DE2923297A1

DE2923297A1 - Plasmidvektoren, hybridplasmide und ihre verwendung zur herstellung von proteinen

Info

Publication number: DE2923297A1
Application number: DE19792923297
Authority: DE
Inventors: Nichtnennung Beantragt
Original assignee: Institut Pasteur de Lille
Current assignee: Institut Pasteur de Lille
Priority date: 1978-06-08
Filing date: 1979-06-08
Publication date: 1979-12-13
Also published as: FR2428075B1; GB2024229B; IT1166872B; CH652744A5; CA1203492A; JPS5550892A; BE876881A; FR2428075A1; NL7904517A; IT7923414A0; GB2024229A

Description

r _ ₇ ..

Die Erfindung betrifft Vektoren, insbesondere Plasmidvektoren, Hybridvektoren, die die Information zur Bildung wertvoller Proteine enthalten, sowie ein Verfahren zur Herstellung von Proteinen mit Hilfe von Mikroorganismen, in die die Hybridvektoren transformiert worden sind, und diese Proteine.

Es ist bereits gelungen, in Vektoren, wie Plasmide, reverse Transcripte von mRNA zu inserieren, die in ihren natürlichen Wirtszellen vermehrt werden und die ein bestimmtes Protein exprimieren lassen. Beispielsweise haben Humphries et al., Nucleic Acids Research, Bd. 4 (1977), S. 2389, die Inserierung einer, doppe lsträngigen, für Hühnerovalbuinin codierenden DNA in ein Plasmid (pCRI) beschrieben, die von einer Kopie einer gereinig- · ten mRNA stammt. Das auf diese Weise erhaltene Hybridplasmid pCRI ov 2-1 konnte in üblicher Weise in E.coli K12 transformiert werden. Es konnte jedoch unter den Stoffwechselprodukten der transformierten Bakterien keine Bildung von Ovalbumin nachgewiesen werden. Dies bestätigt die bekannte Tatsache, daß ein plasmidübertragenes Gen eines höheren Eukaryonten nur schwierig in Wirtsbakterien exprimiert werden kann. Es gibt jedoch eine Ausnahme. Es handelt sich um die kürzlich gelungene Bildung des Hör mons Somatostatin in E. coli, die durch ein Plasmid transformiert worden sind. Bei diesem Plasmid ist ein synthetisches Somatostatin-Gen in ein Gen des lac-Operons von E. coli inseriert.

Die entsprechenden Versuche sind von K. Itakura et al.. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatine, in Science, Bd. 198 (1977) ,S.1056-1063, beschrieben worden.

Diesen Autoren gelang es, besonders günstige Bedingungen aufzufinden, um durch E.coli die Bildung eines Hybridproteins zu induzieren, das ein .Fragment mit der Sequenz der 14 Aminosäuren des Somatostatins enthält. Sie benutzten ein auf chemischem Wege erzeugtes Gen, um die Schwierigkeiten zu vermeiden, die bei Verwendung eines natürlichen Gens auftreten.

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Überdies konnten diese Autoren zeigen, daß die Somatostatine bildung nur dann abläuft, wenn das vorstehend genannte synthetische Gen an den Hauptteil des Z-Gens der ß-Galactosidase des lac-Operons gebunden ist. Wenn das Somatostatin-Gen nur an den Teil gebunden ist, der einem Fragment des lac-Operons (enthaltend die Gene "p", "o", sowie die 8 Basentripletts, die für die ersten Aminosäuren der bakteriellen ß-Galactosidase codieren) entspricht, das nachstehend mit "Iac " bezeichnet wird, erfolgt keine Somatostatinbxldung.

Daraus folgt, daß das dem Somatostatin entsprechende Fragment unter den von den genannten Autoren beschriebenen günstigsten experimentellen Bedingungen nur einen untergeordneten Anteil des exprimierten Hybridproteins darstellt. Der größte Teil des Hybridproteins besteht aus einem Fragment mit der Aminosäuresequenz der ß-Galactosidase. Vermutlich lag das Somatostatinfragment im gesamten gebildeten Hybridprotein in einem Zahlenverhältnis in der Größenordnung von 14 Aminosäuren (den Aminosäuren des Somatostatins) zu etwa 1000 Aminosäuren vor.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung eines prokaryotischen oder eukaryotischen Proteins unter Verwendung einer DNA zu schaffen, die wesentlich größer ist als das vorstehend genannte synthetische Somatostatin-Gen.

Das Verfahren soll besonders wirtschaftlich ablaufen, und der größte Teil des exprimierten Proteins soll aus dem gewünschten Proteinfragment bestehen. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren, das die Expression des Proteins durch ein Bakterium gestattet, sei es mittels einer durch enzymatische Synthese hergestellten DNA, insbesondere ausgehend von einer RNA, oder von einem Gen natürlichen Ursprungs.

Die Erfindung betrifft ferner die Schaffung von Vektoren, insbesondere Plasmidvektoren, in die Genomfragmente eingebaut werden können, deren Genprodukte in Mikroorganismen zur Expression kommen. Die Erfindung betrifft ferner diese Hybridvektoren.

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r , -ι

Die Erfindung betrifft ferner die Schaffung von speziellen DNA-Fragmenten/ die nach Inserierung in einen geeigneten Vektor und Transformation in eine Wirtzelle zur Bildung von prokaryotischem oder eukaryotischein Protein führen.

Das Plasmid der Erfindung enthält in einem nicht essentiellen, d.h. für seinen Lebenszyklus unwesentlichen Teil seines Moleküls, ein DNA-Fragment, das sich vom X Phagen ableitet. Dieses DNA-Fragment (Insertion) ist an einen Teil eines bakteriellen Operons, insbesondere des Lactose-Operons, gebunden, das mindestens den bakteriellen Promotor und ein an diesen Promotor gebundenes Strukturgen-Fragment enthält, beispielsweise das Z-Gen, das für die Bildung der ß-Galactosidase in dem Lactose-Operon codiert. Diese Insertion grenzt gegebenenfalls an das erste Nucleotidtriplett oder die ersten Nucleotidtripletts, das für die erste Aminosäure bzw. die für die ersten Aminosäuren des entsprechenden Proteins codieren, d.h. im Falle des Lactose-Operons die ß-Galactosidase. Dieses Plasmid ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß es im Z-Gen-Fragment (Δ Z) eine Schnittstelle (Erkennungssequenz) für eine bestimmte Endonuclease aufweist und vorzugsweise in seinen anderen Teilen keine weiteren Erkennungssequenzen für die gleiche Endonuclease besitzt. Zweckmässigerweise handelt es sich um eine EcoRI-Schnittsteile.

In einem erfindungsgemäß bevorzugten Plasmid ist das bakterielle Operon-Fragment ein Fragment des Lactose-Operons und es enthält mindestens die Sequenz des Z-Gens, die für die ersten 7 Aminosäuren der bakteriellen ß-Galactosidase codiert, bzw. für die ersten 8 Aminosäuren, wenn man Formylmethionin als erste Aminosäure mitzählt.

Ein erfindungsgemäß bevorzugtes Plasmid besteht einerseits aus einer rekombinanten DNA des Plasmids pBR322 (vgl. Bolivar et al., Gene, Bd. 2 (1977), S. 95'V von dem mit Hilfe der Enzyme EcoRI und Hind III ein für seinen Lebenszyklus unwesentliches Fragment abgetrennt worden ist, und andererseits aus einem

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Fragment des Λ. Phagen, gebunden an ein Fragment des Lactose-Operons, das einen Promotor zusammen mit dem Operator und das Fragment des Z-Gens enthält, das für die 7 bzw. 8 ersten Aminosäuren codiert. Vorzugsweise ist der Operator unempfindlich gegenüber katabolischer Repression.

Man kann in einen solchen Vektor ein DNA-Fragment einbauen, das für das Protein codiert, dessen Expression gewünscht ist, wobei das DNA-Fragment entweder auf chemischen oder enzymatischen Wege, insbesondere ausgehend von einer mRNA hergestellt worden ist. Es kann sich auch um ein natürliches Gen handeln. Dieses Gen kann außerdem sehr viel größer sein als das Gen-Fragment in dem bakteriellen Operon, das vorstehend beschrieben ist. Der erhaltene Vektor ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

In der nachstehend beschriebenen bevorzugten Ausführungsform zur Herstellung eines Hybridproteins, das die Quasigesamtheit der Aminosäuresequenz des Ovalbumins enthält, verwendet man vorzugsweise ein DNA-Fragment, das aus der entsprechenden mRNA auf enzymatischen Wege hergestellt worden ist. Die DNA kann insbesondere durch enzymatische reverse Transcription nach der vorstehend von Humphries et al., a.a.O., beschriebenen Methode erhalten werden. Die Möglichkeit, ein so erhaltenes DNA-Fragment nach seiner Insertion in einen entsprechenden Vektor in einem Bakterium oder einer Hefe zur Expression zu bringen, ist bemerkenswert im Hinblick auf die Tatsache, daß diese Methode bei natürlichen Genen nicht anwendbar ist. Es wurde bereits beschrieben, daß die für Ovalbumin codierenden Gene aus DNA-Sequenzen bestehen, die durch nicht codierende, "Introns" genannte Sequenzen unterbrochen sind.

Somit gelingt es, in die Vektoren der Erfindung den größten Teil des Ovalbuinin-Gens einzubauen und den erhaltenen Hybridvektor nach seiner Transformation in einen Mikroorganismus, insbesondere ein Bakterium, speziell E. coli, zur Expression zu bringen. Man erhält auf diese Weise ein Hybridprotein, dessen

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Hauptteil der Aminosäuresequenz des Ovalbumins entspricht.

Die Erfindung betrifft somit speziell dde erhaltenen modifizierten Vektoren , speziell das Hybridpiasmid, das durch Rekombination des nachstehend beschriebenen bevorzugten Plasmids und eines DNA-Fragments erhalten wird, das für den Hauptteil des Ovalbumins codiert. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Hybridpiasmid, das ein DNA-Fragment mit dem Hauptteil der Ovalbumin-Information enthält, welches einerseits an die Tripletts der ersten 8 Aminosäuren, einschließlich des Formylmethionins, der bakteriellen ß-Galactosidase grenzt, und andererseits direkt oder über ein Zwischenstück aus einer ganzen Zahl Tripletts an die vorausgehende Sequenz angekoppelt sein kann. Die Tripletts des Zwischenstücks müssen so ausgewählt sein, daß sie die Translation nicht unterbrechen. Die Ovalbumin-Information kann um die Tripletts der ersten Aminosäuren, insbesondere der ersten 5 Aminosäuren, verkürzt sein.

Die Erfindung betrifft außerdem die aus diesen Plasmiden gebildeten Vektoren, die in Hefen transformiert werden können. Diese Plasmide enthalten das gesamte vorstehendi-beschriebene Plasmid oder einen Teil davon inseriert. Dieser Teil muß die vorstehend erläuterte Hybrid-DNA beinhalten.

Die Erfindung eignet sich vorzugsweise zur Herstellung von Nahrungsproteinen, insbesondere Ovalbumin. Das Verfahren ist deshalb besonders vorteilhaft, weil der Hauptteil des exprimierten Proteins aus dem für die Ernährung wertvollen Protein besteht, und es nicht erforderlich ist, dieses wertvolle Proteinfragment von dem Fragment abzutrennen, das den ersten Aminosäuren der ß-Galactosidase entspricht.

Im Falle des Ovalbumins, das aus etwa 385 Aminosäuren besteht, sind 380/387 (ausgedrückt durch die Zahl der Aminosäuren) des schließlich erhaltenen Hybridproteins Bestandteil des gewünschten Proteins.

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Γ

Die Erfindung betrifft allgemein Plasmide der vorstehend beschriebenen Art, in denen die dem Ovalbumin entsprechende DNA-Sequenz durch eine DNA-Sequenz ersetzt wird, die für andere Nahrungsproteine codiert. In diesem Fall muß man gegebenenfalls eine Inserierung von einem oder von zwei Basenpaaren (ggf. vervollständigt durch eine ganze Zahl von Tripletts) zwischen dem Fragment, das für die ersten 7 oder 8 Aminosäuren der ß-Galactosidase codiert und der DNA-Sequenz vorsehen, die für das Nahrungsprotein codiert, um sicherzustellen, daß die beiden Fragmente für ihre Translation im richtigen Leseraster angeordnet sind.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins, von dem ein Teil aus einem normal codierten Protein stammt, in einer natürlichen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle, aus dem entsprechenden Gen, das dem Genom der Wirtszelle angehört. Dieses Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man in einen Mikroorganismus, vorzugsweise in ein Bakterium,wie E. coli, oder in eine Hefe, wie Saccharomyces cerevisiae, ein Hybridplasmid einführt, das erhalten worden ist durch Insertion eines bestimmten Gens der vorstehend beschriebenen Art (oder vorzugsweise einer aus der entsprechenden mRNA auf enzymatischen Wege erhaltenen DNA) in das Plasmid der Erfindung, speziell entweder in das Fragment des Z-Gens (oder das Fragment des entsprechenden Gens im Falle eines unterschiedlichen bakteriellen Operons) oder unmittelbar angrenzend an das Fragment - des Z-Gens, und das entstandene Hybridprotein mit dem gewünschten Proteinfragment aus den von den Mikroorganismen gebildeten Zellproteinen isoliert.

Zweckmäßig hat das DNA-Fragment des gewünschten Proteins eine Größe, ausgedrückt durch die Zahl der Tripletts, die größer ist, als die des Fragments des Z-Gens oder eines analogen Fragments. Zweckmäßig beträgt die Zahl der Tripletts mindestens etwa 50.

Im angegebenen Beispiel beträgt sie 387/7.

Die Erfindung betrifft ferner neue, Verfahrensgemäß erhaltene Produkte, speziell:

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Γ · "1

Proteine mit der Aminosäuresequenz des Ovalbumins, im wesentlichen frei von GIycosylresten der Art, wie sie bei natürlichen Proteinen (Glykoproteinen) gefunden werden; die entsprechenden DNA's, die einerseits ein DNA-Fragment entsprechend mindestens den ersten Aminosäuren der ß-Galactosidase, insbesondere entsprechend dem Fragment mit den entsprechenden Tripletts der ersten sieben (oder acht) Aminosäuren der ß-Galactosidäse enthalten und die andererseits ein DNA-Fragment enthalten, das für die Gesamtheit oder den größeren Teil des Ovalbumins codiert, gegebenenfalls mit Ausnahme seiner ersten, insbesondere seiner ersten 5 Aminoäsuren, wobei das DNA-Fragment an das Vorhergehende entweder direkt oder über ein Zwischenstück mit einer ganzen Zahl von Tripletts der vorstehend definierten Art verbunden ist.

Zweckmäßig besteht die DNA, die für den Hauptteil oder die Gesamtheit des Ovalbumins codiert, in dem genannten DNA-Fragment aus einer Sequenz des entsprechenden enzymatischen reversen Transcrxptionsprodukts der entsprechenden mRNA. 20

Ein weiteres Merkmal des modifizierten Proteins der Erfindung ist darin zu erblicken, daß es durch Antikörper des natürlichen Proteins mittels des Radioimmuntests nachgewiesen werden kann.

Die Erfindung betrifft schließlich Mikroorganismenstämme, insbesondere Bakterien, wie E. coli, oder Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, die die Plasmide der Erfindung enthalten und die deren Replikation gleichzeitig mit der Replikation ihrer eigenen DNA ermöglichen.

Andere Merkmale der Erfindung gehen aus der Beschreibung eines Beispiels der Herstellung der Plasmide der Erfindung und ihrer Anwendung zur Herstellung eines Nahrungsproteins hervor. Dieses Protein besitzt die praktisch identische Aminosäuresequenz zumindest eines Teils und vorzugsweise des überwiegenden Teils von Huhne rοvaIbumin.

In der nachstehenden Beschreibung wird Bezug genommen auf eine Zeichnung, in der die Umformungsschrxtte schematisch wiedergegeben sind, denen das Plasmid unterworden wird.

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Beispiel

1. Konstruktion des Vektors

In einen für den Lebenszyklus des Plasmids pBR 322 (Fig. 4a) unwesentlichen Teil wird eine DNA eingebaut, die ein Fragment des Pi Phagen enthält, das ein Segment des Lactose-Operons trägt und eine Schnittstelle für EcoRI am Ort der 7.Aminosäure der ß-Galactosidase (Formylmethionin nicht inbegriffen) aufweist. Diese DNA wird folgendermaßen erhalten:

In den Λ Phagen wird ein Segment des Lactose-Operons eingeführt, wie es von Backman et al., Proc.Natl.Acad.Sci. USA, Bd. 73, Nr. 11 (1976), S. 4174-4178, "Genetics", beschrieben ist. Das Genom dieses modifizierten Phagen enthält eine Erkennungsstelle EcoRI-Z im Z-Gen seines Lactose-Operon-Segments.

In Figur 1 ist schematisch eine Karte des /J. Phagen wiedergegeben mit dem für den Lebenszyklus nicht wesentlichen Teil NE des natürlichen Phagen, der modifiziert worden ist. Die in Figur 1 angegebenen Zahlen zeigen den verwendeten Maßstab, ausgedrückt in Prozent der Länge, ausgehend von den Genen des Phagenkopfs.

Das vorstehend genannte Segment des Lactose-Operons enthält den Operator, den Promotor und die Information, die für die ersten Aminosäuren der ß-Galactosidase codiert (mit den Mutationen L8 und UV5). Dieses Fragment ist in vitro in die EcoRI Schnittstelle inseriert worden, die am Ende des Z-Gens eines Phagen /t, plac5 angeordnet ist (dieser Phage hat keine andere Schnittstelle für EcoRI).

In Figur 2 ist schematisch die ungefähre Anordnung des Lactose-Operon-Segments (Rechteck Z) in diesem Phagen wiedergegeben.

Nach der von den vorstehend genannten Autoren beschriebenen Methode wird in die Schnittstelle EcoRI-Z (schematisch durch den Pfeil in Figur 2 wiedergegeben) ein Fragment OP Hind III 203,

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das ebenfalls von diesen Autoren beschrieben ist (Figur 3a), inseriert. Dieses Fragment enthält neben einem zentralen Teil OP einerseits ein Fragment Z¹ aus dem Z-Gen, das den ersten sieben Aminosäuren entspricht, für die das Z-Gen codiert, und andererseits ein endständiges Fragment I" des Lactose-Operon-Repressors. Beim Inserieren des Fragments OP Hind III 203 (in Figur 3b durch eine verkürzte Gradeinteilung wiedergegeben) im gleichen Sinne wie das homologe Fragment OP benachbart zum endständigen Fragment Z" des Z-Gens des Phagens (angegeben durch das Bezugszeichen "op" in Figur 3b und in Nachbarschaft zu einem endständigen Fragment I" des Gens I des Lactose-Operon-Repressors) bewirkt eine intramolekulare Rekombination eine Deletion (Fig. 3c) nahezu des gesamten Z-Gens. Dies gestattet u.a. die Ausbildung einer Schnittstelle (Erkennungssequenζ) für EcoRI (EcoRi-Az) anstelle der Erkennungssequenz für Hae III sehr nahe dem Ursprung des Z-Gens an einer Stelle entsprechend der siebten Aminosäure der ß-Galactosidase. Es bleiben schließlich vom anfänglichen Z-Gen nur noch die Fragmente Z" und Z¹ beiderseits der Stelle EcoRI-^Z zurück.

In Figur 2 ist ebenso die Schnittstelle für das Enzym Hind III wiedergegeben, welche dem Segment des Lactose-Operons auf der DNA des Bakteriophagen Λ₂ ^am nächsten liegt. Diese Stelle wird mit "sHind III Λ," bezeichnet.

Der auf diese Weise erhaltene Vektor wird in an sich bekannter Weise mittels der Enzyme EcoRI und Hind III geschnitten. Man isoliert in ebenfalls bekannter Weise das Fragment des Phagen, einschließlich des Fragments Z¹, mit einem Ende (an der Seite von Z'), das der Schnittstelle EcoRI-Az entspricht, und dessen anderes Ende der Schnittstelle sHind III X » entspricht.

Die DNA des Plasmids pBR322 wird ebenfalls durch die Enzyme EcoRI und Hind III an ihren entsprechenden Erkennungsstellen geschnitten.

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Sodann erfolgt die in vitro Rekombination der Fragmente der DNA des Plasmids pBR322 und der Fragmente des Aphagen mit den Trägern der Segmente des Lactose-Operons in Gegenwart einer DNA-Ligase, insbesondere einer Ligase aus dem Phagen T4. Sodann wird der in Figur 4b schematisch wiedergegebene gewünschte Vektor nach üblichen Methoden, beispielsweise nach der Methode von Humphries et al., a.a.O., durch Klonieren in E.coil K12, insbesondere E.coli K12 C600 rk mk , isoliert. Dieser Vektor enthält den essentiellen Teil A der DNA des Ausgangsplasmids und die inserierte DNA B mit dem Fragment des Phagen Δ R- und dem Fragment des Lactose-Operons (ΔΖ,ο,ρ(Ι)); (i) bezeichnet nur ein Fragment des Gens (i) .

Die Identifizierung des lac-Fragmentes im Plasmid kann beispielsweise dadurch erfolgen, daß man den Vektor in einen Indikatorstamm E. coli K 12 lac Z einschleust und nach erfolgter Amplifizierung des Plasmids die konstitutive Synthese der ß-Galactosidase auf einem Farbindikator prüft, der 5-Chlor-4-brom-3-indolyl-ß-galactosid enthält. Durch die Vielzahl der vorhandenen Operator-Sequenzen werden die lac-Repressor-Moleküle der Zelle wegtitriert.

Das auf diese Weise erhaltene neue Plasmid p1397 trägt das vorgenannte Segment des Lactose-Operons mit einer einzigen Schnittstelle für EcoRI an der Stelle der siebten Aminosäure (oder der achten Aminosäure, wenn Formylmethionin mitgerechnet wird) der ß-Galactosidase. Das Plasmid wird auch mit "pOMP 0" bezeichnet.

2. Konstruktion von rekombinantem Ovalbumin Das Ovalbumin wird aus dem vorgenannten Hybridplasmid und dem Fragment Hha ov, beschrieben von Humphries et al., 1977, hergestellt. Bei diesem Fragment handelt es sich um ein doppelsträngiges DNA-Fragment, das ausgehend von Plasmid pCRI ov 2-1 durch die Restriktxonsendonuclease Hhal geschnitten und durch Sacharose-Gradienten-Sedimentation isoliert worden ist.

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^ Das Fragment Hha ον enthält etwa 2400 Basenpaare und trägt den größten Teil der Sequenz entsprechend der mRNA des Ovalbumins. Es ist in Figur 4c der Zeichnung schematisch wiedergegeben (Be_wzugszeichen Hha ov).

Das Plasmid p1397 wird mit EcoRI geschnitten und mit der für einsträngige DNA spezifischen ! Nuclease S1 behandelt, um die kurzen einsträngigen Enden, die durch die EcoRI-Verdauung gebildet werden, zu kappen (vgl. Humphries et al., 1977).

Die erhaltene und schematisch in Figur 4d wiedergegebene entsprechende lineare DNA wird mit DNA-Polymerase I aus E.coli in Gegenwart der vier Desoxynucleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und dTTP behandelt; vgl. Humphries et al, 1977.

Das Fragment Hha ov wird in gleicher Weise mit DNA-Polymerase I von E.coli in Gegenwart der vier Desoxynucleosidtriphosphate behandelt.

Durch diese Umsetzungen werden modifizierte DNA Moleküle erhalten, die keine überstehenden Enden (Einstrangenden) mehr aufweisen und die mit überschüssiger T4-Ligase verknüpft werden; vgl. K. Itakura, T. Hirose, R. Crea, A.D. Riggs, H.L. Heynecker, F. Bolivar, H.W. Boyer, Science, Bd. 198

(1977) , S. 1056.

Unter den erhaltenen Hybridplasmiden werden solche Moleküle isoliert, deren für Ovalbumin codierende Sequenz (ausgenommen die ersten 15 Basenpaare, die für die ersten 5 Aminosäuren codieren) verknüpft ist mit der Information für die ersten sieben Aminosäuren der bakteriellen ß-Galactosidase (oder für die ersten acht Aminosäuren, wenn Formylmethionin mitgezählt wird; vgl. Fig. 4e). Dasjenige Hybridplasmid, das für die Ergänzungen des nachstehend beschriebenen Versuchs zurückbehalten wurde, wird mit "pOMP 0" bezeichnet.

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Diese Isolierung wird zweckmäßig nach folgender Erkennungsmethode durchgeführt: Die Hybridplasmide werden in einen lysogenen Stamm von E. coli K12 eingeführt, der einen thermoinduzierbaren Prophagen trägt. Sobald dieser Stamm Kolonien gebildet hat, wird eine Lysis eines Teils der Zellen bewirkt. Die DNA der lysierten Zellen wird sodann durch Kontakt auf einen bestimmten Träger übertragen, insbesondere auf ein Cellulosefilter, auf dem die gewünschten DNA's in situ durch Hybridisierung mit radioaktiver DNA an einer Stelle nachgewiesen werden, die der Impfstelle der eingesetzten Kultur des Mikroorganismus entspricht, wo sich ein intrazelluläres Produkt gebildet hat. Diese Isolierung kann natürlich auch nach anderen bekannten Nachweismethoden erfolgen.

Die nicht lysierten Mikroorganismen dieser Kolonien, die in diesem System positiv reagieren (somit die Träger der Ovalbuminsequenz), werden isoliert und die Plasmide werden nach der Methode von F. Rougeon, P. Kourilsky, B. Mach, Nucleic Acids Research, Bd. 2 (1975), S. 2365 durch Transformation in einen anderen nichtlysogenen Stamm von E.coli K12 (C6OOrk mk ) rückübertragen. Diese Stämme werden in einer Nährbouillon vermehrt. Sodann werden durch Ultraschallbehandlung der Zellen Extrakte hergestellt.
Zu diesem Zweck werden die Bakterien im Kulturmedium eingefroren, danach aufgetaut und bei O⁰C mit Ultraschall behandelt und aufgebrochen (dreimal 20 Sekunden). Der erhaltene Rohextrakt kann dann fraktioniert werden.

Die Gegenwart von Antigenen, die Ovalbumin ähnlich sind, wird durch den Radioimmuntest nachgewiesen. Hierbei unterwirft man den bakteriellen Extrakt bestimmter Stämme einer kompetitiven Reaktion mit durch J markiertem Ovalbumin und bildet mit einem sehr spezifischen Antiovalbumin-Antikörper Komplexe.

Der Radioimmuntest zeigt die Gegenwart von 5 000 bis 50 000 Antigenmolekülen pro Bakterium an. Die Affinität des durch das Bakterium gebildeten Antigens zum Antiovalbumin unterscheidet

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sich kaum von dem des natürlichen Ovalbumins. Die Größe des Antigens wird durch Elektrophorese der mit S markierten Rohextrakte und durch Immunpräzipitation bestimmt .

Das Hybridprotein hat das gleiche Molekulargewxcht wie das Ovalbumin, d.h. etwa ^:. 43 000 Dalton.

Das Hybridprotein unterscheidet sich vom Hühner-Ovalbumin durch eine geringe Anzahl von Modifikationen, die nach der Synthese des Proteins bewirkt worden sind. Das natürliche Ovalbumin ist an zwei Stellen phosphoryliert und an einer Stelle glycosyliert. Der Nährwert d<=s erhaltenen Hybridproteins wird durch das Fehlen der Glycosylgruppen nicht beeinträchtigt.

Das modifizierte Ovalbumin hat folgende theoretische Sequenz: Formylmethionin - Threonin - Methionin - Isoleucin Threonin - Asparaginsäure - Serin - Leucin - Alanin - Alanin Serin - Methionin - Glutaminsäure . ..., die ersten 8 Aminosäuren der ß-Galactosidase und die 5 folgenden Aminosäuren, die die ersten Aminosäuren des Fragments des Ovalbumins Hha ov bilden, dem übrigens die 5 ersten natürlichen Aminosäuren des Ovalbumins fehlen.

Das Plasmid p1397 wurde am 2. Juni 1978 in der Collection Nationale de Culture de Micro-organismes (C.N.C.M.) beim Institut Pasteur unter der Nummer 1-064 hinterlegt.

Das vorstehend beschriebene Plasmid, insbesondere der Teil- des Plasmids, der die entsprechende Sequenz des vorstehend beschriebenen Ovalbumins enthält, kann in ein Plasmid eingebaut werden, das sich in Hefen, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, einschleusen läßt. Das modifizierte Protein kann dann in diesen Hefen exprimiert werden.

Die Konstruktion eines modifizierten, in eine Hefe transformierbaren Plasmids, seine Amplifikation, die Transformation

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einer Hefe mit diesem modifizierten Plasmid und die Feststellung der Expression dieses modifizierten Plasmids in der Hefe werden nachstehend kurz erläutert.

1. Extraktion der Sequenz des lac-Ovalbumins aus dem

Plasmid pOMP2

pOMP2 wird durch die Restriktionsendonuclease Hhal an zwei Erkennungssequenzen gespalten, und zwar auf beiden Seiten des Fragments Hha ov, wie dies in Figur 4e gezeigt ist. Nach der Wiedereinfügung dieses Fragments in einen anderen Vektor wird die Anwesenheit des Fragments leicht daran erkannt, daß es nach Transformation in lac-induzierbare Bakterien diese durch übertitrieren des lac-Repressors zur konstitutiven Synthese der ß-Galactosidase veranlaßt. Die transformierten Bakterien können dann große Mengen ß-Galactosidase erzeugen. Sie bilden blaue Kolonien in Gegenwart des Farbstoffs X-gal, d.h. 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-ß-galactosid'.

Das Verfahren wird folgendermaßen durchgeführt:; 20 μg DNA von pOMP2 werden durch Hhal (Biolab; 25 Einheiten)

30 Minuten bei 37°C behandelt. Sodann wird die Reaktion durch 10 minütiges Erhitzen auf 65⁰C in Gegenwart von 10 mM EDTA abgebrochen. Das erhaltene Reaktionsgemisch wird danach auf einen 5-20prozentigen Sucrosegradienten (Gewicht pro Volumen) in einer Lösung von Natriumacetat, pH 6,0, mit 10 mM EDTA und 0,5 % SDS gegeben und hierauf 16 Stunden bei 20°C und

31 000 U/Min (Beckman-Zentrifuge, Rotor-Typ SW41) zentrifugiert. Es wird das schwerste Fragment isoliert, das die Sequenz lac-Ovalbumin trägt.

2. Bildung des Plasmids 8 mit dem Fragment EcoRI-D Das Plasmid wird durch in vitro Rekombination des Plasmids pBR 322 mit dem Marker Ura (beschrieben von M.L. Bach,

F. Lacroute und D. Botstein, Proc. Nati. Acad. Sei., U.S.A., Bd. 76, Nr. 1 (1979), S. 386-39O)/ das vorher mit EcoRI geschnitten worden ist, mit dem Fragment "EcoRI-D" (beschrieben

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von Cameron et al-, Nucl. Acids Research, Bd. 4/Nr. 5 (1977), S. 1429 - 1448), das vom "Plasmid 2 μ" abstammt und das bekanntlich in Hefen, wie Saccharomyces cerevisiae, transformiert werden kann, erhalten.

Das Verfahren wird nach üblichen Methoden durchgeführt, insbesondere nach der Methode von A. Hinnen et al., Proc. Natl. Acad. Sei., U.S.A., Bd. 75, Nr. 4 (1978), S. 1929-1933.

Eine Probe des "Plasmids 8" ist bei der C.N.C.M. am 27. Mai 1977 unter der Nummer 1-093 hinterlegt worden.

.3. Bildung einer Rekombinante des "Plasmids 8" mit einem die Sequenz lac-Ovalbumin enthaltenden Fragment von pOMP2

30 Mikrogramm DNA des Plasmids 8 werden durch 1,5 Einheiten des Enzyms Hhal in einem üblichen Puffer während 5 Minuten bei 37⁰C geschnitten. Sodann wird die Reaktion durch lOminütiges Erhitzen auf 65⁰C in Gegenwart von 10 M EDTA abgebrochen.

Die erhaltenen linearen Moleküle werden durch Zentrifugation

in einem 5 bis 20prozentigem Sacharosegradienten in einem 10~²M Tris-HCl-Puffer mit 1θ"³Μ EDTA und 10~¹M NaCl während

4 Stunden bei 20⁰C und 40 000 U/Min in einer Beckman-Zentrifuge, Rotor-Typ SW41, gereinigt.

200 ng des erhaltenen lac-Ovalbumin-Fragments mit 2,67 kb (Kilobasen) und 600 ng des erhaltenen linearen Plasmids 8 werden bei 4⁰C in Gegenwart von T4-Ligase in einem Endvolumen von 5 Mikroliter eines 40 mM Tris-Puffers vom pH-Wert 7,5 mit 1OmM MgCl₂, 1OmM DTT, 0,1 M ATP und Serumalbumin (0,05 mg/ml) inkubiert.

Lysogene Zellen des Stammes 1398 (E.coli K12) (C.N.C.M. Nr. 1-094, hinterlegt am 27. Mai 1979) werden mit den Rekombinanten transformiert. Die transformierten Zellen werden in einem Ampicillin (20 Mikrogramm pro Milliliter) enthaltenden Kulturmedium durch in situ Hybridisierung mit einer Probe selektioniert, die eine spezifische DNA der Ovalbumxnsequenz enthält. Der Radio-

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2323297 immuntest (mit einer spezifischen RNA-Probe des Fragments Hha ov) zeigt in den transformierten Bakterien die Gegenwart von Proteinen an, die Ovalbumin enthalten.

4. Amplifikation und Isolierung des Plasmids.

E.coli C600 rk mk wird mit der Plasmid-DNA transformiert, die im Verlauf der vorhergehenden Stufe isoliert worden ist. Dadurch werden die sonst Iac- induzierbaren Bakterienzellen lac-konstitutiv. Nach Entwicklung der Kultur werden die Bakterien nach üblichen Methoden aufgebrochen. Aus dem Zellbrei wird das ringförmige Plasmid durch Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation in Gegenwart von Ethidiumbromid von der linearen DNA getrennt.

5. Transformation von Saccharomyces cerevisiae (C.N.C.M.

Nr. 1-095 hinterlegt am 27. Mai 1979) ·

Der vorstehend beschriebene Ura -Hefestamm wird mit dem Plasmid transformiert und in einem Uracil-freien Nährmedium gezüchtet. Lediglich die durch das Plasmid Ura gewordenen Hefezellen vermehren sich in diesem Medium. Es wird durch den Radioimmuntest unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen die Bildung eines Hybridproteins nachgewiesen, das eine Ovalbuminsequenζ enthält.

Der Vektor der Erfindung, der das Ovalbumin-Gen enthält, kann seinerseits als Vektor zur Herstellung anderer Hybridproteine

dienen. Dies läßt

sich erreichen durch Ersatz des Fragments des Ovalbumin-Gens dieses Vektors oder durch Zusatz eines Fragments der DNA-Kopie der RNA, die dem gewünschten Protein entspricht, das sich in Form des Proteins in seiner natürlichen Wirtszelle exprimiert. Beispielsweise kann man das Somatostatin-Gen oder das Gen jedes anderen Proteins iserieren.

Es wurde festgestellt, daß der größte Teil des Ovalbumin enthaltenden Hybridproteins, der in den Bakterien durch den

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vorstehend beschriebenen Vektor exprimiert worden ist, in den periplasmatischen Raum sezerniert wird, d.h. in den Raum zwischen der zytoplasmatischen Membran und der Bakterienwand.

Ferner wurde festgestellt, daß während der Expression von pOMP2 in einem Stamm von E.coli K 12 88 % des gebildeten Ovalbumins im periplasmatischen Raum gefunden werden, während 12 % im Cytoplasma verbleiben.
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Diese Bestimmungen wurden nach dem vorstehend beschriebenen Radioimmuntest auf einem Kulturmedium der Bakterien nach selektivem Aufbrechen der Bakterienwand nach der Methode von Neu und Heppel, J. of Biol . ehem., Bd. 240 (1965), S. 3685 3692 durchgeführt. In gleicher Weise wurde das intrazelluläre, freie Ovalbumin nach Aufbrechen der Sphäroplasten bestimmt.

Der Vektor, der das für Ovalbumin codierende DNA-Fragment enthält, ist infolgedessen geeignet zur Inserierung einer entsprechenden DNA, die für ein gewünschtes Protein codiert (Somatostatin oder ein anderes Protein). Die Expression des derart modifizierten Vektors bewirkt infolgedessen die Freisetzung des exprimierten Hybridproteins, das insbesondere das gewünschte Protein enthält, in einem Teil des Bakteriums (periplasmatischer Raum), aus dem es leicht isoliert werden kann.

Die Erfindung betrifft somit allgemein jeden Hybridvektor, der eine DNA-Sequenz enthält, die für den größeren Teil des Ovalbumins codiert. Vorzugsweise ist diese einem Ovalbumin entsprechende DNA-Sequenz in dem Vektor an eine DNA-Sequenz gebunden, die mindestens einem Teil des Lactose-Operons entspricht, einschließlich dem Promotor und einem Teil des Z-Gens, das mit ihm assoziiert ist, sei es direkt, oder durch ein Zwischenstück einer ganzen Zahl von Basentripletts, die derart ausgewählt sind, daß sie die Translation nicht unterbre-

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2323297 chen können. Der Hybridvektor "der Erfindung enthält .-vor zugsweise das DNA-Fragment, das die entsprechende Sequenz für die ersten 8 Aminosäuren der ß-Galactosidase enthält. Diese Sequenz ist direkt an das DNA-Fragment gebunden. Diese Sequenz codiert für den größten Teil des Ovalbumins, ausgenommen gegebenenfalls die ersten Aminosäuren, insbesondere die ersten fünf Aminosäuren des Ovalbumins.

Vorzugsweise ist die DNA-Sequenz, die für das Ovalbumin codiert, aus DNA aufgebaut, die bei der enzymatischen reversen Transcription von mRNA anfällt und die dem Ovalbumin-Gen in den natürlichen Wirtszellen entspricht.

Die Erfindung umfaßt alle Varianten, insbesondere diejenige, bei der man andere Plasmide als die vorstehend speziell beschriebenen, insbesondere das in dem Aufsatz von K. Itakura et al., a.a.O., beschriebene Plasmid pSOM1 verwendet, sofern das exprimierte Ovalbumin als unempfindlich gegenüber der Einwirkung endogener proteolytischer Enzyme der bakteriellen Wirtszelle angesehen werden kann. Die Erfindung betrifft auch die erfindungsgemäß modifizierten Plasmide, in denen aber das Fragment des Operons nicht vom ursprünglichen Lactose-Operon herrührt, sondern von einem anderen Operon, beispielsweise einem Galactose-Operon oder einem Tryptophan-Operon.

' Hinsichtlich des letztgenannten Operons ist darauf hinzuweisen, daß die Konstruktion einer Rekombinante des λ Phagens und eines Tryptophan-Operons von A. Moir und W.J. Brammar in dem Aufsatz "The use of specialised transducing phages in the amplification of enzyme production" in der Zeitschrift Molee.Gen.Genet., Bd. 149 (1979), S. 87 - 99, beschrieben ist.

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Claims

VOSSIUS · VOSSiUS · HILTL · TAUCHNSR · HEUNEMANN PATENTANWÄLTE O Q O O O Q Π SI E BE RTSTRASS E 4 ■ 80OO MÖNCHEN 86 · PHONE: (Ο89) 47 4Ο75 CABLE: BENZOLPATENT MÖNCHEN TELEX 5-29 4-3 3 VOPAT D S. Juni U.Z.: P 205 Case: PL/SH-0162-79-05-D.15952 INSTITUT PASTEUR Paris, Frankreich "Plasmidvektoren, Hybridplasmide und ihre Verwendung zur Herstellung von Proteinen" Priorität: 8. Juni 1978, Frankreich, Nr. 78.17221 Patentansprüche

1. Plasmid, dadurch gekennzeichnet, daß es in einem für seinen Lebenszyclus unwesentlichen Teil ein DNA-Fragment enthält, das sich von einem X-Phagen ableitet, wobei dieses DNA-Fragment (Insertion) an einen Teil eines bakteriellen Operons, insbesondere eines Lactose-Operons gebunden ist, das mindestens den bakteriellen Promotor und ein an diesen Promotor gebundenes Strukturgen-Fragment enthält, beispielsweise das Z-Gen, das für die Bildung der ß-Galactosidase in dem Lactose-Operon codiert, wobei die Insertion gegebenenfalls an das erste Nucleotidtriplett oder die ersten Nucleotidtripletts grenzt, das für die erste Aminosäure bzw. die für die ersten Aminosäuren des entsprechenden Proteins codieren, d.h. im Falle des Lactose-Operons die ß-Galactosidase, und wobei das Plasmid ferner dadurch gekennzeichnet ist, daß es im Strukturgen-Fragment eine Schnittstelle für eine bestimmte Endonuclease, wie EcoRI, aufweist und vorzugsweise in seinen anderen Teilen keine weiteren ErkennungsSequenzen für die

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gleiche Endonuclease besitzt.

2. Plasmid nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment des bakteriellen Operons ein Fragment des Lactose-5 Operons ist, das mindestens die Sequenz des Z-Gens enthält, die für die ersten acht Aminosäuren der bakteriellen ß-Galactosidase codiert, einschließlich Formylmethionin als der ersten Aminosäure.

3. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Strukturgen-Fragment eine EcoRI-Schnittstelle aufweist.

4. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment des -i-phagen an einem seiner Enden an das Fragment des bakteriellen Operons gebunden ist und an seinem anderen Ende eine Schnittstelle für Hind III aufweist.

5. Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn-

zeichnet, daß es ein Hybridplasmid bildet, das ein Fragment einer Fremd-DNA, insbesondere in das Fragment des Z-Gens (oder das Fragment des entsprechenden Gens im Falle eines unterschiedlichen bakteriellen Operons) inseriert oder unmittelbar angrenzend an dieses, enthält, wobei dieses Fragment der Fremd-DNA normalerweise für mindestens einen Teil eines bestimmten Proteins in einer prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle codiert, aus der es stammt.

6. Hybridplasmid nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment der Fremd-DNA aus einem DNA-Fragment besteht, das auf chemischem Wege oder durch enzymatische reverse Transcrip-

tion einer mRNA, die dem Protein entspricht, hergestellt worden ist.

7. Hybridplasmid nach einem der Ansprüche 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Gen-Fragment des gewünschten Proteins eine Größe, ausgedrückt durch die Zahl der Nucleotide, besitzt, die

größer ist als die des Fragments des Z-Gens oder eines analogen L J

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Fragments.

8. Hybridplasmid nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment der Fremd-DNA ein Fragment enthält, das bei korrekter Anpassung des Leserasters an die Sequenz des Z-Gen-Fragments für ein Nahrungsprotein codiert.

9. Hybridplasmid nach einem der Ansprüche 6 oder 8, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment der Fremd-DNA für mindestens einen Teil der Aminosäuresequenz des Ovalbumins codiert.

10. Hybridplasmid nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet,

daß das Fragment der Fremd-DNA ein DNA-Fragment mit dem Hauptteil der Ovalbumin-Information enthält, welches einerseits an die Tripletts der ersten 8 Aminosäuren, einschließlich des Formylmethionxns, der bakteriellen ß-Galactosidase, grenzt, und andererseits direkt oder über ein Zwischenstück aus einer ganzen Zahl Tripletts, an die vorausgehende Sequenz angekoppelt ist, wobei die Tripletts des Zwischenstücks so ausgewählt sind, daß sie die Translation nicht unterbrechen, und die Ovalbumin-Information um die Tripletts der ersten Aminosäuren, insbesondere der ersten 5 Aminosäuren, verkürzt sein kann.

11. Hybridplasmid nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß es in eine Hefe, insbesondere Saccharomyces cerevisiae, transformierbar ist.

12. Hybridplasmid nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es ursprüngliche DNA-Fragmente des "Plasmids 2μ" enthält.

13. Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins, von dem ein Teil aus einem Protein stammt, welches normalerweise in einer natürlichen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle von dem entsprechenden Gen codiert wird, das dem Genom der Wirtszelle angehört oder von einem DNA-Fragment codiert wird, das durch enzymatische reverse Transcription der entsprechenden RNA erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet,

daß man in einen MLkcoo rganismus ein Hybridplasmid einführt, das L

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erhalten worden ist durch Insertion einer bestimmten DNA in das Plasmid, und das entstandene Hybridprotein mit dem gewünschten Proteinfragment aus den von den Mikroorganismen gebildeten Zellproteinen isoliert.

14. Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß das Fragment der Fremd-DNA für ein Hybridprotein codiert, das mindestens einen Teil eines Nahrungsproteins enthält.

15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, daß das Nahrungsprotein Ovalbumin ist.

16. Mikroorganismus, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid nach einem der Ansprüche 1 bis 13 enthält.

17. DNA-Fragment, enthaltend eine DNA-Sequenz entsprechend einem Teil des Lactose-Operons, einschließlich des Promotors, des Operators und eines Fragments des Z-Gens, und in korrekter Fortführung des Leserasters mit dem vorgehenden Fragment eine DNA-Sequenz, die für ein Nahrungsprotein codiert.

18. DNA-Fragment nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz für Ovalbumin codiert.

19. DNA-Fragment nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß es den Hauptteil der Ovalbumin-Information enthält und einerseits an die Tripletts der ersten 8 Aminosäuren, einschließlich des Formylmethionins, der bakteriellen ß-Galactosidase grenzt, und andererseits direkt oder über ein Zwischenstück aus einer ganzen Zahl Tripletts an die vorhergehende Sequenz angekoppelt ist, wobei die Tripletts des Zwischenstücks so ausgewählt sind, daß sie die Translation nicht unterbrechen, und die Ovalbumin-Information um die Tripletts der ersten Aminosäuren, insbesondere der ersten 5 Aminosäuren, verkürzt sein kann.

20. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß die für den Hauptteil oder das gesamte Ovalbumin in dem DNA-Fragment codierende DNA durch enzymatische reverse Transcription L J

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der entsprechenden mRNA gewonnen worden ist.

21. DNA-Fragment nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, daß der Hauptteil der für Ovalbumin codierenden DNA, ausgenommen der Teil, der für die ersten 5 Aminosäuren dieses Proteins codiert, unmittelbar an die ersten 8 Tripletts der DNA-Sequenz gebunden ist, die für die ersten 8 Aminosäuren der ß-Galactosidase codieren, wobei die Kopplung zwischen einem Leucin- und einem Alanin-Triplett erfolgt. 10

22. Nahrungsprotein, das in einem Teil mindestens die Aminosäuresequenz des Ovalbumins enthält, und im wesentlichen frei von Glycosy!resten ist, und das entsprechend der Information auf dem DNA-Fragment nach Anspruch 18 oder 19 exprimiert werden kann.

23. Protein nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß es eine Sequenz entsprechend den ersten 8 Aminosäuren der ß-Galactosidase sowie ein weiteres Fragment gebunden an das erste enthält, das die Gesamtheit der Sequenz der Aminosäuren des Ovalbumins enthält, ausgenommen die ersten 5 Aminosäuren des natürlichen Ovalbumins.

24. Hybridvektor, enthaltend eine DNA-Sequenz, die für den Hauptteil des Ovalbumins codiert.

25. Hybridvektor nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz an einen entsprechenden Teil des Lactose-Operons gebunden ist, der den Promotor, den Operator und einen Teil des Z-Gens enthält.

26. Hybridvektor nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß der Teil des Lactose-Operons die Tripletts entsprechend den ersten 8 Aminosäuren der ß-Galactosidase (einschließlich Formylmethionin) enthält, und daß die DNA, die dem Ovalbumin entspricht, entweder direkt oder über ein Zwischenstück einer ganzen Zahl Tripletts, die die Translation nicht unterbrechen, an das Triplett entsprechend der 8. Aminosäure der ß-Galactosidase gebunden ist.

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27. Hybridvektor nach einem der Ansprüche 24 bis 26, dadurch gekennzeichnet, daß die DNA-Sequenz, die für den Hauptteil des Ovalbumins codiert, das enzymatische reverse Transcriptionsprodukt der mRNA des Ovalbumins ist.

28. Hybridvektor nach einem der Ansprüche 24 bis 27, dadurch gekennzeichnet, daß er aus einem Plasmid besteht.

29. Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins, von dem ein Teil aus einem Protein stammt, welches normalerweise in einer natürlichen prokaryotischen oder eukaryotischen Wirtszelle von dem entsprechenden Gen codiert wird, das dem Genom der Wirtszelle angehört oder von einem DNA-Fragment codiert wird, das durch enzymatische reverse Transcription der entsprechenden RNA erhalten worden ist, dadurch gekennzeichnet, daß man in einen Mikroorganismus einen modifizierten Vektor nach einem der Ansprüche 24 bis 28 einführt, der durch Insertion der für das Hybridprotein codierenden DNA in einem Vektor gebildet worden ist, die transformierten Mikroorganismen vermehrt, sodann die Zellen aufbricht und aus dem Zellbrei das Hybridprotein isoliert.

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