DE2915081A1 - Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinen - Google Patents

Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinen

Info

Publication number
DE2915081A1
DE2915081A1 DE19792915081 DE2915081A DE2915081A1 DE 2915081 A1 DE2915081 A1 DE 2915081A1 DE 19792915081 DE19792915081 DE 19792915081 DE 2915081 A DE2915081 A DE 2915081A DE 2915081 A1 DE2915081 A1 DE 2915081A1
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
gene
phage
dna
modified dna
modified
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
DE19792915081
Other languages
English (en)
Inventor
Pierre Prof Tiollais
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institut Pasteur de Lille
Original Assignee
Institut Pasteur de Lille
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institut Pasteur de Lille filed Critical Institut Pasteur de Lille
Publication of DE2915081A1 publication Critical patent/DE2915081A1/de
Withdrawn legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Γ _4- 291508Γ
Die Erfindung betrifft Bakteriophagen, die in ihrem Genom durch Genfusion, vorzugsweise in-vitro-Genfusion, mit einem ein fremdes Gen enthaltenden DNA—Fragment modifiziert sind. Dieses Gen besitzt die Information für die Bildung eines bestimmten prokaryotisehen oder eukaryotischen Proteins. Diese Phagen sind so beschaffen, daß sie die Expression dieses Gens in einem Bakterium ermöglichen.
Die Erfindung betrifft außer dem erfindungsgemäß modifizierten Bakteriophagen die DNA (Desoxyribonukleinsäure) selbst bzw. das Genom des Vektors.
Die Insertion von Genen in Vektoren wurde bereits erfolgreich, beispielsweise mit dem Insulingen, durchgeführt. Diese Gene waren aufgrund ihrer Fähigkeit,sich inihren natürlichen Wirtszellen in Form eines bestimmten Proteins zu exprimieren, gut charakterisiert. Die auftretenden Schwierigkeiten bei der Expression eines solchen Gens in den Bakterien, die mit einem dieses Gen enthaltenden Vektor infiziert wurden, konnten jedoch in den meisten Fällen bisher nicht überwunden werden - folglich
2^ auch nicht die Schwierigkeit, verhältnismäßig bedeutende Mengen des entsprechenden Proteins durch die Bakterien zu bilden, die zur Proteinbildung vom Vektor veranlaßt worden sind, Bei dieser bisher negativen Bilanz ist eine bemerkenswerte Ausnahme zu verzeichnen: die kürzlich durchgeführte Expression von Somatostatin in Escherichia coli Bakterien. E. coli Zellen wurden durch ein Plasmid transformiert, das in seinem Genom das genetische Fusionsprodukt aus dem synthetischen Gen von Somatosta— tin und dem Gen Z von ß-Galactosidase des Lactose-Operons von E. coli enthielt. Die entsprechenden Versuche wurden in "Expression in Escherichia coli of a Chemically Synthesized Gene for the Hormone Somatostatine" in Science, Bd. 198 (9.. 12.1977) , S. 1056-1063, von Keiichi Itakura et al. beschrieben. Nach Angaben der Autoren stellte das gebildete Hybrid
L 909843/0875
Γ . -s- 291508Γ
von ß-Galactosidase und von Somatostatin unter bestimmten Versuchsbedingungen mindestens 3% des gebildeten zellulären Proteins dar.
in Science, Bd. 196 (8.4.1977), S. 161-169, sind auch aus dem Lambda Q)-Bakteriophagen gebildete Vektoren beschrieben, die durch Iac 5-Substitution in ihren Genomen modifiziert worden sind. Diese Substitutionen haben den Promotor-Operator und das Gen Z von E. coU für die ß-Galactosidase (Iac z) . Diese Substitution wird als interessante Anzeige dafür gewertet, daß ein bestimmtes DNA-Fragment in den Vektor kloniert worden ist, vor allem, wenn sich die Insertionsstelle für zu klonierende DNA in der Substitution befindet. Die (doppelt) modifizierten Vektoren, die eine erfolgreiche Klonierung beweisen, können insbe— sondere in Iac —Zellen ausfindig gemacht werden, und zwar als Iac -Bakteriophagen, weil weiße Plaques erhalten werden. Im Gegensatz dazu bildet der nichtmodxfizierte Iac -Vektor unter denselben Versuchsbedingungen gefärbte Plaques auf Nährböden, die ein geeignetes farbiges Substrat, beispielsweise das 5-chlor-4-brom-3—indoxyl—ß-D-galactosid (XG),enthalten.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde. Vektoren zu schaffen, die durch Insertion eines Gens, das normalerweise für die Expression eines bestimmten Proteins in der Zelle, aus der es stammt, codiert, in ihre Vektoren-DNA modifiziert worden sind. Diese Vektoren sind imstande, Bakterien, insbesondere E.coli, zu infizieren und zur Bildung eines Hybridproteins, welches das bestimmte Protein enthält, zu veranlassen und diese Bildung derart zu amplifizieren, daß Ausbeuten von mehr als 10%, ja sogar 30 bis 50% der Gesamtmenge des gebildeten zellulären Proteins erzielt werden.
Diese Aufgabe wird dadurch gelöst, daß unter bestimmten Bedingungen die effektive Expression eines natürlichen Gens einer eukaryotischen Zelle, und nicht mehr nur eines synthetischen ^* Gens, in Form eines effektiv gebildeten Proteins ermöglicht wird „
S09843/087
Die Erfindung betrifft somit den in den Patentansprüchen gekennzeichneten Gegenstand.
Es wurde gefunden, daß der erfindungsgemäße Vektor imstande ist nach Insertion in den Teil des Gens Z, beispielsweise verknüpft am Promotor-Operator des Lactose-Operons, eines prokaryotischen bzw. eukaryotischen DNA-Fragmerfcs, insbesondere eines natürlichen Gens, das für die Expression eines bestimmten Proteins, in der Zelle, aus der es stammt, codiert - die Bildung eines Hybridproteins, das .mindestens einen Teil der ß-Galactosidase und das bestimmte Protein enthält, durch ein Bakterium, insbesondere E. coli, das diese Mutationen nicht unterdrücken kann und das vorher mit dem erfindungsgemäß modifizierten Vektor infiziert worden ist, so zu steuern, daß höhere Ausbeuten erzielt werden.
Es versteht sich, daß die Insertion eines zusätzlichen DNA-Fragments in das Gen Z des erfindungsgemäß modifizierten Phagen sich ebenso auf das Gen Z als Ganzes wie auf den Teil des Gens bezieht, der nach einer Deletion desselben fortbestehen kann, sofern diese Deletion nicht zur Folge hat, daß die Expressionsfähigkeit im Bakterium eines Hybridproteins, welches das bestimmte dem inserierten Gen entsprechende Protein enthält, unterdrückt wird.
Der Promotor des Lactose-Operons kann durch einen anderen Promotor eines anderen bakteriellen Operons ersetzt werden, beispielsweise durch den Promotor des Maltose-Operons und des Galactose-Operons von E. coli.
30
Besonders gute Ergebnisse werden mit der erfindungsgemäß modifizierten DNA bzw. mit dem entsprechenden Phagen erzielt, wenn die Mutationen zur Verhinderung bzw. Verzögerung der Expression der später kommenden Gene, die Gene Q und S der Λ Phagen DNA ^5 betreffen.
L 903843/0875
Γ - 7 - 291508Γ
Es wurde gefunden, daß die Operone oder deren entsprechende .Promotoren/ beispielsweise der Lactose-Promotor von E. coli, in der Lage sind, ein ausreichendes Signal zu geben, das die Synthese des Proteins (das dem in das Gen Z der erfindungsgemäß modifizierten DNA inserierten Gen entspricht) durch das mit dem erfindungsgemäßen Phagen oder der DNA infizierte Bakterium auszulösen vermag.
Man erzielt somit eine Überproduktion des Hybridproteins auf Kosten der Bakterien— oder Phagenproteine wegen der Wirkung der Mutationen in den später kommenden Genen, insbesondere Q und S des Bakteriophagen. Diese Mutationen, welche die Expression der spaten Phagengene unterdrücken und zumindest eine Verzögerung der Bakterienlyse bewirken, führen im Bakterium zu einer Akkumulierung zahlreicher Kopien des Bakteriophagengenoms und gleichzeitig zu einer Hemmung der bakteriellen Proteinsynthese.
Demnach beträgt der Anteil an Hybridprotein mindestens etwa 30 bis 50% der Gesamtmenge des durch solche Bakterien gebildeten zellulären Proteins.
Der erfindungsgemäße Phage kann durch dem Fachmann geläufige Verfahren erhalten werden.
Falls beispielsweise die Endonuclease ein Restriktionsenzym . ist, wie etwa das Enzym EcoRI oder das Enzym Sst, so können andere möglicherweise vorhandene Schnittstellen im Phagen durch Punktmutationen oder Deletionen ausgemerzt werden, beispielsweise durch Methoden, wie sie in Proc.Nat.Acad.Sci. (Wash.), Bd. 1 (1974), S. 3927-3930, von A. Rambach und P. Tiollais in "Bacteriophageλ having EcoRI endonuclease sites only in the non-essential of the genome" beschrieben wurden.
Die Ausmerzung dieser anderen Schnittstellen erleichtert daher eine in vitro-Inkorporation des für das Protein charakteristischen Gens in das Gen Z des erfindungsgemäßen Phagen, sofern
90984370875
dieses Gen oder das dieses Gentragende DNA-Fragment vorher gegebenenfalls mit geraden, geschlossenen oder anderen (nämlich überstehenden) Enden versehen worden ist,Hierdurch wird mit Hilfe einer DNA-Ligase das Zusammenfügen dieses zusätzlichen Fragments des DNA—Fragments und der aus dem erfindungsgemäß modifizierten Phagen erhaltenen Fragmente durch die Einwirkung der Endonuclease auf seine DNA möglich .
Ebenso können die Mutationen der spaten Gene, insbesondere der Gene Q und S, in an sich bekannter Weise erhalten werden. Es handelt sich dabei um sogenannte Unsinn-Mutation=n, beispielsweir^ se Amber, wie sie A. Campbell in "Sensitive mutants of bacteriophage λ ", Virology, Bd. 14 (1961), S. 22-32, und A.R. Goldberg und M. Howe in "New Mutations in the S Cistron of Bacteriophage λ Affecting Host Cell Lysis", Virology, Bd. 38 (1969), S. 200-202, beschrieben haben.
Selbstverständlich schließt die vorliegende Erfindung die Möglichkeit nicht aus, in den Phagen zusätzliche Mutationen unter den nachstehend angegebenen Bedingungen einzuführen, beispielsweise in andere Gene des Phagen wie bei der Bildung von gewissen Bestandteilen der Kapsel, und zwar sogar in DNA-Teilen des Phagen, die wesentlich sind für seine Eigenschaft der Replikation in einem Bakterium, das diese Mutationen unterdrücken kann.
Der erfindungsgemäße Phage kann und soll sogar übliche
Mutationen oder Deletionen haben, die seine biologische Sicherheit -- wie dem Fachmann bekannt ist - garantieren.
Gegebenenfalls hat der erfindungsgemäße Phage zusätzliche übliche Deletionen in denjenigen Teilen, die nicht wesentlich für die Vervielfältigung des Phagen im Wirtsbakterium sind, sofern sich dies als notwendig für die Einkapselung des erfindungsgemäßen Phagen in ein Bakterium insbesondere in E.coli,
909843/0 875
Γ V9 - 291508Γ
erweist, das diese Mutationen in den spaten Genen des Phagen
unterdrücken kann, wenn die Phagen im Hinblick darauf gebildet werden sollen, den verfügbaren Phagenvorrat zu ergänzen.
Diese Deletionen können möglicherweise das Gen Z selbst betreffen, . sofern sie die Bildung eines Hybridproteins, welches das zu synthetisierende Protein enthält, nicht beeinträchtigen.
Ein Verfahren zur Deletion eines Teils des Gens Z ist nachstehend in einem Beispiel erläutert.
Die Insertion des Gens oder des fremden DNA-Fragments, welches das für die Expression des in Frage stehenden Proteins codierende Gen enthält, in das Gen Z der erfindungsgemäßen DNA kann in an sich bekannter Weise erfolgen, vorausgesetzt die Enden der
DNA machen das Einfügen (in das Gen Z) möglich mit Hilfe einer geeigneten DNA-Ligase zwischen den durch das Schneiden der erfindungsgemäßen DNA durch die Endonuclease, beispielsweise
EcoRI, an der angegebenen Schnittstelle im Gen Z entstandenen
freien Enden.
Die r.ekombinanten DNA können sodann in an sich bekannter Weise erneut in einen Stamm eines Iac -Wirtsbakteriums (nach einer
Deletion in dessen Genom selbst an seinem Lactose-Operon), der die Mutationen in den später kommenden Genen unterdrückt, eingefügt werden. Nach der Vervielfältigung der mittels Züchtung
der Bakterien erhaltenen rekombinanten Moleküle isoliert man
diejenigen Klone, die farblose Plaques auf Nährböden bilden,
die ein farbiges, für die Expression von ß-Galactosidase
charakteristisches Substrat, beispielsweise 5-Chlor-4-brom-3-
indolyl-ß-galactosid, enthalten.
Der erfindungsgemäße Vektor bzw. seine DNA sind demnach besonders interessant, da sie eine Bildung von Proteinen, die normalerweise durch eukaryotische Zellen oder auch andere eukaryotische Organismen gebildet werden, durch ein Bakterium,insbesondere
vom Typ E. coli, auszulösen vermögen.Seine Verwendung kann in Betracht
909843/0876
-10- 291508Γ
gezogen werden, wenn man über ein Gen verfügt, dessen Codierfähigkeit, für die Expression bestimmer Proteine der Zelle, aus der es stammt, erkannt worden ist,
Wie nachstehend in einem der Beispiele gezeigt wird, können die erfindungsgemäß modifizierte DNA bzw. der Phage zur Bildung eines Proinsulin enthaltenden Hybridproteins verwendet werden. Sie können außerdem zur Bildung eines Somatostatin enthaltenden Hybridproteins verwendet werden. Das a.a.O. beschriebene Somatostatin kann aus dem Hybridprotein herausgeschnitten werden, beispielsweise durch ein ebenfalls dort beschriebenes Verfahren.
Weiterhin können die erfindungsgemäße DNA bzw. der Phage auch zur Bildung bakterieller oder viraler Proteine verwendet werden, bei-15spielsweise in Zeiltypen, die eine bedeutende antigene Rolle bei krankheitserregenden Keimen spielen. Sie können insbesondere für die Herstellung von Impfstoffen gegen solche Bakterien oder Viren, die krankheitserregend bei Mensch und Tier sind, verwendet
werden, wie in einem der Beispiele ebenfalls gezeigt wird. 20
Machstehend sind einige besonders geeignete erfindungsgemäße Vektoren anhand der Fig. 1 bis 5 erläutert.
In Fig. 1 ist die DNA eines natürlichen Phagen j\ schematisch dar-25gestellt und beschränkt sich im wesentlichen auf die Angabe des verwendeten Maßstabs, ausgedrückt in % Länge, beginnend bei den Genen für den Kopf des Phagen.
In Fig. 2 und 3 sind die Genotypen der modifizierten DNA gemäß SOyorllegender Erfindung schematisch dargestellt.
In Fig. 4a bis 4d sind jeweils die vom Gen Z verursachten !Anwandlungen der Reihe nach dargestellt.
3^ In Fig. 5 ist der Genotyp des modifizierten Phagen gemäß einer anderen Ausführungsform der Erfindung schematisch dargestellt.
9G9843/0875
' - 11 -■ 291508Γ
In Fig. 2, 3 und 5 sind die Mutationen zur Unterdrückung der durch eine Endonuclease schneidbaren Stellen durch einen kleinen Kreis, die Punktmutationen durch einen Punkt und die DeIetionen durch Klammern, die einen weißen Raum abgrenzen, dargestellt.
Die Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Beschreibung eines Phägen vom Typ yt ZQS-EcORI
Fig. 1 zeigt den nicht wesentlichen Hauptteil NE des natürlichen Phagen, an dem Substitutionen, Deletionen und Mutationen vorgenommen werden können, ohne dadurch die Fähigkeit des Phagen, sich zu replizieren und sich in ein Bakterium, insbesondere
vom Typ E. coli K 12, einzukapseln, in Frage zu stellen. 15
Der durch den in Fig. 2 dargestellten Genotyp charakterisierte Phage umfaßt:
- eine Substitution durch ein DNA—Fragment von E. coli, die in den Figuren durch ein mit dem Buchstaben Z bezeichnetes
Rechteck markiert ist; dieses DNA—Fragment enthält im vorliegenden Beispiel den Promotor, den Operator und das Gen Z des Lactose-Operons.
- Ambermutationen: Qam 73 und Sam 7 in den Genen Q bzw. S, beide Typen von Mutationen {.G^npbell, A., "Sensitive Mutants of
Bacteriophage X ", Virology, Bd. 14 (1961), S. 22-23; Goldberg, A.R., und Howe, M., "New Mutation in the S Cistron of Bacteriophage λ Affecting Host Cell Lysis", Virology, Bd. 38 (1969), S. 200-202) können durch die Suppressoren E und F (definiert von Stretton, A.O.W. Kaplan, S. und Brenner, S., "Nonsense Codons", Cold Spring Harbor, Symp. Quant.Bio!., Bd. 31 (1966), S. 173) unterdrückt werden und kommen in bestimmten Stämmen von E. coli K 12, beispielsweise E. coli K 12-C600 und YMC, vor.
- Eine einzige Schnittstelle für das Restriktionsenzym EcoRI, die nahe dem Ende des Gens Z liegt, das vom Promotor des Operons am weitesten entfernt ist, unter Ausmerzung aller .
L 90984370875
anderen Schnittstellen für EcoRI im Phagen. Diese Schnittstelle (in Fig. 2 EcoRI-Z genannt) wird durch einen Pfeil unter dem Rechteck, das die Substitution darstellt, angezeigt. Alle, anderen EcoRI-Schnittstellen sind ausgemerzt, entweder durch Mutationen im Falle der Schnittstellen sRIyU, sRI/\_., sRI^.,-(wie von A. Rambach und P. Tiollais, a.a.O. beschrieben) oder durch eine Deletion zwischen den Schnittstellen sHindIII/)~ und sHindIII ^3 für die Schnittstelle SRlA2. Diese Deletion wird durch partielle Hydrolyse der Phagen DNA durch das Enzym Hind III erhalten.
Die Deletion zwischen den Schnittstellen sHindlllXp und sHindlll^of wie auch die Deletion nin 5 und gegebenenfalls andere Deletionen, sollen außerdem das Phagengenom verkürzen, um seine spätere Verlängerung um das zusätzliche in das Gen Z einzufügende DNA-Fragment auszugleichen, damit das Genom immer noch in der Lage ist, sich in ein Bakterium mit Suppressoren der entsprechenden Mutationen einzukapseln.
- Eine Mutation L8UV5 im Promotor des Lactose-Operons, welche die Synthese von ß-Galactosidase unempfindlich gegen katabolische Repression macht.
Schließlich umfaßt dieser Phage folgende zusätzliche Mutationen und/oder Deletionen, welche die biologische Sicherheit dieses Vektors unterstützen:
- Eine Mutation Earn 1100, die zusammen mit den Mutationen am
in den Genen Q und Z sicher stellt, daß diePropagationsrate in
— in einem Nicht—Suppressor-Stamm kleiner als 10 ist;
- Eine Deletion "nin 5" zwischen den Positionen 83,6 und 89.2%, die verhindern soll, daß sich eine stabile, plasmidähnliche
Struktur einnisten kann;
35
909843/0875
- Eine Deletion KH 54 oder eine Mutation cl~, jiie den Phagen unfähig macht, sich als Prophage in das Chr olios am das Wirtsbakteriums zu integrieren, sei es an die Stelle der .Phagen-anheftung, sei es Rekombination seines Gens Z in das Gen Z der Bakterien mit einer Rate <10 ;
- Die hier verwendeten Bakter'ienstamme tragen eine Deletion in ihrem Lactose-Operon(Deletion X 74), so daß die Integration eines fremden DNA—Fragments mittels Rekombination in das Gen Z -(O verhindert wird..
Diese zusätzlichen Mutationen und/oder Deletionen können natürlich durch andere aus dem Stand der Technik bekannte Sicherheitsmechanismen ersetzt werden.
Dieser Phage läßt sich als Iac -Bakteriophage in einem Testerstamm E.coli K 12«diac auf gefärbten, insbesondere das vorgenannte Substrat XG enthaltenden Nährböden feststellen.
Ein solcher mit dem hier beschriebenen Phagen infizierte Stamm ist in der Collection Nationale de Cultures de Micro-Organismes de 1'Institut Pasteur (CNCM) in Paris unter der Nr. 1-055 hinterlegt.
-B ei.spiel. "2 Nachkommen des Phagen vom Typ AAZQS-EcoRI und •tYÄZQS-EcoRI Dieses Beispiel erläutert ein Deletionsverfahren für Zelltypen, die sich zum "Verkürzen" des Gens Z eignen.
Das Genom des Bakteriophagen (in der CNCM unter der Nr. 1-056 hinterlegt) unterscheidet sich vom Phagen aus Beispiel 1 in erster Linie hinsichtlich der Substitution Z (Fig. 3). Im. Gen Z selbst wird eine bedeutende Deletion vorgenommen, die unter den nachstehenden Bedingungen (anhand von Fig. 4a-4d) durchgeführt wird:
Man geht vom Phagen aus Beispiel 1 aus. Das Fragment OP Hae III 203 (Fig. 4a) ,, das zwei EcoRI-Enden hat, wird in die EcoRI-
L . 909843/Q87S J
QRlQINAL. INSPECTED
Schnittstelle des Gens Z (nach der von Backmann, K., et al. in Proc. Nat.Acad.Sci., Bd. 73 (1976), S. 4174-4178 beschriebenen » Methode) inseriert. Der Phage trägt auf beiden Seiten ein zentrales Stück von OP, ein Fragment Z1, das vom Anfang des Gens Z stammt und die Codons für die ersten 7 Aminosäuren des Genprodukts enthält und ein Fragment I" vom Ende des Repressors vom Lactose-Operon. Wenn das Fragment OP Hae III 203 (dargestellt in verkleinertem Maßstab in der Fig. 4b) in der gleichen Richtung eingefügt wird wie das Fragment OP, das homolog ist dem Fragment nahe dem Ende Z" des Phagengens Z (in Fig. 4b mit "op" bezeichnet und nahe einem Fragment I" vom Ende des Repressorgens I vom Lactose-Operon), so führt eine intramolekulare Rekombination zu einer Deletion (Fig. 4c), die beinahe das ganze Gen Z erfaßt. Dies wiederum ermöglicht eine neue Schnittstelle für EcoRI (EcoRI- ΔΖ) anstelle der Schnittstelle Hae III, sehr nahe dem Origin des Gens Z an einer Stelle, die der 7, Aminosäure der ß-Galactosidase entspricht. Vom ursprünglichen Gen Z bleiben nur die Fragtiente Z" und Zf auf beiden Seiten der Schnittstelle EcoRI- ΔZ übrig. Das Permeasegen des lac-Operons (Gen Y)
2^ wird durch in vivo-Rekombination zwischen einem das gesamte lac-Operon tragenden Phagen und dem Phagen ÄAZQS eingefügt. Die Rekombinante (Fig. 4d), die das Gen Y nahe der Schnittstelle EcoRI-ΔΖ inseriert trägt, also nahe dem lac-Promotor, läßt sich als Phage Y feststellen, d.h. er exprimiert das Gen Y. Der Stamm A lac (Deletion X 74)lysogen für diesen Phagen synthetisiert Permease, wie durch den Melibiosetest bei 420C nachgewiesen wird.
Beispiel3 Nachkommen des Bakteriophagen /\ZQS-Sst
Dieser Phage (in CNCM unter der Nr. 1-058 hinterlegt) unterscheidet sich in erster Linie vom Phagen aus Beispiel 1 durch seine einzige Schnittstelle für Sstl im Gen Z (ß-Untereinheit) , nachdem die übrigen Schnittstellen Sstl durch die Deletion b515 ausgemerzt worden sind. Fig. 5 stellt den Genotyp dieses
909843/0875
Γ - ^ - 291508Γ
Phagen dar. Der Phage ist mit den gleichen biologischen Sicherheitsmechanismen versehen und ist unter den gleichen Bedingungen feststellbar wie der Phage aus Beispiel 1.
Beispiel 4
Beschreibung eines rekombinanten Phagen durch eine Fusion zwischen einem DNA-Fragment des Adenovirus 5 und dem Gen Z, wie es der Phage aus Beispiel 1 trägt
Ein DNA-Fragment des Adenovirus 5, der an den Enden die EcoRI*- Sequenz hat, wird in vitro an der EcoRI-Z Schnittstelle des. Phagen aus Beispiel 1 inseriert. Dieser rekombinante Phage (in der CNCM unter der Nr. 1-057 hinterlegt), läßt sich als Iac -Phage feststellen, indem er weiße Plaques auf Testerstämmen und in den vorgenannten Nährböden bildet. In diesem rekombinanten Phagen findet eine Fusion zwischen dem Adenovirusgen und dem Gen Z statt. Ein Hybridprotein, das der Fusion zwischen JB-Galactosidase und dem fremden Protein entspricht und nachweisbar durch sein höheres Molekulargewicht ist, wird durch PoIyacrylamidgel-Elektrophorese für Proteine untersucht, die im stamm E.coli K12 Hfr 3000 X 74 nach Infizierung dieses Stammes mit dem rekombinanten Phagen synthetisiert werden. Die Synthese des Hybridproteins kann durch einen Induktor der Synthese von ß-Galactosidase, beispielsweise Isopropylthxogalactosid (IPTG), in einem den Repressor vom Lactose-Operon überproduzierenden
2^ Stamm ausgelöst werden, nämlich im Stamm BMH 7156 F'lac i BMH 7156 F'Iac
Beispiel 5
Beschreibung eines rekombinanten Phagen,Träger des Gens für Proinsulin aus Ratten, fusioniert mit dem Gen Z, wie es der Phage aus Beispiel 1 trägt
Das gesamte Proinsulingen wird in vitro an der EcoRI-Z Schnittstelle des Phagen aus Beispiel 1 inseriert. Das Proinsulingen wird aus zwei Genfragmenten gebildet (Fragmente PAU-1 und PAU-2), die nach der von Ullrich A. und Mitarb, in Science, Bd. 196 (1977), S. 1313-1319, beschriebenen Methode synthetisiert werden. Dieser rekombinante Phage wird als lac~-Phage (nach der
L 909843/0875
Γ -ie- 2315081"1
gleichen Methode wie in Beispiel 4) festgestellt. Zwischen dem Gen für Proinsulin aus Ratten und dem Gen Z findet eine Fusion statt. Ein Hybridprotein, das der Fusion zwischen ß-Galactosidase und dem Proinsulin entspricht und nachweisbar durch sein höheres Molekulargewicht ist, wird durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese für Proteine untersucht, die im Stamm E. coli K 12 Hfr 3000 X 74 nach Infizierung dieses Stammes mit dem rekombinanten Phagen synthetisiert werden. Die Synthese des Hybridproteins kann durch einen Induktor der Synthese von ß-Galactosidase, beispielsweise Isopropylthiogalactosid (IPTG), in einem den Repressor vom Lactose-Operon überproduzierenden Stamm ausgelöst werden, nämlich im Stamm BMH 7156 F'Iac X^1TMoS.
Wie sich eindeutig aus dem Vorstehenden ergibt, erschöpft sich die Erfindung keineswegs in den in den Beispielen eingehend beschriebenen Verwendungs- und Durchführungsformen, sondern umfaßt alle Varianten, vor allem Phagen-DNA oder Phagen> deren Endonuclease-Schnittstelle im Innern des oben genannten Gens Z die Schnittstelle für ein Restriktionsenzym ist, allgemeiner 20*gesagt - für eine Endonuclease. Dabei wird jede andere Schnittstelle der gleichen Endonuclease in anderen Teilen des Phagengenoms ausgeschlossen. Als Endonuclease kommen auch andere Enzyme in Frage als die EcoRI- und Sst-Enzyme, die in den Beispielen ausführlicher behandelt wurden. 25
909843/087S
, 4Ψ:
Leerseite

Claims (12)

VOSSIUS . VOSSIUS . Wi1JL - TAUCHNER · HEUNEMANN SIEBERTSTRASSE 4 · 8OOO MÖNCHEN 86 . PHONE: (O89) 474O75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN -TELEX 5-29 45 3 VOPAT D u.Z.: P 109 Case: PL/FZ-0061-79-05 INSTITUT PASTEUR Paris, Frankreich Modifizierte DNA des Phagen λ und ihre Verwendung zur Herstellung von Proteinen Priorität: 14. April 1978, Frankreich, Nr. 78 11109 Patentansprüche
1) Modifizierte /^_Phagen DNA, enthaltend
- Mutationen zur Verhinderung oder Verzögerung der Expression später Gene, speziell der Steuerung der Bildung von zur Einkapselung der modifizierten DNA erforderlichen Proteinen in ein Bakterium, insbesondere E. coli, das diese Mutation unterdrücken kann,
- ein DNA-Fragment, enthaltend einen Teil mindestens des Gens Z
von E. coli, und einen Promotor eines bakteriellen Operons oder eines bakteriell-analogen Operons, inseriert in einen unwesentlichen Teil des Phagen-Genoms und
- eine Schnittstelle für eine Endonuclease in dem Teil des Gens Z, unter Ausmerzung aller anderen Schnittstellen für die gleiche Endonuclease in der modifizierten DNA.
2. Modifizierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bakterielle Operon das Lactose-Operon von E. coli ist.
3. Modifizierte DNA nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das bakterielle Operon das Maltose- oder Galactose-Operon TOn B. coli 1st. 9Q9843Z0875
4. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekenn-
Lonen der spaten Ge
ORIGINAL INSPECTED
zeichnet, daß die Mutationen der spaten Gene die Gene Q und Z L betreffen. _j
-2- 29150δΓ
5. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Schnittstelle eine Schnittstelle von EcoRI oder Sst ist.
6. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Schnittstelle eine Schnittstelle von Sst ist.
7. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 6, gekennzeichnet durch eine Deletion eines Stücks des Gens Z.
8. Modifizierte DNA nach Anspruch 2f dadurch gekennzeichnet, daß das fremde DNA-Fragment ferner das Gen Y des Galactose-Operons enthält.
9. Modifizierte DNA nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß sie ein zusätzliches Fragment einer anderen prokaryotischen bzw. eukaryotischen DNA in den Teil des Gens Z inseriert enthält, das vom Rest des Phagen durch Schneiden mit Hilfe von Endonuclease an seinen zwei Enden abgetrennt werden kann.
10. Modifizierte DNA nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das zusätzliche DNA-Fragment das Proinsulingen enthält.
1.1. Bakteriophage, dessen Genom aus einer DNA nach Anspruch 1 bis 10 besteht.
12. Verwendung der modifizierten \ Phagen DNA zur Herstellung eines Hybridproteins, das mindestens ein Fragment der ß-Galactosidase und ein bestimmtes fremdes Protein enthält, das normalerweise in einer prokaryotisclien bzw. eukaryotischen Zelle durch ein bestimmtes Gen des Genoms dieser Zelle codiert werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Bakterium, insbesondere E. coli, das die Mutationen der spä ten Gene des /L Phagen nicht unterdrücken kann, mit einer rekombinanten DNA oder mit einem entsprechenden Phagen infiziert, wobei die rekombinante DNA aus der genetischen Fusionierung des Proteingens und einer modifizierten DNA nach Anspruch 1 bis 7
L 909843/087S
- "3 - 291508 Γ
1 entsteht.und wobei das Gen in den Teil des Gens Z der modifizierten DNA inseriert ist, und anschließend das Bakterium gegebenenfalls in Gegenwart eines Induktors für ß-Galactosidase züchtet, wobei das Hybridprotein aus dem gebildeten zellulären Protein
5 gewonnen werden kann.
L 9098A3/0875
DE19792915081 1978-04-14 1979-04-12 Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinen Withdrawn DE2915081A1 (de)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR7811109A FR2422685A1 (fr) 1978-04-14 1978-04-14 Vecteurs, derives du bacteriophage lambda, permettant l'insertion et l'expression d'un gene, procaryote ou eucaryote, sous le controle du promoteur et de l'operateur de l'operon lactose de la bacterie escherichia coli

Publications (1)

Publication Number Publication Date
DE2915081A1 true DE2915081A1 (de) 1979-10-25

Family

ID=9207171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE19792915081 Withdrawn DE2915081A1 (de) 1978-04-14 1979-04-12 Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinen

Country Status (7)

Country Link
JP (1) JPS54141790A (de)
BE (1) BE875596A (de)
DE (1) DE2915081A1 (de)
FR (1) FR2422685A1 (de)
GB (1) GB2018778B (de)
IT (1) IT1119726B (de)
NL (1) NL7902910A (de)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BR7807290A (pt) * 1977-11-08 1979-06-12 Genentech Inc Plasmideo,processo para producao de um polipeptido especifico veiculo clonal,cultura bacteriana transformante,processo para produzir uma substancia imunogenica processo para preparar um gene estrutural,e polidesoxirribonucleotido de faixa dupla
FR2480779B2 (fr) * 1979-08-30 1986-07-18 Anvar Vecteur contenant une sequence nucleotidique de l'antigene de surface du virus de l'hepatite b et procede de fabrication d'une molecule immunogene mettant en oeuvre ce vecteur
US6297355B1 (en) 1978-12-22 2001-10-02 Biogen, Inc. Polypeptides displaying HBV antigenicity or hbv antigen specificity
US4874702A (en) * 1980-09-08 1989-10-17 Biogen, Inc. Vectors and methods for making such vectors and for expressive cloned genes
AU8746582A (en) * 1981-09-02 1983-03-10 Biogen N.V. Hepatitis b virus e type antigen
US4460689A (en) * 1982-04-15 1984-07-17 Merck & Co., Inc. DNA Cloning vector TG1, derivatives, and processes of making
US4508826A (en) * 1982-04-15 1985-04-02 Merck & Co., Inc. Bacteriophage DNA cloning vector TG1 and microorganisms containing TG1
JPS58212781A (ja) * 1982-06-02 1983-12-10 Noda Sangyo Kagaku Kenkyusho 新種バクテリオフア−ジ及びその育種法
EP0130074B1 (de) * 1983-06-27 1991-02-06 Genentech, Inc. Übertragbare induzierbare Kontrollsysteme, diese enthaltende Expressionsvektoren, mit diesen transformierte Mikroorganismen und ihre Verwendung bei der Expression von exogenem Protein
CA1278540C (en) * 1983-07-22 1991-01-02 Eli Lilly And Company Modified antibiotic resistance gene

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same

Also Published As

Publication number Publication date
IT1119726B (it) 1986-03-10
GB2018778A (en) 1979-10-24
BE875596A (fr) 1979-10-15
GB2018778B (en) 1982-08-25
NL7902910A (nl) 1979-10-16
FR2422685B1 (de) 1980-10-31
IT7921839A0 (it) 1979-04-13
FR2422685A1 (fr) 1979-11-09
JPS54141790A (en) 1979-11-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DE69126606T2 (de) Vakzine
DE69518910T4 (de) Verfahren zur herstellung von viralen vektoren von mindestens 20kb durch intermolekulare homologe rekombination in einer prokaryotischen zelle
DE3888086T2 (de) Rekombinantes Geflügelpockenvirus, Expressionsvektoren für heterologische Proteine und davon derivierte Geflügelvakzine.
DE69024440T2 (de) Verfahren zum spezifischen ersetzen einer genkopie, die sich in einem rezeptorengenom befindet, durch genintegration
DE3689802T2 (de) &#34;Hervorrufung somatischer Veränderungen in Pflanzen durch Verwendung von minussträngigen RNAs&#34;.
DE3486491T2 (de) Hybrid-DNS-Synthesis von reifen insulinähnlichen Wachstumsfaktoren
DE69434778T2 (de) Rekombinanter vektor mit gensequenz von lipoproteine zur nukleotidefrequenzen expression
DE69125632T2 (de) Modifiziertes baculovirus, verfahren zu seiner herstellung, und dessen expressionsvektoren
DE2950995C2 (de)
DE3486206T2 (de) Expressionssysteme für Hefe mit PyK-Promotoren enthaltenden Vektoren und Synthese von Fremdproteinen.
DE3020528C2 (de)
DD212982A5 (de) Verfahren zur herstellung von rinder-wachstumshormon-aehnlichen polypeptiden
EP0099084A2 (de) Verfahren zur Herstellung von Interferon und Expressionsvektoren dafür
DE69533443T2 (de) Die herstellung von biologisch aktiven, rekombinanten und neurotrophem protein
DE3382575T2 (de) Dna-sequenzen, rekombinante dna-molekuele und verfahren zur herstellung von schweinewachstumshormonaehnlichen polypeptiden.
DD147369A5 (de) Verfahren zur synthese eines eukaryontischen proteins durch mikroorganismen
DD204711A5 (de) Verfahren zur herstellung eines dns-uebertragungsvektors
DE2915081A1 (de) Modifizierte dna des phagen lambda und ihre verwendung zur herstellung von proteinen
DE69013495T2 (de) Regulierung der genexpression.
DE69933990T2 (de) Hocheffiziente und kontrollierte expression von exogenen genen in e. coli
DE3382607T2 (de) Plasmide mit konditionalem unkontrolliertem replikationsverhalten.
DE60211772T2 (de) Verfahren zur Herstellung von Proteinen
DE69233336T2 (de) Vektor
DE2923297A1 (de) Plasmidvektoren, hybridplasmide und ihre verwendung zur herstellung von proteinen
DE3485923T2 (de) Dna-gen, verfahren zu seiner herstellung und dieses gen enthaltendes plasmid.

Legal Events

Date Code Title Description
8141 Disposal/no request for examination