DE19851415B4

DE19851415B4 - Mutanter Transaktivator

Info

Publication number: DE19851415B4
Application number: DE1998151415
Authority: DE
Inventors: Wolfgang Hillen
Original assignee: Individual
Current assignee: Tet Systems & Co Kg 69120 Heidelberg De GmbH; Tet Systems & Co Kg De GmbH
Priority date: 1998-11-07
Filing date: 1998-11-07
Publication date: 2010-11-04
Anticipated expiration: 2018-11-08
Also published as: DE19851415A1

Abstract

Mutanter Transaktivator mit einem Tet-Repressor (TetR), der mindestens einen Aminosäureaustausch an einer Position verschieden von Position 71, 95, 101 oder 102 aufweist und der einen Aminosäureaustausch an Position 19 E19G und einen Aminosäureaustausch an Position 56 A56P aufweist.

Description

Die Erfindung betrifft mutante Transaktivatoren.
Nach dem Stand der Technik sind aus der WO 96/40892 bzw. aus Gossen, M., Freudenlieb, S., Bänder, G., Müller, G., Rillen, W. & Bujard, H. (1995): Transcriptional activation of tetracyclines in mammalian cells, Science 268, 1766–1769 mutante Transaktivatoren bekannt. Dabei handelt es sich um reverse Transaktivatoren rtTA, die Austausche an den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 und 102 des Tet-Repressors TetR aufweisen. Die Austausche befinden sich am Anfang und am Ende von Helix 6 des TetR-Moleküls. Es wird angenommen, dass diese Austausche eine Konformationsänderung nach der Induktion bewirken. Wie diese Austausche zum reversen Phänotyp führen, ist noch nicht geklärt.
Aus Belli, G., Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M., & Herrero, E. (1998): An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast, Nucleic Acids Research, 1998, Vol. 26, No. 4 942–947 sowie Gari, E., Piedrafita, L., Aldea, M. & Herrero, E. (1997): Yeast, Vol. 13; 837–848 ist die Expression von Transaktivatoren tTA und rtTA in Saccharomyces cerevisiae bekannt. Dabei konnte allerdings rtTA nicht alleine als Transaktivator benutzt werden, weil aufgrund einer hohen Basisexpression keine regulierbare Genexpression mehr möglich war. Zur Behebung dieses Nachteils ist ein regulierbarer Repressor in das System eingefügt worden. – Das System zeigt hohe Induktionsraten. Gleichwohl ist es kompliziert und schwer beherrschbar.
Aufgabe der Erfindung ist es, die Nachteile nach dem Stand der Technik zu beseitigen. Es sollen insbesondere mutante Transaktivatoren angegeben werden, mit denen in Hefe auf möglichst einfache und unkomplizierte Weise hohe Induktionsraten erzielt werden können.
Diese Aufgabe wird durch die Merkmale des Anspruchs 1 gelöst. Zweckmäßige Ausgestaltungen ergeben sich aus den Merkmalen der Ansprüche 2 bis 8.
Zur Lösung der Aufgabe ist ein mutanter Transaktivator vorgesehen, mit einem Tet-Repressor TetR, der mindestens einen Aminosäureaustausch an einer Position verschieden von den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 oder 102 aufweist und wobei der Aminosäureaustausch im DNA-bindenden Bereich sich befindet.
Es hat sich überraschenderweise gezeigt, dass mit solchen mutanten Transaktivatoren hohe Induktionsraten erzielbar sind. Sie zeigen ein niedriges Basalniveau. Auf die Einführung eines Repressors kann in diesem System verzichtet werden. Das System ist einfach und lässt sich gut beherrschen.
Die muntanten Transriptionsaktivatoren sind induktorspezifisch, d. h. die Expression kann durch die Art des Induktor variiert werden.
Die mutierten Transaktivatoren eigenen sich darüber hinaus zur Anwendung in einem breiten Spektrum von Organismen, insbesondere in Pflanzen oder niederen Pilzen.
Von Vorteil ist es, dass der Aminosäureaustausch an der Aminsäureposition 19, sich befindet. Des weiteren kann sich ein Aminosäureaustausch im Bereich der Helix 4, vorzugsweise an der Aminosäureposition 56, befinden. Bereits die vorgenannten Austausche sind überraschenderweise ausreichend, um den re versen Phänotyp zu erzeugen. Es sind also andere Bereiche betroffen als in der bekannten rtTA. Das legt es nahe, dass hier möglicherweise ein neuer Induktionsmechanismus zugrunde liegt.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal liegen weitere Aminosäureaustausche an der Aminosäureposition 148 und/oder 179 vor. Es kann sein, dass mindestens ein Aminosäureaustausch in den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 und 102 vorliegt.
Nach einem weiteren Ausgestaltungsmerkmal enthält der Transaktivator das Virusprotein 16 VP16. Ein solcher Transaktivator ist einfach herzustellen.
Der Transaktivator kann in niederen Pilzen, insbesondere in Saccharomyces cerevisiae, in mammalischen Zellen, insbesondere in HeLa, und in pflanzlichen Zellen die Expression in Abhängigkeit niedermolekularer Induktoren aktivieren.
Zweckmäßigerweise ist der mutante Transaktivator aus der folgenden Gruppe ausgewählt: rtTA-1956R gemäß Sequenzprotokoll 13, rtTA-22R gemäß Sequenzprotokoll 1, rtTR-34R gemäß Sequenzprotokoll 3, rtTA-44R gemäß Sequenzprotokoll 5, rtTR-52R gemäß Sequenzprotokoll 7, rtTR-68R gemäß Sequenzprotokoll 9, rtTR-92R gemäß Sequenzprotokoll 11. Die genannten mutanten Transaktivatoren zeigen eine besonders hohe Induktionsrate insbesondere in Anwesenheit von Doxizyklin.
Nach einer weiteren Ausgestaltung ist ein erfindungsgemäßer mutanter Transaktivator Bestandteil eines Arzneimittels oder eines transgenen Organismus oder eines Expresionssystems oder eines Genregulationssystems.
Nachfolgend werden die Herstellung und die Eigenschaften erfindungsgemäßer mutanter Transaktivatoren beispielhaft erläutert. Dabei zeigen:
1 eine Karte des Plasmids pCM190-GFP+,
2 die Fluoreszenzintensität der Reporter-Expression hervorgerufen durch verschiedene mutante Transaktivatoren in Abhangigkeit unterschiedlicher Regulatoren,
3 die Fluoreszenzintensitat der Reporter-Expression hervorgerufen durch verschiedene mutante Transaktivatoren in Abhängigkeit der Temperatur,
4 die Luciferase-Aktivität der Reporter-Expression hervorgerufen durch verschiedene mutante Transaktivatoren in HeLa-Zellen und
5 den Anteil der einzelnen Aminosäureaustausche von rtTA-34R am reversen Phänotyp.
1 zeigt einen zur Herstellung der erfindungsgemäßen mutanten Transaktivatoren geeigneten Vektor, nämlich den Vektor pCM190-GFP+. Der Vektor enthält eine konstitutiv exprimierte TetR-VP16-Fusion als Transaktivator tTA. Stromabwärts schliesst sich daran ein durch Tc regulierbarer Promotor, z. B. ein CMV Promotor an. Der hier gewählte Promotor umfasst 7 tet-Operatoren tetO7, die stromaufwärts der CYC TATA-Region der Bäckerhefe angeordnet sind. In der Nähe der CYC TATA-Region ist das für das grün fluoreszierende Protein GFP aus Aequorea victoria codierende Gen in die singuläre BamHI-Schnittstelle von pCM190 ligiert. Der Vektor enthält ferner ein URA3-Gen sowie eine 2 μ-Sequenz.
Die Funktion der vorgenannten Bestandteile des Vektors ist folgende:
Aus dem tTA bzw. rtTA kann über geeignete Restriktionsschnittstellen der tetR-Anteil entfernt und durch eine korrespondierende mutagenisierte tetR-Sequenz ersetzt werden.
Die Herstellung mutagenisierter TetR kann vorteilhafterweise mittels PCR erfolgen. Dazu wird TetR mittels der Taq-DNA-Polymerase amplifiziert. Ein Zusatz von z. B. Manganchlorid sowie die Einstellung eines Ungleichgewichts der Nukleotide bewirkt eine hohe Fehlerrate dieser Polymerase: Etwa 90% der gebildeten PCR-Produkte weisen einzelne oder mehrere Punktmutationen auf.
Das GFP-Gen dient als Indikator- bzw. Reportergen. Es eignet sich insbesondere als Reporter in der Bäckerhefe. Das URA3-Gen dient als Selektionsmarker in der Bäckerhefe. Die 2 μ-Sequenz gewährleistet eine besonders hohe Kopienzahl des Vektors in den Bäckerhefe-Zellen.
Zur Durchführung eines zum Auffinden der erfindungsgemäßen Transaktivatoren geeigneten Auswahl- bzw. Screeningverfahrens wird ein zufällig generiertes tetR-Mutanten enthaltendes pCM190-GFP+ Gemisch mittels Transformation in Saccaromyces cerevisiae eingebracht. Anschließend wird mittels Uracil-Prototropie der Transformanden auf die Anwesenheit des Vektors selektioniert.
Auf geeigneten Agarplatten kann nun die Induktion von TetR-Mutanten unter verschiedenen Bedingungen geprüft werden. Es kann z. B. der die Induktion von TetR-Mutanten bewirkende Ef fektor variiert werden. Als Effektoren kommen z. B. Tc-Derivate oder andere chemische Verbindungen in Frage.
Die 2 und 3 zeigen die Eigenschaften von unter Verwendung des Verfahrens aufgefundenen Mutanten. Dabei wurde wie folgt vorgegangen:
Der TetR-Anteil von tTA wurde mit dem Vektor pCM190 als Matrize und zwei entsprechenden Oligonukleotiden (5'-GACCGATCCAGCCTCCGCGG und 5'-CGTGTGTCCCGCGGGGAGAA) nach der Methode von Leung et al. (Leung, D. W., Chen, E., & Goeddel, D. V. 1989: A method for random mutagenesis of a defined DNA segment using a modified polymerase chain reaction, Technique 1, 11–15) amplifiziert. Die enthaltenen, mutagenisierten PCR-Fragmente (= mutagenisierte TetR-Gene) und PCM190-GP+ wurden mit Xbal und BsiWI verdaut und aufgereinigt. Anschließend wurden die PCR-Fragmente in den geschnittenen Vektor ligiert und in E. coli DH5α transformiert. Jeweils mehrere 1000 E. coli-Klone wurde zusammen kultiviert und deren Plasmid-DNA präpariert. Diese Plasmidpools wurden sodann mittels der LiAc-Methode in Saccaromyces cerevisiae transformiert (Ito et al., H., Fukada, Y., Murata, K. & Kimura 1983: Transformation of intact yeast cells treated with alkali cations, J. Bact. 153, 163–168).
Die erhaltenen Uracil-prototrophen Hefeklone wurden auf Minimalmedium-Platten ohne Uracil, aber mit jeweils 10 μg/ml Tetrazyklin bzw. Doxizyklin oder ohne Tc-Derivat replikaplattiert und nach zwei bis drei Tagen Wachstum bei 30°C unter langweiligem UV-Licht kontrolliert. Dabei konnten Mutanten identifiziert werden, die einen reversen Phänotyp aufweisen, d. h. sie induzieren im Gegensatz zu tTA in Anwesenheit von Tetrazyklin-Derivaten.
Die mutanten Transaktivatoren wurden zusammen mit einem GFP-freien Kontrollstamm, dem tTA- und dem rtTA- enthaltenden Stamm über Nacht in Minimalmedium kultiviert. Die Zellen wurden geerntet und je eine OD600 wurde mit PBS gewaschen und in 2 ml PBS resuspendiert. Die Lichtemission der Zellen bei 512 mm wurde in einem Fluorimeter bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm vermessen. Dabei erwies sich die Basalaktivität der Mutante rtTA-34R rtTA-22R, rtTA-52R, rtTA-68R und rtTA-92R in Hefe als deutlich erniedrigt im Vergleich zu dem bisher bekannten rtTA (Belli et al. 1998: An activator/repressor dual system allows tight tetracycline-regulated gene expression in budding yeast, Nucleic Acids Res. 26, 942–947). Wie aus 2 ersichtlich ist, liegt die Aktivierung etwa im Bereich des rtTA bzw. des rTA. Es werden hierbei Induktionsfaktoren von 100–300 gemessen. Also sind die vorgenannten Mutanten für den Einsatz zur regulierbaren Genexpression in Hefe wesentlich besser geeignet als rtTA, dessen Induktionsraten maximal 40-fach sind.
In 3 ist die relative Fluoreszenzintensität über erfindungsgemäßen mutanten Transaktivatoren im Vergleich zu tTA und rtTA bei einer Temperatur von 28°C sowie von 37°C aufgetragen. Insbesondere die mutante rtTA-52R zeigt eine ausgeprägte Abhängigkeit der Induktionsrate von der Temperatur.
Nach Isolation der entsprechenden Vektoren aus der Bäckerhefe wurden die mutagenisierten tTA-Bereiche sequenziert, um die für den reversen Phänotyp verantwortlichen Aminosäureaustausche zu bestimmen. Anschließend wurden sowohl rtTA-34R als auch –44R in den Vektor pUHD15-1 (Gossen & Bujard, 1992: Tight control of gene expression in mammalian cells by tetracycline-responsive promoters, Proc., Natl., Acad. Sci. USA 89, 5547-5551) umkloniert, wobei die mutagenisierten Transaktivatoren tTA ersetzten. Durch transiente Transfektionen zusammen mit dem Luciferase-kodierenden Vektor pUHC13-3 wurden die Aktivitäten der Konstrukte in HeLa-Zellen überprüft.
Aus 4 ist ersichtlich, dass insbesondere rtTA-34R auch in Humanzellen eine mehrfach höhere Induktion des Reportergens bewirkt als bisher verwendete rtTA. Dieser Effekt kommt zum einen wie in Saccaromyces cerevisiae durch erniedrigtes Basalniveau zustande. Zum anderen dadurch, dass die Aktivierung der Transkription deutlich erhöht ist.

Eine transiente Transfektion von humanen Epithelzellen zeigt, dass rtTA-34R den bisher verwendeten rtTA in Humanzellen überlegen ist. Dazu wurde der Tetrazyklin-regulierbare Reporter Luciferase in Abhängigkeit von unterschiedlichen Transaktivatoren quantifiziert. Die dabei erzielten Ergebnisse sind aus der nachstehenden Tabelle ersichtlich.

Transaktivator	Induktionsraten in Anwesenheit von Doxizyklin (5 μg/ml)	Induktionsraten Abwesenheit von Doxiyzklin (5 μg/ml)
rTA	-	700-fach
rtTA	130-fach	-
rtTA-34R	370-fach	-
rtTA-1956R	130-fach	-
rtTA-44R	25-fach	-

Die Tabelle zeigt, dass durch rtTA-34R etwa 3-fach höhere Induktionsraten erzielt werden als durch rtTA. rtTA-34R stellt daher einen deutlich verbesserten Transaktivator dar.
Zur Prüfung der Frage, ob in Hefe erzielte Ergebnisse auf Humanzellen übertragbar sind, wurden nach Klonierung der rtTA-Mutanten in den Vektor pUHD15-1 fünf der Klone, die in Hefe einen sehr ausgeprägten Phänotyp zeigten, mittels transienter Transfektionen in humanen Epithelzellen getestet.
U. a. rtTA-34R stellt eine deutliche Verbesserung des reversen, Tc-induzierbaren Systems dar, denn sowohl in Humanzellen als auch in Bäckerhefe sind die Induktionsraten in Anwesenheit von Doxizyklin im Vergleich zum bisher verwendeten rtTA mehrfach gesteigert. Während der rtTA-Phänotyp auf die Aminosäureaustausche D95N L101S G102D zurückzuführen ist, wurden in dem neu konstruierten rtTA-34R die Austausche E1956R (H139H) A148E H179R identifiziert. Die Aminosäuren 71, 95, 101 und 102 sind in rtTA-34R nicht betroffen.
Um den Einfluss der einzelnen Positionen genauer zu untersuchen, wurden die Mutationen 19/56 und (139)/148/179 getrennt. Die entstandenen Proteine rtTA-1956R und rtTA-148179R wurden durch transiente Transfektionsstudien in HeLa-Zellen auf ihr Aktivierungspotential untersucht.
Aus 5 ist ersichtlich, dass die Austausche E19G und A56P ausreichend sind, um einen reversen Phänotyp zu erhalten. Die Mutationen an Position 148 und 179 tragen nur wenig zur Ausprägung bei. Dagegen führen die Mutationen D148E und H179R nicht zur Reversion des Induktionsmechanismus.
Der bisher verwendete rtTA hat im Vergleich zu tTA Austausche an den Aminosäurepositionen 71, 95, 101 und 102 des TetR-Moleküls. Diese Aminosäuren liegen in eine eng begrenzten Bereich des Proteins am Anfang und Ende von Helix 6.
rtTA-34R dagegen zeigt die Austausche an den Positionen 19, 56, 148 und 179, wobei die Austausche 19 und 56 ausreichend sind, um den reversen Phänotyp hervorzurufen (siehe Mutante rtTA-1956R). Position 19 liegt im DNA-bindenden Bereich und Position 56 in Helix 4.

Es folgt ein Sequenzprotokoll nach WIPO St. 25. Dieses kann von der amtlichen Veröffentlichungsplattform des DPMA heruntergeladen werden.

Claims

Mutanter Transaktivator mit einem Tet-Repressor (TetR), der mindestens einen Aminosäureaustausch an einer Position verschieden von Position 71, 95, 101 oder 102 aufweist und der einen Aminosäureaustausch an Position 19 E19G und einen Aminosäureaustausch an Position 56 A56P aufweist.
Mutanter Transaktivator nach Anspruch 1, wobei der Tet-Repressor weitere Aminosäureaustausche an der Position 148 und/oder 179 aufweist.
Mutanter Transaktivator nach einem der Ansprüche 1 oder 2, wobei der Transaktivator hohe Induktionsraten mit Induktionsfaktoren von 100 bis 300 in Hefe erzielt.
Mutanter Transaktivator nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei der Transaktivator das Virus Protein 16 enthält.
Mutanter Transaktivator nach Anspruch 1 mit einer Struktur gemäß Sequenzidentifikationsnummer 13 oder 3.
Transgener, nicht-humaner Organismus umfassend einen mutanten Transaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Expressionssystem umfassend einen mutanten Transaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 5.
Genregulationssystem umfassend einen mutanten Transaktivator nach einem der Ansprüche 1 bis 5.