DE2950995C2

DE2950995C2 -

Info

Publication number: DE2950995C2
Application number: DE2950995A
Authority: DE
Inventors: Pierre Tiollais; Alex Fritsch; Christine Paris Fr Pourcel; Patrick Boulogne Fr Charnay
Original assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Current assignee: Institut Pasteur de Lille; Institut National de la Sante et de la Recherche Medicale INSERM
Priority date: 1978-12-18
Filing date: 1979-12-18
Publication date: 1991-05-02
Also published as: BE880670A; DE2950995A1; FR2444713B1; GB2034323B; CH646456A5; GB2034323A; OA06416A; FR2444713A1

Description

Die Erfindung betrifft das in den Ansprüchen 1 bis 3 angegebene Verfahren zur Herstellung einer DNA, die ein Hepatitis B Virus Genom enthält. Die Erfindung betrifft ferner, gemäß den Ansprüchen 4 und 5, Hybrid-DNA, in die ein Fragment aus einer doppelsträngigen DNA entsprechend der des Hepatitis B Virus eingefügt worden ist. Schließlich betrifft die Erfindung Hybridvektoren gemäß Anspruch 6 und die Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellten DNA nach den Ansprüchen 7 und 8.

Die DE-OS 25 35 554 beschreibt ein biologisches Verfahren, das dadurch gekennzeichnet ist, daß doppelsträngiges Rezeptor- DNA-Material zerteilt wird, die bei dieser Behandlung anfallenden doppelsträngigen DNA-Fragmente mit donor-DNA-Fragmenten vermischt werden, welche durch Zerteilung von unterschiedlichem DNA-Material unter Anwendung gleichartiger Maßnahmen zur Zerteilung von DNA angefallen sind, das Gemisch dieser Fragmente willkürlich zu Hybrid-DNA-Molekülen verschmolzen wird, und geeignete sensitive Mikroorganismuszellen mit diesen doppelsträngigen Hybrid- DNA-Molekülen infiziert werden.

Die Virushepatitis B ist eine häufige Erkrankung, die ins besondere im tropischen Afrika, Südostasien und im Fernen Osten vorkommt, wo etwa 10% der Bevölkerung Träger des viralen Oberflächen-(HBs)-Antigens sind. Die Infektion zeigt sich häufig durch eine akute Form ohne Folge erscheinungen. Sie kann aber auch der Ursprung einer chronischen Hepatitis oder einer Zirrhose oder sogar einer tödlich verlaufenden hepatitischen Nekrose sein. Dies erklärt die Bedeutung der Forschung über die Biologie des Virus sowie die kürzliche Entwicklung eines Impfstoffes, dessen Wirksamkeit an Patienten und Personal von Hemodialysestationen nachgewie sen wurde; vgl. Ph. Maupas, A. Goudeau, P. Coursaget, J. Drucker und Ph. Bagros, Intervirol., Bd. 10 (1978), S. 196 bis 208. Das Danepartikel (vgl. D. S. Dane, C. H. Cameron und M. Briggs, The Lancet, 1970, S. 695 bis 698) wird z. Z. als das ätiologische virale Agens angesehen. Dieses Partikel, das un ter dem Elektronenmikroskop beobachtet werden kann, hat einen Durchmesser von 42 nm. Das Serum der Patienten in der prä icterischen Phase enthält bis zu 10⁹ oder sogar 10¹⁰ Dane partikel pro ml. Das Danepartikel besitzt eine Hülle (Australia Antigen oder HBs-Antigen), ein Kapsid (HBc-Antigen), eine endo gene Polymerase sowie ein DNA-Molekül; vgl. J. L. Melnick, G. R. Dreesman und F. B. Hollinger, Sc. Amer., 237, 1977, S. 44 bis 52. Unter dem Elektronenmikroskop erscheint das Genom als ein doppelsträngiger DNA-Ring, der eine einsträngige Region besitzt, deren Länge von einem zum anderen Molekül schwankt; vgl. J. Summers, A. O'Connell und I. Millman, Proc. Natl. Acad. Sci., USA Bd. 72 (1975), S. 4597 bis 4601, und W. S. Robinson, Ann. Rev. Microbiol., Bd. 31 (1977), S. 357 bis 377. Dieser Ring besteht aus zwei ineinander verdrillten linearen Molekülen ungleicher Länge, wie dies schematisch in Fig. 1 gezeigt ist. Es handelt sich um das kleinste virale Genom, das in Säugern bekannt ist. Der längste Strang enthält etwa 3200 Basen. Die endogene DNA-Polymerase kann zur in vitro-Reparatur der ein strängigen Region (b₁ in Fig. 1) des kürzesten Stranges ver wendet werden; vgl. T. A. Landers, H. B. Greenberg und W. S. Robinson, J. Virol., Bd. 23 (1977), S. 368 bis 376. Alle diese sehr speziellen Eigenschaften der Danepartikel er höhen das Interesse des Studiums der Biologie des Virus.

Die in vitro Reparaturtechniken, die von diesen Autoren ver wendet wurden, erlauben jedoch nicht die vollständige Schließung der einsträngigen Region des kürzesten Stranges.

Die Untersuchung des Virus ist z. Z. besonders mühsam auf grund der Schwierigkeiten, ausreichende Mengen an Serum mit Danepartikeln zu erhalten. Selbst ein an Danepartikeln reiches Serum gestattet nicht die Herstellung größerer Mengen an DNA in der Größenordnung von 1 γ DNA pro 500 ml Serum. Es ist somit erforderlich, Seren unterschiedlicher Herkunft und mit ent sprechend verschiedenen genetischen Varianten zu sammeln; vgl. J. P. Soulier und A. M. Courouce-Pauty, Vox Sang., Bd. 25 (1973), S. 212 bis 235. Dies führt zu Unsicherheiten bei der Untersuchung der Primärstruktur des Genoms. Die Gegenwart der einzelsträngigen Region erschwert darüber hinaus die Er stellung einer physikalischen Karte mittels Restriktions enzymen.

Das Problem der Isolierung verhältnismäßig großer Mengen an Viruspartikeln gewinnt noch erhöhte Bedeutung, wenn man aus reichende Mengen an Viruspartikeln erhalten will, insbesondere ihre HBs-Antigene, welche anscheinend ein Protein mit immunogenen Eigenschaften tragen. Die z. Z. üblichen Impfverfahren haben, soweit ihre Wirksamkeit bewiesen ist, verschiedene Nachteile. Insbesondere können HBs-Impfstoffe noch Antigen-Bestandteile aus Leberzellen enthalten, die für Autoimmunreaktionen ver antwortlich sein können; vgl. B. S. Blumberg, Science, Bd. 197 (1977), S. 17 bis 24.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von DNA des Hepatitis B Virus bzw. der Dane partikel zu entwickeln, und zwar in ausreichenden Mengen und in ausreichender Reinheit, so daß sie selbst zur Herstellung von Antigenen für therapeutische Zwecke eingesetzt werden kann.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß die DNA der Dane partikel nach in vitro "Reparatur" in Gegenwart von Vor läufer-Nukleotiden und einer DNA-Polymerase eine einzige Erkennungsstelle für bestimmte Endonukleasen aufweist. Als speziell verwendbare Restriktionsendonukleasen sind EcoRI und Xho zu nennen.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung der DNA mit dem für das Hepatitis B Virus charakteristischen Genom ist dadurch gekennzeichnet, daß man die ursprüngliche DNA des Hepatitis B Virus mit einer Polymerase und den entsprechenden Vorläufer-Nucleotiden repariert, die reparierte DNA mit einer Restriktionsendonuklease spaltet, für die lediglich eine einzige Erkennungsstelle in der DNA des Hepatitis B Virus vor handen ist und die doppelsträngige DNA mit einem die doppel strängige DNA enthaltenden Hybridvektor in einem Bakterium kloniert. Diese doppelsträngige DNA wird nachstehend als DNA-HVB bezeichnet. Vorzugsweise wird als DNA-Polymerase die endogene Polymerase des Hepatitis B Virus eingesetzt.

Erfindungsgemäß ist die zu klonierende DNA vorher mittels einer Restriktionsendonuklease der vorstehend beschriebenen Art, insbesondere durch die Endonuklease EcoRI geschnitten worden.

Zur Klonierung wird vorzugsweise ein Vektor, zweckmäßig ein Phage oder ein Plasmid verwendet, in dem die doppelsträngige DNA, die vorher an ihrer einzigen Erkennungsstelle geschnit ten wurde, eingespleißt worden ist.

Als Phage, der eine einfache Klonierung der EcoRI-behandel ten doppelsträngigen DNA gestattet, sei beispielsweise λgtWES. λB genannt (vgl. P. Leder, D. Tiemeier und L. Enquist, Science, Bd. 196 (1977), S. 175 bis 177), welcher nur zwei EcoRI-Schnittstellen (EcoRI λ1 und EcoRI λ2) auf weist. Diese Schnittstellen gestatten das Einspleißen der gesamten DNA des Hepatitis B Virus in das Genom dieses Phagen anstelle des Phagen-DNA-Fragments, das zwischen diesen beiden EcoRI-Schnittstellen gelegen ist.

Es liegt auf der Hand, daß auch andere Vektoren mit zwei EcoRI- Erkennungsstellen oder einer einzigen EcoRI-Erkennungsstelle in einem für die Replikation des Vektors unwesentlichen Teil für das erfindungsgemäße Verfahren verwendet werden können.

Das erfindungsgemäße Klonierverfahren kann somit folgende wesentliche Schritte beinhalten:

a) Reparatur der DNA des Hepatitis B Virus in Gegenwart von Vorläufer-Nukleotiden und einer DNA-Polymerase unter Bildung von DNA-HVB;
b) Spaltung der DNA-HVB mittels einer Restriktionsendonuklease, vorzugsweise EcoRI;
c) Spaltung der DNA des Vektors, Isolieren der Anteile dieser DNA (zwei oder drei Fragmente je nachdem wieviel EcoRI- Erkennungsstellen der Vektor aufweist), Trennung und Iso lieren, insbesondere durch Ultrazentrifugieren, der beiden DNA-Fragmente, die einerseits die Kopf- und Schwanzgene sowie andererseits die Replikationsgene des Phagen ent halten. Diese beiden vorhergehenden Arbeitsgänge werden zweckmäßigerweise gleichzeitig durchgeführt;
d) Vermischen dieser beiden DNA-Vektorfragmente mit der ge schnittenen DNA-HVB und ihr Verknüpfen in Gegenwart von DNA-Ligase, insbesondere T4DNA-Ligase;
e) Transfektion oder Transformation einer Kultur von Wirts bakterien mit den erhaltenen Hybridvektoren und nach Inkubation der Kultur;
f) Wiedergewinnung der Phagen, Extraktion ihrer Rekombinanten- DNA, die nachstehend als λ-HVB1 bezeichnet wird, die dann DNA-HVB in ihren Genomen inseriert enthält, und gegebenen falls Behandlung dieser Hybrid DNA mit EcoRI und Isolieren vorzugsweise durch Ultrazentrifugieren der herausgeschnit tenen DNA-HVB, die durch Elektrophorese auf Agarosegel er kennbar ist. Diese DNA-HVB wandert als langsamste Fraktion, und sie enthält etwa 3200 Basenpaare.

Die erfindungsgemäß hergestellten neuen DNA-Moleküle können unmittelbar auf verschiedenen Gebieten eingesetzt werden. Die erhaltenen DNA-Moleküle können vor oder nach der Abtrennung der DNA-HVB, vorzugsweise durch Schneiden mit EcoRI, zum in vitro Nachweis des Hepatitis B Virus in biologischen Proben dienen. Zu diesem Zweck können diese DNA-Moleküle nach üb lichen Methoden radioaktiv markiert werden. Die Verwendung derartig radioaktiv markierter DNA-Moleküle ist besonders vorteilhaft, da sie keine besonders großen Mengen an Blutpro ben von Patienten erfordern, die möglicherweise durch Hepa titis B Virus infiziert sind. Als Beispiel kann angeführt werden, daß diese Art der Anwendung interessant ist für die Untersuchung von ansteckenden Fällen von Hepatitis B oder für die Erkennung von Hepatitis B Virus bei Personal in Hämodialysezentren. In gleicher Weise eignet sich dieses Nachweisverfahren zur Untersuchung von Blutproben, die für Bluttransfusionen verwendet werden sollen. Ferner kann das Verfahren bei Blutplasma oder Serum benutzt werden.

Die Erfindung betrifft auch die neuen Hybridvektoren, die eine doppelsträngige DNA mit den Charakteristiken der DNA des Hepatitis B Virus enthalten. Weiterhin ist es möglich, die Ausprägung der genetischen Information der Vektoren in einem Bakterium zu induzieren, um auf diese Weise die Herstellung eines Hybridproteins zu ermöglichen, das ins besondere das HBs-Antigen enthält. Dies ermöglicht die Her stellung und Untersuchung von Hepatitis B-Impfstoffen.

In dieser Hinsicht ist es vorteilhaft, als Vektor einen modi fizierten Lamda-Bakteriophagen zu verwenden, der in Kombination

a) Mutationen enthält, welche die Ausprägung der späten Gene unterdrücken oder verzögern, insbesondere die der Regulation der Produktion derjenigen Proteine, welche für die Ver packung dieser modifizierten DNA benötigt werden in einem Bakterium, insbesondere E. coli, welches mit Suppressoren für diese Mutationen versehen ist;
b) ein DNA-Fragment, das mindestens einen Teil des Z-Gens so wie einen Promotor des lac-Operons von E. coli oder eines analogen bakteriellen Operons enthält, das in einen un wesentlichen Teil des Phagen-Genoms inseriert ist, sowie
c) eine Spaltstelle einer Restriktionsendonuklease im Z-Gen fragment, jedoch keine weiteren Erkennungsstellen für die gleiche Endonuklease in der vorstehend genannten modifi zierten DNA, d. h. der DNA des hier charakterisierten λ-Vektors.

Vorzugsweise wird als bakterielles Operon das E. coli Lactose- Operon verwendet. Die Mutationen der vorstehend beschriebenen späten Gene betreffen das Q- und das S-Gen; die einzige Er kennungsstelle ist eine EcoRI-Erkennungsstelle. Ein derartiger Phage ist in Molec. Gen. Genetics, Bd. 170 (1979) S. 171 bis 178, beschrieben.

Die Herstellung des vorstehend beschriebenen Hybridproteins, welches das Protein entsprechend der DNA-HVB enthält, kann folgendermaßen erfolgen: Ein Bakterium, insbesondere E. coli, wird mit dem modifizierten Phagen infiziert. Dieses Bakterium ist nicht mit Suppressoren für die Mutationen der späten Gene dieses Phagen ausgestattet. Gegebenenfalls in Gegenwart eines β-Galactosidaseinduktors wird das Bakterium vermehrt, und aus der Bakterienmasse wird das Hybridprotein nach üblichen Methoden isoliert.

Gegebenenfalls kann der eingesetzte Vektor (entweder der vor stehend beispielhaft beschriebene Vektor oder jeder andere Phagen- oder Plasmidvektor) modifiziert werden, um sicherzu stellen, daß die eingespleißte DNA-HVB in der richtigen Ab lesephase vorliegt. Dies wird vorzugsweise dadurch erreicht, daß man in den betreffenden Vektor entweder zwei Paare oder vier Paare von zusätzlichen Basen einsetzt zwischen die Startstelle der Translation des DNA-Fragments, dessen Aus prägung erwünscht ist, und das erste Basenpaar der proximalen Erkennungsstelle des Restriktionsenzyms, insbesondere EcoRI, das die Verknüpfung zwischen dem entsprechenden Teil des Vektors und dem proximalen Ende der einzuspleißenden DNA-HVB bewirken soll. Diese zusätzlichen Basenpaare müssen natür lich derart beschaffen sein, daß in den Vektor keine Basen tripletts (Kodons) eingebaut werden, die ein nonsense Kodon bilden, das die Translation unterbrechen würde. Auf diese Weise wird erreicht, daß die Basenpaare, welche im Ausgangs vektor (ersten Vektor) jeweils die erste Position der auf einanderfolgenden Tripletts darstellen, wenigstens in einem Teil der beiden weiteren Vektoren (entstanden durch besagte Insertionen von zwei oder vier zusätzlichen Basenpaaren) nun zum jeweils zweiten oder dritten Basenpaar (oder umgekehrt) in den aufeinanderfolgenden Tripletts werden. In dieser neuen Triplettfolge werden die Basenanordnungen bei der Translation in der gleichen Art Wirtszellen abgelesen, wenn diese Zellen vorher mit den anderen Vektoren transformiert oder transfiziert wurden.

Ausgehend von dem ersten Vektor, der eine EcoRI-Erkennungs stelle in einem bestimmten Abstand von der Anfangsstelle der Translation aufweist, ist es möglich, einen der beiden anderen vorstehend angegebenen Vektoren zu erhalten, beispielsweise nach folgendem Verfahren: Zunächst wird der erste Vektor mittels EcoRI an der entsprechenden Erkennungsstelle geschnit ten;
sodann wird dasjenige der beiden Phagenfragmente isoliert, das die Anfangsstelle der Translation enthält;
der Einzelstrang, welcher das überstehende Ende der EcoRI Schnittstelle bildet, wird mittels einer geeigneten Endo nuklease, beispielsweise S1 Endonuklease, abgebaut, und das auf diese Weise modifizierte Fragment wird an dem gebildeten freien Ende mit einem Fragment, beispielsweise einem Linker der Formel

wiederverbunden, welcher seinerseits eine EcoRI-Erkennungs stelle aufweist. Sodann wird das modifizierte Vektorfragment in Gegenwart von EcoRI geschnitten. Dies führt zur Bildung eines Vektorfragments, in welchem das erste Basenpaar des kohäsiven EcoRI-Endes um zwei weitere Basenpaare gegenüber der ursprünglichen Schnittstelle bezüglich des Startpunkts der Translation verschoben ist. Schließlich wird das auf diese Weise modifizierte Fragment mit dem anderen, vorzugs weise in Gegenwart einer DNA-Ligase, insbesondere T4DNA- Ligase, verbunden.

Das vorstehend beschriebene Verfahren kann ein zweites Mal wiederholt werden, um eine weitere ähnliche Verschiebung zu erreichen, die zur Herstellung der dritten möglichen Ablese phase führt.

Nach dem Inserieren der DNA-HVB in jeden dieser drei Vektoren ist verständlich, daß einer dieser drei Vektoren auf alle Fälle richtig translatiert wird in der entsprechenden bak teriellen Wirtszelle. Dies führt dementsprechend zur Bildung eines Hybridproteins, das das Protein entsprechend der DNA- HVB enthält.

Andere Merkmale der Erfindung gehen aus der nachstehenden Beschreibung hervor, in der beispielhaft die Klonierung des Genoms des Hepatitis B Virus im λgtWES λB Phagen erläutert wird. In diesem Zusammenhang wird auch auf die Zeichnungen Be zug genommen.

Fig. 1 zeigt schematisch eine natürliche DNA des Hepatitis B Virus, wie sie bereits in der Einleitung beschrieben wurde;

Fig. 2 zeigt schematisch eine Photographie mit dem Elektronen mikroskop von drei DNA-HVB-Molekülen, von denen zwei teilweise einsträngig sind.

Die Fig. 3 bis 6 sind Reproduktionen von Elektronenmikroskop photographien von Heteroduplices zwischen der DNA des Hybrid vektors einerseits (aus λ-DNA und DNA-HVB rekombinierte Moleküle) und andererseits der DNA, die direkt aus Danepartikeln gewonnen wurde.

Fig. 1 zeigt schematisch eine virale DNA, wie sie von Dane partikeln erhalten wird. Sie besteht aus einer einzelsträngigen Region b₁ und einer doppelsträngigen Region b₂. Diese Regionen b₁ und b₂ sind in den Diagrammen der Fig. 2 durch dünne und dickere Linien bezeichnet.

1) Reinigung und Reparatur der DNA des Hepatitis B Virus (DNA-HVB)

400 ml an Danepartikeln reichem Serum, unterteilt in 12 Fraktionen von jeweils 25 ml, werden auf Saccharose-Gradienten von 10 bis 30 Gewichtsprozent pro Volumen in 10 mM Tris- HCl-Puffer vom pH-Wert 8, 10 mM EDTA, 1 M NaCl (TEN-Puffer) geschichtet. Es wird 15 Stunden in einem Beckman-SW27 Rotor bei 5°C und 25 000 U/min zentrifugiert. Jeder Niederschlag (der die Danepartikel enthält) wird in 0,5 ml TEN-Puffer auf genommen und mit Ultraschall behandelt. Die erhaltene Sus pension (6 ml) wird auf zwei Saccharose-Gradienten (10 bis 30 Gewichtsprozent pro Volumen) geschichtet und zwei Stunden in einem Beckman SW50-1 Rotor bei 5°C und 50 000 U/min zentri fugiert. Die Niederschläge werden erneut in 1 ml TEN-Puffer aufgenommen, der Cäsiumchlorid enthält. Die Dichte wird auf 1,23 g/ml eingestellt. Die erhaltene Suspension wird 15 Stunden in einem Beckman SW60-Rotor bei 20°C und 55 000 U/min zentrifugiert. Der Gradient wird in 50 µl-Fraktionen aufge teilt. Der Nachweis der Danepartikel erfolgt durch Bestimmung ihrer endogenen Polymerase aus 1 µl-Proben. Die Polymerase aktivität wird durch Bestimmung des Einbaus von ATP und TTP α³²P in ein säurefällbares Material festgestellt; vgl. W. S. Robinson, Ann. Rev. Microbiol., Bd. 31 (1977), S. 357 bis 377 oder T. A. Landers et al., J. Virol., Bd. 23 (1977), S. 368 bis 376.

Diejenigen Fraktionen, bei denen der Einbau von α³²P ein Maximum aufwies, hatten eine Dichte von 1,23 g/ml. Diese Fraktionen (mit den Danepartikeln) werden unter den gleichen Be dingungen mit einem Gemisch von ATP und TTP α³²P mit einer zehnmal geringeren spezifischen Aktivität (zur Vermeidung des Abbaus der DNA) markiert. Diese Fraktionen werden 1 Stunde bei 37°C in Gegenwart von Pronase (10 mg/ml) und Natrium dodecylsulfat (1%) inkubiert. Sodann wird die DNA durch zwei malige Behandlung mit einem Phenol-Chloroform-Gemisch (Vo lumenverhältnis 1 : 1) extrahiert. Aus dem Extrakt wird die DNA durch Zusatz von 2 Volumenteilen Äthanol bei -20°C ausge fällt. Sodann wird die ausgefällte DNA in 100 µl TEN-Puffer gelöst. Die Konzentration der DNA wird bestimmt, wobei die spezifische Aktivität der Triphosphat-Vorläufer, der Anteil der einsträngigen DNA, der durchschnittlich 30% beträgt, und die Tatsache berücksichtigt wird, daß die endogene DNA- Polymerase etwa die Hälfte der einsträngigen Region repa riert. Die Bestimmung der DNA-Konzentration wird durch elektrophoretische Analyse auf Agarosegel bestätigt. Die 100 µl (entsprechend 400 ml Plasma) enthalten etwa 1 µg DNA. Die Untersuchung unter dem Elektronenmikroskop zeigt, daß das Präparat tatsächlich ringförmige DNA der erwarteten Länge enthält und der größte Teil der Moleküle eine ein strängige Region unterschiedlicher Länge besitzt. Der Anteil an linearen Molekülen, welche gleiche Länge hatten wie die ringförmige DNA, beträgt etwa 10%.

2) in vitro Herstellung von Rekombinanten zwischen DNA-HVB und zwei Fragmenten des λgtWES. λB (Leder et al., Science 1977, 175-177)

30 ng DNA-HVB werden mit 500 ng des Vektorfragments (ent sprechend einem Molekülverhältnis von etwa 1 : 1) vermischt. Das Gemisch wird mit EcoRI-Endonuklease behandelt. Dadurch, daß zum EcoRI-Hydrolyse-Ansatz der DNA-HVB noch der DNA- Vektor zugesetzt wurde, erreicht man die Verdünnung von möglicherweise vorhandener, kontaminierender Nukleaseakti vität. Nach der Hydrolyse werden die Fragmente durch Elek trophorese an einem Polyacrylamidgel voneinander getrennt. Der Gelgradient weist Acrylamidkonzentrationen von 2,5 bis 7,5% auf. Die erhaltenen Fraktionen werden in an sich be kannter Weise durch Chromatographie an Hydroxylapatit kon zentriert; vgl. Tiollais et al. Febs. Letters, Bd. 48 (1974), S. 96 bis 100. Die erhaltenen Konzentrate werden gegen 50 mMol Tris-HCl-Lösung vom pH-Wert 7,5 mit einem Gehalt von 60 mMol Natriumchlorid dialysiert.

Die Ligierung der erhaltenen Fragmente erfolgt nach der Me thode von Murray & Murray, Nature, Bd. 251 (1974), S. 474 bis 481, mit Ausnahme folgender Abänderungen. Die DNA-Lösungen enthalten 30 ng/µl DNA (das Molverhältnis von Vektorfrag menten und einzuspleißenden Fragmenten beträgt zwischen 2 : 1 und 6 : 1) in einem Tris-HCl-Puffer bei einem pH-Wert von 7,5 und 60 mM Natriumchlorid. Diese Lösungen werden 5 Minuten auf 50°C erhitzt, um die überstehenden Enden voneinander zu trennen. Die nachstehend identifizierten Komponenten werden sodann zum Gemisch gegeben. Es wird auf eine Endkonzentration von 10 nM MgCl₂, 10 nM Dithiothreit, 0,1 mM ATP und 50 µg/ml Rinderalbuminserum eingestellt. Hierauf wird eine Poly nukleotid T4-Ligase zugesetzt und das Medium 20 Stunden bei 0°C inkubiert.

3) Klonierung im Stamm C600 recBC rk⁻mk⁻

Die Transfektion des oben bezeichneten Stammes wird nach der Methode von Cameron et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 72 (1975), S. 3416 bis 3420, durchgeführt. Der Stamm wird sodann auf ein Lactose-MacConkey-Medium aufgetragen. 8 unabhängige Klone werden in dem Stamm DP50 Sup F (C.N.C.M.Nr.I-077) ampli fiziert. Die DNA wird sodann mit EcoRI geschnitten, und die Fragmente werden durch die Elektrophorese im Agarosegel ana lysiert. In sämtlichen Fällen zeigt sich die Gegenwart eines EcoRI Fragments, das als langsamste Fraktion wandert. Bei dieser Fraktion handelt es sich um DNA-HVB mit einer geschätzten Größe von etwa 3200 Basenpaaren.

4) Identifizierung des DNA-HVB-Fragments

Die DNA des rekombinanten Bakteriophagen (λHVB 1) wird mit der Ausgangs DNA-HVB im Verhältnis von 3 Molekülen DNA-HVB pro 1 Molekül DNA λ-HVB 1 hybridisiert.

Die beobachteten Heteroduplexmoleküle enthielten eine doppel strängige Schleife einer Größe, die der der doppelsträngigen DNA-HVB gleich ist und die an der erwarteten Stelle im Genom des Bakteriophagen angeordnet ist. Es werden zwei Typen von Schleifen beobachtet: Entweder eine vollständig doppel strängige Schleife oder eine Schleife, die eine einzel strängige Region im zentralen Bereich des inserierten EcoRI- Fragments trägt (vgl. Fig. 3 und 4). Beim Paaren der beiden Stränge des Vektors werden zwei Schlingen beobachtet (Fig. 5 und 6).

Verschiedene Befunde zeigen, daß es sich bei der klonierten DNA tatsächlich um DNA-HVB handelt. Nach der Verdauung der DNA des hybriden Lamda-Bakteriophagen (HVB-1) durch EcoRI- Endonuklease zeigt die elektrophoretische Analyse die Gegen wart eines Fragments mit der Länge der DNA-HVB. Auch die nach der Hybridisierung beobachteten Heteroduplexschleifen haben die gleiche Länge. Die Existenz der doppelsträngigen Schleifen, die an der einzelsträngigen DNA hängen, beweist, daß die inserierte DNA vor der Spaltung mit EcoRI kreisförmig war. Die Gegenwart von zwei Typen von Schleifen (vollständig und teilweise doppelsträngig) beweist, daß die ursprüngliche DNA aus zwei gepaarten Ketten gleicher Größe gebildet war. Die Charakteristika entsprechend gut denjenigen des Hepatitis B Genoms.

Die große Menge an Heteroduplexmolekülen mit der entsprechenden Struktur ist von Bedeutung. Dies zeigt, daß das klonierte Fragment nicht eine DNA-Verunreinigung ist, da bei der Her stellung von DNA-HVB das Elektronenmikroskop den Nachweis von weniger als 1% Verunreinigungen ermöglicht.

Der DNA-Klon stellt anscheinend die Gesamtheit des Genoms der Danepartikel dar. Tatsächlich zeigt die Struktur der Heteroduplexmoleküle, daß der empfindlichste Teil des DNA- HVB, nämlich die einzelsträngige Region, tatsächlich einge spleißt worden ist. Außerdem zeigt die Länge der klonierten DNA, daß der Unterschied in der Länge kleiner wäre als der Meßfehler, nämlich etwa 150 Basenpaare, wenn diese klonierte DNA kürzer wäre als die DNA der Danepartikel. Sämtliche vor stehend aufgeführten Ergebnisse bestätigen auch die Existenz einer einzigen EcoRI-Erkennungsstelle in DNA-HVB.

Die auf diese Weise klonierte DNA-HVB kann in vitro markiert werden, insbesondere mit einem radioaktiven Isotop ³²P. Vor zugsweise wird sie als Indikator verwendet, um die Gegenwart von Danepartikeln beispielsweise in menschlichem Serum fest zustellen. Zu diesem Zweck können übliche DNA-DNA-Hybridi sierungsmethoden angewendet werden.

Die Erfindung betrifft schließlich auch ein Verfahren zur Herstellung eines Hybridproteins, das ein Proteinfragment mit immunisierender Wirkung gegen Hepatitis B aufweist. Zu diesem Zweck wird der vorstehend beschriebene Hybridvektor in Bakterien eingeschleust. In den Bakterien wird zumindest ein Teil der genetischen Information des Hybridvektors, die die DNA entsprechend dem Hepatitis B Antigen enthält, zur Ausprägung gebracht, und das Hybridprotein wird isoliert.

Selbstverständlich ist die Erfindung nicht auf die vorstehend beschriebenen Ausführungsformen und Anwendungen beschränkt. Sie betrifft sämtliche Modifikationen, insbesondere andere genetische Modifikationen der DNA des Hepatitis B Virus.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung einer DNA, die ein Hepatitis B Virus Genom enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die ursprüngliche DNA des Hepatitis B Virus mit einer Poly merase und den entsprechenden Vorläufer-Nukleotiden repa riert, die reparierte DNA mit einer Restriktionsendonuklease spaltet, für die lediglich eine einzige Erkennungsstelle in der DNA des Hepatitis B Virus vorhanden ist und die Klonierung mit einem die doppelsträngige DNA enthaltenden Hybridvektor durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Restriktionsendonuklease EcoRI oder Xho verwendet wird.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die klonierten Hybridvektoren mit einer Restriktions endonuklease gemäß Anspruch 2 spaltet und die doppelsträngige DNA, die der DNA des Hepatitis B Virus entspricht, ab trennt.

4. Hybrid-DNA, in die ein Fragment eingefügt worden ist, das aus einer doppelsträngigen DNA besteht, die der DNA des Hepatitis B Virus entspricht.

5. Hybrid-DNA nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß sie markiert ist.

6. Hybridvektor, dadurch gekennzeichnet, daß er die Hybrid-DNA nach Anspruch 4 enthält.

7. Verwendung der nach dem Verfahren gemäß Anspruch 1 hergestellten DNA zum Nachweis von Hepatitis B Virus in einer biologischen Probe.

8. Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die biologische Probe Blut, Plasma oder Serum ist.