JP2003529530A - キサントモナス・カンペストリスに由来する過敏感反応エリシター - Google Patents

キサントモナス・カンペストリスに由来する過敏感反応エリシター

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JP2003529530A
JP2003529530A JP2000574710A JP2000574710A JP2003529530A JP 2003529530 A JP2003529530 A JP 2003529530A JP 2000574710 A JP2000574710 A JP 2000574710A JP 2000574710 A JP2000574710 A JP 2000574710A JP 2003529530 A JP2003529530 A JP 2003529530A
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、単離されたキサントモナス・カンペストリスの過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを目的とする。本発明の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドおよびこれらをコードする単離DNA分子は、次のような活性を有する。すなわち、病害に対する抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および/または植物において害虫を防除する。これは、病害に対する抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および/または植物もしくは種子から生長した植物において害虫を防除するのに有効な条件下で、過敏感反応エリシターを非感染状態の植物または植物種子に適用することによって達成される。もしくは、エリシターをコードするDNA分子で形質転換されたトランスジェニック植物または植物種子を作製し、該トランスジェニック植物または該植物種子から得られる植物を、病害に対する抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および/または植物もしくは種子から生長した植物において害虫を防除するのに有効な条件下で生長させる。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、1998年10月5日に出願の米国特許仮出願第60/103,124号の恩典を主
張するものである。
【０００２】発明の分野 本発明は、キサントモナス・カンペストリス（Xanthomonas Campestris）由来
の過敏感反応エリシターに関する。
【０００３】発明の背景 病原菌とその植物宿主の間の相互作用は、一般に次の２つの範疇に収まる：(1
)適合性（病原菌−宿主）、宿主植物における、細胞内細菌増殖、徴候発現およ
び病気の発症につながる；および(2)不適合性（病原菌−非宿主）、過敏感反応
をもたらし、病気の徴候の進行を伴うことなく、特定の型の不適合性の相互作用
が生じる。宿主植物との適合性のある相互作用の間には、細菌数は劇的に増加し
、かつ進行性の徴候が生じる。不適合性の相互作用の間には、細菌数は増加せず
、かつ進行性の徴候も生じない。
【０００４】 過敏感反応は、多くの病原菌に対する植物の能動的防御に関連している急性の
局所的壊死である（Kiraly, Z.、「侵略者によって惹起された防御：過敏感（De
fenses Triggered by the Invader:Hypersensitivity）」、201〜224頁、Plant Disease:An Advanced Treatise 、第5巻、J.G. HoesfallとE.B. Cowlingの編集、
アカデミックプレス社、ニューヨーク、1980年；Klement, Z.、「過敏感(Hypers
ensitivity)」、149〜177頁、Phytopathogenic Prokaryotes、第2巻、M.S. Moun
tとG.H. Lacyの編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク、1982年）。細菌に
よって誘起された過敏感反応は、高濃度の（≧107細胞／ml）シュードモナス・
シリンガエ(Pseudomonas syringae)またはエルウィニア・アミローボラ(Erwinia
amylovora)のような宿主範囲が限定された病原菌が非宿主植物の葉へと浸潤す
る場合に、組織の崩壊として容易に認められる（低濃度の接種では単離された植
物細胞においてのみ壊死が生じる）（Klement, Z.、「植物病原菌シュードモナ
スの病原性の迅速な検出（Rapid Detection of Pathogenicity of Phytopathoge
nic Pseudomonads）」、Nature、199:299-300；Klementら、「タバコ葉における
植物病原菌によって誘導された過敏感反応（Hypersensitive Reaction Induced
by Phytopathogenic Bacteria in the Tabacco Leaf）」、Phytopathology、54:
474-477(1963)；Turnerら、「過敏感反応に関連した植物と細菌細胞の間の量的
関係（The Quantitative Relation Between Plant and Bacterial Cells Involv
ed in the Hypersensitive Reaction）」、Phytopathology、64:885-890(1974)
；Klement, Z.、「過敏感（Hypersensitivity）」、Phytopathogenic Prokaryot es 、149〜177頁、第2巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、アカデミックプレス社、
ニューヨーク、1982年）。非宿主において過敏感反応を誘起する能力と宿主にお
いて病原性となる能力は関連しているように見える。Klement, Z.の論文（「過
敏感（Hypersensitivity）」、Phytopathogenic Prokaryotes、149〜177頁、第2
巻、M.S.MountとG.H.Lacyの編集、アカデミックプレス社、ニューヨーク）に記
されたように、これらの病原菌は更に、適合宿主との相互作用において、遅延型
ではあるが生理学的に類似した壊死も生じる。更に過敏感反応または病原性を生
じる能力は、hrpと称される共通の遺伝子セットに依存している（Lindgren, P.B
.ら、「マメ科植物の病原性および非宿主植物の過敏感を制御するシュードモナ
ス・シリンガエ病原型ファセオリコラの遺伝子クラスター（Gene Cluster of Ps
eudomonas syringae pv.'phaseolicola' Controls Pathogenicity of Bean Plan
ts and Hypersensitivity on Nonhost Plants）」、J. Bacteriol.、168:512-22
(1986)；Willis, D.K.ら、「植物病原菌のhrp遺伝子（hrp Genes of Phytopatho
genic Bacteria）」、Mol.Plant-Microbe Interact.、4:132-138(1991)）。結論
としては、過敏感反応は、植物防御の性質および細菌の病原性の基本の両方につ
いての手がかりとなり得る。
【０００５】 hrp遺伝子は、グラム陰性の植物病原菌に広範に存在し、ここでこれらはクラ
スター化され、保存され、一部は相互交換可能である（Willis, D.K.ら、「植物
病原菌のhrp遺伝子(hrp Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、Mol.Plant-Mi crobe Interact. 、4:132-138(1991)；Bonas, U.、「植物病原菌のhrp遺伝子(hrp
Genes of Phytopathogenic Bacteria)」、79〜98頁、Current Topics in Micro biology and Immunology:Bacterial Pathogenesis of Plants and Animal-Molec ular and Cell Mechanisms 、J.L. Dangle編集、スプリンガー−ベルラグ社、ベ
ルリン(1994)）。いくつかのhrp遺伝子は、エルシニア、シゲラ、およびサルモ
ネラ種が動物の病気に必須のタンパク質を分泌する際に使用するものに類似した
タンパク質分泌経路の成分をコードしている（Van Gijsegemら、「植物と動物の
病原菌の間の病原性の決定因子の発展的保存（Evolutionary Conservation of P
athogenicity Determinats Among Plant and Animal Pathogenic Bacteria）」
、Trends Microbiol.、1:175-180(1993)）。E.アミローボラ、P.シリンガエおよ
びP.ソラナセアラム(P. solanacearum)において、hrp遺伝子は、過敏正反応のグ
リシンが豊富なタンパク質エリシターの産生と分泌を制御することが示された（
He, S.Y.ら、「シュードモナス・シリンガエ病原型シリンガエ・ハーピンPss：H
rp経路によって分泌され、植物の過敏感反応を誘起するタンパク質（Pseudomona
s Syringae pv. Syringae HarpinPss : a Protein that is Secreted via the H
rp Pathway and Elicits the Hypersensitive Response in Plants）」、Cell、
73:1255-1266(1993)；Wei, Z.M.ら、「エルウィニア・アミローボラのHrpIは、
ハーピン分泌に機能し、かつ新たなタンパク質ファミリーである(HrpI of Erwin
ia amylovora Functions in Secretion of Harpin and is a Member of a New P
rotein Family)」、J.Bacteriol.、175:7958-7967(1993)；Arlat, M.ら、「ペチ
ュニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質であるPopA
1は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される(PopA1, a
Protein Which Induces a Hypersensitive-like Response on Specific Petunia
Genotypes, is Secreted via the Hrp Pathway of Pseudomonas solanacearum)
」、EMBO J.、13:543-553(1994)）。
【０００６】 これらのタンパク質は最初に、バラ科の植物日焼けを引き起こす細菌であるE.
アミローボラにおいて見出され、ハーピン（harpin）と称された（Wei, Z.M.ら
、「植物病原菌エルウィニア・アミローボラによって産生される過敏感反応エリ
シターであるハーピン(Harpin, Elicitor of the Hypersensitive Response Pro
duced by the Plant Pathogen Erwinia amylovora)」、Science、257:85-88(199
2)）。hrpN遺伝子をコードしている変異は、E.アミローボラが非宿主であるタバ
コの葉において過敏感反応を誘起し、かつ非常に罹病性であるナシ果実において
病気の徴候を刺激するためにハーピンが必要とされることを明らかにした。P.ソ
ラナセアラムGMI1000 PopA1タンパク質は、同様の生理的特性を有し、同じくこ
の菌株の宿主ではないタバコの葉において過敏感反応を誘起する（Arlatら、「
ペチュニアの特定の遺伝子型において過敏感様反応を誘起するタンパク質である
PopA1は、シュードモナス・ソラナセアラムのHrp経路によって分泌される」、EM BO J. 、13:543-53(1994)）。しかし、P.ソラナセアラムpopA変異株は、依然タバ
コにおいて過敏感反応を誘起し、かつトマトにおいて病気を刺激する。従って、
これらのグリシンが豊富な過敏感反応エリシターの役割は、グラム陰性植物病原
菌において広範に変動し得る。
【０００７】 別の植物病原性の過敏感反応のエリシターが単離され、クローニングされ、か
つ配列決定されている。これらは以下を含む：エルウィニア・クリサンセミ(Eew
inia chrysanthemi)（Bauerら、「エルウィニア・クリサンセミのハーピンEch：
腐朽病原菌(Erwinia chrysanthemi HarpinEch : Soft-Rot Pathogenesis)」、MP MI 、8(4):484-91(1995)；エルウィニア・カロトボーラ(Erwinia carotovora)（C
uiら、「エルウィニア・カロトボーラ亜種カロトボーラ菌株Ecc71のRsmA-変異株
は、タバコの葉でhrpNEccを過剰発現し、過敏感反応様反応を誘起する(The RsmA- Mutants of Erwinia carotovora subsp. carotovora Strain Ecc71 Overexpre
ss hrpNEcc and Elicit a Hypersensitive Reaction-like Response in Tabacco
Leaves)」、MPMI、9(7):565-73(1966)；エルウィニア・ステワルティイ(Erwini
a stewartii)（Ahmadら、「ハーピンはエルウィニア・ステワルティイのトウモ
ロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessary for the Patho
genicity of Erwinia stewartii)」、8th Int'l Cong. Molec. Plant-Microb. I nter 、1996年7月14-19日、およびAhmadら、「ハーピンはエルウィニア・ステワ
ルチのトウモロコシに対する病原性には不要である(Harpin is not Necessary f
or the Pathogenicity of Erwinia stewartii on Maize)」、Ann.Mtg.AmPhytopa th.Soc. 、1996年7月27-31日）；および、シュードモナス・シリンガエ病原型シ
リンガエ（コーネル研究財団(Cornell Research Foundation, Inc.)に付与され
た国際公開公報第94/26782号））。
【０００８】 本発明は、さらに別の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを
同定する。
【０００９】発明の概要 本発明は、単離されたキサントモナス・カンペストリスの過敏感反応エリシタ
ータンパク質またはポリペプチドを目的とする。
【００１０】 本発明の過敏感反応エリシターは、植物に用いる場合には、次のような活性を
有する。すなわち、病害に対する抵抗性を植物に付与し、植物の生長を促進し、
および/または害虫を防除する。このことは、非感染型の過敏感反応エリシター
タンパク質またはポリペプチドを、病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、
および／または植物上または植物種子から生育させた植物上で昆虫を防除するの
に有効な条件下で、植物または植物種子に適用することに関する。
【００１１】 病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上で昆虫を防
除するためにグラム陽性過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを
植物体または植物種子に適用する代わりに、トランスジェニック植物または植物
種子を利用することができる。トランスジェニック植物を利用する場合は、これ
はグラム陽性過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドをコードして
いるDNAで形質転換されたトランスジェニック植物を提供すること、および病気
抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物上または植物種子か
ら生育した植物において昆虫を防除するのに有効な条件下で植物を生育すること
に関連している。または、グラム陽性過敏感反応エリシタータンパク質またはポ
リペプチドをコードしているDNA分子で形質転換されたトランスジェニック植物
種子を提供し、土壌中に植えることができる。その後植物は、病気抵抗性を付与
し、植物の生育を強化し、および／または植物上または植物種子から生育した植
物上の昆虫を防除するのに有効な条件下で繁殖される。
【００１２】発明の詳細な説明 本発明は、単離されたキサントモナス・カンペストリスの過敏感反応エリシタ
ータンパク質またはポリペプチドを目的とする。
【００１３】 本発明の過敏感反応エリシターは、植物に用いる場合には、次のような活性を
有する。すなわち、病害に対する抵抗性を植物に付与し、植物の生長を促進し、
および/または害虫を防除する。これは、病害に対する抵抗性を付与し、植物の
生長を促進し、および/または植物もしくは種子から生長する植物に害虫が付く
のを抑制するのに有効な条件下で、過敏感反応エリシターを非感染状態の植物も
しくは植物種子に適用する段階を含む。
【００１４】 病害に対する抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および/または植物、ト
ランスジェニック植物もしくは種子において害虫を防除する目的で、植物または
植物種子に過敏感反応エリシターを適用する別の方法を用いることもできる。ト
ランスジェニック植物を使用する場合、この方法は、本発明のキサントモナス・
カンペストリス過敏感反応エリシタータンパク質もしくはポリペプチドをコード
するDNA分子で形質転換されたランスジェニック植物を作製し、この植物を、病
害に対する抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および/または植物もしくは
種子から生長する植物において害虫を防除するのに有効な条件下で生長させる段
階を含む。または、こうした過敏感反応エリシターをコードするDNA分子で形質
転換したトランスジェニック植物を調製し、土壌に植え込むこともできる。次に
、病害に対する抵抗性を付与し、植物の生長を促進し、および/または植物もし
くは種子から生長する植物において害虫を防除するのに有効な条件下で植物を繁
殖させる。
【００１５】 キサントモナス・カンペストリスに由来する過敏感反応エリシタータンパク質
もしくはポリペプチドは、配列番号：1のアミノ酸配列を有する。これは、下記
の配列である。 この過敏感反応エリシタータンパク質もしくはポリペプチドの分子量は、13〜15
kDaである。
【００１６】 前述の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の断片も、本発明
に含まれている。
【００１７】 適当な断片を、いくつかの方法によって作出することができる。まず、通常の
分子遺伝学的操作によって遺伝子断片をサブクローニングして、既知のエリシタ
ータンパク質をコードする遺伝子のサブクローンを作り出す。そして、このサブ
クローンを、インビトロ、または細菌細胞の中でインビボで発現させ、下記で説
明する手順にしたがって、エリシター活性について調べることのできる比較的小
さなタンパク質またはペプチドを得る。
【００１８】 または、キモトリプシン、スタフィロコッカスプロテイナーゼA、またはトリ
プシンなどのタンパク質分解酵素によって、全長のエリシタータンパク質を消化
して、エリシタータンパク質の断片を作出することができる。異なったタンパク
質分解酵素は、エリシタータンパク質のアミノ酸配列にもとづいて、異なった部
位でエリシタータンパク質を切断する可能性が高い。タンパク質分解によって生
じる断片のいくつかが、抵抗性の活性エリシターである可能性がある。
【００１９】 別の方法において、タンパク質の一次構造に関する知識に基づいて、タンパク
質の特定の部位を表すよう選択された特異的なプライマーセットとともに、PCR
技術を用いて、エリシタータンパク質遺伝子の断片を合成することができる。そ
して、短くなったペプチドまたはタンパク質を発現させるために、適当なベクタ
ーの中に、これらをクローニングすることができる。
【００２０】 化学合成を用いて、適当な断片を作成することもできる。このような合成は、
産生されるエリシターに対する既知のアミノ酸配列を用いて行われる。または、
全長エリシターを高温高圧にかけると断片ができる。そして、これらの断片を、
常法（例えば、クロマトグラフィー、SDS-PAGE）によって分離できる。
【００２１】 変異型は、例えば、ポリペプチドの特性、二次構造、および水感応性に最小限
の影響しか与えないようなアミノ酸を欠失または付加することにより作製できる
。例えば、ポリペプチドには、タンパク質のN末端に、翻訳と同時に、または翻
訳後にタンパク質の移行を指令するシグナル（または先導）配列を結合させるこ
とができる。また、ポリペプチドには、ポリペプチドの合成、精製、または同定
を容易にするためのリンカー、またはその他の配列を結合させてもよい。
【００２２】 本発明の過敏感反応エリシターは好ましくは単離された形態であり（すなわち
その宿主キサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas campestris)から分離さ
れている）、より好ましくは、従来からの技術によって、（好ましくは、少なく
とも約60%、より好ましくは80%純粋な）精製された形で製造される。典型的には
、本発明の過敏感反応エリシターは、産生されても組換え宿主細胞の増殖培地中
には分泌されない。または、本発明のタンパク質またはポリペプチドは、増殖培
地中に分泌される。タンパク質が分泌されない場合、タンパク質、すなわち過敏
感反応エリシターを単離するために、組換えプラスミドをもつ宿主細胞（例えば
、大腸菌）を増殖させ、音波処理、加熱、もしくは化学処理によって溶菌し、こ
のホモジネートを遠心分離して、細菌のデブリを取り除く。次に、上清を加熱処
理して過敏感反応エリシターを遠心により分離する。過敏感反応エリシターを含
む上清画分を、適当なサイズのデキストランまたはポリアクリルアミドカラムで
ゲル濾過して、断片を分離する。必要ならば、イオン交換またはHPLCによって、
このタンパク質画分をさらに精製することができる。
【００２３】 従来からの組換えDNA技術を用いて、細胞の中に過敏感反応エリシターポリペ
プチドまたはタンパク質をコードするDNA分子を取り込むことができる。一般的
に、これには、そのDNA分子が異種的である（すなわち、通常は存在しない）発
現システムの中にDNA分子を挿入することが含まれる。異種性のDNA分子を、セン
ス鎖方向で、かつ正しい読み枠にはまるよう、発現システムまたはベクターの中
に挿入する。このベクターは、挿入されたタンパク質をコードする配列の転写お
よび翻訳に必要な因子を含んでいる。
【００２４】 コーエンとボイヤー（Cohen and Boyer）に付与された米国特許第4,237,224号
は、参照として本明細書に組み入れられるが、制限酵素切断、およびDNAリガー
ゼによるライゲーションを用いて、組換えプラスミドという形での発現システム
の作成を記載している。そして、これらの組換えプラスミドを、形質転換という
方法で導入し、原核生物、および組織培養で増殖させた真核生物細胞などの単細
胞培養で複製させる。
【００２５】 組換え遺伝子は、ワクシニアウイルスなどのウイルスの中に導入することもで
きる。組換えウイルスは、ウイルス感染した細胞の中にプラスミドをトランスフ
ェクション（transfection）することによって作成することができる。
【００２６】 適当なベクターには、以下のウイルスベクターが含まれるが、これらに限定さ
れない。すなわち、gt11、gt WES.tB、Charon 4などのラムダベクターシステム
、また、pBR322、pBR325、pACYC177、pACYC1084、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、p
LG339、pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/- またはKS +/- （
カリフォルニア州ラホヤ（La Jolla）にあるストラタジーン社（Stratagene）の
「ストラタジーンクローニングシステム（Stratagene Cloning Systems）」カ
タログ（1993）参照。このカタログは、参照として本明細書に組み入れられる）
、pQE、pIH821、pGEX、pETシリーズ（F. W. Studierら、「クローニングした遺
伝子を発現させるためのT7RNAポリメラーゼの使用（Use of T7 RNA Polymerase
to Direct Expression of Cloned Genes）」、Gene Expression Technology vol
. 185 (1990)を参照のこと。この論文は、参照として本明細書に組み入れられる
）などのプラスミドベクター、および、これらから派生したもの。組換え分子は
、形質転換、特に、形質導入、接合、可動化、またはエレクトロポレーションに
よって、細胞の中に導入できる。参照として本明細書に組み入れられる、サムブ
ルック（Sambrook）ら、（分子クローニング：実験マニュアル（Molecular Clon
ing. A Laboratory Manual）、Cold Springs Laboratory, Cold Spring Harbor,
NY (1989））によって説明されているような、当技術分野において標準的なク
ローニング技術を用いて、DNA配列をベクターの中にクローニングする。
【００２７】 タンパク質をコードする配列を発現させるために、さまざまな宿主-ベクター
システムを利用することができる。まず、このベクターシステムは、用いられる
宿主細胞に親和性がなければならない。宿主-ベクターシステムには、以下のシ
ステムが含まれるが、これらに限定されない。すなわち、バクテリオファージDN
A、プラスミドDNA、またはコスミドDNAによって形質転換された細菌、酵母ベク
ターを含む酵母などの微生物、ウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、アデノ
ウイルスなど）に感染した哺乳動物細胞系、ウイルス（例えば、バキュロウイル
ス）に感染した昆虫細胞系、および細菌に感染した植物細胞。これらのベクター
の発現因子は、それらの強度および特異性において多様である。用いられる宿主
-ベクターシステムによって、多くの適当な転写因子および翻訳因子のいずれか
を用いることができる。
【００２８】 さまざまな遺伝子シグナルおよびプロセッシング事象によって、遺伝子発現（
例えば、DNA転写、およびメッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳）が、さまざまなレ
ベルで調節される。
【００２９】 DNAの転写は、RNAポリメラーゼを結合させ、それによってmRNA合成を促進させ
るDNA配列であるプロモーターの存在に依存している。真核生物のプロモーター
のDNA配列は、原核生物のプロモーターのDNA配列とは異なっている。さらに、真
核生物のプロモーターと、それにともなう遺伝子シグナルは、原核生物システム
の中では認識されないか、機能しない可能性がある。そして、さらに、原核生物
のプロモーターは、真核生物の細胞の中では認識もされなければ、機能もしない
。
【００３０】 同様に、原核生物におけるmRNAの翻訳は、真核生物のシグナルとは異なる、原
核生物の適正なシグナルが存在することに依存する。原核生物におけるmRNAの効
率的な翻訳には、mRNA上に、シャイン-ダルガーノ（「SD」）配列と呼ばれるリ
ボソーム結合部位が必要である。この配列は、タンパク質のアミノ末端のメチオ
ニンをコードする、通常はAUGの開始コドンの前に存在するmRNAの短いヌクレオ
チド配列である。SD配列は、16S rRNA（リボソームRNA）の3'末端に相補的であ
り、恐らく、rRNAと二本鎖を形成することによって、リボソームが正しい位置に
なるようにして、mRNAがリボソームに結合するのを促進すると考えられる。遺伝
子発現を最大にすることに関する総説は、参照として本明細書に組み入れられる
、ロバートとロウアー（Robert and Lauer）、Methods in Enzymology, 68:473
(1979)を参照のこと。
【００３１】 プロモーターの「強度」（すなわち、転写を促進する能力）はさまざまである
。クローニングされた遺伝子を発現させるために、転写のレベルを高くして、そ
れによって遺伝子発現レベルを上げるためには、強いプロモーターを使用するこ
とが望ましい。使用する宿主細胞システムによって、数ある適当なプロモーター
のいずれか一つを用いることができる。例えば、大腸菌、そのバクテリオファー
ジ、またはプラスミドにクローニングするときには、T7ファージプロモーター、
lacプロモーター、trpプロモーター、recAプロモーター、リボソームRNAプロモ
ーター、コリファージラムダのPR、およびPLプロモーター、ならびにその他、la
cUV5、ompF、bla、lppなどを含むが、これらに限定されないプロモーターを用い
て、隣接するDNAセグメントを高レベルで転写させることができる。さらに、雑
種trp-lacUV5（tac）プロモーター、または組換えDNAもしくはその他の合成DNA
技術によって作出された大腸菌プロモーターを用いて、挿入された遺伝子の転写
をもたらすことができる。
【００３２】 細菌の宿主細胞菌株と発現ベクターは、特異的な誘導があるまでは、プロモー
ターの作用を阻止するものを選ぶことができる。ある操作においては、挿入され
たDNAの転写を効率的に行うためには、特異的なインデューサーの添加が必要に
なる。例えば、lacオペロンは、ラクトースかIPTG（イソプロピルチオ-ベータ-D
-ガラクトシド）を加えることによって誘導される。その他、trp、proなど、さ
まざまなオペロンが、異なる調節の下にある。
【００３３】 また、原核生物細胞での効率的な遺伝子転写と翻訳には、特異的な開始シグナ
ルも必要とされる。これらの転写および翻訳開始シグナルは、それぞれ、遺伝子
特異的なメッセンジャーRNAと合成されたタンパク質の量で測定される「強度」
がさまざまである。プロモーターを含むDNA発現ベクターは、さまざまな「強い
」転写シグナルおよび/または翻訳開始シグナルを任意に組み合わせたものを含
んでいてもよい。例えば、大腸菌における効率的な翻訳には、リボソーム結合部
位を提供するために、開始コドン（「ATG」）から約7〜9塩基5'側にあるSD配列
が必要である。したがって、宿主細胞のリボソームによって利用できる、いかな
るSD-ATGの組み合わせも用いることができる。このような組合せには、コリファ
ージラムダのcro遺伝子もしくはN遺伝子由来のSD-ATGの組合せ、または大腸菌の
トリプトファンE、D、C、B、もしくはA遺伝子由来のSD-ATGの組合せが含まれる
が、これらに限定されない。さらに、組換えDNAまたは合成ヌクレオチドの組み
込みを含むその他の技術によって作出されたSD-ATGの組合せを用いることもでき
る。
【００３４】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコードする単離DNA分
子が、発現系にクローニングされたら、宿主細胞の中に取り込ませる準備ができ
たことになる。この取り込みは、ベクター/宿主細胞システムに応じて、上記し
たさまざまな形質転換の形で行うことができる。適当な宿主細胞には、細菌、ウ
イルス、酵母、哺乳動物細胞、昆虫、植物などが含まれるが、これらに限定され
ない。
【００３５】 本発明はさらに、植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／
または植物のための昆虫の防除に作用する方法に関する。これらの方法は、エリ
シターが病気の抵抗性を付与し、ストレス耐性を付与し、生育を増強し、および
／または昆虫を防除するために有効な条件下で、非感染型の本発明に係る過敏感
反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を、植物または植物種子の全部ま
たは一部に適用する。あるいは、過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペ
プチドは、このような植物自身から回収された種子が植物に病気抵抗性を付与し
、ストレス耐性を付与し、植物の生育を増強し、および／または昆虫の防除に作
用するように、植物に適用することができる。
【００３６】 植物に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または植物または
種子から生育した植物上で昆虫を防除するために過敏感反応エリシターポリペプ
チドまたはタンパク質を植物または植物種子に適用する代わりに、トランスジェ
ニック植物又は植物種子を利用することができる。トランスジェニック植物を利
用する場合は、これは過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質をコ
ードしているDNA分子（該断片は過敏感反応を誘起する）で形質転換されたトラ
ンスジェニック植物を提供すること、および病気抵抗性を植物に付与し、植物の
生育を強化し、および／または昆虫を防除するのに有効な条件下で植物を生育す
ることに関連している。または、本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドま
たはタンパク質をコードしているDNA分子で形質転換されたトランスジェニック
植物種子を提供または土壌中に植えることができる。その後植物は、植物に病気
抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または昆虫を防除するのに有効
な条件下で繁殖される。
【００３７】 本発明の過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質が植物または植
物種子に適用されるような態様は、いくつかの方法で行うことができ、これは以
下を含んでいる：1)単離された過敏感反応エリシターの適用；2)病気を引き起こ
さず、かつ該エリシターをコードしている遺伝子により形質転換された細菌の適
用。後者の態様においては、過敏感反応エリシタータンパク質もしくはポリペプ
チドをコードするDNA分子を含むバクテリアを利用して、該エリシターを植物も
しくは植物種子に適用することができる。このようなバクテリアは、該エリシタ
ーを細胞外へ分泌もしくは排出できるものでなければならず、その結果、該エリ
シターは、植物または植物種子細胞と接触することができる。これらの態様にお
いては、該エリシターは、植物もしくは種子に感染したバクテリアによって産生
されるものであるか、または植物もしくは植物種子に該バクテリアを導入する直
前にバクテリアによって産生されるものである。
【００３８】 本発明の方法を使用して、病気の抵抗性を付与する、生長を増強させる、およ
び／または昆虫を防除するために、さまざまな植物またはそれらの種子を処理す
ることができる。適当な植物には、双子葉類と単子葉類が含まれる。より具体的
には、有用な作物植物として、アルファルファ、イネ、コムギ、オオムギ、ライ
ムギ、ワタ、ヒマワリ、ラッカセイ、トウモロコシ、ジャガイモ、サツマイモ、
マメ、エンドウ、チコリ、レタス、エンダイブ、キャベツ、芽キャベツ、ビート
、パースニップ、カブ、カリフラワー、ブロッコリー、ラディッシュ、ホウレン
ソウ、タマネギ、ニンニク、ナス、コショウ、セロリ、ニンジン、カボチャ属、
カボチャ、ズッキーニ、キュウリ、リンゴ、ナシ、メロン、柑橘類、イチゴ、ブ
ドウ、ラズベリー、パイナップル、ダイズ、タバコ、トマト、ソルガム、および
サトウキビが含まれる。適当な観賞用植物の例は、シロイヌナズナ（Arabidopsi
s thaliana）、セントポーリア、ペチュニア、ペラルゴニューム、ポインセチア
、キク、カーネーション、およびジニアである。
【００３９】 病気抵抗性を付与する本発明の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペ
プチドの使用に関して、感染に対する絶対免疫は授けることができないが、この
病気に対する感受性は低下させられ、かつ徴候発現が遅延される。病巣数、病巣
の大きさ、および真菌病原体の胞芽形成の程度は全て減少される。この病気抵抗
性を付与する方法は、これまで治療することができなかった病気を治療し、費用
の点から個別に治療されなかった全身性病気を治療し、感染性薬剤および環境に
有害な物質の使用を回避する可能性がある。
【００４０】 本発明に従って植物に病原体抵抗性を付与する方法は、ウイルス、細菌および
真菌を含む広範な多様な病原体に対する抵抗性を付与するのに有用である。特に
下記のウイルスに対する抵抗性は、本発明の方法によって達成することができる
：タバコモザイクウイルスおよびトマトモザイクウイルス。特に下記の細菌に対
する抵抗性も、本発明に従って植物に付与することができる：シュードモナス・
ソランセアラム、シュードモナス・シリンガエ病原型タバシ(tabaci)、およびキ
サンタモナス・カンペストリス病原型ペラルゴニ(Xanthamonas campestris pv.
pelargoni)。本発明を使用することにより特に下記の真菌に対して植物を抵抗性
にすることができる：フサリウム・オキシプラム(Fusarium axysporum)およびフ
ィトフソラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)。
【００４１】 植物の生育を強化するための本発明の過敏感反応エリシタータンパク質または
ポリペプチドの使用に関して、様々な形の植物の生育強化または促進を行うこと
ができる。これは、植物の生育が種子から始まる場合はできるだけ早く、もしく
は植物生活環のより後期において引き起こすことができる。例えば、本発明の植
物の生育は、増量した収穫高、産生された種子量の増大、種子の発芽率の上昇、
植物丈の伸張、より大きい有機物量(biomass)、より多くかつ大きい果実、より
早期の果実の色付き、ならびにより早い果実および植物の成熟を含んでいる。結
果的には、本発明は、栽培者に著しい経済的利益をもたらす。例えば早期の発芽
および早い成熟は、生育期が短くその地域での生育が妨げられるような地域で作
物が生育できるようにする。種子の発芽率の上昇は、結果的に作物の株立本数(s
tand)を改善し、より効果的な種子の使用ができる。より多い収穫量、丈の伸張
および増強された有機物量生成は、所定の土地区画からのより多い収益形成を可
能にする。
【００４２】 本発明の別の局面は、何らかの形で、植物のために昆虫防除を行うことに関す
る。例えば、本発明に従った昆虫防除には、過敏感反応エリシターが適用されて
いる植物には昆虫が接触できなくなるようにすること、食害によって植物が直接
的な虫害を受けるのを阻止すること、このような植物から昆虫が離れていくよう
にさせること、このような植物のすぐ近くにいる昆虫を殺すこと、昆虫の幼虫が
このような植物を餌にするのを阻止すること、昆虫が宿主植物上でコロニーを形
成するのを阻止すること、コロニーを形成した昆虫がフィトトキシンを放出する
のを阻止することなどが含まれる。本発明は、昆虫の感染から、その後に生じる
植物の病害も防止する。
【００４３】 本発明は、広範な種類の昆虫に対して有効である。アワノメイガ(European Co
rn Borer)は、トウモロコシ（デントコーンおよびスイートコーン）の主要害虫
であるだけでなく、グリーンビーン、ワックスビーン(wax bean)、ライビーン、
食用ダイズ、コショウ、ジャガイモ、およびトマト、更に多くの草本種を含む20
0を超える植物種を餌にする。さまざまな野菜に損傷を与える別の食害虫の幼虫
は以下を含む：ビートアーミーワーム(beat armyworm)、キャベツルーパ(cabbag
e looper)、コーンイヤーワーム(corn earworm)、フォールアーミーワーム(fall
armyworm)、ダイヤモンドバックモス(diamondback moth)、キャベツルートマゴ
ット(cabbage root maggot)、オニオンマゴット(onion maggot)、シードコーン
マゴット(seed corn maggot)、ピックルワーム(pickleworm)（メロンワーム(mel
oneworm)）、ペッパーマゴット(pepper maggot)、トマトピンワーム(tomate pin
worm)およびマゴット（maggot）。この昆虫のグループは、集合的に、世界中の
野菜の生産にとって経済的に最も重要な害虫グループである。
【００４４】 過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質の適用に関する本発明の
方法は、葉、茎、根、栄養分体（例えば挿し木）、その他を含む、植物の全身ま
たは一部を処理するときに、さまざまな手順によって実施することができる。こ
れには、過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を植物の中に浸潤
させることが含まれていてもよい（しかしその必要はない）。適切な適用法には
、高圧または低圧の噴霧、注入、およびエリシターを適用する直前に葉の表皮を
剥脱することが含まれる。本発明の応用の態様に従って植物種子または繁殖材料
（例えば挿し木）を処理する場合は、低圧または高圧の噴霧、コーティング、浸
漬、または注入によって、本発明に係る過敏感反応エリシタータンパク質または
ポリペプチドを適用することができる。エリシターを植物または植物種子の細胞
に接触させることができるようにする、他の適当な適用手順を、当業者が考案す
ることも可能である。本発明の過敏感反応エリシターで処理したら、植物を生産
するための常法を用いて、種子を天然または人工の土に植えて栽培できる。本発
明に従って処理した種子から植物体を繁殖させた後、植物体に病気抵抗性を付与
し、植物の生育を強化し、および／または植物体上の昆虫を防除するために、過
敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質で植物体を１回以上処理する
ことができる。
【００４５】 本発明に係る過敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質は、単独で
、または他の物質と組み合わせて、植物または植物種子に適用することができる
。または、該エリシターは、異なった時機に適用される他の物質とは別に植物へ
適用することができる。
【００４６】 本発明の応用態様に従って植物または植物種子を処理するのに適した組成物は
、担体の中にか敏感反応エリシターポリペプチドまたはタンパク質を含んでいる
。適当な担体としては、水、水溶液、スラリー、または乾燥粉末などがある。本
態様において、この組成物は、500nMよりも多いエリシターを含む。
【００４７】 必要ではないが、この組成物は、肥料、殺虫剤、殺真菌剤、殺線虫剤、および
これらの混合物など、更に別の添加剤を含むことができる。適当な肥料としては
、(NH4)2NO3などがある。適当な殺虫剤の例はマラチオン(Malathion)である。有
用な殺真菌剤としては、キャプタン(Captan)などがある。
【００４８】 この他の適当な添加剤には、緩衝剤、湿潤剤、被覆剤、および摩砕剤などがあ
る。これらの素材を用いて、本発明の処理を容易にすることができる。さらに、
過敏感反応エリシターは、粘土および多糖類など、他の従来からある種子用調合
剤および処理剤とともに植物種子へ適用することができる。
【００４９】 トランスジェニック植物およびトランスジェニック種子を使用することを含む
本発明の代替的態様において、本発明の過敏感反応エリシターを植物または種子
に局所的に用いる必要はない。その代わりに、該エリシターをコードしているDN
A分子で形質転換されたトランスジェニック植物を、当該技術分野において周知
の処理法に従って作出する。
【００５０】 組換えDNAを機械的に移すために、前述のベクターを植物細胞にマイクロピペ
ットを用いて直接微量注入することができる（本明細書に参照として組入れられ
ているCrossway、Mol. Gen. Genetics.、202:179-85(1985)）。遺伝的材料は、
ポリエチレングリコールを用いて、植物細胞へ移すこともできる（本明細書に参
照として組入れられているKrensら、Nature、296:72-74(1982)）。
【００５１】 遺伝子で植物細胞を形質転換する別の方法は、宿主細胞のパーティクルガン法
（バイオリスティック形質転換としても公知）である。これは、いくつかの方法
のひとつで達成することができる。第一の方法は、細胞への不活性または生物学
的に活性の粒子の打ち込みに関する。この技術は、米国特許第4,945,050号、第5
,036,006号および第5,100,792号に開示されているが、これらは全てStanfordら
の特許であり、本明細書に参照として組入れられている。一般に、この手順は、
細胞外面を透過し、かつ細胞内に組込まれるのに有効な条件下で、細胞で不活性
または生物学的に活性の粒子を打ち込むことに関する。不活性粒子を利用する場
合は、粒子を異種DNAを含むベクターでコーティングすることにより、ベクター
を細胞内へ導入することができる。あるいは、標的細胞を、ベクターで取り囲み
、その結果ベクターが粒子の後を追って細胞へと運ばれるようにすることができ
る。生物学的に活性のある粒子（例えばベクターと異種DNAを含む乾燥した細菌
細胞）も植物細胞に打ち込むことができる。
【００５２】 更に別の導入法は、プロトプラストの、他の実体(entity)、ミニ細胞、細胞、
リソソームまたは他の融合可能な脂質表面を持つ本体のいずれかとの融合である
（本明細書に参照として組入れられているFraleyら、Proc. Natl. Acad. Sci. U
SA、79:1859-63(1982)）。
【００５３】 DNA分子は更に、電気穿孔により植物細胞へ導入することができる（本明細書
に参照として組入れられているFrommら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA、82:5824
(1985)）。この技術において、植物のプロトプラストは、発現カセットを有する
プラスミドの存在下で、電気穿孔される。高い電場強度の電気パルスは、プラス
ミドを導入できるように生体膜を可逆的に透過する。電気穿孔された植物のプロ
トプラストは、細胞壁を再構築し、分割され、かつ再生される。
【００５４】 植物細胞にDNA分子を導入する別の方法は、あらかじめ該遺伝子で形質転換さ
れたアグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)また
はA.リゾゲネス(A. rhizogenes)による植物細胞の感染である。当該技術分野に
おいて公知の適切な条件下で、形質転換された植物細胞は増殖し、徒長枝または
根を形成し、更に植物体へと成長する。一般にこの方法は、細菌浮遊液による植
物組織の接種、および組織の抗生物質を含まない再生培地上の25〜28℃での48〜
72時間の培養に関連している。
【００５５】 アグロバクテリウムは、リゾビアセアエ科のグラム陰性菌の代表的種である。
この種は、クラウンゴール（A.ツメファシエンス）および毛根の病気（A.リゾゲ
ネス）に寄与している。クラウンゴール腫瘍や毛根中の植物細胞は、細菌によっ
てのみ異化されるオパインとして公知のアミノ酸誘導体の生成が誘導される。オ
パインの発現に寄与している細菌遺伝子は、キメラ発現カセットの調節エレメン
トの都合の良い供給源である。これに加えて、オパインの存在をアッセイして、
形質転換された組織を同定することができる。
【００５６】 A.ツメファシエンスのTiプラスミドまたはA.リゾゲネスのRiプラスミドにより
、異種遺伝子配列を、適当な植物細胞に導入することができる。TiおよびRiプラ
スミドは、アグロバクテリウムに感染時に植物細胞に伝達され、植物ゲノムに安
定して導入される。本明細書に参照として組入れられているシェル（J.Schell）
、Science、237:1176-83(1987)。
【００５７】 形質転換後、形質転換された細胞は再生されなければならない。
【００５８】 培養したプロトプラストからの植物の再生は、エバンス（Evans）らの論文、
植物細胞培養ハンドブック（Handbook of Plant Cell Cultures、第1巻：マクミ
ラン出版社、ニューヨーク、1983年）；およびバシル（Vasil I.R.）編集の植物 細胞培養および植物体細胞遺伝学Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants 、アカデミックプレス社、オーランド、第1巻、1984年、および第3巻、19
86年）に記載されており、これらは本明細書に参照として組入れられている。
【００５９】 特にサトウキビ、テンサイ、ワタ、果樹、およびマメの全ての主要な種を含む
が、これに限定されるものではない、あらゆる植物が、培養された細胞または組
織から再生できることが公知である。
【００６０】 再生手段は、植物種毎に異なるが、一般に形質転換されたプロトプラストの浮
遊液または形質転換された外植片(explant)を含むペトリ皿が最初に提供される
。カルス組織が形成され、かつこのカルスから徒長枝が誘導され、次に根が生え
る。あるいは、胚の形成が、カルス組織において誘導される。これらの胚は天然
の胚のように発芽し、植物体を形成する。培地は一般に、オーキシンやサイトカ
インのような様々なアミノ酸およびホルモンを含むであろう。培地へのグルタミ
ン酸やプロリンの添加も、特にトウモロコシやアルファルファのような種におい
ては利点である。効率的再生は、培地、遺伝子型、および培養歴によって左右さ
れるであろう。これら3種の変数が制御できる場合は、従って再生は通常再現可
能かつ反復可能なものである。
【００６１】 発現カセットがトランスジェニック植物に安定導入された後、有性交配により
他の植物体へ転移することができる。多くの標準的繁殖技術のいずれかを、交配
される種に応じて使用することができる。
【００６２】 一旦この種のトランスジェニック植物が作出されると、植物体それ自身を常法
に従い、過敏感反応エリシターをコードしている遺伝子の存在下で、栽培するこ
とができ、その結果病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／または
植物上で昆虫を防除することができる。あるいは、トランスジェニック種子また
は繁殖材料（例えば挿し木）が、トランスジェニック植物から回収される。これ
らの種子は次に土壌に植え、常法により栽培し、トランスジェニック植物を作出
することができる。このトランスジェニック植物は、植えられたトランスジェニ
ック種子から、植物体に病気抵抗性を付与し、植物の生育を強化し、および／ま
たは昆虫を防除するような条件下で繁殖される。理論的裏付けを意図するもので
はないが、このような病気抵抗性、生育の強化および／または昆虫防除は、RNA
媒介型であるか、もしくは、エリシターポリペプチドまたはタンパク質の発現の
結果であることができる。
【００６３】 本発明にしたがってトランスジェニック植物および植物種子を用いるとき、本
発明に係る過敏感反応エリシターを適用した植物または種子を処理するために用
いた物質と同じもので、さらに、それらを処理することができる。これらの、本
発明に係る過敏感反応エリシターを含む他の物質を、高圧または低圧の噴霧、注
入、被覆、および浸漬を含む上記の処理法によって、トランスジェニック植物ま
たは植物種子に適用することができる。同様に、トランスジェニック植物種子か
ら植物体を繁殖させた後、病気への抵抗性を付与するため、生長を増強させるた
め、および／または昆虫を防除するために、本発明に従い過敏感反応エリシター
を1回または複数回適用して植物を処理することができる。従来からある植物処
理剤（例えば、殺虫剤、肥料など）で、これらの植物を処理することもできる。
【００６４】 実施例実施例1 −培養による増殖 本研究で用いるために、キサントモナス・カンペストリス・ペラルゴニイ(pel
argonii)(Xcp)をルリア寒天プレートで増殖させた。このプレートからコロニー
を移し取り、Xcpの培養シードを接種した。この培養シードを、50mLの50％ルリ
ア培地を含む250mLのバッフル付きフラスコで増殖させた。培養シードの増殖は
、250rpmで振盪しながら、約27℃の温度で培養液の吸光度(λ620)が0.5〜0.8に
達するまで行った。
【００６５】 最小培地に接種するために、500mLの遠心管を用い4℃で10分間、10,000rpmの
回転数で培養シードを遠心した。最小培地にルリア培地を持ち込まないように上
清を捨て、得られた細胞の沈殿を前もって用意した最小培地に再懸濁した。最小
培地に接種する場合にはいつも、培養シードと最小培地との比が1：10となるよ
うにした。言い換えれば、50mL培養シードから得られる細胞の沈殿物を500mLの
最小培地に接種した。最小培地培養物は、吸光度（λ620）が1.7〜2.0に達する
まで250rpmで攪拌した500ml培養液を含む2.8L Fernbachフラスコで約27℃にて増
殖させた。
【００６６】 このフラスコを用いて培養を十分行ったところで、発酵物を10LのMicroFermフ
ァーメンター(New Brunswick Scientific, Edison, New Jersey, USA)に移した
。10Lの発酵では、培養シード対最小培地の比を上記のような値に維持した。こ
の発酵は約27℃で行い、初期pHは6.0で、最終pHが5.8であった。培養容器を400r
pmで攪拌し、1分間当たり容器の80〜100％容量に相当する空気を吹き込んでエア
レーションを行った。
【００６７】 1Lの10X最小培地ストック溶液としては、39.2gのK2HPO4、71.5gのKH2PO4、10.
0gの(NH4)2SO4、3.5gのMgCl2、1.0gのNaCl、および34.23gのショ糖を含むものを
用いた。十分混合した後、最終pHを6.0〜6.2に調整した。このストック溶液は、
フィルター滅菌し、4℃に保存した。
【００６８】実施例2 −無細胞エリシターの調製 Xcp過敏感反応エリシターの精製の第一工程は、エリシターの無細胞系調製物(
「CFEP」)の作製であった。該CFEPの作製は下記の4工程からなる。
【００６９】 1. 一回目の遠心処理 一回目の遠心処理の工程では、最小培地で培養した細胞を370mLずつ分け、500
mLの遠心管で8,000rpm、4℃にて10分間遠心した。得られた細胞沈殿物を、溶解
バッファーを用いて1：10の重量対容量比で再懸濁した。溶解バッファーは、10m
M NaClおよび20mM Tris-HClから成り、そのpHは8.0であった。個々の遠心管をボ
ルテックスで撹拌して、細胞沈殿物を再懸濁した。10Lの発酵の場合には、ホモ
ゲナイザーを使用した。
【００７０】 2. 超音波破砕 次に、沈殿を再懸濁したものを、50mLの懸濁液に対し5の強度で3分間超音波破
砕した（用いたホーンチップは、VirTris, VirSonic）。超音波処理の間は、溶
液の入ったビーカーを氷水浴に浸漬して行った。全溶液の超音波破砕処理が終了
するまで、得られた超音波破砕物は氷上に置いた。用いた超音波破砕の設定条件
は、使用チップに関して製造元が示している最大強度であった。
【００７１】 3. 熱処理 超音波破砕物を、予め熱した撹拌プレートに載せ、回転させながら煮沸した。
この回転煮沸処理を5分間続けた。５分間の煮沸後、即座に溶液を氷水浴に置き
、約10℃まで冷やした。
【００７２】 4. 最終遠心処理 最終遠心処理の前に、煮沸による蒸発で失われた容量分を脱イオン水で補い、
冷やした溶液を元の容量に戻した。次に、該溶液を50mLの遠心管を用い、4℃で1
5,000 rpmにて30分間遠心した。各遠心管中の得られた上清を混合し、-80℃のフ
リーザーで凍結した。1mLの試料を予め取り分け、高感受性応答の活性に関する
試験に用いた。
【００７３】実施例3 −タンパク質の確認 過敏感反応エリシターが実際にタンパク質であるか否かを調べるために、CFEP
に対し、タンパク質分解酵素による消化を行った。上記のように調製したCFEPを
2mg/mlの濃度のプロテアーゼKを接種した。37℃で1.5時間インキュベートした後
、プロテアーゼ接種したCFEPを、陽性対照（CFEPのみ）および陰性対照（2mg/ml
のプロテアーゼKを含む溶解バッファー）とともに、タバコ植物体に浸潤させ、
過敏感反応エリシターに関する試験を行った。該陽性対照では高感受性応答の壊
死を起こし、陰性対照では変化が見られなかった。プロテアーゼK接種CFEPも高
感受性応答の兆候を示さなかった。このことは、Xcp過敏感反応エリシターが、
プロテアーゼ消化に感受性であり、間違いなくタンパク質であることを示すもの
である。この実験は、数回繰り返して行ったが、CFEPのバッチによる差はなく、
毎回同一の結果が得られた。
【００７４】実施例4 −クロマトグラフィーを用いた精製 過敏感反応エリシターCFEPの調製は、Xcp過敏感反応エリシターの精製スキー
ムにおける第一工程と同一に行った。エリシターをさらに精製したが、これは4
つのクロマトグラフィー工程から成る。過敏感反応エリシターの精製に用いるた
め、陰イオン交換、陽イオン交換、各種親和性クロマトグラフィー、疎水性相互
作用、および逆相クロマトグラフィーの担体を全て検討した。これら全てのクロ
マトグラフィー実験では、FPLC及びFPLC検出器（Pharmacia Biotech, Upsala, S
weden）を用いて行った。用いた最終的な精製スキームでは、過敏感反応エリシ
ターの疎水的な性質に基づき、Xcp過敏感反応エリシターに結合するクロマトグ
ラフィー担体を主に使用した。
【００７５】 1. ブチルセファロース まず、CFEPを中程度の強度の疎水性相互作用クロマトグラフィー担体に結合さ
せた。該CFEP溶液のNaCl濃度を600mMに調整し、ブチルセファロース4 Fast Flow
(Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)に載せた。このカラムを、バッファーB
の勾配が75〜100％の条件で溶出した。バッファーAの組成は、600mM NaCl、20mM
Tris-HCl（pH8）、バッファーBの組成は10mM Tris-HCl（pH8）であった。バッ
ファーBの勾配が85％のときに、バッファーBから脱イオン水に切り替えた。
【００７６】 2. Mono S ブチルセファロースカラムから溶出した過敏感反応エリシターの濃度が最大で
あると判断された（活性を有する画分の高感受性応答性に関する希釈系列を作製
して調べた）画分を集めてプールし、強力な陽イオン交換体であるMono S(Mono
S 10/10カラム； Pharmacia Biotech)に載せた。カラムに載せる前に、プールし
た画分の溶液をNaCl濃度が20mM、Tris-HClが20mMでpH5.5となるように調整した
。バッファーAは、20mM NaCl、20mM Tris-HClから成り、pH5.5のものを用いた。
また、バッファーBは1M NaCl、20mM Tris-HClで、pH 5.5のものを用いた。試料
をカラムに載せた後、0％バッファーBおよび100％バッファーBでそれぞれ洗浄し
た。過敏感反応エリシターは、Mono S担体には結合しなかったが、pH 5.5で試料
中の多くの夾雑物が結合した。従って、非結合性クロマトグラフィーとして利用
することができた。素通りした画分（過敏感反応エリシター画分）を集め、すぐ
にこの溶液のpHを8.0に調整した。
【００７７】 3. フェニルセファロース（低） 次に、このMono Sカラムの溶出活性画分を、低置換度のフェニルセファロース
6Fast Flow (弱い疎水性相互作用担体、Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)
に載せた。バッファーAの組成は、1M NaCl、20mM Tris-HClでpH 8であり、バッ
ファーBの組成は10mM Tris-HClでpHは8.0であった。上記と同様に、バッファーB
が85％の段階で、溶出液を脱イオン水に切り替えた。過敏感反応エリシターを含
む画分をバッファーBが100％濃度になるまで勾配をかけて溶出した。過敏感反応
エリシターを最も高い濃度で含む分画を、次の精製工程に用いた。活性を有する
画分が、脱イオン水で溶出されたので、この分画を安定化する必要があり、溶液
を20mM NaClおよび20mM Tris-HCl（pH8.0）に調整した。
【００７８】 4. 逆相クロマトグラフィー 過敏感反応エリシターの精製におけるクロマトグラフィーの最終的な工程では
、逆相カラム、ProRPC 5/5 (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden)を用いて行
った。試料溶液は15％アセトニトリル(HPLC等級)および0.1％TFA（HPLC等級）の
濃度に調整した。これをカラムに載せ、0.7ml/分の流速で溶出した。5mLの洗浄
溶出を行った後、15〜50％のB勾配をかけながら、0.7ml/分の流速で、58mL流し
た。勾配全体を、各1mLの画分で採取した。B勾配約25％のところにXcp過敏感反
応エリシターが溶出された。過敏感反応エリシターを含む画分は銀染色し、SDS-
PAGEゲル上で目視により確認した。目視確認後に、比較的純粋でエリシターを高
濃度で含む画分をプールし、前記の溶解バッファーで透析して、アセトニトリル
とTFAを除去した。次に、セントリコン3,000 MWCO（Amicon, Beverly. MA）を用
いて、この透析画分を約100倍濃縮した。
【００７９】実施例5 −Xcp過敏感反応エリシターの電気泳動による溶出 次に、この最終濃縮物を18％アクリルイミドを手動により注入したSDS-PAGEミ
ニゲルにて泳動した（ゲルを空のNovexゲルカセットに注ぎ込み、Novex X-Cell
装置（San Diego, CA）で泳動した）。ゲルの染色および脱色は、通常のクマシ
ーブルー染色法によって行った。かなり過剰にゲルに載せて電気泳動したために
、過敏感反応エリシターに相関するバンドが確認されゲルから切り出すことがで
きた。切り出したゲル断片をElutrap(Schleicher & Schuell, Keene, New Hamps
hire)に載せた。切り出したゲルからタンパク質を溶出し採取チャンバーに入れ
た。ElutrapではSDSを含まない貯蔵バッファーを用いたので、比較的SDS含量を
含まない試料が調製できた。得られた画分の一部を取り、16％のアクリルイミド
でミニゲル（Novexのゲルと電気泳動装置）のSDS-PAGEを行った。ゲルを銀染色
し、試料の純度を決定した。さらに、溶出画分の一部を取り、過敏感反応エリシ
ター希釈液の調製に用いた。この希釈液で、最終試料中の過敏感反応エリシター
の相対濃度を決定した。
【００８０】実施例6 −過敏感反応エリシターの可視化 Xcp過敏感反応エリシターの単離の際に遭遇する最も重大で問題となる性質は
、異常な染色特性であると考えられた。通常のクマシーブルー染色法で染色・脱
色を行ったSDS-PAGEのゲルでは、ゲルに極めて過剰のタンパク質を載せた場合に
のみ、過敏感反応エリシターのバンドが見られた。ゲルに過剰のタンパク質を載
せた条件のときでさえも、染色されたエリシターのバンドはかなり薄いが、一時
的にはある程度染色された。ゲルを完全に脱色すると、通常は、過敏感反応エリ
シターのバンドが次第に消えていった。銀染色法を用いた時にのみ、エリシター
が見かけ上、低濃度でもバンドを可視化することが可能であった。試料中の過敏
感反応エリシターの濃度に応じて、バンドは、（より高濃度の時）比較的辺縁が
明瞭な陰性染色されたバンドとして観察されるか、またはやや退色して、不明瞭
な辺縁のぼやけたほとんど影のようなバンドとして観察された。過敏感反応エリ
シターを可視化する際には常に、銀染色でSDS-PAGEゲルを使用したが、ゲルから
Eiutrapで電気泳動による溶出を行うとき、もしくはタンパク質をPVDF膜に転写
する時には、この染色を行わなかった。
【００８１】 SDS-PAGEゲルのクマシーブルーによる染色のときと同様に、PVDF膜のクマシー
ブルーによる染色では（該タンパク質のN末端配列の決定を行うために固定化し
た）、かなり過剰に載せた場合には非常に薄いバンドが観察された。通常量を用
いた場合には、明確なタンパク質のバンドは全く見られず、膜は一見したところ
透明なままであった。
【００８２】実施例7 −Xcp過敏感反応エリシターのN末端配列 エリシターの精製が成功したら、このタンパク質のN末端配列を調べることが
可能となった。精製Xcp過敏感反応エリシタータンパク質を、SDS-PAGEにかけた
。このゲルから、該タンパク質をトランスブロット(Bio-Rad, Hercules, CA)でP
VDF膜に転写した。該タンパク質を含むこの膜を、自動エドマン分解にかけ、高
速液体クロマトグラフィーで個々のアミノ酸の検出および同定を行った。Xcp過
敏感反応エリシターの最初の10アミノ酸を決定した：
【００８３】実施例8 −タバコおよびトマトの植物体におけるエリシター誘導性の病害耐性 キサントモナス・カンペストリス病原型ペラルゴニイの過敏感反応エリシター
を、タバコの植物体に約5ppmの濃度で噴霧した。この処理を施して3日後に、こ
の植物体に約2ppmの濃度でタバコモザイクウイルス（TMV）を接種した。接種の4
日後に、未処理の対照植物と比較して、エリシター処理を施した植物では、病変
の数が65％以上減少した。さらに、過敏感反応エリシターは、TMVに対する耐性
のみならず、トマトの青枯病に対する耐性も誘導した。
【００８４】実施例9 −過敏感反応エリシターによるトマトの生長促進の誘導 キサントモナス・カンペストリス病原型ペラルゴニイの過敏感反応エリシター
が、植物の生長を促進する可能性を調べるために、トマトの種子を約5ppmのエリ
シター溶液に4時間以上浸した。エリシタータンパク質を含まないこと以外は同
一の溶液に種子を浸して未処理の対照とした。これらの処理済み、および未処理
の種子の両方を、人工土壌を含む8インチのポットに、ポット当たり20種子の割
合で植えた。植え込みを行ってから20日後に、トマトの苗のサイズを測定した。
エリシター処理済み種子に由来する植物体では、未処理の種子から生長した植物
体と比較して、10％大きかった。
【００８５】 植物病原体キサントモナス・カンペストリス・ペラルゴニイから、タンパク質
性の過敏感反応エリシターをほぼ均一に精製した。このタンパク質は、分子量が
約14kDaで、熱耐性を示す。通常のクマシーブルーおよび銀染色法による染色を
施すと、この過敏感反応エリシターは染色に関して異常な性質を示す。Xanthomo
nas campestris pelargoniiの過敏感反応エリシターは、過敏感反応エリシター
タンパク質ファミリーの構成員であり、このファミリーの他のタンパク質と共通
の性質を持つ。このような性質としては、生化学的特性、高感受性応答の誘導能
、ならびに予備的な実験から病害耐性および植物体生長促進の誘導能が挙げられ
る。
【００８６】 好ましい態様を本明細書において詳細に説明し記載したが、本発明の精神から
逸脱することなく様々な改変、付加、置換などが成されること、したがってそれ
らも添付の特許請求の範囲に規定される本発明の範囲内であると考えられことが
当業者には明らかであると思われる。
【配列表】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ， ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ， ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，Ｃ Ｕ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ， ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，Ｌ Ｋ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ， ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ ，ＺＷ (72)発明者 ファン ハオ アメリカ合衆国 ワシントン州 ボーセル ６ス ドライブ エス．イー． 19712 Ｆターム(参考） 2B030 AA02 AB03 AD20 CA06 CA17 CA19 CB02 CD03 CD07 CD10 4H045 AA10 AA30 BA10 CA11 EA05 FA73 FA74 GA23 GA25 HA05

Claims (12)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 単離されたキサントモナス・カンペストリス(Xanthomonas c
    ampestris）の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチド。
  2. 【請求項２】 分子量が１３〜１５ｋＤａである請求項１記載の単離された
    過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチド。
  3. 【請求項３】 そのアミノ酸配列が配列番号：１に示す配列である、請求項
    １記載の単離された過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチド。
  4. 【請求項４】 病害に対する抵抗性を植物に付与する方法であって、 病害に対する抵抗性を付与するのに有効な条件下で、非感染植物もしくは植物種
    子に、請求項１記載の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを適
    用する段階。
  5. 【請求項５】 適用の期間に植物が処理を受ける請求項４記載の方法。
  6. 【請求項６】 以下の段階を含む、植物種子が適用期間に処理を受ける請求
    項４記載の方法： 天然または人工土壌に過敏感反応エリシターで処理した種子を植え込む段階、
    および 土壌に植え込んだ種子から植物体を繁殖させる段階。
  7. 【請求項７】 以下の段階を含む、植物の生長を促進する方法： 植物の生長を促進するのに有効な条件下で、非感染植物または植物種子に、請
    求項１記載の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを適用する段
    階。
  8. 【請求項８】 適用の期間に植物が処理を受ける請求項７記載の方法。
  9. 【請求項９】 以下の段階を含む、植物種子が適用の期間に処理を受ける請
    求項７記載の方法： 天然または人工土壌に過敏感反応エリシターで処理した種子を植え込む段階、
    および 土壌に植え込んだ種子から植物体を繁殖させる段階。
  10. 【請求項１０】 以下の段階を含む、植物における害虫を防除する方法： 害虫を防除するのに有効な条件下で、非感染植物または植物種子に、請求項１記
    載の過敏感反応エリシタータンパク質またはポリペプチドを適用する段階。
  11. 【請求項１１】 適用の期間に植物が処理を受ける請求項１０記載の方法。
  12. 【請求項１２】 以下の段階を含む、植物種子が適用の期間に処理を受ける
    請求項１０記載の方法： 天然または人工土壌に過敏感反応エリシターで処理した種子を植え込む段階、
    および 土壌に植え込んだ種子から植物体を繁殖させる段階。
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