WO2001075127A2 - Klonierungssystem zur konstruktion von homologen rekombinationsvektoren - Google Patents

Klonierungssystem zur konstruktion von homologen rekombinationsvektoren Download PDF

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WO2001075127A2
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restriction
cloning system
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Michael Nehls
Sigrid Wattler
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Ingenium Pharmaceuticals Ag
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    • C12N2840/203—Vectors comprising a special translation-regulating system translation of more than one cistron having an IRES

Definitions

  • the invention relates to a new cloning system, consisting of a nector and adapter system, which considerably simplifies the construction of homologous recombination vectors for mutagenesis of genes in living eukaryotic cells.
  • the invention further relates to a method for producing homologous recombination vectors.
  • the invention relates to the use of the cloning system in order to change the genome at defined loci in eukaryotic cells, in particular embryonic stem cells.
  • Targeted mutagenesis is carried out using the homologous recombination method.
  • a synthetic vector which is inserted into a cell and contains parts of the chromosomal locus to be modified, recombines with the genomic DNA of the cell.
  • the isolation of the cells into which the vector DNA has been integrated chromosomally from the pool of non-recombined cells is made possible by a positive selection cassette in the vector which is flanked by the chromosomal vector DNA.
  • Any stable integration of the vector DNA leads to permanent resistance to a cytotoxic pharmacological agent which is expressed by a specific resistance gene. Examples of this are the resistance to geniticin (G418) by the integrated neomycin gene or the resistance to hygromycin by the integration of the hygromycin gene.
  • the inserted positive selection cassette can, through the choice of the insertion in the chromosomal vector DNA, lead to a mutation of the gene in the sense of a classic one Knock-outs, that is, inactivation of gene function.
  • Inactivating or modifying a regulatory-acting genetic element or functional sub-area of the transcribed translated gene product which influences gene expression can have a positive, negative and also a modifying influence on gene function.
  • the desired homologous recombination that runs over the positive selection cassette must be selected against the undesired non-homologous recombination that runs over the vector ends.
  • the vector ends are equipped with negative selection cassettes, which are then often integrated into the genome during non-homologous recombination (Mansour, SL, Thomas, KR and Capechi, MR (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature 336: 348-352).
  • a normally non-cytotoxic agent becomes cytotoxic when the negative selection cassettes are stably expressed.
  • HSV-tk herpes simplex virus thymidine kinase gene
  • the construction of the recombination vector therefore often represents the time-limiting step.
  • the previously known systems which are based on the use of homologous recombination in yeast or in bacteria, it takes several weeks to construct the recombination vector. So far, there is no experimental system that enables the completion of a vector for homologous recombination in a short time.
  • the invention is therefore based on the object of providing a system which enables the construction of a vector suitable for homologous recombination without complex cloning steps.
  • Another object of the invention is to provide a cloning system which does not depend on unique restriction enzyme recognition sequences for the introduction of the positive selection cassette.
  • the invention therefore relates to a cloning system for homologous recombination in eukaryotic cells, consisting of a vector adapter system comprising a lambda vector with at least two negative selection cassettes, at least two loxP sites present in the same orientation, an origin of replication located between the loxP sites, a resistance marker for bacteria and a genomic stuffer fragment, flanked by a 5 'and 3' restriction site linker and four different adapter oligonucleotides A, B, C and D, the 5 'nucleotide sequence of the adapter oligonucleotides A, B, C and D being a Contains restriction enzyme Sfi compatible end and the 3 'nucleotide sequence of the adapter oligonucleotides A, B, C, and D is homologous to the respective target gene.
  • the 5'-restriction site linker comprises the restriction sites 5'-BamHI-Sfi-C, Sall, Sfi-A, BamHI and the 3'- Restriction sites linker the restriction sites 3'-BamHI, Sfi-B, Sall, Sfi-D, Bamffl.
  • a cloning system is particularly preferred, the 5 'nucleotide sequence of the adapter oligonucleotides A and C comprising the restriction sites SfiA and SfiC and the 5' nucleotide sequence of the adapter oligonucleotides B and D comprising the restriction sites SfiB and SfiD.
  • the construction of a positive / negative recombination vector is greatly shortened and simplified by the cloning system according to the invention.
  • the cloning time is reduced to three days and the processing of several projects in one time unit is made possible. A previously complex process is thus significantly shortened and less expensive.
  • the cloning system according to the invention consisting of a vector adapter system allows any DNA to be converted into a complete recombination vector with flanking negative selection cassettes by a single cloning step.
  • a preferred cloning system according to the invention comprises a newly constructed lambda vector (lambda-KO-Sfi), as shown in FIG. 1.
  • the adapter oligonucleotides used in the cloning system according to the invention enable the efficient amplification of the genomic sequence to be mutated (hereinafter also referred to as the right and left homology arm).
  • the adapter oligonucleotides are constructed such that 15-50, preferably 20-25 base pairs (bp) of the 3 'nucleotide sequence are homologous to the respective target gene and the 5' nucleotide sequence contains an end compatible with the restriction enzyme Sfi.
  • the restriction enzyme Sfi enables the construction of several independent interfaces based on the freely selectable middle three base pairs of its restriction recognition sequence.
  • the adapter oligonucleotides with the restriction sites SfiB and SfiD are defined for the right arm and adapter oligonucleotides with the restriction sites SfiA and SfiC for the left arm.
  • the right homology arm with the adapter oligos B and D and the left homology arm with the adapter oligonucleotides A and C are amplified.
  • the amplification is carried out using a polymerase with 3 '-5' exonuclease activity, so that the probability of incorrectly incorporated bases is minimized.
  • the size of the PCR products and thus the length of the homology can be freely selected.
  • the two PCR products are ligated in a ligation approach with the positive selection cassette, which has the restriction sites SfiA and SfiB, and with the lambda KO-Sfi framework, which contains the restriction sites SfiC and SfiD.
  • Four incompatible restriction sites have thus been constructed using only one restriction enzyme, so that the ligation of the four fragments can only be carried out in one way and the cloning proceeds without false ligation products which otherwise lead to background.
  • the invention takes advantage of the high cloning capacity of lambda phage.
  • the PCR products of the homology arms can also be cloned if only very small amounts have been synthesized. This avoids the time-consuming testing of ideal conditions for PCR reactions with proof-reading polymerases.
  • the cloning of the recombination vector is independent of the restriction sites present in the genomic DNA, this allows the positive selection cassette to be placed at any position in the genome and also larger deletions to be set. After receiving the adapter oligonucleotides, the recombination vector is completed in three days.
  • the lambda vector KO-Sfi (see FIG. 1) is derived from the lambda vector KO (Nehls et al. (1994), Biotechniques 17: 4: 770-775).
  • the lambda vector KO is based on the vector Lambda 2001 (Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York).
  • Each genomic fragment inserted into the vector is automatically flanked by two negative selection cassettes, for example HSV-t &.
  • the vector also contains two loxP sites with the nucleotide sequence ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT oriented in the same orientation.
  • loxP sites After infection of the phage with a bacterial strain expressing cre recombinase (such as BNN132), these loxP sites enable the phage to be converted into a plasmid. Propagation of the plasmid is made possible by an origin of replication and resistance markers for bacteria located within the loxP sites, such as pBluescript (Stratagene, order number # 211201).
  • a genomic fragment of the phage preferably of approximately 5Kb (also referred to here as a stuffer fragment) was placed between the two thymidine kinase genes (HSV-t ⁇ :) in order to ensure the propagation of the phage.
  • a restriction interface linker with the following structure was used (see also FIG. 1):
  • the Sfi interfaces have the following sequences: Sfi A: ggccntagnggcc Sfi B: ggccngcgnggcc Sfi C: ggccnctgnggcc Sfi D: ggccncagnggcc
  • the Lambdaphagen DNA is first hydrolytically cleaved with Sfi.
  • the fragments obtained are purified and cut in a second digestion with the restriction enzyme Sall. That should end each three times be cut and religation products avoided during cloning.
  • the lambda arms are then cleaned by sucrose gradient centrifugation and thus separated from the stuffer fragment.
  • the PCR products are ligated under standard conditions and the in vitro packaging is carried out using a packaging extract (Gigapack plus) manufactured by Stratagene.
  • the adapter oligonucleotides (see also FIG. 1)
  • the adapter oligonucleotides serve to amplify the homology arms (0.8-12 kb) of the genomic sequence to be mutated and to incorporate these amplified sequences into the cloning vector Lambda-KO-Sfi.
  • the 5 'ends of the adapter oligonucleotides A, B, C and D each define the four different Sfi interfaces. After amplification of the genomic sequences, ie the right and left homology arms, and purification of the two PCR products, these are hydrolytically cleaved with Sfi. In order to ensure complete cleavage, an additional three nucleotides were placed at the 5 'ends of the adapter oligonucleotides (underlined in the table below). At the 3 'end of the Adapteroligonukleotide is homologous to the nucleotide sequence of each candidate gene nucleotide sequence is (as in the table below (N i genome sch) represented 25).
  • Sfi-B gac ggc cag cga ggc c (N g enom lsC h) 25
  • Sfi-C cag ggc cac tgc ggc c
  • an IRES- ⁇ -galactosidase MCS neomycin cassette was provided with the Sfi interfaces A and B and inserted into the LambdaKO-Sfi vector as a stuffer Cloned fragment. In this way, the expression of the endogenous gene can simultaneously be monitored.
  • DNA from the selection cassette is also obtained in a molar ratio, which can also be cleaned at the same time.
  • FIG. 1A shows a graphic representation of a cloning system according to the invention, consisting of a lambda vector (lambda-KO-Sfi) and four adapter oligonucleotides A, B, C and D.
  • the Lambda KO-Sfi The LambdaKo-Sfi vector consists of the right and left arm of the Lambda2001 (Ausubel, FM, Brent, R., Klingston, RE, Moore, DD, Seidman, JG, Smith, JA and Struhl, K. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York.), By Nehls et al. has been modified (Nehls et al. (1994), Biotechniques 17: 4: 770-775): two loxP sites oriented in the same orientation were introduced adjacent to the lambda arms.
  • restriction interface linker was newly introduced at the 5 'end of the stuffer fragment: BamHI-Sfi-C, Sall, Sfi-A, BamHI and a second restriction interface linker at the 3' end of the stuffer fragment: BamHI, Sfi-B, Sall, Sfi-D, BamHI.
  • the Sfi interfaces are defined as follows: Sfi-A: ggccNTAGNggcc; Sfi-B: ggccNGCGNggcc; Sfi-C: ggccNCTGNggcc; Sfi-D: ggccNCAGNggcc.
  • FIG. 1B shows a homologous recombination vector for targeted mutagenesis of ES cells, which consists of the cleaned, Sfi-cut lambda KO-Sfi arms, in which the PCR products (right and left homology arm) and the ES cell selection cassette in one Ligation step were ligated.
  • the left homology arm was amplified with adapter oligonucleotides C and A, the right arm with adapter oligonucleotides B and D.
  • the total size of the two PCR products can be freely selected within the range of 0.8-12 kb.
  • exon III of the Hprt gene is deleted. This mutation leads to the loss of function of Hprt, as already described by Hasty et al. (1991) Mol. Cell Biol. 11: 5586-5591.
  • the left homology arm of Hprt is 3639 bp long and ends with the 17th base of the 3rd exon.
  • the right homology arm which is 950 bp long, begins in the 3rd intron with the 39th base.
  • the bases in bold in the following list identify the adapter sequences.
  • PCR was carried out with the following reagents: Template 50-100 ng genomic DNA from ES cells of the mouse strain 129 oligonucleotides 2.5 ng / ⁇ l MWG ultrapure purified dNTP's 2 mM Pharmacia, order number # 27-2035-02 Taq polymerase 0.5 U Boehringer, expand high fidelity PCR system
  • the denaturation took place for 45 seconds at 94 ° C., the oligonucleotides were annealed for 1 minute at 56 ° C. and the synthesis for 3 minutes at 72 ° C. This cycle was repeated 34 times.
  • the PCR products were purified using the QIAquick PCR Purification Kit (order number # 21806) as described by the manufacturer.
  • the elution volume was 30 ⁇ l.
  • the purified PCR product was digested in a 50 ⁇ l batch with 40 U Sfi (Biolabs, order number # 123L) for three hours at 50 ° C. and then again purified using the QIAquick PCR Purification Kit and eluted from the column in 30 ⁇ l.
  • a typical ligation batch consisted of the following amounts in a 10 ⁇ l batch:
  • the ligation was carried out at room temperature for two hours.
  • 10 and 50 ⁇ l of the packaging reaction were used for infection with 300 ⁇ l of a growing culture of C600 bacteria (Stratagene, order number # 200261) and incubated on Lambda plates (Current Protocol in Molecular Biology) overnight.
  • Single plaques were taken up in 500 ul SM phage buffer (Ausubel, F.M. et al., (1994) Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). 50 ul phages in SM phage buffer were infected with 100 ul of a growing culture BNN 132 (30 minutes, 37 ° C) and then a liquid culture TB medium (Ausubel, FM et al., (1994) Current Protocol in Molecular Biology John Wiley & Sons, New York) plus 100 ⁇ g ampicillin / ml (Amersham, order number #US 11259-25) and inoculated overnight at 30 ° C in a bacterial shaker.
  • SM phage buffer 500 ul SM phage buffer
  • 50 ul phages in SM phage buffer were infected with 100 ul of a growing culture BNN 132 (30 minutes, 37 ° C) and then a liquid culture TB medium (Ausubel, FM et al
  • the plasmid DNA was obtained via QIAgen column chromatography (Qiagen, order number # 12143) according to the manufacturer's instructions.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein neues Klonierungssystem, bestehend aus einem Vektor- und Adaptersystem, das die Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren zur Mutagenese von Genen in lebenden eukaryontischen Zellen erheblich vereinfacht. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung homologer Rekombinationsvektoren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung des Klonierungssystems, um in eukaryontischen Zellen, insbesondere embryonalen Stammzellen, das Genom an definierten Loci zu verändern.

Description

Klonierungssystem zur Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren
Die Erfindung betrifft ein neues Klonierungssystem, bestehend aus einem Nektor- und Adaptersystem, das die Konstruktion von homologen Rekombinationsvektoren zur Mutagenese von Genen in lebenden eukaryontischen Zellen erheblich vereinfacht. Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung homologer Rekombinationsvektoren. Darüber hinaus betrifft die Erfindung die Verwendung des Klonierungssystems, um in eukaryontischen Zellen, insbesondere embryonalen Stammzellen, das Genom an definierten Loci zu verändern.
In der Literatur sind zahlreiche Verfahren beschrieben, wie anhand chromosomaler Veränderungen an Genen deren Expression bzw. Struktur verändert werden kann. (Capechi, M. R. (1989), Altering the genome by homologous recombination, Science 244:1288-1292; Bradley, A., Hasty, P., Davis, A. and Ramirez-Solis, R. (1992), Modifying the mouse: design and desire, Bio/Technology 10:534-539.)
Die gezielte Mutagenese wird mit dem Verfahren der homologen Rekombination durchgeführt. Dabei rekombiniert ein in eine Zelle eingebrachter synthetischer Vektor, der Teile des zu verändernden chromosomalen Lokus enthält, mit der genomischen DNA der Zelle. (Clarke, A. R. (1994), Murine genetic modeis for human diseases, Curr. Opin. Genet. Dev. 4:453-460; Melton, D. W. (1994), Gene targeting in the mouse, Bioassays 16:633-638.)
Die Isolierung der Zellen, in die die Vektor-DNA chromosomal integriert hat, aus dem Pool nicht-rekombinierter Zellen wird durch eine positive Selektionskassette im Vektor ermöglicht, die von der chromosomalen Vektor-DNA flankiert wird. Jede stabile Integration der Vektor-DNA führt zur dauerhaften Resistenz gegen ein zytotoxisches pharmakologisches Agens, welches von einem spezifischen Resistenzgen exprimiert wird. Beispiele dafür sind die Resistenz gegen Geniticin (G418) durch das integrierte Neomycingen oder die Resistenz gegen Hygromycin durch die Integration des Hygromycingens .
Die eingebrachte positive Selektionskassette kann durch die Wahl der Insertion in der chromosomalen Vektor-DNA zu einer Mutation des Gens im Sinne eines klassischen Knock-outs, das heißt Inaktivierung der Genfunktion, führen. Inaktivierung bzw. Modifikation eines die Genexpression beeinflussenden regulativ wirkenden genetischen Elements bzw. fünktionellen Teilbereichs des transkribierten translatierten Genprodukts kann sowohl positiven, negativen, als auch modifizierenden Einfluß auf die Genfunktion haben. (Bradley, A., Hasty, P., Davis, A. and Ramirez-Solis, R. (1992), Modifying the mouse: design and desire, Bio/Technology 10:534-539; Van der Neut, R. (1997), Targeted gene disruption: Applications in Neurobiology J. Neurosci. Methods 71 : 19-27.
Die gewünschte homologe Rekombination, die über die positive Selektionskassette verläuft, muß gegen die unerwünschte nicht-homologe Rekombination, die über die Vektorenden verläuft, selektioniert werden. Dazu werden die Vektorenden mit negativen Selektionskassetten ausgestattet, die dann häufig bei der nicht-homologen Rekombination ins Genom integriert werden (Mansour, S. L., Thomas, K. R. and Capechi, M.R. (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature 336:348-352). Ein normalerweise nicht zytotoxisches Agens wird bei stabiler Expression der negativen Selektionskassetten zytotoxisch. Beispiel hierfür ist die aktivierte Zytotoxizität von Gancyclovir durch das Herpes simplex Virus Thymidinkinase-Gen (HSV-tk) (Mansour, S. L., Thomas, K. R. and Capechi, M.R. (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non- selectable genes, Nature 336:348-352).
Die Wahrscheinlichkeit einer homologen Rekombination ist abhängig von deren Isogenie mit der genomischen DNA der Zielzelle, (te Riele, H., Maandag, E. R. and Berns, A. (1992), Highly efficient gene targeting in embryonic stem cells through homologous recombination with isogenic DNA constructs, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5128-5132.)
Die Klonierung von chromosomalen DNA- Ab schnitten des zu verändernden Lokus, der molekularbiologische Zusammenbau eines bakteriellen Plasmid-Vektors mit der entsprechenden chromosomalen DNA, die gezielte Integration der positiven Selektionskassette und das Ausstatten beider homologer Fragmente mit negativen Selektionskassetten ergeben zwangsläufig, dass die Konstruktion eines homologen Rekombinations-Vektors meist zu einem langwierigen und technisch aufwendigen Unterfangen wird. Zeitlimitierend erweist sich dabei die Notwendigkeit, für das Einbringen der positiven Selektionskassette in die Ziel-DNA auf einzigartige Restriktionsenzymerkennungssequenzen (Restriktionsschnittstellen) angewiesen zu sein. Daraus ergeben sich aufwendige, zeit- und arbeitsintensive Klonierungen. Bei der gezielten Mutagenese eines eukaryontischen Genoms mittels homologer Rekombination stellt die Konstruktion des Rekombinationsvektors daher oft den zeitlimitierenden Schritt dar. Bei den bisher bekannten Systemen, die auf der Nutzung homologer Rekombination in Hefe oder in Bakterien beruhen, sind zur Konstruktion des Rekombinationsvektors mehrere Wochen erforderlich. Es existiert bisher kein experimentelles System, welches die Fertigstellung eines Vektors für die homologe Rekombination in kurzer Zeit ermöglicht.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, ein System bereitzustellen, welches die Konstruktion eines für die homologe Rekombination geeigneten Vektors ohne aufwendige Klonierungsschritte ermöglicht.
Der Erfindung liegt weiterhin die Aufgabe zugrunde, ein Klonierungssystem bereitzustellen, welches für das Einbringen der positiven Selektionskassette nicht auf einzigartige Restriktionsenzymerkennungssequenzen angewiesen ist.
Die Aufgabe wird gelöst durch den Gegenstand der Patentansprüche.
Die Erfindung betrifft daher ein Klonierungssystem zur homologen Rekombination in eukaryontischen Zellen, bestehend aus einem Vektor-Adaptersystem, umfassend einen Lambda- Vektor mit mindestens zwei negativen Selektionskassetten, mindestens zwei in gleicher Orientierung vorliegenden loxP-Stellen, einen zwischen den loxP-Stellen befindlichen Replikationsursprung, einen Resistenzmarker für Bakterien und ein genomisches Stuffer-Fragment, flankiert von je einem 5' und 3' Restriktionsschnittstellenlinker und vier verschiedene Adapteroligonukleotide A, B, C und D, wobei die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C und D ein zum Restriktionsenzym Sfi kompatibles Ende enthält und die 3'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C, und D zum jeweiligen Zielgen homolog ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst der 5'- Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 5'-BamHI-Sfi-C, Sall, Sfi-A, BamHI und der 3'- Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 3'-BamHI, Sfi-B, Sall, Sfi-D, Bamffl.
Besonders bevorzugt ist ein Klonierungssystem, wobei die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A und C die Restriktionsschnittstellen SfiA und SfiC und die 5'- Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide B und D die Restriktionsschnittstellen SfiB und SfiD umfasst.
Überraschenderweise wird durch das erfindungsgemäße Klonierungssystem die Konstruktion eines positiven/negativen Rekombinationsvektors stark verkürzt und vereinfacht. Bei Verwendung des erfindungsgemäßen Klonierungssystems wird die Klonierungszeit auf drei Tage verkürzt und die Bearbeitung mehrerer Projekte in einer Zeiteinheit ermöglicht. Ein bisher aufwendiges Verfahren wird somit erheblich verkürzt und kostengünstiger.
Das erfindungsgemäße Klonierungssystem bestehend aus einem Vektor-Adaptersystem erlaubt es, jede beliebige DNA durch einen einzigen Klonierungsschritt in einen vollständigen Rekombinationsvektor mit flankierenden negativen Selektionskassetten umzuwandeln.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Klonierungssystem umfasst einen neu konstruierten Lambda- Vektor (Lambda-KO-Sfi), wie in Abbildung 1 dargestellt.
Die im erfindungsgemäßen Klonierungssystem eingesetzten Adapteroligonukleotide ermöglichen die effiziente Amplifikation der zu mutierenden genomischen Sequenz (nachfolgend auch als rechter und linker Homologiearm bezeichnet).
Die Adapteroligonukleotide sind so aufgebaut, dass 15-50, vorzugsweise 20-25 Basenpaare (bp) der 3 '-Nukleotidsequenz zum jeweiligen Zielgen homolog sind und die 5'- Nukleotidsequenz ein zum Restriktionsenzym Sfi kompatibles Ende enthält. Das Restriktionsenzym Sfi ermöglicht die Konstruktion von mehreren unabhängigen Schnittstellen aufgrund der frei wählbaren mittleren drei Basenpaare seiner Restriktionserkennungssequenz. Zur Amplifikation der Homologiearme werden für den rechten Arm die Adapteroligonukleotide mit den Restriktionsschnittstellen SfiB und SfiD und für den linken Arm Adapteroligonukleotide mit den Restriktionsschnittstellen SfiA und SfiC definiert. Demgemäß werden der rechte Homologiearm mit den Adapteroligos B und D und der linke Homologiearm mit den Adapteroligonukleotide A und C amplifiziert. Die Amplifikation erfolgt dabei unter Verwendung einer Polymerase mit 3 '-5' Exonuklease- Aktivität, so dass die Wahrscheinlichkeit falsch eingebauter Basen minimiert wird.
Die Größe der PCR-Produkte und damit die Länge der Homologie ist frei wählbar. Die beiden PCR-Produkte werden in einem Ligationsansatz mit der positiven Selektionskassette, die die Restriktionsschnittstellen SfiA und SfiB besitzt sowie mit dem Lambda-KO-Sfi- Gerüst, dass die Restriktionsschnittstellen SfiC und SfiD enthält, ligiert. Es sind somit mittels nur einem Restriktionsenzym vier nicht kompatible Restriktionsschnittstellen konstruiert worden, wodurch die Ligation der vier Fragmente nur in einer Weise erfolgen kann und die Klonierung ohne falsche Ligationsprodukte verläuft, die ansonsten zu background führen. Darüberhinaus macht sich die Erfindung die hohe Klonierungskapazität von Lambdaphagen zunutze.
Die PCR-Produkte der Homologiearme sind auch dann klonierbar, wenn nur geringste Mengen synthetisiert worden sind. Damit wird ein aufwendiges Austesten von Idealbedingungen für PCR-Reaktionen mit Proof-Reading-Polymerasen vermieden. Die Klonierung des Rekombinationsvektors ist unabhängig von in der genomischen DNA vorhandenen Restriktionsschnittstellen, dies erlaubt die positive Selektionskassette an jede beliebige Position im Genom zu plazieren und auch größere Deletionen zu setzen. Nach Erhalt der Adapteroligonukleotide ist der Rekombinationsvektor in drei Tagen fertig gestellt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Der Lambdavektor KO-Sfi
Der Lambdavektor KO-Sfi (siehe Fig. 1) ist von dem Lambdavektor KO (Nehls et al. (1994), Biotechniques 17:4:770-775) abgeleitet. Der Lambdavektor KO beruht auf dem Vektor Lambda 2001 (Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York). Jedes in den Vektor inserierte genomische Fragment ist automatisch von zwei negativen Selektionskassetten, zum Beispiel HSV-t&, flankiert. Der Vektor enthält weiterhin zwei in gleicher Orientierung gerichtete loxP-Stellen mit der Nukleotidsequenz ATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTAT. Diese loxP-Stellen ermöglichen nach Infektion des Phagen mit einem cre-Rekombinase exprimierenden Bakterienstamm (wie z.B. BNN132) die Konvertierung des Phagen in ein Plasmid. Die Propagation des Plasmids wird durch einen innerhalb der loxP-Stellen befindlichen Replikationsursprung und Resistenzmarker für Bakterien ermöglicht, wie zum Beispiel pBluescript (Stratagene, Bestellnummer #211201).
Bei der Konstruktion des Lambdavektors wurde zwischen die beiden Thymidinkinasegene (HSV-tÄ:) ein genomisches Fragment des Phagen, vorzugsweise von ca. 5Kb, (hier auch als Stuffer-Fragment bezeichnet) plaziert, um die Propagation des Phagen zu gewährleisten. Dabei wurde ein Restriktionsschnittstellenlinker mit folgenden Aufbau eingesetzt (siehe auch Fig. 1):
5'- BamHI- Sfi-C, Sall, Sfi-A, Bamffl 3'- BamHI, Sfi-B, Sall, Sfi-D, BamHI
Die Sfi-Schnittstellen besitzen die folgenden Sequenzen: Sfi A: ggccntagnggcc Sfi B: ggccngcgnggcc Sfi C: ggccnctgnggcc Sfi D: ggccncagnggcc
Aus den vorstehend genannten neu eingebrachten Linkersequenzen wurden zudem zwei, für die jeweiligen Enden spezifischen Sequenzierprimer abgeleitet:
MM-D 5 ' -gacggatcctcggccactg MM-C 5'-ctcgaggatccggccactg
Zur Verwendung als Klonierungsvektor wird die Lambdaphagen-DNA zunächst mit Sfi hydrolytisch gespalten. Die erhaltenen Fragmente werden gereinigt und in einem zweiten Verdau mit dem Restriktionsenzym Sall geschnitten. Damit sollte jedes Ende dreimal geschnitten sein und Religationsprodukte bei der Klonierung vermieden werden. Die Lambda-Arme werden dann durch Sucrosegradientenzentrifugation gereinigt und auf diese Weise von dem Stuffer-Fragment getrennt. Die Ligation der PCR-Produkte erfolgt unter Standardbedingungen und die in vitro Verpackung erfolgt unter Verwendung eines von Stratagene hergestellten Verpackungsextraktes (Gigapack plus).
Die Adapteroligonukleotide (siehe auch Fig. 1)
Die Adapteroligonukleotide dienen zur Amplifikation der Homologiearme (0.8 —12 kb)deτ zu mutierenden genomischen Sequenz und zum Einbau dieser amplifizierten Sequenzen in den Klonierungsvektor Lambda-KO-Sfi.
Die 5 '-Enden der Adapteroligonukleotide A, B, C und D definieren jeweils die vier verschiedenen Sfi-Schnittstellen. Nach Amplifikation der genomischen Sequenzen, d.h. des rechten und linken Homologiearmes, und Aufreinigung der beiden PCR-Produkte werden diese mit Sfi hydrolytisch gespalten. Um eine vollständige Spaltung zu gewährleisten, wurden an den 5 '-Enden der Adapteroligonukleotide zusätzlich drei Nukleotide plaziert (in nachfolgender Aufstellung unterstrichen dargestellt). Am 3'-Ende der Adapteroligonukleotide befindet sich eine zur Nukleotidsequenz des jeweiligen Kandidatengens homologe Nukleotidsequenz (in nachfolgender Aufstellung als (Ngenomisch)25 dargestellt).
Sfi-A: cga ggc cgc tat ggc c(Ngenomt ch)25
Sfi-B: gac ggc cag cga ggc c(NgenomlsCh)25 Sfi-C: cag ggc cac tgc ggc c
Figure imgf000009_0001
Sfi-D: cag ggc cac tgc ggc c (Nge„omisch)25
Die Selektionskassette
Um bei einem Knock-out eines Gens gleichzeitig die Expression des endogenen Gens überwachen zu können, wurde eine IRES-ß-Galaktosidase-MCS-Neomycin-Kassette mit den Sfi Schnittstellen A und B versehen und in den LambdaKO-Sfi- Vektor als Stuffer-Fragment einkloniert. Auf diese Weise kann gleichzeitig die Expression des endogenen Gens überwacht werden. Bei einer Lambda-Phagen-DNA-Präparation fällt daher auch DNA der Selektionskassette im molaren Verhältnis an, die gleichzeitig mitgereinigt werden kann.
Die verwendeten Abkürzungen besitzen erfindungsgemäß die folgende Bedeutung:
Außer den im Duden gebräuchlichen Abkürzungen, den üblichen Codes für Aminosäuren und Nukleotide sowie den gängigen Kürzeln für Restriktionsenzyme, Polymerasen, usw. wurden folgende Abkürzungen verwendet:
Bp Basenpaar
ES-Zellen embryonale Stammzellen hprt-Gen Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferasegen
HSK Herpes Simplex Virus
MCS multiple cloning site μl Mikroliter
Ng Nanogramm
Ori Origin of replication
PCR Polymerasekettenreaktion t£-Gen Thymidin-Kinase-Gen
U Unit
Die Erfindung wird weiter durch die folgende Zeichnung erläutert:
Figur 1A zeigt eine graphische Darstellung eines erfindungsgemäßen Klonierungssystems, bestehend aus einem Lambda- Vektor (Lambda-KO-Sfi) und vier Adapteroligonukleotiden A, B, C und D .
Der Lambda KO-Sfi: Der LambdaKo-Sfi Vektor besteht aus dem rechten und linken Arm des Lambda2001 (Ausubel, F. M., Brent, R., Klingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A. and Struhl, K. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York.), der von Nehls et al. abgeändert wurde (Nehls et al. (1994), Biotechniques 17:4:770-775): angrenzend an die Lambdaarme wurden zwei in gleicher Orientierung gerichtete loxP-Stellen eingebracht. Zwischen die loxP-Stellen wurde in den rechten Lambdaarm das Gen für die ß-Lactamase sowie ein Replikationsursprung (ori) inseriert. Ein genomisches Stuffer-Fragment ist beidseits von zwei Kassetten für die negative Selektion flankiert. (Mansour, S. L., Thomas, K. R. and Capechi, M.R. (1988), Disruption of the proto-oncogene int-2 in mouse embryo derived stem cells: a general strategy for targeting mutations to non-selectable genes, Nature 336:348-352). An das 5'- Ende des Stuffer-Fragmentes wurde folgender Restriktionschnittstellenlinker neu eingebracht: BamHI- Sfi-C, Sall, Sfi-A, BamHI und ein zweiter Restriktionschnittstellenlinker an das 3'- Ende des Stuffer-Fragmentes: BamHI, Sfi-B, Sall, Sfi-D, BamHI. Die Sfi- Schnittstellen sind folgendermaßen definiert: Sfi-A: ggccNTAGNggcc; Sfi-B: ggccNGCGNggcc; Sfi-C: ggccNCTGNggcc; Sfi-D: ggccNCAGNggcc.
Figur 1B zeigt einen homologen Rekombinationsvektor zur gezielten Mutagenese von ES- Zellen, der aus den gereinigten, Sfi geschnittenen Lambda KO-Sfi-Armen besteht, in denen die PCR-Produkte (rechter und linker Homologiearm) und die ES-Zell-Selektionskassette in einem Ligationschritt ligiert wurden. Dazu wurde der linke Homologiearm mit den Adapteroligonukleotiden C und A amplifiziert, der rechte Arm mit den Adapteroligonukleotiden B und D. Die Gesamtgröße der beiden PCR-Produkte kann dabei in den Grenzen von 0.8-12 kb frei gewählt werden.
Beispiele
Die nachstehenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sind jedoch nicht begrenzend zu verstehen.
Beispiel 1:
Konstruktion eines homologen Rekombinationsvektors für das Hprt-Gen
Zur Konstruktion eines homologen Rekombinationsvektors für das Hprt-Gen wurden die folgenden experimentellen Schritte durchgeführt:
A. Auswählen genomischer Oligonukleotide für die PCR der Homologiearme
Im gewählten Beispiel wird das Exon III des Hprt-Gens deletiert. Diese Mutation führt zum Funktionsverlust von Hprt, wie bereits von Hasty et al. (1991), Mol.Cell Biol. 11 : 5586-5591, beschrieben.
Der linke Homologiearm von Hprt ist 3639 bp lang und endet mit der 17ten Base des 3ten Exons. Der rechte Homologiearm, der 950 bp lang ist, beginnt im 3ten Intron mit der 39ten Base. Die in der nachfolgenden Aufstellung fettgedruckten Basen kennzeichnen die Adaptersequenzen.
Sfi-A cga ggc cgc tat ggc c ga gca agt ctt tca gtc cta tag Sfi-B gac ggc cag cga ggc c gg gcc att cta gtt tta tct ata
Sfi-C gca ggc cac tgc ggc c gg tta gaa gaa ttg gct ctc gtt g
Sfi-D cag ggc cac tgc ggc c gc agt ttt acc tgc atg ccc
B. Genomische PCR
Die PCR wurde mit den folgenden Reagenzien durchgeführt: Template 50-100 ng Genomische DNA aus ES-Zellen des Maus-Stammes 129 Oligonukleotide 2.5 ng/μl MWG ultrapure gereinigt dNTP's 2 mM Pharmacia, Bestellnummer #27-2035-02 Taq-Polymerase 0.5 U Boehringer, Expand high fidelity PCR System
# 1732650
10 x Buffer 1 x Arbeitskonzentration
Die Denaturierung erfolgte für 45 Sekunden bei 94 C, das Anlagern der Oligonukleotide ("Annealing") für 1 Minute bei 56°C, die Synthese für 3 Minuten bei 72°C. Dieser Zyklus wurde 34 mal wiederholt.
Aufreinigung der PCR-Produkte
Die PCR-Produkte wurden unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit (Bestellnummer #21806) nach den Beschreibungen des Herstellers aufgereinigt. Das Elutionsvolumen betrug 30 μl .
D. Sfi- Verdau der PCR-Produkte
Das aufgereinigte PCR-Produkt wurde im 50 μl Ansatz mit 40 U Sfi (Biolabs, Bestellnummer #123L) drei Stunden bei 50°C verdaut und anschließend wiederum unter Verwendung des QIAquick PCR Purification Kit aufgereinigt und in 30 μl von der Säule eluiert.
E. Ligation der Sfi-geschnittenen PCR-Produkte mit Lambda-KO-Sfi und der positiven Selektionskassette
Ein typischer Ligationsansatz bestand aus folgenden Mengen in einem 10 μl Ansatz:
50 ng Lambda-KO-Sfi-Arme (Sfi geschnitten)
10 ng Selektionskassette (Sfi geschnitten)
1 ng rechter Homologiearm
1 ng linker Homologiearm 1 x Ligationspuffer (Boehringer)
1 U T4-Ligase (Boehringer, Bestellnummer #716354)
Die Ligation erfolgte bei Raumtemperatur für zwei Stunden.
F. In vitro- Verpackung
2 μl des vorstehend genannten Ligationsansatzes wurden für 1.5 Stunden bei Raumtemperatur mit 10 μl Verpackungsextrakt in vitro veφackt (Stratagene, Gigapack III plus, Bestellnummer #200204).
G. Plattierung der Library
Je 10 und 50 μl der Veφackungsreaktion wurden zur Infektion mit je 300 μl einer wachsenden Kultur von C600-Bakterien (Stratagene, Bestellnummer #200261) verwendet und auf Lambda-Platten (Current Protocol in Molecular Biology) über Nacht inkubiert.
H. Plasmidkonvertierung
Einzelplaques wurden in 500 μl SM-Phagenpuffer (Ausubel, F.M. et al., (1994) Current Protocol in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York) aufgenommen. Je 50 μl Phagen in SM-Phagenpuffer wurden mit 100 μl einer wachsenden Kultur BNN 132 infiziert (30 Minuten, 37°C) und dann eine Flüssigkultur TB Medium (Ausubel, F.M. et al., (1994) Current Protocol in Molecular Biology John Wiley & Sons, New York) plus 100 μg Ampicillin/ml (Amersham, Bestellnummer #US 11259-25) angeimpft und über Nacht bei 30°C im Bakterienschüttler inkubiert.
L Plasmidpräparation
Die Plasmid-DNA wurde über QIAgen-Säulenchromotografie (Qiagen, Bestellnummer #12143) nach den Angaben des Herstellers gewonnen.

Claims

PATENTANSPRÜCHE
1. Klonierungssystem zur homologen Rekombination in eukaryontischen Zellen, bestehend aus einem Vektor-Adaptersystem, umfassend
einen Lambda- Vektor, gekennzeichnet dadurch dass dieser a) mindestens zwei negative Selektionskassetten b) mindestens zwei in gleicher Orientierung vorliegende loxP-Stellen c) einen zwischen den loxP-Stellen befindlichen Replikationsursprung d) einen Resistenzmarker für Bakterien; und e) ein genomisches Stuffer-Fragment, flankiert von je einem 5' und 3' Restriktionsschnittstellenlinker, enthält;
und vier verschiedene Adapteroligonukleotide A, B, C und D, wobei die 5'- Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C und D ein zum Restriktionsenzym
Sfi kompatibles Ende enthält und die 3 '-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A, B, C, und D zum jeweiligen Zielgen homolog ist.
2. Klonierungssystem gemäß Anspruch 1, wobei der 5'- Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 5'-BamHI-Sfi-C, Sall, Sfi-A,
BamHI und der 3'-Restriktionsschnittstellenlinker die Restriktionsschnittstellen 3'-BamHI, Sfi-B, Sall, Sfi-D, BamHI umfasst.
3. Klonierungssystem gemäß Anspruch 1, wobei
die 5 '-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide A die Restriktionsschnittstellen
SfiA, die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide C die Restriktionsschnittstellen SfiC, die 5'-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide B die Restriktionsschnittstellen
SfiB, und die 5 '-Nukleotidsequenz der Adapteroligonukleotide D die Restriktionsschnittstellen SfiD umfasst.
4. Klonierungssystem gemäß Anspruch 1, wobei die zum jeweiligen Zielgen homologe 3' Nukleotidsequenz der Adaptemukleotide A, B, C, und D 15 bis 50 bp, vorzugsweise 20-25 bp umfasst.
5. Verfahren zur Herstellung eines homologen Rekombinationsvektors, bestehend aus
einem Lambda- Vektor mindestens zwei negativen Selektionskassetten, mindestens einer positiven Selektionskassette und einem linken und rechten Homologiearm
umfassend die Schritte: a) Auswählen von zum Zielgen homologer Sequenzen (genomischer
Oligonukleotide) zur Amplifikation der 5'- und 3'-Homologiearme mittels PCR; b) Amplifikation der 5'- und 3 '-Homologiearme mittels PCR und Aufreinigung der PCR-Produkte; c) Restriktionsverdau der aufgereinigten PCR-Produkte mittels Restriktionsenzym Sfi; d) Ligation der Sfi-geschnittenen Fragmente mit einem Sfi-geschnittenen Lambda- Vektor und einer Sfi-geschnittenen positiven Selektionskassette; e) in v/tro-Veφackung der Ligationsprodukte und Plattierung der Phagenbibliothek; und f) Plasmidkonvertierung und Gewinnung der DNA des homologen
Rekombinationsvektors.
6. Verfahren zur Herstellung eines homologen Rekombinationsvektors gemäß
Anspruch 5, gekennzeichnet dadurch, dass der Lambda- Vektor Lambda KO-Sfi ist.
7. Verwendung des Klonierungssystem gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4 um in eukaryontischen Zellen, insbesondere embryonalen Stammzellen, das Genom an definierten Loci zu verändern.
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