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Hintergrund
der Erfindung
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Gebiet der
Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Polypeptide mit Larvenwachstum-inhibierendem
oder insektizidem Effekt auf Scarabaeidae-Insekten, Polynucleotide,
codierend dieselben, Bekämpfungsmittel
zum Bekämpfen von
Scarabaeidae-Insekten, enthaltend die Polypeptide als aktive Bestandteile,
und ein Verfahren zur Bekämpfung
von Scarabaeidae-Insekten unter Verwendung der Polypetide.
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Beschreibung
des zugehörigen
Fachgebiets
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Larven
von Scarabaeidae-Insekten fressen Wurzeln einer großen Vielfalt
von Pflanzen, wie zum Beispiel Rasen, Nutzpflanzen, Gartenbaupflanzen
und Bäume
und Büsche,
und verursachen daran ernsten Schaden. Es gab eine große Anzahl
an Berichten über
Schäden,
die insbesondere von Anomala cuprea, Blitopertha orientalis und
Popillia japonica am Rasen von Golfplätzen, an einem Süßkartoffelfeld
und an einem Erdnussfeld verursacht wurden. Insbesondere verursacht
Anomala cuprea, welche besonders groß ist, wegen ihres eifrigen
Appetits beträchtlichen
Schaden daran.
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Jedoch
ergibt das konventionelle Versprühen
chemischer Pestizide am Boden schwer einen bekämpfenden Effekt, weil diese
Larven den Boden besiedeln und es schwierig ist, sie zu lokalisieren,
und folglich war es notwendig, eine große Menge chemischer Pestizide über einen
großen
Bereich der Oberfläche
auf dem Boden zu versprühen
und sie in den Boden einzubringen. Deswegen bestanden Bedenken über nachteilige
Einflüsse
der chemischen Pestizide auf die natürliche Umgebung und menschliche
Körper,
und es bestand ein großer
Wunsch nach einem biologischen Bekämpfungsverfahren, das die chemischen
Pestizide ersetzen kann.
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Als
eines der biologischen Bekämpfungsverfahren
zur Bekämpfung
von Scarabaeidae-Insekten wurden Versuche, zu Bacillus popilliae
gehörende
Bakterien einzusetzen, über
einen langen Zeitraum erprobt. Die Bakterien sind parasitisch für Larven
von Scarabaeidae-Insekten als Wirte und infizieren diese per os
gewöhnlich
in der Form von Sporangien, propagieren in großen Mengen in der Hämolymphe,
um „milky
disease" zu verursachen,
und führen
letztlich zum Tod der Larven.
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Kürzlich wurden
eine Aminosäuresequenz
eines Polypeptids, das einen parasporalen Körper eines Stammes darstellt,
der zu Bacillus popilliae, d.h. Bacillus popilliae subsp. melolonthae
H1 gehört,
und eine Nucleotidsequenz des Gens, codierend das Polypeptid, teilweise
aufgeklärt
(J. Bacteriol. Band 179, S. 4336-4391 (1997)), und es wurde berichtet,
dass das Polypeptid, das den parasporalen Körper von Bacillus popilliae
Subsp. melolonthae H1 darstellt, einen kontrollierenden bzw. bekämpfenden
Effekt auf Melolontha melolontha aufweist (WO 97/14798). Jedoch
wurde nicht geklärt,
ob der bakterielle Stamm und ein Polypeptid davon bekämpfende
bzw. kontrollierende Effekte auf Anomala cuprea, Blitopertha orientalis
und Popillia japonica aufweisen, von welchen jeder zu einer unterschiedlichen
Art gehört.
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Zusätzlich dazu
betrifft US-Patent 5 559 534 ein isoliertes Polynucleotid, das ein
Toxin codiert, welches gegen Scara baeidae-Schädlinge aktiv ist, wobei das
Polynucleotid die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 9 davon codiert oder ein Fragment davon, das ausreichend
ist, um Anti-Scarabaeidae-Aktivität beizubehalten.
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Zusammenfassung
der Erfindung
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Eine
gemäß der vorliegenden
Erfindung zu lösende
Aufgabe ist, Polypeptide bereitzustellen, die einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt
oder einen insektiziden Effekt auf Scarabaeidae-Insekten, insbesondere
Anomala cuprea, Blitopertha orientalis und Popillia japonica, aufweisen,
Transformanten bereitzustellen, die darin eingeführt ein Polynucleotid aufweisen,
das das Polypeptid codiert, Bekämpfungsmittel
für Scarabaeidae-Insekten
bereitzustellen, die die Polypeptide als aktive Bestandteile enthalten,
Bekämpfungsmittel
für Scarabaeidae-Insekten
unter Verwendung des Polypeptids und von Sporangien von Bacillus
popilliae bereitzustellen, und ein Verfahren für das Bekämpfen von Scarabaeidae-Insekten
unter Verwendung der Bekämpfungsmittel
bereitzustellen.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung haben gefunden, dass die Sporangien
gewisser Stämme,
die zu Bacillus popilliae gehören,
einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt oder einen insektiziden
Effekt aufweisen. Nachfolgend haben sie den parasporalen Körper von
Sporangien von Bacillus popilliae (1), die eine
Spore und einen parasporalen Körper
enthalten, herausgenommen, haben ein Screening unter Verwendung
eines Antikörpers
gegen das Polypeptid, das den parasporalen Körper darstellt, durchgeführt, um
dadurch ein Polynucleotid zu isolieren, das das Polypeptid codiert,
und haben seine Nucleotidsequenz und Aminosäuresequenz bestimmt. Eine Transformante,
die unter Verwendung eines Vektors darin eingeführt das Polynucleotid aufweist,
ermöglichte
Massenproduktion des oben genannten Polypeptids. Ferner haben die
Erfinder der vorliegenden Erfindung klar gestellt, dass das von
der Transformante produzierte Polypeptid einen bekämpfenden
bzw. kontrollierenden Effekt auf Anomala cuprea aufweist, und dass
weiterhin die Verwendung des Polypeptids in Kombination mit den
Sporangien den Bekämpfungseffekt
erhöht.
Folglich wurde die vorliegende Erfindung bewerkstelligt.
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Deshalb
ist gemäß der vorliegenden
Erfindung bereitgestellt (1)
ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuresequenz,
die Substitution, Deletion oder Insertion von 9 oder weniger Aminosäureresten
einschließt,
aufweist, und einen Larvenwachstum-inhibierenden oder Insektiziden
Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweist.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist bereitgestellt (2) ein Polypeptid, das die Aminosäuresequenz von
SEQ ID NO: 4, 6, 18 oder 20 oder die Aminosäuresequenz, die Substitution,
Deletion oder Insertion von 50 oder weniger Aminosäureresten
einschließt,
aufweist, und einen Larvenwachstum-inhibierenden oder Insektiziden
Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweist.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung Polynucleotide bereit, die die
Polypeptide codieren.
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Noch
weiter stellt die vorliegende Erfindung Vektoren, umfassend die
Polynucleotide, und Transformanten, welche die Polynucleotide eingeführt haben,
bereit.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung Bekämpfungsmittel zur Bekämpfung eines
Scarabaeidae-Insekts, enthaltend die Polypeptide als aktive Bestandteile,
bereit.
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Weiterhin
stellt die vorliegende Erfindung Bekämpfungsmittel zur Bekämpfung eines
Scarabaeidae-Insekts, die die Polypeptide und Sporangien von Bakterien,
die zu Bacillus popilliae gehören,
als aktive Bestandteile umfassen, bereit.
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Noch
ferner stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Bekämpfung eines
Scarabaeidae-Insekts bereit, bei welchem das Scarabaeidae-Insekt
zur Bekämpfung
eines Scarabaeidae-Insekts
einer Wirkung bzw. einem Einfluss des Bekämpfungsmittels unterworfen
wird.
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In
der vorliegenden Erfindung beinhaltet der Ausdruck „Polypeptid" Peptide, die aus
einer Vielzahl von Aminosäuren
bestehen, die über
Peptidbindungen verknüpft
sind, und Polypeptide, an welche andere Moleküle, wie zum Beispiel Glycoproteine
gebunden sind, sowie Proteine in einer Form von Multimeren, etc.
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Gemäß der vorliegenden
Erfindung Polypeptide, die einen Larvenwachstum-inhibierenden oder
einen Insektiziden Effekt auf Scarabaeidae-Insekten, insbesondere
Anomala cuprea, Blitopertha orientalis und Popilliae japonica, Transformanten,
welche darin eingeführt
ein Polynucleotid, codierend das Polypeptid, aufweisen, ein Bekämpfungsmittel
zum Bekämpfen
eines Scarabaeidae-Insekts, umfassend das Polypeptid als einen aktiven
Bestandteil, und ein Verfahren zur Bekämpfung eines Scarabaeidae-Insekts
unter Verwendung des Polypeptids und von Sporangien von Bacillus
popilliae als aktive Bestandteile.
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Kurze Erklärung der
Zeichnungen
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1 ist
ein schematisches Diagramm eines Sporangiums, enthaltend eine Spore
und einen parasporalen Körper;
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2 ist
ein Diagramm, das einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt eines Polypeptids,
produziert von dem Polynucleotid, auf ein Scarabaeidae-Insekt (Larve
von Anomala cuprea), durchgeführt
in Beispiel 9, veranschaulicht;
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3 ist
ein Diagramm, das einen Insektiziden Effekt von biologischen Tests,
durchgeführt
in Beispiel 5, veranschaulicht;
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4 ist
ein Diagramm, das den Larvenwachstum-inhibierenden Effekt der biologischen
Tests, durchgeführt
in Beispiel 5, veranschaulicht;
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5 zeigt
Anordnung von Aminosäuresequenzen
in Beispiel 11;
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6 zeigt
Anordnung von Aminosäuresequenzen
in Beispiel 11;
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7 zeigt
Anordnung von Aminosäuresequenzen
in Beispiel 11;
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8 ist
ein Diagramm, das einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt eines Polypeptids,
hergestellt von einem Polynucleotid in Beispiel 13 der vorliegenden
Erfindung, auf ein Scarabaeidae-Insekt (Larven von Anomala cuprea)
zeigt.
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Detaillierte
Beschreibung der Erfindung
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung im Detail beschrieben werden.
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Ein
parasporaler Körper,
enthalten in Sporangien eines Bakteriums, das zu Bacillus popilliae
gehört, ist
ein proteinöses
Aggregat (Hukuhara, Toshihiko, „Insect Pathology", S. 57, 1979), welches
eine Art oder mehrere Arten an Polypeptiden umfasst. Das Polypeptid
der vorliegenden Erfindung ist ein oder mehrere Polypeptid(e), das/die
den parasporalen Körper
in dem Sporangium von Bacillus popilliae semadara oder dergleichen,
was unten beschrieben werden wird, bildet/bilden bzw. darstellt/darstellen.
Jedoch unterscheidet sich das Polypeptid der vorliegenden Erfindung
in der Aminosäuresequenz
von einem Polypeptid, das einen parasporalen Körper, beschrieben in WO 97/19798,
bildet, und folglich werden das Polypeptid und Polynucleotid der
vorliegenden Erfindung als neu erachtet.
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Gemäß einem
ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid bereitgestellt,
das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 aufweist und einen Larvenwachstum-inhibierenden
Effekt oder einen insektiziden Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweist.
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Gemäß einem
zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Polypeptid bereitgestellt,
das die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 4, 6, 18 oder 20 aufweist und einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt
oder einen insektiziden Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweist.
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Daneben
ist ein Polypeptid offenbart, das die Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 8
oder 10 aufweist und einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt oder
einen insektiziden Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweist.
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Beachten
Sie, dass die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 und die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 1 Sequenzen
sind, die in den Aminosäuresequenzen
von SEQ ID NO: 9, 6, 18 oder 20 und den Nucleotidsequenzen von SEQ
ID NO: 3, 5, 17 oder 19 mit Homologie von 95% oder mehr gefunden
werden und als spezifisch für
den parasporalen Körper
von Bacillus popilliae angesehen werden (vgl. Beispiel 11).
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Das
oben genannte Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann Polypeptide
einschließen,
die Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Anzahlen
an Aminosäureresten
enthalten, sofern die Polypeptide einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt
oder einen insektiziden Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweisen.
Hier bedeutet der Ausdruck „mehrere
Anzahlen von" insbesondere
eine Anzahl von 9 oder weniger, was ein Polypeptid betrifft, das
die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2 aufweist, und 50 oder weniger was ein Polypeptid
betrifft, das die Aminosäuresequenz
von SED ID NO: 4, 6, 18 oder 20 aufweist, obwohl es abhängig von
der Position und den Arten an Aminosäureresten in einer dreidimensionalen
Struktur des Polypeptids variieren kann. Diese Polypeptide, die
Substitution, Deletion oder Insertion einer oder mehrerer Anzahlen
von Aminosäureresten
einschließen,
können
beispielsweise erhalten werden durch Einführen einer Mutation in ein
Polynucleotid, codierend das Polypeptid, durch ortsgerichtete Mutagenese
und Durchführen
von Transkription und Translation des Polynucleotids. Diese Polypeptide
der vorliegenden Erfindung können
mit anderen Polypeptiden fusionierte Polypeptide sein. Die Polypeptide
der vorliegenden Erfindung können
Polypeptide sein, die die Aminosäuresequenz
aufweisen, die Homologie von 50% oder mehr, vorzugsweise 70% oder
mehr, und stärker
bevorzugt 90% oder mehr mit der oben genannten Aminosäuresequenz
aufweisen, sofern die Polypeptide einen Larvenwachstum-inhibierenden
Effekt oder einen insektiziden Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt
aufweisen. Weiterhin können
die Polypeptide der vorliegenden Erfindung Polypeptide sein, die einen
Teil der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 4, 6, 18 oder 20 aufweisen, sofern die Polypeptide
einen Larvenwachstums-inhibierenden Effekt oder einen insektiziden
Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt aufweisen.
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Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung sind Polynucleotide, die
die oben genannten Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren.
Codons von jedem der Aminosäurereste
sind keinen besonderen Beschränkungen
unterworfen, sofern die codierte Aminosäuresequenz die gleiche ist.
Spezifische Beispiele des Polynucleotids der vorliegenden Erfindung
schließen
ein Polynucleotid, umfassend die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:
1, ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz der codierenden Region
von SEQ ID NO: 3, 5, 17 oder 19 aufweist, ein. Auch offenbart ist
ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 7 oder
9 aufweist.
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Das
Polynucleotid der vorliegenden Erfindung kann ein Polynucleotid
sein, das hybridisierbar ist unter den stringenten Bedingungen an
jedes der oben genannten Polynucleotide, oder eine Sonde, die aus
dem oben genannten Polynucleotid hergestellt werden kann, solange
sie Polypeptide codieren, die einen Larvenwachstum-inhibierenden
Effekt oder einen Insektiziden Effekt auf ein Scarabaeidae-Insekt
aufweisen. Der Ausdruck „die
stringenten Bedingungen",
der hierin verwendet wird, bezieht sich auf eine Bedingung, unter welcher
ein sogenanntes spezifisches Hybrid gebildet wird und nicht-spezifisches Hybrid
nicht gebildet wird. Solch eine Bedingung ist ein Bedingung, bei
welcher DNAs, die hohe Homologie aufweisen, beispielsweise DNAs
mit Homologie von 50% oder mehr, vorzugsweise 70% oder mehr und
stärker
bevorzugt 90% oder mehr, hybridisiert werden und DNAs, die eine
Homologie aufweisen, die niedriger ist als die obige, nicht hybridisiert werden.
Spezifisch beinhaltet es eine Bedingung von 40°C, 1×SSC (0,15 M NaCl, 15 mM Natriumcitrat,
pH 7,0) und 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat).
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Die
Polynucleotide der vorliegenden Erfindung können beispielsweise von Bakterien,
die zu Bacillus popilliae gehören,
spezifischer von Bacillus popilliae semadara, FERM P-16818, Bacillus
popilliae var. Mame, FERM P-17661, Bacillus popilliae var. popilliae
Hime, FERM P-17660, Bacillus popilliae var. popilliae Sakura, FERM
P-17662 und Bacillus popilliae Dutky, American Type Culture Collection
Nr. 14706, durch die folgenden Verfahren erhalten werden.
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Bacillus
popilliae semadara, FERM P-16818 ist von Chiba-ken (1-l Ichiba-cho,
Chuo-ku, Chiba-shi, Chiba-ken, Japan) seit dem 21. Mai 1998 im Nationalen
Institut von Biowissenschaft und Humantechnologie des Amtes für Industrielle
Wissenschaft und Technologie des Ministeriums des Internationalen
Handels und der Industrie (Postleitzahl: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi,
Ibaraki-ken, Japan) (zur Zeit Nationales Institut der Fortgeschrittenen
Industriellen Wissenschaft und Technologie, Internationale Patent-Organismus-Hinterlegungsstelle,
Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken,
305-8566, Japan) hinterlegt worden, und die ursprüngliche
Hinterlegung wurde zu einer internationalen Hinterlegung, basierend
auf dem Budapester Vertrag vom 10. Juni 2002, umgewandelt, und ihr
wurde die Hinterlegungsnummer FERM BP-8068 zugeordnet.
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Bacillus
popillia var. Maure. FERM P-17661 ist von der Anmelderin der Anmeldung
seit dem 25. November 1999 im Nationalen Institut von Biowissenschaft
und Humantechnologie des Amtes für
Industrielle Wissenschaft und Technologie des Ministeriums für Internationalen
Handel und Industrie (Postleitzahl: 305-8566, 1-3 Higashi 1-Chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japen) (zur Zeit Nationales Institut der
Fortgeschrittenen Industriellen Wissenschaft und Technologie, Internationale
Patent-Organismus-Hinterlegungsstelle, Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi
1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japan) hinterlegt worden,
und die ursprüngliche
Hinterlegung wurde in eine internationale Hinterlegung, basierend
auf dem Budapester Vertrag vom 10. Juni 2002, umgewandelt, und ihr
wurde die Hinterlegungsnummer FERM BP-8069 zugeordnet.
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Ein
Verfahren, sie zu erhalten, beinhaltet ein Screening-Verfahren unter Verwendung
eines Antikörpers.
Das heißt,
ein Antikörper
gegen einen gereinigten parasporalen Körper wird im Vorhinein präpariert.
Auf der anderen Seite wird eine chromosomale DNA des oben genannten
Bakterienstamms präpariert,
mit einem geeigneten Restriktionsenzym geschnitten und in einen
Expressionsvektor insertiert, um eine chromosomale DNA-Bibliothek
herzustellen. Dann wird die Bibliothek in Escherichia coli oder
dergleichen expandiert und mittels Western-Blotting unter Verwendung
des oben erwähnten
Antikörpers
durchmustert.
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Ein
weiteres Verfahren, die Polynucleotide der vorliegenden Erfindung
zu erhalten, beinhaltet ein PCR-Verfahren. Eine geeignete Nucleotidsequenz
wird ausgewählt
aus Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 11 bis 16, 21 und 22, und
Nucleotidsequenzen, erhalten durch Dazuaddieren von Modifikationen,
und partiellen Nucleotidsequenzen, abgeleitet von den Nucleotidsequenzen
von SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 17 und 19, und zwei Arten an Polynucleotiden,
die entgegengesetzt aufeinander zuführen, werden bereitgestellt.
PCR wird unter Verwendung der Polynucleotide als Primer und unter
Verwendung einer chromosomalen DNA als Matrize durchgeführt. Durch
Klonieren eines amplifizierten DNA-Fragments können die Polynucleotide der
vorliegenden Erfindung erhalten werden.
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Beachten
Sie, dass PCR unter Verwendung von Oligonucleotiden, die entsprechende
Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 11 und 13 aufweisen, als Primer
und einer chromosomalen DNA von Bacillus popilliae semadara als
eine Matrize, amplifizierte Polynucleotid-Fragmente von etwa 4,2
kb erzeugen kann, die die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 17
bzw. 19 aufweisen. Die Nucleotidsequenzen dieser Polynucleotide
existieren auf der chromosomalen DNA von Bacillus popilliae semadara
benachbart zueinander und die Aminosäuresequenzen (SEQ ID NOs: 18
und 20) der Polypeptide, codiert von den Polynucleotiden, weisen eine
Homologie von etwa 73% zueinander auf, was klar darauf hindeutet,
dass beide Polynucleotide ähnliche Funktionen
aufweisen.
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Außerdem weisen
die Polynucleotide, die die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 3,
5, 7 und 9 aufweisen, erhalten mittels PCR unter Verwendung einer
chromosomalen DNA von Bacillus popilliae var. popilliae Mame als
eine Matrize, und Polypeptide, die Aminosäuresequenzen von SEQ ID NOs:
4, 6, 8 und 10 aufweisen, welche Translationsprodukte davon sind,
hohe Homologie zu der Nucleotidsequenz des Polynucleotids von Bacillus
popilliae semadara und dem von dem Polynucleotid codierten Polypeptid
auf (Homologie von 61 bis 88% für
das Polynucleotid und 59 bis 98% für das Polypeptid). Dies deutet
darauf hin, dass sie auch ähnliche
Funktionen aufweisen.
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Weiterhin
beinhaltet ein anderes Verfahren zum Erhalten der Polynucleotide
der vorliegenden Erfindung ein Hybridisierungsverfahren. Nach Verdau
der chromosomalen DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym wird
eine Genom-Bibliothek unter Verwendung eines Plasmidvektors oder
eines Phagenvektors oder dergleichen hergestellt. Auf der anderen
Seite werden geeignete Polynucleotidsonden, die die Nucleotidsequenzen
von SEQ ID NOs: 11 bis 16, 21 und 22 oder Nucleotidsequenzen, erhalten
durch Hinzuaddieren von Modifikationen, oder partielle Nucleotidsequenzen,
die von den Nucleotidsequenzen von SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 17
und 19 abgeleitet sind, bereitgestellt. Durch Kolonie-Hybridisierung
oder Plaque-Hybridisierung,
bei welcher eine in Escherichia coli oder dergleichen und Verwendung
des Vektors hergestellte Bibliothek mit einer markierten Sonde durchmustert
wird, kann das Polynucleotid der vorliegenden Erfindung erhalten
werden.
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Die
Vektoren, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Plasmidvektoren,
Ti-Plasmidvektoren, Phagenvektoren, „Phagemid"-Vektoren, YAC-Vektoren, Virusvektoren
und dergleichen ein. Die Vektoren können zusätzlich zu den Polynucleotiden
der vorliegenden Erfindung Sequenzen beinhalten, die Expression
von Polypeptiden regulieren oder dabei assistieren (beispielsweise
ein Promoter, ein Operator, ein Terminator, ein Enhancer und eine
SD-Sequenz) oder Markergene für
das Selektieren von Transformantenwirten beinhalten (beispielsweise
ein Ampicillinresistenzgen, ein Tetracyclinresistenzgen, ein Kanamycinresistenzgen,
und ein Neomycinresistenzgen) und dergleichen. Die Vektoren können mehrere
Arten an Polynucleotiden der vorliegenden Erfindung oder eine Vielzahl
an Molekülen
des gleichen Polynucleotids umfassen.
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Die
Wirte, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen Mikroben
(beispielsweise Bakterien wie zum Beispiel Escherichia coli, Pseudomonad
und Bacillus, Actinomyceten wie zum Beispiel Streptomyces, Pilze
wie zum Beispiel Schimmelpilze und Hefen), Pflanzen (beispielsweise
Rasen, Süßkartoffeln,
Tabake, Reispflanzen und Mais), kultivierte Zellen (beispielsweise
kultivierte Pflanzenzellen wie zum Beispiel eine kultivierte Tabakzelle,
kultivierte Insektenzellen wie zum Beispiel eine kultivierte Seidenraupenmottenzelle
und kultivierte Tierzellen wie zum Beispiel eine kultivierte Mauszelle)
und dergleichen ein.
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In
der vorliegenden Erfindung können
konventionelle Verfahren, die in der Gentechnik verwendet werden,
in der Vorgehensweise des Konstruierens eines Vektors und bei der
Transformationsoperation von Wirten mit dem Vektor verwendet werden.
Beispielsweise schließt
das Transformationsverfahren ein Calciumchloridverfahren, ein Elektroporationsverfahren,
ein PEG-Verfahren und dergleichen für Mikrobenwirte, ein Elektroporationsverfahren,
ein Teilchenkanone-Verfahren, ein Agro bakteriumverfahren und dergleichen
für kultivierte Zellen
und Pflanzenwirte, ein.
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In
einem Fall, in dem der Wirt eine Mikrobe oder eine kultivierte Zelle
ist, kann das Verfahren des Produzierens eines Polypeptids der vorliegenden
Erfindung durch Kultivieren der Mikrobe oder der kultivierten Zelle
in einem geeigneten Medium und Gewinnung des produzierten Polypeptids
aus der Kultur durchgeführt
werden. Das Kulturverfahren des Kultivierens eines transformierten
Wirts kann im Wesentlichen das Gleiche sein wie das Kulturverfahren
für den
zu verwendenden Wirt. Extraktion des Polypeptids aus der Kultur
und dessen Reinigung, falls notwendig, können durch gewöhnlich eingesetzte
Verfahren durchgeführt
werden. Auf der anderen Seite wird in einem Fall, in dem der Wirt
eine Pflanze ist, die transformierte Pflanze mittels der gleichen Verfahren
wie die für
gewöhnlich
verwendeten Verfahren kultiviert, und ein Polypeptid kann aus dem
Pflanzenkörper
extrahiert werden. Von einem unterschiedlichen Standpunkt können die
transformierte Pflanze und ihre Samen wie sie sind als insektenresistente
Cultigenspezies („insect
resistant cultigen species")
bereitgestellt werden. Zusätzlich
dazu gibt es ein Produktionsverfahren eines Polypeptids ohne Verwendung
irgendeiner Transformante. Es beinhaltet beispielsweise ein zellfreies
in vitro Transkriptions/Translations-System unter Verwendung eines
Weizenkeimextrakts oder eines Escherichia coli-Extrakts. Ein Polypeptid
kann hergestellt werden durch Zugeben eines DNA-Fragments oder eines RNA-Fragments,
oder eines Vektors, enthaltend das Polypeptid der vorliegenden Erfindung,
zu dem Transkripitons/Translations-System, wodurch ein konventionelles
Verfahren zur Herstellung eines Polypeptids durchgeführt wird.
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Die
Polypeptide der vorliegenden Erfindung haben eine Larvenwachstum-inhibierende,
oder Insektizide Aktivität
auf Scara baeidae-Insekten und weisen diesen gegenüber Bekämpfungseffekte
auf. Aus diesem Grund können
die Polypeptide auf Rasen, Nutzpflanzen oder Bäume als Bekämpfungsmittel oder ein aktiver Bestandteil
davon zum Zwecke des Bekämpfens
von Scarabaeidae-Insekten appliziert werden. Die Verwendung der
Polypeptide der vorliegenden Erfindung in Kombination mit Sporen
oder Sporangien, enthaltend Sporen und parasporale Körper, von
Bakterien, die zu Bacillus popilliae gehören, können die Larvenwachstum-inhibierende
oder Insektizide Aktivität
auf Scarabaeidae-Insekten weiter erhöhen.
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Die
Scarabaeidae-Insekten, die das Ziel der Kontrolle mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden
sind, schließen
Anomala cuprea, Blitopertha orientalis, Popillia japonica, Phyllopertha
diversa, Adoretus tenuimaculatus, Anomala rufocuprea und dergleichen
ein. Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind insbesondere effektiv
gegenüber
Anomala cuprea und Blitopertha orientalis.
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Als
das Bekämpfungsmittel
der vorliegenden Erfindung können
die mittels des oben genannten Produktionsverfahrens produzierten
Polypeptide wie sie sind in der Form der Transformanten, als ein
gereinigtes Produkt nach Isolation, oder als Gemische von diesen
mit Substanzen, die für
Kultur-/Reaktionssysteme
von diesen verwendet werden, verwendet werden. Alternativ können sie
unter Zugabe von Exzipienzien, Trägern, Nährmitteln („nutritive agents"), Stabilisatoren
und dergleichen, die bekannt sind und in landwirtschaftlichen Chemikalien üblicherweise
verwendet werden, verwendet werden, um sie in eine optionale Präparationsform wie
zum Beispiel Pulver („dust"), benetzbares Pulver
oder ein Fließmittel
zu konvertieren.
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Die
oben erwähnte
optionale Komponente schließt
ein: feines Mineralienpulver wie zum Beispiel Kaolinton, Bentonit,
Montmorillonit, Diatomeenerde, sauren Ton, Talke, Perlit und Vermiculit,
anorganische Salze, wie zum Beispiel Ammoniumsulfat, Harnstoff,
Ammoniumchlorid und Ammoniumnitrat, organische feine Pulver, wie
zum Beispiel Weizenkleie, Chitin, Polysaccharide, Reiskleie und
Mehl, als feste Träger;
Fixierungsmittel und Dispergierungsmittel wie zum Beispiel Casein,
Gelatine, Gummiarabicum, Alginsäure,
Saccharide, synthetische Polymere (Polyvinylalkohol, Polyacrylsäuren etc.)
als Adjuvantien („adjutants"); und Kryoprotektionsmittel
wie zum Beispiel Propylenglykol und Ethylenglykol, natürliche Polysaccharide
wie zum Beispiel Xanthangummi, Verdickungsmittel wie zum Beispiel
Polyacrylsäuren
als andere Komponenten.
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Das
Verhältnis
der Polypeptide der vorliegenden Erfindung, enthalten in dem Bekämpfungsmittel,
ist keinen besonderen Beschränkungen
unterworfen, sofern sie einen Bekämpfungseffekt auf Scarabaeidae-Insekten
aufweisen, es ist jedoch vorzugsweise 0,0001 bis 100 Massen-%.
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Das
Verfahren der Applikation des Bekämpfungsmittels wird wie geeignet
ausgewählt,
abhängig
von der Verwendungsform wie zum Beispiel der Herstellungsform, den
Pflanzen und dergleichen und beinhaltet beispielsweise Flüssigdispersion
auf dem Boden, Festdispersion auf dem Boden, Flüssigdispersion in der Luft, Festdispersion
in der Luft, Anwendung in Installationen, Anwendung für das Mischen
mit Erde, Anwendung für Perfusion
in Erde und ähnliche
Verfahren.
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Außerdem ist
es möglich,
das Bekämpfungsmittel
der vorliegenden Erfindung nach Mischen mit anderen Mitteln, d.h.
Pestiziden, Nematiziden, Akariziden, Herbiziden, Mikrobiziden, Pflanzenwachstumsregulatoren,
Düngern,
Bodenkonditionierungsmaterialien (Torf, Huminsäurematerialien, Polyvinylalkohol basierte
Materialien etc.) und dergleichen zu applizieren, es mit abwechselndem
Applizieren der anderen Mittel ohne Mischen zu applizieren oder
es zusammen mit den anderen Mitteln gleichzeitig zu applizieren.
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Die
Applikationsmenge des Bekämpfungsmittels
der vorliegenden Erfindung kann nicht als Einzelwert definiert werden,
weil sie abhängig
von der Art des Scarabaeidae-Insekts, der Art der Pflanze, auf welche
das Mittel appliziert wird, Herstellungsform des Mittels und dergleichen
variieren kann. Beispielsweise kann die Applikationsmenge des Polypeptids
0,01 bis 100 g/m2, vorzugsweise etwa 0,1
bis 50 g/m2 für Dispersion auf dem Boden
sein.
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Weiterhin
ist es möglich,
Gemische des Bekämpfungsmittels
der vorliegenden Erfindung mit anderen Biokontrollmitteln oder Polypeptiden
abgeleitet von Mikroben (beispielsweise die parasporalen Körper eines weiteren
Stamms von Bacillus popilliae oder die parasporalen Körper von
Bacillus thuringiensis) oder mikrobiellen Sporen (beispielsweise
Sporen von Bacillus popilliae, Bacillus thuringiensis oder Bacillus
subtilis) zu verwenden.
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Beste Ausführungsform
der Erfindung
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Nachfolgend
wird die vorliegende Erfindung spezifischer veranschaulicht werden.
Jedoch ist der Umfang der vorliegenden Erfindung nicht darauf beschränkt.
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Beispiel 1
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Eine
Suspension von Sporangien von Bacillus popilliae, hergestellt aus
Larven von Anomala cuprea, infiziert mit „milky disease", wurde einer Behandlung
mittels einer French Press unterzogen, um Sporen und parasporale
Körper
aus den Sporangien zu entfernen. Nur die parasporalen Körper wurden
mit einem Zweiphasentrennverfahren unter Verwendung von Natriumdextransulfat
(hergestellt von Sigma Co., Ltd.), Polyethylenglycol 6000 (hergestellt
von Wako Pure Chemical Industry Co., Ltd.) und NaCl gewonnen und
mit 0,1 M NaOH solubilisiert und dann SDS-PAGE unterzogen. Eine
etwa 135 kD Bande wurde aufgeschnitten und in kleine Stücke pulverisiert,
welche dann mit einem Adjuvans vermischt wurden. Das Gemisch wurde
einem Kaninchen intradermal injiziert, um es zu immunisieren.
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Um
den Background beim Screening eines Polypeptid-Genklons, der den
parasporalen Körper
bildet, unter Verwendung eines Antikörpers zu verringern, wurde
der Arbeitsvorgang der Absorption des erhaltenen Antiserums mit
Escherichia coli-Fragmenten
dreimal wiederholt, um den Antikörper
zu entfernen, der an Escherichia coli selbst adsorbiert, und nur
den Antikörper
zu erfassen, der an dem Polypeptid adsorbiert, das den parasporalen
Körper
bildet, auf den abgezielt wird.
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Beispiel 2
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Eine
chromosomale DNA wurde aus den bakteriellen Zellen von Bacillus
popilliae semadara mittels eines gewöhnlichen Verfahrens gereinigt
und mit Restriktionsenzym EcoRI verdaut. Dies wurde mit Phosphatase-behandeltem
pBluescript SK(+) ligiert und Escherichia coli DH5α wurde mit
dem Ligationsprodukt transformiert. Die Transformanten wurden über der
LB Agarplatte verteilt, so dass 2.000 bis 3.000 Kolonien darauf erscheinen
konnten.
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Eine
Nitrocellulosemembran wurde auf der Agarplatte in engen Kontakt
gebracht, um Kolonien auf die Membran zu transferieren, und die
Membran wurde auf einer frischen Agarplatte platziert, so dass die
Seite der Membran, an der die Kolonien anhafteten, nach oben zeigt.
Die Platte wurde 2 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Zur Bakteriolyse
der Bakterienzellen auf der Membran wurde die folgende Tätigkeit
durchgeführt.
Das heißt,
die Membran wurde auf ein mit 10% SDS imprägniertes Filterpapier transferiert
und 5 Minuten lang stehen gelassen. Dann wurde die Membran auf ein
Filterpapier, imprägniert
mit 0,2 M NaOH, 0,15 M NaCl und 1% β-Mercaptoethanol, transferiert
und 5 Minuten lang stehen gelassen und schließlich wurde sie auf ein Filterpapier,
imprägniert
mit 0,15 M NaCl, 0,5 M Tris-HCl und pH 7,5, transferiert und 10
Minuten lang stehen gelassen. Die Membran wurde in eine Pufferlösung (0,1
M Tris-HCl, pH 7,8, 0,15 M NaCl, 5 mM MgCl2,
40 μg/ml Lysozym
und 5% Magermilch) transferiert und 2 Stunden lang geschüttelt, um
die Bakterienzellen zu entfernen.
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Nach
Waschen der Membran mit TBST (0,02 M Tris-HCl, pH 7,2, 0,5 M NaCl
und 0,05 Tween 20) für 5
Minuten, wurde die Membran 1,5 Stunden lang in einer Anti-Parasporaler
Körper-Antiserumlösung, 8.000-fach
verdünnt
mit einer Antikörperverdünnungsflüssigkeit
(TBST, enthaltend 5% Magermilch), geschüttelt. Nach dreimaligem Wiederholen
eines 10-minütigen
Waschens mit TBST wurde die Membran in eine Lösung von 2.000-fach verdünntem Anti-Kaninchen
IgG (H&L), HRP-verknüpft (hergestellt
von New England Biolabs, Inc.), transferiert und inkubiert, bis
Farbentwicklung in einem HRP-Färbesubstrat
(4 CN, hergestellt von NEN Life Science Products Co.) beobachtet
wurde.
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Kolonien
nahe einer Stelle, an der starke Färbung beobachtet wurde, das
heißt,
an welche das Anti-Parasporaler Körper-Antiserum adsorbiert war, wurden eine
nach dem anderen von der Masterplatte eingesammelt und die gesammelten
Kolonien wurden einem Zweitscreening unterzogen, das auf die gleiche Weise wie
oben beschrieben durchgeführt
wurde, um einen positiven Klon zu erhalten.
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Plasmid
wurde aus dem positiven Klon gereinigt und die Nucleotidsequenz
des insertierten Anteils wurde mittels eines gewöhnlichen Verfahrens bestimmt.
Als ein Ergebnis deckte es auf, dass das Plasmid zwei Polypeptid-Gene
in einem einzelnen klonierten Fragment enthielt, welche den parasporalen
Körper
von Bacillus popilliae bilden, (SEQ ID NOs: 17 bzw. 19, wobei entsprechende
Translationsprodukte von SEQ ID NOs: 18 und 20 sind). Die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 18 und die von SEQ ID NO: 20 haben etwa 73% Homologie
zueinander. In diesem Fall wird Geninformationsprozessierungssoftware
GENETYX-WIN (Software Development Co., Ltd.) zur Auffindung der
Homologie verwendet.
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Beispiel 3
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PCR
wurde unter Verwendung des Plasmids des oben genannten positiven
Klons als eine Matrize und von Polynucleotiden, die Nucleotidsequenzen
aufweisen, die Teile eines Polynucleotids von SEQ ID NO: 19 und
eines komplementären
Stranges davon entsprechen (SEQ ID NOs: 21 bzw. 22), als Primer
durchgeführt. Nach
Elektrophorese der Reaktionslösung
wurden etwa 4 kb amplifizierte Fragmente gewonnen und gereinigt und
mit Restriktionsenzymen EcoRI und PstI verdaut. Die verdauten Produkte
wurden an eine Vektor pTrc99A (hergestellt von Amersham Pharmacia
Biotech Co., Ltd.), der mit EcoRI und PstI im Vorhinein verdaut
worden war, ligiert, und Escherichia coli BL21 (DE3) wurde mit der
Reaktionslösung
transformiert. Die erhaltenen Transformanten wurden über Nacht
in einem 2×YT-Flüssigmedium,
enthaltend 50 mg/l Ampicillin über
Nacht unter Schütteln
kultiviert, und dann wurde IPTC (Isopropyl β-D-thiogalactopyranosid) zugegeben, um
die Transformanten zu einer Endkonzentration von 1 mM zu bringen,
was von weiterer 2 Stunden langer Kultur gefolgt wurde. Beobachtung
mit einem Mikroskop zeigte die Bildung eines Einschlusskörpers („inclusion
body") in den Zellen
an. Deshalb wurde der Klon als ein Expressionsklon (1) bezeichnet.
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Beispiel 4:
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In
einen 2-Liter Erlenmeyer-Schikanekolben wurden 750 ml eines 2×YT-Flüssigmediums,
enthaltend 50 mg/l Ampicillin, gefüllt, und der Expressionsklon
(1), erhalten in Beispiel 3, wurde darin inokuliert. Das Medium
wurde bei 37°C
unter Schütteln
kultiviert. 16 Stunden danach wird IPTG zu dem Medium gegeben, um es
zu einer Endkonzentration von 1 mM zu bringen, und das Medium wurde
2 Stunden lang weiter kultiviert. Das kultivierte Medium wurde zentrifugiert,
um aus der Kulturlösung
Bakterienzellen zu gewinnen, die mit einer 10 mM-Kaliumphosphatpufferlösung, pH
7,0, gewaschen wurden. Wiederum wurde die Suspension zentrifugiert,
um die Bakterienzellen zurückzugewinnen,
welche in der oben genannten Pufferlösung suspendiert wurden, um
es letztlich in 120 ml zu bringen.
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10
g pro Schale an Lauberde („leaf
mold") wurden ausgemessen
und in 40 aus Kunststoff hergestellte Nährschalen von 6 cm Durchmesser
gefüllt.
In 20 Schalen von diesen wurde pro Schale 1 ml der Suspension des
Expressionsklons (1) verteilt bzw. dispergiert, und 1 ml an Wasser
als Leerwert wurde in den verbleibenden 20 Schalen verteilt, dies
wurde von gutem Mischen gefolgt. In jede der Nährschalen wurde eine Erststadiumlarve
(„first
instar larva") von
Anomala cuprea gesetzt und unter einer Bedingung von 25°C versorgt.
Mortalität der
Larven und mittleres Körpergewicht
der überlebenden
Larven wurden mit einem Ablauf einer Zeit gemessen, um die Insektizide Aktivität und Larvenwachstum-inhibierende
Aktivität
des Expressionsklons (1) zu verifizieren.
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Die
Ergebnisse sind in Tabelle 1 und 2 gezeigt.
Eine Charge, in der der Expressionsklon (1) verteilt war, zeigte
eine Zunahme an Mortalität
und in der 5. Woche wurde eine hohe Mortalität von 95% erhalten. Weiterhin
nahm das mittlere Körpergewicht
der überlebenden
Larven in der Charge, in der der Expressionsklon (1) verteilt war,
nicht wesentlich zu, sondern blieb, verglichen mit dem Leerwert,
auf einem niedrigen Level. Diese Ergebnisse bestätigten, dass der Expressionsklon
(1), das heißt
das Polypeptid der vorliegenden Erfindung, eine Larvenwachstum-inhibierende
oder Insektizide Aktivität
aufweist.
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Beispiel 5
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In
einen 2-Liter Erlenmeyer-Schikanekolben wurden 750 ml eines 2×YT-Flüssigmediums,
enthaltend 50 mg/l Ampicillin, gefüllt und der Expressionsklon
(1), erhalten in Beispiel 3, wurde darin inokuliert. Das Medium
wurde unter Schütteln
bei 37°C
kultiviert. Nach 16 Stunden wurde IPTG zugegeben, um das Medium
auf eine Endkonzentration von 1 mM zu bringen, und das Medium wurde
2 Stunden lang weiterkultiviert. Das Kulturmedium wurde zentrifugiert,
um aus der Kulturlösung
Bakterienzellen zu gewinnen, welche mit einer 10 mM-Kaliumphosphatpufferlösung, pH
7,0 gewaschen wurden. Die Sus pension wurde wiederum zentrifugiert, um
die Bakterienzellen zurückzugewinnen,
welche in der oben genannten Pufferlösung suspendiert wurden, um
es letztlich in 75 ml zu bringen, was es folglich zu einer Expressionsklonsuspension
machte.
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Auf
der anderen Seite wurden die Sporangien von Bacillus popilliae semadara
aus Larven von Anomala cuprea, infiziert mit „milky disease", gesammelt bzw.
gereinigt und mit Wasser gewaschen. Sie wurden erneut in Wasser
zu einer Dichte von 8×107 Sporangien/ml suspendiert, um es eine Sporangiensuspension
zu machen.
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80
aus Kunststoff hergestellt Nährschalen
von 6 cm Durchmesser, von welchen jede mit 25 g Lauberde („leaf mold"), die ausgemessen
wurde, befüllt
war, wurden hergestellt. In 20 Schalen von diesen wurde pro Schale
1 ml der Suspension des Expressionsklons (1) verteilt, in anderen
20 Schalen wurden 0,5 ml pro Schale der Sporangiensuspension verteilt,
in noch weiteren 20 Schalen wurde 1 ml der Expressionsklon-Suspension zusammen
mit 0,5 ml der Sporangiensuspension verteilt, und in den verbleibenden
20 Schalen wurde pro Schale 1 ml an Wasser verteilt, was von gutem
Mischen gefolgt wurde. In jede der Nährschalen wurde eine Zweitstadiumlarve
(„second
instar larva") von
Anomala cuprea einzeln nacheinander gesetzt und unter einer Bedingung
von 25°C
21 Tage lang versorgt. Die Mortalität der Larven und das mittlere
Körpergewicht
der überlebenden
Larven wurden mit einem Verlauf der Zeit gemessen, um synergistische
Effekte in der Insektiziden Aktivität und der Larvenwachstum-inhibierenden
Aktivität
des Expressionsklons (1), verwendet in Kombination mit den Sporangien,
zu verifizieren.
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Die
Ergebnisse sind in 3 und 4 gezeigt.
Dispersion der Suspension des Expressionsklons (1) oder der Sporangien
allein wies einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt auf, wies
aber keinen ausreichenden Insektiziden Effekt auf. Im Gegensatz
dazu, wurde, wenn der Expressionsklon (1) und die Sporangien in Kombination
verteilt wurden, eine abrupte Zunahme bei der Mortalität beobachtet,
so dass ein synergistischer Effekt bestätigt wurde.
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Beispiel 6
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Polynucleotide,
die die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 11 und SEQ ID NO: 13 aufweisen,
die Teilen von komplementären
Strängen
von SEQ ID NO: 17 bzw. SEQ ID NO: 19 entsprechen, wurden mit chemischer
Synthese hergestellt. PCR, durchgeführt unter Verwendung der Polynucleotide
als Primer und einer chromosomalen DNA von Bacillus popilliae semadara
als einer Matrize zeigte Amplikation von etwa 4,2 kb Fragmenten
an. TA-Cloning der
Fragmente erzeugte eine Anzahl an Klonen, von welchen manche der
Bestimmung der Nucleotidsequenz des Insert-Anteils mittels Sequenzierung
unterzogen wurden. Als ein Ergebnis wurden Polynucleotide, die die
Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 17 und SEQ ID NO: 19 aufweisen,
erhalten. Deshalb deckte es auf, dass das Polynucleotid der vorliegenden
Erfindung auch mittels PCR unter Verwendung der Polynucleotide,
die die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 11 bzw. SEQ ID NO: 13
aufweisen, erhalten werden kann.
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Beispiel 7
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Eine
chromosomale DNA wurde aus den Bakterienzellen von Bacillus popilliae
var. popilliae Mame mittels eines gewöhnlichen Verfahrens gereinigt.
Auf der anderen Seite wurden, basierend auf der Nucleotidsequenz
des Gens, codierend das Polypeptid, das den parasporalen Körper von
Bacillus popilliae semadara bildet, als eine Referenz, Polynucleotide
chemisch synthetisiert, die die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 11 bzw.
SEQ ID NO: 14 aufweisen. PCR, durchgeführt unter Verwendung der Polynucleotide
als Primer und der chromosomalen DNA als eine Matrize, zeigte Amplifikation
von etwa 4,3 kb Fragmenten an. TA-Cloning der Fragmente erzeugte
eine Anzahl an Klonen, von welchen einer der Bestimmung der Nucleotidsequenz
des Inserts mittels Sequenzierung unterzogen wurde. Als ein Ergebnis
wurde ein Polynucleotid erhalten, das die Nucleotidsequenz von SEQ
ID NO: 3 aufweist. Diese wurde weiterhin translatiert, um die Aminosäuresequenz von
SEQ ID NO: 4 zu erhalten.
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Beispiel 8
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Polynucleotide,
die Nucleotidsequenzen von SEQ ID NO: 12 bzw. SEQ ID NO: 13 aufweisen,
wurden mittels chemischer Synthese hergestellt. PCR, durchgeführt unter
Verwendung der Polynucleotide als Primer und der chromosomalen DNA,
hergestellt wie oben beschrieben, als eine Matrize, zeigte Amplifikation
von etwa 4,2 kb Fragmenten an. TA-Cloning der Fragmente führte zu
einer großen
Anzahl an Klonen, von welchen einer der Bestimmung der Nucleotidsequenz
des Insert-Anteils mittels Sequenzierung unterzogen wurde. Als ein
Ergebnis wurde ein Polynucleotid erhalten, das die Nucleotidsequenz
von SEQ ID NO: 5 aufweist. Dies wurde ferner translatiert, um die
Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 6 zu erhalten.
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Beispiel 9 (Vergleichsbeispiel)
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Polynucleotide
mit der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 15, entsprechend einem Teil
eines komplementären
Strangs von SEQ ID NO: 3, bzw. die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:
11, wurden mittels chemischer Synthese hergestellt. PCR, durchgeführt unter
Verwendung der Polynucleotide als Primer und der wie oben beschrieben
hergestellten chromosomalen DNA als eine Matrize, zeigte Amplifikation
von etwa 1,2 kb Fragmenten an.
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TA-Cloning
der Fragmente erzeugte eine große
Anzahl an Klonen, von welchen einer der Bestimmung der Nucleotidsequenz
des Insert-Anteils mittels Sequenzierung unterzogen wurde. Als ein
Ergebnis wurde ein Polynucleotid erhalten, das die Nucleotidsequenz
von SEQ ID NO: 7 aufweist. Dies wurde ferner translatiert, um die
Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 8 zu erhalten.
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Beispiel 10
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Die
chromosomale DNA, erhalten wie oben beschrieben, wurde mit Restriktionsenzym
XhoI verdaut („degested") und die Fragmente
wurden mit der SalI-Kassette, enthalten in einem LA PCR in vitro
Cloning Kit, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd., ligiert. Auf
der anderen Seite wurde ein Polynucleotid, das die Nucleotidsequenz
(SEQ ID NO: 16) aufweist, was einem Teil einer Sequenz von SEQ ID
NO: 3 entspricht, mittels chemischer Synthese hergestellt. Dann
wurde PCR unter Verwendung des Polynucleotids und eines Kassetten-Primers
Cl, der dem Kit beigefügt
war, als Primern und dem ligierten chromosomalen DNA-Fragment als eine
Matrize durchgeführt.
Als ein Ergebnis wurde die Amplifikation von etwa 3 kb Fragmenten
beobachtet. TA-Cloning
der Fragmente führte
zu einer großen
Anzahl an Klonen, von welchen einer der Bestimmung der Nucleotidsequenz
des Insert-Anteils mittels Sequenzierung unterzogen wurde. Als ein
Ergebnis wurde ein Klon erhalten, der ein Polynucleotid aufweist,
das die Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 9, gekoppelt in Tandem an
Downstream der letzteren Hälfte
der Nucleotidsequenz von SEQ ID NO: 3, aufweist. Die Nucleotidsequenz
von SEQ ID NO: 9 wurde ferner translatiert, um die Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 10 zu erhalten.
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Beispiel 11
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Die
Aminosäuresequenzen
der Polypeptide der parasporalen Körper, die in Bacillus popilliae
existieren, erhalten in Beispielen 2, 7 und 8, und die Nucleotidsequenzen
der Polynucleotide, die sie codieren, wurden vergleichend unter
Verwendung der Geninformationsprozessierungssoftware GENETYX-WIN
(Software Development Co., Ltd.) untersucht. Als ein Ergebnis wurden
Sequenzen gefunden, die sehr hohe Homologie von 98% oder mehr in
der Aminosäuresequenz
aufweisen und als spezifisch für
den parasporalen Körper
von Bacillus popilliae erachtet werden, d.h. es wurde die Aminsäuresequenz
SEQ ID NO: 2 und die entsprechende Nucleotidsequenz von SEQ ID NO:
1 gefunden. Die mittels eines Pfeils in 5 bis 7 angezeigten
Anteile entsprechen der Aminosäuresequenz
von SEQ ID NO: 2.
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Beachten
Sie, dass diese Sequenzen Homologie von 9% oder weniger in der Aminosäuresequenz
zu der Sequenz, isoliert von Bacillus popilliae subsp. Melolonthae
H1, beschrieben in WO 97/14798, aufweisen, und folglich davon vollständig verschieden
sind.
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Beispiel 12
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PCR
wurde unter Verwendung einer chromosomalen DNA von Bacillus popilliae
var. popilliae Mame als eine Matrize und Polynucleotiden von SEQ
ID NO: 12 und SEQ ID NO: 14 als Primer durchgeführt, um etwa 4 kb Fragmente
zu amplifizieren, welche gereinigt wurden und mittels Elektrophorese
und nachfolgendem Ausschneiden zurückgewonnen wurden. Die Fragmente
wurden an einem pT7Blue-Vektor (Novagen, Inc.) ligiert, und Escherichia
coli DH5α wurde
mit dem Ligationsprodukt transformiert. Unter den erhaltenen Klonen
wurde ein Klon, der den pT7Blue mit dem 4 kb-Insert stromabwärts des
lac-Promotors in Sinn-Richtung beherbergt, um ein Fusionspolypeptid
mit einem N-terminalen Anteil eines lacZ-Polypeptids zu bilden,
ausgewählt.
Dieser wurde als ein Expressionsklon (2) bezeichnet und in den folgenden
Tests der Produktion eines Polypeptids und von dessen Effekten verwendet.
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Beispiel 13
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Zehn
Erlenmeyerkolben mit 300 ml Kapazität, enthaltend 200 ml eines
2×YT-Mediums
wurden vorbereitet. In 5 Kolben von diesen wurde der Expressionsklon
(2), erhalten in Beispiel 12, inokuliert und bei 37°C über Nacht
unter Schütteln
kultiviert. Als ein Vergleichskontrolle-Klon wurde Escherichia coli
DH5α, der
einen pT7Blue-Vektor aufwies, der darin insertiert kein 4 kb-Fragment
aufwies, in die verbleibenden 5 Kolben inokuliert und auf die gleiche
Weise wie die obigen kultiviert. Nach Abschluss der Kultur wurden
Bakterienzellen mit einem Mikroskop beobachtet. Als ein Ergebnis
wurde die Bildung von Einschlusskörpern in den Bakterienzellen
nur im Fall des Expressionsklons (2) beobachtet. Die Bakterienzellen
wurden einmal aus jedem Kolben mittels Zentrifugation zurückgewonnen
und nach Waschen mit Wasser wurden die Bakterienzellen wiederum
zentrifugiert, um sie zurückzugewinnen
und dann in Wasser zu suspendieren, um es letztlich in 23 ml zu
bringen.
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20
g pro Schale Lauberde wurde ausgemessen und in 15 aus Kunststoff
hergestellte Nährschalen
von 6 cm Durchmesser gefüllt.
In 5 Schalen von diesen wurde eine Suspension des Expressionsklons
gegeben und in andere 5 Schalen von diesen wurde eine Suspension
des Vergleichskontroll-Klons gegeben, was von gutem Mischen gefolgt
wurde. Die verbleibenden 5 Schalen wurden für Nullwert-Tests ohne Zugabe
bestimmt. In jede der Nährschalen
wurde eine Erststadiumlarve von Anomala cuprea gesetzt und unter
Bedingung von 25°C
versorgt. Die Körpergewichte
der Larven wurden mit einem Verstreichen der Zeit gemessen und verglichen,
um die Larvenwachstum-inhibierende
Aktivität
des Expressionsklons (2) zu verifizieren. Im Gegensatz zu dem Leerwert-Test
und der Kontroll-Charge
unterdrückte
eine Charge, wo der Expressionsklon (2) zugegeben war, offensichtlich
die Zunahme an mittlerem Körpergewicht
(8), was bestätigte,
dass der Expressionsklon (2), das heißt das Polypeptid der vorliegenden
Erfindung, einen Larvenwachstum-inhibierenden Effekt aufweist.
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