KR20010095191A

KR20010095191A - 폴리하이드록시알카노에이트 합성효소 및 상기 효소를코딩하는 유전자

Info

Publication number: KR20010095191A
Application number: KR1020010017037A
Authority: KR
Inventors: 야노테츠야; 이마무라타께시; 수다사까에; 혼마츠토무
Original assignee: 미다라이 후지오; 캐논 가부시끼가이샤
Priority date: 2000-03-30
Filing date: 2001-03-30
Publication date: 2001-11-03
Also published as: US20020098565A1; EP1149912A2; JP3848048B2; DE60142203D1; KR100481125B1; EP1149912A3; JP2001275674A; ATE469225T1; EP1149912B1

Abstract

폴리하이드록시알카노에이트(PHA)의 제조기술에 있어서 유용한 PHA합성효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 PHA합성효소의 제조방법 및 상기 형질전환체를 이용한 PHA의 제조방법을 제공한다. 슈도모나스·푸티다 P91균주(Pseudomonas putidaP91)로부터 얻게 된 PHA합성효소유전자를 숙주미생물에 도입해서 얻게 된 형질전환체를 배양해서, PHA합성효소 또는 PHA를 생산시킨다.

Description

폴리하이드록시알카노에이트합성효소 및 상기 효소를 코딩하는 유전자{POLYHYDROXYALKANOATE SYNTHASE AND GENE ENCODING THE SAME}

본 발명은, 폴리하이드록시알카노에이트(이하 "PHA"라 기재)합성효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 PHA합성효소의 제조방법 및 상기 형질전환체를 이용한 PHA의 제조방법에 관한 것이다.

(종래의 기술)

이제까지, 많은 미생물이 폴리-3-하이드록시부티르산(PHB) 또는 그 외의 PHA를 생산하여, 균체내에 축적하는 것이 보고되어 왔다(「생분해성 플라스틱핸드북」, 생분해성 플라스틱연구회편, (주)엔·티·에스발행, P178-197, 1995). 이들 폴리머는, 종래의 플라스틱과 마찬가지로, 용융가공등에 의해 각 종 제품의 생산에 이용할 수 있다. 또, 생분해성이기 때문에, 자연계에서 미생물에 의해 완전분해된다고 하는 이점을 가지고 있고, 종래의 많은 합성고분자화합물과 같이 자연환경에 잔류해서 오염을 일으키는 일이 없다. 또, 생체적합성에도 뛰어나 있고, 의료용 연질부재등으로서의 응용도 기대되고 있다.

이와 같은 미생물에 의해 생성된 PHA는, 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건등에 의해, 여러 가지의 조성이나 구조의 것으로 될 수 있는 것이 알려져 있고, 이제까지 주로, PHA의 물성의 개량이라고 하는 관점에서, 이와 같은 조성이나 구조의 제어에 관한 연구가 이루어져 왔다.

예를 들면, 알칼리게네스·유트로퍼스 H16균주(Alcaligenes eutropus H16, ATCC No. 17699) 및 그 변이균주는, 그 배양시의 탄소원을 변화시킴으로써, 3-하이드록시부티르산(3HB)과 3-하이드록시발레르산(3HV)과의 공중합체를 여러 가지의 조성비로 생산하는 것이 보고되어 있다(특개평 6-15604호 공보, 특개평 7-14352호 공보, 특개평 8-19227호 공보등).

또, 특허공보 제 2642937호에서는, 슈도모나스·올레오보란스·ATCC 29347균주(Pseudomonas oleovorans ATCC 29347)에, 탄소원으로서 비고리형상 지방족 탄화수소를 줌으로써, 탄소수가 6∼12까지의 3-하이드록시알카노에이트의 모노머유닛을 가진 PHA가 생산되는 것이 개시되어 있다.

특개평 5-74492호 공보에서는, 메틸로박테리움속(Methylobacterium sp.), 파라코커스속(Paracoccus sp.), 알칼리게네스속(Alcaligenes sp.), 슈도모나스속(Pseudomonas sp.)의 미생물을, 탄소수 3∼7의 제 1알콜에 접촉시킴으로써, 3HB와 3HV와의 공중합체를 생산시키는 방법이 개시되어 있다.

특개평 5-93049호 공보, 및, 특개평 7-265065호 공보에서는, 아에로모나스·카비에(Aeromonas caviae)를, 올레산이나 올리브유를 탄소원으로 해서 배양함으로써, 3HB와 3-하이드록시헥산산(3HHx)의 2성분공중합체가 생산되는 것이 개시되어있다.

특개평 9-191893호 공보에서는, 코마모나스·아시도보란스·IFO 13852균주(Comamonas acidovorans IFO 13852)가, 글루콘산 및 1, 4-부탄디올을 탄소원으로서 사용한 배양에 의해, 3HB와 4-하이드록시부티르산을 모노머유닛으로서 가진 폴리에스테르를 생산하는 것이 개시되어 있다.

또, 어떤 종의 미생물에서는, 여러 가지의 치환기, 예를 들면, 불포화탄화수소로부터 얻게 되는 기, 에스테르기, 알릴기, 시아노기, 할로겐화 탄화수소로부터 얻게 되는 기, 에폭사이드등이 도입된 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있고, 이와 같은 수법에 의해서 미생물에 의해 생산된 PHA의 물성개량을 목표로 하는 시도도 이루어지기 시작했다.

이와 같은 폴리머의 하나로서, 곁사슬에 페닐기를 가진 PHA의 개발이 행하여지고 있다. 예를 들면, Makromol. Chem., 191, 1957-1965(1990); Macromolecules, 24, 5256-5260(1991); Chirality, 3, 492-494(1991)등에서는, 슈도모나스·올레오보란스가 3-하이드록시-5-페닐발레르산(3HPV)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하는 것이 보고되어 있고, 3HPV가 함유되는 것에 기인한다고 생각되는, 폴리머물성의 변화가 확인되어 있다.

이상과 같이, 미생물에 의해 생산된 PHA에 있어서는, 그 생산에 사용하는 미생물의 종류나 배지조성, 배양조건등을 바꿈으로써, 여러 가지의 조성·구조의 것이 얻어지고 있으나, 미생물 또는 PHA합성효소 각각에 있어서 기질특이성이 크게상이하기 때문에, 공지의 미생물 또는 PHA합성효소만으로는 여러 가지의 사용목적에 널리 적합한 각 종 모노머단위의 조성을 함유하는 PHA를 합성하는 것은 곤란하였다.

여기서, 상기한 바와 같은, 치환기를 곁사슬에 도입한 PHA는, 도입한 치환기의 특성등에 기인하는, 극히 유용한 기능과 특성을 구비한 "기능성 폴리머"로서의 전개도 기대할 수 있고, 그와 같은 기능성과 생분해성을 겸비한 뛰어난 폴리머를 생산하여, 균체내에 축적할 수 있는 미생물로부터의 PHA합성효소를 코딩하는 유전자의 취득, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 PHA합성효소의 제조방법 및 상기 형질전환체를 이용한 PHA의 제조방법의 개발은 극히 유용하고 또한 중요하다고 생각되었다.

본 발명은 이와 같은 PHA생산에 유용한 PHA합성효소의 유용성에 비추어 이루어진 것으로서, PHA합성효소, 상기 효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 벡터에 의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 PHA합성효소의 제조방법 및 상기 형질전환체를 이용한 PHA의 제조방법을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

그래서 본 발명자들은, 디바이스재료나 의료용 재료등으로서 유용한, 신규의 곁사슬구조를 가진 PHA의 개발을 목표로 하여, 소망의 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 능력을 가진 신규 미생물의 탐색, 및, 이와 같은 미생물로부터의 PHA합성효소를 코딩하는 유전자의 취득, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 벡터에의해 형질전환된 형질전환체, 상기 형질전환체를 이용한 PHA합성효소의 제조방법 및 상기 형질전환체를 이용한 PHA의 제조방법의 개발에 대해서 예의 연구를 거듭해 왔다.

그 결과, 하기 식[1]로 표시되는 5-(4-플루오로페닐)발레르산(FPVA)을 합성하고, 이것을 원료로 해서, 화학식[2]로 표시되는 3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산(3HFPV)을 모노머유닛으로서 함유하는 신규의 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 능력을 가진 신규 미생물을 발견하여, P91균주라 하였다.

(화학식 1)

(화학식 2)

또 본 발명자들은, 이 P91균주가 화학식[3]으로 표시되는 4-페녹시-n-부티르산(PxBA)을 원료로 해서, 화학식[4]로 표시되는 3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산(3HPxB)을 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 능력을 가진 것도 발견하였다.

(화학식 3)

(화학식 4)

여기서, 3HPxB를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산하여 균체내에 축적하는 미생물의 보고예로서는, Macromolecules, 29, 3432-3435, 1996에 기재된, 슈도모나스·올레오보란스를 사용한 방법이 있다. 그러나, 이 방법은, 8-페녹시옥탄산(PxOA)을 기질로서 사용한다고 하는 점에서, P91균주에 있어서의 PxBA를 기질로서 사용하는 방법과는 전혀 상이해 있다. 또, 생산되는 PHA에 관해서는, 상기의 보고예의 방법에서는, 기질인 PxOA유래의 3-하이드록시-8-페녹시옥탄산과, 대사산물유래의 부산물인 3-하이드록시-6-페녹시헥산산 및 3HPxB의 3종류의 모노머유닛으로 이루어진 공중합체가 생산된다. 한편, P91균주는, PxBA유래의 3HPxB만을 페녹시기함유 모노머유닛으로서 함유하는 PHA를 생산할 수 있다. 이와 같은 점에서도 상기의 보고예와는 근본적으로 상이하다.

또한, 이제까지, PxBA를 기질로 한, 3HPxBA를 모노머유닛으로서 함유하는 PHA의 미생물생산의 보고예는 없고, 또, 3HPxB만을 페녹시기함유 모노머유닛으로서함유하는 PHA의 미생물생산에 관한 보고예도 없다.

본 발명에 의한 P91균주의 균학적 성질을 열거하면 이하 기재한 바와 같다.

<P91균주의 균학적 성질>

(형태학적 성질)

세포의 형상과 크기: 간상균, 0.6㎛×1.5㎛

세포의 다형성: 없음

운동성: 있음

포자형성: 없음

그램염색성: 음성

콜로니형상: 원형, 전체 가장자리가 매끄러움, 저볼록형상, 표층이 매끄러움, 광택, 크림색

(생리학적 성질)

카탈라제: 양성

옥시다제: 양성

O/F시험: 산화형

질산염의 환원: 음성

인돌의 생성: 음성

포도당산성화: 음성

아르기닌디하이드롤라제: 양성

우레아제: 음성

에스쿨린가수분해: 음성

젤라틴가수분해: 음성

β-갈락토시다제: 음성

King's B한천에서의 형광색소산생: 양성

(동화능)

포도당: 양성

L-아라비노스: 음성

D-만노스: 음성

D-만니톨: 음성

N-아세틸-D-글루코사민: 음성

말토스: 음성

글루콘산칼륨: 양성

n-카프르산: 양성

아디프산: 음성

dl-말산: 양성

시트르산나트륨: 양성

아세트산페닐: 양성

이상의 균학적 성질로부터, 버제스·메뉴얼·오브·시스테마틱·박테리올로지·제 1권(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Volume 1)(1984년), 및, 버제스·메뉴얼·오브·디터미네이티브·박테리올로지(Bergey's Manual ofDeterminative Bacteriology) 제 9판(1994년)에 의거해서 검색하였던 바, P91균주는 슈도모나스·푸티다(Pseudomonas putida)에 속한다고 판명되었다. 따라서, 이 균주를 슈도모나스·푸티다·P91균주라 명명하였다. 또한, P91균주는 기탁번호 「FERM P-17409」로서, 통상산업성, 공업기술원, 생명공학공업기술연구소, 특허미생물기탁센터에 기탁되어 있다.

본 발명자들은, 상기 과제에 의거해서 예의 연구를 행한 결과, P91균주로부터 PHA합성효소의 유전자를 클로닝하는 것에 성공하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명의 PHA합성효소는, 서열번호: 1 또는 3에 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 한다. 또, 서열번호: 1 또는 3의 아미노산서열에 대해서, 이들 아미노산서열을 가진 단백질이 표시하는 PHA합성효소활성이 손상되지 않는 범위내에서, 1이상의 아미노산의 결실, 치환 및 부가의 적어도 1종의 변이가 도입된 변이PHA합성효소도 본 발명에 관한 PHA합성효소에 포함된다.

또, 본 발명에는, 서열번호: 1 또는 3의 아미노산서열을 가진 PHA합성효소를 코딩하는 PHA합성효소유전자가 포함되고, 그 유전자서열로서는 서열번호: 2 또는 4로 표시되는 것을 들 수 있다. 또, 이들 서열번호: 2 및 4의 염기서열을 변이시켜서 얻게 되는 상기한 변이PHA합성효소를 코딩하는 변이PHA합성효소유전자도 본 발명에 관한 PHA합성효소유전자에 포함된다.

또 본 발명에는, 상기 PHA합성효소유전자를 함유하는 재조합벡터, 상기 재조합벡터에 의해서 형질전환된 형질전환체가 포함된다. 또 본 발명에는, 이 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 PHA합성효소를 격리하는 것을 특징으로 하는 PHA합성효소의 제조방법, 상기 형질전환체를 배양하여, 얻게 되는 배양물로부터 PHA를 격리하는 것을 특징으로 하는 PHA의 제조방법이 포함된다.

본 발명은, PHA합성효소, 이 PHA합성효소를 부호화하는 유전자, 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 재조합벡터에 의해 형질변환된 형질변환체를 제공한다. 본 발명에 의한 PHA합성효소는, 신규의 측쇄구조를 기질로서 가지는 모노머를 사용하여 PHA합성효소를 부호화하기 때문에, 여러종류의 물성을 가지는 PHA를 제조할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 본 발명의 PHA합성효소유전자는, 슈도모나스·푸티다·P91균주의 균체로부터 분리된 것이다. 먼저, PHA합성효소유전자를 가진 균주로부터 염색체DNA를 취득한다. 염색체DNA의 분리방법은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

예를 들면, P91균주를 LB배지, 또는 M9배지에 적당한 탄소원을 첨가한 것등에서 배양한 후, 예를 들면, 마머등의 방법(Journal of Molecular Biology, 3권, 208페이지, 1961년)등에 의해 염색체DNA를 조제한다. 이 방법에 의해 얻게 된 염색체DNA를 적당한 제한효소(예를 들면 Sau3AI등)를 사용해서 분해하고, 적당한 단편길이를 가진 분해물에 대해서, 이들을 연결가능한 제한효소(예를 들면 BamHI등)로 절단한 벡터에 연결하여, 유전자라이브러리를 제작한다. 여기서의 적당한 단편길이란, 통상의 플라스미드벡터를 사용할 때는 4000∼25000염기쌍정도, 코스미드 또는 파지벡터를 사용할 때는 15000∼30000의 염기쌍정도이다. 적당한 길이의DNA단편을 분리하여 취하는 방법으로서는, 자당밀도구배를 사용하는 방법이나 아가로즈겔을 사용하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판(1982년))등 공지의 방법을 사용하면 된다.

벡터는, 숙주미생물에 있어서 자율적으로 증식할 수 있는 파지벡터 또는 플라스미드벡터가 사용된다. 파지벡터 또는 코스미드벡터로서는, 예를 들면 pWE15, M13, λEMBL3, λEMBL4, λFIXII, λDASHII, λZAPII, λgt10, λgt11, Charon4A, Charon21A등을 들 수 있고, 플라스미드벡터로서는, 예를 들면 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pET계등을 들 수 있다. 그 외에, 대장균이나 슈도모나스속등의 복수의 숙주미생물에서 자율적 증식이 가능한 벡터등의 각 종 셔틀벡터를 사용할 수도 있다. 이와 같은 벡터에 대해서도 상기와 마찬가지로 적당한 제한효소에 의해 절단함으로써 소망하는 단편을 얻을 수 있다.

염색체DNA단편과 벡터단편과의 연결은 DNA리가제를 사용하면 되고, 예를 들면 라이게이션키트(타카라슈조(주)등)를 사용해서 행할 수 있다. 이와 같이 해서 염색체DNA단편과 벡터단편을 연결시켜, 여러 가지의 DNA단편을 함유하는 재조합플라스미드의 혼합물(이하, 유전자라이브러리라 기재)을 제작한다. 여기서 유전자라이브러리제작에 있어서는, 적당한 길이의 염색체DNA단편을 사용하는 방법 외에, P91균주로부터 mRNA를 추출정제하여, 역전사효소를 이용해서 cDNA단편을 합성하는 방법(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년)을 이용할 수도 있다. 또, 유전자라이브러리를, 대장균에 한번 형질전환 또는 형질도입한 후, 유전자라이브러리를 대량으로 증폭하는 일도 가능하다(Molecular Cloning,Cold Spring Harbor Laboratory출판, 1982년).

숙주미생물에의 재조합벡터의 도입은, 공지의 방법에 의해 행한다. 예를 들면, 숙주미생물이 대장균인 경우, 염화칼슘법(Journal of Molecular Biology, 53권, 159페이지, 1970년), 염화루비듐법(Methods in Enzymology, 68권, 253페이지, 1979년)이나 일렉트로포레이션법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 184페이지, 1994년)등을 이용할 수 있다. 또, 코스미드벡터나 파지벡터를 이용하는 경우의 형질도입에 대해서는 인비트로·패키징법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 571페이지, 1994년)등을 사용할 수 있다. 그 외에, 접합전달에 의한 방법도 이용가능하다.

다음에, P91균주의 PHA합성효소유전자를 함유하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브를 조제한다.

PHA합성효소유전자의 염기서열에 대해서는, 이미 몇 가지의 서열이 보고되어 있다(Peoples, O. P. and Sinskey, A. J., J. Biol. Chem., 264, 15293(1989); Huisman, G. W. et al., J. Biol. Chem., 266, 2191(1991); Pieper, U. et al., FEMS Microbiol. Lett., 96, 73(1992); Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992); Matsusaki, H. et al., J. Bacteriol., 180, 6459(1998)).

이들 염기서열로부터 보존도가 높은 영역을 선택하여, 올리고뉴클레오타이드를 설계한다. 이와 같은 올리고뉴클레오타이드로서는, Timm, A. and Steinbuchel, A., Eur. J. Biochem., 209, 15(1992)에 의해 보고된 서열을 들 수있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 올리고뉴클레오타이드는 예를 들면 아머샴·파머시아바이오테크의 커스텀합성서비스등을 이용해서 합성이 가능하다.

다음에 설계한 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 하고, P91균주의 염색체DNA를 주형으로 해서 폴리머라제연쇄반응(이하 PCR이라 기재)을 행하여, PHA합성효소유전자를 부분적으로 증폭한다. 이와 같이 해서 얻게 된 PCR증폭단편은 P91균주의 PHA합성효소유전자에 100% 가까운 상동성을 가진 단편으로서, 콜로니하이브리디제이션을 행할 때의 프로브로서 높은 S/N비를 기대할 수 있는 동시에, 하이브리디제이션의 스트링전시(stringency)제어를 용이한 것으로 하는 것이 가능하다. 상기의 PCR증폭단편을 적당한 시약을 사용해서 표지하고, 상기 염색체DNA라이브러리에 대해서 콜로니하이브리디제이션을 행하여, PHA합성효소유전자를 선발한다(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 603페이지, 1994년). 여기서 PCR증폭단편의 표지는 AlkPhosDirect(아머샴·파머시아바이오테크)등의 시판의 키트를 이용할 수 있다.

또, PHA합성효소유전자를 함유하는 유전자단편의 선발은, 상기의 유전자형을 이용한 선발방법이외에도 PHA합성의 유무를 직접 평가하는 표현형을 이용한 방법에 의한 것도 가능하다. PHA합성의 유무를 조사하는 방법으로서는, 예를 들면, 수단블랙B에 의해 염색하는 방법(Archives of Biotechnology, 71권, 283페이지, 1970년), 위상차현미경에 의해 PHA의 축적을 조사하는 방법등을 사용할 수 있다.

상기의 어느 하나의 방법에 의해 선발된 대장균으로부터 알칼리법(Current Protocols in Molecular Biology, 1권, 161페이지, 1994년)을 사용해서 플라스미드를 회수함으로써, PHA합성효소유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있다. 상기 DNA단편의 염기서열의 결정은, 예를 들면 생거법(Sanger's sequencing method)(Molecular Cloning, 2권, 133페이지, 1989년)등에 의해서 행하는 것이 가능하고, 염기서열자동분석장치, 예를 들면 DNA시퀀서 377A(퍼킨·엘머)등을 사용해서 다이프라이머법 또는 다이터미네이터법에 의해 행할 수 있다.

또한, 상기 방법에 의해 전체 염기서열을 결정한 후에는, 화학합성법, 염색체DNA를 주형으로 한 PCR법, 또는 상기 염기서열을 가진 DNA단편의 제한효소에 의한 분해등의 임의의 방법에 의해 조제한 DNA단편을 프로브로 해서 하이브리다이즈함으로써, 본 발명의 유전자를 얻는 것이 가능하다.

서열번호: 2 및 4에 본 발명의 PHA합성효소유전자의 염기서열을, 서열번호: 1 및 3에 상기 유전자가 코딩하는 아미노산서열을 표시하나, 앞서 설명한 바와 같이, 상기 아미노산서열을 가진 폴리펩티드가 PHA합성활성을 가지는 한, 몇 가지의, 예를 들면 1 또는 수개의 아미노산에 대해서 결실, 치환, 부가등의 변이가 있어도 된다. 또, 본 발명의 유전자는, 서열번호: 1 및 3으로 표시되는 아미노산을 코딩하는 염기서열을 가진 것에 첨가하여, 축중코돈에 있어서만 상이한 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 축중이성체도 포함한다. 여기서 결실, 치환, 부가등의 변이는, 부위돌연변이도입방법(Current Protocols in Molecular Biology 1권, 811페이지, 1994년)등에 의해 도입가능하다.

본 발명의 형질전환된 미생물은, 본 발명의 재조합벡터를, 상기 재조합벡터를 제작할 때에 사용한 발현벡터에 적합한 숙주속에 도입함으로써 얻게 된다. 숙주로서는, 에셰리키아(Esherichia)속, 슈도모나스(Pseudomonas)속, 랄스토니아(Ralstonia)속, 알칼리게네스(Alcaligenes)속, 코마모나스(Comamonas)속, 버크홀데리아(Burkholderia)속, 아그로박테리움(Agrobacterium)속, 플라보박테리움(Flabobacterium)속, 비브리오(Vibrio)속, 엔테로박터(Enterobacter)속, 리조비움(Rhizobium)속, 글루코노박터(Gluconobacter)속, 아시네토박터(Acinetobacter)속, 모라셀라(Moraxella)속, 니트로조모나스(Nitrosomonas)속, 아에로모나스(Aeromonas)속, 파라코커스(Paracoccus)속, 바실루스(Bacillus)속, 클로스트리디움(Clostridium)속, 락토바실루스(Lactobacillus)속, 코리네박테리움(Corynebacterium)속, 아르트로박터(Arthrobacter)속, 아크로모박터(Achromobacter)속, 미크로코커스(Micrococcus)속, 마이코박테리움(Mycobacterium)속, 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 스트렙토마이세스(Streptomyces)속, 악티노마이세스(Actinomyces)속, 노카르디아(Nocardia)속, 메틸로박테리움(Methylobacterium)속등의 각 종 세균을 들 수 있다. 또, 상기 박테리아이외에, 사카로미세스(Saccharomyces)속, 칸디다(Candida)속등의 효모, 또한 각 종 곰팡이등을 숙주로서 들 수 있다.

슈도모나스속에 속하는 미생물, 예를 들면 대장균등의 세균을 숙주로서 사용하는 경우는, 본 발명에 관한 재조합벡터는, 그 자신이 숙주속에서 자율복제가능한 동시에, 프로모터, PHA합성효소유전자를 함유하는 DNA 및 전사종결서열등의 발현에 필요한 구성을 가진 것임이 바람직하다. 발현벡터로서는, 광범위한 숙주에 있어서 복제·유지되는 RK2복제기점을 가진 pLA2917(ATCC 37355)이나 RSF1010복제기점을 가진 pJRD215(ATCC 37533)등을 들 수 있으나, 광범위한 숙주에 있어서 복제·유지되는 복제기점을 가진 것이면 어느 것이나 사용가능하다.

프로모터는, 숙주속에서 발현할 수 있는 것이면 어느 것이나 사용가능하고, 예를 들면, trp프로모터, trc프로모터, tac프로모터, lac프로모터, PL프로모터, PR프로모터, T7프로모터, T3프로모터등의 대장균이나 파지등에 유래하는 프로모터를 사용할 수 있다. 세균에의 재조합DNA의 도입방법으로서는, 상기한 염화칼슘법이나 일렉트로포레이션법등이 이용가능하다.

효모를 숙주로서 사용하는 경우는, 발현벡터로서, 예를 들면 YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터등이 이용가능하다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL프로모터, AOD프로모터등을 사용할 수 있다. 효모에의 재조합체DNA의 도입방법으로서는, 예를 들면 일렉트로포레이션법(Method Enzymol., 194, 182-187(1990)), 스페로플라스트법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1929-1933(1978)), 아세트산리튬법(J. Bacteriol., 153, 163-168(1983))등이 이용가능하다.

또, 재조합벡터에는, 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각 종의 기능을 가진 발현억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 또는, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자등을 또 가진 것이라도 된다.

본 발명에 관한 PHA합성효소의 제조는, 예를 들면, 이것을 코딩하는 유전자를 가진 재조합벡터에 의해 숙주를 형질전환해서 얻은 형질전환체를 배양하고, 배양물(배양균체 또는 배양상청액)속에 유전자산물인 PHA합성효소를 생성축적시켜,배양물로부터 PHA합성효소를 취득함으로써 행하여진다.

본 발명의 형질전환체를 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 사용되는 통상의 방법을 사용하면 된다.

또 배양방법은, 배치식, 유동배치식, 연속배양, 리액터형식등, 통상의 미생물의 배양에 사용하는 어떠한 방법도 사용할 수 있다.

대장균등의 세균을 숙주로 해서 얻게 된 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 완전배지 또는 합성배지, 예를 들면 LB배지, M9배지등을 들 수 있다. 또, 배양온도는 25∼37℃의 범위에서 호기적으로 8∼72시간 배양함으로써 PHA합성효소를 균체내에 축적시키고, 회수한다. 탄소원은 미생물의 증식에 필요하고, 예를 들면 글루코스, 프럭토스, 슈크로스, 말토스, 갈락토스, 전분등의 당류, 에탄올, 프로판올, 부탄올등의 저급알콜류, 글리세롤등의 다가알콜류, 아세트산, 시트르산, 숙신산, 타르타르산, 락트산, 글루콘산등의 유기산, 프로피온산, 부탄산, 펜탄산, 헥산산, 헵탄산, 옥탄산, 노난산, 데칸산, 운데칸산, 도데칸산등의 지방산등을 이용할 수 있다.

질소원으로서는, 예를 들면 암모니아, 염화암모늄, 황산암모늄, 인산암모늄등의 암모늄염 외에, 펩톤, 고기즙, 효모엑기스, 맥아엑기스, 카제인분해물, 옥수수 침지액등의 천연물유래의 것을 들 수 있다. 또, 무기물로서는, 예를 들면 인산제 1칼륨, 인산제 2칼륨, 인산마그네슘, 황산마그네슘, 염화나트륨등을 들 수 있다. 배양액에, 카나마이신, 암피실린, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신등의 항생물질을 첨가해도 된다.

또, 프로모터가 유도성의 발현벡터를 사용해서 형질전환한 미생물을 배양하는 경우는, 프로모터의 종류에 적합한 유도물질을 배지에 첨가하면 된다. 예를 들면, 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드(IPTG), 테트라사이클린, 인돌아크릴산(IAA)등을 유도물질로서 들 수 있다.

PHA합성효소의 취득 및 정제는, 얻게 되는 배양물중으로부터, 균체 또는 상청액을 원심·회수하여, 균체파쇄, 추출, 친화성 크로마토그래피, 양이온 또는 음이온교환크로마토그래피, 겔여과등을 단독으로 또는 적당히 조합함으로써 행할 수 있다. 얻게 된 정제물질이 목적의 효소인 것의 확인은, 통상의 방법, 예를 들면 SDS폴리아크릴아미드겔전기영동, 웨스턴블로팅등에 의해 행할 수 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 PHA합성효소의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 PHA합성효소의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

또, PHA의 제조를 위하여, 미생물을 숙주로서 사용한 형질전환체를 배양할 때에도, 사용한 숙주나 숙주속에 도입한 재조합벡터의 구성등에 따른 조성의 배지 및 배양조건을 사용해서 형질전환체를 배양하고, 배양물로부터 PHA를 취득하는 방법을 이용할 수 있다. 배지나 배양조건으로서는, 예를 들면 상기의 PHA합성효소의 제조에 있어서 예시한 것을 마찬가지로 이용할 수 있다.

균체로부터의 PHA의 회수는, 통상 행하여지고 있는 클로로포름등의 유기용매에 의한 추출이 가장 간편하기는 하나, 유기용매를 사용하기 어려운 환경속에 있어서는, SDS등의 계면활성제에 의한 처리, 리소자임등의 효소에 의한 처리, EDTA, 차아염소산나트륨, 암모니아등의 약제에 의한 처리에 의해서 PHA이외의 균체성분을 제거해서, PHA를 회수하는 방법을 사용할 수도 있다.

또한, 숙주로서 미생물을 사용한 형질전환체의 배양, 형질전환체에 의한 PHA의 생산과 균체내에의 축적, 및, 균체로부터의 PHA의 회수는, 상기의 방법에 한정되는 것은 아니다.

실시예

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은, 이들 실시예에 그 기술적 범위를 한정하는 것은 아니다.

(실시예 1: P91균주의 PHA합성효소유전자의 클로닝)

P91균주를 100㎖의 LB배지(1% 폴리펩톤, 0.5% 효모엑기스, 0.5% 염화나트륨, pH 7.4)에서, 30℃, 하룻밤 배양후, 마머등의 방법에 의해 염색체DNA를 분리회수하였다. 얻게 된 염색체DNA를 제한효소 BglII에 의해 완전분해하였다. 벡터는 pUCl8을 사용하여, 제한효소 BamHI에 의해 절단하고, 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권, 572페이지, 1989년; Cold Spring Harbor Larboratory출판)한 후, DNA라이게이션키트 Ver. II(타카라슈조)를 사용해서 염색체DNA의 BglII완전분해단편과 연결하였다. 다음에, 이 연결DNA단편을 사용해서 대장균(Escheichia coli) HB101균주를 형질전환하고, P91균주의 염색체DNA라이브러리를 제작하였다.

다음에, P91균주의 PHA합성효소유전자를 함유하는 DNA단편을 얻기 위한 프로브조제를 행하였다. 서열번호: 5 및 6의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 합성하고(아머샴 파머시아·바이오테크), 이 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 해서 PCR을 행하여, 증폭되어 온 단편을 프로브로서 사용하였다. 프로브의 표지화는 AlkPhosDirect(아머샴 파머시아·바이오테크)를 이용해서 행하였다. 얻게 된 프로브를 사용해서 P91균주의 염색체DNA라이브러리로부터 콜로니하이브리디제이션법에 의해서 PHA합성효소유전자를 함유하는 재조합플라스미드를 가진 대장균을 선발하고, 알칼리법에 의해서 플라스미드를 회수함으로써 PHA합성효소유전자를 함유하는 DNA단편을 얻을 수 있었다.

여기서 취득한 유전자단편을 불화합성 그룹인 IncP, IncQ, 또는 IncW의 어디에도 속하지 않는 넓은 숙주범위복제영역을 함유하는 벡터 pBBR122(Mo Bi Tec)에 재조합, 이 재조합플라스미드를 슈도모나스·푸티다 P91m1균주(PHA합성능력결손균주)에 일렉트로포레이션법에 의해 형질전환하였던 바, P91m1균주의 PHA합성능력이 복귀되어, 상보성을 표시하였다.

PHA합성효소유전자를 함유하는 단편에 대해서 생거법(Sanger' sequencing method)에 의해 염기서열을 결정하였다. 그 결과, 서열번호: 2 및 4로 표시되는 염기서열을 가진 PHA합성효소유전자가 상기 단편속에 존재하는 것을 확인할 수 있었다. 또, 서열번호: 2 및 4의 염기서열에 의해 코드되는 아미노산서열을 서열번호: 1 및 3에 각각 표시한다.

(실시예 2: P91균주의 PHA합성효소유전자의 발현벡터에의 재조합)

서열번호: 2로 표시되는 PHA합성효소유전자의 개시코돈근처의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드(서열번호: 7) 및 종지코돈근처의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드(서열번호: 8)를 설계·합성하고(아머샴 파머시아·바이오테크), 이올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 해서 PCR을 행하여, PHA합성효소유전자의 전체길이를 증폭하였다(LA-PCR키트; 타카라슈조).

또, 서열번호: 4로 표시되는 PHA합성효소유전자의 개시코돈근처의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드(서열번호: 9) 및 종지코돈근처의 염기서열을 가진 올리고뉴클레오타이드(서열번호: 10)를 설계·합성하고(아머샴 파머시아·바이오테크), 이 올리고뉴클레오타이드를 프라이머로 해서 PCR을 행하여, PHA합성효소유전자의 전체길이를 증폭하였다(LA-PCR키트; 타카라슈조).

다음에, 상기한 바와 같이 해서 얻게 된 PCR증폭단편 각각에 대해서 제한효소 HindIII을 사용해서 완전분해물로 하고, 발현벡터 pTrc99A의 제한효소 HindIII에 의해 절단, 탈인산화처리(Molecular Cloning, 1권, 5. 7. 2페이지, 1989년; Cold Spring Harbor Laboratory출판)한 것에, DNA라이게이션키트 Ver. II(타카라슈조)를 사용해서 연결하였다.

얻게 된 재조합플라스미드에 의해 대장균(Escherichia coliHB101)을 염화칼슘법에 의해 형질전환하고(타카라슈조), 얻게 된 재조합체로부터 회수한 재조합플라스미드를 각각 pP91-C1(서열번호: 2유래), pP91-C2(서열번호: 4유래)로 하였다.

(실시예 3: PHA합성효소유전자재조합대장균에 의한 PHA생산-1)

실시예 2에서 얻게 된 재조합플라스미드, pP91-C1(서열번호: 2유래), pP91-C2(서열번호: 4유래)에 의해 대장균(Escherichia coliHB101fB fadB결손균주)을 염화칼슘법에 의해 형질전환하고, 각각의 재조합플라스미드유래의 재조합대장균을 얻었다.

pP91-C1재조합균주, pP91-C2재조합균주 각각을 효모엑기스 0.5%, FPVA 0.1%를 함유하는 M9배지 200㎖에 식균하고, 37℃, 125스트로크/분으로 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 1번 세정해서 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 뒤, 회전식 증발기로 농축하고, 농축액을 냉메탄올속에서 재침전시키고, 또 침전만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻게 된 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 뒤, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 1에 표시한다.

	pP91-C1재조합균주	pP91-C2재조합균주
균체건조중량폴리머건조중량폴리머건조중량/균체건조중량모노머유닛조성(에어리어비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시헵탄산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시-5-(4-플루오로페닐)발레르산	810㎎/L24㎎/L3%0%0%0%5%4%9%10%72%	800㎎/L23㎎/L3%0%0%0%3%5%11%12%69%

(실시예 4: PHA합성효소유전자재조합대장균에 의한 PHA생산-2)

pP91-C1재조합균주, pP91-C2재조합균주 각각을 효모엑기스 0.5%, PxBA 0.2%를 함유하는 M9배지 200㎖에 식균하고, 37℃, 125스트로크/분으로 진탕배양하였다. 24시간후, 균체를 원심분리에 의해서 회수하고, 냉메탄올로 1번 세정해서 동결건조하였다.

이 동결건조펠릿을 100㎖의 클로로포름에 현탁하고, 60℃에서 20시간 교반해서 PHA를 추출하였다. 추출액을 구멍직경 0.45㎛의 멤브레인필터로 여과한 뒤, 회전식 증발기로 농축하고, 농축액을 냉메탄올속에서 재침전시키고, 또 침전만을 회수해서 진공건조하여 PHA를 얻었다. 얻게 된 PHA는, 상법에 따라서 메탄올리시스를 행한 뒤, 가스크로마토그래피-질량분석장치(GC-MS, 시마즈 QP-5050, EI법)로 분석하여, PHA모노머유닛의 메틸에스테르화물의 동정을 행하였다. 그 결과를 표 2에 표시한다.

	pP91-C1재조합균주	pP91-C2재조합균주
균체건조중량폴리머건조중량폴리머건조중량/균체건조중량모노머유닛조성(에어리어비)3-하이드록시부티르산3-하이드록시발레르산3-하이드록시헥산산3-하이드록시헵탄산3-하이드록시옥탄산3-하이드록시노난산3-하이드록시데칸산3-하이드록시-4-페녹시-n-부티르산	750㎎/L4㎎/L0.5%0%0%0%2%3%5%5%85%	720㎎/L4㎎/L0.6%0%0%0%2%3%7%6%82%

본 발명에 의하면, PHA합성효소, 상기 PHA합성효소를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터에 의해 형질전환된 형질전환체를 제공할 수 있다. 본 발명에 관한 PHA합성효소유전자는, 신규의 곁사슬구조를 가진 모노머를 기질로 한 PHA합성효소를 코드하기 때문에, 여러 가지의 물성을 가진 PHA를 합성하기 때문에 유용하다.

Claims

서열번호: 1로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
서열번호: 1로 표시되는 아미노산서열을 실질적으로 유지하고 또한 폴리하이드록시알카노에이트합성효소활성을 손상하지 않는 범위에서 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 변형의 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
제 2항에 기재된 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 아미노산서열을 코딩하는 DNA서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자.
서열번호: 1로 표시되는 아미노산서열을 코딩하는 서열번호: 2의 DNA서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자.
서열번호: 3으로 표시되는 아미노산서열을 가진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
서열번호: 3으로 표시되는 아미노산서열을 실질적으로 유지하고 또한 폴리하이드록시알카노에이트합성효소활성을 손상하지 않는 범위에서 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 변형의 아미노산서열을 가지는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소.
제 6항에 기재된 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 아미노산서열을 코딩하는 DNA서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자.
서열번호: 3으로 표시되는 아미노산서열을 코딩하는 서열번호: 4의 DNA서열을 함유하는 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자.
제 3항, 제 4항, 제 7항 및 제 8항중에서 어느 한 항에 기재된 유전자를 폴리하이드록시알카노에이트합성효소유전자로서 함유하는 것을 특징으로 하는 재조합벡터.
제 9항에 기재된 재조합벡터의 도입에 의해서 형질전환하여 얻게 된 것임을 특징으로 하는 형질전환미생물.
폴리하이드록시알카노에이트합성효소를 위한 기질을 함유하는 배지에서 제10항에 기재된 형질전환미생물을 배양하는 단계와,

얻게된 배양물로부터 폴리하이드록시알카노에이트를 격리하는 단계

로 이루어진 것을 특징으로 하는 폴리하이드록시알카노에이트의 제조방법.
제 10항에 기재된 형질전환미생물을 배양하는 단계와,

형질변환된 미생물이 폴리히드록시알카노에이트합성효소를 생성하게 하는 단계

로 이루어진 것을 특징으로하는 폴리하이드록시알카노에이트합성효소의 제조방법.