DE69927046T2 - Vektoren für die gen-mutagenese und die entdeckung von genen durch 'gene-trapping' - Google Patents

Vektoren für die gen-mutagenese und die entdeckung von genen durch 'gene-trapping' Download PDF

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Description

  • 1.0. Gebiet der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Vektoren, welche strukturelle Elemente inkorporieren, welche, nachdem die Vektoren in das Wirtszellgenom integriert haben, die Anzahl der zellulären Gene erhöhen, die identifiziert werden können, wie auch die, die effizient mutiert werden können. Die beschriebenen Vektoren sind wichtige Werkzeuge sowohl für die Entdeckung von Genen, das Klonieren von Genen, Genmutation, Genregulation, das Anliefern von Fähren mit Nukleinsäuren über das gesamte Genom, sowie Genaktivierung und Überexpression.
  • 2.0. Hintergrund der Erfindung
  • Gen-Trapping stellt einen potenten Ansatz zur gleichzeitigen Mutation und Identifzierung von Genen dar. Gen-Trap-Vektoren können nicht spezifisch in das Target-Zell-Genom insertiert werden und Gen-Trap-Vektoren wurden konsequenterweise konstruiert, welche Ereignisse auswählen, in welchen der Gen-Trap-Vektor in ein Gen insertiert wurde und dieses mutierte. Durch Ausbeuten der zellulären Splice-Maschinerie entfernt die auswählbare Natur dieser Vektoren den großen Hintergrund der Insertions-Ereignisse, wo Vektoren nicht in Gene integriert haben.
  • Die meisten Säugergene werden in Exons und Introns unterteilt. Exons sind Teile des Gens, welche in mRNA gesplict werden und das Proteinprodukt eines Gens kodieren. In genomischer DNA werden diese kodierenden Exons von nicht-kodierenden Intron-Sequenzen unterbrochen. Obwohl RNA-Polymerase sowohl Intron- als auch Exon-Sequenzen transkribiert, müssen Intron-Sequenzen vom Transkript entfernt werden, so dass das resultierende mRNA in Protein translatiert werden kann. Dementsprechend haben alle Säugetier-und die meisten eukaryontischen Zellen die Maschinerie, Exons in mRNA zu splicen. Gen-Trap-Vektoren wurden konzipiert, um in Introns oder in Gene in einer Art und Weise zu integrieren, welche erlaubt, dass die zelluläre Splice-Maschinerie vektorkodierte Exons in zelluläre mRNA splict. Häufig enthalten solche Gen-Trap-Vektoren auswählbare Markersequenzen, welchen starke Splice-Akzeptor-Sequenzen vorangehen und welchen kein Promotor vorangeht. Folglich splict, wenn solche Vektoren ins Gen integrieren, die zelluläre Splice-Maschinerie Exons des getrapten Gens an das 5'-Ende der auswählbaren Markersequenz. Typischerweise können solche auswählbaren Markergene nur exprimiert werden, falls der Vektor, welcher das Gen kodiert, in ein Intron integriert hat. Die resultierenden Gen-Trap-Ereignisse werden im Folgenden identifiziert durch Auswahl von Zellen, welche eine selektive Kultur überleben können.
  • Gen-Trapping hat sich als sehr effizientes Verfahren bestätigt zum Mutieren großer Anzahl von Genen. Die Insertion des Gen-Trap-Vektors erzeugt eine Mutation im getrappten Gen und stellt auch ein molekulares Tag zur Verfügung, welches ausgebeutet werden kann, um das getrappte Gen zu identifizieren. Wenn ROSAβgeo verwendet wurde, um Gene zu trappen, wurde demonstriert, dass zumindest 50% der resultierenden Mutationen in einem Phänotyp bei Untersuchungen in Mäusen resultierten. Dies zeigt, dass die Gen-Trap-Insertions-Vektoren bedeutsame Mutagene sind. Obwohl ein Werkzeug von hohem Potenzial zum Mutieren von Genen ist das Potenzial des Verfahrens bislang durch Schwierigkeiten beim Modifizieren der getrappten Gene limitiert. Verfahren, welche verwendet wurden, um Trap-Ereignisse zu identifizieren, verlassen sich auf die Fusions-Transkripte, welche vom Splicen von Exon-Sequenzen von getrappten Genen an Sequenzen, kodiert durch den Gen-Trap-Vektor, resultieren. Allgemeine Genidentifizierungs-Protokolle, verwendet, um Sequenzen aus diesem Fusions-Transkript zu erhalten, schließen 5' RACE, cDNA-Klonieren und Klonieren von genomischer DNA, umgebend die Stelle der Vektorintegration ein. Jedoch haben sich diese Verfahren als arbeitsintensiv herausgestellt, nicht vollständig adaptierbar zur Automation und im Allgemeinen unpraktisch für den High-Throughput.
  • 3.0. Zusammenfassung der Erfindung
  • In jüngster Zeit wurden Vektoren entwickelt, welche auf einer neuen Strategie von Gen-Trapping basieren, welche einen Vektor verwendet, der ein ausgewähltes Markergen enthält, dem ein Promotor vorangeht und eine Splice-Donor-Sequenz folgt, anstelle einer Polyadenylierungs-Sequenz. Diese Vektoren stellen keine Selektion zur Verfügung, solange sie in ein Gen integrieren und Trappen nachfolgend strangabwärts gele gene Exons, welche die Polyadenylierungs-Sequenz, benötigt zur Expression des auswählbaren Markers, zur Verfügung stellen. Die Integration solcher Vektoren in das Chromosom resultiert im Splicen des auswählbaren Markergens an 3'-Exons des getrappten Gens. Diese Vektoren stellen eine Reihe von Vorteilen zur Verfügung. Sie können verwendet werden, um Gene zu trappen, unabhängig, ob die Gene normal im Zelltyp, in welchen der Vektor integriert hat, exprimiert werden. Darüber hinaus können Zellen, welche solche Vektoren beherbergen, gescreent werden unter Verwendung automatisierter (d. h. 96-Wellplatten-Format) Gen-Identifizierungs-Assays, wie z. B. 3' RACE (siehe im Allgemeinen Frohman, 1994, PCR Methods and Applications, 4:S40-S58). Die Verwendung dieser Vektoren macht es möglich, große Anzahlen von Mutationen herzustellen und schnell das mutierte oder getrappte Gen zu identifizieren. Jedoch war vor der vorliegenden Erfindung die Ausbeutung solcher Vektoren auf einer kommerziellen Skala begrenzt durch die Anzahl von Target-Gene, welche effizient unter Verwendung solcher Vektoren getrappt werden können.
  • Die relative Ineffizienz einer ersten Generation von 3'-Gen-Trap-Vektoren begrenzte die Gesamtzahl von Genen, welche schnell und praktisch getrappt, identifiziert, analysiert und effizient mutiert werden konnte. Diese Ineffizienz machte die rasche Entwicklung effizienterer 3'-Gen-Trap-Verfahren nötig, welche erlauben, dass ein höherer Prozentsatz an Genen im Target-Zell-Genom getrappt und schnell identifiziert werden kann, beispielsweise durch DNA-Sequenzanalyse.
  • Um dieses Defizit auszumerzen, stellt die vorliegende Erfindung einen genetisch konzipierten Vektor zur Verfügung, der Folgendes umfasst:
    • a) ein 5'-Gen-Kassette, umfassend in operabler Kombination: 1) einen Splice-Akzeptor; 2) eine erste Exon-Sequenz, lokalisiert 3' zu besagtem Splice-Akzeptor, wobei besagtes erstes Exon einen Marker kodiert, der die Identifikation einer Zelle ermöglicht, welche besagtes Exon exprimiert; und 3) eine Polyadenylierungs-Sequenz, welche das 3'-Ende von besagtem ersten Exon definiert;
    • b) eine 3'-Gen-Trap-Kassette, lokalisiert 3' zu besagter Polyadenylierungs-Sequenz, umfassend in operabler Kombination: 1) einen Promotor 2) eine zweite Exon-Sequenz, lokalisiert 3' von und exprimiert durch besagten Promotor, wobei besagtes zweites Exon keine Aktivität verleihende antibiotische Resistenz kodiert; 3) eine Splice-Donor-Sequenz, definierend die 3'-Sequenz des Exons; und
    • c) ein Mutagenese-verstärkendes Mini-Exon, umfassend in operabler Kombination eine Splice-Akzeptor-Stelle, ein Stück einer Exon-Sequenz und einen Splice-Donor, operativ positioniert strangaufwärts von besagtem Splice-Akzeptor;
    wobei besagter Vektor keinen Promotor kodiert, welcher die Expression von besagtem ersten Exon mediatisiert und worin besagter Vektor keine Sequenz kodiert, welche die Polyadenylierung eines mRNA-Transkripts, kodiert durch besagte zweite Exon-Sequenz und exprimiert durch besagten Promotor, mediatisiert.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft die Konstruktion neuer Vektoren, umfassend eine 3'-Gen-Trap-Kassette, welche das hocheffiziente 3'-Gen-Trappen erlaubt. Die vorliegende beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette umfasst in operabler Kombination eine Promotorregion, ein Exon (typischerweise charakterisiert durch ein Translations-Initiations-Kodon und einen offenen Leserahmen und/oder eine internale Ribosom-Eintritts-Stelle), eine Splice-Donor-Sequenz und optional Intron-Sequenzen. Die Splice-Donor-Sequenz (SD) ist operativ positioniert, so dass das Exon der 3'-Gen-Trap-Kassette an die Splice-Akzeptor-Stelle (SA) eines strangabwärts gelegenen Exons gesplict wird oder eines zellulär kodierten Exons. Als solche sollte die 3'-Gen-Trap-Kassette (oder der Gen-Trap-Vektor, inkorporierend selbige) nicht eine Splice-Akzeptor (SA)-Sequenz, sowie eine Polyadenylierungs-Stelle operativ positioniert von der SD-Sequenz der Gen-Trap-Kassette inkorporieren. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Exon-Komponente der 3'-Gen-Trap-Kassette, welche auch als eine Sequenz-Akquisitions-Kassette dient, eine Exon-Sequenz und eine Splice-Donor-Sequenz abgeleitet aus genetischem Material, welcher natürlicherweise in Eukaryonten-Zellen vorkommt, umfassen.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung des beschriebenen Vektors, neue DNA-Sequenz-Information von Gen-getrappten Exons von einer infizierten Target-Zelle oder einer Vielzahl von Target-Zellen zu akquirieren.
  • Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung schließen rekombinante Vektoren, insbesondere virale Vektoren, ein, welche genetisch erzeugt worden sind, um die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette zu inkorporieren. Vorzugsweise, jedoch nicht notwendigerweise, werden diese Vektoren des Weiteren einen auswählbaren Marker inkorporieren, welcher den Erhalt und die Detektion der Vektorsequenzen in der Target-Zelle ermöglicht. Der auswählbare Marker kann eingesetzt werden in Form einer 5'-Gen-Trap-Kassette, welche strangaufwärts von und in der gleichen Orientierung wie die 3'-Gen-Trap-Kassette platziert ist. Optional kann eine 5'-Gen-Trap-Kassette, welche einen auswählbaren Marker inkorporiert, in Zusammenhang mit einer vektorkodierten mutagenen Mini-Exon-Sequenz verwendet werden, welche operabel positioniert ist, inter alia, um das Spicen von zellulären Transkripten an auswählbare Marker der 5'-Gen-Trap-Kassette zu verstärken.
  • Der Vektor enthält eine oder mehrere mutagene Enhancersequenz(en), wie z. B. jedoch nicht limitiert auf eine Sequenz, kodierend eine selbstschneidende RNA, einen Transkriptions-Terminator, ein Exon, welches den Leserahmen ändert (oder ein oder mehrere Stopp-Kodons kodiert), und/oder ein terminales Exon oder irgendeine Mischung oder eine Kombination davon operativ positioniert zwischen der 5'-Gen-Trap-Kassette und der 3'-Gen-Trap-Kassette der offenbarten Vektoren.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der neuen 3'-Gen-Trap-Kassette oder der Vektoren, umfassend dieselbe, um Gene zu mutieren bzw. in einer Population von Target-Zellen oder Geweben, in vitro oder in vivo zu trappen und/oder, um die Polynukleotid-Sequenz unbekannter Gene zu erhalten (d. h. neue Gene zu entdecken). Als solche werden allgemeine Verfahren der Gen-Mutation, -Identifiikation und des Phänotyp-Screenings beschrieben, welche die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette verwenden und Vektoren umfassend dieselben.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung der hier beschriebenen Vektoren (beispielsweise viraler Vektoren, umfassend ein Mini-Exon und/oder eine 3'-Gen-Trap-Kassette), um die Gen-Expression in Target-Zellen zu aktivieren. Vorzugsweise sind die Vektoren retrovirale Vektoren, welche nichtspezifisch integriert in das Target-Zell-Genom (unter Verwendung der viralen Integrationsmaschinerie) sind. Des Weiteren werden Assays beschrieben, welche die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette einsetzen oder Vektoren, inkorpierend selbige, um neue Gene zu aktivieren, genetisch oder phänotyisch auszuwählen und nachfolgend zu identifizieren.
  • Weitere Ausführungsformen der vorliegend beschriebenen Erfindung schließen Bibliotheken von eukaryontischen Zellen ein, welche Gene aufweisen, welche zur gleichen Zeit mutiert (durch eine oder mehrere der beschriebenen mutagenen Komponenten) und identifiziert (unter Verwendung der beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette) unter Verwendung der beschriebenen Vektoren wurden und/oder cDNA-Bibliotheken, erzeugt durch Ausbeuten der Target-Häufigkeit und der Sequenz-Akquisitions-Charakteristika der beschriebenen Vektoren.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zum Erhalten der DNA-Sequenz-Information von einer Target-Zelle, umfassend die Schritte des nicht-spezifischen Integrierens einer 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette (oder eines mutagenen Mini-Exons), des Erhaltens des chimären RNA-Transkripts, erzeugt, wenn die Gen-Trap-Kassette (oder das mutagene Mini-Exon) durch die endogene Splicing-Maschinerie der Target-Zelle an ein endogenes Exon, kodiert innerhalb des Target-Zell-Genoms, gesplict wird, und des Erhalten der Sequenz-Information von dem endogen kodierten Exon des Target-Zell-Genoms.
  • 4. Beschreibung der Figuren
  • 1 präsentiert eine diagrammartige Repräsentation, wie die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette an zellulären Exons gesplict wird, nachdem die Kassette in das Target-Zell-Genom inkorporiert wurde.
  • 2 zeigt einen dualen (5'- und 3'-) Gen-Trap-Vektor, welcher einen auswählbaren Marker in die 5'-Trap sowie die hier beschriebene 3'-Gen-Trap inkorporiert. 2 zeigt auch die Positionen der Rekombinase-Erkennung, beispielsweise frt oder Iox, Stellen, die beispielsweise 5' vom Promotor der 3'-Gen-Trap-Kassette und 3' vom SD der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette lokalisiert werden können, wie auch die bevorzugte Stellen optionaler Charakteristika, wie z. B. eines vektorkodierten mutagenen Mini-Exons, welches strangaufwärts von der 5'-Gen-Trap-Kassette vorliegt, und Mutagenese-Verstärker-Kassetten, wie z. B. eine unidirektionale Transkriptions-Terminations-Sequenz, ein mutagenes terminales Exon und eine selbstschneidende RNA-kodierende Region. Die dargestellten Merkmale sind in reverser Orientierung relativ zu den flankierenden LTRs.
  • 3a und 3b zeigen die Sequenzen von zwei selbstschneidenen RNAs, welche als Mutagenese-Verstärker verwendet werden können.
  • 4 zeigt ein repräsentierendes Beispiel einer mutagenen Mini-Exon-Sequenz, welche in Zusammenhang mit den hier beschriebenen Vektoren verwendet werden kann.
  • 5 zeigt eine Vielzahl synthetischer Exon-Sequenzen, welche in Zusammenhang mit der beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette verwendet werden kann.
  • 5.0. Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • In den modernen Zeiten von Genomics, hat sich das Gen-Trappen als ein Ansatz von hohem Potenzial sowohl für das Gruppieren von Gensequenzen in funktionelle Kategorien als auch das Identifizieren neuer Gene etabliert. Beispielsweise haben erste Ergebnisse gezeigt, dass etwa die Hälfte der Gen-Trap-Ereignisse von den embryonalen Stammzellen, die bisher charakterisiert sind, Gensequenzen identifizieren, die bislang nicht durch traditionelle cDNA-Bibliothek-Technologie entdeckt worden sind.
  • Das Gen-Trappen (unter Verwendung von Promotor-Traps) wurde in einer Vielzahl von Zelltypen verwendet, um genetisch nach Genen zu screenen, welche durch induktive Signale, Differentiationsereignisse oder Phänotypen von Interesse (d. h. bei der Genentdeckung) induziert werden. Des Weiteren wurden solche Screens verwendet, um Tumor-Supressor-Gene, Gene induziert durch zelluläre Differentiations-Prozesse, wie z. B. hämatopoetische und Muskel-Zell-Differentiation, Gene induziert durch Signale, welche zelluläre Ereignisse induzieren, wie z. B. B-Zellaktivität oder Apoptose, und Gene aktiviert durch kleine Moleküle oder andere Verbindungen zu identifizieren. Diese Untersuchungen zeigen an, dass das Gen-Trappen verwendet werden kann, um Gene zu gruppieren, basiert auf ihrer Funktion in wichtigen zellulären und physiologischen Prozessen. Jedoch war die breitere Ausbeutung dieses Screens bislang limitiert durch die Schwierigkeit des Identifizierens der getrappten Gene.
  • Mehrere der Probleme, welche im Allgemeinen adressiert werden müssen, wenn Gen-Trap-Vektoren konzipiert werden, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf: 1) die Prozentzahl des Target-Zellengenoms, das effizient mit einem gegebenen Vektor getrappt werden kann ("Targetgröße"); 2) die Mutagenität des Vektors nach Insertion in ein Gen in einer Target-Zelle; und 3) das Identifizieren des mutierten Gens durch Sequenzieren des chimären Transkripts, erzeugt durch das Gen-Trap-Ereignis. Die vorliegenden Vektoren werden technisch erzeugt, um die oben erwähnten Bedenken zu adressieren, beispielsweise durch Einbringen von Merkmalen, welche die Effizienz der Splice-Akzeptoren optimieren, sowie der Splice-Donoren, welche in den Vektoren vorliegen.
  • 5.1. Die breite Anwendbarkeit der beschriebenen Vektoren
  • Die hier beschriebenen Vektoren können in virtuell jedem Typ von eukaryontischen Zellen verwendet werden können, welche manipuliert werden können, um einen Gen-Trap-Vektor in das Genom der Zelle zu insertieren. Beispielsweise können Vektoren, welche die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette inkorporieren, verwendet werden, um Gene zu trappen und/oder Sequenzinformation von primären tierischen Geweben, wie auch irgendwelchen anderen eukaryontischen Zellen oder Organismen zu akquirieren, einschließend, jedoch nicht limitiert auf Hefe, Bakterien, Pilzen und Pflanzen. Pflanzen von speziellem Interesse schließen Dicots und Monocots, Angiosperma (Mohnblumen, Rosen, Kamelien, etc.), Gymnosperma (Kiefer, etc.), Sorghum, Gräser, wie auch Pflanzen von landwirtschaftlicher Signifikanz, z. B., jedoch nicht limitiert auf, Getreide (Reis, Weizen, Mais, Hirse, Hafer, etc.), Nüsse, Linsen, Kichererbsen, Knollengewächse (Kartoffeln, Süßkartoffeln, Wasserbrotwurzel, etc.), Kräuter, Baumwolle, Hanf, Kaffe, Kakao, Tabak, Roggen, Rüben, Alfalfa, Buchweizen, Heu, Sojabohnen, Bananen, Rohrzucker, Früchte (Zitrusfrüchte und andere), Grapefrucht, Gemüse und Pilze (Champignons, Trüffel, etc.), Palme, Ahorn, Mammutbaum, Kokosnusseibe, Eiche und andere Laub wechselnde und immergrüne Bäume. Alternativ können linearisierte 3'-Gen-Trap-Kassetten in Target-Zellen eigebracht werden, unter Verwendung der beschriebenen konventionellen Verfahren der Nukleotidzufuhr.
  • Weitere Beispiele geeigneter tierischer Target-Zellen schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Säugetier-, einschließend Menschen-, oder Vogel-Endothel-Zellen, Epithelzellen, Inselchen, Neuronen oder neuronales Gewebe, Mesothelzellen, Osteozyten, Lymphozyten, Chondrozyten, hämatopoetische Zellen, Immunzellen, Zellen der Keimbahn oder Organe (beispielsweise Lunge, Herz, Magen, Pankreas, Niere, Haut, etc.), exokrine und/oder endokrine Zellen, embryonale und andere totipotente oder pluripotenete Stammzellen, Fibroblasten und auf Kultur adaptierte und/oder transformierte Versionen der oben genannten Zellen können in Verbindung mit den beschriebenen Vektoren verwendet werden. Des Weiteren können Tumor erzeugende oder andere Zelllinien als Targets für die hier beschriebenen Vektoren verwendet werden.
  • Typischerweise können Vektoren, inkorporierend die hier beschriebenen Merkmale, in Target-Zellen eingebracht werden durch irgendwelche der weitverbreiteten Verfahren, die im Stand der Technik bekannt sind. Beispiele solcher Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Elektroporation, vitale Infektion, Retro-Transposition, Transposition, Mikropartikel-Bombardement, Mikroinjektion, Lipofektion, Transfektion, in Form von kationischen Lipidkomplexen oder als nicht-gepackte/komplexierte oder "nackte" DNA.
  • Die Vektoren, beschrieben in der vorliegenden Erfindung, können auch verwendet werden im Zusammenhang von virtuell irgendeinem Typ von phänotypischen oder genetischen Screening-Protokollen, sowohl in vitro als auch in vivo, und die hier beschriebenen Vektoren stellen den zusätzlichen Vorteil zur Verfügung der Befähigung von raschen Verfahren zum Identifizieren der DNA-Sequenzen der getrappten Gene.
  • 5.2. Strukturelle Merkmale der beschriebenen Vektoren
  • 5.2.1. Markergen
  • Vektoren, angedacht durch die vorliegende Erfindung, können technisch erzeugt werden, so dass sie auswählbare Markergene enthalten, welche die Selektion von Zellen zur Verfügung stellen, welche den Marker im zellulären Genom inkorporiert aufweisen. Im Allgemeinen befähigen solche auswählbare Marker die Realisierung von Verfahren zum Identifizieren und Auswählen eukarontischer Zellen, welche Proteine inkorporieren und exprimieren, kodiert durch die auswählbaren Marker. Beispiele solcher Selektionsverfahren schließen antibiotische, colorimetrische, enzymatische und fluoreszente Selektion von Zellen ein, welche ein Gen-Trap-Ereignis integriert aufweisen. Ein Beispiel solcher selektierbarer Markergene ist βgeo, jedoch kann irgendeiner der Vielzahl anderer auswählbarer Marker eingesetzt werden (beispielsweise siehe US-Patent Nr. 5,464,764).
  • Dementsprechend fokussiert sich eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf Vektoren, welche technisch erzeugt werden, so dass sie ein Markergen inkorporieren und optional exprimieren, welches das Trapping und Identifizieren von Target-Zellen ermöglicht, welche die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette inkorporieren. Solche Marker schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf, antibiotische Resistenzgene, colorimetrische Markergene, Enzyme (beispielsweise β-Lactamase) oder andere Markergene, welche die direkte oder indirekte Expression von beispielsweise fluoreszenten Markergenen, wie z. B. dem Gen kodierend das grünfluoreszierende Protein, mediatisieren, sowie Assays zum Nachweis derselben, welche unter anderem in US-Patent Nr. 5,625,048 beschrieben werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "direkt", wenn ein biologischer oder biochemischer Kontext verwendet wird, auf die direkte Verursachung eines Prozesses, welcher keine Zwischenschritte benötigt, welche üblicherweise durch ein Molekül verursacht werden, welches ein anderes Molekül kontaktiert oder bindet (dieses kann ein Molekül des gleichen Typs oder eines unterschiedlichen Typus an Molekül sein). Beispielsweise kontaktiert Molekül A das Molekül B, was verursacht, dass Molekül B den Effekt X ausübt, welcher Teil eines biologischen Prozesses ist. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bezieht sich der Begriff "indirekt", wenn er in biologischen oder biochemischen Kontext verwendet wird, auf die indirekte Verursachung, welche Zwischenschritte verlangt, üblicherweise verursacht durch zwei oder mehrere direkte Schritte. Beispielsweise kontaktiert Molekül A das Molekül B, so dass der Effekt X ausgeübt wird, welcher wiederum den Effekt Y erzeugt. Auch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll sich der Begriff "Gen" auf irgendwelche und alle diskreten kodierenden Regionen des zellulären Genoms beziehen, wie auch auf assoziierte nicht-kodierende und regulatorische Regionen oder soll sich auf die Region beziehen, welche ein spezifisches und funktionelles Genprodukt oder eine Aktivität kodiert. Des Weiteren soll sich der Begriff "operativ positioniert" auf die Tatsache beziehen, dass die Steuerelemente oder Gene in geeigneter Orientierung und räumlicher Lage vorliegen, um die gewünschten angezeigten Funktionen der Steuer-Elemente oder Gene zur Verfügung zu stellen. Auch für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird ein Gen "exprimiert", wenn ein Steuerungs-Element in der Zelle die Produktion von funktionellen und/oder nachweisbaren Spiegeln von mRNA mediatisiert, welche durch das Gen oder einen auswählbaren Marker insertiert darin, kodiert wird, und welche anschließend gesplict/verarbeitet werden kann, und, wo anwendbar, translatiert werden kann, um ein aktives Produkt zu erzeugen. Ein Gen wird nicht exprimiert, wo ein relevantes Steuerungs-Element in der Zelle fehlt, inaktiviert worden ist oder die Produktion von funktionellen und/oder nachweisbaren Spiegeln von mRNA, kodiert durch das Gen oder eines nachweisbaren Markers insertiert darin, nicht-mediatisiert. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine mRNA in "funktionellen" Spiegeln produziert, falls sie nach Translation ein Protein produziert, welches die Größe und Aktivität aufweist, welche normalerweise mit der korrespondierenden Stelle assoziiert sind.
  • Das Markergen kann in die beschriebene Vektoren eingebracht werden als selbst enthaltene Expressionskassette, einschließend in operabler Kombination einen Marker, einen Promotor zum Exprimieren des Markers, eine Ribosomen-Bindungs/Translationsstart-Stelle und eine Polyadenylierungs-Sequenz. Des Weiteren kann der Marker im Vektor platziert werden, so dass er von einem Vektor-Promotor exprimiert werden wird, und kann optional technisch erzeugt werden, um funktionell eine unabhängige Ribosomen-Enzym-Eintrittsstelle (independent ribosome entry site, IRES) zu inkorporieren, was die Markerexpression gewährleistet.
  • 5.2.2. 5'-Gen-Trap-Kassette
  • Die vorliegenden beschriebenen Vektoren können technisch erzeugt werden, so dass sie eine 5'-Gen-Trap-Kassette enthalten, welche typischerweise eine Splice-Akzeptor-Stelle 5' lokalisiert zu einem Exon enthält (welches ein auswählbares Markergen kodieren kann), gefolgt von einer operativ positionierten Polyadenylierungs-Sequenz. Typischerweise enthalten Vektoren, welche 5'-Gen-Traps inkorporieren, keine Promotoren, welche das Exon, kodiert, in der 5'-Gen-Trap-Kassette, exprimieren und sie kodieren keine Splice-Donor-Sequenz, operativ positioniert 5' zum Splice-Akzeptor des Exons der 5'-Gen-Trap-Kassette. Konsequenterweise unterbricht die 5'-Gen-Trap-Kassette, nachdem sie in das zelluläre Chromosom integriert worden ist, das normale Splicen der strangaufwärts liegenden Gens und fungiert als ein terminales Exon. Der Nettoeffekt ist, dass das zelluläre Transkript zerstört wird und effizient durch die 5'-Gen-Trap-Kassette mutagenisiert wird. Die 5'-Gen-Trap-Kassette kann ein Markergen inkorporieren, als Exon-Komponente und kann folglich anstelle des oder zusätzlich zum Markergen beschrieben in Sektion 5.2.1 verwendet werden.
  • Die strukturellen Eigenschaften der 5'-Gen-Trap-Kassette können auch so manipuliert werden, dass sie Gen-Trap-Ereignisse erzeugen, welche davon abhängen, wo die 5'-Gen-Trap in das zelluläre Genom integriert hat (aus Gründen der Erläuterung und nicht der Begrenzung soll die folgende Diskussion annehmen, dass das Exon der 5'-Gen-Trap-Kassette einen auswählbaren Marker kodiert). Beispielsweise kann, setzt man voraus, dass, wenn kein Promotor vorliegt, der Marker, kodiert durch eine 5'-Gen-Trap-Kassette (welche technisch erzeugt worden ist ohne ein IRES) typischerweise nur exprimiert wird, falls er in ein Intron 5' von der Translationsstart-Stelle des endogenen Gens integriert hat. Setzt man die Abwesenheit des IRES voraus, kann, falls der Vektor, welcher eine solch 5'-Gen-Trap-Kassette inkorporiert, in ein Intron integriert hat, das strangabwärts von der Translationsstart-Stelle des endogenen Gens gelegen ist, der Marker nur exprimiert werden, falls er im korrekten Leserahmen vorliegt, um so ein Fusionsprotein zu erzeugen, welches auswählbare Markeraktivität zur Verfügung stellt.
  • Dementsprechend können Vektoren, welche solche 5'-Gen-Trap-Kassetten inkorporieren, selektiv die Wahrscheinlichkeit auswählen, dass die identifizierten Gen-getrappten Sequenzen mit Sequenzen 5' zum Start der Translation beginnen.
  • Ein alternatives Verfahren des Erzeugen eines ähnlichen Effekts setzt Vektoren ein, welche einen verschachtelten Satz von Stopp-Kodons, vorliegend in oder anderweitig technisch eingebracht in der (die) Region zwischen dem SA der 5'-Gen-Trap-Kassette und dem Translations-Initiations-Kodon des auswählbaren Markers inkorporieren, oder solche Stopp-Kodons können zwischen dem Ende der für den auswählbaren Marker kodierenden Region und der Polyadenylierungs-Sequenz lokalisiert sein. Der auswählbare Marker kann auch technisch erzeugt werden, so dass er eine unabhängige Ribosom-Eintrits-Stelle (IRES) enthält, so dass der Marker in einer Art und Weise exprimiert werden wird, die größtenteils unabhängig von der Stelle ist, in welche der Vektor in das Target-Zell-Genom integriert hat. Typischerweise, jedoch nicht notwendigerweise, wird ein IRES nicht im Zusammenhang mit einem verschachtelten Satz von Stopp-Kodons, wie oben beschrieben, verwendet.
  • In einer speziell bevorzugten Ausführungsform setzen die beschriebenen Vektoren eine 5'-Gen-Trap-Kassette ein, welche ein auswählbares Markergen umfasst, dem eine Splice-Akzeptor-Sequenz vorangeht, und eine Polyadenylierungs (pA)-Sequenz (SAβgeopA, 2) folgt. Alternativ kann SAIRESβgeopA verwendet werden, welche des Weiteren eine internale Ribosomen-Eintritts-Stelle strangaufwärts von dem βgeo-Gen inkorporiert bzw. es kann auch SAneopA verwendet werden (welches sich mit der β-gal-Aktivität verbreitet). Die oben genannten 5'-Gen-Trap-Kassetten können in effizienter Art und Weise Gene mutieren und verwendet werden, so dass sie der Expression der getrappten Gene folgen. Das Optimieren der verwendeten SA-Sequenz kann des Weiteren die Effizienz der 5'-Gen-Trap-Kassette erhöhen oder regulieren. Beispiele geeigneter SA-Sequenzen schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf:
    Figure 00140001
  • Irgendwelche der oben genannten SA-Sequenzen können verwendet werden im Zusammenhang mit beispielsweise SAneopA oder SAIRESneopA.
  • Polyadenylierung (polyA oder pA)-Stellen, welche verwendet werden können in Zusammenhang mit der beschriebenen 5'-Gen-Trap-Kassette schließt ein, sind jedoch nicht limitiert auf synthetische/Konsensus-Polyadenylierungs-Stellen, Derivate von Kaninchen-Beta-Globulin polyA, SV40 Triple-polyA, Rinderwachstumshormon-polyA und Sequenzen, welche ähnliche Funktionalität zur Verfügung stellen. In einer bevorzugten Ausführungsform soll die polyA-Stelle eine Transkriptions-Terminations-Funktion inkorporieren und vorzugsweise einen unidirektionalen (im Gegensatz zum bidirektionalen) Transkriptions-Terminator, welcher operativ relativ zur auswählbaren Sequenz in der 5'-Gen-Trap-Kassette positioniert ist.
  • Optional kann die 5'-Gen-Trap-Kassette durch geeignete Rekombinase-Stellen (beispielsweise lox P, frt, etc.) flankiert sein. In solch einer Ausführungsform wird eine Rekombinase-Stellen-flankierte 5'-Gen-Trap-Kassette in Verbindung mit einer zweiten 5'-Gen-Trap-Kassette (welche strangabwärts von der 3'-Rekombinase-Stelle vorliegt) verwendet werden, welche einen nachweisbaren Marker kodiert, einen davon verschiedenen auswählbaren Marker oder einen enzymatischen Marker (wie z. B., jedoch nicht limitiert auf, grün fluoreszierendes Protein, β-Lactamase, TK, Blasticidin, HPRT, etc.) und welche vorzugsweise nicht durch die gleichen Rekombinase-Stellen der ersten 5'-Gen-Trap-Kassette flankiert wird. Im Falle, dass beide der 5'-Gen-Trap-Kassetten nicht in akzeptablen Spiegeln exprimiert werden (via alternatives Splicing) kann die zweite 5'-Gen-Trap-Kassette (welche einen nachweisbaren Marker kodiert) "aktiviert" werden durch Verwendung einer geeigneten Rekombinase-Aktivität (d. h. cre, flp, etc), in vitro oder in vivo, um die erste (Rekombinase-Stellen-flankierte) 5'-Gen-Trap-Kassette zu entfernen.
  • 5.2.3. Mutagenese-Verstärker (Enhancer)
  • Um des Weiteren das Splicing und die Expression des Exons, kodiert innerhalb einer mutagenen 5'-Gen-Trap-Kassette, zu verstärken, werden zusätzliche Merkmale zu den beschriebenen Vektoren hinzugefügt: ein mutagenes Mini-Exon (siehe 4), optional natürlicherweise auftretend, wird operativ strangaufwärts von der 5'-Gen-Trap-Kassette positioniert. Diese mutagene Mini-Exon umfasst minimal in operabler Kombination eine Splice-Akzeptor (SA)-Stelle, ein Stück einer Exon-Sequenz und einen Splice-Donor (SD). Eine operative Polyadenylierungsstelle ist nicht direkt mit dem mutagenen Mini-Exon assoziiert, da das Exon nicht dazu gedacht ist, dass es als terminales 3'-Exon dient. Das mutagene Mini-Exon fungiert durch Unterbrechen des Splicings eines zellulär induzierten Transkripts in dem Gebiet strangaufwärts von und in der Umgebung der SA-Stelle der 5'-Gen-Trap/des auswählbaren Markers. Durch Rekrutieren der zellulären Splice-Maschinerie auf diese Region wird der SA der 5'-Gen-Trap-Kassette leichter erkannt und verwendet, was unter anderem effizient die Mutagenität bei der Expression der 5'-Gen-Trap-Kassette verstärkt.
  • Je nachdem, ob das mutagene Mini-Exon in Verknüpfung mit einer 5'-Gen-Trap-Kassette verwendet wird oder nicht, wird es vorzugsweise 3N + 1 – oder 3N + 2-Basen aufweisen, um den Leserahmen irgendeinen nativen Gens oder Exons, in welches es gesplict worden ist, zu alternieren oder zu verändern. Alternativ, jedoch weniger bevorzugt, können mutagene Mini-Exons Stopp-Kodons in alle drei Leserahmen inkorporieren, was das Problem beseitigen würden, dass das Exon nicht eine 3N-Zahl an Nukleotiden enthält. Durch Einbringen von Rahmen-Verschiebungs-Mutationen (d. h. Inserts mit 3N+/– 1-Basen, welche die SA-SD-Region des mutagenen Mini-Exons aufspannen), kann man auch zelluläre Transkripte beim "Herumsplicen", um ein integriertes Gen-Trap-Konstrukt behindern oder selbiges verhindern, sowie beim Produzieren des funktionellen Proteinprodukts. In solchen Fällen wird das Variieren der SA- und/oder SD-Sequenzen des mutagenen Mini-Exons eine korrespondierende Variation in der Effizienz des Splice-Eingriffs (d. h. der effizienten Mutagenese) erzeugen. Als solche stellen die hier beschriebenen mutagenen Mini-Exons (oder mutagene Mini-Exons) auch einen effizienten Mechanismus zum Regulieren der Genexpressionen einer Zelle oder eines Tieres zur Verfügung. Wie bei essentiell allen der mutagenen oder regulatorischen Merkmalen der beschriebenen Vektoren können die beschriebenen mutagenen Mini-Exons geeignet flankiert sein durch Rekombinase-Stellen, um die rasche und in einigen Fällen gewebsspezifische Entfernung der mutagenen Mini-Exon-Sequenz zu ermöglichen.
  • Kompositorische und strukturelle Zwänge, ähnlich zu denjenigen wie oben diskutiert, können auch verwendet werden, um Mini-Exons zu konzipieren zur Anwendung in Verbindung mit 3'-Gen-Trap-Kassetten (wie unten beschrieben), welche zelluläre Genexpression aktivieren.
  • Optional kann das mutagene Mini-Exon als eine kombinierte mutagene Gen-Trap-Kassette und Sequenz-Akquisitions-Komponente verwendet werden, welche an Stelle von oder zusätzlich zu den beschriebenen 5'- und 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassetten fungiert. In solch einem Konstrukt wird der SA des mutagenen Mini-Exons durch ein Promotor-Element ersetzt und das mutagene Mini-Exon kann als Sequenz-Akquisitions-Komponente dienen, welche unabhängig von der endogenen Expression des getrappten Gens operiert (anstelle von oder zusätzlich zu der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette). Des Weiteren kann das mutagene Mini-Exon durch Rekombinase-Stellen flankiert sein, welche die selektive oder konditionierte Entfernung des mutagenen Mini-Exons ermöglichen.
  • Weitere strukturelle Modifikationen können eingesetzt werden, um die mutagene Effektivität der beschriebenen Gen-Trap-Vektoren zu verstärken. Solche Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf: 1) Modifizieren/Optimieren der Sequenz an der oder flankierend die Verzweigungspunkt-Sequenz und die flankierenden Regionen der SA-Stelle der 5'-Gen-Trap-Kassette, um das Splicen der 5'-Gen-Trap-Kassette durch eine gegebene Target-Zelle zu realisieren (idealerweise wird die SA-Region natürlicherweise in der Target-Zelle auftreten oder eine Konsensus-SA-Region sein); 2) Platzieren eines terminalen 3'-Exons (SA-Exon-polyA/Transkriptions-Terminator), vorzugsweise natürlicherweise auftretend, operativ positioniert strangaufwärts von der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette (optional zwischen den beschriebenen 5'- und 3'-Gen- Trap- Kassetten); 3) Platzieren einer unidirektionalen Transkriptions-Terminations-Sequenz, operativ positioniert strangaufwärts von der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette (optional zwischen den beschriebenen 5'-und 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassetten, und vorzugsweise strangabwärts von dem terminalen 3'-Exon; und 4) Einbringen einer selbst-schneidenden RNA-Sequenz in den Vektor in einer funktionellen Orientierung, strangaufwärts von der 3'-Gen-Trap-Kassette (und vorzugsweise strangabwärts von der 5'-Gen-Trap-Kassette und optional an jeder Seite von irgendeinem des natürlich vorkommenden terminalen 3'-Exons oder des unidirektionalen Transkriptions-Terminators, welche in einem der beschriebenen Gen-Trap-Konstrukte vorliegen können), welche des Weiteren die Möglichkeit verringert, dass ein zellulär induziertes Transkript um einen Vektor kodiertes Gen-Trap-Element "herumsplict".
  • Zelluläres Splicen von endogen eingebrachten oder fremden Exons kann auch verstärkt werden durch Einbringen von Kassetten, welche kleine nukleare RNA und/oder kleine nukleare Ribonukleoproteine kodieren, die technisch erzeugt wurden, um die Splice-Effizienz einer exogen eingebrachten Gen-Trap-Kassette oder einer mutagenen Mini-Exon-Kassette zu verstärken.
  • Mehrere der oben genannten Merkmale (beispielsweise das 3'-terminale Exon und der Transkriptions-Terminator, etc.) verstärken auch die Effizienz der Sequenzakquisition durch die 3'-Gen-Trap-Kassette durch Verhindern des Fortlaufens der Transkriptions/Promotorwechselwirkung, welche die Expression der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette behindern kann. Des Weiteren ist, wo retrovirale Vektoren eingesetzt werden, die Orientierung von mehreren der oben genannten Merkmale insbesondere wichtig, geht man von der Tatsach aus, dass einige der strukturellen Elemente die Expression und das Verpacken des retroviralen RNA-Genoms behindern, falls nicht verhindern würden.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung fasst das Platzieren der Rekombinase-Stellen flankierend eine oder mehrere der Mutagenese-Verstärker-Regionen oder irgendwelche andere Gen-Trap – oder andere Kassetten oder Teile der beschriebenen Vektoren ins Auge. Unter Verwendung dieser Anordnung kann virtuell irgendein Teil des Vektors, der durch Rekombinase-Stellen flankiert ist, konditioniert aktiviert werden oder deaktiviert werden durch Exponieren einer Zelle, welche solch ein Konstrukt beherbergt, gegen die korrespondierende Rekombinase-Aktivität. Optional können verschiedene Mutagenese-Verstärker-Regionen, wie z. B. die mutagene Mini-Exon-Kassette und der Transkriptions-Terminator, sowie die selbst-schneidende RNA-Kassette, durch verschiedene Rekombinase-Stellen flankiert werden, welche die unabhängige Modulation oder die Funktion von einer oder beider dieser Komponenten ermöglichen werden. Unter Verwendung solch einer Anordnung in Verbindung mit einer strangabwärts gelegenen 5'-Gen-Trap-Kassetten-mutagenen Enhancer-Sequenz kann die 5'-Gen-Trap "aktiviert werden" durch die Rekombinase-mediatisierte Entfernung der mutagenen Enhancer (Verstärker)-Sequenz.
  • Als ein schnelles Mittel zum Nachweis, ob ein gegebener Integrationsort ermöglichen kann, dass die Zelle in effizienter Art und Weise um eine gegebene 5'-Gen-Trap-Kassette "herumsplicen" kann, kann eine zweite 5'-Gen-Trap-Kassette, einbringend einen unterschiedlichen auswählbaren oder enzymatisch oder fluoreszent nachweisbaren Marker, eingebracht im Tandem mit und strangabwärts von der ersten 5'-Gen-Trap-Kassette eingebracht werden. Durch Screenen oder Auswählen der Expression sowohl der ersten als auch der zweiten 5'-Gen-Trap-Kassetten kann man rasch das Ausmaß bestimmen, in welchem eine Zelle, welche solch einen Vektor inkorporiert, möglicherweise um die erste 5'-Gen-Trap-Kassette "herumsplict". Die zweite 5'-Gen-Trap-Kassette kann auch entweder strangaufwärts oder strangabwärts von irgendwelcher Mutagenese-Verstärker-Sequenzen positioniert werden, welche in einem gegebenen Vektor vorliegen, um die Effektivität der Mutagenese-Enhancer-Sequenz zu bestimmen.
  • Alternativ kann das Exon der zweiten 5'-Gen-Trap-Kassette beispielsweise das Thymidinkinase (TK)-Gen kodieren. Unter Verwendung solcher Konstrukte kann beispielsweise FIAU verwendet werden, um gegen Zellen auszuwählen, welche um die erste oder "mutagene" 5'-Gen-Trap-Kassette "herumsplicen". Im Allgemeinen werden die zweiten 5'-Gen-Trap-Kassetten in den Vektor strangabwärts in den Mutagenese-Verstärker-Sequenzen eingebracht und strangaufwärts von der 3'-Gen-Trap-Kassette. Optional kann eine der beiden Tandem-5'-Gen-Trap-Kassetten durch geeignet orientierte Rekombinase-Stellen flankiert werden, welche das nachfolgende spezifische Entfernen der 5'-Gen-Trap-Kassette ermöglichen. Unter Verwendung solch einer Strategie kann ein erstes 5'-Gen-Trap-Exon (beispielsweise kodierend neo-Restistenz) entfernt werden unter Verwendung einer geeigneten Rekombinase- Aktivität, um Effizienz das Splicing und die Expression der zweiten 5'-Gen-Trap-Kassette "zu aktivieren", welche (speziell, wenn sie einen geeigneten Marker/eine Signalaktivität, wie z. B. B-gal, grün flureszierendes Protein, etc. kodiert) verwendet werden kann, um die Expression des getrappten Gens im Gewebe zu verfolgen und zwar in Zellen und Gewebe-Proben unter Verwendung etablierter Verfahren.
  • In einer weiteren Ausführungsform kann der Gen-Trap-Vektor der Erfindung eine 5'-Gen-Trap-Kassette enthalten mit einem auswählbaren Marker und eine 3'-Gen-Trap-Kassette. Unter Verwendung dieses Vektors kann man gegen das "Herumsplicen" durch Wachsen der Zellen, in welche der Vektor eingebracht worden ist, unter Bedingungen, welche auf das Vorliegen und die Expression des Markers in der 5'-Gen-Trap-Kassette auswählen, auswählen.
  • 5.2.4 Trans-fungierende mutagene Elemente
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält Vektoren, welche technisch erzeugt wurden, um Produkte zu kodieren und zu exprimieren, welche die Funktion oder Expression des korrespondierenden nicht veränderten Allels durch Antisense oder Ribozym-Abschneiden reduzieren. Beispielsweise könnten solche Vektoren ein Promotor-Element enthalten, vorzugsweise induzierbar oder konditional, welches ein Antisense-Transkript lenkt, welches in dem Teil des Target-Zell-Genoms liegt, welcher den integrierten Vektor flankiert. Möglicherweise wird ein solcher induzierbarer Promotor technisch erzeugt werden, um in dem integrierten Provirus in der Region 3' zur R-Region und 5' zu dem 3'-terminal invertierten Repeat des retroviralen LTR vorliegen (beispielsweise an der Nhe l-Stelle lokalisiert innerhalb von 75 Basen der terminalen invertierten Repeat-Sequenzen; diese und andere Restriktions-Stellen in dem LTR können auch modifiziert werden, um einzigartige oder seltene Restriktions-Stellen zu invertieren). Alternativ kann solch ein Promotor durch Rekombinase-Stellen flankiert werden und in einer reversen Orientierung (relativ zu dem LTR) platziert werden und nachfolgend aktiviert werden (durch Rekombinase-mediatisiertes "Flipping") unter Verwendung der geeigneten Rekombinase-Aktivität. Im Allgemeinen können Antisense-Strategien oder Charakteristika ähnlich zu denjenigen beschrieben in US-Patent Nr: 5,679,523 in die hier beschriebenen Vektoren inkorporiert werden. Wo die Verwendung von Ribozymen und katalytischen RNAs beabsichtigt ist, können Ribozyme technisch erzeugt werden, welche transkribiert und beigefügt werden an die (via Splicing oder Cotranskription) und vorzugsweise zielgerichtet werden auf die zellulär transkribierten Transkripten. Ribozym-Verfahren sind auch adaptierbar auf die oben beschriebene Rekombinase-Strategie.
  • Als ein alternatives Mittel zum Erzeugen von funktional homozygoten mutierten Zellen können die beschriebenen mutagenen Vektoren eingesetzt werden in Verknüpfung mit traditionellen mutagenen Methoden (d. h. Bestrahlung, chemischer Mutagenese, UV-Licht, "Bulky"-Additions-Produkten, Deletions-Mutagenese, Insertions-Mutagenese, Frame-Shift-Mutagenese und Transitions-und Transversions-Mutagenese, etc.). Geeignete mutagenisierte Zellen, beispielsweise eine Serie von Target-Zellen, enthaltend große und vorzugsweise überlappende Region von deletierter chromosomaler DNA verstärken die Wahrscheinlichkeit, dass ein gegebenes Mutations-Ereignis, erhalten mit den beschriebenen Vektoren, effizient sich selbst als ein homozygotes Knockout-Ereignis manifestieren wird.
  • 5.2.5 3'-Gen-Trap-Kassette
  • Die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette umfasst in operativer Kommunikation eine Promotorregion, welche die Expression eines Exons mediatisiert sowie eine operatives Splice-Donor (SD)-Sequenz, welche das 3'-Ende des Exons definiert. Nach Integration in das Target-Zell-Chromosom wird das Transkript, exprimiert durch den 3'-Gen-Trap-Promotor, gesplict durch eine Splice-Akzeptor (SA)-Sequenz eines getrappten zellulären Exons, lokalisiert strangabwärts von der integrierten 3'-Gen-Trap-Kassette.
  • Wie oben beschrieben enthält die 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette einen Promotor, welche die Expression von einem oder mehreren Exons steuert (optional kodierend einen oder mehrere offene Leserahmen), auf welche(s) eine Splice-Donor-Sequenz (1) folgt. Irgendeine Zahl von transkriptionellen Promotoren und Verstärkern kann eingebracht werden in die 3'-Gen-Trap-Kassette, einschließend, jedoch nicht limitiert auf zell- oder gewebsspezifische Promotoren, den Herpes simplex-Thymidin-Kinase-Promotor, Cytomegalovirus (CMV)-Promotor/Verstärker, SV40-Promotren, PGK-Promotor, regulierbaren Promotoren (beispielsweise Metallothionein-Promotor), Adenovirus später Promotor, Vaccinavirus 7,5K-Promotor, Vogel (beispielsweise Huhn, etc.)-Beta-Globin-Promotor, Histon-Promotoren (beispielsweise Maus-Histon H3-614, etc.), Beta-Aktin-Promotor (vorzugsweise Huhn), Metallothionein-Promotoren (vorzugsweise Maus-Metallothionein Iund II) und dergleichen, wie auch irgendwelche Permutationen und Varianten davon, welche hergestellt werden können unter Verwendung wohletablierter molekularbiologischer Techniken (siehe im Allgemeinen Sambrook et al (1989) Molecular Cloning Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, und Current Protocols in Molecular Biology (1989) John Wiley & Sons, alle Vols. und laufende Updates davon). Promotor/Verstärker-Regionen können auch ausgewählt werden, um gewebsspezifische Expression zur Verfügung zu stellen.
  • Vorzugsweise wird das Exon (oder die Exons) der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette konzipiert, so dass es (sie) ein erstes Exon eines Gens im Hinblick auf die Funktion dieses ersten Exons mimt(mimen). In bestimmten Ausführungsformen ist eine 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette, welche ein erstes Exon eines Gens mimt, vorzugsweise zumindest gleich gut durch die Splice-Maschinerie der Zelle zu erkennen. In bestimmten Ausführungsformen hat ein Exon, welches für die 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette der vorliegenden Erfindung geeignet ist, kein Stopp-Kodon. Des Weiteren ist in bestimmten Ausführungsformen ein bevorzugtes Exon klein, d. h. ungefähr gleich mit einer durchschnittlichen Größe eines ersten Exons eines Gens, exprimiert in dem Zelltyp und vorzugsweise nicht weniger als ungefähr die Hälfte oder ein Viertel dieser Längen vorzugsweise nicht mehr als ungefähr das Doppelte, das Dreifache oder das Vierfache dieser Länge.
  • Im Allgemeinen werden das Exon oder die Exons (und Teile des Introns folgend auf das/die Exon(s) gemäß den bestimmten Ausführungsformen) sowie die Splce-Donor-Sequenz von einem natürlich vorkommenden Gen abgeleitet; jedoch können synthetische Exons konzipiert, um ein natürlich vorkommendes Exon zu mimen, auch verwendet werden. Ein synthetisches Exon weist eine andere Sequenz im Vergleich zu natürlich vorkommenden Exons auf. Eine natürlich abgeleitete Exon-Sequenz ist eine Exon-Sequenz, welche in der Natur existiert. Ein synthetisches Exon kann konzipiert werden und konstruiert werden de novo oder modifiziert existierende Exons in der einen oder anderen Weise. Ein synthetisches Exon, bedeutsam für die Vektoren der vorliegenden Erfindung kann beispielsweise eine hoch effiziente oder Konsensus-Ribosom-Bindungs-Stelle oder eine IRES-Sequenz, 5' zum Translations-Initiations-Kodon ei nes offenen Leserahmens oder Exons, enthalten. Alternativ kann man beispielsweise einen offenen Leserahmen erzeugen, die Kodon-Verwendung optimieren, eine oder mehrere Restriktions-Stellen konzipieren, welche die Aminosäuresequenz, kodiert durch den offenen Leserahmen, nicht ändern oder eine alternative oder Konsensus-Splice-Donor-Sequenz in das Exon technisch einbringen. Typischerweise sollte solch eine synthetisch abgeleitete Exon-Sequenz nicht natürlicherweise vorkommen oder noch typischer sollte sie nicht von natürlich vorkommenden DNA-Sequenzen abgeleitet werden.
  • Ein speziell bedeutendes Merkmal gemäß den bestimmten Ausführungsformen der hier beschriebenen Vektoren ist eine 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette, welche ein Exon einsetzt, das nicht für antibiotische Resistenz- oder andere auswählbare Marker bzw. Aktivität kodiert (beispielsweise ein antibiotische Resistenzgen). Bereits früher erwähnte Gen-Trap-Vektoren haben auswählbare Markersequenzen verwendet.
  • Wie hier diskutiert stellen 3'-Gen-Trap-Kassetten, welche offene Leserahmen oder auswählbare Marker-Sequenzen von nicht-eukaryontischem Ursprung inkorporieren, typischerweise eine merklich reduzierte Effizienz des 3'-Exon-Trappens dar. Konsequenterweise verstärken Vektoren, welche die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette einsetzen, welche keine solchen Markersequenzen einschließen, in starkem Maße die Anzahl der Target-Gene, welche getrappt werden können und leicht identifiziert werden können durch Gen-Trap-Sequence-Trapping.
  • Gemäß bestimmter Ausführungsformen ist das Exon der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette (einschließend der SD-Stelle) vorzugsweise ähnlich oder homolog zur Nukleinsäuresequenz, welche nativ für eine Eukaryonten-Zelle ist. Das Exon kann auch ähnlich oder homolog zu einer Sequenz sein, die sich in einem tierischen oder pflanzlichen Virus findet oder zu einer Sequenz, die natürlicherweise in der Target-Zelle auftritt oder dem Genom von Zellen von einer Spezies verwendet zu der Target-Zelle oder einer Familie, Ordnung, Klasse, Fühlung oder einem Reich, verwandt mit denjenigen der Target-Zelle. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung wird eine homologe Sequenz definiert als eine Nukleinsäure-Sequenz, welche in der Lage ist, an eine Target-Sequenz unter hochstringenten Bedingungen zu hybridisieren, beispielsweise Hybridisierung an Filter gebundene DNA in 0,5 M NaHPO4, 7% Natriumdodecylsulfat (SDS), 1 mM EDTA bei 65°C und Waschen in 0,1 × SSC/0,1% SDS bei 68°C (Ausubel F.M. et al., Hrsg., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., und John Wiley & Sons, Inc., New Qork, at p. 2.10.3) oder möglicherweise unter weniger stringenten Bedingungen, wie z. B. moderat stringenten Bedingungen, beispielsweise Waschen in 0,2 × SSC l 0,1% SDS bei 42°C (Ausubel et al., 1989, supra). Optional ist das Exon isogen zur Sequenz im Target-Zell-Genom.
  • Wo das Target-Zell-Genom ein Gen identisch (oder korrespondierend mit) dem Exon der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette enthält, wird das natürlich vorkommende Gen in bestimmten Ausführungsformen vorzugsweise nicht durch die Target-Zelle in Spiegeln exprimiert, welche substanziell mit der Amplifikation und dem Sequenzieren der getrappten Exon-Sequenzen in der Target-Zelle wechselwirken oder diese verhindern. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "substanziell mit der Amplifikation und dem Sequenzieren wechselwirken" sich auf die Tatsache beziehen, dass die endogene Expression des natürlich vorkommenden Exons die Effizienz der Amplifikation und des Sequenzierens der getrappten Exon-Sequenz durch 3' RACE-Protokolle oder optional durch konventionelles Klonieren und Sequenzieren reduzieren kann, ohne sie insgesamt zu verhindern. Weitere Verfahren des Umgehens dieser möglicher Komplikation schließen das Einbringen einer einzigartigen Sequenz innerhalb des ansonsten natürlich vorkommenden Exons der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette ein, welche als eine PCR-Priming-Stelle verwendet werden kann, oder eine 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette mit einem Exon, welches nicht natürlicherweise in dem Target-Zell-Genom vorkommt.
  • Das Exon der hier beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette kann oder kann nicht eine Translations-Start-Stelle und/oder einen offenen Leserahmen enthalten. Optional kann irgendein offener Leserahmen (können irgendwelche offene Leserahmen), der in dem Exon vorliegt (die in dem Exon vorliegen), technisch erzeugt werden, so dass er Kodons inkorporiert, welche optimiert worden sind, um den bevorzugten Kodon – Gebraucht zu reflektieren.
  • Geht man davon aus, dass das Exon der hier beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette vorzugsweise Sequenzen umfasst, welche nativ für eine Eukaronten- oder vorzugsweise Säugetierzelle sind, wird das Exon typischerweise nicht eine Sequenz von prokaryontischem Ursprung konstituieren. Des Weiteren wird das Exon typischerweise nicht einen Marker konstituieren, welcher ein Protein kodiert mit einer antibiotischen Resistenz-Aktivität (wie z. B. neo, amp, z. B., β-Lactamase, tet, kan und dergleichen) oder welches anderweitig auswählbare Wirkstoffresistenz oder Sensitivität der Wirtszelle verleiht (obwohl solch ein Marker optional beispielsweise an die 5'-Region des Exons angeheftet werden kann). Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist ein Gen oder ein Genprodukt in der Lage, antibiotische Resistenz "zu verleihen", falls ein Gen ein Genprodukt kodiert, mit einer Aktivität, welche einen auswählbaren Wachstumsvorteil für die Prokaryonten- oder Eukaryonten-Zelle zur Verfügung stellt, exprimierend das antibiotische Resistenzgen in Medien enthaltend geeignete Konzentrationen des korrespondierenden Antibiotikums.
  • Alternativ wird das Exon im Allgemeinen keine enzymatische Aktivität kodieren bzw. kein Reportergen, welches die auswählbare Detektion über gut bekannte konventionelle chromogene oder fluoreszierende Assays (beispielsweise β-Galactoseoxidase, alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Oxidase) mediatisiert, welche nicht nativ für die, vorzugsweise Säugetier-, Target-Zelle ist. Des Weiteren sollen die hier beschriebenen Vektoren vorzugsweise keinerlei Regionen der Target-DNA-Sequenz enthalten (d. h. zum Steuern des Gen-Targetings der 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette an einen speziellen genetischen Ort über homologe Rekombination), welche die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette flankiert.
  • Des Weiteren kann, geht man davon aus, dass die Splice-Donor-Aktivität durch Intron-Sequenzen beeinflusst werden kann, welche strangabwärts von der Splice-Donor-Stelle liegen, die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette optional technisch erzeugt werden, so dass sie zwischen ungefähr einer Base und ungefähr mehreren Tausend Basen an Intron-Sequenzen, benachbart 3' zur Splice-Donor-Sequenz enthält.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung bezieht sich auf das technische Erzeugen einer 3'-Gen-Trap-Kassette, umfassend ein synthetisch abgeleitetes Exon. Typischerweise wird solch eine Exon-Sequenz eine synthetisch konstruierte Konsensus-Splice-Donor-Region und eine strangaufwärts gelegene Region einer synthetischen "Exon"-Sequenz inkorporieren (d. h. eine Sequenz nicht abgeleitet von einer natürlich vorkommenden Exon-Sequenz). Beispiele solcher synthetischer Exons schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf, Epitop-Tags oder geeignete Derivate (d. h., solche, die keinen Splice-Akzeptor inkorporieren) der hier beschriebenen Mini-Exon-Sequenzen. Ein wünschenswertes Merkmal solcher synthetischer Exon-Sequenzen ist, dass sie technisch erzeugt werden, um nicht ein Stopp-Kodon zu kodieren, welches in nachteilhafter Art und Weise die Splice-Donor-Funktion beeinflussen kann. Beispiele solcher Exon-Sequenzen sind in 5 gezeigt. 5 stellt die synthetischen Exons fett dar, welche mit dem AGGT der Splice-Donor-Stelle enden, wobei die 3'-flankierende "Intron"-Sequenz, in normalem Text dargestellt ist. 5 zeigt auch synthetische Exons, welche generisch viele der wünschenswerten Merkmale der Exons der beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette einbringen. Beispielsweise kann das generische synthetische Exon ein Translations-Initiations-Kodon enthalten oder nicht, kann das Exon technisch erzeugt werden, so dass es variabel an Länge ist und vorzugsweise sollte das synthetische Exon kein Stopp-Kodon enthalten. Nach der Splice-Donor-Stelle kann eine flankierende 3'-Intron-Sequenz synthetisch oder von einer Intron-Sequenz von natürlich vorkommenden eukaryontischen und vorzugsweise Säugetier-Quellen abgeleitet werden.
  • 5.3 Anwendungen der beschriebenen Vektoren
  • Vektoren, welche die beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassetten inkorporieren sind dadurch charakterisiert, dass sie eine merkliche Verbesserung in der Effizienz des 3'-Gen-Trappens zeigen. Als solches ist eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette sowie Vektoren, welche selbige inkorporieren, welche charakterisiert sind durch die Fähigkeit des Trappens von 3'-Exons mit zumindest 15% der Effizienz, mit welcher eine ähnlich situierte SAβgeo-5'-Gen-Trap-Sequenz (oder SAneo-5'-Gen-Trap-Kassette) 5'-Exons trappt, zumindest ungefähr 25%, mehr bevorzugt zumindest ungefähr 40%, mehr bevorzugt zumindest ungefähr 60% und am meisten bevorzugt zumindest ungefähr 85% dieser Effizienz. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ist eine ähnlich situierte Gen-Trap-Kassette eine Kassette, welche in ähnlicher Orientierung innerhalb eines ähnlichen Vektors vorliegen. Alternativ können ähnlich situierte Gen-Trap-Kassetten beide im gleichen Vektor vorliegen.
  • Irgendeine eine Vielzahl von quantitativen Messungen steht den Fachleuten auf dem Gebiet zur Verfügung und kann verwendet werden, um die relative Effizienz der jeweiligen 3'-und 5'-Gen-Trap-Kassetten zu berechnen, wie auch die Anzahl von Genen, welche effizient getrappt werden können. Beispielsweise kann man die Prozentzahl der Target-Gene, identifiziert durch bereits beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassetten, relativ zum Prozentsatz von Target-Genen identifiziert durch 5'-Gen-Traps, wie z. B. SAβgeo oder SAneo und ausgewählt, beispielsweise unter Verwendung des antibiotischen Markers G418, bestimmen. Alternativ kann der Prozentsatz von identifizierbaren 3'-Gen-Trap-Ereignissen mit dem Prozentsatz von Target-Zellen, denen antibiotische Resistenz verliehen wurde oder welche chromogen identifizierbar durch SAβgeomediatisierte 5'-Gen-Trap-Ereignisse sind, verglichen werden.
  • Die funktionelle Effizienz der hier beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette kann auch quantifiziert werden durch die absolute Anzahl der unabhängigen Gen-Trap-Ereignisse, charakterisiert unter Verwendung des Vektors. Im Allgemeinen ermöglichen die hier beschriebenen Vektoren das rasche Trappen von zumindest ungefähr einiger Hundert Gene, typischerweise ungefähr 1 000 verschiedener Gene, noch typischer zumindest ungefähr 3 000, vorzugsweise zumindest ungefähr 10 000 Genen, mehr bevorzugt zumindest ungefähr 25 000 Genen, mehr bevorzugt zumindest ungefähr 50 000 Genen und am meisten bevorzugt zumindest ungefähr 55 000 Genen bis hin zur maximalen Anzahl von Genen, welche in einer gegebenen Zelle vorliegen oder in einem gegebenen Zelltyp. Beispielsweise glaubt man, dass murine Zellen zwischen 60 000 und 100 000 Genen oder mehr kodieren.
  • Ein weiteres Maß für die Gen-Trapping-Effizienz ist die Anzahl der verschiedenen zellulären Exons, die getrappt werden können. Typischerweise wird die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette zelluläre 3'-Exons trappen mit hinreichender Effizienz, so dass Nachweis, Screening und Identifikation von zumindest ungefähr 10 000 verschiedenen 3'-Gen-getrappten zellulären Exons realisierbar gemacht wird (im Allgemeinen repräsentierend ungefähr zwischen etwa 7 500 und 9 500 verschiedene Gene – die Anzahl ist typischerweise kleiner, weil unabhängige Integrations-Ereignisse innerhalb verschiedener Introns/Exons innerhalb des gleichen Gens auftreten können), vorzugsweise von zumindest ungefähr 15 000 verschiedenen 3'-Gen-getrappten zellulären Exons, mehr bevorzugt von ungefähr 25 000 verschiedenen 3'-Gen-getrappte zelluläre Exons und am meisten bevorzugt ungefähr 55 000 verschiedene 3'-Gen-getrappte Exons bis hin zu ungefähr 70 und ungefähr 100% der Gene, welche im Säugetier-Genom vorliegen.
  • 5.3.1. Gen-getrappte Bibliotheken von Zellen
  • Geht man von der Vielzahl von Genen aus, welche schnell unter Verwendung der vorliegenden Vektoren charakterisiert werden können, schließen zusätzliche Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Gen-getrappte Bibliotheken von kultivierten tierischen Zellen ein, welche stabil die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette3'-Gen-Trap-Kassette inkorporieren. Die hier beschriebenen Bibliotheken können hergestellt werden durch einen Prozess, welcher die Schritte des Behandelns (d. h. Infizieren, Transfizieren, Retrotransponieren oder virtuell irgendein anderes Verfahren zum Einbringen von Polynukleotiden in eine Zelle) einer Population von Zellen zum stabilen Integrieren eines Vektors, enthaltend die 3'-Gen-Trap-Kassette, des Identifizierens oder anderweitigen Auswählens stabiler transduzierter Zellen, sowie des Identifizierens der getrappten 3'-zellulären Exons umfassen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen die tierischen Zellbibliotheken Säugetier-Zellen und in einer insbesondere bevorzugten Ausführungsform sind die Säugetier-Zellen embryonale Stammzellen (ES). Vorzugsweise werden solche Bibliotheken so konstruiert, so dass jede mutierte Zelle in der Bibliothek einen einzelnen identifizierbaren 3'-Gen-Trap-Vektor/ein jeweiliges Ereignis beherbergt (obwohl mutierte Zellen, welche multiple Gen-Trap-Vektoren beherbergen, auch von der vorliegenden Erfindung ins Auge gefasst werden).
  • In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die individuellen mutierten Zellen in der Bibliothek separiert und klonal expandiert. Die isolierten und klonal expandierten mutierten Zellen werden dann analysiert, um die DNA-Sequenz oder die partielle DNA-Sequenz des insertional mutierten Wirt-Gens sicherzustellen. Folglich stellt die vorliegende Erfindung das Sequenzieren von zumindest einem Teil eines jeden Gens, mutiert in der Bibliothek, zur Verfügung. Die resultierende Sequenz-Datenbank dient nachfolgend als ein Index der Bibliothek. Auf den Punkt gebracht, wird jede Gruppe der klonal expandierten Zellen in der Bibliothek individuell katalogisiert unter Verwendung der partiellen Sequenzinformation. Die resultierende Sequenz ist spezifisch für das mutierte Gen, da die vorliegenden Verfahren so konzipiert sind, dass die Sequenzinformation von Exons erhalten wird, welche an die 3'-Gen-Trap-Kassette gesplict wurden. Die resultierende Sequenz-Datenbank kann verwendet werden, um das mutierte Gen von Interesse zu identifizieren, oder sie repräsentiert alternativ ein Werkzeug von hohem Potenzial zum Identifizieren neuer Gene. Sobald identifiziert, kann die korrespondieren de Mutanten-Zelle aus der Bibliothek genommen werden und, wie unten beschrieben, weiter untersucht werden.
  • Im Allgemeinen werden die mit Index versehene Bibliotheken von isolierten Zellen oder individuellen Zelltypen (beispielsweise ES-Zellen), welche unter Verwendung von Vektoren mutiert worden sind, welche die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette inkorporieren, eine Kollektion von zumindest ungefähr 50 verschiedenen isolierten Mutanten-Zell-Kultur-Linien umfassen, typischerweise von zumindest ungefähr 100, mehr typischerweise von zumindest ungefähr 500, vorzugsweise von ungefähr 1 000, mehr bevorzugt von zumindest ungefähr 5 000, mehr bevorzugt von zumindest ungefähr 10 000, mehr bevorzugt von zumindest ungefähr 25 000 und sogar noch mehr bevorzugt von zumindest ungefähr 40 000 bis hin zu von ungefähr 100 000 bis 500 000 verschiedenen isolierten und charakterisierten Mutanten-Zell-Kulturlinien oder mehr. Vorzugsweise sind die Genome der verschiedenen Mutanten-Zellkulturen, welche in einer gegebenen Bibliothek vorliegen, essentiell identisch (beispielsweise abgeleitet von einer allgemeinen Quelle oder einem ererbten Strang), außer hinsichtlich des Ortes der insertierten Gen-Trap-Kassette bzw. des Vektors, welcher selbige inkorporiert.
  • Idealerweise ist der Umfang der Mutagenese der gesamte Satz von Genen, welcher in der Target-Zell-Linie getrappt werden kann. Durch Erhöhen der Redundanz der Bibliothek wird die resultierende Sequenzdatenbank idealerweise eine essentiell vollständige Repräsentation der Gene enthalten, die in der Target-Zelle getrappt werden können. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll der Begriff "essentiell vollständige Repräsentation" sich auf eine statistische Situation beziehen, wo im Allgemeinen zumindest 80–95% Wahrscheinlichkeit besteht, dass die Genome der Zellen, verwendet, um die Bibliothek zu konstruieren, kollektiv eine stabil insertierte 3'-Gen-Trap-Kassette in zumindest 70% der Gene enthaltend, welche in dem Target-Zell-Genom getrappt werden können, bevorzugt zumindest ungefähr 85% und am meisten bevorzugt zumindest ungefähr 95% der Gene, welche getrappt werden können, wie durch eine Standard-Poisson-Verteilung bestimmt werden kann (wobei angenommen wird, dass ein gegebener Vektor nicht spezifisch in das Genom integriert).
  • Die breite genomische Abdeckung, realisiert durch die vorliegenden Vektoren, ermöglicht auch eine Mutagenese des Target-Zell-Genoms im großen Maßstab. Typischer weise wird eine solche Bibliothek von mutierten Target-Zellen eine Kollektion von mutierten Zellen umfassen oder isolierte Kulturen davon, welche kollektiv zumindest eine 3'-Gen-Trap-Mutation (mediatisiert durch die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette oder einen Vektor, umfassend selbige) in jedem Chromosom, das in dem Target-Zell-Genom vorliegt, umfassen, vorzugsweise werden zumindest ungefähr 2 bis 3 unabhängige Gen-Trap-Mutationen pro Chromosom kollektiv in der Bibliothek vorliegen, mehr bevorzugt werden zumindest ungefähr 10 unabhängige Gen-Trap-Mutationen pro Chromosom vorliegen, und am meisten bevorzugt werden zumindest ungefähr 500 unabhängige Gen-Trap-Mutationen pro autosomalem Chromosom (abzüglich der Geschlechtschromosomen) vorliegen, und/oder bis hin zu ungefähr 70 bis 90% oder sogar eine essentiell vollständige Repräsentation der Gene in dem Genom werden kollektiv in der Bibliothek vertreten sein.
  • Die hier beschriebene Erfindung ermöglicht die genetische Analyse des Genoms im großen Maßstab von irgendeinem Organismus/irgendeiner Zelle, welche mit den beschriebenen Vektoren transduziert werden können oder für welche eine kultivierte Zell-Linie existiert. Dementsprechend können die beschriebenen Bibliotheken konstruiert werden von irgendeinem Zelltyp, welcher durch Standardtechniken transfiziert werden kann oder mit einem rekombinantem Vektor, der die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette beherbergt, transfiziert werden kann. Als solche sind die hier beschriebenen Verfahren des Herstellens, Organisierens und Indexierens von Bibliotheken von mutierten tierischen Zellen auch breit anwendbar auf virtuell jegliche Art von Eukaryonten-Zellen, welche genetisch manipuliert werden können und in Kultur gezüchtet werden können.
  • Wo die Maus-ES-Zellen verwendet werden, um die Bibliothek zu konstruieren und vorzugsweise frühe Passagen von ES-Zellen, wird die Bibliothek ein genetisches Werkzeug für die umfassende funktionelle Untersuchung des Mausgenoms. Da ES-Zellen zurück in einen Blastozyten injiziert werden können und in die normale Entwicklung und ultimativ in die Keimbahn inkorporiert werden können, repräsentieren die mutierten ES-Zellen der Bibliothek in effizienter Art und Weise eine Kollektion von transgenen Mutanten-Mauslinien (siehe im Allgemeinen US-Patent Nr. 5,464,764, veröffentlicht am 7. November 1995).
  • Eine ähnliche Methode kann verwendet werden, um virtuell jegliche Art nicht-menschlicher transgener Tiere zu konstruieren (oder Tiere, welche in der Lage sind, transgen zu werden), sowie transgene Pflanzen. Solche nicht-menschlichen transgenen Tiere können beispielsweise transgene Schweine, transgene Ratten, transgene Kaninchen, transgene Rinder, transgene Ziegen und andere transgene Tierspezies einschließen, insbesondere Säugetier-Spezies, die im Stand der Technik bekannt sind. Des Weiteren können Rinder, Schafe und Schweine-Arten, weitere Mitglieder der Nagetierfamilie, beispielsweise Ratten, wie auch Kaninchen und Meerschweinchen und nicht-menschliche Primaten, z. B. Schimpansen, verwendet werden, um die vorliegende Erfindung zu praktizieren.
  • Transgene Tieren und Zellen, erzeugt unter Verwendung der hier beschriebenen Bibliothek und/oder Vektoren sind bedeutsam für die Untersuchung von grundlegenden biologischen Prozessen und für die Entwicklung von Therapeutika und Diagnostika für Erkrankungen, einschließend, jedoch nicht limitiert auf Altern, Krebs, Autoimmun-Erkrankungen, Alopezie, glandulare Erkrankungen, inflammatorische Erkrankungen, Ataxia teleangiectatica, Diabetes, Arthritis, Bluthochdruck, Atheriosklerose, kardiovaskulare Erkrankungen, pulmonale Erkrankungen, degenerative Erkrankungen des neuralen oder skelettalen Systems, Alzheimer-Krankheit, Parkinson-Krankheit, Asthma, Entwicklungs-Erkrankungen oder Abnormalien, Unfruchtbarkeit, Epithelulzerationen sowie virale und mikrobielle Pathogenese und infektiöse Erkrankungen (ein relativ vollständiger Überblick über solche Pathogene wird unter anderem in Mandell et al., 1990, "Principles and Practice of Infectious Disease", 3. Auflabe, Churchill Livingstone Inc., New York, N.Y. 10036 zur Verfügung gestellt). Als solches sind die beschriebenen Tiere und Zellen insbesondere bedeutsam für die Praxis von funktioneller Genomics (ähnliche Bibliotheken und Verfahren zum Herstellen und Screenen derselbigen werden in US-Patent Nr. 6,207,371 und in WO 98/14614 diskutiert).
  • 5.3.2. Die Akquisition von DNA-Sequenz-Information
  • Das Sequenzieren von cDNA-Bibliotheken hat viele Hunderte von Tausenden von exprimierten Sequenztags (ESTs) zur Verfügung gestellt. Diese Gene sind typischerweise dazu gedacht, Gene oder kodierende Teile von DNA zu identifizieren. Da die Ge ne dazu gedacht sind, für die meisten, nicht für alle potenziellen Wirkstoff-Targets zu kodieren, gab einen Ansturm, ESTs zu erhalten, welche alle Säuger-Gene identifizierten. Jedoch haben sich trotz des Vorteils der bislang erzeugten Sequenz-Daten viele Gene als schwierig bei der Identifizierung unter Verwendung etablierter cDNA-Verfahren herausgestellt, da viele Gene nicht exprimiert werden bzw. in sehr geringen Spiegeln exprimiert werden, nur in spezifischen Zelltypen exprimiert werden oder nur transient exprimiert werden. Geht man davon aus, dass Gen-Trapping Gene unabhängig von ihren endogenen Expressions-Spiegeln identifizieren kann, ist Gen-Trapping ein wichtiges Werkzeug zur Gen-Entdeckung (wie durch die große Vielzahl neuer Sequenzen demonstriert wird, welche identifiziert wurden unter Verwendung der beschriebenen Vektoren). Wie für die EST-Technologie ist eine potenzielle Begrenzung der 5'-Gen-Trap-Vektoren (Vektoren, konzipiert, um 5'-Exons zu trappen), dass, nur exprimierte Gene typischerweise getrappt werden. Dementsprechend sind speziell aus Gründen der Gen-Zufuhr ES-Zellen besonders bevorzugte Target-Zellen, da man glaubt, dass ES-Zellen im Allgemeinen promisk in der Expression der meisten Gene sind. Geht man von dieser Promiskuität aus, dann könnten die meisten Gene in ES-Zellen getrappt werden unter Verwendung der hier beschriebenen Vektoren. Um die Prozentzahl der Gene zu testen, welche als exprimiert in ES-Zellen detektiert werden können, wurden 23 ESTs aus der GenBank dbest-Datenbank zufällig ausgewählt und die Primer wurden synthetisiert, welche die Gene durch PCR identifizieren würden. Wenn diese Primer verwendet wurden, in RT-PCR-Assays unter Verwendung von ES-Zellen-RNA, produzierten alle 23 Sätze von Primern das Produkt. Dies wies darauf hin, dass Transkripte für alle 23 Gene in ES-Zellen nachgewiesen werden könnten. Geht man davon aus, dass die 23 gescreenten ESTs zufällig ausgewählt wurden, ist es wahrscheinlich, dass sie größtenteils repräsentativ für die Gene im Allgemeinen sind und sie zeigen, dass eine Majorität von Genen, welche in anderen Zelltypen in hinreichend hohen Spiegeln exprimiert werden, um durch Sequenzieren von konventionellen cDNA-Bibliotheken identifiziert worden zu sein, auch in ES-Zellen exprimiert werden und folglich möglicherweise identifizierbar sind unter Verwendung von SA-auswählbaren Marker-polyA (5-Gen-Trap)-Vektoren.
  • Jedoch in den Fällen, wo Gene entweder nicht exprimiert werden oder nur schwach exprimiert werden, ist eine 3'-Gen-Trap-Kassette vorzugsweise einzusetzen, um die Gene zu trappen und zu identifizieren. Darüber hinaus ermöglichen 3'-Gen-Trap- Kassetten die schnelle Bereitstellung der cDNA-Sequenzdaten aus dem getrappten Gen mit Hilfe automatisierter Mittel.
  • Vektoren, konzipiert, um 3'-Exons zu trappen, haben es möglich gemacht, große Anzahlen von Mutationen zu produzieren und schnell die Gene, welche mutiert worden sind, zu identifizieren. Jedoch ist eine Begrenzung der ursprünglichen Versionen solcher Vektoren, dass auswählbare Markergene, verwendet in der 3'-Gen-Trap-Kassette, ineffizient eingesetzt werden durch die Splice-Maschinerie der meisten Eukaryonten-Zellen. Als eine Konsequenz ermöglichen Vektoren, welche eine 3'-Gen-Trap-Kassette einsetzen, die ein Exon kodierend eine Aktivität, verleihend antibiotische Resistenz einsetzen, typischerweise nur das realisierbare und effiziente Gen-Trappen und Identifizieren (unter Verwendung von 3' RACE) von relativ kleinen Anteilen der Gene im Genom. Des Weiteren begrenzt die inhärente Ineffizienz des Auswählens für getrappte 3'-Exons typischerweise die Gesamtzahl der Gene, welche analysiert werden kann unter Verwendung solcher Verfahren. Konsequenterweise wurden vor der vorliegenden Erfindung nur kleine Anteile des zellulären Genoms effizient getrappt/mutagenisiert unter Verwendung von antibiotischem Auswahlmarker-mediatisierten 3'-Exon-Trapping.
  • Die hier beschriebenen Vektoren bringen eine 3'-Gen-Trap-Kassette ein, welche typischerweise ermöglicht, ein Vielfaches oder mehr einer Größenordnung an größerer Anzahl von Genen zu trappen und durch jene Exon-Sequenz im Vergleich zu ursprünglichen 3'-Gen-Trap-Vektoren zu identifizieren, welche ein Exon einsetzen, das eine auswählbare Markeraktivität kodiert.
  • Die hier beschriebenen Vektoren können auch 3'- und/oder 5'-Gen-Trap-Kassetten inkorporieren, welche technisch erzeugt worden sind, um die Wahrscheinlichkeit des Identifizierens von 5'-Enden des offenen Leserahmens von Genen zu erhöhen. Dies ist signifikant, da die 5'-Enden von Genen häufig die Signalsequenz kodieren, welche in sekretierten und Transmembran-Proteinen zu finden ist. Diese Gruppe von Genen wird stark angereichert hinsichtlich potenzieller Protein-Therapeutika und Wirksubstanz-Targets. Geht man davon aus, dass 5' nicht-kodierende Sequenzen durchschnittlich 100 bp lang sind und die durchschnittliche Länge der Gen-Trap-Sequenz ungefähr 500 bp ist, werden Gen-getrappte Sequenzen, erzeugt unter Verwendung der hier beschrie benen Vektoren, typischerweise den 5'-Teil des getagten offenen Leserahmens identifizieren. Dies ist speziell wertvoll, da 5'-Enden von Genen schwierig zu erhalten sein können aufgrund komplizierter Faktoren, wie z. B. hoher GC-Anteile, sekundärer Struktur sowie mangelnde Verarbeitbarkeit durch reversive Transkriptase.
  • Wenn eine große Vielzahl von Gen-Traps in bekannten Genen erzeugt wurden und identifiziert wurden unter Verwendung der beschriebenen Vektoren, enthielten 93% der Gen-Trap-Sequenz-Tags, welche zu cDNA-Sequenzen in GenBank passten, die gleiche oder eine zusätzliche 5'-Sequenz. Dies bestätigt, dass die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette verwendet werden kann, um die 5'-Enden der Gene zu identifizieren und zu charakterisieren. Tatsächlich identifizieren die Gen-Trap-Verfahren der vorliegenden Erfindung die 5'-Enden von Genen besser als oder gleich gut wie andere Verfahren, die bis hierher beschrieben worden sind.
  • Eine der hauptsächlichen Herausforderungen von Genomics bleibt die Isolierung und das Klonieren von Volllängen-cDNA für alle Gene. Bislang hat dies die Produktion von cDNA aus einer großen Vielzahl von Geweben nötig gemacht, gefolgt durch das anschließende Sequenzieren der individuellen cDNAs. Wie oben beschrieben, kann es unter Verwendung solcher Verfahren sehr schwierig sein, 5'-Enden von cDNA zu erhalten. Des Weiteren besteht das Problem, dass zum Erhalten eines vollständigen Repertoires von cDNAs individuelle cDNA-Bibliotheken aus essentiell allen differenzierten Zelltypen erstellt werden müssen und zu allen Entwicklungs-Zeitpunkten, da Gene exprimiert werden müssen, um als ESTs kloniert werden zu können.
  • Wie oben diskutiert, können die hier beschriebenen Vektoren verwendet werden zur Erzeugung von cDNA-Bibliotheken. Beim Einbringen in Zellen in Kultur erzeugt die 3'-Gen-Trap-Kassette Transkripte von Genen unabhängig davon, ob sie normal in diesen Zellen exprimiert werden oder nicht. Die Expressions-Grade der verschiedenen getrappten Gene werden durch den insertierten Promotor normalisiert, so dass sogar Gene, die nur zu sehr geringen Graden exprimiert werden, identifiziert werden können. Unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren und Vektoren kann man eine breite cDNA-Abdeckung des Target-Zell-Genoms in Form einer einzelnen Bibliothek erhalten, ohne unabhängige multiple cDNA-Bibliotheken produzieren zu müssen von multiplen Zelltypen, welche unter multiplen Bedingungen gezüchtet worden sind.
  • Die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette kann beispielsweise in das Genom von Gewebs-Kultur-Zellen insertiert werden und Verfahren (beispielsweise PCR) können verwendet werden, welche nun ermöglichen, dass cDNA, welche aus getrappten Genen stammt, in die cDNA-Bibliothek subkloniert werden kann. Diese Verfahren werden die Abdeckung der erzeugten cDNAs erhöhen, und gleichzeitig substanziell den Aufwand, involviert in die Produktion der Bibliothek, vermindern. Wie oben diskutiert, sind die hier beschriebenen Verfahren auch insbesondere bedeutsam beim Erhalten der 5'-Enden von Genen und optimieren folglich die Chance des Erhaltens von Volllängen-cDNAs. Beispiele von Variablen, welche verwendet werden können, um die Vielfalt und Anzahl der getrappten cDNAs, erzeugt unter Verwendung der beschriebenen Vektoren zu verändern, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf, das Einstellen der Multiplizität der Infektion und das Erzeugen von cDNAs aus infizierten Target-Zellen, welche nicht einem Zeitraum von selektiver Kultur ausgesetzt wurden, um Zellen auszuwählen, welche einen exogen eingebrachten auswählbaren Marker inkorporieren und exprimieren. Die resultierenden Gen-getrappten cDNA-Bibliotheken können sequenziert werden, um eine Multiplizität von Gen-getrappten kodierten Regionen von Genen zu erzeugen, welche für bioinformatische Zwecke verwendet werden können, Genexpressions-Untersuchungen, sowohl in situ als auch in vitro (Hybridisations-Untersuchungen, Genchips (welche auch Oligonukleotidsequenzen, korrespondierend mit den getrappten Gensequenzen einsetzen), etc.), und für die Produktion von Gen-Trap-Datenbanken mit einer Vielzahl von Tieren und Pflanzen. Diese Gen-Trap-Sequenzen können direkt als Sonden eingesetzt werden oder Oligonukleotidsequenzen, korrespondierend zu den Gen-Trap-Sequenzen können verwendet werden, um Bibliotheken durch Hybridisieren oder PCR zu screenen. Des Weiteren können Gen-Trap-Sequenzen identifiziert unter Verwendung der offenbarten Vektoren inkorporiert werden in Klonierungs-Vektoren, welche die Expression der Gen-Trap-Sequenzen steuern. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung soll eine isolierte Polynukleotidsequenz aufweisend, enthaltend oder anderweitig einbringend solch eine Gen-Trap-Sequenz (oder eine Oligonukleotidsequenz abgeleitet davon) irgendeine oder alle isolierten Polynukleotide oder Vektoren bedeuten, welche minimal ein zusammenhängendes Stück einer beschriebenen cDNA-Gen-Trap-Sequenz (oder eine Oligonukleotidsequenz abgeleitet davon) inklusive jegliche weitere natürlich erscheinende oder rekombinanten Sequenzen einbringen oder umfassen, welche die hier beschriebene Gen-Trap-Sequenz, die in solchen isolierten Polynukleotiden oder Vektoren vorliegt, flankieren können.
  • Geht man von der Geschwindigkeit und Effizienz aus, mit welcher DNA- (und korrespondierende Aminosäuren-) Sequenz-Information erhalten werden kann, unter Verwendung der beschriebenen Verfahren und Vektoren, ist es klar, dass sie bedeutsame Werkzeuge zum Durchführen genetischer Screens in irgendwelchen (einschließend primäre und sekundäre) Zellen oder einer Zelllinien, welche Splice-Maschinerie und Gene, enthaltend Introns, enthalten, zur Verfügung stellen. Die hier beschriebenen Gen-Trap-Vektoren repräsentieren einen speziell bedeutsamen technologischen Durchbruch, da die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette die rasche Identifikation von grob 13fach (wie empirisch bestimmt) mehr an Genen ermöglicht, als effizient erhalten werden können unter Verwendung konventioneller 3'-Gen-Trap-Vektoren, welche auf Gen-Trappen, detektiert durch antibiotische Selektion basieren. Kombiniert mit der Häufigkeit des Erhaltens neuer Gensequenzen wird der beobachtete Anstieg an identifzierbaren Gen-Trap-Targets Sequenzinformation für eine große Vielzahl neuer Gene und Gensequenzen zur Verfügung stellen. Des Weiteren repräsentieren, wen sie in ES-Zellen als Target eingesetzt werden, alle diese neuen Sequenzen sowohl neu identifizierte Gene (und potenzielle Wirkstoffe oder Wirkstoff-Targets) als auch eine "Knockout"-Zellen sowie einen potenziellen "Knockout"-Embryo oder ein entsprechendes Tier.
  • Die rasche Sequenzakquisitions-Charakteristik der hier beschriebenen Verfahren, Bibliotheken, Zellen und Tiere sind sehr gut passend für das rasche Identifizieren der molekularen/genetischen Basis für Erkrankungen wie auch genetisch bestimmte Vorteile, wie z. B. verlängerte Lebensdauer, niedriger Cholesterol-Spiegel, niedriger Blutdruck, Resistenz gegen Krebs, geringes Auftreten von Diabetes, Nichtauftreten von Obesität oder die Linderung von oder Verhinderung von allen entzündlichen Krankheiten, einschließend, jedoch nicht limitiert auf Koronar-Arterien-Erkrankungen, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, Systemische Lupus erythematosus und inflammatorische Nierenbecken-Erkrankungen. Gibt man von der großen Abdeckung, bereitgestellt durch die große Anzahl von Targetgenen aus, involviert eine spezifische bedeutsame Anwendung der beschriebenen Techniken die Charakterisierung und Analyse von Single-Nukleotide-Polymorphisms kodierenden Regionen (coding region single nukleotide polymorphisms, cSNPs).
  • 5.4. Verfahren des Einbringens
  • Die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette wird bevorzugt in Target-Zellen eingebracht als eine strukturelle Komponente von irgendeinem einer großen Bandbreite von Vektoren, welche spezifisch oder nicht-spezifisch in das Target-Zell-Genom eingebracht werden können (Rekombinase-Systeme können auch verwendet werden, um die 3'-Gen-Trap-Kassette zu insertieren). Geeignete Vektoren, welche in Verbindung mit den hier offenbarten Merkmalen verwendet werden können, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Herpes simplex-virale Vektoren, Adenovirus-Vektoren, adenoassoziierte Virus-Vektoren, retrovirale Vektoren, lentivirale Vektoren, Pseudorabies-Viren, Alpha-Herpes-Virus, und dergleichen. Ein detaillierter Review viraler Vektoren, insbesondere viraler Vektoren, geeignet zum Modifizieren nicht-replizierender Zellen, und wie solche Vektoren verwendet werden können im Zusammenhang mit der Expression von Polynukleotiden von Interesse findet sich in dem Buch Viral Vectors: Gene Therapy and Neuroscience Applications Hrsg. Caplitt and Loewy, Academic Press, San Diego (1995).
  • Wo retrovirale Vektoren verwendet werden, um die hier beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette zuzuführen, können retrovirale Vektoren im Zusammenhang mit dem retroviralen Verpacken durch Zelllinien verwendet werden, wie diejenigen, die in US-Patent Nr. 5,449,614 ('''614-Patent"), veröffentlicht am 12. September 1995, beschrieben werden. Wo Nicht-Maus-Säugetier-Zellen als Targets zum Erzeugen der beschriebenen Bibliothek verwendet werden sollen, wird das Verpacken durch Zellen, welche Retrovirus mit amphotropen Hüllen erzeugen, im Allgemeinen eingesetzt werden, um die Infektion einer breiten Bandbreite von Wirtszellen zu ermöglichen. Alternativ können pantrope packende Zelllinien, wie z. B., jedoch nicht limitiert auf die Zelllinie 293/GPG (On et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA. 93:11400-11406 und WO 97/17457) verwendet werden, um die beschriebenen Vektoren zu verpacken, oder ein geeignetes virales, beispielsweise retrovirales Rezeptorgen kann in die nicht-murine, beispielsweise, menschliche Target-Zellen transfiziert werden.
  • Des Weiteren können die beschriebenen retroviralen Vektoren in Verbindung mit Chimären-Integrase-Molekülen, wie z. B. in WO 99/07389 beschrieben, verpackt werden. Typischerweise sind die LTRs, welche bei der Konstruktion der packenden Zelllinien verwendet werden, selbst-inaktivierend. Das heißt, das Verstärker-Element wird von den 3'-U3-Sequenzen entfernt, so dass die Proviren, resultierend aus der Infektion, keinen Verstärker in jedem LTR aufweisen würden. Ein Verstärker in dem Provirus kann ansonsten die Transkription des mutierten Gens oder nahe gelegener Gene beeinflussen. Typischerweise liegen die Gen-Trap-Kassetten der beschriebenen retroviralen Vektoren in einer Orientierung entgegengesetzt der normalen funktionierenden Orientierung der retroviralen LTRs vor.
  • Ein weiterer Vorteil der Verwendung von viralen und insbesondere retroviralen Infektionen (d. h. biologischen Verfahren) bei der Zufuhr rekombinanter viraler Vektoren, einbringend unter anderem die 3'-Gen-Trap-Kassette, ist, dass die virale Infektion effizienter erfolgt als bei üblichen nicht-biolgischen Verfahren zur Zufuhr genetischen Materials an Target-Zellen. Wo rekombinantes genetisches Material durch retrovirale Infektion zugeführt wird, wird das rekombinante RNA-Genom des Retrovirus reversiv transkribiert innerhalb der Target-Zelle und die retrovirale Integrase, gepackt innerhalb des infizierenden Virus, mediatisiert anschließend die essentiell zufällige Integration des Vektors (und der 3'-Gen-Trap-Kassette) in das Target-Zell-Genom. Dementsprechend schließen weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung Verfahren des Insertierens rekombinanter Vektoren ein, welche die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette inkorporieren, und welche durch Integrase-oder Rekombinase-Aktivitäten mediatisiert werden, die entweder exogen zur Target-Zelle hinzugefügt werden oder nicht natürlicherweise innerhalb der Target-Zelle vorkommen.
  • Repräsentative retrovirale Vektoren, welche adaptiert werden können, um die vorliegend beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette zu inkorporieren, werden unter anderem in US-Patent Nr. 5,521,076 und WO 98/14614 und US-Patent Nr. 6,207,371 und WO 99/07339 beschrieben (welche des Weiteren Screening-Protokolle offenbaren, die verwendet werden können, um spezifische Gen-Trap-Ereignisse entweder biochemisch oder phänotyisch zu untersuchen).
  • Typischerweise ist die Orientierung der Gen-Trap-Kassetten inkorporiert in retrovirale Vektoren entgegengesetzt zu derjenigen der normalen retroviralen Transkription; jedoch sind retrovirale Vektoren auch angedacht, wo eine oder mehrere Gen-Trap-Kassetten in der gleichen Orientierung wie normale retrovirale Transkription inkorporiert sind. Typi scherweise ist der Grund des Platzierens einer Gen-Trap-Kassette in einer entgegengesetzten Orientierung relativ zu den LTRs, dass das Vorliegen von technisch erzeugten Steuer-Elementen, z. B. Polyadenylierungs-Signalen, Splice-Stellen und der Promotoren, mit der richtigen Transkription des retroviralen Genoms bei der Verpackung der Zelllinie wechselwirkt und nachfolgend retrovirale Titer reduziert.
  • Des Weiteren kann, da eine 'kryptische' Splice-Donor-Sequenz in den invertierten LTRs zu finden ist, dieser Splice-Donor durch ortsspezifische Mutagenese entfernt werden, so dass er nicht in nachteilhaftiger Art und Weise die Trapping-verwandten Splice-Ereignisse beeinflusst. Optional kann die LTR-Promotor-und/oder Verstärker-Funktion inaktiviert werden durch Deletieren aller oder eines Teils der Promotor- und/oder Verstärker-Sequenzen.
  • 5.5. Molekular-genetische Anwendungen
  • 5.5.1. Genaktivierung
  • Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist die Verwendung der 3'-Gen-Trap-Kassette, um sowohl nach dem Erhalt oder dem Verlust von Funktionen in Tieren zu screenen, beispielsweise Mäusen, wie auch in kultivierten Zellen. Wenn Vektoren verwendet werden, welche eine 3'-Gen-Trap inkorporieren mit einem Exon, welches keine Translations-Start-Stelle enthält, kann ein gegebenes Target-Gen entweder überexprimiert werden oder insertionell inaktiviert (mutiert) werden, abhängig davon, wo der Vektor innerhalb des Gens integriert worden ist. Falls der Vektor in einem Intron landet, welches dem Start der Translation vorangeht, kann er Überexpression des gesamten offenen Leserahmens, kodierend das zelluläre Protein verursachen. Unter Verwendung dieser Typen von Trap-Ereignissen kann man genetisches Screens durchführen, basierend auf Gen-Überexpression. Diese Screens könnten in Zellkultur oder in Mäusen realisiert werden, beispielsweise, um Gene zu entdecken, welche eine signifikante Rolle in Erkrankungs-Prozessen spielen. Beispielsweise können diese Screens verwendet werden, um Onkogene zu identifizieren durch Einbringen der 3'-Gen-Trap-Kassette in primäre Embryo-Fibroblasten und Auswählen, nach Abhängigkeit in Soft-Agar zu wachsen. Alternativ würde das Assayen nach Zellen, welche in der Lage sind, zellulärer Seneszenz zu entkommen, auch die Identifikation potenzieller Onkogene ermöglichen.
  • Um zu demonstrieren, dass die vorliegenden Vektoren verwendet werden können, um Trap-Ereignisse auszuwählen, welche in Genexpression (oder in Überexpression) resultieren, wurde ein Experiment durchgeführt, um zu bestimmen, ob Gene getrappt werden könnten, welche die Expression von Faktoren ermöglichen, welche ES-Zell-Differentiation vorantreiben. Große Anzahlen von Genen wurden in Zell-Kultur auf Gewebs-Kultur-Platten getrappt. Multiple Platten wurden parallel infiziert und die resultierenden Platten wurden hinsichtlich ES-Zell-Differentiation beobachtet. Einige Platten zeigten beinahe keinerlei Differentiation, wohingegen einige Platten 100% differenzierte ES-Zellen haben dürften. Diese Differentiation ist wahrscheinlich das Ergebnis der Expression eines Gens, das entweder ein Differentiations-Faktor ist, oder verursacht, dass die ES-Zellen ein Differentiations-Faktor produzieren und ihn in das Medium pumpen, was in der Difterentiation aller der Zellen auf der Schale resultiert. Es ist wichtig, dass dies auch demonstriert, dass das 3'-Gen-Trap-System verwendet werden kann, um sekretierte Gene zu aktivieren und zu screenen, welche spezifische biologische Antworten erzeugen, und zwar durch Testen der Überstände des Gen-Trap-Pools. Das Screenen auf Es-Zell-Differentiations-Faktoren ist nur ein Beispiel, dass diese Technik verwendet werden kann, um sekretierte Moleküle, involviert in irgendeine Zelle Antwort von Interesse zu identifizieren. Man könnte beispielsweise auf sekretierte Moleküle screenen, welche Apoptose oder hämatopoetische Zelldifferentiation induzieren.
  • Geht man von der erhöhten Expression infolge der hier beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassette aus, ist eine weitere Anwendung der hier beschriebenen 3'-Gen-Trap-Kassetten die Genaktivierung. Beispielsweise kann, nachdem geeignete tierische Zellen mit Vektoren behandelt oder infiziert worden sind, welche die beschriebene 3'-Gen-Trap-Kassette inkorporieren, falls der Vektor in das 5'-Intron eines ansonsten ruhigen Gens integriert, das Gen aktiviert und überexprimiert werden durch regulatorische Elemente, beispielsweise durch Enhancer-/Promotorelemente, inkorporiert in die 3'-Gen-Trap-Kassette. Unter Verwendung solcher nicht-zielorientierter, nicht-spezifischer oder zielorientierter nicht-spezifischer (siehe WO 99/07389) Genaktivierung können modifizierte tierische Zellen, enthaltend menschliche Zellen erzeugt werden, welche irgendwelche einer großen Vielzahl von natürlichen zellulären Produkten erzeugen.
  • Produkte, welche insbesondere als bedeutsam für solche Anwendungen gelten, schließen normalerweise sekretierte Moleküle oder Hormone ein, wie z. B. jedoch nicht limitiert auf Erythropoetin (epo), tPA, Zytokine, Interleukine, Tumor-Suppressoren, Chemokine, sekretierte Moleküle, G-CSF, GM-CSF, Nerv-Growth-Factor (NGF), Ciliary-Neurotropic-Factor (CNTF), Brain-Derived-Neurotropic-Factor (BDNF), Interleukine 1-2 und 4-14, Tumor-Nekrose-Faktor-α (TNF-α), α- oder γ- Interferone und dergleichen, Leptin und Faktoren VIII und IX.
  • Die Aktivierung von ruhigen Genen, die Überexpression oder die abnormale Expression von Genen durch die 3'-Gen-Trap-Kassette kann auch verwendet werden, um die Genfunktion innerhalb eines Organismus zu untersuchen. Die Genüberexpression kann verwendet werden, um die Genfunktion zu untersuchen und durch das Trappen von Genen in der 3'-Kassette können Gene innerhalb eines Organismus überexprimiert werden. Die Überexpression kann zu einem Phänotyp im Organismus führen, welcher Licht auf die Funktion eines Gens wirft. Beispielsweise enthält der spezifisch beschriebene retrovirale Vektor den PGK-Promotor, welcher ubiquitär exprimiert wird. Wenn ein Gen in ES-Zellen getrappt wird und die ES-Zellen nachfolgend eingesetzt werden, um Mäuse zu erzeugen, wird die Maus das getrappte Gen ubiquitär überexprimieren. Weitere Modifikationen können beispielsweise durchgeführt werden, um einen Promotor zu verwenden, der gewebsspezifisch ist, anstelle des PGK-Promotors, um das getrappte Gen in einer gewebsspezifischen Art und Weise zu exprimieren. Der Albumin-Promotor kann verwendet werden für die leberspezifische Überexpression. Des Weiteren könnte eine Signal-Sequenz zur 3'-Trap-Kassette hinzugegeben werden, um die Sekretion des Proteinprodukts des getrappten Gens aus der Zelle in den extrazellulären Zwischenraum, in den Blutkreislauf oder in Brust-Exkretionen zu verursachen. Dies könnte das Verständnis der Genfunktion realisieren helfen.
  • Da die Überexpression ein mögliches Resultat eines Gen-Trap-Ereignisses unter Verwendung der 3'-Gen-Trap-Kassette ist, könnte sie sich als verwendbar herausstellen, in der Lage zu sein, die 3'-Trap-Überexpressions-Komponente zu entfernen. Dies kann realisiert werden durch Flankieren irgendeiner essentiellen Komponente 3'-Gen-Trap-Kassette (essentielle Komponenten können den Promotor, das Exon, den Splice-Donor, die Intron-Sequenz oder die gesamte Kassette enthalten) mit Rekombinase-Stellen, wie z. B. diejenigen, erkannt durch die flp- oder cre-Rekombinasen. Auf diese Art und Weise ermöglicht die Zugabe der korrespondierenden Rekombinase in Zellen oder im Organismus, dass man je nach Wunsch konditional Überexpression zurückdrängen oder entfernen kann.
  • Für die Genaktivierung kann eine generische 3'-Gen-Trap-Kassette eingesetzt werden, welches ein Exon inkorporiert, das nativ ist für die oder kompatibel ist mit der Biologie der Target-Zelle, oder eine spezifische 3'-Gen-Trap-Kassette kann konstruiert werden, welches ein spezifisches Exon und eine Splice-Donor-Stelle von einem bekannten Gen einsetzt. Optional wird, geht man davon aus, dass die Genaktivierung zur Verwendung von 3'-Gen-Traps typischerweise verlangt, dass der Vektor strangaufwärts (5') von der Translations-Start-Stelle des aktivierten Gens integriert oder insertiert wird, das Genaktivierungs-Exon vorzugsweise nicht eine funktionelle Translations-Start-Stelle inkorporieren (IRES oder Kozak-Sequenz) oder wird nur eine nominal funktionelle (oder kryptische) Translations-Start-Stelle inkorporieren, welche in der Lage ist, nur zufällige Grade der Translations-Aktivität zu mediatisieren. Alternativ kann die Inkorporation einer internalen Ribosom-Eintrittsstelle in das Exon in einer Überexpression des 3' Gen-getrappten oder aktivierten Gens resultieren.
  • Wo ein Fusionsprodukt zwischen dem 3' Gen-Trap-Exon und einem strangabwärts gelegenen zellulär kodierten Exon (beispielsweise wenn es nur eine spezielle Domäne des Proteinprodukts des „aktivierten" Gens kodiert) gewünscht wird, wird der Gen-Trap-Vektor typischerweise eine funktionelle Tranlations-Start-Stelle oder eine internale Ribosom-Eintritts-Stelle und eine Translations-Start-Stelle inkorporieren.
  • Alternativ werden in den Fällen, wo die gewünschten Vektoren strangabwärts von der Translations-Start-Steile integriert werden, die Gene mutiert werden und Screens, um solch einen Verlust der Funktion zu detektieren, können eingesetzt werden. Ein Beispiel dieses Ansatzes würde sein, Fibroblasten zu mutieren, beispielsweise mit den vorliegenden Vektoren und nach Treffern zu screenen, welche das Wachstum in Softagar ermöglichen. Auf diesem Weg könnten Gene kodierend Tumor-Suppressoren identifiziert werden. Obwohl nur eines von zwei Allelen typischerweise getrappt werden wird, ist das Genom der Zellen in Kultur häufig unstabil, und durch Selektion können Ereignisse gefunden werden, in welchen das zweite Allele verloren geht. Dies macht es möglich, auch nach rezessiven Phenotypen zu suchen.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung schließt die Verwendung der beschriebenen Vektoren ein, um nicht-zielgerichtete spezifische Gen-Aktivierung zu bewirken. In solchen Verfahren wird das erste Exon eines gewünschten Gens in die beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette beispielsweise eines retroviralen Vektors eingebracht. Solche retroviralen Vektoren werden dann verwendet, um Target-Zellen zu infizieren, wobei die Vektoren über das gesamte Wirtszell-Genom in einer nicht-spezifischen/nichtzielgerichteten Art und Weise integrieren. Die infizierten Zellen können in selektiven Medien kultiviert werden, um die Population an Zellen anzureichern, welche den Vektor inkorporieren und diese Zellen können gescreent werden, vorzugsweise unter Verwendung von High-Troughput-Verfahren und Assays, um Zellen zu detektieren, welche eine aktive Form des gewünschten Produktes exprimieren (d.h., das Produkt kodiert durch das Gen, von welchem das erste Exon erhalten wurde).
  • 5.5.2 Funktionsbasierte Gen-Entdeckung
  • Die Gen-Aktivierungsfähigkeiten der hier beschriebenen Vektoren finden weitere Anwendungen in der selektiven Gen-Entdeckung. Beispielsweise können proliferationsdefiziente Zellen (beispielsweise Tumorsuppressor-oder DNA-Repair-Knockout-Zellen etc.) identifiziert werden mit dem hier beschriebenen Gen-Aktivierungs-Vektoren. Die infizierten Zellen können nachfolgend nach Zellen-Kolonien gescreent werden, welche einen partiell oder vollständig korrigierten Proliferations-Phenotyp anzeigen. Wenn Zellen, welche den korrigierten Phenotyp anzeigen, identifiziert werden, können die „aktivierten" Gene verantwortlich für das Korrigieren des proliferationsdefizienten Phenotyps schnell identifiziert werden durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung beispielsweise von 3' RACE. Typischerweise sind Gene, welche partiell oder vollständig den in DNA Reparier-Mutation korrigieren (Mutationen, häufig assoziiert mit Krebs in Tieren und Menschen), wahrscheinlicherwveise eher solche, welche eine Tumorsuppressor- oder möglicherweise Onkogen-Aktivität kodieren (siehe im Allgemeinen Selten et al., 1985, EMBO J., 4(7): 1793–1798).
  • Im Gegensatz dazu können krebsartige oder transformierte Zellen (oder Zelllinien) infiziert werden mit den beschriebenen Gen-Aktivierungsmethoden und nachfolgend verschiedenen zytotoxischen Agenzien ausgesetzt werden, welche toxisch für wachsende oder schnell wachsende Zellen sind (siehe im Allgemeinen Wilson et al., 1986, Cell, 44:477–487; Stephenson et al., 1973, J. Virol., 11:218–222; Sacks et al., 1979 Virology, 97:231–240; Inoue et al., 1983, Virology 125:242–245; Norton et al., 1984, J. Virol., 50:439–444; Cho et al., 1976, Science, 194:951–953; Steinberg et al., 1978, Cell 13:19–32; Maruyama et al., 1981, J. Virol., 37:1028–1043; Varmus et al., 1981, Cell, 25:23–26; Varmus et al., 1981, Virology, 108:28–46; Mathey-Prevot et al., 1984 J. Virol., 50:325–334; und Ryan et al., 1985, Mol. Cell. Biol., 5:3477–3582). Vorzugsweise werden die infizierten Zellen cytotoxischen oder chemotherapeutischen Agenzien unter Bedingungen ausgesetzt, wo die Zellen, welche in einen nicht-transformierten Phenotyp zurückgekehrt sind, kontakt-inhibiert und wenig empfänglich für cytotoxische Agenzien, welche in Kulturmedien vorliegen, sind. Dies trägt des Weiteren zur preferenziellen Eliminierung von schnell wachsenden und transformierten Zellen bei, und – nach einigen Zyklen – zur eventuellen Isolierung von Zellen, welche partiell oder vollständig in einen nichtkrebsartigen oder nichttransformierten Phenotyp zurückgekehrt sind. Die „aktivierten" Gene verantwortlich für die Korrektur des transformierten Phenotyps oder zum Unterdrücken des Tumor-Genen-Phenotyps können nachfolgend schnell identifiziert werden durch DNA-Sequenzierung unter Verwendung des beschriebenen 3' RACE-Protokolls.
  • Die hier beschriebenen Verfahren sind auch bedeutsam für das Identifizieren der genetischen Basis von Krebs. Krebsarten, welche untersucht werden können und potentiell korrigiert werden können unter Verwendung der hier beschriebenen Verfahren schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf: Herz: Sarcom (Angiosarcom, Fibrosarcom, Rhabdomyosarcom, Liposarcom), Myxom, Rhabdomyom, Fibrom, Lipom und Teratom; Lunge: Bronchogenes Karzinom (squamöse Zellen, undifferenziert kleinzellig, undifferenziert großzellig, Adenokarzinom), Alveolar (Bronchiolar-) Karzinom, bronchiales Adenom, Sarcom, Lymphom, chondromatöses Hämatom, Mesotheliom; Gastrointestinal: Esophagus (kleinzelliges Karzinom, Adenokarzinom, Leiomyosarcom, Lymphom), Magen (Karzinom, Lymphom, Leiomyosarcom), Pancreas (duktales Adenokarzinom, Insulinom, Glucagonom, Gastrinom, karzinoide Tumore, Vipom), Dünndarm (Adenokarzinom, Lymphom, karzinoide Tumore, Karposi-Sarcom, Leiomyom, Hämangiom, Lipom, Neurofibrom, Fibrom), Dickdarm (Adenokarzinom, tubulares Adenom, villöses Adenom, Hamartom, Leiomyom); Urogenitaltrakt: Niere (Adenokarzinom, Wilm's-Tumor (Nephroblastom), Lymphom, Leukemie), Blase und Harnröhre (Squamosus-Zell-Karzinom, transitionales Zellkarzinom, Prostata (Adenokarzinom, Sarcom), Testis (Seminom, Teratom, embryonales Karzinom, Teratom, embryonales Karzinom, Teratokarzinom, Choriokarzinom, Sarcom, Interstitiell-Zell-Karzinom, Fibrom, Fibroadenom, adenomatoide Tumore, Lipom); Leber: Hepatome (hepatozelluläres Karzinom), Cholangiokarzinom, Hepatoblastom, Angiosarcom, hepatozelluläres Adenom, Hämangiom; Knochen: Osteogenes Sarcom (Osteosarcom), Fibrosarcom, bösartiges fibröses Histiocytom, Chondrosarcom, Ewing-Sarcom, bösartiges Lymphom (Ritothelzellsarcom), multiples Myelom, bösartiger Riesenzelltumor, Chordom, Osteochrondrom (osteocartilaginöse Extosen), gutartiges Chondrom, Chondroblastom, Chondromyxofibrom, osteoides Osteom und Riesenzelltumore; Nervensystem: Schäden (Osteom, Hemangiom, Granulom, Xanthom, Osteitis Deformans), Meninges (Meningiom, Meningiosarcom, Gliomatoses), Gehirn (Astrocytom, Medulloblastom, Gliom, Ependymom, Germinom [Pinealom], Glioblastoma multiforme, Oligodendrogliom, Schwannom, Retinoblastom, Congenitaltumore), Chorda spinalis (Neurofibrom, Meningiom, Gliom, Sarcom); gynäkologisch: Uterus (endometriales Karzinom), Cervix (Cervical Karzinom, vorkrebsartige Cervical-Dysplasie), Ovarien (Ovar-Karzinom [seröses Cystadenokarzinom, muzinöses Cystadenokarzinom, endometrioide Tumore, Celioblastom, Klarzellkarzinom, unklassifiziertes Karzinom), Granulosa-thecal-Zelltumore, Sertoli-Leydig-Zelltumore, Dysgerminom, bösartiges Teratom), Vulva (squamöses Zellkarzinom, Intraepitheliales Karzinom, Adenokarzinom, Fibrosarcom, Melanom), Vagina (Klarzellkarzinom, squamöses Zellkarzinom, botryoides Karzinom [embryonales Rhabdomyosarcom], Fallopio-Kanal (Karzinom); hämatoligisch: Blut (myeloide Leukämie [akut und chronisch], akute lymphoblastische Leukämie, chronische lymphozytische Leukämie, chronische lymphocytische Leukämie, myeloproliferative Erkrankungen, multiples Myelom, myelodysplastisches Syndrom), Hodgkin's-Krankheit, nicht-Hodgkin's-Lymphom [bösartiges Lymphom]; Haut: bösartiges Melanom, Basalzellkarzinom, Squamouszell-Karzinom, Karposi-Sarcom, Pigmentflecken, dysplastische Nävi, Lipom, Angiom, Dermatofibrom, Keloide, Psoriasis; Brust: Karzinom und Sarcom und Nebennierendrüsen:Neuroblastom.
  • Modifikationen der oben genannten Studien schließen die Verwendung von retroviralen Gen-Trap-Vektoren im Zusammenhang mit chimärer Integrase ein, welche die retrovirale Integration in Gene, reguliert durch spezifische Steuer-Sequenz- oder Transkriptions-Faktoren, zielorientiert oder beeinflusst. Beispielsweise können die hier beschriebenen retroviralen Gen-Aktivierungs-Vektoren in einen Virus gepackt werden, welcher eine p53-chimäre Integrase inkorporiert (wie in WO 98/07389 beschrieben), welche in erster Linie Vektor-mediatisierte Gen-Aktivierung in Richtung von Genen zielorientiert, welche durch diese bekannte Tumor-Suppressor-Aktivität reguliert werden.
  • Geeignet modifiziert stellen die hier beschriebenen Vektoren des Weiteren ein Vehikel zum Platzieren virtuell einer jeden DNA-Sequenz über das Target-Zell-Genom hinweg zur Verfügung und zum schnellen Identifizieren, wo die Vektoren integriert haben. Eine wachsende Anzahl von DNA-Sequenzen sind identifiziert worden, von denen man wünschen könnte, sie über das Genom hinweg zu platzieren. Beispiele solcher Sequenzen schließen Rekombinations-Stellen wie z.B. frt-Stellen oder Lox P-Stellen, identifiziert durch flp und cre-Rekombinasen ein. Obwohl diese Stellen über das gesamte Genom hinweg platziert werden können, durch homologe Rekombination oder andere Transformations-Verfahren, ermöglicht die vorliegende Erfindung die schnelle Identifikation sowie das Katalogisieren der Integrations-Stellen unter Verwendung von automatisierten Prozessen. Diese Rekombinations-Stellen können verwendet werden zur spezifischen DNA-Insertion oder gemeinsam mit Insertionen in andere Positionen, und sie können verwendet werden, um chromosomale Umorganisierungen, wie z.B. Inversionen, Deletionen und Translokalisationen zu erzeugen. Folglich sind die hier beschriebenen Vektoren insbesondere bedeutsam zum Untersuchen der Gen-Funktion über chromosomale Umorganisierungen. Andere Sequenzen, von denen man wünschen könnte, sie über das gesamte Genom hinweg zu platzieren, schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf Tet-, Ecdyson-, oder Estrogenrezeptor-DNA-Bindungs-Stellen oder Antwortelemente. Diese Stellen werden im Allgemeinen verwendet zum Induzieren oder Unterdrücken der Genexpression, und durch Platzieren dieser Stellen über das gesamte Genom hinweg, vorzugsweise in zehntausenden unterschiedlicher Gene wird eine Möglichkeit zur Verfügung gestellt werden, um eine konditionale oder gewebspezifische Regulation der Genexpression zu erzeugen.
  • Ein weiteres Merkmal der beschriebenen Mutagenese-Strategie ist, dass Vektor kodierte Sequenzen und strukturelle Merkmale ausgenutzt werden können, um schnelle Identifikation von genomischer DNA, welche direkt die integrierten Gen-Trap-Konstrukte flankiert, zu ermöglichen. Dieser Ansatz nutzt die Tatsache aus, dass die Exon-Sequenz, welche das Gen identifiziert, in welches das Konstrukt integriert worden ist, zugänglich ist über die Sequenz-Akquisitionsfähigkeiten der 3' Gen-Trap-Kassette.
  • Oligonukleotide, welche mit geeignet (auf bioinformatischem Weg) identifizierten zellulären Exons hybridisieren, können im Zusammenhang mit Oligonukleotiden verwendet werden, welche mit der Vektor kodierten Sequenz in PCR-Reaktionen hybridisiert, welche Template erzeugt, die kloniert werden können oder direkt sequentiert werden können, um die Integrations-Stelle zu identifizieren. Wo PCR sich als nicht vollständig geeignet herausstellen könnte, können PCR-Reaktionen verbessert werden durch die Verwendung von Vektoren, welche erzeugt worden sind, um eine relativ seltene Restriktionsschnittstelle (beispielsweise Sfi I, etc.) einzubringen. Solche Restriktionsstellen können ausgenutzt werden, um die PCR-Produkte oder sogar die genomische Sequenz, welche den Vektor flankiert, in geeignete Klonierungs-Vektoren oder Bibliotheken davon zu subklonieren, welche anschließend verwendet werden können, um beispielsweise Vektor-Integrations-Stellen unter Verwendung etablierter Verfahren, beispielsweise PCR, Long-Range PCR, Zyklus-Sequenzieren etc zu identifizieren.
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung platziert ein Gen kodierend eine rekombinase Aktivität (beispielsweise flp oder cre, etc.), siehe US-Patent Nr. 5.654.182 und 4.959.317 in den Vektor enthaltend die beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette. Das rekombinase Gen kann in einer Art und Weise exprimiert werden ähnlich zu derjenigen beschrieben für die Marker Gene, siehe oben. Kurz gesagt, kann die Rekombinase exprimiert werden von einer unabhängigen Expression-Kassette, kann in eine 5' Gen-Trap eingebracht werden oder kann von einem Vektor-Promotor exprimiert werden. Abhängend von der Strategie, eingesetzt, um die Rekombinase zu exprimieren, kann sie auf einem separaten Konstrukt vorliegen oder in dem Vektor, entweder 5' oder 3' von der Gen-Trap-Kassette. Durch Einbringen des Rekombinase-Gens in die beschriebenen Gen-Trap-Vektoren kann eine Kollektion oder Bibliothek von mutierten Zellen erhalten werden, welche die Rekombinase in essentiell demselben Muster wie die verschiedenen getrappten Gene exprimieren. Die obige Diskussion beschreibt gerade einmal wenige Beispiele, wie die vorliegend beschriebenen Vektoren verwendet werden können, um irgendeine DNA-Sequenz über das gesamte Genom hinweg in einer Art und Weise zu platzieren, welche die rasche Identifikation ermöglicht, wo die Vektoren in das Target-Genom integriert haben. Die Fachleute auf dem Gebiet werden verstehen, dass die beschriebenen Vektoren eine Technologie konstituieren einer breiten Anwendungsmöglichkeit auf dem Gebiet der eukaryotischen Molekulargenetik. Als solche sind irgendwelche einer großen Vielzahl von Vektoren und genetischen Anwendungen inner halb des Umfangs der vorliegenden Offenbarung angedacht. Beispielsweise können retrovirale Vektoren konzipiert werden, welche eine 3' Gen-Trap-Kassette ohne die anderen beschriebenen Merkmale oder strangabwärts von einem mutagenen Mini-Exon und/oder Transkriptions-Terminator und/oder einer selbstschneidenden RNA-Sequenz enthalten. Des Weiteren können 3' Gen-Traps konzipiert werden mit Tandem-Promoteren, wo der eine der Promotoren induzierbar ist. Alternativ werden Gen-Traps auch angedacht, wo beispielsweise das SAneo der beschriebenen 5' Gen-Trap fusioniert worden ist, vorzugsweise in-frame an das Exon der beschriebenen 3' Gen-Trap-Kassette (d.h. unter Deletion der pA und Promotor-Sequenzen). Solch ein Konstrukt hat den Vorteil, sowohl der erhöhten SA-als auch SD-Funktionen der beschriebenen Gen-Trap-Kassetten und er ermöglicht die automatisierte Identifikation der Gene, welche in einer gegebenen Target-Zelle exprimiert werden. Solch ein Konstrukt wird im Zusammenhang mit einem strangaufwärts gelegenen mutagenen Mini-Exon verwendet.
  • 5.5.3 Konditionale Mutagenese
  • Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, Mutationen zu erzeugen, welche, temporär und räumlich, in Zellen oder in einem Organismus oder Tier ein- und ausgeschaltet werden können. Die Fähigkeit, ein Gen mit einer spezifischen Stelle oder einer spezifischen Zeit zu mutieren, hat bedeutsame Auswirkungen zum Verständnis der Gen-Funktion. Beispielsweise reguliert die Orientierung von SAβgeo innerhalb eines Introns, dessen Fähigkeit, das normale Transkript zu trappen und folglich zu mutieren, welches durch das getrappte Gen produziert wird. Geeignet orientierte frt-Rekombinase-Stellen können in Zusammenhang mit flp-Rekombinase verwendet werden, um die oben genannten Genom-Umorganisierungen zu bewirken (d.h. die Gen-Trap-Kassette zu „flippen" oder sogar zu entfernen und folglich die Mutation „an" oder „aus" zu schalten). Alternativ kann das cre/lox-System beispielsweise eingesetzt werden, um konditionale Mutationen zu erzeugen, wo ein gegebenes mutagenes Konstrukt selektiv nur modifiziert (ersetzt, geflippt, deletiert etc.) werden kann, in Geweben oder Zellen, welche die cre-Rekombinase exprimieren.
  • Um das obengenannte Konzept zu validieren, wurde ein Vektor erzeugt, welcher die SAβgeo-Kassette innerhalb von zwei invertierten Lox-Stellen platziert. Diese Stellen werden durch die cre-Rekombinase erkannt, welche effizient DNA-Sequenzen, lokali siert zwischen den Lox-Stellen, flippen kann. Ein retroviraler Vektor enthaltend SAβgeo, flankiert durch invertierte Lox-Stellen, wurde in ein Intron des HPRT-Gens durch homologe Rekombination integriert. Wenn SAβgeo in Vorwärtsorientierung vorlag, wurde die HPRT-Funktion beseitigt, wie durch das Überleben von Zellen in der Gegenwart von 6-Thioguanin demonstriert wurde. Jedoch wenn die cre-Rekombinase in diesen Zellen exprimiert wurde, wurde die Orientierung von SAβgeo geflippt in die umgekehrte Orientierung, und die HPRT-Funktion wurde regeneriert, wie durch das Wachstum der Zellen in HAT-enthaltendem Medium demonstriert wurde. Folglich wurde das HPRT-Gen effiziert ausgeschaltet oder angeschaltet durch flippende Orientierung von SAβgeo. Dementsprechend wird eine zusätzliche Ausführungsform der vorliegenden Erfindung auf die Vektoren gerichtet, welche die selektive und reversible Modulation der Gen-Expression ermöglichen. Unter Verwendung einer ähnlichen Verfahrensweise können die Gen-Trap-Mutationen auch abhängig oder geweb-spezifisch durch Verknüpfen der Rekombinase Expression gemacht werden, und damit das Flippen von SAβgeo, beispielsweise für verschiedene Stimuli/Steuer-Elemente. Es ist auch möglich, unter Verwendung einer Rekombinase-mediatisierten Strategie eine Allel-Serie zu erzeugen, um irgendeine einer Vielzahl von mehr oder weniger mutagenen Konstrukten (geeignet flankiert durch Lox-oder frt-Stellen) an oder aus zu „schalten".
  • Eine alternative Strategie für die Verwendung der hier beschriebenen Vektoren für die geweb-spezifische oder regulierbare Expression ist, spezifische DNA-Bindungsstellen wie z.B. frt- oder Lox-Stellen innerhalb der LTRs zu platzieren. Mit den Lox-Stellen in den LTRs kann, sobald die Insertion durchgeführt und identifiziert worden ist, die cre-Rekombinase, beispielsweise hinzugegeben werden und verwendet werden, um das gesamte Insert, ausgenommen ein LTR, enthaltend eine einzelne frt- oder Lox-Stelle, zu entfernen. Des Weiteren kann ein DNA-Antwort-Element, welches die regulierbare Gen-Expression ermöglicht, ganz oder teilweise eingebracht werden, in Verbindung mit den Rekombinase-Stellen. Wenn der Vektor oder das Gen-Trap-Insert durch die Rekombinase-Aktivität entfernt wird, wird das gleiche Rekombinations-Ereignis, welches in der Erzeugung von dem einzelnen LTR resultieren wird, auch ein funktionales DNA-Antwort-Element erzeugen. Dieses einzelne LTR wechselwirkt nicht mit der Gen-Funktion, jedoch das DNA-Element kann verwendet werden, um die Gen-Expression zu modulieren. Typische DNA-Elemente oder Operatoren, verwendet zum Modulieren von eukaryotischen Gen-Expressionen, schließen die Tet-, Ecdyson- oder Extrogen- DNA-Bindungsstellen ein. Das Vorliegen des Tet-Operators in Kombination mit dem Tet-Repressor-Protein würde die Expression des Gens, so dass es auf- oder abmoduliert wird, ermöglichen. Dies kann in Mäusen durchgeführt werden durch Kreuzen der Linie von Mäusen, welche die LTR-Insertion tragen mit Linien von Mäusen, welche den Tet-Repressor entweder ubiquitär oder nur in spezifischen Geweben exprimieren.
  • Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung basiert auf der Tatsache, dass die flp-Rekombinase beispielsweise das Ersetzen der frt-flankierten integrierten Vektor-Sequenzen mediatisieren kann, ohne exogen zugefügte frt-flankierte Sequenzen. Dementsprechend kann, sobald ein geeignet konstruierter Vektor (inkorporierend flankierende Rekombinase-Stellen) in einer gegebenen Region des Target-Zell-Genoms eingebracht worden ist, virtuell irgendeine der großen Vielzahl von DNA-Sequenzen (d.h. Promotoren, Enhanzern, IRES, Antwortelemente etc.), welche auch die gleichen flankierenden Rekombinase-Stellen inkorporieren ausgetauscht werden in oder aus dem Vektor heraus durch Einsetzen des geeigneten Rekombinase-Proteins.
  • 5.5.4 Biologische Assays
  • Wie evident ist, können Vektoren, insbesondere retrovirale Vektoren, einbringend die hier beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette verwendet werden, um die Expressionen von endogenen Genen in einer großen Vielzahl von eukaryotischen Target-Zellen zu mutieren, aktivieren oder zu steuern. Dementsprechend sind die hier beschriebenen Vektoren insbesondere bedeutsam, um molekular genetische Techniken in Pflanzen wie auch höheren Eukaryonten, wie z.B. Vögeln, Fischen und Säugetieren zu praktizieren. Beispiele solcher molekular genetischer Techniken schließen sowohl in vitro als auch in vivo Screens zur Gen-Aktivierung, -Mutation und -Regulierung ein.
  • Beispielsweise können CD4-positive menschliche T-Zellen, in vitro infiziert werden, mit den hier beschriebenen Vektoren und nachfolgend infiziert werden mit einem zytopathischen Stamm des human immunodeficiency virus (HIV). Zellen, welche in der Lage sind, die HIV-Infektion zu überleben, können isoliert werden und schnell gescreent werden hinsichtlich genetischer Mutationen, welche, welche assoziiert sind mit der HIV-Resistenz.
  • Eine andere Screening-Strategie, welche in vitro eingesetzt werden kann, ist das Mutieren von transformierten Zellen mit dem beschriebenen Gen-Trap-Vektoren und das Auswählen von Mutationen, welche die schnelle Proliferation der transformierten Zellen verhindern. Diese Strategie kann verwendet werden, um Onkogene zu identifizieren oder Tumor-Suppressor-Gene. Nach Mutation der Zellen können verschiedene Chemikalien verwendet werden, um die Zellen zu töten, welche schnell sich teilen, um nach Insertionen auszuwählen in Genen, welche eine Rolle in der Zellproliferation spielen sowie im transformierten Phenotyp. Ein Beispiel einer Chemikalie, welche schnell proliferierende Zellen abtötet, ist Bromodeoxyuridin (BrdU), Pestov und Lau, 1994, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91 (26): 12549–12553. BrdU interkaliet in erster Linie in der DNA von sich schnell teilenden Zellen und, nach Zugabe von Hoechst 33258, selektierte die Behandlung mit fluoreszierendem Licht negativ gegen sich schnell teilende Zellen, während zur gleichen Zeit nach langsam wachsenden Zellen selektiert wird.
  • Eine weitere Anwendung von Zellen transduziert mit den beschriebenen Vektoren sind zellbasierte in vitro Phenotyp-Screens, welche durchgeführt werden können unter Verwendung von heterozygoten Zellen oder unter Verwendung von Zellen, welche kultiviert wurden oder manipuliert wurden zur Homozygozität (unter Verwendung beispielsweise von hoher Konzentration von Antibiotika, um nach homozygoter Repräsentation des korrespondierenden auswählbaren Marker-Gens eingebracht in einen anwendbaren Gen-Trap-Vektor, zu selektieren) vor solchen Screening Assays.
  • Ein in vivo-Assay, angedacht durch die vorliegende Erfindung schließt die Anwendung von Vektoren ein, welche die 3'-Gen-Trap-Kassette einsetzen, um Tiere zu mutieren und in vivo zu screenen. In diesen Assays werden die vorliegenden Vektoren verwendet anstelle von oder zusätzlich zu klassischen chemischen Mutagenen wie z.B. ENU (siehe im Allgemeinen Vitaterna et al., 1994, Science, 264:719–725). Beispielsweise können Test-Tiere an verschiedenen Stellen infiziert werden und mit variierenden Konzentrationen der hier beschriebenen viralen Vektoren. Bevorzugte Arten der Verabreichung schließen oral, intranasal, rektal, topikal, intraperitoneal, intravenös, intramuskulär, subkutan, subdermal, intrakranial, intrathekal und dergleichen ein. Die anomalen zellulären Phenotypen, resultierend von solchen mutagenen Stimuli, können dann identifiziert, isoliert und gescreent werden. Wo Tumorzellen beobachtet und isoliert werden, kann 3' RACE eingesetzt werden, um schnell die Mutation, assoziiert mit dem Tumor-Genen- Phenotyp, zu identifizieren und folglich ein Kandidaten-Tumor-Suppressor-Gen oder potentielles Onkogen zu identifizieren.
  • Eine zusätzliche in vivo-Anwendung der hier beschriebenen Vektoren involviert die Erzeugung von mutierten Transgenen und somatischen Transgenen, Zellen, Tieren und Pflanzen, welche abnormal resistent sind oder für Infektion durch Pathogene, assoziiert mit infektiösen Erkrankungen, empfänglich sind.
  • Eine weitere bedeutsame Anwendung der vorliegenden Erfindung ist die Produktion im großen Maßstab von mutierten nicht-menschlichen transgenen Tieren. Solche nichtmenschlichen transgene Tiere können beispielsweise transgene Schweine, transgene Ratten, transgene Kaninchen, transgene Rinder, transgene Ziegen und transgene Tier-Spezies wie Vögel und Fische einschließen, insbesondere Säugetier-Spezien, die im Stand der Technik bekannt sind. Des Weiteren können Rinder, Schafe und Schweine-Spezies, verschiedene Mitglieder der Nagetier-Familie, beispielsweise Ratten, wie auch Kaninchen und Meerschweinchen und nicht-menschliche Primaten, wie z.B. Schimpansen verwendet werden, um die vorliegende Erfindung zu praktizieren. Insbesondere bevorzugte Tieren sind Ratten, Kaninchen, Meerschweinchen und am meisten bevorzugt Mäuse. Sowohl somatische Zell-transgene Tiere (siehe oben) sowie Keimbahn-transgene Tiere sind insbesondere angedacht. Des Weiteren sind solche Tiere die Quelle von Geweben und Zellen für weitere Gen-Trap-Untersuchungen unter Verwendung von kultivierten Zellen.
  • Die Produktion von Mutationen in embryonalen Maus-Stamm-Zellen durch homologe Rekombination ist wohl etabliert und hat sich als bedeutsam zum Untersuchen der Gen-Funktion in einem Säugetier-System gezeigt. Jedoch leidet das homologe Gen-Targeting unter einer Vielzahl von Einschränkungen. Eine solche Einschränkung ist der Bedarf für ein Gen, welches sowohl bekannt als auch kartiert ist, um die Exon/Intron-Struktur der genomischen Sequenz zu bestimmen. Selbst, wenn ein Gen und seine Struktur bekannt sind, muss ein Targeting-Vektor erzeugt werden für jedes individuelle Gen, das man zu mutieren wünscht. Dies begrenzt die Geschwindigkeit, mit welcher große Anzahlen von Genen durch homologe Rekombination mutiert werden können. Die hier beschriebenen Verfahren des nicht homologen 3' Gen-Trappens und Mutierens leiden nicht unter den oben erwähnten Einschränkungen.
  • Im Allgemeinen können nicht-spezifisch insertierte oder nicht-zielgerichtete Vektoren von Vektoren, konzipiert zur homologen Rekombination, unterschieden werden durch die Tatsache, dass solche Vektoren nicht die (extensiven) flankierenden Regionen von homologen Targeting-Sequenzen aufweisen, die typisch für DNA-Vektoren, konzipiert, um Sequenzen durch homologe Rekombination zu insertieren (siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,733,761, sind.
  • Andere Verfahren können verwendet werden, um Mutationen in Mäusen zu erzeugen. Dieses schließen chemische oder Bestrahlungs-induzierte Mutationen ein, welche verwendet werden können, um Gene zu mutieren, ohne frühere Kenntnis des Gens. Diese Mutationen können realisiert werden in einem großen Maßstab, benötigen jedoch häufig langwierige und involvierte Prozesse, um die mutierten Gene beispielsweise durch positionelles Klonen zu identifizieren. Des Weiteren werden diese Mutationen erst identifiziert nach Screenen einer großen Zahl von Mäusen auf Phenotypen. Dies macht eine große Mauskolonie, die großen Kosten des Aufrechterhaltens dieser Kolonie und die Zeit zum Züchten dieser Tiere notwendig. Verfahren werden benötigt, welche die schnelle Mutation von Genen ermöglichen, unabhängig von der früheren Kenntnis dieses Gens und ermöglichend die eindeutige Identifizierung des Gens. Das Gen-Trappen, wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, verleiht die Fähigkeit, große Anzahlen von Genen zu mutieren und die „beinahe" gleichzeitige Identifikation der Mutationen, immer noch im embryonalen Stamm-Zellen-Stadium. Dies ermöglicht die substanzielle Analyse von vorne herein, ohne das Anfallen der Kosten der Maus-Produktion im großen Maßstab undstellt, wie oben diskutiert, ein Gen-Entdeckungs-Komponente von hohem Potential zur Verfügung. Mäuse können nachfolgend produziert werden aus embryonalen Stammzellen enthaltend Gen-Trap-Mutationen in den ausgewählten Genen und die resultierten Phenotypen können schnell durch Identifizierung charakterisiert werden. Die resultierenden Knockout-Mäuse können nachfolgend gezüchtet werden, mit anderen Maus-Stämmen und rückgekreuzt werden, um Gen-gleiche oder rekombinant Gen-gleiche Tiere zu erzeugen, welche die Evaluation der Gen-Trap-Mutation in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglichen. Eine repräsentative Liste von verschiedenen Stämmen und genetischen Manipulationen welche verwendet werden kann, um die obigen Aspekte der vorliegenden Erfindung zu praktizieren (einschließend ES [embryonale Stamm]-Zell-Bibliotheken, wird bereitgestellt in „Genetic Variants and Strains of the Laboratory Mouse" 3rd Bd., Vols. 1 und 2, 1996, Lyon et al., eda., Oxford University Press, NY, NY.
  • Geht man davon aus, dass veränderte zelluläre Phenotypen mit hier beschriebenen Verfahren des Gen-Trappens bzw. der Gen-Aktivierung assoziiert sein können, sind weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung die Anwendung von Screening-Assays, um veränderte zelluläre und tierische Phenotypen nachzuweisen. Veränderte Phenotypen können auch nachgewiesen werden, nach Exponieren der mutierten Zellen und Tiere gegenüber exogenen Materialien und Verbindungen. Des Weiteren können die Gene/Proteine assoziiert mit den mutierten Phenotypen, isoliert werden und weiteren biochemischen Analysen unterzogen werden, um Wirkstoff-Kandidaten zu identifizieren, welche die normale Funktion des Proteins verändern, ersetzen, damit wechselwirken, inhibieren oder verstärken können.
  • Die vorliegende Erfindung wird des Weiteren illustriert durch die folgenden Beispielen, welche nicht so gedacht sind, dass sie in welcher Art und Weise wie auch immer limitierend sein sollen.
  • 6.0 Beispiele
  • Wenn Vektoren enthaltend sowohl SAβgeo (als eine 5' Exon-Trap) und PGKpuroSD (als ein 3' Exon-Trap) getestet wurden, wurde festgestellt, dass 13 mal so viele G418 resistente Kolonien erhalten wurden im Vergleich zu Puro-resistenten Kolonien. Dies zeigte, dass in vielen Fällen, wenn SAβgeo ein Gen trappte, der Puro-SD-Teil des Gen-Trap-Vektors nicht in der Lage war, effizient die 3' Teile des gleichen Gens zu trappen (wie dies durch das Nichtauftreten, des Verleihens von Puromycin–Resistenz gegenüber Target-Zellen evident ist). Darüber hinaus wurde, wenn G418-resistente Kolonien isoliert wurden und 3' RACE unterzogen wurden, um zu bestimmen, ob Puro in strangabwärts gelegene Exons gesplict wurde, jedoch nicht in hinreichend hohen Graden, um Puro-Selektion zur Verfügung stellen, gefunden, dass nur ungefähr 10% der Kolonien ein 3' RACE-Produkt lieferten. Des Weiteren zeigten die Sequenz-Daten, dass Splicen in der Mehrzahl der Fälle nicht auftrat. Diese Daten zeigten an, dass PGKpuroSD 3' Gen-Trap-Kassetten nur in strangabwärts gelegene Exons von Genen mit limitierter Effizienz zu splicen und strangabwärts gelegene Exons einfangen könnten.
  • Ähnlich ineffiziente Ergebnisse wurden auch beobachtet unter Verwendung einer Vielzahl anderer auswählbarer Marker zusätzlich zu Puro. Dies könnte davon herrühren, dass die meisten auswählbaren Marker von Mikroorganismen abgeleitet wurden. Beispielsweise wurde das Puro-Gen abgeleitet von Streptomyces Alboniger und inkorporiert folglich einen Codon-Gebrauch, welcher verschieden ist von dem typischerweise von Säugetier-Zellen verwendeten.
  • Um zu bestimmen, ob der Codon-Gebrauch verantwortlich für die beobachtete Ineffizienz im Splicen war, wurde ein Puro-Gen synthetisiert, welches einen optimierten Säugetier-Codon-Gebrauch inkorporierte. Jedoch wurden die 3' Gen-Trap-Kassetten, welche das modifizierte Puro-Exon inkorporierten, nicht effizient gesplict. Ein anderer möglicher Grund, für das inadäquate Splicen ist, dass der Puromycin-Marker 700 bp lang ist, wo hingegen die durchschnittliche Länge eines ersten Exons nur etwa 100 bp ist. Folglich blieb es des Weiteren möglich, dass das Platzieren eines auswählbaren Marker-Gens, nahe zu einem Promotor die optimale Erkennung des Puro-Exons, sowie der Splice-Donor-Sequenz durch die Splice-Maschinerie, verhinderte.
  • Nach der bedeutsamen Entdeckung, dass die zelluläre RNA-Splice-Maschinerie das Puro-Gen-Exon nur mit limitierter Effizienz verarbeiten konnte, wurde gefolgert, dass die 3' Gen-Trap-Kassetten enthaltend natürlich auftretende Säugetier-Exons möglicherweise merklich verstärktes Splice- und folglich Trap-Effizienzen zeigen würden. Um diese Hypothese zu testen, wurde eine 3' Gen-Trap-Kassette konzipiert, welche das Puro-Exon und die Splice-Donor-Stelle mit einem natürlich vorkommenden Maus-Exon mit einer nativen Splice-Donor-Sequenz ersetzte wie auch einem Teil der natürlich vorkommenden Intron-Sequenz folgend auf die Splice-Donor-Stelle (das erste Exon des Maus btk-Gens, Nukleotide 40.043 bis 40.250 der GenBank accession number MMU58105). Diese Kassette wurde nachfolgend 3' zum SAβgeo-Gen in den viralen Gen-Trap-Vektor insertiert. Das erste Exon des Maus btk-Gen wurde ausgewählt, da es etwa von der Größe eines durchschnittlichen ersten Säugetier-Exons ist und – was wichtig ist – es zuvor bestimmt worden war, dass, obwohl es natürlicherweise im Maus-Genom vorkommt, das btk-Gen nicht in Murinen ES-Zellen exprimiert wird. Dieses Merkmal ist wichtig, da, falls es in ES-Zellen exprimiert würde, das 3' RACE-Produkt immer mit der btk Sequenz vom endogenen Gen kontaminiert wäre und möglicherweise die Fähigkeit, die trappten Gene zu identifizieren, behindern würde. Konsequenterweise ist dies ein bevorzugtes Merkmal des 3' Gen-Trap-Kassetten-Exons, dass es von einem natürlich vorkommenden Gen abgeleitet ist, welches nicht normalerweise durch die Target-Zelle exprimiert wird oder nicht ohne externalen Stimulus oder Manipulation exprimiert wird.
  • Exons, welche in die hier beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette eingebracht werden können, können von Sequenzen genommen werden oder abgeleitet werden, welche natürlicherweise in irgendeiner der großen Vielzahl von eukaryotischen Zellen auftreten (z.B. Hefe, Insekten, Fungi, Pflanzen, Vögel, Reptilien, Fische, etc.), obwohl tierische Zellen, genauer gesagt, Säugetierzellen typischerweise bevorzugt sind. Alternativ können
    Exons konzipiert und synthetisiert werden (beispielsweise „Konsensus" Exons), so dass sie effizient und funktionell durch die mRNA-Verarbeitungs-Maschinerie der eukaryotischen Target-Zellen verarbeitet werden können (beispielsweise Splicen, Kappen, Polyadenylieren, Transport und Abbau).
  • Obwohl das erste Exon von btk hier spezifisch beispielhaft aufgeführt ist, ist die vorliegende Erfindung nicht auf dieses Exon limitiert. Virtuell jedes natürlich vorkommende Exon eines eukaryotischen Gens oder eine Serie von Exons von einem oder mehreren eukaryotischen Genen, ein Konsensus-Exon oder ein synthetisches Exon (wie das hier beschriebene Mini-Exon oder geeignet modifizierte Sequenzen, z.B. um Translation zu verhindern, korrespondierend zu Epitop-Tags wie im Allgemeinen beschrieben im US-Patent Nr. 5.652.128, dafür bekannt, dass es Effizienz durch die Target-Zellen gesplict) oder Exons, welche leicht erkannt und effizient verarbeitet werden durch die Target-Zellen RNA-Verarbeitungs – und Expressions-Maschinerie, können in die hier beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette eingebracht werden. Typischerweise sind die ersten Exons weniger als ungefähr 1.000 bp lang, mehr bevorzugt weniger als ungefähr 700 bp lang und noch mehr bevorzugt weniger als ungefähr 500 bp, und am meisten bevorzugt weniger als ungefähr 700 bp lang. Beispiele solcher ersten Exons können beispielsweise gefunden werden in GenBank und schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf erste Exons von menschlichen Wachstumshormonen, Erythropoietin, hprt, Metallothionein I und II, Mais, Weizen, Sojabohnen Ribulose 1,5-Bisphosphat Carboxylat, Ratten-(oder Mensch-, Hund-, Kaninchen-, Schwein-, Maus-, etc.) Preproinsulin, etc.
  • Geht man davon aus, dass typische antibiotische Resistenz-Marker nicht nativ für tierische oder Säugetier-Zellen sind, sind Marker, welche antibiotische Resistenz oder Sensitivität (Herpes Thymidinkinase) menschliche Target-Zellen verleihen im Allgemeinen nicht bevorzugt zum Einbringen in die hier beschriebene 3' Gen-Trap-Kassetten. In ähnlicher Art und Weise sind, geht man davon aus, dass typische verfügbare enzymatische Marker, welche in chromogenen Assays zum Nachweis und zur Selektion von Gen-Trap-Ereignissen eingesetzt werden könnten (beispielsweise β-Galactosidase, Meerrettich-Peroxidase, bakterielle alkalische Phosphatase, etc.)e auch nicht für das Säugetier-Genom nativ sind, solche Gene nicht bevorzugt für die Praktizierung der vorliegenden Erfindung. Jedoch, falls geeignete Manipulationen gefunden würden, welche die Effizienz erhöhten, mit welcher Transkripte kodierend die obigen auswählbaren und enzymatischen Marker verarbeitet und durch die Säugetier-Zellen exprimiert werden, könnten solche Marker verwendet werden, um die beanspruchte Erfindung zu praktizieren. Obwohl die oben genannten auswählbaren Marker und enzymatischen Reporter vorzugsweise nicht Teil der hier beschriebenen 3' Gen-Trap-Kassette sind, können sie als Teile der 5' Gen-Trap-Komponente in Kombination mit der beschriebenen 3' Gen-Trap-Kassette verwendet werden.
  • 6.1 Vektor Konstruktion
  • Der Promotor des Mausphosphoglycerat-Kinase-(PGK) Gens wurde strangaufwärts vom ersten Exon des natürlich vorkommenden murinen btk-Gens platziert (Nukleotide 40.043 bis 40.250 des murinen btk-Gens). Das erste Exon des btk-Gens enthält keine Translations-Start-Stelle und kein Initiations-Kodon markierend die 5' Region der kodierenden Sequenz; jedoch könnten diese Merkmale in das Exon technisch eingebaut werden, falls es gewünscht wird. Das 3' Ende der kodierenden Region des ersten Exons ist durch eine Splice-Donor-Sequenz markiert. Geht man davon aus, dass die Splice-Donor-Erkennungs-Sequenzen sich in Intron-Sequenzen ausdehnen können, wurden 103 Basen von Intron DNA nach dem Ende des btk ersten Exons beibehalten. Die PGKbtkSD-Kassette weist kein 3' Polyadenylierungssignal auf. Dementsprechend kann kein Transkript, produziert durch die Kassette, geeignet verarbeitet werden und folglich durch 3' RACE identifiziert werden, solange das Transkript nicht in ein 3' Exon gesplict wird, das polyadenyliert werden kann.
  • Die obige 3' Gen-Trap-Kassette wurde in einen retroviralen Vektor (in rückwärtiger Orientierung relativ zu den flankierenden LTR-Regionen) platziert, welcher eine Polyadenylierungs-Stelle 5' zu dem PGK-Promotor der 3' Gen-Trap-Kassette einbrachte, das Neo-Gen wurde 5' von der Polyadenylierungs-Stelle platziert und eine Splice-Akzeptor (SA)-Stelle wurde 5' zu der neo-kodierenden Region platziert, um eine funktionelle SAneopA – oder optional eine SAIRESneopA 5' Gen-Trap-Kassette zu erzeugen. Dieser Vektor inkorporiert auch in operabler Kombination ein Paar von Rekombinase-Erkennungs-Stellen, welche die PGKbtkSD-Kassette flankieren (siehe 2). Dieser Vektor verlangt typischerweise, dass die Target-Zelle natürlicherweise das getrappte Gen exprimiert; jedoch kann dieses Erfordernis durch Hinzufügen eines Promotors, welcher unabhängig die Expression eines auswählbaren Markers kontrolliert, beseitigt werden. 2 zeigt des Weiteren die bevorzugten Stellen der optionalen Merkmale wie z.B. des mutagenen Mini-Exons und einer oder mehrerer mutagener Enhancer-Regionen.
  • 6.2. 3'Gen-Trapping
  • Der btk-Vektor wurde in die embryonische Stammzellen unter Verwendung von Standard-Technik eingebracht. Kurz gesagt, wurde Überstand von GP + E Verpackungs-Zellen zu den ungefähr 2 × 106 embryonalen Stammzellen (in einem Zugabe-Verhältnis von ungefähr 0,1 Viren/Target-Zellen) für 16 Stunden hinzugefügt, und die Zellen wurden nachfolgend mit G418 für 10 Tage ausgewählt. G418 resistente Zellen wurden nachfolgend isoliert, kultiviert auf 96-Well-Platten und einer automatisierten RNA-Isolierung, reverser Transkription, PCR und Sequenzierungs-Protokollen, um die Gengetrappten Sequenzen zu erhalten, unterzogen.
  • Die RNA-Isolierung wurde durchgeführt auf DNA-bindenden Platten (Corning/Costar) behandelt mit 5'-Amino (dT)42 (GenoSys Biotechnologies) in einem 50mM Natrium Phosphatpuffer, pH 8,6, und bei Raumtemperatur über Nacht zum Absetzen stehen gelassen. Unmittelbar vor ihrer Verwendung wurden die Platten PBS und zweimal mit TE gespült. Die Zellen wurden mit PBS gespült, mit einer Lösung enthaltend 100mM Tris-HCl, 500mM LiCl, 10mM EDTA, 1% LIDS, und 5mM DTT in DEPC Wasser lysiert und auf die DNA bindende Platte transferiert, wo die mRNA gefangen war. Nach einer 15 minütigen Inkubation wurde die RNA zweimal mit der Lösung enthaltend 10mM Tris-HCl, 150mM LiCl, 1mM EDTA, und 0,1% LIDS in DEPC-Wasser gewaschen. Die RNA wurde anschließend dreimal mit der gleichen Lösung ohne LIDS gewaschen. Elutionspuffer enthaltend 2mM EDTA in DEPC-Wasser wurde hinzugegeben und die Platte wurde auf 70°C für fünf Minuten erhitzt. Eine Vormischung enthaltend 2x First Strand Puffer, 100mM Tris-NCl, pH 8,3, 150mM KCl, 6mM mgCl2, 2mM dNTPs, RNAGuard (1,5 Einheiten/Reaktion, Pharmacia), 20mM DTT, QT primer (3pmol/rxn, GenoSys Biotechnologies, Sequenz:
    5'CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGACTCGAGCTCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTT 3' und Superskript II Enzym (200 Einheiten/rxn, Life Technologies) wurde hinzugegeben und die Platte wurde auf einen Thermal-ZyKlisierungs-Apparat transferiert zum Zweck der RT-Reaktion (37°C für 5 min 42°C für 30 min und 55°C für 10 min).
  • Optional wird eine geeignete Restriktions-Stelle, z.B. SFI a oder b etc. in den Vektor technisch eingebaut (in beispielsweise dem Exon der 3' Gen-Trap-Kassette) und die resultierende RT-Reaktion kann in einen geeigneten Klonierungs- oder Explosions-Vektor einkloniert werden.
  • 6.2.1 PCR Produkt-Erzeugung
  • Die cDNA amplifiziert unter Verwendung von zwei Runden an PCR. Die PCR-Vormischung enthält: 1.1X MGBII Puffer (74 mM Tris pH 8.8, 18.3mM Ammoniumsulfat, 7.4mM MgCl2, 5.5mM 2ME, 0,011% Gelatin), 11.1% DMSO (Sigma), 1.67mM dNTPS, Taq (5 Einheiten/rxn), Wasser und Primer. Die Sequenzen der ersten runden Primer waren: Po 5' AAGCCCGGTGCCTGACTAGCTAG3'; BTKo 5' GAATATGTCTC-CAGGTCCAGAG3' und Qo 5' CCAGTGAGCAGAGTGACGAGGAC3' (pmol/rxn). Die Sequenzen der zweiten Runden-Primer waren Pi
    5' CTAGCTAGGGAGCTCGTC3'; BTKi
    5' CCAGAGTCTTCAGAGATCAAGTC3'; und Qi
    5' GAGGACTCGAGCTCAAGC3' (50pmol/rxn).
  • Die äußere Vormischung wurde zu einem Aliquot an cDNA hinzugegeben und für 17 Zyklen laufen gelassen (95°C für 1 min 94°C für 30 sec, 58°C für 30 sec 65°C für 3,5 min). Ein Aliquot dieses Produkts wurde zur inneren Vormischung hinzugegeben und bei den kleinen Temperaturen 40 mal zyklisiert.
  • Die ineinander verschachtelten 3' RAGE-Produkte wurden in einem 96-Well-Mikrotiter-Platten-Format aufgereinigt unter Verwendung eines zweistufigen Protokolls wie folgt. Fünfundzwanzig Mikroliter eines jeden PCR-Produkts wurden auf ein 0,25 ml Bett an Sephacryl® S-300 (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden), welches zuvor mit STE buffer equilibriert worden war (150 mM NaCl, 10 MM Tris-HCL, 1mM EDTA, pH 8,0) appliziert. Die Produkte wurden durch Zentrifugation bei 1200 × g für 5 Minuten zurückgewonnen. Dieser Schritt entfernt nicht inkorporierte Nukleotide, Oligonukleotide und Primer-Dimere. Als nächstes wurden die Produkte auf ein 0,25 ml Bett an Sephadex® G-50 (DNA Grade, Pharmacia Biotech AB) appliziert, welche mit MilliQ H2O equilibriert worden war und durch Zentrifugation, wie zuvor beschrieben, zurückgewonnen. Aufgereinigte PCR-Produkte wurden durch Fluoreszenz unter Verwendung von PicoGreen (Molecular Probes, Inc., Eugene Oregon) gemäß den Hersteller-Instruktionen quantifiziert.
  • Farbstoff-Terminator-Zyklisierungs-Sequenzierungs-Reaktion mit AmpliTag® FS DNA Polymerase (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA) wurde durchgeführt unter Verwendung von 7 pmol an Primer (Oligonukleotide OBS;
    5' CTGTAAAACGACGGCCAGTC3') und ungefähr 30–120 ng an 3' RACE-Produkt. Das Zyklisierungs-Profil betrug 35 Zyklen von 95°C für 10 sec, 55°C für 30 sec und 60°C für 2 min Nicht eingebrachte Farbstoff-Terminatoren wurden entfernt von der vervollständigten Sequenzierungs-Reaktion unter Verwendung von G-50 Säulen, wie zuvor beschrieben. Die Reaktionen wurden getrocknet unter Vakuum, resuspendiert in Beladungs-Puffer und elektrophoresiert durch ein 6% Long Ranger-Acrylamid gel (FMC BioProducts, Rockland, ME) auf einem ABI Prism® 377 mit XL upgrade gemäß den Hersteller-Instruktionen.
  • Die automatisierte 96-Well-Format wurde verwendet, um die Sequenz zu erhalten und die Daten wurden von 70% Kolonien erhalten. Nach Prüfung wurde die Sequenz des ersten Exons von btk, gefolgt von der btk Splice-Verknüpfung, identifiziert. Auf die Splice-Verknüpfung folgten einzigartige Sequenzen eines jeden separaten Gen-Trap-Ereignisses. Diese Sequenzen waren im Durchschnitt 500 bp lang und waren von einer hohen Qualität, enthaltend häufig lange offene Leserahmen. Darüber hinaus können 80% dieser Sequenzen unter Verwendung von Blast-Suchen mit Sequenzen, gefunden in der GenBank-Datenbank, abgeglichen werden, was darauf hindeutet, dass transkri bierte Exon-Sequenzen identifiziert wurden. Diese Gen-Trap-Sequenz-Tags sind von signifikant besserer Länge und Qualität als diejenigen, produziert durch frühere Gen-Trap-Designs. Die neuen Tags sind verbessert sowohl an Länge und Qualität und die Tatsache, dass 80% der Tags mit GenBank-Sequenzen zusammenpassen, legt nahe, dass sie effizient Gene trappen.
  • Diese Daten zeigen, dass die Splice-Maschinerie besser in der Lage ist, eine Exon-Typ-Sequenz vorliegend benachbart zu oder eng verwandt mit einem Promotor beim Splicen im strangabwärts gelegene Exons zu erkennen. Diese Daten zeigen auch, dass die Mehrzahl der G418 resistenten Kolonien identifiziert werden kann unter Verwendung von Gen-Trap-Sequenz-Tags. DNA-Sequenz-Daten wurden bereits erhalten, welche etwa 7000 verschiedene Gene repräsentieren, getrappt durch einen Vektor inkorporierend eine PGKpuroSD 3' Gen-Trap-Kassette in Verknüpfung mit Puro-Selektion. Geht man davon aus, dass bereits etabliert worden ist, dass solche Vektoren typischerweise um das 13-fache mehr G418 resistente Kolonien als Puro-Kolonien produzieren, haben Vektoren inkorporierend die hier beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette eine sehr große Target-Größe, wahrscheinlich gut über 70.000 Gene. Dieses Target kann des Weiteren vergrößert werden zur Verwendung von SaneopA-anstelle von SAβgeo-Fusion, um die Sensitivität der antibiotischen Selektion zu erhöhen, und irgendwelche anderen auswählbaren oder sonst wie identifizierbaren Marker könnten verwendet werden in der 5' Gen-Trap-Kassette. Die Verwendung von IRESneo vergrößerte die Anzahl der G418 resistenten Kolonien auf über 15fach der Zahl von Puro-resistenten Kolonien, demonstrierend seine verbesserte Sensitivität. Andere potentielle 5' Trap-Marker schließen ein, sind jedoch nicht limitiert auf antibiotische Resistenz-Gene (beispielsweise β-Lactamase) kolorimetrische Marker-Gene, Gene kodierend Rekombinase-Aktivität (z.B. flp oder cre, etc.), Enzyme, fluoreszente Marker-Gene (beispielsweise Gene kodierend Aktivitäten, welche direkt oder indirekt zelluläre Fluoreszenz mediatisieren) wie z.B. Gene kodierend grün fluoreszierendes Protein sowie Assays zum Nachweis derselben, welche u.a. beschrieben werden in US-Patent Nr. 5.625.048.
  • Typischerweise kann, je besser der auswählbare Marker ist, umso eine größere Anzahl an Target-Genen getrappt werden. Die Fähigkeit, das erste btk-Exon zu verwenden, um Gen-Trap-Sequenz-Tags von den 3' Exons der G418 resistenten Kolonien zu erhalten, erzeugte ungefähr 13-fach mehr mutierte Zellen als mutiert und schnell sequen tiert werden konnten unter Verwendung von früheren Vektoren und repräsentiert folglich eine signifikante Verbesserung in der Gen-Trap-Technologie.
  • Geht man von den obigen Ergebnissen aus, ist es klar, dass die überraschenden und unerwarteten Eigenschaften, welche in einer Größenordnungs-Verbesserung gegenüber irgendwelchen zuvor berichteten 3' Gen-Trap-Kassetten resultierten, nur durch Abweichen von unserem etablierten auswählbaren Marker-Paradigma zum Gen-Trappen realisiert wurde.
  • 6.3 Pharmacogenomics
  • Wie oben diskutiert, ist ein zusätzliches Verfahren zum Verbessern der Target-Größe der beschriebenen Vektoren und Konstrukte, auf die Selektion insgesamt zu verzichten und andere, beispielsweise molekular genetische Mittel zum Isolieren der getrappten Exone zu verwenden. Die Verwendung eines solchen Ansatzes ermöglicht die schnelle Erzeugung und Analyse von Gen-Sequenz-Information. Zusätzlich zum Bereitstellen eines klaren Vorteils im Hinblick auf die Geschwindigkeit der Sequenz-Akquisition, ermöglicht die Sequenzierung der Gen-getrappten Bibliotheken substanzielle Kostenersparnisse aufgrund der reduzierten Rate der Repeat-Sequenzen relativ zu konventionellen cDNA-Bibliotheken. Die ökonomischen Vorteile, die dem hier beschriebenen System der Sequenz-Akquisition inne wohnen, machen es praktikabel, leicht eine breit basierte Prüfung des Genoms eines Individuums zu erhalten oder eine Kollektion von Genomen von Individuen, um u.a. genetische Polymorphismen, insbesondere SNPs und cSNPs zu identifizieren, welche mit der Erkrankung (wo ein Teil des überprüften Individuums bekannt sind, allgemeine Erkrankungs-Merkmale oder Symptome zu manifestieren) zu identifizieren. Des Weiteren können ähnliche Verfahren eingesetzt werden in breit angelegten genomischen Assays, welche die genetische Basis für in Erscheinung tretende Merkmale, Wirksubstanzempfänglichkeit, Wirksubstanzsensitivität, Wirksubstanzallergie etc. identifizieren, und zwar sowohl in Menschen wie auch nicht-menschlichen Tieren.
  • In solchen Verfahren können bis hin zu Sättigungs-Konzentrationen von Konstrukten umfassend, die beschriebene 3' Gen-Trap-Kassette in geeignete Target-Zellen eingebracht werden, einschließend primäre menschliche oder nicht-menschliche Zellen (bei spielsweise primäre nukleatisierte Blut-Zellen wie z.B. Leukozyten und Lymphozyten etc.) unter Verwendung von etablierten Verfahren. Nachdem die 3' Sequenz-Akquisitions-Kassette in das Target-Zell-Genom integriert hat, wird RNA von den Target-Zellen isoliert, cDNA produziert (und optional via PCR, wie oben beschrieben, amplifiziert) und eine cDNA-Bibliothek wird konstruiert. Die Bibliothek wird nachfolgend sequenziert und katalogisiert/verglichen relativ zu einer Kontroll-Bibliothek wie auch anderen „experimentellen" Bibliotheken. Sobald SNPs, cSNPs oder andere noch merklichere Polymorphismen identifiziert werden, welche mit dem „experimentellen" oder „Erkrankungs"-Gruppen korrilieren, wird ein Katalog von genetischen Polymorphismen entwickelt, welcher sowohl eine Multi-Loci-Analyse zur Verfügung stellt wie auch die Regionen des Genoms hervorhebt, welche mit spezifischen Erkrankungen korrelieren oder anderweitig weitere Untersuchungen und Analysen garantieren. Solche Information kann sich als wertvoll für die Identifikation von genetischen Polymorphismen assoziiert mit Wirksubstanz-Effektivität herausstellen (oder mit nachteiligen Wirksubstanz-Reaktionen) wie auch für das Design von diagnostischen Assays.
  • 7.0 Verweis auf Mikroorganismus-Hinterlegungen
  • Die folgenden Plasmide wurden hinterlegt bei der American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA, unter den Bedingungen des Budapester Abkommens für die internationale Anerkennung von Hinterlegungen von Mikroorganismen zum Zwecke des Patent-Verfahrens sowie der Regulatoren darunter (Budapester Abkommen) und wird folglich aufbewahrt und zur Verfügung gestellt entsprechend den Bestimmungen des Budapester Abkommens. Die Verfügbarkeit eines solchen Plasmides soll nicht als eine Lizenz konstruiert werden, die Erfindung entgegen den Rechten, garantiert entsprechend der Autorität einer jeden Regierung in Überstimmung mit ihren Patentgesetzen, zu praktizieren.
  • Im hinterlegten Plasmid wurde die angegebene ATCC Belegungsnummer zugeordnet.
    Plasmid ATCC-Nr.
    PbtK 209712
  • Figure 00630001
  • SEQUENZPROTOKOLL
    Figure 00640001
  • Figure 00650001
  • Figure 00660001
  • Figure 00670001
  • Figure 00680001
  • Figure 00690001

Claims (20)

  1. Ein genetisch erzeugter Vektor umfassend: a) eine 5' Gen-Cassette umfassend in operabler Kombination: 1) einen Splice-Akzeptor; 2) eine erste Exon-Sequenz lokalisiert 3' zu besagtem Splice-Akzeptor, wobei besagtes erstes Exon einen Marker kodiert, welcher die Identifikation einer Zelle exprimierend besagtes Exon ermöglicht; und 3) eine Polyadenylierungs-Sequenz definierend das 3' Ende des ersten Exons; b) eine 3' Gen-Trap-Cassette lokalisiert 3' zu besagter Polyadenylierungs-Sequenz und umfassend in operabler Kombination: 1) einen Promotor 2) eine zweite Exon-Sequenz lokalisiert 3' von und exprimiert durch besagten Promotor, wobei besagtes zweites Exon nicht eine Aktivität verleihend antibiotische Resistenz kodiert; 3) eine Splice-Donor-Sequenz definierend die 3' Region des Exon; und c) ein Mutagenese-verstärkendes Mini-Exon umfassend in operabler Kombination, eine Splice-Akzeptor-Stelle, ein Stück einer Exonsequenz und einen Splice-Donor operativ positioniert strangaufwärts von dem Splice-Akzeptor von a)1); wobei besagter Vektor nicht einen Promotor kodiert, welcher die Expression von besagtem ersten Exon mediatisiert und wobei besagter Vektor keine Sequenz kodiert, welche die Polyadenylierung eines mRNA-Transkripts, kodiert durch besagte zweite Exon-Sequenz und exprimiert durch besagten Promotor, mediatisiert.
  2. Der Vektor gemäß Anspruch 1, wobei besagtes erstes Exon desweiteren eine internale Ribosom-Eintritts-Stelle kodiert, operativ positioniert zwischen besagtem Splice-Akzeptor und dem Start-Codon von besagtem ersten Exon.
  3. Der Vektor von Anspruch 1, wobei besagtes zweites Exon und besagte Splice-Donor-Sequenzen abgeleitet werden aus einem natürlich vorkommenden eukaryontischem Gen.
  4. Der Vektor von Anspruch 1 des weiteren einbringend in der Region zwischen besagter Polyadenylierungs-Sequenz und besagtem Promotor zumindest einen Mutagenese-Verstärker erhalten aus der Gruppe bestehend aus einer Transkriptionsterminations-Sequenz, einem 3' terminalen Exon, einer Sequenz kodierend eine selbst-schneidende RNA und einem Exon, welches den Leserahmen verändert.
  5. Der Vektor gemäß Anspruch 1, wobei besagtes erstes Exon einen Marker kodiert erhalten von der Gruppe bestehend aus einem Marker verleihend antibiotische Resistenz, einem Marker verleihend antibiotische Sensitivität, einem enzymatischen Marker, einer Rekombinase und einem per Fluoreszenz nachweisbaren Marker.
  6. Der Vektor gemäß Anspruch 5, wobei besagter Marker Neomycin-Resistenz kodiert.
  7. Ein genetisch erzeugter Vektor umfassend: a) ein Marker-Gen exprimiert durch einen ersten Vektor kodierten Promotor; und b) eine 3' Gen-Trap-Cassette umfassend in operabler Kombination: 1) einen zweiten Vektor-kodierten Promotor; 2) eine Exon-Sequenz lokalisiert 3' von und exprimiert durch besagten zweiten Promotor, wobei besagtes Exon nicht eine Aktivität verleihend antibiotische Resistenz kodiert; 3) eine Splice-Donor-Sequenz definierend die 3'-Region des Exons; c) ein Mutagenese-verstärkendes Mini-Exon umfassend in operabler Kombination eines Splice-Akzeptor-Stelle, ein Stück einer Exon-Sequenz und einen Splice-Donor, operativ verknüpft strangaufwärts von der 3' Gen-Trap-Cassette; wobei besagter Vektor nicht eine Sequenz kodiert, welche die Polyadenylierung eines mRNA-Transkripts, kodiert durch besagte Exon-Sequenz, mediatisiert.
  8. Ein infektiöses Retrovirus mit einem Genom erzeugt durch einen Vektor, gemäß einem der Anspruche 1 bis 7.
  9. Die ex vivo Verwendung eines Retrovirus gemäß Anspruch 8, um ein Gen in einer eukaryontischen Target-Zelle zu trapen.
  10. Die ex vivo Verwendung eines Vektors gemäß Ansprüchen 1 oder 7, um ein Gen zu trapen in einer eukaryontischen Target-Zelle, wobei besagter Vektor in besagte Target-Zelle eingebracht wird durch ein Verfahren ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Elektroporation, virale Infektion, Retrotransposition, Mikroinjektion und Transfektion.
  11. Eine transgene Zelle einbringend einen Vektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 7, in das Genom der Zelle.
  12. Ein transgenes, nicht menschliches Tier, welches genetisch modifiziert worden ist, um einen Vektor gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 7 in das Genom von einer oder mehrerer Zellen in das Tier einzubringen.
  13. Die ex vivo Verwendung eines Vektors gemäß irgendeinem der Ansprüche 1 oder 7, um die Expression eines natürlich vorkommenden Gens in einer Zelle zu aktivieren.
  14. Die Verwendung gemäß Anspruch 13, wobei besagte Zelle eine Säugetierzelle ist.
  15. Die Verwendung gemäß Anspruch 14, wobei besagte Säugetierzelle eine menschliche Zelle ist.
  16. Die Verwendung einer 3' Gen-Trap-Cassette, um die Expression eines zellulär kodierten Gens ex vivo zu verändern, wobei besagte 3' Gen-Trap-Cassette in operabler Kombination folgendes umfasst: 1) einen Promotor; 2) eine Exon-Sequenz lokalisiert 3' von und exprimiert durch besagten Promotor, wobei besagtes Exon nicht eine Aktivität verleihend antibiotische Resistenz kodiert; und 3) eine Splice-Donor-Sequenz definierend die 3' Region besagten Exons, wobei besagte Cassette nicht homolog in das Genom einer eukaryonschen Target-Zelle inkorporiert wird und besagte Splice-Donor-Sequenz des Transkripts, kodiert durch besagtes Exon, zu einer Splice-Akzeptor-Sequenz von besagtem zellulär kodiertem Gen gesplict wird; und wobei die 3' Gen-Cassette operativ strangabwärts von einem Mutagenese verstärkenden Mini-Exon positioniert wird, umfassend in operabler Kombination eine Splice-Akzeptor-Stelle, ein Stück einer Exon-Sequenz und einen Splice-Donor.
  17. Die Verwendung gemäß Anspruch 16, wobei besagte nicht homolog inkorporierte Cassette in einem Vektor vorliegt, welcher nicht spezifisch in das Genom der eukaryontischen Target-Zelle integriert hat.
  18. Die Verwendung gemäß Anspruch 17, wobei besagtes Exon nicht durch das Target-Zell-Genom kodiert wird oder nicht normal durch das Target-Zell-Genom exprimiert wird.
  19. Ein Prozess zum Erhalten einer eurkaryontischen Polynukleotid-Sequenz-Information umfassend: a) Einbringen in eine eukaryontische Zelle eines Vektors umfassend I) Eine 3' Gen-Trap-Cassette umfassend in operabler Kombination: 1) einen Promotor; 2) eine Exon-Sequenz lokalisiert 3' von und exprimiert durch besagten Promotor, wobei besagtes Exon nicht eine Aktivität verleihende Antibiotische Resistenz kodiert; und 3) eine Splice-Donor-Sequenz definierend die 3' Region des Exons, und II) Ein Mutagenese-verstärkendes Mini-Exon operativ positioniert strangaufwärts von besagter 3'-Gen-Trap-Cassette, wobei das Mutagenese-verstärkende Mini-Exon in operabler Kombination eine Splice-Akzeptor-Stelle, ein Stück einer Exon-Sequenz und einen Splice-Donor umfasst; b) Aufrechtefialten der Zelle unter Bedingungen, welche nicht spezifische oder nicht gezielte Integration der Gen-Trap-Cassette in das Genom der Zelle ermöglichen; c) Erhalten des chimeren Transkripts resultierend vom Splicen von besagtem Exon aus besagter 3' Gen-Trap-Cassette zu einem zweiten Exon, kodiert durch das Genom von besagter eukaryontischer Zelle; d) reverses Transkribieren besagten chimeren Transkripts in vitro, um ein cDNA Templat zu erzeugen; und e) Bestimmen der Polynukleotid-Sequenz der cDNA aus Schritt d.
  20. Der Vektor gemäß Anspruch 1, wobei besagtes zweites Exon synthetisch abgeleitet ist.
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