CN101297036B - 新质粒载体和稳定保持质粒的转化体 - Google Patents

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Abstract

本发明的目的是开发新型载体，优选开发下述新型载体：所述新型载体即使没有抗生素的选择压力也能够在雷尔氏菌属、贪铜菌属和沃特氏菌属中稳定保持，并且没有接合转移性。本发明还提供使用该载体的聚羟基链烷酸酯稳定生产菌株和使用该菌株生产聚羟基链烷酸酯的方法。本发明是下述新型重组载体，所述重组载体含有在雷尔氏菌属、贪铜菌属和沃特氏菌属中发挥作用的DNA复制起始区域；本发明特别是使用下述重组载体得到的转化体，所述重组载体含有在雷尔氏菌属、贪铜菌属和沃特氏菌属中发挥作用的DNA复制起始区域和稳定化重组载体的区域(par区域)，所述载体能够在细菌中稳定保持，并能高效生产聚羟基链烷酸酯。

Description

新质粒载体和稳定保持质粒的转化体
技术领域
本发明涉及新载体。此外，本发明属于质粒稳定化技术领域，更详细地说，本发明涉及能够在是氢细菌也是公知的PHB合成菌的雷尔氏菌属、贪铜菌属或者沃特氏菌属中稳定存在的重组载体，以及被该载体转化的菌株和利用该菌株进行的聚羟基链烷酸酯的商业生产。
背景技术
在将重组DNA技术实际用于通过微生物生产目的物质时，一般会存在重组质粒不稳定的问题。
实验室通常使用的克隆和表达载体通常是多拷贝质粒，它们向后代的稳定遗传是通过相对于每个细胞基因组导入多个质粒来确保的(参考非专利文献1)。但是，如果使用质粒导入外来基因，则由于细菌增殖循环期间质粒缺失，会造成导入基因不稳定。所以在工业的生产工程中，必须保证细菌中的质粒在发酵罐内的培养结束之前是稳定的。
以往，作为用来向雷尔氏菌属、沃特氏菌属和贪铜菌属中导入基因的质粒载体，主要使用pJRD215系列载体、pBBR系列载体(参考非专利文献2和非专利文献3)。但是，我们的研究证明：当宿主细菌在细胞内积累聚羟基链烷酸酯等时，这些质粒载体会变得非常不稳定。例如，对于pJRD215系列载体，当在不大量积累聚羟基链烷酸酯的条件下进行培养时，即使不施加抗生素选择压力，在经过4次转接后也仍有约80％的细胞保有质粒；但是，在大量积累聚酯的条件下进行培养时，同样4次转接后，却只有30％的细胞保有质粒。此外，pBBR系列的载体也显示同样的特征。
这些质粒载体是为用于广泛宿主范围而开发的广域宿主载体(参考非专利文献4和非专利文献5)，但是当以雷尔氏菌属、沃特氏菌属和贪铜菌属等为宿主、工业性地进行物质生产时，有必要开发适合于雷尔氏菌属、沃特氏菌属和贪铜菌属的基因导入用质粒。
以往，为了使质粒稳定化，人们考察了各种各样的方法，到目前为止，可以在雷尔氏菌属中使用的质粒载体只能选择通过对氯霉素、卡那霉素、氨苄青霉素等的耐药性来保持质粒的转化体。如果通过抗生素施加选择压力来进行培养，则存在如下问题：(1)抗生素耐药性菌株的使用对环境造成危害、(2)培养所必需的抗生素的量会显著增加生产成本、(3)抗生素不宜应用于用于人和动物的治疗的物质的生产。因此，通过耐药性来保持质粒的转化体不适用于工业生产。
作为稳定保持质粒的系统，par系统为人熟知，其不采用通过抗生素施加选择压力的方法(参考非专利文献6、7)。par系统一旦启动，复制的质粒就被分配到子细胞中，所以即使不通过抗生素抗性施加选择压力也能够获得稳定保持质粒的菌株。到目前为止，人们开发了重组了RP4质粒的par系统的载体(参考专利文献1)、使用R1质粒的par区域的载体(参考专利文献2)，它们可以在大肠杆菌中使用。而且，已知耐金属贪铜菌CH34株保有的巨大质粒pMOL28的par区域中存在启动子parP、质粒稳定化因子parA28、parB28和识别序列parS，这些基因已经被克隆化在质粒pSUP202中，其核苷酸序列已经公布(参考非专利文献8)。
如前所述，雷尔氏菌属、贪铜菌属、沃特氏菌属，尤其是钩虫贪铜菌经常用作聚羟基链烷酸酯生产和蛋白质生产菌(参考非专利文献9)，需要开发可以专门用于这些细菌的、没有接合转移性的、且不施加抗生素选择压力也能稳定保持的质粒载体。但是，前述的利用par区域的质粒稳定化对于雷尔氏菌属细菌、贪铜菌属细菌、沃特氏菌属属细菌并不适用，不清楚以往的系统构建方法和构建的系统对于质粒的稳定化实际上是否有效。
专利文献1：美国专利第6143518号说明书
专利文献2：美国专利第4760022号说明书
非专利文献1：Jones IM等，Mol Gen Genet.180(3)：579-84.(1980)
非专利文献2：T.Fukui等，Biotechnology Letters.Vol.19，No.11，Nov1997：1093-97
非专利文献3：STEVEN SLATER等，JOURNAL OF BACTERIOLOGY，Apr.1998：1979-1987
非专利文献4：Luan Tao等，Metabolic Engineering，Volume 7，Issue 1，January 2005：10-17
非专利文献5：Davison J等，Gene.1987；51(2-3)：275-80
非专利文献6：M.Gerlitz等，Journal of Bacteriology，Nov：6194-6203(1990)
非专利文献7：B.Youngren等，Journal of Bateriology，July：3924-3928(2000)
非专利文献8：Safieh Taghavi等，Mol.Gen.Genet，250：136-179(1996)
非专利文献9：Gravin C.等，Protein Expression & Purification Dec；38(2)：64-71(2004)
发明内容
发明要解决的问题
本发明的目的是开发新载体。优选目的是开发可以以雷尔氏菌属(Ralstonia)细菌、贪铜菌属(Cupriavidus)细菌或者沃特氏菌属(Wautersia)细菌为宿主使用的、并且没有抗生素选择压力也能够在细菌中稳定保持的载体。另一个目的是用该转化体生产聚羟基链烷酸酯，且稳定其生产性能。
解决课题的方法
为了制备目的产物，即能够用于雷尔氏属细菌等的转化的载体，必须要有用于在宿主细菌中复制载体的DNA序列(ori)，所以，在本发明中，我们考虑通过开发含有能够在雷尔氏属细菌等中发挥功能的DNA复制起始区域(ori)的载体，来制备能够以雷尔氏菌属、贪铜菌属、沃特氏菌属细菌为宿主使用的新载体。而且，用于工业生产规模的物质生产的载体不仅要能够在宿主细菌内复制，还必须具有如下特征：1)其DNA碱基对数利于简便地操作，2)具有耐药性基因用于选择转化体，3)没有接合转移性。
一般认为前述的par系统非常有效，因为作为稳定化载体的方法，其可以不添加抗生素，也不必向宿主细菌的染色体中引入变异等。但是，虽然前述的巨大质粒pMOL28由于具有par系统而能够在宿主细菌中稳定保持，但是280k的碱基对数非常多，且其不具有耐药性基因，所以认为它不能用作雷尔氏菌属、贪铜菌属和沃特氏菌属细菌用的载体。
本发明人等为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：如果使耐金属贪铜菌(Cupriavidus metallidurans)CH34菌株所具有的巨大质粒pMOL28的复制起始区域和par系统在不同于耐金属贪铜菌CH34菌株的宿主中发挥功能，那么即使不施加抗生素抗性选择压力，质粒也能够稳定保持，所述“不同于耐金属贪铜菌CH34菌株的宿主”例如钩虫贪铜菌(Cupriavidusnecator，旧称Ralstonia eutropha或者Wauterisia eutropha)。从而，开发出新的质粒载体。
也就是说，本发明的第一方面涉及一种重组载体，该重组载体含有SEQID NO：18所示的序列，且导入了以雷尔氏菌属、贪铜菌属或者沃特氏菌属细菌为宿主发挥功能的复制起始区域。优选不具有mob基因簇和oriT序列、即不具有接合转移性的重组载体；更优选导入par区域而形成的重组载体，该par区域是作为稳定化质粒的结构即par系统而发挥作用的DNA区域；更加优选含有SEQ ID NO：19所示的DNA片段作为par区域的重组载体；特别优选在上述重组载体中导入至少一个选自下组的PHA合成相关基因而成的重组载体：3-羟基丁酸(3HB)供应体系即硫解酶、还原酶，聚羟基丁酸(PHB)合酶即PHB合酶，聚羟基链烷酸酯(PHA)合酶即PHA合酶，β氧化途径中的酶即酰基CoA转移酶、烯酰CoA水合酶和酰基CoA脱氢酶。
本发明的第二方面涉及通过上述重组载体将基因转移进入宿主细菌而获得的转化体，优选宿主细菌是钩虫贪铜菌的转化体。
本发明的第三方面涉及培养上述转化体、并从该培养物制备PHA的制造方法。
以下更详细的说明本发明。
本发明第一方面的重组载体含有序列编号18所示的序列，且导入了以雷尔氏菌属、贪铜菌属或者沃特氏菌属细菌为宿主发挥功能的复制起始区域。
上述复制起始区域是指作为重组载体复制的复制起点发挥作用的序列。SEQ ID NO：18所示的序列是耐金属贪铜菌CH34菌株所具有的巨大质粒pMOL28中的、SEQ ID NO：7所示的复制起始区域(ori区域)的一部分。本发明中导入载体的复制起始区域只要含有SEQ ID NO：18、并以雷尔氏菌属、贪铜菌属或者沃特氏菌属细菌为宿主发挥功能，可以是任何形式的。作为上述复制起始区域，也可以使用SEQ ID NO：7所示的序列。
本发明的重组载体优选不具有mob基因簇和oriT序列。这是因为，该载体如果具有mob基因簇和ori序列，则当与其它微生物接触时就有可能产生接合转移，会存在称为“重组体的封入”的安全方面的问题。其中，mob基因簇是指编码转移DNA的功能的基因簇，mob基因簇所编码的蛋白具有向oriT序列中插入缺刻的功能，和稳定地转移已成为单链的DNA的功能。oriT序列是指缺刻位点和用于插入缺刻的识别序列。
本发明的重组载体优选是导入了稳定化载体的区域的重组载体，所述稳定化载体的区域作为par系统发挥功能(par区域)。前述par区域只要是在雷尔氏菌属、贪铜菌属或者沃特氏菌属细菌中发挥功能的par系统即可，任何序列都是可以的，但优选雷尔氏菌属细菌、贪铜菌属细菌或者沃特氏菌属细菌所具有的质粒中的par区域，更优选巨大质粒中的par区域。本发明中特别优选使用含有SEQ ID NO：19所示序列的DNA片段。上述SEQID NO：19所示的序列是耐金属贪铜菌CH34菌株所具有的巨大质粒pMOL28中的、SEQ ID NO：8所示的par区域的一部分，并包含parA基因、parB基因和识别序列parS。
SEQ ID NO：19所示的序列是耐金属贪铜菌CH34菌株所具有的巨大质粒pMOL28中的par区域的一部分，所以如果要使含有这段序列的DNA片段作为par系统发挥功能，除了SEQ ID NO：19所示的序列之外，还必须含有启动子和终止子。
作为上述启动子，可以使用上述巨大质粒pMOL28中的parP，也可以使用其它生物来源的启动子，只要其以雷尔氏菌属细菌、贪铜菌属细菌或者沃特氏菌属细菌作为宿主发挥功能。巨大质粒pMOL28中的启动子parP基本相当于SEQ ID NO：8的第2388位到第2848位的碱基序列。
作为上述终止子可以使用上述巨大质粒pMOL28中的终止子，也可以使用其它生物来源的终止子，只要其以雷尔氏菌属细菌、贪铜菌属细菌或者沃特氏菌属细菌作为宿主发挥功能。巨大质粒pMOL28中的终止子包含于SEQ ID NO：8的第61位到第202位的碱基序列中。
作为导入本发明的重组载体中的par区域，可以使用SEQ ID NO：8所示的序列。
本发明的重组载体优选至少导入了一个与PHA合成相关的基因。这样一来，如果该重组载体的转化体中所有基因有效工作，就能够更高效地合成PHA。而且，该能够合成PHA的转化体与多拷贝型质粒不同，质粒能够稳定地复制，所以能够给宿主稳定地提供PHA合成相关基因，能够积累商业上有意义量的PHA。
作为前述PHA合成相关基因，可以列举出下组酶的基因：3HB供应体系的硫解酶、还原酶，PHB合酶类的PHB合酶，PHA合酶类的PHA合酶，β氧化途径酶类的酰基CoA转移酶、烯酰CoA水合酶和酰基CoA脱氢酶等等；导入了选自上组中的至少一个基因而成的重组载体是优选的。硫解酶可以列举β-酮硫解酶等，还原酶可以列举乙酰乙酰CoA还原酶等，PHA合酶基因可以列举豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)来源的PHA合酶的变体基因即N149S/D171G变体等，酰基CoA转移酶可以列举3-羟基酰基ACP-CoA转移酶等。
向本发明的重组载体中导入PHA合成相关基因时，如果预先向载体中导入了限制性酶切位点，导入该基因就变得容易。
本发明的重组载体优选含有选择标记。在本发明中，向重组载体中导入par区域，则载体的稳定性良好，所以不需要抗生素等选择压力；但是如后面所述，用本发明的重组载体转化宿主细胞时，该选择标记可以用于转化株的选择。
选择标记并不特别限定，可以列举例如卡那霉素、氨苄青霉素、四环素等抗生素的抗性基因等。在本发明的重组载体中，上述选择标记优选SEQID NO：14所示的卡那霉素抗性基因。
本发明的重组载体，还可以对上述导入了基因而获得的重组载体进行小型化。
重组载体的小型化可以通过下述方式进行：缺失对复制起始区域、par区域、选择标记和PHA合酶基因的表达而言并非必要的部分。例如，因为本发明的重组载体优选不具有mob基因簇和oriT序列，所以可以通过缺失这些基因簇或序列来小型化。通过小型化，在将本发明的重组载体导入宿主时，能够提高转化率。
本发明的重组载体更优选含有SEQ ID NO：18所示的序列，且含有以雷尔氏菌属细菌、贪铜菌属细菌或者沃特氏菌属细菌作为宿主发挥功能的复制起始区域，和SEQ ID NO：14所示的卡那霉素抗性基因。
本发明的重组载体通过包含巨大质粒来源的复制起始区域，成为在耐金属贪铜菌以外的宿主中也能够发挥功能的重组载体。
用于本发明的重组载体制备的载体并不特别限定，可以使用各种质粒和噬菌体等，但是优选使用大肠杆菌来源的质粒，因为这样可以将得到的重组载体作为与大肠杆菌的穿梭质粒。
本发明的重组载体的制备并不特别限定，从任何质粒载体开始，通过引入雷尔氏菌属细菌、贪铜菌属细菌或者沃特氏菌属细菌中发挥作用的复制起始区域均可以制备本发明重组载体，必要时，还可以引入：抗生素抗性基因等选择标记(卡那霉素、氨苄青霉素、四环素等的抗性基因等)、作为稳定化重组载体的par系统发挥功能的par区域。
本发明的第二方面是转化体，其是通过用上述重组载体进行转化而得到的。也就是说，通过将上述得到的重组载体导入到适合该载体的宿主菌中，从而得到本发明的转化体。
作为本发明中的宿主菌，只要是能用上述重组载体转化即可，并不特别限制，除了耐金属贪铜菌之外，还可以使用从自然环境中分离的微生物、保藏于菌种保藏机构(例如IFO、ATCC等)的微生物等。具体的可以使用雷尔氏菌属(Ralstonia)、贪铜菌属(Cupriavidus)、沃特氏菌属(Wautersia)、气单胞菌属(Aeromonas)、埃希氏菌属(Escherichia)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、假单胞菌(Pseudomonas)属等的细菌类。从安全性和生产性的观点来看，优选雷尔氏菌属、贪铜菌属、沃特氏菌属，更加优选钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)。该钩虫贪铜菌在分类学上等同于Ralstoniaeutropha、Wautersia eutropha(Van eechoutte M等，Int J Syst Evol Microbiol，Mar，54(Pt2)：317-327(2004)；Vadamme P等，Int J Syst Evol Microbiol，Nov，54(Pt6)：2285-2589(2004))。
本发明的转化体中，通过上述重组载体导入耐金属贪铜菌CH34菌株所具有的巨大质粒pMOL28的ori区域或par区域的部分。通常，如果向具有巨大质粒的微生物中导入该巨大质粒来源的基因，就会发生同源重组或者拒绝具有相同基因的质粒的导入，所以进一步导入该微生物中具有的巨大质粒中的基因很困难。但是，在本发明中，用上述重组载体转化耐金属贪铜菌以外的宿主，宿主中原本具有的巨大质粒中的复制起始区域和通过该重组载体导入的复制起始区域等并不存在竞争，两者所具有的复制能力和稳定性的效果相协同，表现非常高的复制能力和稳定性。
本发明的转化体的制备方法并不特别限定，重组载体向宿主细菌中的导入可以通过周知的方法进行。例如，可以使用电穿孔法(Current Protocolsin Morecular Biology，卷1，1.8.4页，1994年)、钙法(Lederberg.E.M.etal.，J.Bacteriol.119.1072(1974))等。转化体的选择可以使用卡那霉素抗性的表达体系等选择标记。在本发明中，因为使用耐金属贪铜菌以外的微生物作为宿主，所以不需预先除去宿主的巨大质粒的操作。
其次，对本发明的第三方面即PHA的制造方法进行说明。
本发明中的PHA用以下的一般式(1)表示。
[化1]
(式中R表示碳原子数1～13的烷基，m表示2以上的整数。m个R可以相同，也可以不同。)
作为上述PHA，优选用一般式(2)表示的、由3-羟基丁酸和3-羟基己酸单体单元构成的共聚聚酯P(3HB-co-3HH)。
[化2]
Figure S2006800398987D00082
(式中n、p表示1以上的整数)
本发明的PHA的制造方法包括培养上述转化体、从该培养物中提取纯化PHA。该方法并不特别限定，但可以如下进行。
在聚羟基链烷酸酯的生产中，供应糖、油脂或者脂肪酸作为碳源，用含有碳源以外的营养源即氮源、无机盐类、其它有机营养源的培养基，可以培养上述转化体。例如，作为培养以下述微生物为宿主得到的转化体的培养基，可以供应微生物可同化的碳源，并根据情况限制氮源、无机盐类和/或有机营养源，例如可以使用将氮源限制在0.01到0.1％的培养基等，所述微生物为雷尔氏菌属、贪铜菌属、沃特氏菌属、气单胞菌属、埃希氏菌属、产碱杆菌属、假单胞菌属等的微生物。
作为糖，可以列举例如葡萄糖、果糖等碳水化合物。油脂可以列举大量含有碳原子数10以上的饱和、不饱和脂肪酸的油脂，例如椰子油、棕榈油、棕榈核油等。作为脂肪酸，可以列举己酸、辛酸、癸酸、月桂酸、油酸、棕榈酸、亚油酸、亚麻酸、豆蔻酸等饱和、不饱和脂肪酸，或者这些脂肪酸的酯和盐等脂肪酸衍生物。
作为氮源，可以列举例如氨、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵等铵盐，还有蛋白胨、肉提取物、酵母提取物等。作为无机盐类，可以列举例如磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸镁、硫酸镁、氯化钠等。此外，作为有机营养源，可以列举例如甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸等氨基酸，维生素B1、维生素B12、维生素C等维生素等。而且，还可以向培养液中添加对应于表达载体中存在的耐药性基因的抗生素(卡那霉素等)。
培养温度只要是该菌可以生长的温度即可，优选20℃到40℃。培养时间没有特别限制，优选从1天到10天左右。然后，从得到的该培养菌体中回收PHA即可。
在本发明中，从菌体中回收PHA可以通过例如如下的方法进行：培养结束后用离心机等从培养液分离菌体，用蒸馏水和甲醇等洗净该菌体，干燥，从该干燥菌体中用氯仿等有机溶剂提取PHA，从该含有PHA的有机溶剂中通过过滤等除去菌体成分，向该滤液中加入甲醇、己烷等劣溶剂(貧溶剤)，使PHA沉淀。接着通过过滤、离心分离除去上清液，干燥，回收PHA。
获得的PHA的重量平均分子量(Mw)和3HH组成(mol％)分析可以通过例如气相色谱法和核磁共振法等进行。或者作为确认PHA生产的简易方法可以利用尼罗红染色法。也就是说，在重组菌生长的琼脂培养基中加入尼罗红，培养重组菌1～7天，通过观察重组菌是否变红，能够确认聚酯生产的有无。
发明的效果
本发明的重组载体可以使用雷尔氏菌属、贪铜菌属、沃特氏菌属细菌为宿主，其中不具有mob基因簇和oriT序列的没有接合转移性，且导入par区域的重组载体在细菌中即使没有抗生素选择压力也能够稳定保持。另外，该转化体能够稳定的生产PHA。
附图说明
(图1)pCUP的基因和限制性酶切图谱。
(图2)pCUP2的基因和限制性酶切图谱。
(图3)pCUP2EEACP149NS/171DG的基因和限制性酶切图谱。
(图4)pCUP2EEphaJ的基因和限制性酶切图谱。
本发明的具体实施方式
以下通过实施例更加具体的说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。所有的基因操作按照《Molecular Cloning》(Cold Spring HarborLaboratory Press，(1989))所述进行。基因操作中所使用的酶、克隆宿主等可以从供应商处购入，按照其说明使用。作为酶，只要可以用于基因操作即可，没有特殊限制。
以下实施例中使用大肠杆菌来源的质粒，该质粒含有SEQ ID NO：14所示的卡那霉素抗性基因。
实施例
实施例1：质粒载体pCUP的制备
作为本实施例中的导入了复制起始区域和par区域的质粒载体，只要能够在雷尔氏菌属细菌中使用即可，没有限制。本实施例中制备的质粒载体使用耐金属贪铜菌CH34菌株具有的巨大质粒(pMOL28)的复制起始区域(SEQ ID NO：7)和SEQ ID NO：8所述的par区域。
具体的操作程序如下：首先用DNA Purification Kit(Promega公司制造)从耐金属贪铜菌CH34菌株制备含有巨大质粒的DNA，以该DNA为模板，用SEQ ID NO：1和2所述的引物通过PCR方法扩增含有SEQ ID NO：7和8的序列的约4kbp的DNA区域。PCR条件为(1)98℃、2分钟，(2)98℃、30秒，(3)55℃、30秒，(4)72℃、5分钟，从(2)到(4)30个循环，(5)72℃，5分钟，聚合酶使用TaKaRa Pyrobest DNA Polymerase(Takara公司制造)。将扩增片段克隆到大肠杆菌用克隆载体PCR-Blunt2-TOPO(Invitrogen公司制造)中。
接着，用SEQ ID NO：3和4中所述的引物通过PCR方法从PCR-Blunt2-TOPO(Invitrogen公司制造)载体的2061bp-2702bp区域的两端向外侧进行扩增反应，通过DNA连接酶(Ligation High(东洋纺公司制造))连接，来制备如图1所示的641bp缺失的载体pCUP。PCR条件为(1)98℃、2分钟，(2)98℃、30秒，(3)55℃、30秒，(4)72℃、7分钟，从(2)到(4)30个循环，(5)72℃，7分钟，聚合酶使用TaKaRa PyrobestDNA Polymerase(Takara公司制造)。
实施例2：质粒载体pCUP2的制备
为了使向本发明的质粒载体中导入基因更容易，进一步向实施例1中获得的pCUP中导入了限制性内切酶MunI位点。具体的操作程序如下：首先用SEQ ID NO：5和6所述的引物通过PCR方法以实施例1中制备的pCUP为模板进行PCR，扩增片段通过DNA连接酶(Ligation High(东洋纺公司制造))连接，来导入MunI位点，制备如图2所示的pCUP2。PCR条件为(1)98℃、2分钟，(2)98℃、30秒，(3)55℃、30秒，(4)72℃、5分钟，从(2)到(4)30个循环。聚合酶使用TaKaRa Pyrobest DNA Polymerase(Takara公司制造)。
这样，就制备了含有SEQ ID NO：18所示的DNA区域和SEQ ID NO：19所示的DNA区域、且不含有mob基因簇和oriT序列等接合转移相关基因的质粒载体。
实施例3：用质粒载体pCUP2制备转化体
如下述地采用电穿孔法实施转化。用于电穿孔的基因导入装置使用Biorad公司制造的Gene Pulser，转化杯同为Biorad公司制造，其缝隙为0.2cm(gap0.2cm)。向转化杯中注入Ralstonia eutropha H16菌株的感受态细胞400μl和质粒pCUP2制备液5μl，放入脉冲装置中，在静电容25μF、电压1.5kV、电阻值800Ω的条件下施加电脉冲。脉冲后，将转化杯中的菌液在Nutrient Broth培养基(DIFCO公司制造)中30℃振荡培养3小时，用选择平板(Nutrient Agar培养基(DIFCO公司制造)，含卡那霉素100mg/L)在30℃培养2天，获得了转化体。
比较例1：用质粒载体pJRD215制备转化体
除了质粒使用不具有SEQ ID NO：18的序列和par区域的pJRD215之外，用与实施例3同样的方法获得了用pJRD215转化的转化体。
实施例4：用质粒载体pCUP2制备的转化体的质粒保留率(palsmid retention rate)
我们测定了在实施例3中获得的转化体的质粒保留率。测定如下进行：在由1w/v％肉提取物(Meat-extract)、1w/v％细菌胰蛋白胨(Bacto-Trypton)、0.2w/v％酵母提取物(Yeast-extract)、0.9w/v％Na2PO4/12H2O、0.15w/v％KH2PO4组成的、pH6.8的添加卡那霉素(50mg/L)的MB+肉汤培养基中，培养实施例3中得到的、用质粒载体pCUP2转化的转化体24小时，将培养液以1％(v/v)转接到由1.1w/v％Na2PO4·12H2O、0.19w/v％KH2PO4、1.29w/v％(NH4)2SO4、0.1w/v％MgSO4/7H2O、2.5w/v％棕榈油W油精油、0.5v/v％微量金属盐溶液(在0.1N盐酸中溶解1.6w/v％FeCl3·6H2O、1w/v％CaCl2·2H2O、0.02w/v％CoCl2·6H2O、0.016w/v％CuSO4·5H2O、0.012w/v％NiCl2·6H2O)组成的未添加卡那霉素的MB+油培养基中，振荡培养24小时。该培养每24小时传代1次，共传代3次，在第4次培养的24小时时，如下测定质粒的保留率。
首先，用无菌水将培养液稀释到10的八次方分之一，向未添加卡那霉素的平板(Nutrient Agar培养基(DIFCO公司制造))中接种10到100μl，从得到的菌落中进一步随机挑取100个菌落影印到添加卡那霉素(100mg/L)的选择平板(Nutrient Agar培养基(DIFCO公司制造))上，计算长出的菌落数。只有保持质粒的细菌能够在平板上形成菌落，因而以由此获得的耐药性菌落的数目表示稳定性。结果如表1所示。
比较例2：用质粒载体pJRD215转化的转化体的保留率
用比较例1中得到的转化体代替实施例3中得到的用质粒载体pCUP2转化的转化体，除此之外，与实施例4同样测定质粒的保留率。结果如表1所示。
                    表1
菌株   Ralstonia eutrophaH16   Ralstonia eutrophaH16
  质粒   pCUP2   pJRD215
  生存菌落数   98   32
  保留率   98％   32％
实施例5：导入了PHA合成基因的质粒载体的制备
对于实施例2得到的质粒载体(pCUP2)，将N149S/D171G变体插入到pCUP2的限制性内切酶MunI位点，制备了表达质粒载体(pCUP2EEACP149NS/171DG)(图3)，所述N149S/D171G变体是通过EcoRI处理制备的SEQ ID NO：13所示的豚鼠气单胞菌来源的PHA合酶变体基因。
豚鼠气单胞菌来源的PHA合酶变体基因N149S/D171G变体如下制备。首先用Pst I处理pBluescript II KS(-)(东洋纺公司制造)，用DNA BluntingKit(Takara制造)将末端平滑化，连接，制备出质粒pBlue-New，其中缺失了Pst I位点。向该质粒的EcoR I位点中克隆进从pJRD215-EE32d13(特开平5-93049号公告)中用EcoR I酶切出的d13片段(pBlue-d13)。接着，以克隆E2-50来源的质粒(Kichise等，Appl.Environ.Microbiol，68：2411-2419(2002))为模板，用SEQ ID NO：9和10的引物组，及SEQ ID NO：11和12的引物组分别通过PCR方法进行扩增，得到2个片段。其条件为(1)94℃、2分钟，(2)94℃、30秒，(3)55℃、30秒，(4)72℃、2分钟，从(2)到(4)25个循环，(5)72℃、5分钟。将扩增到的2个片段等摩尔混合后再次进行PCR反应使2个片段结合。其条件为(1)96℃、5分钟，(2)95℃、2分钟，(3)72℃、1分钟，从(2)到(3)12个循环。聚合酶使用Pyrobest DNA Polymerase(Takara公司制造)。将目的大小的DNA片段从琼脂糖凝胶电泳中切出，用Pst I和Xho I处理，将其以片段替换的形式克隆到用相同的酶处理的pBlue-d13中(pBlue-N149S/D171G)。用PERIKIN ELMER APPLIED BIOSYSTEMS公司制造的DNA测序仪310Genetic Analyzer进行碱基序列确定，确认PHA合酶第149位的天冬酰胺被丝氨酸取代、第171位的天冬氨酸被甘氨酸取代的变体基因。
如上所示制备的pBlue-N149S/D171G用限制性内切酶EcoR I处理，再与限制性内切酶MunI处理的pCUP2用DNA连接酶(Ligation High，东洋纺公司制造)连接，制备了含有PHA合酶的质粒载体pCUP2EEACP149NS/171DG。
实施例6：导入烯酰CoA水合酶基因的质粒载体的制备
对于实施例2中得到的质粒载体(pCUP2)，将经EcoR I处理制备的SEQ ID NO：17所示的豚鼠气单胞菌来源的烯酰CoA水合酶基因导入pCUP2的限制性内切酶MunI部位，制备了表达质粒载体(pCUP2EEphaJ)(图4)。该载体如下制备。
首先，以含有本发明中使用的烯酰CoA水合酶基因的pJRD215-EE32(特开平5-93049号公告)为模板，用SEQ ID NO：15和16的引物组通过PCR方法进行扩增，得到含有SEQ ID NO：17所述的烯酰CoA水合酶基因的扩增片段。其条件是(1)94℃、2分钟，(2)98℃、10秒，(3)60℃、10秒，(4)68℃、1分钟，从(2)到(4)30个循环，(5)68℃，3分钟。聚合酶使用LA Taq DNA Polymerase(Takara公司制造)。接着用BglII和AflII处理该扩增片段，与同样用BglII和AflII处理后再用碱性磷酸酶处理而将DNA去磷酸化了的pJRD215-EE32d13进行连接，以代替pJRD215-EE32d13中BglII和AflII之间的DNA片段的形式进行了克隆(pJRD215-EEphaJ)。连接使用Ligation High(东洋纺公司制造)。从这样制备的pJRD215-EEphaJ中用EcoRI制备含有烯酰CoA水合酶基因的DNA片段，通过与MunI处理的pCUP2进行连接，制备了pCUP2EEphaJ(图4)。连接使用Ligation High(东洋纺公司制造)。
实施例7：用导入PHA合成基因的质粒载体制备转化体
用实施例5中获得的导入了PHA合成基因的质粒载体(pCUP2EEACP149NS/171DG)制备液代替质粒pCUP2制备液，像实施例3那样，用导入了PHA合成基因的质粒载体制备了转化体。转化使用不能合成PHA的菌株即Ralstonia eutropha PHB-4菌株(Tsuge T等，MacromolBiosci，Oct 20；4(10)：963-70.(2004))。
实施例8：用导入了烯酰CoA水合酶基因的质粒载体制备转化体
用实施例6中获得的导入了烯酰CoA水合酶基因的质粒(pCUP2EEphaJ)载体制备液代替质粒pCUP2制备液，像实施例3那样，用导入了烯酰CoA水合酶基因的质粒载体制备了转化体。转化使用不能合成PHA的菌株即Ralstonia eutropha PHB-4菌株。
实施例9：用质粒载体pCUP2EEACP149NS/171DG转化的转化体的保 留率
用实施例7中得到的转化体代替实施例3中用质粒载体pCUP2转化的转化体作为转化体，像实施例4那样测定了质粒的保留率。结果如表2所示。
                        表2
菌株   Ralstonia eutrophaPHB-4   Ralstonia eutrophaPHB-4   Ralstonia eutrophaPHB-4
质粒   pCUP2EEACP149NS/171DG pCUP2EEphaJ pJRD215
  存活菌落数   95   96   30
  保留率   95％   96％   30％
实施例10：用质粒载体pCUP2EEphaJ转化的转化体的保留率
用实施例8中得到的转化体代替实施例3中得到的用质粒载体pCUP2转化的转化体作为转化体，像实施例4那样测定了质粒的保留率。结果如表2所示。
比较例3：用以Ralstonia eutropha PHB-4菌株为宿主的质粒载体pJRD215制备转化体
作为质粒，使用不具有SEQ ID NO：18的序列和par区域的pJRD215，宿主使用Ralstonia eutropha PHB-4菌株，像实施例3那样，使用质粒载体pJRD215获得了转化体。
比较例4：用以Ralstonia eutropha PHB-4菌株为宿主的质粒载体pJRD215转化的转化体的保留率
用比较例3中得到的转化体代替实施例3中得到的用质粒载体pCUP2转化的转化体，像实施例4那样，测定了质粒的保留率。结果如表2所示。
实施例11：用实施例7中获得的转化体生产聚酯
将实施例7中得到的转化体接种到含有尼罗红(Nilered)的培养基(十二水合磷酸氢二钠9g、磷酸二氢钾1.5g、氯化铵0.05g、七水合硫酸镁0.02g、果糖0.5g、六水合氯化钴0.25ppm、六水合氯化铁(III)16ppm、二水合氯化钙10.3ppm、六水合氯化镍0.12ppm、五水合硫酸铜0.16ppm、尼罗红0.5mg、琼脂15g/L)，30℃培养2天。其结果是，通过菌落变红确认菌体内积累了聚酯。
工业实用性
本发明的质粒载体可以以雷尔氏菌(Ralstonia)属、贪铜菌(Cupriavidus)属、沃特氏菌(Wautersia)属细菌为宿主，其中，不具有mob基因簇和oriT序列的载体没有接合转移性，而且导入par区域的载体在细菌中即使没有抗生素选择压力也能够稳定保持。另外，该转化体能够稳定地生产PHA。
序列表
Figure IYZ000004018662700011
Figure IYZ000004018662700021
Figure IYZ000004018662700031
Figure IYZ000004018662700041
Figure IYZ000004018662700051
Figure IYZ000004018662700071
Figure IYZ000004018662700081
Figure IYZ000004018662700091
Figure IYZ000004018662700101
Figure IYZ000004018662700121

Claims (5)

1.一种转化体，其是通过重组载体将基因转移进入宿主细菌而获得的，其中，
所述宿主细菌是钩虫贪铜菌(Cupriavidus necator)，
该重组载体不含有mob基因簇和oriT序列，并且
该重组载体进一步含有载体稳定化区域，该区域是par区域，发挥par系统功能；
所述重组载体导入了SEQ ID NO：19所示序列的DNA片段作为载体稳定化区域。
2.权利要求1所述的转化体，其中导入了至少一个选自下组的聚羟基链烷酸酯合成相关基因：硫解酶基因、还原酶基因、聚羟基丁酸合酶基因、聚羟基链烷酸酯合酶基因、酰基CoA转移酶基因、烯酰CoA水合酶基因和酰基CoA脱氢酶基因。
3.一种聚羟基链烷酸酯的制造方法，其中，培养权利要求2所述的转化体，从该培养物中提取纯化聚羟基链烷酸酯。
4.权利要求3所述的聚羟基链烷酸酯的制造方法，其中，所述聚羟基链烷酸酯是由3-羟基丁酸和3-羟基己酸单体单元构成的共聚聚酯。
5.权利要求1所述的转化体，其中所述重组载体包含SEQ ID NO：18所示的序列。
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