrylaatit, joilla on määrätyt ja ennustetut kemialliset ominaisuudet, jotka eivät liity luonnossa esiintyviin molekyyleihin.

Tällaiset aineet, erityisesti suurimolekyylipainoiset polymeerit, jotka sisältävät toistuvia aminohapposekvenssejä, o-vat osoittautuneet vaikeiksi valmistaa biokemiallisin keinoin. Tarvittavat geenit suurten, toistuvia aminohappoyksi-köitä sisältävien peptidien valmistamiseksi olivat epästabiileja ja usein niille tapahtui molekyylinsisäinen rekombinaatio, joka aiheutti poikkeamia geenin toistuvissa yksiköissä. Sellaisen biotekniikan kehittyminen, joka tuottaisi biologisilla menetelmillä polymeerisiä molekyylejä, jotka olisivat samanlaisia kuin orgaanisilla synteesillä saadut, laajentaisi merkittävästi biotekniikan sovellutusaluetta.

Lyhyt kuvaus asiaanliittyvästä kirjallisuudesta

Sadler et ai., Gene, (1980) 8:279-300, esittävät moninkertaisten laktoosioperaattoreiden kloonauksen peräkkäin 3 101720 aina neljään. Brutlag et ai., Cell, (1977) JLO:509-519 esittävät hybridibakteriplasmidit, jotka sisältävät runsaasti toistuvan satelliitti-DNA:n. Doel et ai., Nucleic Acids Research, (1980) 8:4575-4592, esittävät poly(aspartyyli-fenyylialaniinin) synteesin bakteereissa. Menetelmä proliini-pitoisuuden lisäämiseksi kloonaamalla plasmidi, joka koodit-taa proliinipolymeerin tuotantoa, on esitetty julkaisussa Kangas et ai., Applied and Environmental Microbiology, (1982) 43:629-635. Julkaisussa Gupta et ai., Bio/Technology, p. 602-609, September 1983, keskustellaan biologisista rajoituksista runsaasti toistuvien DNA-sekvenssien pituuteen, jotka voivat stabiilisti pysyä plasmidireplikoneissa.

KEKSINNÖN YHTEENVETO

Käyttöön tarjotaan menetelmät ja koostumukset polypeptidien valmistukseen, joissa on toistuvia oligomeeriyksiköitä, ilmentämällä synteettinen rakennegeeni. Oligomeeristä peptidi-sekvenssiä koodittavat eri yksiköt vaihtuvat nukleotidisek-venssin suhteen, joka käyttää hyväkseen aminohappokodoniyli-määrää. Pitkät nukleiinihapposekvenssit rakennetaan syntetisoimalla nukleiinihappo-oligomeerit, jotka ilmentävät useita eri toistuvia peptidiyksiköitä, ja oligomeerit yhdistetään, jolloin saadaan halutun pituinen polynukleotidi. Käytetään ; ilmentymisjärjestelmiä, joilla saadaan kohdeisännän kasvu suureen tiheyteen ennen polypeptidituotteen merkittävää ilmentymistä, jonka jälkeen ilmentyminen alkaa polypeptidituotteen suurten saantojen antamiseksi, jotka voidaan eristää isäntäsoluista. Eräässä toteutusmuodossa käytetään järjestelmää, jossa isäntä-RNA-polymeraasi ei tunnista synteettisen geenin transkription aloitusjärjestelmää ja isännässä on mukana funktionaalista RNA-polymeraasia ilmentävä geeni indusoitavasta säädeltynä.

LYHYT KUVAUS PIIRROKSISTA

Kuva 1: Plasmidin pSY701 rakenne.

4 101720

Kuva 2: Polypeptidituotteiden immuunitäplät käyttäen vasta-ainetta (A) beeta-laktamaasille tai (B) gly-ala-peptidille.

Kuva 3: Konstruointikaavio plasmidille pG10/SlpI.

Kuva 4: Immuunitäplät polypeptidituotteille (A) T7gpl0/Slpl anti-Slp Ab:n kanssa, (B) T7gp9/Slpl anti-Slp Ab:n kanssa tai (C) Coomassien sinisellä värjättynä.

Kuva 5: Konstruointikaavio plasmidille pSY856.

Kuva 6: Aikajärjestys kanamysiiniresistenssin geenituotteen akkumuloitumiselle T7-järjestelmän kanssa.

Kuva 7: Konstruointikaavio plasmidille pSY857.

Kuva 8: Konstruointikaavio plasmidille pSY980.

Kuva 9: (A) Värjäys amidomustalla geelistä, joka sisältää tuotteen beeta-galaktosidaasi/sipIII-geenin fuusiosta; (B) immuunitäplä samasta tuotteesta anti-Slp-vasta-aineella.

Kuva 10: Konstruointikaavio plasmidille pSY1280.

KUVAUS EDULLISISTA TOTEUTUSMUODOISTA

Käyttöön tarjotaan uudet polypeptidit, jotka ovat polyoligo-meerejä sisältäen toistuvia, suhteellisen lyhyitä aminohappo-sekvenssiyksiköitä. Oligomeerit voivat olla liittyneinä eri aminohapposekvenssin välikkeiden avulla. Sen vuoksi uudet polypeptidit sisältävät toistuvia aminohapposekvenssejä ja ovat erityisen käyttökelpoisia kuituproteiineina, mukaanluettuna elastomeeriyhdisteet. Toistuvia yksiköitä sisältäviä peptidejä koodittava geeni tuotetaan erityisesti niiden ongelmien välttämiseksi, jotka aikaisemmin liittyivät monia toistuvia yksiköitä sisältäviin geeneihin.

5 101720 Käsillä olevan keksinnön kohteena on DNA-sekvenssi, joka koodittaa peptidiä, joka sisältää toistuvan oligopeptidiyksikön, jolle toistuvalle yksikölle on tunnusomaista se, että se sisältää ainakin kolme eri aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, että peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa kussakin toistuvassa yksikössä ja jossa yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan liittämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraavan kaavan mukainen:

Kk (WMXxNYy) jossa: K ja L ovat kumpikin DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat aminohapposekvenssiä, jossa on noin 1-100 aminohappoa, K:n ja L:n muodostaessa vähemmän kuin noin 20 % aminohappojen kokonaislukumäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; W on seuraavan kaavan mukainen: [(A)„ (B) p] q A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-sikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koodittaessa identtistä aminohappoa toistuvissa yksiköissä, jotka ovat erilaisia, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta eroten toisistaan ainakin yhden nukleotidin suhteen; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta oligopeptidiyksikköä kuin jota A koodittaa ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B:n yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa ainakin 90 nukleotidin DNA-sekvenssin; M ja N ovat samoja tai erilaisia ja ovat kodonien DNA-sekvenssi ja ovat 0-18 nukleotidia lukuvaiheistuksessa vastaavasti W:n ja X:n kanssa; e 101720 X on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen: CU1) UB1) .] . n' p1 q' Y on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen:

CU2>n2<B2>p2V

jossa: kaikki symbolit tulevat niiden kirjainparien määritelmistä; x ja y ovat 0 tai 1; i on 1-100; ja q:n, q::n ja q2:n kokonaissumma on ainakin 1 eikä ole enempää kuin noin 50; ja että sekvenssin koodittaman polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

Nukleotidien kokonaislukumäärä on ainakin 90 nukleotidia, tavallisesti ainakin noin 150 nt, edullisesti ainakin noin 900 nt ja voi olla 20 knt (kilonukleotidia), tavallisesti se ei ole enempää kuin noin 15 nt, tavallisemmin ei enempää kuin noin 10 knt.

Edelleen käsillä olevan keksinnön kohteena on DNA-sekvenssi, joka koodittaa peptidiä, joka sisältää toistuvan oligopepti-diyksikön, jolle toistuvalle yksikölle on tunnusomaista, että se käsittää aminohapposekvenssin GAGAGS tai GVGVP, DNA-sekvenssin käsittäessä seuraavan kaavan: [ (A)n(B)p]q jossa: A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-sikköä, jolloin kodonit ainakin kahdelle G:lie samoissa tai erilaisissa A:ssa ovat erilaiset, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa 7 101720 muuta oligopeptidiyksikköä kuin A-yksikkö ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 5-25; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvens-sin, joka on ainakin 90 nukleotidia; ja että sekvenssin koodittaman polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

Edelleen käsillä olevan keksinnön kohteena on polypeptidi, joka käsittää yhdistelmä-DNA-ilmentymistuotteen DNA-sekvens-sistä, joka koodittaa peptidiä, jossa on toistuvat oligopepti-diyksiköt, jolle oligopeptidille on tunnusomaista, että siinä on ainakin kolme erilaista aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, jolloin peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa kussakin toistuvassa yksikössä ja jolloin yksiköt ovat valinnaisesti amino-happosillan yhdistämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraavan kaavan mukainen:

Kk (WMXxNYy) iL, jossa: K ja L ovat kumpikin DNA-sekvenssejä, jokta koodittavat noin 1-100 aminohapon aminohapposekvenssiä, K:n ja L:n muodostaessa vähemmän kuin noin 20 % aminohappojen kokonaismäärästä; • k ja 1 ovat 0 tai 1; W on seuraavan kaavan mukainen: [<A>n(B)p]q A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa oligopeptidiyksikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koo-dittaessa identtisiä aminohappoja toistuvissa yksiköissä, jotka ovat erilaisia, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta kuin A-yksikön koodittamaa oligopeptidiyksikköä ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja β 101720 tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; i kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvens- sin, joka on ainakin 90 nukleotidia; ja että polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

Edelleen käsillä olevan keksinnön kohteena on peptidi, joka käsittää yhdistelmä-DNA-ilmentymistuotteen DNA-sekvenssistä, joka koodittaa peptidiä, jossa on toistuvina yksikköinä oligo-peptidi, jolle oligopeptidille on tunnusomaista, että siinä on ainakin kolme erilaista aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, jolloin peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa kussakin toistuvassa yksikössä ja jossa yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan yhdistämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraa-van kaavan mukainen: K|t [ (A) n (B) p] qLx jossa: K ja L ovat molemmat DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat noin 1-100 aminohapon aminohapposekvenssiä, K:n ja L:n muodostaessa vähemmän kuin noin 20 % aminohappojen kokonaislukumäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-; sikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kah den kodonin koodittaessa identtisiä aminohappoja toistuvassa yksikössä, joka on erilainen, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta kuin A-yksikön koodittamaa oligopeptidiyksikköä ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvenssin, joka on ainakin 90 nukleotidia; 9 101720 ja että polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

Vielä edelleen keksinnön kohteena on prokaryoottinen isäntä, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin.

Myös keksinnön kohteena on menetelmä peptidin tuottamiseksi, joka sisältää yhdistelmä-DNA-ilmentymistuotteen DNA-sekvens-sistä, joka koodittaa peptidiä, jolla on toistuvia oligopepti-diyksiköitä, jolle oligopeptidille on tunnusomaista, että siinä on ainakin kolme erilaista aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, ja mainitussa peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa jokaisessa toistuvassa yksikössä ja jossa yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan yhdistämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraavan kaavan mukainen:

Kk (WMXxNYy) iL, jossa: K ja L ovat kumpikin DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat noin 1-100 aminohapon aminohapposekvenssiä, K:n ja L:n käsittäessä vähemmän kuin 20 % aminohappojen kokonaislukumäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; W on seuraavan kaavan mukainen: [ (A)n(B)p]q ; A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk- sikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koodittaessa identtisiä aminohappoja toistuvassa yksikössä, joka on erilainen, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta kuin A-yksikön koodittamaa oligopeptidiyksikköä ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvens- ,0 101720 sin, joka on ainakin 90 nukleotidia; M ja N ovat samoja tai erilaisia ja ovat kodonien DNA-sekvens-si ja ovat 0-18 nukleotidia lukuvaiheistuksessa vastaavasti W:n ja X:n kanssa, koodittaen aminohapposekvenssiä; X on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen : [(A1) «(B1) , n' p' q Y on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen :

C(A2)n2(B2) 2^ 2 V Q

jossa: kaikki symbolit ovat kirjainparien määritelmien mukaiset; x ja y ovat 0 tai 1; i on 1-100; ja q:n, q*:n ja q2:n kokonaissuinma on ainakin 1 eikä ole enempää kuin noin 50; ja että sekvenssin koodittaman polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal; menetelmän käsittäessä: patenttivaatimuksen 12 mukaisen prokaryoottisen isännän kasvattamisen, jossa DNA-sekvenssi on isännässä toimivien aloituksen ja lope-: tuksen säätelyalueiden transkriptionaalisessa ja translatio- naalisessa säätelyssä, jolloin peptidi ilmentyy; ja ilmentymistuotteen eristämisen.

Käytettävät nukleotidisekvenssit syntetisoidaan, niin että toistuvilla yksiköillä on eri kodonit samalle aminohapolle, kuten edellä on kuvattu. Tavallisesti ainakin noin 25 %, tavallisemmin ainakin noin 40 %, ja yleensä ainakin noin 60 %, mutta ei enempää kuin noin 95 %, edullisesti ei enempää kuin noin 90 % toistuvia yksiköitä koodittavista nukleotidisekvens-seistä on samoja. Suurempaa vaihtelevutta näissä rajoissa käytetään, kun alkuperäisille rakenteille on kokeellisesti osoitettu tapahtuvan spontaanit rekombinaatiotapahtumat.

11 101720

Erityisen mielenkiintoisia ovat polypeptidit, joilla on toistuvana yksikkönä SGAGAG (G = glysiini; A = alaniini; S = se-riini). Tämä toistuva yksikkö löytyy luonnossa esiintyvästä silkkifibroiiniproteiinistä, joka voidaan esittää seuraavasti: GAGAG(SGAGAG)gSGAAGY (Y * tyrosiini). Kohdekeksintoon on suunniteltu toistuva yksikkö, jossa N-pää voi olla MGAGAG tai mikä tahansa muu sekvenssi, jossa yleensä on ainakin noin 3 aminohappoa, tavallisesti ainakin noin 5 aminohappoa, tavallisemmin 12 aminohappoa eikä enempää kuin 200, tavallisesti ei enempää kuin 100 aminohappoa, jotka voivat olla erilaisia kuin toistuva yksikkö. Yleensä erilainen N-pää on tuloksena geenin insertoimisesta vektoriin tavalla, joka johtaa fuusio-proteiinin ilmentymiseen. Mikä tahansa proteiini, jonka ominaisuudet eivät ole ristiriidassa haluttujen tuotteen ominaisuuksien kanssa, voi antaa N-pään. Erityisesti voidaan käyttää endogeenisiä isäntäproteiineja, esim. bakteeriprpteiine-ja. Proteiinin valinta voi riippua transkription aloitusalu-een luonteesta. Samoin voi C-päällä olla aminohapposekvenssi, joka eroaa toistuvasta sekvenssistä. Mukavasti voi olla 1-100, tavallisesti 1-25 aminohappoa, jotka saattavat olla luonnossa esiintyvän rakennegeenin C-pää, joka taas tyypillisesti saadaan fuusiotuotteen muodostumisesta.

Silkin kaltainen proteiini (silk-like-protein = Slp) -geeni voidaan tuottaa muodostamalla oligomeerit noin 5-25 toistuvasta yksiköstä, kuten edellä on kuvattu, tavallisemmin noin 10-20 toistuvasta yksiköstä. Omaaviensa erilaisten koheesiopa iden vuoksi oligomeerit voidaan konkatemerisoida polymeerin saamiseksi, jossa on 2 tai useampi oligomeeriyksikkö, tavallisesti ei enempää kuin noin 50 oligomeeriyksikköä, tavallisemmin ei enempää kuin noin 30 oligomeeriyksikköä, ja usein ei enempää kuin noin 25 oligomeeriyksikköä.

Silkin kaltaiset proteiinit voivat vaihdella siksi, että niillä on vaihtuvat multimeerit, joilla on sama tai erilainen kätisyys. Esimerkiksi kaavassa olevalla (B)p:llä voi olla pa-rillinen tai pariton lukumäärä aminohappoja. Silkissä 12 101720 glysiinin vedyt voivat olla rivissä toisella puolella ja ala-niinin ja seriinin metyylit ja hydroksyylit toisella puolella. Jos (B)p on parillinen, syntyy jatkuva suora rivi, jos pariton, syntyy (A)n:n vaihtuva rivi. Niinpä erilaisia ominaisuuksia voidaan saavuttaa vaihtamalla (B)p:n koodittamien aminohappojen lukumäärää.

Erityisen mielenkiintoisia ovat polypeptidit, jotka matkivat Bombyx mori-silkin koostumusta ja fysikaalisia ominaisuuksia.

Myös mielenkiintoisia ovat polypeptidit, joissa toistuvana perusyksikkönä on GVGVP (G glysiini, V = väliini, P = pro-liini), jotka voidaan löytää luonnossa esiintyvästä elastii-nista. Kohdekeksinnössä N-pää voi olla mikä tahansa mukava sekvenssi, ja haluttaessa voi olla kokonainen tai osa prote-aasilla vähennettynä. Tavallisesti N-pääsekvenssi, jolla ei ole kohdeaihetta, on vähemmän kuin noin 100 aminohappoa, tavallisemmin vähemmän kuin noin 60 aminohappoa.

Erityisen mielenkiintoinen on perussekvenssi, jossa on noin 6-10, edullisesti 8, yksikköä, jotka ovat noin 6-20 aminohapon, tavallisesti 8-16 aminohapon sekvenssin erottamia, joissa saattaa olla sisäinen toisto, joka eroaa 4-8 aminohapon toistuvasta perusyksiköstä. Esimerkiksi toinen toistosek-venssi voi olla GAGAGS, toistuneena kahdesti. Toistuvien perusyksiköiden kokonaislukumäärä on yleensä alueella noin 150-300, tavallisesti 175-250. C-pää voi päättyä toistuvalla yksiköllä tai sen osalla tai erilaisella sekvenssillä, jossa on 1-100, tavallisesti 1-30 aminohappoa. C-pää ei ole keksinnölle kriittinen, ja se valitaan ensisijaisesti mukavuuden kannalta. Mitä tulee N-päähän, se voi olla suunniteltu pro-teolyyttiseen lohkaieuun. Kuten silkkiproteiinin tapauksessa, voi kohteena oleva elastiininkaltainen proteiini olla samoin suunniteltu.

Erityisen mielenkiintoisia ovat proteiinit, jotka matkivat elastiinin ominaisuuksia ja antavat elastomeerisia ominaisuuksia.

13 101720

Toistuvia yksiköitä käsittävä sekapolymeeri on hyödyllinen menetelmä ominaisuuksien muuttamiseksi, valitsemalla sopivasti eri yksiköt, yksiköiden lukumäärä kussakin multimeerissa, niiden välinen tila, ja multimeeriyhdistelmän toistojen lukumäärä. Niinpä vaihtelemalla primääristen monomeerien lukumäärää ja järjestystä voidaan saada aikaan joukko erilaisia fysikaalisia ja kemiallisia ominaisuuksia.

Esimerkkejä harkkopolymeerien käytöstä ovat silkkiyksiköiden ja elastiiniyksiköiden yhdistelmät, jolloin saadaan tuotteita, joiden ominaisuudet eroavat polymeereistä, joilla on vain sama monomeeriyksikkö.

Rakennegeenien valmistamiseksi voidaan käyttää erilaisia lähestymistapoja. Oligomeerien valmistamiseksi voidaan syntetisoida DNA:n komplementaarisäikeet, niin että hybiridisoitaes-sa saadaan kaksisäikeinen DNA, jolla on sopivat päät. Haluttaessa kaikki oligomeeriyksiköt voivat olla samoja, niin että erillisessä vaiheessa voidaan saada konkatemeeri riippuen hybridisaation olosuhteista. Normaalisti käytetään tavanomaisia lämpökäsittely- ja kytkentäolosuhteita, kuten seuraavissa esimerkeissä on kuvattu.

Haluttaessa voidaan valmistaa kaksi erilaista oligomeeriyk-sikköä, joissa kahden yksikön päät ovat komplementaarisia toistensa kanssa, mutta saman yksikön päät eivät voi sitoutua yhteen. Tällä tavoin voidaan muodostaa erillisiä oligomeeri-yksiköitä ja yhdistää ne sitten toisiinsa konkatemeerin muodostamiseksi, jossa väliin tulevat kytkentäsekvenssit ovat ainakin osittain päiden määräämät. Rakenteesta riippuen voi 5'-pää antaa aloituskodonin metioniinin, tai rakennegeeni voidaan liittää väliyhdisteeseen, josta saadaan ainutlaatuinen sekvenssi (valinnaisesti spesifisellä entsyymillä pilkottavissa) 5'-päähän tai voidaan insertoida osaan geeniä, tavallisesti isännälle endogeeniseen, sopivaan lukuvaiheistuk-seen fuusiotuotteen saamiseksi. Tarjoamalla sopivat komple-·· mentaaripäät väliyhdisteen tai typistetyn geenin ja 14 101720 kohderakennegeenin 5'-pään välille voidaan sekvenssit yhdistää sopivassa lukuvaiheistuksessa halutun proteiinin saamiseksi. Etuja, jotka voidaan saada käyttämällä väliyhdisteitä tai fuusioproteiineja, ovat spesifisten sekvenssien saaminen erityistarkoituksiin, kuten kytkeminen, eritys, kompleksin-muodostus muiden proteiinien kanssa, affiniteettipuhdistus, tai vastaavat.

Kun rakennegeeni kerran on koottu, se voidaan kloonata; jolloin halutun geenin sisältävät kloonit, erityisesti mitä tulee sekvenssin pituuteen, voidaan eristää; ja geeni voidaan poistaa ja käyttää liittymään sekvenssiin ilmentymistä varten.

Ilmentymisrakenteessa on rakennegeenin transkription ja translaation aloituksen ja lopetuksen säätelyalueet, .5' ja 3', vastaavasti. Kuten jo todettiin, nämä alueet voidaan luoda käyttämällä fuusioproteiinia, jolloin kohderakennegeeni insertoidaan eri rakennegeeniin sen aloituskodonin alapuolelle ja lukuvaiheistuksessa aloituskodonin kanssa. Vaihtoehtoisesti saadaan erilaisia transkription ja translaation aloi-tusalueita suuresta joukosta erilaisia geenejä käytettäväksi ilmentymisisännissä, niin että nämä transkription ja translaation aloitusalueet voidaan liittää kohderakennegeeniin kohderakennegeenien transkription ja translaation aloituksen aikaansaamiseksi. On saatavissa suuri joukko erilaisia lope-tusalueita, jotka voivat olla samasta geenistä kuin transkription aloitusalue, tai eri geenistä. Kirjallisuudessa on esitetty lukuisia rakenteita, ja samoja menetelmiä voidaan käyttää kohdegeenin kanssa, kuin mitä on käytetty muiden ra-kennegeenien kanssa.

Erityisen mielenkiintoista on indusoitavan transkription aloitusalueen käyttö. Tällä tavalla isäntäkanta voidaan kasvattaa suureen tiheyteen ennen halutun tuotteen merkittävää ilmentymistä. Indusoitavan transkription käyttäminen on erityisen käyttökelpoista silloin, kun peptidi pysyy soluisän-näesä ennemmin kuin erittyy isännästä.

is 101720

Indusoitavien transkription aloitusalueiden joukko on olemassa tai sitä voidaan käyttää hyväksi tietyissä tilanteissa. Indusoitavia alueita voidaan säätää tietyllä kemikaalilla, kuten isopropyylitiogalatosidi (IPTG) beeta-galaktosidaasi-geenin indusoimiseksi. Muita indusoitavia alueita ovat vasen ja oikea lambda-promoottori; erilaiset aminohappopolykistro-nit, esim. histidiini ja tryptofaani; lämpöherkät promoottorit; ja säätelygeenit, esim. clts 857.

Vaihtoehtoinen järjestelmä, jota voidaan edullisesti käyttää hyväksi on transkription aloitusalueyhdistelmän käyttäminen. Käytetään ensimmäistä transkription aloitusaluetta, joka säätelee halutun geenin ilmentymistä, mutta joka ei ole funktionaalinen ilmentymisisännässä, koska ei onnistu olemaan funktionaalinen endogeenisen RNA-polymeraasin kanssa. Toista transkription aloitusaluetta, kuten indusoitavaa aluetta, voidaan sitten käyttää säätelemään RNA-polymeraasin ilmentymistä, jonka kanssa ensimmäinen transkription aloitusalue on funktionaalinen. Tällä tavalla ilmentyminen tapahtuu vain aktivoitaessa säätelyaluetta, joka säätelee eksogeenisen RNA-polymeraasin ilmentymistä. Kohdehakemuksessa tätä järjestelmää on valaistu T7-faagi-transkription aloitusalueella, spesifisesti T7-faagin geenien 9 ja 10 aloitusalueita.

Vaihtoehtoinen järjestelmä pohjautuu mutanttien käyttöön, jotka läpikäyvät kehitysmuutoksen, joka perustuu ympäristön muutokseen, kuten ravinnon puutteeseen, lämpötilaan, osmoottiseen paineeseen, suolaisuuteen, tai vastaavaan. Tätä järjestelmää kuvaamaan voidaan saada B. subtilis-kannat, jotka eivät pysty itiön muodostukseen, mutta jotka voivat tuottaa niitä komponentteja, jotka aloittavat itiön muodostukseen liittyvien tuotteiden ilmentymisen. Sen vuoksi itiön muodostukseen liittyvä transkription aloitusalue aktivoidaan muuttamalla väliaineen olosuhteita. Tässä tilanteessa isäntä antaa välttämättömän indusoivan aineen tai aktivoijän ilmentymisen aloitukseen.

l6 101720

On olemassa erilaisia muitakin menetelmiä, joilla saadaan geenin transkription ja translaation indusoitavissa olevaan säätelyyn tietyssä isännässä.

Enimmäkseen on isäntä yksisoluinen organismi, joko prokary-ootti tai eukaryootti, joka on valittu bakteereista, levistä, sienistä, rihmasienistä, jne. Kuvaavia isäntiä ovat E. coli, B. subtilis, B. stearothermophilus, S. cerevisiae, ja vastaavat.

Ilmentymisrakenne halutun geenin ilmentymiseen, itsenään tai yhdessä minkä tahansa transkriptioon liittyvien apugeenien kanssa, liitetään normaalisti sopivaan vektoriin ilmentymis-isäntään liittämistä varten. Kaupallisesti on saatavissa suuri joukko vektoreita muiden ollessa kuvattu kirjallisuudessa. Vektoreille on normaalisti tunnusomaista se, että niillä on yksi tai useampi ainutlaatuinen restriktiokohta, replikoi-tumisjärjestelmä ekstrakromosomaaliseen ylläpitoon isännässä, ja yksi tai useampi markkeri, joka ottaa huomioon selektiivisen paineen isäntään. Markkerit voivat tarjota kömpiementoin-nin, prototrofian auksotrooppiseen isäntään, biosidiresis-tenssin, esim. antibiootille, kuten penisilliini tai kanamy-siini, tai vastaavat. Joissakin tapauksissa, ennemmin kuin selektiivistä painetta, käytetään markkerigeeniä, joka ottaa huomioon tiettyjen kasvustojen havaitsemisen, jotka sisältävät geenin. Tätä tilannetta kuvaa geeni beeta-galaktosidaa-siin, jolloin käytetään kasvualustaa, joka antaa värillisen tuotteen.

Ilmentymisrakenne, joka sisältää mitä tahansa apugeenejä, voidaan liittää ilmentymisvektoriin tunnettujen menetelmien mukaan, erityisesti käyttämällä restriktiota, insertoimista ja kytkemistä.

Ilmentymisrakennetta voidaan sitten käyttää sopivan isännän transformoimiseen. Isännästä riippuen voidaan käyttää joko koskemattomia soluja tai protoplastia, jolloin käytetään transformaatiota tai konjugoimista. Mukavasti voidaan käyttää 17 101720 kalsiumfosfaatilla seostettua DNA:ta tai ei-ionisia deter-genttejä plasmidin liittämiseksi isäntään. Tulisi ymmärtää, että vektoreita ei ole välttämätöntä käyttää isännän trans-formoimiseen, koska pelkkä DNA voidaan liittää integroimista varten genomiin. Kuitenkin jos toivotaan integroitumista, saadaan paljon suurempi tehokkuus käyttämällä vektoreita, mikä siis suosii vektoreiden käyttämistä.

Riippuen vektorin luonteesta voidaan ilmentymisrakenne säilyttää ekstrakromosomaalisessa osassa tai se voidaan integroida isäntään. Kun integroitumista halutaan, on tavallisesti toivottua, että prokaryooteilla ja joillakin eukaryooteilla on sekvenssi, joka on homologinen isännän kromosomissa olevan sekvenssin kanssa. Tavallisesti sekvenssi on ainakin noin 200 emäsparia eikä enempää kuin noin 5000 emäsparia, tavallisesti ei enempää kuin noin 2000 emäsparia. Homologisen sekvenssin valinta on jonkinverran työlästä, mutta voidaan käyttää komp-lementaatioon silloin kun isäntä on auksotrooppinen mutantti ja homologi tarjoaa prototrofiän.

Transfomantit ja integrantit voidaan sitten kasvattaa sopivassa ravintoväliaineessa suureen tiheyteen, jonka jälkeen indusoidaan transkriptio ilmentymisrakenteen transkriptiojärjestelmän luonteen mukaisesti. Kun haluttu proteiini jää sytoplasmaan, nämä solut korjataan ja liuotetaan, ja riippuen proteiinin käytöstä, proteiini voidaan edelleen puhdistaa tavanomaisilla menetelmillä, kuten kromatografia, liuotin-liuo-tin-uutto, affiniteettikromatografia, ja vastaavat.

Toistuvilla proteiineilla voi olla erilaisia käyttöjä. Slp-proteiineja voidaan käyttää tuotettaessa kuituja, joilla on ainutlaatuiset ominaisuudet, korvaamaan silkkiä, ja vastaavasti. Voidaan tuottaa kollageeniproteiineja, joissa kollageeni ei sisällä telopeptidiä tai sisältää telopeptidin, riippuen toiminnasta. Atelopeptidikollageenilla pitäisi olla vähän jos ollenkaan immunogeenisuutta, niin että se on käyttökelpoinen elementti erilaisiin proteeseihin tai ie 101720 käytettäväksi kollageenin korvikkeena muissa sovellutuksissa. Samoin myös muita proteiineja, joilla on toistuvat yksiköt, kuten keratiini, voidaan myös valmistaa kohdekeksinnön mukaan. Muita käyttökelpoisia toistuvia proteiineja voidaan valmistaa, jotka perustuvat hämähäkinsilkkien ja muiden toistuvien eläinkuitujen sekvensseihin.

Seuraavat esimerkit annetaan kuvaamaan, ei rajoittamaan. Esimerkki 1 DNA;n valmistusmenetelmät 1. Plasmidi-DNArn valmistus E. colista: A. Pieni mittakaava; Plasmidi-DNA valmistettiin 1,5 ml:n viljelmistä joko keittomenetelmällä tai emäksisellä liuotusmene-telmällä (Maniatis et al·., Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor. (1982)).

B. Suuri mittakaava; Plasmidin sisältävää kantaa kasvatettiin yön yli 1 l;n Luria-liemessä sopivan antibiootin kanssa. Solut kerättiin sentrifugoimalla 10.000 x g 5 min ja suspendoi-tiin uudelleen 10 ml:aan jääkylmää TE:tä (10 mM Tris-HCl, pH 8, 1 mM EDTA). Solut sentrifugoitiin uudelleen, suspendoitiin uudelleen 4 ml;aan TES (TE ja 25 % paino/til. sakkaroosia) ja homogenisoitiin käyttämällä vorteksia. Näytteet pidettiin jäissä seuraavaa vaihetta varten. Lysotsyymiä (1 ml 10 mg/ml:n seosta) lisättiin solususpensioon ja inkuboitiin 5 min ennen kuin lisättiin 2 ml 0,5 M EDTA, pH 8. 10 minuutin inkuboinnin jälkeen lisättiin 50 ml proteinaasi K;ta (40 mg/ml) ja sen jälkeen 10 min kuluttua 15 ml liuotuspuskuria (0,1 % Triton X-100, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl, pH 8). 15-20 min kuluttua soluliuotustuote sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 19 101720 35.000 x g 90-120 min. £upernatantti (19,8 ml) siirrettiin muoviputkeen 20 g:n kanssa CsCl ja 400 ui:n kanssa etidium-bromidia (10 mg/ml). Liukenemisen jälkeen seos jaettiin kahteen polyallomeeriultrasentrifuugiputkeen, suljettiin lämmön avulla ja sentrifugoitiin Beckmanin Ti 65 moottorilla nopeudella 60.000 rpm 24 h. Alempi plasmidivyöhyke poistettiin putkesta ihonalaisneulalla. Etidiumbromidi uutettiin kolme kertaa samalla tilavuudella NaCl-kyllästettyä isopropanolia. Kaksi tilavuutta H2O lisättiin DNA-liuokseen ja sitten DNA saostettiin etanolilla.

2. Kaksisäikeisen DNA:n valmistus: JM103-viljelmää kasvatettiin OD600:n arvoon noin 0,2 ‘ja jaettiin sitten 2 ml:n eriin. Kukin erä infektoitiin tuoreella Ml3-täplällä ja inkuboitiin 37QC:ssa noin 6 h voimakkaasti ravistaen. Sitten solut pelletoitiin ja supenatantti säilytettiin myöhempiä infektointeja varten. Kaksisäikeinen faagi-DNA uutettiin keittomenetelmällä (Maniatis et ai.).

3. Deproteinisaatio:

Suoritettiin fenoliuutto sopivalle tilavuudelle DNA-näytettä, tyypillisesti välillä 100 ul-10 ml. DNA-näyte laimennettiin 0,01 M Tris-HCl:ään, pH 7,5, 1 mM EDTA, ja sama tilavuus vedellä kyllästettyä fenolia lisättiin. Näytettä vorteksoi-tiin lyhyesti ja pantiin jäihin 3 minuutiksi. Kun oli sentri-fugoitu 3 min mikrofuugissa, vesikerros siirrettiin uuteen putkeen ja uutettiin kerran samalla tilavuudella seosta kloroformi: isoamyylialkoholi (24:1).

4. Etanolisaostus:

Vesipitoisessa puskurissa oleva DNA konsentroitiin etanoli-saostuksella. DNA-näytteeseen lisättiin 1/10-tilavuus 3 M natriumasetaattia, pH 7,5, ja 2-3 tilavuutta kylmää etanolia. DNA saostettiin 30 min -70°C:ssa tai yön yli 20 101720 -20°C:ssa ja pelletoitiin sitten sentrifugoimalla mikrofuu-gissa 15 min 4°C:ssa. Pelletti pestiin kerran 200 ul:lla kylmää 80 % etanolia ja pelletoitiin jälleen 10 min 4°C:ssa. II-makuivatuksen tai lyofilisoinnin jälkeen pelletit suspendoi-tiin uudelleen sopivaan puskuriin.

5. DNA;n fosfataasikäsittely; DNA:n fosfataasikäsittely suoritettiin lisäämällä 1 ui (25 yksikköä) vasikan ohutsuolen fosfataasia (Boeringer Mannheim) suoraan restriktioentsyymin pilkkomisreaktioon ja jatkamalla inkubointia 30 min 370C:ssa. Fosfataasi inaktivoitiin 60 min 65°C:ssa ennen deproteinisaatiota fenoliuutolla.

6. Sijoittamisreaktio DNA-polymeraasi I:llä: DNA suspendoitiin uudelleen puskuriin, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 50 mM KC1, 5 mM MgCl2 ja 400 um kutakin neljää deoksinukleotiditrifosfaattia. Kymmenen yksikköä Kle-nowin DNA-polymeraasia (BRL) lisättiin, ja reaktion annettiin kehittyä 15 min huoneenlämmössä. DNA uutettiin sitten fenolilla ja etanoli saostettiin.

7. T4 polynukleotidikinaasireaktio:

Reaktio (10 ui) sisälsi: T4 polynukleotidikinaasia (BRL), 150 ng DNA, 1 ui lOx kinaasipuskuria (0,7 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 M MgCl2» 50 mM DTT) ja \32pl“ATE> (200-300 nCi). Tätä inkuboi-tiin 37°C:ssa 30 min ja sitten DNA puhdistettiin käyttäen NACS-kolonnia (Bethesda Research Labs).

8. Pilkkominen restriktioendonukleaaseilla: DNA pilkottiin restriktioendonukleaaseilla (REN) 1 x "AA"-puskurissa [l0 x AA-puskuri on 330 mM Tris-asetaattia, pH 7,9, 660 mM kaliumasetaattia, 100 mM magnesiumasetaattia, 50 mM ditiotreitolia (DTT) ja 1 mg/ml naudan seerumin albumiinia (nukleaasivapaata)^' Aina kun oli mahdollista, DNA:n konsent-raatio pidettiin pienempänä kuin 1 ug/25 ui.

21 101720

Inkubointi suoritettiin 370C:ssa 1-4 h useimmille restriktio-endonukleaaseille, paitsi Ball-, BanI- ja Nael-pilkkomisil-le, joita inkuboitiin yön yli.

9. Analyyttinen agaroosigeelielektroforeesi DNA;lie: DNA-näytteisiin geelielektroforeesia varten lisättiin 0,2 tilavuutta täyttöpuskuria (5 x elektroforeesipuskuri, 0,01 % bromifenolisiniväri, 50 mM EDTA ja 50 % glyseroli). Sitten näytteet ladattiin vaakasuoran, upotetun, 1,0 % (w/v) agaroo-sigeeliä sisältävän elektroforeesiyksikön ajovyöhykkeisiin. Elektroforeesipuskuri oli joko 1 x TAC tai 1/2 x TBE. 1 x TAC on 40 mM Tris-emästä, 10 mM EDTA, säädettynä pH-arvoon 7,8 etikkahapolla. 1/2 x TBE on 0,045 M Tris-emästä, 0,045 M boo-rihappoa, 1 mM EDTAa, pH 8. Geeliä ajettiin 40-50 V:lla 18 h, poistettiin sitten ja värjättiin 0,5 ug/ml etidiumbrqmidilla 30 min. DNA-vyöhykkeet tehtiin näkyviksi pitkäaaltoisella UV-läpivalaisimella.

10. Preparatiivinen agaroosigeelielektroforeesi:

Menetelmät ja materiaalit ovat samat kuin analyyttiselle aga-roosigeelielektroforeesille. Ainoa ero on alhaisen sulamispisteen omaavan agaroosin käyttö, jonka konsentraatio on alueella 0,5-2,5 % (w/v) riippuen puhdistettavan DNA-fragmentin koosta. DNA-restriktiofragmentit poistettiin LMP-agaroosigee-leistä näkyväksi tekemisen jälkeen etidiumbromidilla.

11. NACS-puhdistus: DNA:ta sisältäviä geelifragmentteja sulatettiin 70°C:ssa 5 min ja laimennettiin noin 5-kertaisesti TElsllä (10 mM Tris-HC1, pH 7,5, 0,2 M NaCl). Geeliliuos pantiin NACS-kolonniin (BRL). Kolonni pestiin 5 ml:11a samaa puskuria. Sitoutunut DNA eluoitiin 300 ui:11a joko TE2 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1,0 M NaCl) DNA-fragmenteille, jotka olivat pienempiä kuin 1000 emäsparia, tai TE3 (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 2 M NaCl) suuremmille fragmenteille. Eluoitu DNA konsentroitiin etano-lisaostuksella.

12. DNA-kytkentä; 22 101720

Reaktiot koheesiopäiden kytkemiseksi sisälsivät: 1 ug DNA, 1 x AA-puskuri (katso vaihe 8, edellä), 1 mM ATP ja 20 yksikköä T4 DNA-ligaasia (BRL) 20 ul:ssa lopullista reaktiotilavuut-ta. Kytkeytymisen annettiin tapahtua 16-18 h 150c tai 1-2 h huoneenlämmössä. Blunt-pääkytkennöille reaktiot sisälsivät 1 ug DNA, 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl2i 5 mM DTT, 0,25 mM spermidiiniä, 200 mg BSA, 1 mM heksamiinikobolttikloridia (HCC), 0,5 mM ATP ja 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia (NEB) 20 ui:n reaktiotilavuudessa. Kytkeytymisen annettiin tapahtua 30 min - 1 h huoneenlämmössä.

Bakteeripohjäiset transformointimenetelmät 1. Transformointiin kelpaavien E. coli-solujen valmistus: 200 ml:n viljelmä steriilissä L-liemessä siirrostettiin pienellä silmukallisella E. coli-soluja. Tätä inkuboitiin ravistaen 37°C:ssa kunnes ODgoo oli noin 0,5. Viljelmä sijoitettiin jäihin 10 minuutiksi ja sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 6000 x g 10 min. Solupelletti suspendoitiin uudelleen 100 ml:aan jääkylmää 0,1 M MgCl2, pidettiin jäissä 30-40 min ja sentrifugoitiin jälleen. Pelletti suspendoitiin uudelleen 2 ml:aan jääkylmää 100 mM CaCl2, siirrettiin steriiliin koeputkeen ja inkuboitiin jäissä 24 h. Kelpaavat solut jaettiin samansuuruisiin eriin ja säilytettiin -70°C:ssa.

2. E. colin transformointi:

Erä pakastettuja kelpaavia soluja sulatettiin jäissä. 50 ui:aan soluja lisättiin 0,1-1 ug DNA:ta ja seosta inkuboitiin jäissä 30 min. Putki poistettiin jäistä ja pantiin 42°C:een hauteeseen 2 minuutiksi. L-lientä (1 ml) lisättiin ja trans-formointisekoitusta inkuboitiin ravistaen halutussa lämpötilassa (tavallisesti 30°C tai 37°c) 2 h. Sitten kymmenesosa transformaatiosta pantiin L-liemilevyille, jotka sisälsivät sopivaa antibioottia, ja tarpeen vaatiessa lisättiin XGAL:ia ja IPTG:tä.

23 101720 3. B. subtilis'n DNA-transformoint.it B. subtilis-solut kasvatettiin varhaiseen stationäärivaihee-seen (muutos Klett-yksiköissä <5 % 15 minuutissa). Transfor-moinnissa seurattiin vakiintuneita menetelmiä (Anagnostopou-los et ai., 1981) (viite 8). Solut (0,45 ml) inkuboitiin 1-10 ug:n kanssa DNA:ta 37QC:ssa 80 min ravistaen, ja pantiin sitten TBAB-agarlevyille sopivan antibiootin kanssa.

4. Plasmidi-DNA:n eristys B. subtiliksesta:

Plasmidi-DNA B. subtiliksesta saatiin menetelmällä, joka on samanlainen kuin emäsliuotusmenetelmä, paitsi että pelletoi-dut solut suspendoitiin uudelleen 8 ml:aan liuosta 1.· (50 mM glukoosia, 10 mM EDTAa, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mg/ml ly-sotsyymiä) ja inkuboitiin huoneenlämmössä 30 min. Sitten lisättiin 16 ml liuosta 2 (0,2 N NaOH, 1 % (w/v) SDS) ja inkuboitiin jäissä 10 min. Lopuksi lisättiin 12 ml 3 M kaliumase-taattia (pH 4,8) ja inkuboitiin vielä 20 min jäissä. Liuenneet solut sentrifugoitiin 15 min nopeudella 15.000 rpm Sor-val SS-34-roottorilla. DNA saostettiin lisäämällä sama tilavuus isopropyylialkoholia ja sentrifugoitiin nopeudella 7000 rpm. Pelletti suspendoitiin uudelleen 5 ml:aan 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 1 mM EDTA (TE). Liuos uutettiin fenolilla kerran ja . uutettiin kloroformilla. DNA saostettiin etanolilla ja sus pendoitiin uudelleen 3 ml:aan TE. Tilavuus säädettiin 5,2 ml:ksi lisäämällä 4,2 g CsCl, 400 ui etidiumbromidia 10 mg/ml liuoksena ja TE:tä. Liuos siirrettiin Beckmanin pikasuljetta-vaan polyallomeerisentrifuugiin ja sentrifugoitiin kierrosno-peudella 45.000 rpm Beckmanin vti65-roottorilla 18 h.

Vasta-ainetuotanto, proteiinikemia ja proteiinien elektroforeesi 1. Vasta-aineen valmistus keinotekoisesti syntetisoiduille peptideille: 24 101720

Synteettinen peptidi, jossa oli sekvenssi (GAGAGS)gGAAGY kytkettiin BSArhan käyttäen Kagenin ja Glickin gluteraldehydi-menetelmää (1979). Kytkeytymisastetta seurattiin käyttäen hi-venmääriä radioaktiivista jodioitua synteettistä peptidiä. Peptidikonjugaatteja konsentraatiossa 1 mg/ml täydellisessä Freundin apuaineessa käytettiin immunisoimaan kanit päivänä 0. Eläimet injektoitiin uudelleen antigeenillä Freundin epätäydellisessä apuaineessa päivänä 30 ja tiitteri määritettiin päivänä 60. Positiiviset seerumit havaittiin käyttäen mikro-tiitteri-RIA:ta käyttäen synteettistä peptidiä antigeeninä. Karen and Glick (1979), in Methods of Radioimmunoassay, Jaffe and Berman (eds.), Academic Press, p. 328.

SlpIII-sekvenssiä vastaava 53 aminohapon peptidi valmistettiin Applied Biosystems-peptidisyntetisoijassa. Tämän mole-kyylipainoltaan 3640 olevan aineen saanto oli noin 0,5 grammaa. Peptidi kytkettiin naudan seerumin albumiiniin. Aine lähetettiin Antibodies, Inc.:lle vasta-aineiden valmistamiseksi kaneissa. Saatiin antiseerumit, jotka reagoivat synteettisten peptidien kanssa, joilla oli sekä Sipi- että SlpIII-sekvens-sit. Nämä antiseerumit ovat olleet käyttökelpoisia gly-ala-sekvenssejä sisältävien fuusiopeptidien havaitsemisessa.

Seuraten yllä kuvattua menetelmää syntetisoitiin antigeeni, jolla oli kaava (V-P-G-V-G)q* joka kytkettiin keyhole limpet hemocyaniniin. Sitten valmistettiin edelläkuvatut polyklonaa-liset antiseerumit, jotka sidottiin ELP-peptidiin.

2. Proteiinien polyakryyliamidigeelielektroforeesi:

Suunnilleen 10^ E. coli-solua kasvatusviljelmästä pelletoi-tiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 10.000 x g 5 min. Solu-pelletit suspendoitiin uudelleen 100-500 ui:aan 2X-näytepus-kuria (100 mM Tris-HCl, pH 6,8, 4 % SDS, 10 % B-merkaptoeta-nolia, 60 % glyserolia tai sakkaroosia) ja sonikoitiin 30 sek käyttäen Tekmarin äänihajotinta. Näytteitä keitettiin suunnilleen 5 min ja 20-100 ui soluliuotustuotetta ladattiin SDS-polyakryyliamidigeeliin (7,5-16 % w/v). Geelit 25 1 0 1 7 2 0 valmistettiin seuraten Lemmiin menetelmää (Nature, 227:680-685 (1970)). Geelissä olevat proteiinit värjättiin 2 % Coo-massie brilliant bluella 10 % metanolissa, 7,5 % etikkahapos-sa 1 h ja väri poistettiin 10 % metanolissa, 7,5 % etikkaha-possa yön yli.

3. Geeleissä olevien proteiinien immunotäplitys:

Proteiinielektroforeesin jälkeen yksi sivulasilevyistä poistettiin polyakryyliamidigeelistä. Geelin pinta kostutettiin siirtopuskurilla (25 mM Tris-HCl, 192 raM glysiiniä, 20 % me-tanolia). Pala nitroselluloosapaperia (Sartorius, SM11307) kyllästettiin siirtopuskurilla ja pantiin geelille. Ilmakuplat suodattimen ja geelin välistä poistettiin. Geeli ja nit-roselluloosasuodatin pantiin valmistajan (BioRad) määrittämään siirtoyksikköön. Siirron annettiin tapahtua 200 mA:11a 3-4 h. Sitten nitroselluloosasuodatin poistettiin ja värjättiin Amido-Schwartzilla 3 min (0,05 % Amido black, 45 % de-ionisoitua vettä, 45 % metanolia, 10 % etikkahappoa) ja väri poistettiin Il20:ssa. Suodatinta inkuboitiin ainakin 10 min huoneenlämmössä "BLOTTO":ssa (5 % rasvatonta kuivamaitoa, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 % w/v NaCl, 0,2 % w/v natriumatsi-dia). Suodatin pantiin seerumiin, joka oli sopivasti laimennettu (1:50-1:500) Blottossa (2,5 % rasvatonta kuivamaitoa, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 % NaCl, 0,2 % natriumatsidia) ja sekoitettiin lievästi noin 16 h huoneenlämmössä. Suodatinta pestiin 1 h vaihtaen 5 kertaa TSA:ta (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 0,9 % NaCl, 0,2 % natriumatsidia). Täplä pantiin 15 ml:aan 0,5X BLOTTO-liuosta, joka sisälsi lxlO7 cpm 125i-proteiinia A, ja sekoitettiin kevyesti 2 h huoneenlämmössä. Suodatinta pestiin 2 h vaihtaen TSA:ta vähintään 7 kertaa, huuhdottiin kerran deionisoidulla vedellä ja ilmakuivattiin. Täplä peitettiin Saran-kalvolla ja autoradiografoitiin.

4. Aminohappoanalyysi:

Aminohappokoostumukset määritetään Henricksonin ja Meredithin PTC-derivisointimenetelmällä (1984). Proteiininäytteitä hyd- 26 1 0 1 7 2 0 rolysoitiin 5,7 N vakiokiehuvalla HCI:llä 108°C:ssa 24 tuntia vakuuroissa. PITC:n kanssa reagoimisen jälkeen aminohappojohdannaiset saatiin selville 254 nm:ssä HPLC-käänteisfaasikro-matografiällä käyttäen Hewlett Packard 1090-järjestelmää ja Supelco C18-kolonnia (4,6 mm x 25 cm) lineaarigradientilla 0-50 % asetonitriilin 0,1 M NH40Ac:ssä, pH 6,78, toimiessa liikkuvana pohjana. Henrickson, R.L. and Meredith, S.C.

(1984) Amino Analysis by Reverse Phase High Performance Liquid Chromatography. Anal. Biochem. 137:65-74.

5. Aminohapposekvenssien analyysi: N-terminaalinen aminohapposekvenssi määritettiin automaattisella Edmanin degradaatiolla käyttäen Applied Biosystems Model 470A-kaasufaasiproteiinisekventoijaa. PTH-aminohappo-johdannaiset analysoitiin käänteisfaasi-HPLC:llä käyttäen Hewlett Packard 1090 järjestelmää ja Altex C18 kolonnia (2 mm x 25 cm) kompleksigradienttipuskurijärjestelmällä.

6. Peptidisynteesi:

Synteettiset peptidit valmistettiin kiinteäfaasisynteesillä Applied Biosystems Model 430A Peptide Synthesizerillä käyttäen valmistajan tarjoamaa standardikäyttöistä symmetristä anhydridikemiaa. Kytkeytymissaanto jokaisessa vaiheessa määritettiin Sarin et ai.:n (1981) kvantitatiivisella ninhydrii-nimenetelmällä. Synteettinen peptidi irrotettiin kiinteästä alustasta ja aminohapposuojaryhmät poistettiin käyttäen vedetöntä HF:ää (Stewart and Young, 1984). Epäpuhtaista peptideistä poistettiin suola kromatografialla Sephadex G-50:llä. Sarin, V.K., Kent, S.B.H., Tam, J.P. and Merrifield, R.B. (1981). Anal. Biochem. 237:927-936. Stewart, J.M. and Young, J.D. (1984). Solid Phase Peptide Synthesis, Pierce Chemical Company, Rockford, IL. pp. 85-89.

Synteettiset DNA-menetelmät 1. In vitro-DNA-synteesi: 27 1 0 1 7 2 0 N,N-di-isopropyylifosfqramidiitit, säädetyn huokoiset lasi-kolonnit ja kaikki synteesireagenssit saatiin Applied Biosys-temsiltä, Foster City, California.

Synteettiset oligonukleotidit valmistettiin fosfiittitrieste-rimenetelmällä Applied Biosystems Model 380A DNA-syntetisoi-jalla käyttäen 10-kertaista ylimäärää suojattuja fosforami-diitteja ja 1 umoolia nukleotidia sitoutuneena synteesin alustakolonniin. Synteesiin käytetyt kemialliset menetelmät ovat syntetisoijän käyttöön suositeltuja menetelmiä ja ne on kuvattu (Matteucci, et ai. Journal Amer. Chem. Soc., 103:3185-3319 (1981)). Suojauksen poisto ja oligomeerien loh-kaisu kiinteästä alustasta suoritettiin standardimenetelmien mukaan, kuten on kuvattu julkaisussa McBride et ai.,^Tetrahedron Letters, 24:245-248 (1983). Toistuva synteesisaanto mitattuna poistettujen suojaryhmien optisella tiheydellä Applied Biosystemsin (1984) suosittelemalla tavalla oli suurempi kuin 97,5 %.

Epäpuhdas oligonukleotidiseos puhdistettiin preparatiivisella geelielektroforeesilla, kuten on kuvattu Applied Biosystemsin käytännössä, November 9, 1984 (User Bulletin No. 13). Akryy-liamidigeelin konsentraatio vaihteli 10-20 % riippuen oligo-meerin pituudesta. Puhdistettu oligomeeri identifioitiin UV-varjostuksella, poistettiin geelistä ja uutettiin rouhinta-ja huuhtelumenetelmällä (Smith, Methods in Enzymology, 65:371-379 (1980)).

2. DNA:n sekventointi: DNA-sekvenssit määritettiin seuraavalla menetelmällä. Kiinnostavan alueen sisältävät fragmentit kloonattiin moninkertaisiin kloonauskohtiin M13mpl8 tai M13mpl9 (Maniatis et ai., 1982, and Norrander et ai., 1983). Yksisäikeinen DNA valmistettiin ja eekventoitiin primeerin laajennusmenetelmällä (Sanger et ai♦, 1977, and Biggin et ai., 1983) käyttäen 35S-deoksiadenosiini-5‘-(alfa-tio)trifosfaattia (New England Nuclear) leimauksena. Joissakin tapauksissa käytettiin kään-teiskopioijaentsyymiä (Molecular Genetics) primeerin m 101720 laajentamiseksi käyttäen dideoksi:deoksinukleosiditrifosfaat-tisuhteita, joita ovat käyttäneet Zagursky et ai♦, (Gene Anal. Techn. (1985) 2:89-94). Näissä reaktioissa käytettiin deoksiadenosiinitrifosfaattia leimattuna joko 32P:llä tai 33S:llä. Puristustekotuotteiden ilmaantuminen joissakin G-C-rikkaissa sekvenseissä vältettiin eliminoimalla deoksiguano-siinitrifosfaatti G-reaktiosta ja käyttäen deoksi-inosiini-trifosfaattia (P-L Biochemicals) lopullisena konsentraationa 37,5 uM sen sijaan. Muissa seoksissa dideoksiGTP:n konsent-raatio G-reaktiossa oli 0,5 mM. Kaikki sekvenssit ajettiin 6 tai 8 % polyakryyliamidigeeleillä, joka sisälsivät 8 M ureaa (Sanger et ai. 1978). Sekventoinnissa käytetyt primeerit ostettiin P-L Biochemicalsilta. Tietojen säilytykseen ja analysointiin käytettiin sekä DNAstarin että International Biotechnologies, Inc.:n ohjelmistoja.

3. Kloonatun DNA:n in vitro-mutaatio:

Mutatoitavan sekvenssin sisältävä plasmidi-DNA (1 ug) pilkottiin kahdessa erillisessä reaktiossa. Yksi reaktio sisälsi joko yhden tai kaksi restriktioendonukleaasia, jotka lohkaisevat kohdissa, jotka reunustavat välittömästi kiinnostuksen kohteena olevaa aluetta. Toisessa reaktiossa DNA pilkottiin restriktioendonukleaasilla, joka pilkkoo vain kerran kohdassa, joka on erillään mutatoitavasta sekvenssistä. Ensimmäisessä reaktiossa syntyneet fragmentit erotettiin agaroosigee-lielektroforeesilla ja suuri fragmentti, josta puuttuu muta-toitava sekvenssi, poistettiin ja puhdistettiin. DNA toisesta reaktiosta, suuri DNA-fragmentti ensimmäisestä reaktiosta ja synteettinen, pituudeltaan 20-30 emäksen oligodeoksinukleoti-di, joka sisälsi mutanttisekvenssin, sekoitettiin moolisuh-teessa 1:1:250. Seos denaturoitiin kuumentamalla 100°C:ssa 3 min 25-100 ul:ssa 100 mM NaCl, 6,5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2 ja 1 mM B-merkaptoetanolia. Denaturoitu seos lämpökäsi-teltiin uudelleen alentaen asteittain lämpötilaa seuraavasti: 370c 30 min, 4oC 30 min 3a °°c 10 rain* Reaktioon lisättiin 0,5 mM deoksiribonukleotiditrifosfaatteja, 1 mM ATP, 400 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja 5 yksikköä E. colin 29 101720 DNA-polymeraasin suurta, fragmenttia, ja inkuboitiin l5°C:ssa 12-16 h. Reaktioseos transformoitiin sitten E. coliin ja valikoitiin antibioottiresistenssit kasvustot.

Fermentointiolosuhteet

Fermentori on 15L Chemap, toimintatilavuus 10 1. Viljelyolosuhteet ovat: lämpötila = 30°C, pH = 6,8; pH:n säätöön käytetään 2,5 M NaOH. Kaasutilan paine on alle 10 kPa (0,1 bar). Liuennut happi on säädetty 50 %:ksi. Ilmavirtaus vaihtelee välillä 0,5 1/min - 20 l/min. Sekoitusnopeus vaihtelee välillä 200 - 1500 rpm.

Fermentori siirrostetaan 10 % (v/v) siirrosteella, jota on kasvatettu väliaineessa A 15 tuntia 30°C:ssa sekoittaen.

Väliaine B oli fermentorin väliaine. Lähtötilavuus oli 5 1.

Kun glukoosipitoisuus saavutti arvon 1 %, lisättiin fermento-riin väliaineen B konsentroitu liuos (5x) tarkoituksena pitää glukoosipitoisuus suunnilleen arvossa 1 %. Kun viljelmä saavutti 0D600“arvon 60,0, lämpötila nostettiin 42°C:een 10 minuutiksi ja alennettiin sitten 39°C:een 2,5 tunniksi. Solut korjattiin sitten sentrifugoimalla ja pakastettiin -70°C:ssa käyttöön asti.

30 101720

Taulukko 1 Väliaine A: LB-väliaine

Aineosa g/l

NaCl 10 tryptoni 10 hiivauute 5 kanamysiini 5x1O”3

Väliaine B

Aineosa g/1 NH„C1 4.5 KHgPOi, 0.76

MgSOjj ·7Η20 0.18 K2s°i| 0.09

CaCl2 24x10"3

FeSOjj^HgO 7.6x10“3 TE 0.5 ml kasaminohapot 25 hiivauute 5 glukoosi 20 kanamysiini 5x10“3 31 101720

Esimerkki 2

Sipi-geenin kokoaminen ja ilmentyminen 1. Yhteenveto kaaviosta Sipi-geenin kokoamiseksi 18 emäsparin DNA-sekvenssi, joka koodittaa useimmin toistuvaa oligopeptidiä Bombyx morin tuottamassa silkkifibroiiniprote-iinissa ^Lucas, F. and K.M. Rudall (1986) Extracellular Fibrous Proteins: The Silks, p. 475-558, Comprehensive Biochemistry, vol. 26, part B., M. Florkin and F.H. Stotz (eds.) Elsevier, AmsterdamJ , syntetisoitiin in vitro. Kaksi yksinkertaista säiettä syntetisoitiin, lämpökäsiteltiin yhteen ja saadut kaksisäikeiset segmentit multimerisoitiin pää .häntään konkatameerien saamiseksi, joissa oli aina 13 toistoa ja ylikin. Rakennegeeni silkki I:lle, jonka kanssa oli tarkoituksena työskennellä, sisälsi 13 toistoa, jotka koodittivat oligopeptidiä gagags, jossa g = glysiini, a = alaniini ja s = se-riini. Tähän rakennegeeniin viitataan termillä "monomeeri". Konstruoitiin "dimeeriset, trimeeriset, tetrameeriset, penta-meeriset ja heksameeriset" Sipi-geenit, jotka sisälsivät 26 (SlpI-2), 39 (SlpI-3), 52 (Slp-I-4), 65 (SlpI-5) ja 78 (Sipi-6) toistoa. Kunkin monomeeriyksikön välillä on lyhyt välisekvenssi. Kokoonpanoa kuvataan seuraavasti: •

Toistuva DNA-sekvenssi 5·-$ CTOCGCOCOCACCAAOT

CGCCCGCGTCCTTCACC A-5* "Monomeeri * ^ 1 ^ i S ] l, < L, 1 L, ... -^ΤΊ,

Multimeerit I I

Ι...Λ { le.,n f 2. "Monomeerisen" Slpl-rakennegeenin kokoonpano: 32 101720

Edelläesitetyt kaksi kaksoissäiettä syntetisoitiin kuten edellä on kuvattu. Säikeet puhdistettiin erikseen geelielekt-roforeesilla, fosforyloitiin käyttäen T4 polynukleotidikinaa-sia ja sekoitettiin sitten yhteen ja annettiin yhdistyä. Tästä syntyi kaksisäikeiset segmentit, jotka spontaanisti asettuivat riviin pää häntään pitkiksi konkatameereiksi. Fosfodi-esterisidokset segmenttien välillä muodostettiin T4 DNA-li-gaasilla. Reaktio pysäytettiin sijoittamalla terminaaliset koheesiopäät käyttäen DNA-polymeraasi Isn Klenowin fragmenttia. Blunt-päinen toistuva DNA kytkettiin sitten Hindi REN-kohtaan plasmidivektorissa pUC12 (Veiera, et ai., Gene 19:259-268 (1982)). Kytketty DNA transformoitiin E. o’oliin HB101 ja transfomantit valikoitiin niiden kyvyn suhteen kasvaa ampisilliinin läsnäollessa. Potentiaalisten kloonien DNA analysoitiin; koko ja orientoituminen REN-pilkkomisella ja geelielektroforeesilla. DNA-sekvensseistä määritettiin iso-laatit, joissa suuret insertit olivat sopivasti orientoituneet. Myöhempää multimerisointia varten valikoitu "monomee-ri"-klooni sisälsi 13 toistoa, jotka koodittivat oligopepti-diä agagsg, ja sille annettiin nimi pSY708. DNA-sekvenssi, deduktiivinen aminohapposekvenssi ja SlpI-insertin REN-kohdat ja pSY708:n reuna-alueet on esitetty taulukossa 2.

33 1 0 1 7 2 0

Taulukko 2

H FAS

r s v h

H TAA

3 111 « « 1 · AACCTTCCCCTCCACCTCAC-CSCmwCwww-wACwAAw iCu iCwauwwdwACwAAu. ug · ----...............................---------.---------.----- 60

TTCCAACCCGACCTCCAGTCCCCCCCCCCCCGTCCTTCACCACGCCCGCCTCCTTCACCA

kl(l«vtri(4(sct(4<i( ----. —-------.----1----.------------1-------1----

CCGGGCGCACGAAGTGGTGCCGGCCCACCAAGTGGTGCGGGCGCAGGAAGTGGTGCGGGC

----.— ---. ----♦———1 120

CGCCCGCGTCCTTCACCACGCCCGCGTCCTTCACCACGCCCGCGTCCTTCACCACGCCCC

t c A < S C4(i(s|«CACiCAI

---· r-—-------·1——. —----·-------— GCACGAAGTGGTGCCGGCGCAGGAAGTCCTCCGGGCGCACGAAGTGGT6CGGGCGCAGGA ^ * 1

X B A S X

B A T a c

ahaa X

1111 1

• t · · I

GCCGGCGCAGCAACTGGCACTCTAGAGGATCCCCCCGCGACCTCCAATTC

CgCCCCCSTCCrrCACCCTCACATCTCCTACCeCCCCSCTCSACCTTAAC

* ‘ 1 f 1 1 U · 4 1 1 1 · 1 · « 34 1 0 1 7 2 0 3. Ilmentymisvektorin pgY701 konstruointi:

Plasmidi pSP65 (10 ug, Boehringer Mannheim) pilkottiin Aatu REN:llä, uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. DNA suspendoitiin uudelleen 10 ui:aan H2O. Puolet tästä DNA:sta pilkottiin endonukleaasi III:11a seuraavassa seoksessa: 5 ug DNA, 10 ui 10X eksonukleaasi Ill-puskuria (600 mM Tris-HCl/ pH 8,0, 6,6 mM MgCl2, 10 mM β-merkaptoetanolia) ja 9 yksikköä eksonukleaasi III kokonaistilavuuden ollessa 200 ui. 20 ui:n näytteet otettiin aikoina 0, 1, 2,5, 5 ja 7,5 min ja laimennettiin välittömästi 100 ui:aan seuraavaa puskuria (30 mM natriumasetaattia, pH 4,5, 0,25 M NaCl, 1 mM ZnS04), joka sisälsi 5 ug tRNA ja 36 yksikköä Sl-nukleaasia. Inkubointi tapahtui 30°C:ssa 45 minuuttia ja sitten reaktio päätettiin lisäämällä 15 ui pysäytyspuskuria (0,5 M Tris, pH 9,0, 125 mM EDTA, 1 % w/v SDS, 200 ug/ml tRNA). Näytteet uutettiin fenolilla ja saostettiin etanolilla. Uudelleen suspendoitu DNA pilkottiin Smal REN:llä ja elektroforesoitiin 1 % matalasula-mispisteisen agaroosigeelin läpi. β-laktamaasigeenin sisältämää DNA-fragmenttia vastaava geelivyöhyke, plasmidialkuperä ja β-galaktosidaasipromoottori erotettiin geelistä ja sulatettiin 65°C:ssa. Lisättiin yksi tilavuus H2O. Kussakin näytteessä (eri ajat) oleva DNA saatettiin uudelleen renkaaksi kytkemällä agaroosin läsnäollessa. Reaktio sisälsi 8 ui sulatettua geeliä, 2 ui kytkentäpuskuria (100 mM Tris-HCl, pH

7,5, 50 mM MgCl2, 50 mM DTT, 1 mM ATP), 10 yksikköä T4 DNA-ligaasia ja inkuboitiin 15°C:ssa 3 h. Käyttökelpoiset JM101-solut transformoitiin kytketyllä DNA:11a ja transformantit valikoitiin kasvattamalla L-liemilevyillä, jotka sisälsivät ampisilliinia (40 ug/ml). Plasmidi-DNA valmistettiin neljästä transformantieta. DNA pilkottiin BamHI REN:llä, leimattiin 32p-dGTP:llä käyttäen DNA Polymeraasi I:n Klenowin fragmenttia, pilkottiin Pvu I:llä ja sitten pienin fragmentti geeli-puhdistettiin. Yhdestä transformantieta peräisin oleva fragmentti sekventoitiin käyttäen Maxamin ja Gilbertin menetelmää. Fragmentit muista kolmesta plasmidista pilkottiin edel-• leen Taqlrllä ja elektroforesoitiin samalla geelillä. Sekven- toidulla plasmidilla oli fuusio moninkertaisten kloonautumis- 35 101720 kohtien välillä ja β-laktamaasin N-terminaali-ATG:n yläpuolella. Kahdesta muusta plasmidista saadun BamHI-Taql-fragmentin koko osoitti fuusioitumisen moninkertaisten kloonautumis-kohtien ja β-laktamaasigeenin 4. aminohapon välillä. Alla on annettu DNA ja vastaavat aminohapposekvenssit vuorottelevan β-laktamaasin N-terminaalialueesta, pitkin REN-kohtien ren-gaskarttaa pSY701:lle (katso kuva 1). Kuvan 1 aminohapposekvenssi on met-thr-met-ile-thr-pro-ser-leu-gly-cys-arg-ser-thr-leu-glu-asp-pro-his-phe-arg-val-ala-leu-ile-pro-phe-phe-ala-ala-phe-cys-leu-pro-val-phe-ala-his.

4. pSY708;sta peräisin olevan "monomeeri"-SlpI:n insertoimi-nen pSY701;een:

Plasmidi pSY708 pilkottiin Hindlll;11a, koheesiopäät sijoitettiin käyttäen DNA polymeraasi I:n Klenowin fragmenttia ja pilkottiin sitten BamHI;11a. Plasmidi pSY701 pilkottiin Xbal:llä, sijoitettiin kuten edellä ja pilkottiin sitten BamHI:11a. DNA-fragmentti pSY708:sta ja pSY701:n runko puhdistettiin sitten elektroforeesilla matalasulamispisteisen agaroosigeelin läpi ja puhdistettiin NACS (BRL) kolonneilla. Sopivat fragmentit sekoitettiin, kytkettiin, ja transformoitiin sitten E. coliin JM109. Transformoidut solut valikoitiin kasvattamalla L-levyilla, jotka sisälsivät ampisilliinia (40 ' mg/ml), IPTG (5xl0-4 M) ja XGAL (20 mg/ml). Transformantit analysoitiin plasmidisisällön suhteen ja yksi (pSY756) valikoitiin lisätutkimuksia varten, koska se sisälsi monomeeri-SlpI-l-sekvenssien insertin sopivasti orientoituneena, määritettynä REN-kohtien kartoituksella. Vaikka koko DNA-sekvens-siä ei määritetty pSY756:lle, liitokset insertin ja vektorin välillä vahvistettiin oikeiksi restriktiosekvensseiksi Xbal:-lie, yläpuolella, ja BamHI:lie, alapuolella.

5. pSY756:n Sipi-geenin multimerisointi:

Plasmidi pSY708 pilkottiin REN Smalsllä ja DNA-fragmentti, joka sisälsi koodattavan sekvenssin polypeptidille arg(ala- 13TLEDP) 13thr-leu-glu-asp-pro (R(AGAGSG) gly-ala-gly-ser-gly) puhdistettiin kuten kohdassa 4 edellä.

36 101720

Plasraidi pSY756 pilkottiin Smalsllä deproteinisoitiin ja kytkettiin sitten pSY708:sta saadun puhdistetun DNA-fragmentin kanssa. E. coli JM109:n transformantit valikoitiin väliaineeseen, joka sisälsi ampisilliiniä. Kloonien havaittiin sisältävän 2 yksikköä (dimeeri pSY882), 3 yksikköä (trimeeri pSY883), ja 4 yksikköä (tetrameeri pSY915) alkuperäistä kloonin pSY708 monomeerisekvenssiä. Samoin konstruoitiin myös pentameerit ja heksameerit. Kaikki nämä plasmidit ovat geneettisesti stabiileita ja tuottavat gly-ala-peptidiä yhdistelmänä β-laktamaasin kanssa.

6. Sipi-geenin fuusion ilmentyminen p-laktamaasiproteiiniin:

Sipi-peptidin E. coli-solujen synteesi fuusioproteiinina β-laktamaasin kanssa havaittiin immunoblotting-analyysillä (Western). Anti-"Slp"-vasta-aineet nostettiin synteettistä silkkipeptidiä vastaan. Fuusiot β-laktamaasin ja Sipi:n välillä havaittiin myös vasta-aineilla, jotka oli nostettu E. coli-p-laktamaasia vastaan. Kuten kuvassa 2 on esitetty, tämä vasta-aine reagoi Sipi:n dimeerien ja trimeerien kanssa, jotka ovat fuusioituneet E. coli-p-laktamaasiin♦ Slpl-insert-ti kehittää signaalisekvenssin viidennen aminohapon tälle entsyymille, β-laktamaasin vasta-aine (kuva 2A) havaitsee sekä tuottamattomat fuusioproteiinit että tuotetun valmiin entsyymin, joka näkyy pääantigeenivyöhykkeenä tässä kuvassa, noin kohdassa 28 kD. Kaikkien Slp:n sisältävien polypeptidien liikkuvuudet ovat tavallisuudesta poikkeavan hitaat ja proteiinit eivät ole niin suuria kuin miltä ne näyttävät geeleissä .

Anti-Slp-vasta-aine on myös käyttökelpoinen havaittaessa näitä fuusiotuotteita. Vyöhykkeet 2-5 kuvassa 2B esittävät 4 erillistä kloonia, jotka sisältävät Slpl:n dimeerifuusiot β-laktamaasin kanssa, kun taas vyöhykkeet 6 ja 7 ovat kahdesta trimeerifuusion sisältävästä kloonista. Kuten voidaan nähdä, trimeerin antigeenisuus on huomattavasti suurempi kuin dimee-rin. Aikaisemmista tutkimuksista tiedetään, että fuusioprote-iineja, jotka sisältävät vain Sipi:n monomeerin, ei lainkaan havaita tällä anti-Slp-vasta-aineella. Trimeeripeptidin li 37 101720 sääntynyt antigeenisyys. mahdollistaa sen havaitsemisen tuotettuna fuusiona p-laktamaasin signaalipeptidin kanssa. Tuotettu muoto näkyy paikassa noin 33 kD kuvan 2B vyöhykkeissä 6 ja 7. Normaalisti tuotetun valmiin β-laktamaasientsyymin (havaittu β-laktamaasivasta-aineella) sekä SlpI-3-trimeerin ja β-laktamaasin signaalipeptidin välistä fuusiota vastaavan peptidin (havaittu gly-ala-vasta-aineella) esiintyminen ilmaisee, että huolimatta Sipi-sekvenssien insertiosta signaa-lisekvenssiin, normaali proteolyyttinen entsyymin tuottaminen tapahtuu E. colissa.

7.a. Sipi-geenin ilmentyminen fuusioitumalla T7-geeneihin:

Sipi-sekvenssi on myös ilmentynyt fuusioproteiinina sekä geenin 9 että geenin 10 proteiinien kanssa bakteriofaagista T7 E. colissa. Konstruointi on kaaviomaisesti esitetty kuvassa 3. Plasmidi pSY915 (sisältäen SlpI-4-tetrameerin) pilkottiin täydentämistä varten REN Sali:llä ja osittain BamHI:11a.

DNA-fragmentit, jotka sisälsivät SlpI-4-tetrameerin, puhdistettiin ja kloonattiin sitten plasmidiin pSY114 (pG2 Promega Biotechiltä), joka oli pilkottu RENeillä Sali ja BamHI. Tästä välituoteplasmidista erotettiin Slpl:n tetrameeri-insertti RENeillä Accl ja EcoRI. Tämä fragmentti kloonattiin sitten pSY633:een (pBR322, joka sisältää täydellisen T7 geeni 9 sekvenssin; pAR441 Studier et al.:lta (1986)), joka oli pilkottu EcoRI:11a ja AsuII:11a. Saadussa plasmidissa SlpI-tetrameeri fuusioidaan geenin 9 translaation lukuvaiheistukseen lähelle geenin 9 C-päätä. Tätä plasmidia käytettiin sitten transformoimaan coli-kanta 0-48 (Studier et ai.:n, 1986, kanta HMS174 (A.DE3), joka sisältää T7 RNA polymeraasigeenin inser-toituneena kromosomiin, jota kontrolloi transkriptionaalises-ti IPTG-indusoitava β-galaktosidaasipromoottori. Tässä konfi-guraatiossa SlpI-4-sekvenssin ilmentyminen riippuu T7 RNA-po-lymeraasin tuotannosta, jota itsessään kontrolloi IPTG-indu-soitava β-galaktosidaasipromoottori. Kuten kuvassa 4B ja 4C on esitetty, kun nämä solut indusoidaan IPTG:llä, geenin 9/SlpI-4-fuusiogeenin proteiinituote syntetisoidaan ja havaitaan vasta-aineella synteettiselle Slp-peptidille. Fuusiotuo-te kulkee geelissä kuin se olisi kooltaan 82 kD. Odotettu 38 1 0 1 7 2 0 koko on vain 65 kD. Epätavallinen liikkuvuus on tunnusomaista epätavalliselle aminohappokoostumukselle (paljon glysiiniä ja alaniinia) ja nähdään kaikissa Slp-pitoisissa tuotteissa.

Samalla tavalla plasmidi pSY638 (Studierin pAR2113), joka sisältää promoottorialueen ja T7 geeni 10 proteiinin ensimmäiset 13 aminohappoa, pilkottiin REN BamHI:11a, sijoitettiin DNA polymeraasin Klenowin fragmentilla ja sitten pilkottiin REN EcoRI:11a. Tähän linearisoituun plasmidiin kloonattiin pSY633:n AsuiI-EcoRI-fragmentti, joka sisältää SlpI-4-tetra-meerin. Tämä kytkentä synnyttää silkkitetrameerin vaiheistuksessa olevan fuusion ja sen jälkeen T7 geeni 10:n 13. aminohapon. Jälkimmäistä fuusiotuotetta voidaan käyttää kehräämiseen ilman lisätoimenpiteitä, koska N-terminaaliset 1*3 aminohappoa ovat vain pieni osa suuresta Sipi-proteiinista. Vaikka fuusiotuote on noin 30 kD kooltaan, sillä on epätavallinen liikkuvuus ja se kulkee kuin se olisi suurempi, 50 kD. Tämä on esitetty kuvassa 4A.

Plasmideita pG9/sipI-4 ja pGlO/slpI-4 parannettiin edelleen insertoimalla kanamysiiniresistenssigeeni β-laktamaasiin orientoituneena vastakkaisesti T7-ilmentymisjärjestelmään nähden. Niinpä mikä tahnsa T7-järjestelmän alhainen ilmentyminen ei johda kohonneeseeen β-laktamaasiaktiivisuuteen. Tällainen aktiivisuus eliminoi väliaineessa olevan ampisilliinin, joka oli lisätty plasmidin säilyvyyden valikoimiseksi. Kun ampi-silliini oli kulunut loppuun, plasmidit olivat kadonneet viljelmästä. Kanamysiiniresistenssigeeni kiertää tämän ongelman ja edustaa merkittävää parannusta T7-ilmentymisjärjestelmässä, erityisesti suurimittakaavaisissa viljelmissä. Kanamysiiniresistenssigeeni (lähtöisin Tn903:sta) eristettiin plasmi-dista pUC4K (Veira, J. and J. Messing, 1982. Gene. 19:259-268) ja oli Hindi-fragmentti ♦ 7.b. Slpl-4:n fermentointi ja puhdistus: E♦ coli-kanta 0-48, jossa oli mukana pSY997, kasvatettiin C:ssa käyttäen Chemap tai Braun fermentoria 10 l:ssa LB:ta 370 39 101720 OD-arvoon (Klettin yksiköt) 300 (3xl09 solua/ml). T7-järjestelmä indusoitiin sitten lisäämällä 3,5 mM IPTG:tä. 150 minuutin kuluttua solut konsentroitiin lOx käyttäen Millipore suodatinyksikköä (Pellicon kasettijärjestelmä, 100.000 mole-kyylipainon leikkaava suodatin). Solususpensio pakastettiin sitten -70°C:ssa käyttämiseen asti.

Solususpensio sulatettiin vesihauteessa 42QC:ssa ja liuotettiin French-puristimessa ja liuotustuote lingottiin kiihtyvyydellä 125.000 x g 1 tunti 25°C:ssa. Kirkastunut superna-tantti käsiteltiin DNAaasilla (250 um/ml) 15 min huoneenlämmössä, suodatettiin sitten 0,45 um:n steriilin suodattimen läpi. Suodoksen tilavuus mitattiin ja se inkuboitiin jäissä hitaasti sekoittaen, sitten kutakin ml kohti suodosta lisättiin 231 mg ammoniumsulfaattia 45 min kuluessa. pH:n neutra-loimiseksi lisättiin yksi ml NaOH jokaista 10 g kohti ammoniumsulfaattia. 2 tunnin jatkuvan sekoituksen jälkeen seos lingottiin kiihtyvyydellä 9.000 x g 10 min. Pelletti suspen-doitiin uudelleen 1/10 alkuperäisestä suodostilavuudelsta käyttäen tislattua vettä. Sentrifugointi ja uudelleen suspendoiminen toistettiin kolme kertaa. Pelletti suspendoitiin uudelleen 1/10 alkuperäisestä suodostilavuudesta tislattuun veteen. Näytteet analysoitiin proteiinikonsentraation, aminohappokoostumuksen ja proteiinisekvenssin suhteen standardime-·_ netelmillä. Tämä on yksi monista mentelmistä tuotteen saami seksi. Tämä menetelmä johtaa SlpI-4-tuotteeseen, joka on enemmän kuin 90 % puhdas. Aminohappokoostumus on melkein kokonaan gly, ala ja ser, kuten odotettua, ja N-terminaalinen aminohapposekvenssi on geenin 10 ohjaajan.

8. T7 RNA-polymeraasigeenin kontrolloitu ilmentyminen Bacillus subtiliksessa: T7 RNA polymeraasigeenin (T7 geeni 1, T7 nukleotidit 3128-5845) koodittava sekvenssi plasmidista pSY558 (Studier et al.jn pAR1151, 1986) modifioitiin kloonatun DNA:n in vitro-mutaatiolla. Tunnistussekvenssi insertoitiin restriktioendo-nukleaasiin Ndel kohdassa 3171. Käyttäen 40 101720 oligodeoksinukleotidia,, joka syntetisoitiin aikaisemmin kuvatulla tavalla, T7 geenin 1 sekvenssi vaihdettiin sen luonnollisesta sekvenssistä TAAATG modifioituun sekvenssiin CATATG.

Samoin yläpuolelle suuntautuva säätelysekvenssi Bacillus subtilis geenistä spoVG, joka on saatu plasmidista pCB1291 (Rosenblum, et ai., J. Bacteriology, 148:341-351 (1981)), modifioitiin in vitro-mutaatiolla kohdassa 85 (Johnson et ai.. Nature, 302:800-804 (1983)) siten että se myös käsittää Ndel-lohkaisukohdan. Geenin psoVG yläpuolelle suuntautuvat säätelysekvenssit kytkettiin sitten T7 RNA polymeraasigeenin koodattavan sekvenssin kanssa näiden uusien Ndel-lohkaisukoh-tien välityksellä. E. coli HB101:n transformaation jälkeen yksittäisten ampisilliiniresistenttien eristeiden plasmidipi-toisuus tarkistettiin restriktiokartoituksella. Oikea konstruktio nimettiin pSY649:ksi.

Plasmidi-DNA, joka sisälsi spoVG:T7 RNA polymeraasifuusiogee-nin (pSY649), modifioitiin edelleen sellaiseksi, että se sisälsi kloramfenikoliresistenssigeenin, joka toimii B. subtiliksessa. Ensin eristettiin Ndel-Sall-fragmentti, joka oli noin 1200 emäsparin kokoinen, plasmidista pGR71-P43 (Goldfarb, et al·., Nature, 293:309-311 (1981)). Tässä fragmentissa on B. subtiliksen P43-promoottori ja vierekkäinen kloramfenikolin asetyylitransferaasigeeni Tn9:stä. Kun kaikki koheesiopäät oli sijoitettu käyttäen Klenowin DNA-polymeraa-sireaktiota, tämä fragmentti insertoitiin Xbal-kohtaan pUC13:n moninkertaisessa kloonauskohdassa (Veiera et ai.,

Gene, 19:259-268 (1982)). Ampisilliini- ja kloramfenikolire-sistentit transformantit valikoitiin lisäkäyttöä varten. Oikea plasmidikonstruktio nimettiin pSY630:ksi. Smal-Hindi-endonukleaasilohkaisufragmentti plasmidista pSY630, joka sisältää P43-promoottorisekvenssiin yhdistyneen kloramfenikoli-asetyylitransferaasigeenin, geelipuhdistettiin ja kytkettiin blunt-päiden välityksellä plasmidin pSY649 PvuI-kohtaan, joka oli ensin käsitelty T4 DNA-polymeraasilla. Saatu plasmidi, pSY856, transformoitiin sitten B. subtilis 1168:aan. Koska « 101720 plasmidi pSY856 ei pysty replikoituinaan itsenäisesti B. subtiliksessa, stabiilien transformanttien, jotka ovat kloramfenikolille resistenttejä, täytyy olla peräisin plasmi-din integroitumisesta subtilis-kromosomiin (Ferrari et a.l., J. Bacteriology, 154:1513-1515 (1983)). Integroitumis-tapahtuma, jota helpotti homologinen rekombinaatio, tapahtui todennäköisimmin joko psoVG- tai P43-paikoissa bakteerikromo-somia (pSY856 sisältää DNA-sekvenssit, jotka ovat homologisia B. subtilis-kromosomille vain näissä kahdessa kohdassa). Saatua kantaa, "BIPoL", kasvatettiin sekä kloramfenikolin läsnäollessa että ilman sitä tarkoituksena määrittää valikoitavissa olevan markkerin stabiilisuus. T7 polymeraasin ilmentyminen havaittiin, eikä tällä ollut mitään ilmeistä vaikutusta tämän kannan kasvuun tai elinvoimaisuuteen.

9.a. Plasmidin kantaman kohdeqeenin (kanamysiiniresistenssi) ilmentyminen B. subtilis-kannassa BIPoL:

Staphylococcus aureus-plasmidia pUBHO (Lacey et ai., J.

Med. Microbiology, 7:285-297, 1974), joka sisältää kanamysii-niantibioottiresistenssiä koodattavan geenin, käytettiin tutkimaan kasvusäädellyn, kannasta BIPoL peräisin olevan spoVG:T7 RNA polymeraasigeenin ilmentymistä. EcoRI- BamHI-fragmentti faagista T7 DNA (asemat 21.402-22.858) joka sisälsi T7 geenin 9 promoottorisekvenssin, puhdistettiin plasmi-dista pAR441 (Studier et ai., 1986). Tämä DNA-fragmentti kytkettiin pUB110:aan EcoRI- ja BamHI-restriktioendonukleaasi-kohtien väliin. Saatu plasmidi, pSY952, sisältää T7-spesifi-sen promoottorin samoin orientoituneena kuin kanamysiinire-sistenssigeeni. Plasmidi pSY952 transformoitiin B. subtilis 1168:aan ja BIPoL:ään ja nämä kannat analysoitiin plasmidista saadun kanamysiiniresistenssigeenin koodittaman polypeptidin ilmentymisen suhteen. Havaittiin suunnilleen 109 solua kasvu-viljelmistä 1168, 1168, joka sisälsi pUB110:n, 1168, joka sisälsi pSY952:n, BIPoL, BIPoL, joka sisälsi pUB110:n, ja BIPoL, joka sisälsi pSY952:n, useita kertoja kasvun ja itiön-muodostussyklin aikana. Proteiinit näissä solunäytteissä käsiteltiin ja analysoitiin polyakryyliamidigeelielektroforee-silla.

42 1 0 1 7 2 0

Koska transkriptionopeus spoVG-promoottorista nousee soluti-heyden funktiona ja saavuttaa maksimin varhaisen itiönmuo-dostuksen aikana, kohdeproteiinin kiihtynyt akkumuloituminen on odotettavissa BIPoL-kannassa, joka sisältää pSY952:n, kasvun aikana viljelmän itiönmuodostuksen alkaessa. Tulokset osoittavat, että proteiinin, jonka molekyylipaino on 34 kilo-daltonia, määrä lisääntyy viljelmän lähestyessä ja saavuttaessa stationäärivaiheen. Proteiinin koko on sopusoinnussa kanamysiiniresistenssigeenituotteen (Sadaie et ai., J. Bacteriology, 141:1178-1182 (1980)) kanssa, jota kooditettiin pSY952:ssa. Tämä proteiini ei ole läsnä BlPoL:ssä tai 1168:ssa, joka sisältää pSY952:n, josta puuttuu spoVG-sääde1-ty T7 RNA polymeraasigeeni, tai BlPoL:ssä, joka sisältää pUB110:n, josta puuttuu T7-promoottorisekvenssi. Kohdeproteiinin maksimaalinen kasaantumismäärä pSY952:n sisältämässä BlPoL:ssa 24 tunnin kasvun jälkeen oli 20 % kokonaissolupro-teiinista määritettynä densitometrisesti.

9.b. Sipi-4:n ilmentyminen B. subtiliksessa:

Plasmidi pGlOSlpI pilkottiin EcoRI REN:llä. Koheesiopäiden sijoittamisen jälkeen käyttäen Klenowin DNA-polymeraasireak-tiota DNA pilkottiin Bglll RENtllä. Plasmidi pSY662 pilkottiin Smal ja BamHI RENreillä. Kaksi plasmidia puhdistettiin ; sitten elektroforeesilla alhaalla sulavan agaroosigeelin läpi ja puhdistettiin NACS (BRL) kolonneilla. pGlOSlpI:n DNA-fragmentti kytkettiin pSY662:n runkoon ja transformoitiin E. coliin, joka sisälsi ampisilliiniä (40 ug/ml). Transfor-mantit analysoitiin plasmidisisällön suhteen ja yksi (pSY662/G10/SlpI-4) valikoitiin lisätutkimuksia varten.

B. subtilis BIPoLm kelpaavat solut transformoitiin pSY662/G10/sipI-4:llä ja inkuboitiin 37°C:ssa ravistaen 90 min. Transformaatioseos laimennettiin sitten 1:100 tuoreeseen LB:hen, joka sisälsi 10 ug/ml tetrasykliiniä ja inkuboitiin 37°C:ssa ravistaen. Näytteet otettiin ja yhtä suuret lukumäärät soluja liuotettiin ja ladattiin geeliin erotettavaksi 43 1 0 1 7 2 0 SDS-PA6E:11a. Immunoblot-analyysi suoritettiin käyttäen anti-Slp-vasta-aineita havaitsemaan geenin 10/SlpI-4 fuusioprote-iinin synteesi.

SlpI-4-polypeptidin ilmentyminen B. subtiliksessa havaittiin sen seerumireaktiivisuudesta anti-Slp-vasta-aineen kanssa, sen jälkeen kun soluproteiinit oli siirretty polyakryyliami-digeelistä nitroselluloosasuodattimelle. Todettiin, että see-rumireaktiivinen proteiini oli SlpI-4-geenin tuote, joka saatiin käsittelemällä täydellisesti soluproteiineja CNBrrllä. Tämän pitäisi lohkaista metioniinijäännösten jälkeen, mutta koska SlpI-4 puuttuu, jää metioniini koskemattomaksi. CNBr-käsittely eliminoi enemmän kuin 98 % proteiineista, jotka värjäytyivät Coomassie blue-värillä. Ja kuten oli odotettua proteiinille, josta metioniini puuttui, SlpI-4 jäi koskemattomaksi ja reagoi vielä anti-Slp-seerumin kanssa.

Esimerkki 3

SipiII-geenin kokoonpano ja ilmentyminen 1. Yhteenveto kaaviosta SlpIII-geenin kokoamiseksi:

Synteettinen SlpIII-geeni koodittaa proteiinia, joka on samanlainen kuin Sipi-geeni ja kidealue kuin silkkimadon,

Bombyx morin, valmistaman sikkifibroiiniproteiinin. SlpIII muistuttaa lähemmin silkkifibroiinimolekyyliä, koska se sisältää tyrosiini-aminohapon säännöllisin välein (noin 50 jäännöstä), kun taas Slpl:n multimeerit eivät sisällä. SlpIII-geeni koottiin pienehköistä osista. Ensin syntetisoitiin kemiallisesti kolme kaksisäikeistä DNA:n osaa, jotka olivat pituudeltaan noin 60 emäsparia. Kukin osa kloonattiin insertoimalla bakteriofaagiin M13 ja DNA-sekvenssi vahvistettiin. Nämä osat poistettiin sitten vektorista ja kytkettiin yhteen tietyssä järjestyksessä. Tätä noin 180 emäsparin kytkentää nimitetään SlpIII-"monomeeriksi". "Monomeerit" kytket-- tiin sitten tietyssä järjestyksessä, jolloin saatiin SlpIII:n dimeerit, trimeerit, tetrameerit, jne. Multimeerit 44 101720 kloonattiin sitten joko. suoraan plasmidin ilraentymisvektoreihin SlpIII-proteiinin havaitsemiseksi tai alunperin lisäysplasmidiin. SlpIII DNA:n insertoiminen lisäplasmidiin mahdollistaa geenin lisämanipulaation ja sitä kuvataan enemmän jäljessä. Kokoonpanokaaviota kuvataan seuraavasti;

Kaksisäikeisten DNA-osien synteesi —

Osa 1 - S' ' i • ......... «Τΐΐ ^

Osa 2 = S ~Lt,,,...,.,11..

Osa 3 = . -

"Monomeerin" kokoonpano — H ^ ^ —-I

Multimerisointi — 123 ^ 123 i - S

DNA ja vastaavat aminohapposekvenssit SlpIII-geenin kolmesta osasta on esitetty taulukossa 3.

101720 45 JS S mm _ _

ä S SS

«1 <« - S „ a «r 5 s« • «Κ·».·Ι·ϋ|· S U a «* u u 52 - *-.·«.-« s ta u «· w» S S — S S « ia u “ “ · 32« 15" 53« “ u * *»*-»« e u·'

u ia « _ SS

a a « s a „ Zz.m ss “ä· ^ ^ <rt IA u ** w ^ u W *· (j m te u sa,. as a-*· SS. =3.- »H- 23. 32. “®- ^ 3s« δδο *2" ° as «s 22« _*: ta w te ΐ u )· e, — r3 22« S S 8ö* jp ss «-» ta a ~ *" 3ä- as« 3Ϊ" *«- ss.·· 22- 25« S S 88« 33. 53« ϋ?“ 53. 23. “f.

as. 35« rH“ tit· S“« *" — «« ·~ * a s a s« S - ' »s· ^ w ^ «»«#«··· ^ • «a··. Jtww Λ a e » » 8 ^ w»« 46 101720

Kaksisäikeinen DNA-sekyenssi esitetään 5'-3'-suuntaan. Aminohapot (g =* glysiini, a = alaniini, s = seriini, y = tyrosii-ni), joita sekvenssi koodittaa, on esitetty välittömästi kunkin osan alapuolella. Tunnistussekvenssit lohkaisulle rest-riktioendonukleaaseilla on esitetty kunkin osan yläpuolella.

Ylläolevat kuusi yksittäistä säiettä syntetisoitiin. Synteesin jälkeen DNA-säikeet puhdistettiin ja homologiset säikeet lämpökäsiteltiin. Noin 1 ui (0,5 ug) kutakin säiettä sekoitettiin 2 ui:n kanssa 10X AA (kuvaus) puskuria ja 16 ui:n kanssa steriloitua deionisoitua H2O 1«5 ml:n polypropyleeni-sessä Eppendorf-putkessa. Putki pantiin kiehuvaan vesihauteeseen (500 ml 1 litran keittimessä) 10 minuutiksi ja sitten keitin poistettiin kuumalta levyltä ja annettiin jäähtyä työpöydällä huoneenlämpöön. Tämä vaati noin 1-2 h.

Kukin kolmesta kaksisäikeisestä osasta kloonattiin erikseen Ml3mpl8:aan. Osa 1 kytkettiin moninkertaisen kloonauskohdan restriktiokohtien Smal ja BamHI välille. Osa 2 kytkettiin kohtien BamHI ja PstI välille ja osa 3 insertoitiin kohtien PstI ja HindllI välille. Vastaavat kloonit ovat: M13mpl8.1, Ml3mpl8.2, Ml3mpl8.3. DNA-sekvenssi määritettiin kullekin kloonatulle osalle. Yksi edustava osa kustakin osasta, jolla oli oikea DNA-sekvenssi, otettiin talteen ja siitä tuli materiaali seuraavaan vaiheeseen: "monomeerin" kokoamiseen.

3. SipiII:n “monomeerin*' kokoaminen: DNA-osat 2 ja 3 eristettiin pilkkomalla M13-kloonit restrik-tioentsyymeillä: osalle 2, M13mpl8.2 pilkottiin BamHI:11a ja PstI:llä; osalle 3, Ml3mpl8.3 pilkottiin PstI:llä ja Hindlll:11a. Kaksi osaa puhdistettiin ja sekoitettiin yhteen yhtä suurina moolimäärinä M13mpl8.1.n kanssa, joka oli ensin pilkottu BamHI:11a ja Hindlll. T4 DNA-ligaasi lisättiin liittämään homologiset limittäiset päät järjestyksessä 1-2-3. Ko-heesiopäiden hybridisaatiospesifisyyden johdosta kolme osaa liittyvät tehokkaasti toisiinsa vain tässä järjestyksessä.

47 1 0 1 7 2 0

Kloonatun "monomeerin" .DNA-sekvenssi kokoonpanossa Ml3mpl8.1.2.3 määritettiin oikeaksi ja on esitetty kohdassa 2 edellä.

4. SlpIII: n "monomeerin" multimerointi:

Tarkoituksena valmistaa suuria määriä "monomeerista" rakenne-geeniä "monomeeri" subkloonattiin ensin plasmidivektoriin pUC12. M13mpl8.1.2.3 pilkottiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja Hindlll. “Monomeeri" SlpIII geelipuhdistettiin ja kytkettiin EcoRI:11a ja Hindlll:11a pilkottuun pUC12:een. Saatu plasmidi-DNA valmistettiin, "monomeeri" erotettiin vektorista pilkkomalla BanI REN:llä ja fragmentti geelipuhdistettiin.

Multimeerien luomiseksi "monomeeri"-DNA, jossa oli Banl-päät, yhdistettiin kytkemällä. Ei-toistuva terminaalinen Banl-tun-nistussekvenssi mahdollistaa liittymisen vain pää-häntään-järjestyksessä. Multimeroitumislaajuutta seurataan geeli-elektroforeesilla ja värjäämällä DNA etidiumbromidilla. Mul-timeerit, joissa on enemmän kuin 20 yksikköä, on saatu tällä menetelmällä.

5. SlpIII-multimeerien kloonaus:

Plasmidi pCQV2 (Queen et ai., J. Appi. Mol. Gen., 2:1-10 (1983)) pilkottiin restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja BamHI ja noin 900 emäsparin fragmentti puhdistettiin. Tämä DNA-fragmentti sisältää bakteriofaagin lambda cI-857 estogeenin, lähelle sitoutuneen, oikealle suuntautuneen promoottorin, P^, ja ero-geenin alun. Plasmidi pSY335 (kuvattu nimellä pJF751 julkaisussa Ferrari et ai., J. Bacteriology, 161:556-562 (1985)) pilkottiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja BamHI ja kytkettiin sen jälkeen pCQV2:n suunnilleen 900 emäsparin DNA-fragmenttiin. Tästä konstruktiosta saatu plasmidi, pSY751, ilmentää β-galaktosidaasigeenin 37QC:ssa ja 42C>C:ssa, mutta ei 30°C:ssa (kuva 8).

48 101720 Tässä lähestymistavassa SlpIII-geeni ensin kloonataan "apu"-sekvenssiin välituoteplasmidissa ja subkloonataan sitten il-mentymisjärjestelmiin. Apusekvenssillä on seuraavat hyödylliset ominaisuudet: ainoalaatuinen keskeinen BanI REN-kohta, kolme ainoalaatuista REN-kohtaa BanI:n molemmilla puolilla, informaatio, joka koodittaa proteiinin pilkkomista joko aminohapoissa metioniini, aspartaattiproliini tai arginiini ja pienessä koossa. BanI-kohta on insertiopiste SlpIII-multimee-reille, joissa on BanI-päät.

Apuaine syntetisoitiin Applied Biosystems 380A-syntetisoijal-la, kloonattiin M13mpl8:aan ja DNA-sekvenssi vahvistettiin. Apuaine subkloonattiin sitten erityisesti konstruoituun plas-midivektoriin, josta puuttuivat BanI REN-kohdat. Vasfaanotta-japlasmidi valmistettiin seuraavasti. Plasmidi pJHlOl (Ferra-ri et ai., 1983) pilkottiin osittain AhalII-restriktjoentsyy-millä ja kytkettiin uudelleen. E. coli HBlOl-transformantit valikoitiin väliaineessa, joka sisälsi kloramfenikolia (12,5 mg/ml). Useiden isolaattien restriktioanalyysin jälkeen valittiin yksi plasmidi, pSY325 (kuva 7). Tämä plasmidi sisältää vain kloramfenikoliresistenssigeenin ja pJHl01:n repli-koitumisalkuperän (pBR322:sta). Pilkkomisen jälkeen XhoII:11a täydennystä varten pSY325 kytkettiin geelipuhdistetulla apuaineella. Tuloksena oli apuaineplasmidi, pSY937, ja sen uudet ·· REN-kohdat vahvistettiin.

SlpIII-multimeerit kloonattiin pSY937:n BanI-kohtiin (kuva 7). Posiitiiviset kloonit identifioitiin kasvustohybridisaa-tiolla ja SlpIII:n osan 1 alempi säie DNA-koettimena hybridi-saatiolle (koetinsekvenssi on esitetty taulukossa 2). Positiiviset kloonit karakterisoitiin geelielektroforeesilla in-sertoituneen multimeerin koon suhteen. Lopuksi SlpIII-sek-venssit subkloonattiin käyttäen reunustavissa apualueissa olevaa REN-kohtaa ilmentymisplasmidien spesifisesti sijoittamiseksi.

SlpIII-proteiinilla oli seuraava aminohappokoostumus: 49 101720

SlpIII 1178 aminoh. MP 83.000

(fo) DPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHP P FAS DPM

GAGS (GAGAGS)g GAAGY C(GAGAGS)g GAAGY]18

GAGAGSGAGAGSGAGAMDPGRYQLSAGRYHYQLVWCQK

(fm) tarkoittaa aloituskodonia SlpIII:n ilmentymisvektori

Plasmidi-DNA pSY1086 on pSY937:n johdannainen, joka sisältää 19 toistoa SlpIII:sta (3,5 ke). Tämä plasmidi-DNA pilkottiin Nrul:llä ja PvuII:11a ja fragmentit erotettiin agaroosigeeli-elektroforeesilla. Puhdistettu SlpIII-multimeeri kloonattiin sitten plasmidiin pSY751, joka oli pilkottu PvuIII REN:llä. Useat kloonit analysoitiin ja yksi (pSY1008) valittiin käytettäväksi ilmentymiskokeisiin ja SlpIIIs n puhdistukseen.

pSY1008:n ampisilliinilääkkeelle resistenssi geeni substitu-oitiin Kanamycin-markkerin kanssa pSY1010:sta (valmistettu pilkkomalla pSY633 Dral:llä ja SspI:llä ja insertoimalla pUC4K:n pilkkomisesta saatu Kan^) ja saatua plasmidia kutsuttiin nimellä pSY1186. Poistamalla plasmidin pSY1186 SlpIII-osa BanI:llä saatiin uusi plasmidi, pSY1262. Tämä plasmidi sisältää ainoalaatuisen BanI-kohdan, joka mahdollistaa mono-meerien polymeroinnilla saatujen, BanI-pään sisältävien fragmenttien suoran kytkennän. Tätä plasmidia on käytetty luomaan plasmidit, jotka sisältävät insertit seuraaville proteiineille: SELPl,2, 3 ja Slp4.

so 101720

SlpIII:n tuotanto ja puhdistus Soluviljelmä E. coli viljellään seuraavassa väliaineessa: 3/1 hiivauute 20 kasaminohapot 20 peptoni 20 gelatiinipeptoni 20 KH2PO4 2 K2HPO4 2

Na2HP04 . 7H20 2 glukoosi 2 ampisilliini 0,1 Yön yli kasvanutta viljelmää (500 ml - 1 1), jota oli kasvatettu 30°C:ssa, käytettiin siirrostamaan 375 1 väliainetta, joka oli 500 l:n fermentorissa. Fermentorin olosuhteet olivat kierrosnopeusmittarin lukema 100 rpm, astian vastapaine n. 35 kPa (5 psi) ja ilmavirtaus 170 1/min, joiden tarkoitus oli pitää liuenneen 02:n arvo suurempana kuin 50 %.

Glukoosia (1 g/l) ja ampisilliiniä (0,05 g/l) lisättiin fer-mentaation, kun viljelmä saavutti ODgso-arvon 1,0 ja jälleen arvossa 2,0. Kun viljelmä saavutti 0D650-arvon 2,0, lämpötila nostettiin 42°C:een 10 minuutiksi ja alennettiin sitten 38°C:een 2 tunniksi. Viljelmä jäähdytettiin sitten 10°C:een ja solut korjattiin sentrifugoimalla jatkuvassa sentrifuugis-sa ja pakastettiin -70°C:ssa käyttöön saakka. Saannot kahdesta eri fermentaatiosta olivat solujen märkäpainolta 7,3 kg ja 5,2 kg.

Tulisi huomata, että muitakin väliaineita voidaan käyttää, ja eri plasmidien kanssa voidaan käyttää erilaisia valikointi-olosuhteita (s.o. kanamysiinivalikoinnin ampisilliinille korvaaminen) . Näitä olosuhteita on käytetty laboratoriomittakaa-vaisissa fermentoinneissa (tilavuus 10 1).

51 101720

Solujen liuotus

Menetelmä 1. Solut sulatetaan ja suspendoidaan konsentraati-oon 1 kg:n märkäpaino/6 l:aan 50 mM Tris-HCl:ää, pH 7,0, 1 mM EDTA:a ja rikotaan käyttämällä 2 kertaa APR Gaulin-solumurs-kaimessa paineessa n. 56.000 kPa (8000 psi). Tämän liuotusprosessin aikana solut pidetään kylmänä jäähauteessa. Solu-liuotustuote sentrifugoidaan sitten kiihtyvyydellä 26.000 x g jatkuvassa sentrifuugissa, kuten T2-28-roottori Sorvali RC5B jäähdytetyssä sentrifuugissa toimien lämpötilassa 4°C. Näissä olosuhteissa enemmän kuin 90 % valmistetusta SlpIIl:sta voidaan saada pellettiin. Supernatantti sisältää kyllä jonkin verran tuotetta, joka voidaan ottaa talteen saostamalla NH4S04sllä, kuten jäljessä on kuvattu. Pelletti uutetaan LiBrrllä, kuten jäljessä on kuvattu.

Menetelmä 2. Pakastetut solut sulatetaan ja suspendoidaan uudelleen konsentraatioon 1 kg:n märkäpaino/6 Iraan 50 mM Tris-HCl:ää, pH 7,0, 10 mM EDTA:a ja 5 mM PMSF:ää proteaasi-aktiivisuuden inhiboimiseksi. Soluja sekoitetaan tässä puskurissa huoneenlämmössä 0,5-2 tuntia, sitten lisätään lysotsyy-miä konsentraatioon 1 g/1 ja inkubointia jatketaan 20 min. Sitten lisätään β-merkaptoetanolia 70 mMtksi ja detergenttiä NP40 lisätään sitten lopulliseen konsentraatioon 1 % 20 minuutiksi samalla kun solususpensiota jatkuvasti sekoitetaan. MgCl2 lisätään 50 mMtksi ja sen jälkeen DNAasia konsentraati-ona 1 mg/1 ja inkubointia jatketaan huoneenlämmössä 20 min. Soluliuotustuote sentrifugoidaan sitten kuten menetelmässä 1 kiihtyvyydellä 26.000 x g jatkuvassa sentrifuugissa ja supernatantti kerätään ja kuljetetaan jatkuvan sentrifuugin läpi toisen kerran kiihtyvyydellä 26.000 x g. Tästä toisesta sent-rifugoinnista saatu supernatantti sisältää <5 % kokonais-SplIIItsta, mutta se mikä siellä on, voidaan ottaa talteen NH4S04:llä, kuten jäljessä on kuvattu. 1. ja 2. kiihtyvyydellä 26.000 x g suoritetusta sentrifugoinnista saadut pelletit yhdistetään ja uutetaan LiBrtllä kuten jäljessä on kuvattu.

101720 52

Menetelmä 3. Tähän menetelmään käytetään E. coli-kantaa, joka sisältää toisen plasmidin, joka koodittaa T7-faagilysotsyy-miä. Tämä plasmidi on yhteensopiva plasmidin kanssa, joka koodittaa SlpIII-geeniä ja lääkeresistenssiä determinanttia. Kanta kasvatetaan samassa väliaineessa ja samoissa olosuhteissa kuin kahdessa ensimmäisessä menetelmässä. Kuitenkin, koska solujen sisällä syntyy T7-lysotsyymiä, niiden seinämä heikkenee ja ne voidaan helposti liuottaa fermentoinnin loppuvaiheessa lisäämällä EDTA:a >100 mM:ksi ja NP40 konsentraa-tioon 0,5-1,0 % v/v. Liuotus voidaan myös suorittaa lisäämällä kloroformia (20 ml litraa kohti fermentointilientä) NP40:n sijasta. Vaihtoehtoisesti voidaan solut kerätä sentrifugoi-malla ennen liuotusta, suspendoida uudelleen 1 kg:n märkäpai-no 6 l:aan Tris-EDTA:a, kuten kahdessa ensimmäisessä' menetelmässä on kuvattu, ja liuottaa sitten lisäämällä NP40:ä tai kloroformia. Solujen liuotuksen jälkeen jommallakummalla menetelmällä liuotustuote sentrifugoidaan jatkuvalla roottorilla kiihtyvyydellä 26.000 x g, kuten kahdessa ensimmäisessä menetelmässä on kuvattu. Mitä noihin menetelmiin tulee, pelletin LiBr-uuttoa ja supernatantin NH4S04~saostusta käytetään tuotteen talteenottamiseen.

SlpIII:n puhdistus

Pelletti, joka on saatu sentrifugoimalla soluliuotustuote kiihtyvyydellä 26.000 x g, kuten edellä on kuvattu, uutetaan samaan tilavuuteen 9 M LiBr. Suolaliuosta lisätään ja pelletti suspendoidaan tasaisesti sekoittamalla huoneenlämmössä (RT). Seosta sekoitetaan 1 tunti RT:ssä sen jälkeen, kun tasainen suspensio on tapahtunut. Seos sentrifugoidaan sitten kiihtyvyydellä 26.000 x g jatkuvassa roottorissa 4°C:ssa tai RTtssä pelletin ja supernatanttifraktion saamiseksi. Super-natantti säästetään ja pelletti uutetaan uudelleen toisella samanlaisella tilavuudella 9 M LiBr kuin edellä. Kun on sekoitettu 1 tunti, seos sentrifugoidaan kiihtyvyydellä 26.000 x g ja supernatantti tästä sentrifugoinnista yhdistetään ensimmäisestä LiBr-uutosta saadun supernatantin kanssa ja 53 1 0 1 7 2 0 annetaan seistä 4°C:ssa yön yli. Suunnilleen 90 % Sipulista, joka sisältyi soluliuotustuotteesta kiihtyvyydellä 26.000 x g saatuun pellettiin, saadaan uutettua LiBrillä käyttäen tätä menetelmää.

LiBr-uutteen seistessä yön yli 4°C:ssa muodostuu sakka, joka poistetaan sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 26.000 x g ja heitetään pois. Supernatantti pannaan sitten dialyysikennoihin ja dialysoidaan vaihtaen useita kertoja dH20:ta 2 päivän ajan. Koska LiBr poistetaan dialyysillä, SlpIII-tuote saostuu dialyysikennoihin. Sakka kerätään sentrifugoimalla ja pestään 2-3 kertaa dioilla. Lopullinen pesty tuote sentrifugoi-daan ja kuivataan lyofilisoimalla.

SlpIII:n talteenottamiseksi 26.000 g:n supernatanttifrakti-oista käytetään NH4S04-saostusta. Kiinteä NH4SO4 lisätään hitaasti näytteeseen, jota pidetään 40C:ssa, kunnes saavutetaan 38 % kyllästyminen (231 g/1). Seosta sekoitetaan sitten 4°C:ssa 2-3 tuntia. Sakka otetaan talteen sentrifugoimalla jatkuvavirtauksisessa sentrifuugissa ja pestään 4-5 kertaa samalla tilavuudella tislattua vettä tai 0,5 % SDS H20:ssa. Jokaisen pesun jälkeen sakka otetaan talteen jatkuvalla sent-rifugoinnilla. Pelletti tulee enemmän valkoiseksi peräkkäisillä pesuilla, kun kontaminaatioproteiini poistuu. SlpIII *’ otetaan talteen pestynä pellettinä ja voidaan kuivata lyofi lisoimalla.

SlpIIIin trypsiinikäsittelyvaihe

SlpIII suspendoitiin 50 mM Tris-HCliään, pH 8,0, 0,1 M NaCl-puskuriin, ja TPCK-käsitelty trypsiiniliuos sekoitettiin suspensioon. Lopullinen trypsiinikonsentraatio oli 0,1 %. 3 tunnin kuluttua liuosta sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 16.000 x g 15 min, pelletti pestiin puolikkaalla tilavuudella 0,5 % SDS H20issa ensin, sitten tislatulla vedellä. Jokaisen pesun jälkeen pelletti otettiin talteen sentrifugoimalla. Lopullinen tuote suspendoitiin uudelleen veteen ja pidettiin 40Cissa lisäanalyysiä varten.

54 101720

Trypsiinikäsittelyllä SlpIII puhdistettiin 99,4 % puhtaaksi. SlpIII:n fysikaaliset mittaukset

Puhdistettujen silkinkaltaisten proteiinien fysikaalisia mittauksia on verrattu Bombyx mori-silkin arvojen kanssa sen vahvistamiseksi, että mikrobiologisesti tuotetut toistuvat aminohappopolymeerit matkivat tarkoin luonnossa esiintyvien polymeerien ominaisuuksia. Fysikaaliset mittaukset suoritettiin anti-paralleeliketjuisen laskostetun kerroskonformaatio-mallin varmistamiseksi Bombyx mori-silkkifibroiinin kidealu-eille (Marsh, Corey and Pauling, Biochem. Biophys. Acta (1955) lii; Pauling and Corey, Proc. Natrl. Acad. Sei. USA (1953) 39»:247). Esianalyysit röntgendi f fraktiomalleille, jotka oli saatu Slp-kalvoista, ovat yhdenmukaisia niiden kanssa, jotka on kuvattu julkaisussa Fraser, MacRai and Steward (1966) (taulukko 4). SlpIII:n Sirkulaarinen dikroinen (CD) ja Fourierin muunnosinfrapuna (FTIR) spektroskooppianalyysi ovat yhdenmukaisia suuren joukon kanssa pidennettyjä β- ja β-kier-roskonformaatioita. SlpIII:sta saatujen spektrien vertailut luonnossa esiintyvän silkkifibroiinin spektrien kanssa eri liuottimissa (Isuka and Young, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1966) 55^:1175) osoittavat, että SlpIII liuoksessa koostuu satunnaisista ja erittäin järjestyneistä rakenteista, joita nähdään silkkifibroiineissa.

Taulukko 4

Aine * (A) b (A) C (A) (AG)n 9.M2 6.95 8.87 (agagsg)n 9.39 6.85 9.05 CTP-fraktio 9.38 6.87 9.13

Luonnon fibroiini 9.MO 6.97 9.20 9.MM 6.95 9.30 sipin 9.38 6.9M 8.97

Viitattu julkaisussa Fraser et ai., J. Mol. Biol. (1966) 19:580.

5s 101720

Esimerkki 4 EBSI-geenikonstruktio:

Kuusi oligonukleotidisäiettä syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu.

(BSD IttU Soi L rAGCTGGGC^rTGCACTAGGCCrC^ k rAATTrAr^vrTACTggAGAGgcrr (ERI) Seal Basil (wttt) Baal m. i*AG£TTGOTGgCAGGTGTAfiOAGTTCCCGGTBTAGflCGTTCCGGGAGTTGG ' TGTACCTGOAGTOGOTGTTCCAGGCOTAGGTOTGO*

(XfflaQ

W. mGGGCACACCTACOCeTGGAACACeCACrCCAOgTACACCAACTCCCGOA ACGCCTACACCCGOAACTCCTACACCICfiCÄCCAr

Baal (Xrnal) v. yeCGgCGTAGQAgTACCAGGGGTAGgCCHgecrGGAflCGqGTGCTCqTAG CGGCGCAGGCGCQSSC£CCGGAGTAeGfiS3S2D33'

BaaS ·· * Baal (XXI) Baal BaaO _ «L rAATTrcGeAfcegrAgTgCBOAflegeBCCcergCBCCgerAfrAflrACCCO gTgeAGQGAgGGcrAgeBCTOQTAeTeeTAGn*

AiaQ

Oligonukleotidisäikeet (iii), (iv), (v) ja (vi) lämpökäsitel-tiin ja kytkettiin plasmidista pBSml3(+) (Stratagene) saadun DNA:n kanssa, joka oli pilkottu Hindlll:11a ja EcoRI:11a. Tästä kytkentäreaktiosta saadut tuotteet transformoittin E. coli-kantaan JM109. Transformanttikasvustot valikoitiin niiden ampisilliiniresistenssin suhteen. Kasvustot seulottiin niiden hybiridisaation suhteen 32p_ieiniatuiila oligonukleoti-deilla (iii), (v). Plasmidi-DNA useista positiivisesti hybri-disoituvasta kloonista puhdistettiin ja sekventoitiin. Kaksi plasmideista, pSY1292 ja pSY1293, sisälsi sekvenssin, joka esiintyi oligonukleotideissa (iii), (v) ja (iv), (vi). Nämä sekvenssit sisälsivät kaikki näissä synteettisissä oligonuk-leotideissa läsnäolevat nukleotidit paitsi yhden. Emäspari G:C puuttui kohdassa 7 (iii). Tämän emäsparin puuttuminen 56 101720 esti yhden BanI-kohdista♦ Toisen Banll-kohdan liittämiseksi geenifragmentin 5'-päähän oligonukleotidit (i) ja (ii) lämpö-käsiteltiin ja kytkettiin plasmidin pBS13(+) kanssa, joka oli pilkottu HindiII tila ja EcoRI:11a. Plasmidi-DNA ampisillii-nille resistenteistä transformanttikasvietoista puhdistettiin. Kaksi plasmidia, pSY1295 ja pSY1296, jotka olivat pilkottavissa Stul:llä, laatuaan ainoalla oligonukleotidisek-venssiin sisältyvällä kohdalla, sekventoitiin. Ne molemmat näyttivät sisältävän sekvenssin, joka esiintyi oligonukleoti-deissa (i) ja (ii). Plasmidi-DNA pSY1292 pilkottiin peräkkäin Hindlll:11a, SI-nukleaasilla ja EcoRI:11a. Pilkkomistuotteet erotetttiin elektroforeesilla agaroosigeelissä ja noin 150 emäsparin DNA-fragmentti poistettiin geelistä. Tämä DNA-frag-mentti pilkottiin plasmidi-DNA:lla pSY1296, joka oli·'pilkottu Stul:llä ja EcoRI:11a. Tämän kytkentäreaktion tuotteet transformoitiin E. coli-kantaan JM109 ja valikoitiin ampisilliini-resistenssin suhteen. Kasvustot seulottiin hybridisaation suhteen ^2p_ieimattuun oligonukleotidiin (v). Plasmidi-DNA kahdesta positiivisesti hybridisoituvasta kloonista puhdistettiin ja sekventoitiin. Näille plasmideille annettiin nimet pSY1297 ja pSY1298. Ne sisälsivät seuraavan sekvenssin:

(KindXXX) BanXX

>ccTgcae?cTccAiCTxecTeTcccx6CTeTACcxcTTCcocaTgrACOcaTTCCucGAC «o

TCGACCCCAGACCTCATCCACACGGTCCACATCCTCAAGGCCCACATCCGCAAGGCCCTC

XaaX

TTCgTCTAgCTeaACTeCGTSTTCCASCCSTJICCTSTCCCCCgCCTACCACTACCACCGC 120

AACCACATGGACCTCACCCACAAGCTCCGCATCCACACGCCCCCCATCCTCATGCTCCCC

BanXX

iacc^cccic<aiCcg«CTcciqcTA6^^ iso seoitx ocisue 57 101720 EBSI-multimeerigeenin kokoaminen;

BanI-apuplasmidi pSY937 modifioitiin tarkoituksena saada terminaaliset Banll-kohesiiviset DNA-fragmentit. Kaksi oligonuk-leotidia syntetisoitiin tätä tarkoitusta varten.

CBaaHX) Dnl Sipi BtaS

«fi. ICATCTATtrrrTAAATATTCTCBCSAALGl 11ΓTOTATCGGCECGATGTGT

TAgeCTGgggATGGATATCAGCrSr hpl IcaAY Mli

(BaaBD FvuII ZcaKY Ftol BiaU

vffi St?ATCgACCICATATCt^TGgiCACGGTAACACATCe?AggCeATAgAAAAA

gyrrrrxriAGA atatttaaaCaTAQT Not ftpTTSP

Oligonukleotidit (vii) ja (viii) lämpökäsiteltiin ja kytkettiin plasmidi-DNA:n pSY937 kanssa, joka oli pilkottu BamHI 11a. Tämän kytkennän tuotteet transformoitiin coli-kantaan JM109 ja kasvustot valikoitiin kloramfenikoliresistenssin suhteen. Transformanttikasvustot seulottiin hybridisaation suhteen 32p_ieimattuun oligonukleotidiin (vii). Plasmidi-DNA kahdesta positiivisesti hybridisoivasta kloonista, pSY1299 ja pSY1300, sisälsivät oligonukleotideissa (vii) ja (viii) esiintyvän sekvenssin, määritettynä DNA-sekventoinnilla.

‘ Plasmidi-DNA pSY1298 pilkottiin Banll:11a ja pilkkomisfrag- mentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla. EBSI-geeni-fragmentti, suunnilleen 150 emäsparia, poistettiin ja puhdistettiin elektroeluoinnilla ja etanolisaostuksella. Noin 1 ug puhdistettu fragmenttia itsekytkettiin tarkoituksena tuottaa multimeereja, joiden koot ulottuvat alueelle 450 emäsparia -6000 emäsparia. Itsekytkeytymistuotteet kytkettiin sitten plasmidi-DNA:n pSY1299 kanssa, joka oli pilkottu Banll;lla. Tämän kytkennän tuotteet transformoitiin E. coli-kantaan HB101. Transformantit valikoitiin kloramfenikoliresistenssin suhteen. Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista puhdistettiin ja analysoitiin EBSI-multimeeri-DNA-insertioista joh-·' tuvan koon kasvun suhteen. Saatiin 10 kloonia (pSY1240-1249), se 101720 joiden insertit olivat Jcokoalueella 1,5 kiloemäsparia - 4,4 kiloemäsparia.

EBSI-multiroeerigeenin ilmentyminen:

Yksi näistä klooneista, pSY1248, joka sisälsi 4 kiloemäksen EBSI-multimeerigeenin, kloonattiin uudelleen λp^-ilmentyrnis-vektoriin pSY751. Plasmidi-DNA pSY1248:sta pilkottiin NruI;-llä ja PvuII:11a, erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla ja EBSI-multimeerigeeniä vastaava vyöhyke poistettiin ja puhdistettiin NACS-puhdistuksella. DNA plasmidista pSY751 pilkottiin PvuII:11a ja kytkettiin NruI-PvuII-fragmentin kanssa pSY1248:sta. Tuotteet tästä kytkennästä transformoitiin E. coli-kantaan HB101, ja trans formant it valikoitiin amp'isillii-niresistenssin suhteen. Eristettiin kaksi kloonia, jotka sisälsivät uuden plasmidin pSY1280. pSY1280 sisältäviä £. coli-soluja kasvatettiin 30°C:ssa OD600”arvoon 0,7 ja siirrettiin sitten 42°C:een 1,5 tunniksi. Näiden solujen tuottamat proteiinit analysoitiin SDS-PAGE:11a. Erotetut proteiinit siirrettiin nitroselluloosapaperille ja niiden immuunireaktiivisuus havaittiin anti-ELP-kaniseerumilla. Voimakkaasti reaktiivinen proteiinivyöhyke havaittiin ilmeisellä molekyylipainolla 120 kD.

pSY1280:n ampisilliinilääkeresistenssigeeni korvattiin kana-mysiinimarkkerilla ja näin saatua plasmidia kutsuttiin nimellä pSY1332. Tätä plasmidia käytettiin fermentoinnissa EBSI:n puhdistamiseksi, (katso menetelmät) pSY1332/pSY1280 EBSI-proteiini 1413 aminoh. MP 113.159

MDPWLQRRDWENPGVTQLMRLAAHPPFASERFCMCS C(cvgvp)8 (GAGAGSGAGAGS)1]25 MCIRAHGXQLSAGRXHYQLVWCQK

59 101720 EBSI-proteiinin puhdistus: E. coli-kantaa HB101, joka sisälsi plasmidin pSY1280, fermen-toitiin 10 l:n tilavuudessa. Solut konsentroitiin suodattamalla ja korjattiin edelleen sentrifugoimalla. Pelletoidut solut säilytettiin pakastettuna -70C°C:ssa käyttöön saakka. Pakastetut solut sulatettiin jäissä ja suspendoitiin 4 ml:aan 50 mM Tris-HCl:ää, pH 7,0, 10 mM EDTA:a, 5 mM PMSFtää grammaa kohti solujen märkäpainoa. Solut rikottiin Frenchin puristimella kahdesti paineessa n. 104 MPa (15.000 psi) ja jäähdytettiin sitten 0°C:een. Epäpuhdas liuotustuote kirkastettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 26K x g 20 minuuttia. Supernatantin proteiinit saostettiin lisäämällä kiinteätä ammoniumsulfaattia 20 %:n kyllästysasteeseen (114.t|/l). Sakka kerättiin sentrifugomalla kiihtyvyydellä 10K x g 10 minuuttia. Pelletti suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan H.20 Da dialysoitiin 10 mM Trisiä, pH 8,0, 0,15 M NaCl:ää vastaan 4°C:ssa. Dialysoitu liuos uutettiin 0,1 % Trypsin-liuoksella (Sigma) 1,5 tuntia huoneenlämmössä ja saostetiin uudelleen 20 % ammoniumsulfaatilla. Saostunut proteiini suspendoitiin uudelleen H20:hon ja dialysoitiin 10 mM Trisiä, pH 7,0, 1 mM EDTA:a vastaan 4°C:ssa. Tämän näytteen proteiinipuhtaus analysoitiin aminohappokoostumuksesta ja sen määritettiin olevan 83 %.

EBSI-proteiinin elastiset ominaisuudet:

Edellä kuvatun puoliksi puhdistetun EBSI-proteiinin liukoista valmistetta inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia ja sentrifugoi-tiin kiihtyvyydellä 10K x g 10 minuuttia huoneenlämmössä. Tämä käsittely aiheutti EBSI-proteiinin aggregoitumisen, liukenemattomaksi tulemisen, ja pelletin tulemisen läpikuultavaksi kiinteäksi aineeksi. Kiinteä aine kesti mekaanista hajottamista joko vorteksoimalla tai maseroimalla käyttäen lasisau-vaa. Kiinteätä ainetta voitiin leikata partakoneenterällä suikaleiksi, jotka olivat erittäin elastisia. Ne säilyttivät täysin muotonsa toistettujen venytysten ja lepovaiheiden jälkeen. Ne kestivät puristusta ilman mitään ilmeneviä palautumattomia rakennemuutoksia.

so 101720 EBSI: n puhdistus EBSI-näyte (n. 70 % puhdas) dialysoitiin 50 mM Tris-HCl:ssä, 50 mM NaCl:ssä, pH 8,0, 4C>C:ssa yön yli vaihtaen puskuria kerran. Jos saostumista havaittiin, näytettä sentri£ugoitiin kiihtyvyydellä 27.000 x g 15 min 4°C:ssa. Kaikki jäljellä olevat vaiheet suoritettiin 40C:ssa. Supernatantti pantiin DEAE-Sephacel-kolonniin, joka oli tasapainotettu 50 mM Tris-HCl :llä, 50 mM NaCl:llä, pH 8,0. EBSI:ä sisältävien fraktioiden läpi kulkeneet virrat kerättiin ja yhdistettiin. NaCl lisättiin DEAE-Sephacel-kolonnista saatuihin yhdistettyihin fraktioihin niin, että näytteeseen saatiin lopullinen kon-sentraatio 2 M NaCl. Liukenematon materiaali poistettiin sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 27.000 x g 20 min. Su£erna-tantti pantiin sitten Phenyl-Sepharose-kolonniin, joka oli tasapainotettu 50 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 7,0, 2 M NaCl:llä. Kolonni pestiin tarkoin puskurilla, kunnes mitään eluoituvaa proteiinia ei havaittu Α280:11*. Kolonni eluoitiin sitten vaiheittain 50 mM natriumfosfaattipuskurilla, pH 7,0 ja lopuksi vedellä. EBSI-aktiiviset fraktiot yhdistettiin ja ne säilytettiin 4QC:ssa lisäanalyysiä varten.

Lisäämällä nämä vaiheet aikaisempiin menetelmiin saatiin 100 % puhdas EBSI.

Esimerkki 5 ELPI:n konstruoiminen ja ilmentyminen

Kaksi oligonukleotidisäiettä syntetisoitiin ja puhdistettiin kuten edellä menetelmäosassa on kuvattu.

(EcaU) BhI Sami I) 3*-A ATTCGCTOegiSGTgTAGQAGTTCCGGGTGTAfiGCGTTCgCSGQGTAO GCGTTCCGGGaGTaGOGGTGCCA^-I · ·:

MJU

»tiT fad ____ AOPocgiCATecarACOgnmA-r 61 101720

Kaksi oligonukleotidisäiettä lämpökäsiteltiin ja kytkettiin DNA:11a plasmidista pBSml3(+) (Stratagene), joka oli pilkottu REN:eillä HindiII ja EcoRI.

Tämän kytkentäreaktion tuotteet transformoitiin coli-kantaan JM109. Transformanttikasvustot seulottiin niiden hybri-disoitumisen suhteen 32p-ieimatun oligonukleotidin (i) kanssa. Plasmidi-DNA positiivisesti hybridisoituvista klooneista puhdistettiin ja sekventoitiin. Yksi plasmidi, pSY1287, sisälsi sekvenssin, joka esiintyi oligonukleotideissa (i) ja (ii) ·

Plasmidi-DNA pSY1287:stä pilkottiin BanI REN:llä ja pilkko-misfragmentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesilla. ELPI-geenifragmentti, noin 60 emäsparia, irrotettiin ja puhdistettiin NACS-kolonnissa. Noin 1 ug puhdistettua fragmenttia itsekytkettiin multimeerien tuottamiseksi, joiden koko-alue oli 300 emäsparia - 5000 emäsparia.

Itsekytkennän tuotteet kytkettiin sitten plasmidi-DNA:n pSY937 kanssa, joka oli pilkottu REN:llä BanI. Tämän kytkentäreaktion tuote transformoitiin E. coli-kantaan HB101. Transformantit valikoitiin kloramfenikoliresistenssin suhteen. Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista puhdistettiin ja analysoitiin niiden kasvanut koko, joka johtui ELPI:n moninkertaisista DNA-insertioista. Havaittiin neljä kloonia (pSY1388-1391), joiden inserttien koko oli alueella 1,0 kilo-emäsparia - 2,5 kiloemäsparia. Nämä kloonit kloonattiin uudelleen Λρ^-ilmentymisvektoriin pSY751. Saatuja klooneja (pSY1392-1395) käytettiin ELPI:n ilmentymiseen.

ELPI-proteiinilla oli seuraava aminohappokoostumus: pSY1395 ELPI-proteiini 859 aminoh. MP 72.555

MDPVVLQRRDWBNPOVTQLNRLAAHP P FA RNXLAIRtf C(VPGV0)*3*0 VPWTRVDLSAGRTHXQLWCQK

62 101720 SELPl-geenin konstruointi ja ilmentyminen

Kaksi oligonukleotidisäiettä syntetisoitiin kuten edellä mene te lisäosassa on kuvattu.

Faol PvuII SnaBI (Päti) (t) 5*-OTOCOlA6cf6<STACOTAGCTGCA-3 *

(PstI) PvuII

(il) 3'-ACGTClACGCGtCÖACCATGCATCG-5'-

Fspi Sna&I

Nämä oligonukleotidisäikeet lämpökäsiteltiin ja kytkettiin plasmidin pSY1304 kanssa, joka oli pilkottu PstI REN:llä (pSY1304 eroaa pSY857:stä siinä, että sillä on monomeferiyk-sikkö pSY857:n trimeeriyksikön sijalla). Plasmidi-DNA kloram-fenikolille resistenteistä transformanttikasvustoista, puhdistettiin. Yksi plasmidi, pSY1365, joka oli pilkottavissa REN SnaBI:llä, sekventoitiin ja todettiin oikeaksi.

Kuvatulla tavalla (ELPI:n konstruointi ja ilmentyminen) puhdistettu ELPI-geenifragmentti käsiteltiin Mung Bean Nuclease :11a toimittajan (Stratagene) kuvaamalla tavalla. DNA-fragmenttiseos kytkettiin sitten plasmidi-DNA:n pSY1365 kanssa, joka oli pilkottu peräkkäin REN:eillä Fspi, SnaBI ja vasikan ohutsuolifosfataasilla. Tuotteet tästä kytkentäreakti-osta transformoitiin E. coli-kantaan HB101 ja valikoitiin kloramfenikoliresistenssin suhteen. Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista puhdistettiin ja analysoitiin niiden ELPI-monomeeri-DNA:n insertio. Kaksi plasmidia, pSY1366 A ja B, sekventoitiin. Niiden osoitettiin molempien sisältävän ELPI-DNA-sekvenssin oikein orientoituneena.

Plasmidi-DNA pSY1366 pilkottiin REN:llä BanI ja SELPl-mono-meerin sisältävä DNA-fragmentti geelipuhdistettiin. Multimee-rien saamiseksi 1 ug SELPl-DNA-fragmenttia itsekytkettiin. Saatiin multimeerit, joiden kokoalue oli 500 emäsparia - 10 kiloemäsparia. SELPl-multimeerit kloonattiin pSY1262:n Banl-kohtaan.

63 1 0 1 7 2 0

Positiiviset kloonit karakterisoitiin geelielektroforeesilla insertoidun multimeerin koon suhteen ja käytettiin ilmentymiseen ja proteiinianalyysiin.

psyi396 SELPl-proteiini 2025 aminoh. MP 148.212 MDP VVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPMGAGS ( GAGAGS) g CGAA(VPGVG)4 VAAGY (GAGAGS)9]2u

GAA(VPGVG)ij VAAGY (GAGAGS)2 GAGAMDPGRYQLSAGRYHYQLVWCQK

SELP2 - Monomeerin konstruoiminen

Plasmidi-DNA pSY1298 pilkottiin Banll REN:1la ja EBSI-geeni-fragmentti puhdistettiin kuten aikaisemmin on kuvattu. EBSI-monomeerifragmentti kytkettiin pSY1304:ään (pSY937, joka sisälsi Slplll:n monomeerin, konstruoitu kuten pSY857), joka oli pilkottu Banll REN:llä ja käsitelty vasikan ohutsuolen fos fataas i1la.

Tuotteen kytkentäseoksesta transformoitiin E. coli-kantaan HB101. Transformantit valikoitiin kloramfenikoliresistenssin suhteen. Useiden isolaattien restriktioanalyysin jälkeen valittiin yksi plasmidi, pSY1301, joka sisälsi EBSI-monomeeri-geeniä vastaavan DNA-fragmentin.

SELP2 - Moninkertaisen geenin kokoonpano ja ilmentyminen

Plasmidi-DNA pSY1301 pilkottiin RENsllä BanI ja SELP2-"monomeerin" sisältävä DNA-fragmentti geelipuhdistettiin. Multimeerin luomiseksi 1 ug SELP2:n DNA-fragmenttia itsekytket-tiin. Saatiin multimeerit, joiden koko oli enemmän kuin 12 ke.

SELP2-multimeerit kloonattiin pSY1262:n BanI-kohtaan. Posi-·* tiiviset kloonit karakterisoitiin geelielektroforeesilla in sertoidun multimeerin koon suhteen. Kloonit, joiden insertit olivat kooltaan 1,5 ke - 11 ke, valittiin.

64 101720

Plasmidi-DNA:ta, joka sisälsi 6 ke:n (18 toistoa) insertin, käytettiin lisäanalyysiin ja proteiinin puhdistukseen.

SELP2 - Proteiinin puhdistus

Plasmidin pSY1372 sisältävä E. coli-kanta HB101 fermentoitiin fermentointimenetelmissä kuvatun menetelmän mukaan. Solut korjattiin sentri£ugoimalla. Pelletoidut solut säilytettiin pakastettuna -70°C:ssa käyttöön saakka. Pakastetut solut sulatettiin jäissä ja suspendoitiin 4 ml:aan 50 mM Tris-HCl, pH

7,0, 10 mM EDTA, 5 mM PMSF grammaa kohti solujen märkäpai-noa. Solut hajotettiin kuljettamalla Gaulin-soluhajottimen läpi paineessa n. 52 MPa (8000 psi). Epäpuhdas liuotustuote kirkastettiin eentri£ugoimalla kiihtyvyydellä 26.000-x g 20 min. Supernatantti, joka sisälsi >75 S SELP2-proteiinia, saostettiin lisäämällä 20 % ammoniumsul£aattia (114 g/1).

Sakka kerättiin sentri£ugoimalla kiihtyvyydellä 10.000 x g 10 min. Pelletti suspendoitiin uudelleen 10 ml:aan H2O ja dialy-soitiin vasten 10 mM Trisiä, pH 8,0, 0,15 M NaCl:ää 4°C:ssa. Dialysoitu materiaali sentrifugoitiin kiihtyvyydellä 26.000 x g 15 min tarkoituksena kerätä proteiinin liukenematon fraktio, jota oli noin 10 % SELP2-proteiinista. Tämä liukenematon proteiinipelletti pestiin kahdesti 0,2 % SDS:ssä 50°C:ssa 30 min ravistaen satunnaisesti. Liukenematon proteiini kerättiin : joka kerran sentrifugoimalla kiihtyvyydellä 26.000 x g 15 min ja sen jälkeen pestiin 50 % etanolilla. Lopullinen proteiinipelletti suspendoitiin uudelleen veteen ja analysoitiin Western blot-analyysillä ja aminohappokoostumuksella. Western blot-analyysillä näyttää SELP2-proteiini olevan homogeeninen kooltaan yhdenmukaisesti suuren molekyylipainonsa (>150 kd) kanssa. Aminohappokoostumuksella määritettynä SELP2-valmiste on noin 80 % puhdas ja havaittu aminohappojen (Ser:Gly:Ala:-Pro:Val:Tyr) moolisuhde on hyvin lähellä sitä odotettua koostumusta, joka ennakoitiin pSY1372:ssa läsnä olevasta SELP2-sekvenssistä.

es 101720 pSY1372 SELP2-proteiini 2055 aminoh. MP 152.354 MDPWLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPMGAGS (GAGAGS)2 (GVGVP)g C(gagags)6 gaagy (gagags)5 (gvgvp)0]17 <gagags)6 gaagy (gagags)2 gagamdpgryqlsagryhyqlvwcqk SELP3 - Konstruointi ja ilmentyminen

Plasmidi-DNA pSY1301 pilkottiin osittain REN:llä Haell ja pilkkomisfragmentit erotettiin agaroosigeelielektroforeesil-la. Suuremmat DNA-fragmentit poistettiin ja puhdistettiin NACS-kolonnissa. Puhdistetut fragmentit itsekytkettiin, kyt-kentäreaktiota lämmitettiin 70°C:ssa 15 min T4 DNA-ligaasin inaktivoimiseksi ja mahdollisesti pilkkomiseksi REN:llä PstI. Pilkkomisseos transformoitiin sitten E. coli-kantaan JM109. Transformantit valikoitiin niiden kloramfenikoliresis-tenssin suhteen. Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista puhdistettiin ja siitä analysoitiin: (1) resistenssi REN:lie PstI; ja (2) 60 emäsparin SELP2-geenifragmenttiin sisältyvän Haell-fragmentin deleetio. Yksi klooni (pSY1377) tyydytti molemmat vaatimukset. Plasmidi-DNA pSY1377 pilkottiin REN:llä BanI ja SELP3-monomeerin sisältävä DNA-fragmentti geelipuh-distettiin. Multimeerien saamiseksi 1 ug SELP3:n DNA-frag-menttia itsekytkettiin. Saatiin multimeerit, joiden kokoalue oli 500 emäsparia - 10 kiloemäsparia. SELP3-multimeerit kloonattiin pSY1262:n BanI-kohtaan♦ Positiiviset kloonit karakterisoitiin geelielektroforeesilla insertoituneen multimeerin koon suhteen ja käytettiin ilmentymiseen ja proteiinianalyysiin .

pSY1397 SELP3-proteiini 2257 aminoh. MP 168.535 MD P WLQRRDWENP GVTQLNRLAAHPP FAS DP MCA GS (GAGAGS)2 [(GVGVPVg (GAGAGS)8]24

(GVGVP)g (GAGAGS)5 GAGAMDPGRYQLSAGRYHYQLVWCQK

66 101720 SLP4 - Konstruointi ja ilmentyminen

Plasmidi-DNA pSY1304 (pSY857, jossa on yksittäinen monomeeri-yksikkö erona pSY857:n trimeeriyksikköön) pilkottiin osittain R£N:llä Haell ja pilkkomisfragmentit erotettiin agaroosigee-lielektroforeesilla. Suuremmat DNA-fragmentit irrotettiin ja puhdistettiin NACS-kolonnissa. Puhdistetut fragmentit itse-kytkettiin, kytkentäreaktiota lämmitettiin 70°C:ssa 15 min T4 DNA-ligaasin inaktivoimiseksi ja mahdollisesti pilkkomiseksi REN:llä PstI. Pilkkomisseos transformoitiin sitten E. coli-kantaan JM109. Transformantit valikoitiin niiden kloram-fenikoliresistenssin suhteen. Plasmidi-DNA yksittäisistä transformanteista puhdistettiin ja niistä analysoitiin: (1) resistenssi REN:lie PstI? ja (2) SELP2-geenifragmenttiin sisältyvän 60 emäsparin Haell-fragmentin deleetio. Yksi klooni (pSY1378) tyydytti molemmat vaatimukset. Plasmidi-;DNA pSY1378 pilkottiin REN:llä BanI ja SLP4-monomeerin sisältävä DNA-fragmentti geelipuhdistettiin. Multimeerien saamiseksi 1 ug SLP4:n DNA:ta itsekytkettiin. Saatiin multimeerit, joiden kokoalue oli 300 emäsparia - 6 kiloemäsparia. SLP4-multimee-rit kloonattiin pSY1262:n BanI-kohtaan. Positiiviset kloonit karakterisoitiin geelielektroforeesilla insertoidun multimee-rin koon suhteen ja käytettiin ilmentymiseen ja proteiinianalyysiin.

pSY1398 SLP4-proteiini 1101 aminoh. MP 76.231 MDPWLQRRDWENPCVTQLNRLAAHPPFASDPMGAGS C(GAGAGS)6]27

(GAGAGS) GAGAMDPGRYQLSAGIYHYQLVWCQK

Kuten edelläolevista tuloksista ilmenee, voidaan erittäin toistuvia sekvenssejä valmistaa, kloonata ja käyttää ilmentymiseen tuottamaan suurta joukkoa erilaisia tuotteita, jotka voivat matkia luonnon tuotteita, kuten silkkiä ja muita proteiineja ja antigeenejä. Lisäksi tarjotaan käyttöön uudet järjestelmät peptidin ilmentymisen kontrolloimiseen 67' 101720 indusoitavissa olosuhteissa erilaisissa isännissä. Tällä tavalla voidaan saada proteiinituotteita, joilla on uusia ominaisuuksia tai voivat läheisesti matkia luonnossa esiintyvien tuotteiden ominaisuuksia.

Kirjallisuusviitteet 1. Maniatta, T.. Fritach, E.F. and Sambrook, J.

1982. 'Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, MY.

2. Laeomli, U.K. 1970. Mature (London), 227:680-685.

3. Applied Bioayateos User Bulletin. 1984. No. 13.

4. Matteucci, M.D. and Caruthera, M.H. 1981.

Journal Amer. Chen. Soc.. 103:3185-3319.

5. McBride, L.J. and Caruthera, M.H. 1933·

Tetrahedron Lettera. 24:245-248.

6. Smith, 1980. Methoda In Enzymology. 65:371-370 7. Vieira, J. and Meaalng, J. 1982. Gene. 19:259- 268.

8. Anagnoatopoula, C. and Spizlzen, J. 1981. j.

Baoterlol.. 81741-746.

9. Davanloo, P., Rosenberg, A.H. Dunn, J.J. and Studler, F.W. 1984. Proc. Natl. Acad. Set, us A.

81 :2035-2039.

10. Roaenbluh, A., Banner, C.D.B., Loaick, R. and Fltz-Jaaea, P.C. 1981. J. Baoterlol.. 148:341-351.

ββ 101720 11. Sadaie, Y., Burtls, K.C. and Doi, R. 1980. J. Bacterlol.. 141 :1178-1182.

12. Queen, C. 1983. J. Applied Molecular Genetics, 2.:1-10.

13. Ferrari·, F.A., Trach, K. and Hoch, J.A. 1985. J. Bacterlol., 161 :556-562.

14. Johnson, W.C., Moran, C.P. and Loslck, T.R. 1983. Nature (London), 302:800-804.

15. Studier, W.F. and Moffat, B.A. 1986. J. Mol·; ·

Biol.. 189:113-130.

16. Goldfarb, O.S., Doi, R.H. and Rodriguez, R.L.

1981. Mature (London). 293:309-311« 17. -Ferrari, F.A., Nguyen, A., Lang, D. and Koch, J.A.

1983. J. Bacterlol.. 154:1513-1515.

18. Lacey, R.W. and Chopra, I. 1974. J. Med.

Microbiology. 7.:285-297.

19. Norrander, J., Keeps, T. and Messing, J. 1983·

Gene. 26:101-106 20. Sanger, F., Nlcklen, S. and Coulson, A.R. 1977.

Prop. Matl. Acad. Sol. 0SA. 74:5463-5467.

21. Biggin, M.D., Gibson, T.J. and Hong, G.F. 1983.

Proc. Natl. Acad. Scl. USA, 80:3963-3965.

22. Zagursky, R.J., Baumeister, K., Lomax, N. and Bernan, M.L. 1985. Gene Anal. Techn., 2.:89-94.

♦ * 69 101720 23. Sanger, F. and Coulaon, A.R. 1978. FEBS Letters, 87:107-110.

24. Sadler, J.R., Techlenburg, M. and J. L. Betz.

I960. Plasmids containing many tandem copies of a synthetic lactose operator. Gene 8.:279-300.

Kaikki julkaisut ja patenttihakemukset, jotka on mainittu tässä selityksessä, osoittavat sen alan ammattimiesten taidon määrää, johon tämä keksintö kuuluu. Kaikki julkaisut ja patenttihakemukset on liitetty tähän viitteenä samassa määrin, kuin jos jokainen yksittäinen julkaisu tai patenttihakemus olisi erityisesti ja yksittäisesti liitetty tähän viitteenä.

Keksinnön nyt tultua täysin kuvatuksi on alan ammattimiehelle ilmeistä, että monia muutoksia ja muunnoksia voidaan siihen tehdä poikkeamatta mukana olevien vaatimusten hengestä tai piiristä.

Claims

101720

1. DNA-sekvenssi, joka koodittaa peptidiä, joka sisältää toistuvan oligopeptidiyksikön, joka toistuva yksikkö on tunne t t u siitä, että se sisältää ainakin kolme eri aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, että peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa kussakin toistuvassa yksikössä ja jossa yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan liittämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraavan kaavan mukainen: Kk (WMXxNYy) iLx jossa: K ja L ovat kumpikin DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat aminohapposekvenssiä, jossa on noin 1-100 aminohappoa, K:n ja L:n muodostaessa vähemmän kuin noin 20 % aminohappojen kokonaislukumäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; W on seuraavan kaavan mukainen: [(A). (B)p]q A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-sikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koodittaessa identtistä aminohappoa toistuvissa yksiköissä, jotka ovat erilaisia, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta eroten toisistaan ainakin yhden nukleotidin suhteen; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta oligopeptidiyksikköä kuin jota A koodittaa ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B:n yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; 101720 n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja g on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa ainakin 90 nukleotidin DNA-sekvenssin; M ja N ovat samoja tai erilaisia ja ovat kodonien DNA-sekvens-si ja ovat 0-18 nukleotidia lukuvaiheistuksessa vastaavasti W:n ja X:n kanssa; X on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen: CU1) 1 (B1) , n1 p' q Y on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen: CU1) 2(b1) 2] 2 n P* jossa: kaikki symbolit tulevat niiden kirjainparien määritelmistä; x ja y ovat 0 tai 1; i on 1-100; ja q:n, qJ:n ja q1:n kokonaissumma on ainakin 1 eikä ole enempää kuin noin 50; ja että sekvenssin koodittaman polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal. DNA-sekvenssi, joka koodittaa peptidiä, joka sisältää toistuvan oligopeptidiyksikön, joka toistuva yksikkö on tunne t t u siitä, että se käsittää aminohapposekvenssin 101720 GAGAGS tai GVGVP, DNA-sekvenssin käsittäessä seuraavan kaavan: f(A)n(B)p]q jossa: A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-sikköä, jolloin kodonit ainakin kahdelle G:lie samoissa tai erilaisissa A:ssa ovat erilaiset, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:taf jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta oligopeptidiyksikköä kuin A-yksikkö ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 5-25; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja g on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvens-sin, joka on ainakin 90 nukleotidia; ja että sekvenssin koodittaman polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, jossa oligo-peptidi on GAGAGS ja B sisältää kodonin tyrosiinille.

4. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, jossa A on * seuraavan kaavan mukainen: GGTGCGGGCGCAGGAAGT.

5. Patenttivaatimuksen 3 mukainen DNA-sekvenssi, jossa A sisältää sekvenssin: GGT GCC GGC AGC GGT GCA GGA GCC GGT TCT GGA GCT GGC GCG GGC TCT GGC GCG GGC GCA GGA. 101720

6. Patenttivaatimuksen 2 mukainen DNA-sekvenssi, jossa oligo-peptidi on GVGVP.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen DNA-sekvenssi, jossa yksi A on seuraavan kaavan mukainen: GGTGTAGGCGTTCCG.

8. Polypeptidi, joka käsittää yhdistelmä-DNA-ilmentymistuot-teen DNA-sekvenssistä, joka koodittaa peptidiä, jossa on toistuvat oligopeptidiyksiköt, joka oligopeptidi on tunnet-t u siitä, että siinä on ainakin kolme erilaista aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, jolloin peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa kussakin toistuvassa yksikössä ja jolloin yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan yhdistämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraavan kaavan mukainen: Kk (ΝΜΧχΝΥ,) ^ jossa: K ja L ovat kumpikin DNA-sekvenssejä, jokta koodittavat noin . 1-100 aminohapon aminohapposekvenssiä, K:n ja L:n muodostaessa vähemmän kuin noin 20 % aminohappojen kokonaismäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; W on seuraavan kaavan mukainen: [(A)n(B)p]q A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa oligopeptidiyksikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koodattaessa identtisiä aminohappoja toistuvissa yksiköissä, jotka ovat erilaisia, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; 101720 B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta kuin A-yksikön koodittamaa oligopeptidiyksikköä ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja g on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvens-sin, joka on ainakin 90 nukleotidia; ja että polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen polypeptidi, jossa polypep-tidi sisältää toistuvana yksikkönä ainakin toisen GAGAGS:stä ja GVGVP:stä.

10. Peptidi, joka käsittää yhdistelmä-DNA-ilmentymistuotteen DNA-sekvenssistä, joka koodittaa peptidiä, jossa on toistuvina yksikköinä oligopeptidi, joka oligopeptidi on tunnettu siitä, että siinä on ainakin kolme erilaista aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, jolloin peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa kussakin toistuvassa yksikössä ja jossa yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan yhdistämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraa-van kaavan mukainen: KJCAUB),]^ jossa: 101720 K ja L ovat molemmat DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat noin 1-100 aminohapon aminohapposekvenssiä, K:n ja L:n muodostaessa vähemmän kuin noin 20 % aminohappojen kokonaislukumäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-sikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koodittaessa identtisiä aminohappoja toistuvassa yksikössä, joka on erilainen, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta kuin A-yksikön koodittamaa oligopeptidiyksikköä ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvens-sin, joka on ainakin 90 nukleotidia. ja että polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal.

11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen polypeptidi, jossa A koodittaa GAGAGS:ää tai GVGVP:tä. ·· 12. Prokaryoottinen isäntä, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen DNA-sekvenssin.

13. Menetelmä peptidin tuottamiseksi, joka sisältää yhdistel-mä-DNA-ilmentymistuotteen DNA-sekvenssistä, joka koodittaa peptidiä, jolla on toistuvia oligopeptidiyksiköitä, joka oli-gopeptidi on tunnettu siitä, että siinä on ainakin kolme erilaista aminohappoa ja kaikkiaan 4-30 aminohappoa, ja 101720 mainitussa peptidissä on ainakin kaksi toistuvaa yksikköä ja ainakin kaksi identtistä aminohappoa jokaisessa toistuvassa yksikössä ja jossa yksiköt ovat valinnaisesti aminohapposillan yhdistämiä, jossa on noin 1-15 aminohappoa, DNA-sekvenssin ollessa seuraavan kaavan mukainen: MWMX^hLi jossa: K ja L ovat kumpikin DNA-sekvenssejä, jotka koodittavat noin 1-100 aminohapon aminohapposekvenssiä, K:n ja L:n käsittäessä vähemmän kuin 20 % aminohappojen kokonaislukumäärästä; k ja 1 ovat 0 tai 1; W on seuraavan kaavan mukainen: [ (A) n (B) p ] q A on DNA-sekvenssi, joka koodittaa toistuvaa oligopeptidiyk-sikköä, jossa A sisältää noin 12-90 nukleotidia, ainakin kahden kodonin koodittaessa identtisiä aminohappoja toistuvassa yksikössä, joka on erilainen, jolloin on ainakin kaksi erilaista A:ta, jotka eroavat toisistaan ainakin yhdessä nukleotidissa; B on DNA-sekvenssi, joka on erilainen kuin A ja joka koodittaa muuta kuin A-yksikön koodittamaa oligopeptidiyksikköä ja jossa on noin 3-45 nukleotidia, jolloin B-yksiköt voivat olla samoja tai erilaisia; n on kokonaisluku alueella 1-100; kukin p on itsenäisesti 0 tai 1; ja q on ainakin 1 ja on valittu siten, että se antaa DNA-sekvenssin, joka on ainakin 90 nukleotidia; 101720 M ja N ovat samoja tai erilaisia ja ovat kodonien DNA-sekvens-si ja ovat 0-18 nukleotidia lukuvaiheistuksessa vastaavasti W:n ja X:n kanssa, koodittaen aminohapposekvenssiä; X on sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen : CC A1 ) ,(B1) ,] . n' p1 q' Y ön sama tai erilainen kuin W ja on seuraavan kaavan mukainen: CCA2)n2(B2) 2] 2 P A jossa: kaikki symbolit ovat kirjainparien määritelmien mukaiset; x ja y ovat 0 tai 1; i on 1-100; ja q:n, q::n ja q2:n kokonaissumma on ainakin 1 eikä ole enempää kuin noin 50; ja että sekvenssin koodittaman polypeptidin massa on vähintään n. 10 kDal; menetelmän käsittäessä: patenttivaatimuksen 12 mukaisen prokaryoottisen isännän kasvattamisen, jossa DNA-sekvenssi on isännässä toimivien aloituksen ja lopetuksen säätelyalueiden transkriptionaalisessa ja translatio-naalisessa säätelyssä, jolloin peptidi ilmentyy; ja 101720 ilmentymistuotteen eristämisen.

14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen.menetelmä, tunnettu siitä, että peptidi käsittää ainakin yhden toistuvista yksiköistä GAGAGS ja GVGVP. 1 < i 79 1 0 1 7 2 0