DE2915081A1 - Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinen - Google Patents
Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinenInfo
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Description
Γ _4- 291508Γ
Die Erfindung betrifft Bakteriophagen, die in ihrem Genom durch Genfusion, vorzugsweise in-vitro-Genfusion, mit einem ein
fremdes Gen enthaltenden DNA—Fragment modifiziert sind. Dieses
Gen besitzt die Information für die Bildung eines bestimmten prokaryotisehen oder eukaryotischen Proteins. Diese Phagen sind
so beschaffen, daß sie die Expression dieses Gens in einem Bakterium
ermöglichen.
Die Erfindung betrifft außer dem erfindungsgemäß modifizierten
Bakteriophagen die DNA (Desoxyribonukleinsäure) selbst bzw. das Genom des Vektors.
Die Insertion von Genen in Vektoren wurde bereits erfolgreich,
beispielsweise mit dem Insulingen, durchgeführt. Diese Gene waren aufgrund ihrer Fähigkeit,sich inihren natürlichen Wirtszellen
in Form eines bestimmten Proteins zu exprimieren, gut charakterisiert. Die auftretenden Schwierigkeiten bei der Expression
eines solchen Gens in den Bakterien, die mit einem dieses Gen enthaltenden Vektor infiziert wurden, konnten jedoch
in den meisten Fällen bisher nicht überwunden werden - folglich
2^ auch nicht die Schwierigkeit, verhältnismäßig bedeutende Mengen
des entsprechenden Proteins durch die Bakterien zu bilden, die zur Proteinbildung vom Vektor veranlaßt worden sind, Bei dieser
bisher negativen Bilanz ist eine bemerkenswerte Ausnahme zu verzeichnen: die kürzlich durchgeführte Expression von Somatostatin
in Escherichia coli Bakterien. E. coli Zellen wurden
durch ein Plasmid transformiert, das in seinem Genom das genetische
Fusionsprodukt aus dem synthetischen Gen von Somatosta— tin und dem Gen Z von ß-Galactosidase des Lactose-Operons von
E. coli enthielt. Die entsprechenden Versuche wurden in "Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthesized
Gene for the Hormone Somatostatine" in Science, Bd. 198 (9.. 12.1977) , S. 1056-1063, von Keiichi Itakura et al. beschrieben.
Nach Angaben der Autoren stellte das gebildete Hybrid
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Γ . -s- 291508Γ
von ß-Galactosidase und von Somatostatin unter bestimmten Versuchsbedingungen
mindestens 3% des gebildeten zellulären Proteins dar.
in Science, Bd. 196 (8.4.1977), S. 161-169, sind auch aus dem
Lambda Q)-Bakteriophagen gebildete Vektoren beschrieben, die
durch Iac 5-Substitution in ihren Genomen modifiziert worden sind. Diese Substitutionen haben den Promotor-Operator und das
Gen Z von E. coU für die ß-Galactosidase (Iac z) . Diese Substitution
wird als interessante Anzeige dafür gewertet, daß ein bestimmtes DNA-Fragment in den Vektor kloniert worden ist, vor
allem, wenn sich die Insertionsstelle für zu klonierende DNA in der Substitution befindet. Die (doppelt) modifizierten Vektoren,
die eine erfolgreiche Klonierung beweisen, können insbe— sondere in Iac —Zellen ausfindig gemacht werden, und zwar als
Iac -Bakteriophagen, weil weiße Plaques erhalten werden. Im Gegensatz dazu bildet der nichtmodxfizierte Iac -Vektor unter
denselben Versuchsbedingungen gefärbte Plaques auf Nährböden, die ein geeignetes farbiges Substrat, beispielsweise das
5-chlor-4-brom-3—indoxyl—ß-D-galactosid (XG),enthalten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Vektoren zu schaffen,
die durch Insertion eines Gens, das normalerweise für die Expression eines bestimmten Proteins in der Zelle, aus der es
stammt, codiert, in ihre Vektoren-DNA modifiziert worden sind. Diese Vektoren sind imstande, Bakterien, insbesondere E.coli, zu
infizieren und zur Bildung eines Hybridproteins, welches das bestimmte Protein enthält, zu veranlassen und diese Bildung derart zu
amplifizieren, daß Ausbeuten von mehr als 10%, ja sogar 30 bis 50% der
Gesamtmenge des gebildeten zellulären Proteins erzielt werden.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß unter bestimmten Bedingungen
die effektive Expression eines natürlichen Gens einer eukaryotischen Zelle, und nicht mehr nur eines synthetischen
^* Gens, in Form eines effektiv gebildeten Proteins ermöglicht
wird „
S09843/087
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten
Gegenstand.
Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße Vektor imstande ist nach
Insertion in den Teil des Gens Z, beispielsweise verknüpft am Promotor-Operator des Lactose-Operons, eines prokaryotischen
bzw. eukaryotischen DNA-Fragmerfcs, insbesondere eines
natürlichen Gens, das für die Expression eines bestimmten Proteins,
in der Zelle, aus der es stammt, codiert - die Bildung eines Hybridproteins, das .mindestens einen Teil der ß-Galactosidase
und das bestimmte Protein enthält, durch ein Bakterium,
insbesondere E. coli, das diese Mutationen nicht unterdrücken kann und das vorher mit dem erfindungsgemäß modifizierten Vektor
infiziert worden ist, so zu steuern, daß höhere Ausbeuten erzielt werden.
Es versteht sich, daß die Insertion eines zusätzlichen DNA-Fragments
in das Gen Z des erfindungsgemäß modifizierten Phagen sich
ebenso auf das Gen Z als Ganzes wie auf den Teil des Gens bezieht,
der nach einer Deletion desselben fortbestehen kann, sofern diese Deletion nicht zur Folge hat, daß die Expressionsfähigkeit
im Bakterium eines Hybridproteins, welches das bestimmte dem inserierten Gen entsprechende Protein enthält,
unterdrückt wird.
Der Promotor des Lactose-Operons kann durch einen anderen Promotor eines anderen bakteriellen Operons ersetzt werden, beispielsweise
durch den Promotor des Maltose-Operons und des Galactose-Operons von E. coli.
30
30
Besonders gute Ergebnisse werden mit der erfindungsgemäß modifizierten
DNA bzw. mit dem entsprechenden Phagen erzielt, wenn die Mutationen zur Verhinderung bzw. Verzögerung der Expression
der später kommenden Gene, die Gene Q und S der Λ Phagen DNA ^5 betreffen.
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Γ - 7 - 291508Γ
Es wurde gefunden, daß die Operone oder deren entsprechende .Promotoren/
beispielsweise der Lactose-Promotor von E. coli, in der Lage sind, ein ausreichendes Signal zu geben, das die
Synthese des Proteins (das dem in das Gen Z der erfindungsgemäß
modifizierten DNA inserierten Gen entspricht) durch das mit dem
erfindungsgemäßen Phagen oder der DNA infizierte Bakterium auszulösen
vermag.
Man erzielt somit eine Überproduktion des Hybridproteins auf Kosten der Bakterien— oder Phagenproteine wegen der Wirkung der
Mutationen in den später kommenden Genen, insbesondere Q und S des Bakteriophagen. Diese Mutationen, welche die Expression der
spaten Phagengene unterdrücken und zumindest eine Verzögerung der Bakterienlyse bewirken, führen im Bakterium zu einer Akkumulierung
zahlreicher Kopien des Bakteriophagengenoms und gleichzeitig zu einer Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese.
Demnach beträgt der Anteil an Hybridprotein mindestens etwa 30 bis 50% der Gesamtmenge des durch solche Bakterien gebildeten
zellulären Proteins.
Der erfindungsgemäße Phage kann durch dem Fachmann geläufige
Verfahren erhalten werden.
Falls beispielsweise die Endonuclease ein Restriktionsenzym . ist, wie etwa das Enzym EcoRI oder das Enzym Sst, so können
andere möglicherweise vorhandene Schnittstellen im Phagen durch Punktmutationen oder Deletionen ausgemerzt werden, beispielsweise
durch Methoden, wie sie in Proc.Nat.Acad.Sci. (Wash.),
Bd. 1 (1974), S. 3927-3930, von A. Rambach und P. Tiollais in
"Bacteriophageλ having EcoRI endonuclease sites only in the
non-essential of the genome" beschrieben wurden.
Die Ausmerzung dieser anderen Schnittstellen erleichtert daher eine in vitro-Inkorporation des für das Protein charakteristischen
Gens in das Gen Z des erfindungsgemäßen Phagen, sofern
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dieses Gen oder das dieses Gentragende DNA-Fragment vorher gegebenenfalls
mit geraden, geschlossenen oder anderen (nämlich überstehenden) Enden versehen worden ist,Hierdurch wird mit Hilfe
einer DNA-Ligase das Zusammenfügen dieses zusätzlichen Fragments des DNA—Fragments und der aus dem erfindungsgemäß modifizierten
Phagen erhaltenen Fragmente durch die Einwirkung der Endonuclease auf seine DNA möglich .
Ebenso können die Mutationen der spaten Gene, insbesondere der
Gene Q und S, in an sich bekannter Weise erhalten werden. Es handelt sich dabei um sogenannte Unsinn-Mutation=n, beispielsweir^
se Amber, wie sie A. Campbell in "Sensitive mutants of bacteriophage
λ ", Virology, Bd. 14 (1961), S. 22-32, und A.R. Goldberg
und M. Howe in "New Mutations in the S Cistron of Bacteriophage λ Affecting Host Cell Lysis", Virology, Bd. 38 (1969),
S. 200-202, beschrieben haben.
Selbstverständlich schließt die vorliegende Erfindung die Möglichkeit
nicht aus, in den Phagen zusätzliche Mutationen unter den nachstehend angegebenen Bedingungen einzuführen, beispielsweise
in andere Gene des Phagen wie bei der Bildung von gewissen Bestandteilen der Kapsel, und zwar sogar in DNA-Teilen
des Phagen, die wesentlich sind für seine Eigenschaft der Replikation
in einem Bakterium, das diese Mutationen unterdrücken kann.
Der erfindungsgemäße Phage kann und soll sogar übliche
Mutationen oder Deletionen haben, die seine biologische
Sicherheit -- wie dem Fachmann bekannt ist - garantieren.
Gegebenenfalls hat der erfindungsgemäße Phage zusätzliche übliche Deletionen in denjenigen Teilen, die nicht
wesentlich für die Vervielfältigung des Phagen im Wirtsbakterium
sind, sofern sich dies als notwendig für die Einkapselung des erfindungsgemäßen Phagen in ein Bakterium insbesondere in E.coli,
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Γ V9 - 291508Γ
erweist, das diese Mutationen in den spaten Genen des Phagen
unterdrücken kann, wenn die Phagen im Hinblick darauf gebildet
werden sollen, den verfügbaren Phagenvorrat zu ergänzen.
Diese Deletionen können möglicherweise das Gen Z selbst betreffen,
. sofern sie die Bildung eines Hybridproteins, welches das
zu synthetisierende Protein enthält, nicht beeinträchtigen.
Ein Verfahren zur Deletion eines Teils des Gens Z ist nachstehend in einem Beispiel erläutert.
Ein Verfahren zur Deletion eines Teils des Gens Z ist nachstehend in einem Beispiel erläutert.
Die Insertion des Gens oder des fremden DNA-Fragments, welches
das für die Expression des in Frage stehenden Proteins codierende Gen enthält, in das Gen Z der erfindungsgemäßen DNA kann in
an sich bekannter Weise erfolgen, vorausgesetzt die Enden der
DNA machen das Einfügen (in das Gen Z) möglich mit Hilfe einer geeigneten DNA-Ligase zwischen den durch das Schneiden der erfindungsgemäßen
DNA durch die Endonuclease, beispielsweise
EcoRI, an der angegebenen Schnittstelle im Gen Z entstandenen
freien Enden.
EcoRI, an der angegebenen Schnittstelle im Gen Z entstandenen
freien Enden.
Die r.ekombinanten DNA können sodann in an sich bekannter Weise
erneut in einen Stamm eines Iac -Wirtsbakteriums (nach einer
Deletion in dessen Genom selbst an seinem Lactose-Operon), der die Mutationen in den später kommenden Genen unterdrückt, eingefügt werden. Nach der Vervielfältigung der mittels Züchtung
der Bakterien erhaltenen rekombinanten Moleküle isoliert man
diejenigen Klone, die farblose Plaques auf Nährböden bilden,
die ein farbiges, für die Expression von ß-Galactosidase
charakteristisches Substrat, beispielsweise 5-Chlor-4-brom-3-
Deletion in dessen Genom selbst an seinem Lactose-Operon), der die Mutationen in den später kommenden Genen unterdrückt, eingefügt werden. Nach der Vervielfältigung der mittels Züchtung
der Bakterien erhaltenen rekombinanten Moleküle isoliert man
diejenigen Klone, die farblose Plaques auf Nährböden bilden,
die ein farbiges, für die Expression von ß-Galactosidase
charakteristisches Substrat, beispielsweise 5-Chlor-4-brom-3-
indolyl-ß-galactosid, enthalten.
Der erfindungsgemäße Vektor bzw. seine DNA sind demnach besonders interessant, da sie eine Bildung von Proteinen, die normalerweise
durch eukaryotische Zellen oder auch andere eukaryotische Organismen gebildet werden, durch ein Bakterium,insbesondere
vom Typ E. coli, auszulösen vermögen.Seine Verwendung kann in Betracht
vom Typ E. coli, auszulösen vermögen.Seine Verwendung kann in Betracht
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gezogen werden, wenn man über ein Gen verfügt, dessen Codierfähigkeit,
für die Expression bestimmer Proteine der Zelle, aus der es
stammt, erkannt worden ist,
Wie nachstehend in einem der Beispiele gezeigt wird, können die erfindungsgemäß modifizierte DNA bzw. der Phage zur Bildung eines
Proinsulin enthaltenden Hybridproteins verwendet werden. Sie können außerdem zur Bildung eines Somatostatin enthaltenden
Hybridproteins verwendet werden. Das a.a.O. beschriebene Somatostatin kann aus dem Hybridprotein herausgeschnitten werden,
beispielsweise durch ein ebenfalls dort beschriebenes Verfahren.
Weiterhin können die erfindungsgemäße DNA bzw. der Phage auch zur Bildung bakterieller oder viraler Proteine verwendet werden, bei-15spielsweise
in Zeiltypen, die eine bedeutende antigene Rolle bei
krankheitserregenden Keimen spielen. Sie können insbesondere für die Herstellung von Impfstoffen gegen solche Bakterien oder Viren,
die krankheitserregend bei Mensch und Tier sind, verwendet
werden, wie in einem der Beispiele ebenfalls gezeigt wird. 20
Machstehend sind einige besonders geeignete erfindungsgemäße
Vektoren anhand der Fig. 1 bis 5 erläutert.
In Fig. 1 ist die DNA eines natürlichen Phagen j\ schematisch dar-25gestellt
und beschränkt sich im wesentlichen auf die Angabe des verwendeten Maßstabs, ausgedrückt in % Länge, beginnend bei den
Genen für den Kopf des Phagen.
In Fig. 2 und 3 sind die Genotypen der modifizierten DNA gemäß SOyorllegender Erfindung schematisch dargestellt.
In Fig. 4a bis 4d sind jeweils die vom Gen Z verursachten !Anwandlungen
der Reihe nach dargestellt.
3^ In Fig. 5 ist der Genotyp des modifizierten Phagen gemäß einer
anderen Ausführungsform der Erfindung schematisch dargestellt.
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In Fig. 2, 3 und 5 sind die Mutationen zur Unterdrückung der durch eine Endonuclease schneidbaren Stellen durch einen kleinen
Kreis, die Punktmutationen durch einen Punkt und die DeIetionen durch Klammern, die einen weißen Raum abgrenzen, dargestellt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Fig. 1 zeigt den nicht wesentlichen Hauptteil NE des natürlichen
Phagen, an dem Substitutionen, Deletionen und Mutationen vorgenommen werden können, ohne dadurch die Fähigkeit des Phagen,
sich zu replizieren und sich in ein Bakterium, insbesondere
vom Typ E. coli K 12, einzukapseln, in Frage zu stellen.
15
Der durch den in Fig. 2 dargestellten Genotyp charakterisierte Phage umfaßt:
- eine Substitution durch ein DNA—Fragment von E. coli, die in
den Figuren durch ein mit dem Buchstaben Z bezeichnetes
Rechteck markiert ist; dieses DNA—Fragment enthält im vorliegenden
Beispiel den Promotor, den Operator und das Gen Z des Lactose-Operons.
- Ambermutationen: Qam 73 und Sam 7 in den Genen Q bzw. S, beide
Typen von Mutationen {.G^npbell, A., "Sensitive Mutants of
Bacteriophage X ", Virology, Bd. 14 (1961), S. 22-23;
Goldberg, A.R., und Howe, M., "New Mutation in the S Cistron
of Bacteriophage λ Affecting Host Cell Lysis", Virology, Bd. 38 (1969), S. 200-202) können durch die Suppressoren E
und F (definiert von Stretton, A.O.W. Kaplan, S. und Brenner, S., "Nonsense Codons", Cold Spring Harbor, Symp.
Quant.Bio!., Bd. 31 (1966), S. 173) unterdrückt werden und
kommen in bestimmten Stämmen von E. coli K 12, beispielsweise E. coli K 12-C600 und YMC, vor.
- Eine einzige Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI,
die nahe dem Ende des Gens Z liegt, das vom Promotor des Operons am weitesten entfernt ist, unter Ausmerzung aller .
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anderen Schnittstellen für EcoRI im Phagen. Diese Schnittstelle
(in Fig. 2 EcoRI-Z genannt) wird durch einen Pfeil unter dem Rechteck, das die Substitution darstellt, angezeigt. Alle, anderen
EcoRI-Schnittstellen sind ausgemerzt, entweder durch
Mutationen im Falle der Schnittstellen sRIyU, sRI/\_., sRI^.,-(wie
von A. Rambach und P. Tiollais, a.a.O. beschrieben) oder durch eine Deletion zwischen den Schnittstellen sHindIII/)~
und sHindIII ^3 für die Schnittstelle SRlA2. Diese Deletion
wird durch partielle Hydrolyse der Phagen DNA durch das Enzym Hind III erhalten.
Die Deletion zwischen den Schnittstellen sHindlllXp und
sHindlll^of wie auch die Deletion nin 5 und gegebenenfalls
andere Deletionen, sollen außerdem das Phagengenom verkürzen, um seine spätere Verlängerung um das zusätzliche in das Gen Z
einzufügende DNA-Fragment auszugleichen, damit das Genom immer noch in der Lage ist, sich in ein Bakterium mit Suppressoren
der entsprechenden Mutationen einzukapseln.
- Eine Mutation L8UV5 im Promotor des Lactose-Operons, welche
die Synthese von ß-Galactosidase unempfindlich gegen katabolische
Repression macht.
Schließlich umfaßt dieser Phage folgende zusätzliche Mutationen und/oder Deletionen, welche die biologische Sicherheit dieses
Vektors unterstützen:
- Eine Mutation Earn 1100, die zusammen mit den Mutationen am
in den Genen Q und Z sicher stellt, daß diePropagationsrate in
— in einem Nicht—Suppressor-Stamm kleiner als 10 ist;
- Eine Deletion "nin 5" zwischen den Positionen 83,6 und 89.2%,
die verhindern soll, daß sich eine stabile, plasmidähnliche
Struktur einnisten kann;
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- Eine Deletion KH 54 oder eine Mutation cl~, jiie den Phagen
unfähig macht, sich als Prophage in das Chr olios am das Wirtsbakteriums
zu integrieren, sei es an die Stelle der .Phagen-anheftung,
sei es Rekombination seines Gens Z in das Gen Z der Bakterien mit einer Rate
<10 ;
- Die hier verwendeten Bakter'ienstamme tragen eine Deletion in
ihrem Lactose-Operon(Deletion X 74), so daß die Integration
eines fremden DNA—Fragments mittels Rekombination in das Gen Z
-(O verhindert wird..
Diese zusätzlichen Mutationen und/oder Deletionen können natürlich
durch andere aus dem Stand der Technik bekannte Sicherheitsmechanismen ersetzt werden.
Dieser Phage läßt sich als Iac -Bakteriophage in einem Testerstamm
E.coli K 12«diac auf gefärbten, insbesondere das vorgenannte
Substrat XG enthaltenden Nährböden feststellen.
Ein solcher mit dem hier beschriebenen Phagen infizierte Stamm
ist in der Collection Nationale de Cultures de Micro-Organismes de 1'Institut Pasteur (CNCM) in Paris unter der Nr. 1-055 hinterlegt.
-B ei.spiel. "2
Nachkommen des Phagen vom Typ AAZQS-EcoRI und •tYÄZQS-EcoRI
Dieses Beispiel erläutert ein Deletionsverfahren für Zelltypen, die sich zum "Verkürzen" des Gens Z eignen.
Das Genom des Bakteriophagen (in der CNCM unter der Nr. 1-056
hinterlegt) unterscheidet sich vom Phagen aus Beispiel 1 in erster Linie hinsichtlich der Substitution Z (Fig. 3). Im. Gen Z
selbst wird eine bedeutende Deletion vorgenommen, die unter den nachstehenden Bedingungen (anhand von Fig. 4a-4d) durchgeführt
wird:
Man geht vom Phagen aus Beispiel 1 aus. Das Fragment OP Hae III
203 (Fig. 4a) ,, das zwei EcoRI-Enden hat, wird in die EcoRI-
L . 909843/Q87S J
QRlQINAL. INSPECTED
Schnittstelle des Gens Z (nach der von Backmann, K., et al. in
Proc. Nat.Acad.Sci., Bd. 73 (1976), S. 4174-4178 beschriebenen
» Methode) inseriert. Der Phage trägt auf beiden Seiten ein zentrales
Stück von OP, ein Fragment Z1, das vom Anfang des Gens Z stammt und die Codons für die ersten 7 Aminosäuren des Genprodukts
enthält und ein Fragment I" vom Ende des Repressors vom Lactose-Operon. Wenn das Fragment OP Hae III 203 (dargestellt
in verkleinertem Maßstab in der Fig. 4b) in der gleichen Richtung eingefügt wird wie das Fragment OP, das homolog ist dem
Fragment nahe dem Ende Z" des Phagengens Z (in Fig. 4b mit "op" bezeichnet und nahe einem Fragment I" vom Ende des Repressorgens
I vom Lactose-Operon), so führt eine intramolekulare Rekombination zu einer Deletion (Fig. 4c), die beinahe das ganze Gen Z
erfaßt. Dies wiederum ermöglicht eine neue Schnittstelle für EcoRI (EcoRI- ΔΖ) anstelle der Schnittstelle Hae III, sehr nahe
dem Origin des Gens Z an einer Stelle, die der 7, Aminosäure der ß-Galactosidase entspricht. Vom ursprünglichen Gen Z bleiben
nur die Fragtiente Z" und Zf auf beiden Seiten der Schnittstelle
EcoRI- ΔZ übrig. Das Permeasegen des lac-Operons (Gen Y)
2^ wird durch in vivo-Rekombination zwischen einem das gesamte
lac-Operon tragenden Phagen und dem Phagen ÄAZQS eingefügt.
Die Rekombinante (Fig. 4d), die das Gen Y nahe der Schnittstelle EcoRI-ΔΖ inseriert trägt, also nahe dem lac-Promotor, läßt sich
als Phage Y feststellen, d.h. er exprimiert das Gen Y. Der Stamm A lac (Deletion X 74)lysogen für diesen Phagen synthetisiert
Permease, wie durch den Melibiosetest bei 420C nachgewiesen
wird.
Dieser Phage (in CNCM unter der Nr. 1-058 hinterlegt) unterscheidet
sich in erster Linie vom Phagen aus Beispiel 1 durch seine einzige Schnittstelle für Sstl im Gen Z (ß-Untereinheit) ,
nachdem die übrigen Schnittstellen Sstl durch die Deletion b515 ausgemerzt worden sind. Fig. 5 stellt den Genotyp dieses
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Γ - ^ -
291508Γ
Phagen dar. Der Phage ist mit den gleichen biologischen Sicherheitsmechanismen
versehen und ist unter den gleichen Bedingungen feststellbar wie der Phage aus Beispiel 1.
Beschreibung eines rekombinanten Phagen durch eine Fusion zwischen einem DNA-Fragment des Adenovirus 5 und dem Gen Z, wie
es der Phage aus Beispiel 1 trägt
Ein DNA-Fragment des Adenovirus 5, der an den Enden die EcoRI*- Sequenz hat, wird in vitro an der EcoRI-Z Schnittstelle des. Phagen aus Beispiel 1 inseriert. Dieser rekombinante Phage (in der CNCM unter der Nr. 1-057 hinterlegt), läßt sich als Iac -Phage feststellen, indem er weiße Plaques auf Testerstämmen und in den vorgenannten Nährböden bildet. In diesem rekombinanten Phagen findet eine Fusion zwischen dem Adenovirusgen und dem Gen Z statt. Ein Hybridprotein, das der Fusion zwischen JB-Galactosidase und dem fremden Protein entspricht und nachweisbar durch sein höheres Molekulargewicht ist, wird durch PoIyacrylamidgel-Elektrophorese für Proteine untersucht, die im stamm E.coli K12 Hfr 3000 X 74 nach Infizierung dieses Stammes mit dem rekombinanten Phagen synthetisiert werden. Die Synthese des Hybridproteins kann durch einen Induktor der Synthese von ß-Galactosidase, beispielsweise Isopropylthxogalactosid (IPTG), in einem den Repressor vom Lactose-Operon überproduzierenden
Ein DNA-Fragment des Adenovirus 5, der an den Enden die EcoRI*- Sequenz hat, wird in vitro an der EcoRI-Z Schnittstelle des. Phagen aus Beispiel 1 inseriert. Dieser rekombinante Phage (in der CNCM unter der Nr. 1-057 hinterlegt), läßt sich als Iac -Phage feststellen, indem er weiße Plaques auf Testerstämmen und in den vorgenannten Nährböden bildet. In diesem rekombinanten Phagen findet eine Fusion zwischen dem Adenovirusgen und dem Gen Z statt. Ein Hybridprotein, das der Fusion zwischen JB-Galactosidase und dem fremden Protein entspricht und nachweisbar durch sein höheres Molekulargewicht ist, wird durch PoIyacrylamidgel-Elektrophorese für Proteine untersucht, die im stamm E.coli K12 Hfr 3000 X 74 nach Infizierung dieses Stammes mit dem rekombinanten Phagen synthetisiert werden. Die Synthese des Hybridproteins kann durch einen Induktor der Synthese von ß-Galactosidase, beispielsweise Isopropylthxogalactosid (IPTG), in einem den Repressor vom Lactose-Operon überproduzierenden
2^ Stamm ausgelöst werden, nämlich im Stamm BMH 7156 F'lac i
BMH 7156 F'Iac
Beschreibung eines rekombinanten Phagen,Träger des Gens für Proinsulin aus Ratten, fusioniert mit dem Gen Z, wie es der Phage
aus Beispiel 1 trägt
Das gesamte Proinsulingen wird in vitro an der EcoRI-Z Schnittstelle
des Phagen aus Beispiel 1 inseriert. Das Proinsulingen wird aus zwei Genfragmenten gebildet (Fragmente PAU-1 und PAU-2),
die nach der von Ullrich A. und Mitarb, in Science, Bd. 196 (1977), S. 1313-1319, beschriebenen Methode synthetisiert werden.
Dieser rekombinante Phage wird als lac~-Phage (nach der
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Γ -ie- 2315081"1
gleichen Methode wie in Beispiel 4) festgestellt. Zwischen dem
Gen für Proinsulin aus Ratten und dem Gen Z findet eine Fusion statt. Ein Hybridprotein, das der Fusion zwischen ß-Galactosidase
und dem Proinsulin entspricht und nachweisbar durch sein höheres Molekulargewicht ist, wird durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese
für Proteine untersucht, die im Stamm E. coli K 12 Hfr 3000 X 74 nach Infizierung dieses Stammes mit dem
rekombinanten Phagen synthetisiert werden. Die Synthese des Hybridproteins kann durch einen Induktor der Synthese von ß-Galactosidase,
beispielsweise Isopropylthiogalactosid (IPTG), in einem den Repressor vom Lactose-Operon überproduzierenden
Stamm ausgelöst werden, nämlich im Stamm BMH 7156 F'Iac X^1TMoS.
Wie sich eindeutig aus dem Vorstehenden ergibt, erschöpft sich die Erfindung keineswegs in den in den Beispielen eingehend
beschriebenen Verwendungs- und Durchführungsformen, sondern umfaßt alle Varianten, vor allem Phagen-DNA oder Phagen>
deren Endonuclease-Schnittstelle im Innern des oben genannten Gens Z die Schnittstelle für ein Restriktionsenzym ist, allgemeiner
20*gesagt - für eine Endonuclease. Dabei wird jede andere Schnittstelle
der gleichen Endonuclease in anderen Teilen des Phagengenoms ausgeschlossen. Als Endonuclease kommen auch andere Enzyme
in Frage als die EcoRI- und Sst-Enzyme, die in den Beispielen
ausführlicher behandelt wurden. 25
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, 4Ψ:
Leerseite
Claims (12)
1) Modifizierte /^_Phagen DNA, enthaltend
- Mutationen zur Verhinderung oder Verzögerung der Expression später Gene, speziell der Steuerung der Bildung von zur Einkapselung
der modifizierten DNA erforderlichen Proteinen in ein Bakterium, insbesondere E. coli, das diese Mutation unterdrücken
kann,
- ein DNA-Fragment, enthaltend einen Teil mindestens des Gens Z
von E. coli, und einen Promotor eines bakteriellen Operons oder eines bakteriell-analogen Operons, inseriert in einen unwesentlichen
Teil des Phagen-Genoms und
- eine Schnittstelle für eine Endonuclease in dem Teil des
Gens Z, unter Ausmerzung aller anderen Schnittstellen für die gleiche Endonuclease in der modifizierten DNA.
2. Modifizierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bakterielle Operon das Lactose-Operon von E. coli ist.
3. Modifizierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bakterielle Operon das Maltose- oder Galactose-Operon
TOn B. coli 1st. 9Q9843Z0875
4. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn-
Lonen der spaten Ge
ORIGINAL INSPECTED
zeichnet, daß die Mutationen der spaten Gene die Gene Q und Z
L betreffen. _j
-2- 29150δΓ
5. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Schnittstelle eine Schnittstelle von EcoRI oder Sst ist.
6. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet,
daß die Schnittstelle eine Schnittstelle von Sst ist.
7. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine Deletion eines Stücks des Gens Z.
8. Modifizierte DNA nach Anspruch 2f dadurch gekennzeichnet,
daß das fremde DNA-Fragment ferner das Gen Y des Galactose-Operons enthält.
9. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet,
daß sie ein zusätzliches Fragment einer anderen prokaryotischen bzw. eukaryotischen DNA in den Teil des Gens Z inseriert
enthält, das vom Rest des Phagen durch Schneiden mit Hilfe von Endonuclease an seinen zwei Enden abgetrennt werden kann.
10. Modifizierte DNA nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das zusätzliche DNA-Fragment das Proinsulingen enthält.
1.1. Bakteriophage, dessen Genom aus einer DNA nach Anspruch 1
bis 10 besteht.
12. Verwendung der modifizierten \ Phagen DNA
zur Herstellung eines Hybridproteins, das mindestens ein Fragment der ß-Galactosidase und ein bestimmtes fremdes Protein
enthält, das normalerweise in einer prokaryotisclien bzw. eukaryotischen Zelle durch ein bestimmtes Gen des Genoms dieser
Zelle codiert werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium, insbesondere E. coli, das die Mutationen der spä
ten Gene des /L Phagen nicht unterdrücken kann, mit einer rekombinanten
DNA oder mit einem entsprechenden Phagen infiziert, wobei die rekombinante DNA aus der genetischen Fusionierung des
Proteingens und einer modifizierten DNA nach Anspruch 1 bis 7
L 909843/087S
- "3 - 291508 Γ
1 entsteht.und wobei das Gen in den Teil des Gens Z der modifizierten
DNA inseriert ist, und anschließend das Bakterium gegebenenfalls
in Gegenwart eines Induktors für ß-Galactosidase züchtet,
wobei das Hybridprotein aus dem gebildeten zellulären Protein
5 gewonnen werden kann.
L 9098A3/0875
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