DE106542T1 - Plasmidstabilisierung. - Google Patents

Plasmidstabilisierung.

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DE106542T1
DE106542T1 DE198383305439T DE83305439T DE106542T1 DE 106542 T1 DE106542 T1 DE 106542T1 DE 198383305439 T DE198383305439 T DE 198383305439T DE 83305439 T DE83305439 T DE 83305439T DE 106542 T1 DE106542 T1 DE 106542T1
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plasmid
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dna fragment
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/69—Increasing the copy number of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
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Claims (1)

  1. Patentansprüche
    1. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß
    es sowohl ein oder mehrere inserierte Gene trägt, wobei das (die) Gen(e) nicht von Natur aus mit dem Plasmid verwandt ist (sind), als auch ein inseriertes DNA-Fragment, das eine partitionierende Funktion exprimiert.
    2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die partitionierende Funktion durch eine R1 par Region ausgeübt wird.
    3- Plasmid nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das DNA-Fragment als wesentlichen Bestandteil die R1 par Region A, die R1 par Region B oder sowohl die R1 par Region A als auch die R1 par Region B enthält.
    4. Plasmid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das inserierte DNA-Fragment, das
    die R1 par Region A und die R1 par Region B enthält, nicht länger als etwa 6 kb, bevorzugt nicht langer als etwa 4 kb und besonders bevorzugt nicht länger als 3 kb ist.
    5. Plasmid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das inserierte DNA-Fragment, das die R1 par Region A enthält, nicht länger als etwa 4 kb, bevorzugt nicht länger als etwa 2,5 kb und besonders bevorzugt nicht langer als 2 kb ist.
    6. Plasmid nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das inserierte DNA-Fragment, das die R1 par Region B enthält, nicht langer als etwa 2 kb, bevorzugt nicht langer als etwa 1,5 kb und besonders bevorzugt nicht langer als etwa 1 kb ist.
    7. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlieh ein Gen trägt, das Resistenz gegen Antibiotika vermittelt.
    8. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es bei Ab-Wesenheit eines inserierten DNA-Fragments, das die partitionierende Funktion ausübt, nicht stabil vererbt werden würde.
    9- Plasmid nach Anspruch 8, dadurch g e k e η η zeichnet, daß es ein ρ 15 Plasmid oder ein Derivat dieses Plasmids ist oder ein Plasmid ist, das in hoher Kopienzahl vorliegt und einen weiten Wirtsbereich aufweist, oder ein Derivat dieses Plasmids ist.
    10. Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es dadurch nicht stabil vererbt wird, daß es ein DNA-Fragment trägt, das ein oder mehrere Gene enthält, die nicht von Natur aus mit dem
    Plasmid verwandt sind.
    11. Plasmid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es ein pMB1 Plasmid oder ein Derivat dieses Plasmids ist, beispielsweise ein pBR322 Plasmid oder ein Derivat von diesem .
    12. Plasmid nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß es zumindest während eines Stadiums der Kultivierung der Bakterien, die das Plasmid enthalten, eine niedrige Kopienzahl aufweist.
    13- Plasmid nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kopienzahl von etwa 0,5-5 Kopien pro Zelle aufweist.
    14. Plasmid nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es ausgewählt wird aus Plasmiden der Inkompatibilitätsgruppe IncFII, einschließlich R1 und Derivaten von diesen; F und Derivaten von diesen
    und Plasmiden mit niedriger Kopienzahl und breitem Wirtsbereich und Derivaten von diesen.
    15. Plasmid nach Anspruch 12 oder 13, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Plasmid mit konditional ungehemmter (runaway) Replikation ist.
    16. Plasmid nach Anspruch 15, dadurch g e k e η η zeichnet, daß es, wenn der Wirtsmikroorganismus, der das Plasmid enthält, unter bestimmten Bedingungen gezüchtet wird, eine Kopienzahl aufweist, die nicht größer als etwa 3-5 Kopien pro Zelle ist, und daß es, wenn der Wirtsorganismus unter bestimmten anderen Bedingungen gezüchtet wird, eine Kopienzahl in der Höhe von mindestens etwa 500 - 1000 Kopien pro Zelle aufweist.
    υ ι υ υ ο *■+ /.
    17- Plasmid nach Anspruch 16,· dadurch gekennzeichnet, daß es eine Kopienzahl von nicht mehr als etwa 3-5 Kopien pro Zelle bei einer ersten Temperatur und eine Plasmidkopienzahl in der Höhe von mindestens etwa 500-1000 Kopien pro Zelle bei einer höheren Temperatur aufweist.
    18. Plasmid nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß die nicht höher als etwa 3-5 Kopien pro Zelle liegende Plasmidkopienzahl im Bereich von etwa 0,5 bis 1 Kopie pro Zelle liegt.
    19- Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 1, 16, 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß ein regulierbarer Prömotor stromaufwärts des (der) nativen Replikationskontrollgens (-gene) des Plasmids inseriert ist.
    20. Plasmid nach mindestens einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, daß es ein R1-Typ Plasmid ist.
    21. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es ein inseriertes DNA-Fragment trägt, das kürzer ist als das EcoRI-A-Fragment des Plasmids R1 und eine R1 par Region enthält.
    22. Plasmid nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß das inserierte DNA-Fragment die RI par Region A, die R1 par Region B oder sowohl die R1 par Region A und die R1 par Region B enthält.
    23- Plasmid nach Anspruch 22, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das DNA-Fragment als wesentlichen Bestandteil die R1 par Region A, die R1 par Region FS oder sowohl die R1 par Region A und die R1 par Region B enthält.
    24. Plasmid nach Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, daß das inserierte DNA-Fragment, das die R1 par. Region A und die R1 par Region Π enthält, nicht langer ist als etwa 6 kb, bevorzugt nicht länger als etwa 4 kb und besonders bevorzugt nicht langer als etwa 3 kb.
    25. Plasmid nach Anspruch 23, dadurch g e k e η η -
    ζ ei c h.n e t, daß das inserierte DNA-Fragment, das die R1 par Region A aufweist, nicht langer als etwa U kb, bevorzugt nicht langer als etwa 2,5 kb und besondersbevorzugt nicht langer als etwa 2 kb ist.
    26. Plasmid nach Anspruch 23, dadurch g e k e η η zeichnet, daß das inserierte DNA-Fragment, das die R1 par Region B enthält nicht länger als etwa 2 kb, bevorzugt nicht langer als etwa 1,5 kb und besonders bevorzugt nicht langer als etwa 1 kb ist.
    27. Bakterium, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Plasmid nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche enthält.
    28. Bakterium nach Anspruch 27, dadurch gekennzeichnet, daß es ein gramnegatives Bakteriura ist.
    29. Bakterium nach Anspruch 28, dadurch g e k e η η zeichnet, daß es Escherichia coli ist.
    30. Verfahren zum Herstellen eines Genprodukts einer Plasmid-DNA, dadurch gekennzeichnet, daß Bakterien, die ein Plasmid gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 20 oder 21 bis 26 enthalten, kultiviert werden und das Genprodukt des Plasraids aus der Bakterienkultur geerntet wird.
    31. Verfahren nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß die Kultivierung mindestens für eine Dauer von 100 Generationen d-.-r Bakterien durchgeführt wird .
    32. Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, daß der Verlust des Plasmids unter 2 χ 10 /Zelle/Generation liegt.
    33- Verfahren nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß der Verlust des Plasmids unter
    -S
    10 /Zelle/Generation liegt.
    31*. Verfahren nach Anspruch 33, dadurch g e k e η η zeichnet, daß der Verlust des Plasmids unter 5 χ 10" /Zelle/Generation liegt.
    35. DNA-Fragment, dadurch gekennzeichnet, daß es als wesentlichen Bestandteil eine R1 par Region enthält.
    36. DNA-Fragment nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, daß es als wesentlichen Bestandteil die R1 par Region A, die R1 par Region B oder sowohl die R1 par Region A als auch die R1 par Region B enthält.
    37. DNA-Fragment nach Anspruch 36, dadurch gekennzeichnet, daß es die R1 par Regionen A und B enthält und daß es nicht langer als etwa 6 kb, bevorzugt nicht langer als etwa 4 kb und besonders bevorzugt nicht langer als 3 kb ist.
    38.-DNA-Fragment nach Anspruch 36, dadurch g e k e η η zeichnet, daß es die R1 par Region A enthält und daß es nicht langer als etwa 4 kb, bevorzugt nicht langer als etwa 2,5 kb und besonders bevorzugt nicht langer als 2 kb ist.
    39. DNA-Fragment nach Anspruch 36, dadurch >\ e kennzeich η e t, daß. es die R1 par Region B enthält und daß es nicht langer als etwa 2 kb, bevorzugt nicht länger als etwa 1,5 kb und besonders bevorzugt nicht langer als 1 kb ist.
DE198383305439T 1982-09-16 1983-09-16 Plasmidstabilisierung. Pending DE106542T1 (de)

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