DE602005003011T2

DE602005003011T2 - Verfahren zur genetischen diversifizierung in genkonversionaktiven zellen

Info

Publication number: DE602005003011T2
Application number: DE602005003011T
Authority: DE
Inventors: Jean-Marie Buerstedde; Hiroshi Arakawa
Original assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschungszentrum fuer Gesundheit und Umwelt GmbH
Current assignee: Helmholtz Zentrum Muenchen Deutsches Forschung De
Priority date: 2004-02-23
Filing date: 2005-02-23
Publication date: 2008-08-14
Anticipated expiration: 2025-02-24
Also published as: CN1934244A; EP1718734B1; DE602005003011D1; CN103396997A; JP2012210229A; EP1718734A1; AU2005215914B2; US8518699B2; US20070186292A1; US20140068795A1; EP1568765A1; AU2005215914C1; JP5192153B2; ATE376584T1; EP1718734B8; AU2005215914A1; WO2005080552A1; CA2556997A1; DK1718734T3; JP2007522813A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur gezielten und selektiven genetischen Diversifizierung einer Zielnukleinsäuresequenz oder eines Genprodukts durch Ausbeuten der Beziehung zwischen Immunglobulingen-Konversion und Hypermutation in Antikörper herstellenden Zellen.
Viele Ansätze zur Herstellung von Diversität in Genprodukten verlassen sich auf die Herstellung einer sehr großen Anzahl von Mutanten, welche dann unter Verwendung von leistungsstarken Verfahren zur Selektion ausgewählt werden. Diese Systeme weisen jedoch eine Anzahl von Nachteilen auf. Wenn die Mutagenese in vitro mit Genkonstrukten durchgeführt wird, welche danach in vitro oder als Transgene in Zellen oder Tieren exprimiert werden, ist die Genexpression in dem physiologischen Kontext schwierig und das mutierte Repertoire ist in der Zeit fixiert. Wenn die Mutagenese andererseits in lebenden Zellen durchgeführt wird, ist es schwierig, Mutationen zu einer Zielnukleinsäure dorthin zu leiten, wo sie gewünscht werden. Daher ist die Effizienz der Isolierung von Molekülen mit verbesserter Aktivität durch wiederholte Zyklen der Mutation und Selektion mit ausreichender Effizienz beschränkt. Darüber hinaus ist eine zufällige Mutagenese in vivo toxisch und induziert wahrscheinlich ein hohes Niveau an unerwünschten sekundären Mutationen.
In der Natur findet eine gezielte Diversifizierung einer ausgewählten Nukleinsäuresequenz in den rearrangierten V(D)J-Segmenten des Immunglobulin (Ig) Gen-Locus statt. Das primäre Repertoire an Antikörperspezifitäten wird durch einen Prozess des Rearrangements von DNA hergestellt, bei dem das Zusammenfügen (joining) von Immunglobulin V-, D- und J-Gensegmenten eine Rolle spielt. Nach dem Treffen auf Antigen unterliegen die rearrangierten V(D)J-Segmente in den B-Zellen, deren Oberflächen Ig das Antigen mit niedriger oder mittlerer Affinität binden kann, einer zweiten Welle der Diversifizierung durch Hypermutation. Diese sogenannte somatische Hypermutation bildet das sekundäre Repertoire, aus dem erhöhte Bindungsspezifitäten ausgewählt werden, was zu einer Affinitätsreifung der humoralen Immunantwort führt (Milstein und Rada, 1995).
Die Immunglobulin-Loci von Maus und Mensch enthalten große Pools von V-, D- und J-Gensegmenten, welche an dem V(D)J-Rearrangement teilnehmen können, so dass eine wesentliche Diversität in diesem Stadium durch zufällige Kombination hergestellt wird. Andere Spezies wie Huhn, Kaninchen, Kuh, Schaf und Schwein nutzen eine andere Strategie, um ihr primäres Ig-Repertoire zu entwickeln (Butler, 1998). Nach dem Rearrangement eines einzelnen funktionellen V- und J-Segments kommt es durch Genkonversion in einem spezialisierten lymphoiden Organ, der Bursa von Fabricius (Reynaud et al., 1987; Arakawa und Buerstedde, im Druck) zu einer weiteren Diversifizierung des Gens für die leichte Kette des Huhns. Während diesem Prozess werden Abschnitte von Sequenzen aus nicht funktionellen Pseudo-V-Genen in das rearrangierte V-Gen transferiert. Die 25 Pseudo-V-Gene sind oberhalb des funktionellen V-Gens gelegen und teilen eine Sequenzhomologie mit dem V-Gen. Ähnlich zu der Situation bei Menschen und Mäusen findet eine Affinitätsreifung nach dem Treffen auf Antigen durch Hypermutation in den Keimzentren der Milz des Huhns statt (Arakawa et al., 1996).
Alle drei B-Zell-spezifischen Aktivitäten der Bildung des Ig-Repertoires-Genkonversion (Arakawa et al., 2002), Hypermutation und Rekombination beim Isotyp-Wechsel (Muramatsu et al. 2000; Revy et al., 2000) – benötigen eine Expression des Gens für Aktivierungs-induzierte Deaminase (Activation induced Deaminase, AID). Während es anfänglich vorgeschlagen wurde, dass AID ein DNA editierendes Enzym ist (Muramatsu et al., 1999), weisen noch neuere Studien darauf hin, dass AID DNA direkt durch Deaminierung von Cytosin zu Uracil modifiziert (Di Noia und Neuberger, 2002). Die Cytosin-Deaminierungsaktivität muss jedoch weiter reguliert werden, da nur Unterschiede in dem Typ, der Lokalisierung und der Weiterverarbeitung der durch AID induzierten DNA-Modifizierung das selektive Auftreten von Rekombination und Hypermutation in verschiedenen Arten und Umgebungen der B-Zelle erklären können. Basierend auf der Entdeckung, dass bestimmte Mutationen von AID die Rekombination beim Wechsel, aber nicht somatische Hypermutation beeinflussen, wurde vorgeschlagen, dass AID der Bindung an einen Co-Faktor bedarf, um eine Rekombination beim Wechsel zu beginnen (Ta et al., 2003; Barreto et al., 2003).
Eine Analyse von DT40 Knockout Mutanten weist darauf hin, dass das RAD54 Gen (Bezzubova et al., 1997) und andere Mitglieder des RAD52 Rekombinationsreparaturweges notwendig zu einer effizienten Ig Genkonversion sind (Sale et al., 2001). Störung von RAD51 Analoga und Paraloga induziert die Ig Genkonversion und induziert Hypermutation in dem rearrangierten Gen für die leichte Kette (Sale et al., 2001), was darauf hinweist, dass ein Defekt in der Reparatur von DNA durch homologe Rekombination die Ig Genkonversion zur Hypermutation verschieben kann.
Kürzlich wurden erste Zellsysteme entwickelt, welche das Phänomen der somatischen Hypermutation in dem Immunglobulin-Locus nutzen, um Mutanten eines Zielgens in konstitutiver und gezielter Art herzustellen. Diese Zellsystemen erlauben es, durch zyklische Schritte der Herstellung von Mutationen und Selektion ein Genprodukt herzustellen, welches eine gewünschte Aktivität aufweist. Damit beschreiben WO 00/22111 und WO 02/100998 eine humane Burkitt-Lymphom Zelllinie (Ramos), welche zu gezielter konstitutiver Hypermutation einer bestimmten Nukleinsäureregion in der Lage ist. Diese mutierte Region kann das endogene rearrangierte V-Segment oder ein endogenes Gen sein, welches funktionsfähig mit Kontrollsequenzen verbunden ist, die die Hypermutation regeln. Ein wesentlicher Nachteil dieses Zellsystems ist, dass menschliche Zellen nicht ef fizient durch gezielte Integration genetisch manipuliert werden können, da transfizierte Konstrukte sich hauptsächlich an zufälligen chromosomalen Positionen einfügen.
WO 02/100998 beschreibt auch ein anderes Zellsystem zur Herstellung von genetischer Diversität in dem Ig-Locus, welches auf der Hühner B-Zelllinie DT40 basiert. DT40 führt eine Genkonversion des rearrangierten Immunglobulingens der leichten Kette während der Zellkultur fort (Buerstedde et al., 1990). Es ist wichtig, dass diese Zelllinie ein hohes Verhältnis der gezielten gegenüber der zufälligen Integration von transfizierten Konstrukten aufweist, und dadurch eine effiziente genetische Manipulation erlaubt (Buerstedde und Takeda, 1991). Gemäß WO 02/100998 führt eine Deletion von den Paralogen des RAD51-Gens in DT40, welche eine Roll bei homologer Rekombination und DNA-Reparatur spielen, zu einer Abnahme der Genkonversion und einer gleichzeitigen Aktivierung der Hypermutation des rearrangierten V-Segments. Der hauptsächliche Nachteil dieses Systems ist jedoch, dass die mutierten Zellen eine Defizienz der DNA-Reparatur aufweisen, wie durch Sensitivität gegenüber Röntgenstrahlen und chromosomale Instabilität wiedergegeben wird. Die Mutanten weisen auch eine geringe Proliferationsrate und eine geringe Effizienz des Gentargetings auf. Daher ist dieses System schlecht für eine effiziente genetische Diversifizierung und Selektion geeignet.
Die vorliegende Erfindung überwindet die Nachteile der Systeme aus dem Stand der Technik und stellt auch weitere Vorteile bereit.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem ersten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur gezielten und selektiven Diversifizierung von endogenen Immunglobingenen oder Teilen davon durch Hypermutation oder eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion bereitgestellt, umfassend die Deletion von allen oder einem Teil der Genkonversions-Spender in einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, die Konversionsaktivität des Immunglobulingens aufweist und die keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die für Paraloge und Analoge des RAD51-Gens kodieren, welche für wichtige homologe Kombinationsfaktoren kodieren.
In einem zweiten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur gezielten und selektiven Diversifizierung einer transgenen Zielnukleinsäure durch (a) Hypermutation oder (b) eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion bereitgestellt, umfassend die Insertion eines genetischen Konstrukts, das (a) die Zielnukleinsäure oder (b) die Zielnukleinsäure und mindestens eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen, in den Immunglobulin-Locus einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, die Konversionsaktivität des Immunglobulingens aufweist und die keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die für Paraloge oder Analoge des RAD51-Proteins kodieren.
In einem dritten Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren zur gezielten und selektiven Diversifizierung einer transgenen Zielnukleinsäure durch (a) Hypermutation oder (b) eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion bereitgestellt, umfassend die Insertion eines genetischen Konstrukts, welches Sequenzen enthält, die Hypermutation und/oder Genkonversion steuern und (a) die Zielnukleinsäure oder (b) die Zielnukleinsäure und mindestens eine Sequenz, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen, in den Immunglobulin-Locus einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, die Konversionsaktivität des Immunglobulingens aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die für Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins kodieren.
Spezifisch enthält die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Zelle homologe Rekombinationsfaktoren des Wildtyps. Wegen der intakten Maschinerie für homologe Rekombination ist die erfindungsgemäße Zelle zur Rekombination und Reparatur in der Lage und weist eine normale Proliferationsrate auf.
Die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Zelle, d. h. eine B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, ist ein Immunglobulin exprimierender B-Lymphozyt aus Tierspezies, welche den Mechanismus der Genkonversion zur Entwicklung ihres Immunglobulin-Repertoires nutzen. Bevorzugt stammt die Zelle von einem Lymphom aus Hühner-Bursa ab. Am meisten bevorzugt stammt die Zelle von der DT40-Zelllinie ab oder ist damit verwandt.
Die Zielnukleinsäure kann für ein Protein kodieren oder eine regulatorische Aktivität besitzen. Beispiele von Proteinen sind eine Immunglobulinkette, ein Selektionsmarker, ein DNA-bindendes Protein, ein Enzym, ein Rezeptorprotein oder ein Teil davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Zielnukleinsäure das V(D)J-Segment eines rearrangierten humanen Immunglobulingens. Beispiele von regulatorischen Nukleinsäuren sind Transkriptions-regulatorische Elemente oder eine RNAi-Sequenz.
In einer Ausführungsform, in der die Zielnukleinsäure durch eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion diversifiziert wird, enthält die erfindungsgemäße Zelle mindestens eine Sequenz, die dazu in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen.
In einer weiteren Ausführungsform ist die Zielnukleinsäure eine exogene Nukleinsäure, welche funktionell mit Kontrollnukleinsäuresequenzen verbunden ist, welche die genetische Diversifizierung steuern.
In einer zusätzlichen Ausführungsform wird die Zielnukleinsäure in der erfindungsgemäßen Zelle so exprimiert, dass die Selektion von Zellen, welche eine gewünschte Aktivität aufweisen, erleichtert ist. Die Selektion kann eine direkte Selektion in Bezug auf die Aktivität der Zielnukleinsäure in der Zelle, auf der Zelloberfläche oder außerhalb der Zelle sein. Alternativ kann die Selektion eine indirekte Selektion in Bezug auf die Aktivität einer Reporternukleinsäure sein.
In einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung genetische Mittel zur Verfügung, um die genetische Diversifizierung der Zielnukleinsäure in der erfindungsgemäßen Zelle zu modulieren. Die Modulation kann durch Modifizierung von in cis wirkenden regulatorischen Sequenzen, durch Variation der Anzahl von Genkonversions-Spendern oder durch Modifikation von in trans wirkenden regulatorischen Faktoren wie Aktivierungs-induzierter Deaminase (AID) oder eines DNA-Reparatur- oder Rekombinationsfaktors außer einem RAD51-Analog oder -Paralog stattfinden. Die Zelle exprimiert bevorzugt bedingt Aktivierungs-induzierte Deaminase (AID).
In einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Zelle zur Verfügung, welche zu gezielter und selektiver genetischen Diversifizierung einer Zielnukleinsäure durch Hypermutation oder eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion in der Lage ist. Das Verfahren umfasst (a) das Transfizieren einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, welche Konversionsaktivität des Immunglobulingens aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die für Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins kodieren, mit einem genetischen Konstrukt, das die Zielnukleinsäure enthält, und (b) das Identifizieren einer Zelle, bei der das endogene V-Gensegment oder ein Teil davon durch die Zielnukleinsäure ersetzt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform enthält das die Zielnukleinsäure enthaltende genetische Konstrukt weiterhin mindestens eine Nukleinsäure, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen. Der Locus, der die Zielnukleinsäure enthält, kann durch eine einzelne Transfektion oder mehrere Transfektionsrunden mit Konstrukten, welche verschiedene Komponenten des Locus enthalten, konstruiert werden.
In der Ausführungsform, in der die Selektion auf eine Zelle mit einer gewünschten Aktivität indirekt ist, umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin (c) ein Transfizieren der Zelle aus Schritt (b) mit einem weiteren genetischen Konstrukt, das ein Reportergen umfasst, das durch die Zielnukleinsäure beeinflusst werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst das erfindungsgemäße Verfahren weiterhin (d) die kondentionelle Expression eines in trans wirkenden regulatorischen Faktors. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der in trans wirkende regulatorische Faktor Aktivierungs-induzierte Deaminase (AID).
Nach einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird die Zielnukleinsäure durch gezielte Integration in die Zelle eingefügt.
In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts mit einer gewünschten Aktivität bereitgestellt, Schritte umfassend, bei denen man: (a) eine B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, die eine Konversionsaktivität des Immunglobulingens aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die für Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins kodieren, mit einem genetischen Konstrukt transfiziert, das eine transgene Zielnukleinsäure und optional mindestens eine Sequenz umfasst, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen; (b) die Zellen unter geeigneten Bedingungen zur Expression der Zielnukleinsäure kultiviert, (c) eine Zelle oder Zelle in der Population von Zellen identifiziert, welche ein mutiertes Genprodukt mit der gewünschten Aktivität exprimiert; und (d) eine oder mehrere klonale Populationen von Zellen aus der Zelle oder den Zellen, die in Schritt (c) identifiziert wurden, etabliert und aus den klonalen Populationen eine Zelle oder Zellen selektiviert, welche ein Genprodukt mit einer verbesserten gewünschten Aktivität aufweist.
In einer Ausführungsform werden Schritte (c) und (d) iterativ wiederholt, bis ein Genprodukt mit einer optimierten gewünschten Aktivität produziert wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann die genetische Diversifizierung abgeschaltet werden, z. B. durch Herabregulation der Expression eines in trans wirkenden regulatorischen Faktors, wenn die Zelle identifiziert worden ist, welche ein Genprodukt mit einer optimierten gewünschten Aktivität produziert. Der in trans wirkende regulatorische Faktor kann z. B. Aktivierungs-induzierte Deaminase (AID) oder ein Faktor sein, der bei homologer Rekombination oder DNA-Reparatur eine Rolle spielt, außer einem RAD51-Paralog oder -Analog.
In einer anderen Ausführungsform wird die Diversifizierung einer Zielnukleinsäure weiter durch Optimierung einer Zielsequenz modifizieren, z. B. das Einführen von Ig-Hypermutations-Hotspots oder einen erhöhten Gehalt an GC.
BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ΨV-Gendeletion. (A) Eine physikalische Karte des rearrangierten Hühner Ig leichte Ketten-Locus und der ΨV Knockout-Konstrukte. Der Locus enthält insgesamt 25 ψV-Gene oberhalb von einem funktionellen V-Segment. Die Knockout-Strategie der ψV-Gene durch die gezielte Integration von pψVDel1-25 und die pψVDel13-25-Konstrukte ist unten gezeigt. Nur die relevanten EcoRI-Schnittstellen sind angegeben. (B) Southernblot Analyse von Wildtyp und Knockout-Klonen unter Verwendung der in (A) gezeigten Sonde nach EcoRI-Verdau. Der Wildtyp-Locus hybridisiert als ein 12 kB-Fragment, während ψV^teilweise und ψV^–Loci jeweils als ein 7,4 kB- und 6.3 kB-Fragment hybridisieren. (C) AID-Status. Das AID-Gen wurde durch PCR amplifiziert, um die Anwesenheit oder Abwesenheit einer AID-cDNA-Expressionskassette zu verifizieren.
2 sIgM Expressionsanalyse von Kontrollen und ψV-Knockout-Klonen. (A) FACS anti-IgM Färbung, Profile von repräsentativen Subklonen, die von anfänglichen sIgM(+) Klonen abgeleitet sind. (B) Durchschnittliche Prozentsätze von Ereignissen, die in sIgM(–) Auswahl fallen, basierend auf der Messung von 24 Subklonen.
3 Ig leichte Kette Sequenzanalyse der ψV-Knockout Klone. Mutationsprofile der AID^RψV^– und AID^RψV^teilweise Klone. Alle in verschiedenen Sequenzen in der Region zwischen der Leadersequenz bis zu dem J-C-Intron identifizierten Nukleotid-Substitutionen werden auf der rearrangierten Sequenz der leichten Kette, die in dem AID^R Vorläufer-Klon vorliegt, kartiert. Mutationen der AID^RψV^– und der AID^RψV^teilweise Klone sind jeweils über und unter der Referenzsequenz gezeigt. Deletionen, Insertionen und Genkonversions-Ereignisse sind auch angegeben. Hotspotmotive (RGYW und dessen Komplement WRCY) sind durch dicke Buchstaben markiert.
4 Mutationsprofile von hypermutierenden Zelllinien. (A) Prozentsatz von Sequenzen, welche eine bestimmte Anzahl von Mutationen tragen. Jede Nukleotidsubstitution ohne Matrix wird gezählt, aber Genkonversionen, Deletionen und Insertionen, die mehrere Nukleotide betreffen, werden als einzelnes Ereignis gezählt. PM, Punktmutation; GC, Genkonversion (gene conversion); D, Deletion; I, Insertion. (B) Muster von Nukleotidsubstitutionen in Sequenzen von ψV und der XRCC3-Knockout Klonen. Nukleotidsubstitutionen als Teil von Genkonversions ereignissen sind ausgeschlossen. Die Verhältnisse von Transition (trs) zu Transversion (trv) sind auch gezeigt. (C) Hotspot-Vorlieben von Nukleotidsubstitutionsmutationen ohne Matrix. In einem Hotspotmotiv (RGYW oder sein Komplement WRCY) auftretende Mutationen sind mit Prozentsätzen gezeigt. (D) Für Trypanblau positive Zellen als Indikator von spontan sterbenden Zellen.
5 Verteilung von Nukleotidsubstitutionen in genomischen Sequenzen aus nicht sortierten AID^RψV^– Zellen und in cDNA-Sequenzen aus sortierten IgM(–) AID^RψV^– Zellen. Die Anzahl von Mutationen wird für jeweils 50 bp gezählt und wird zusammen mit den entsprechenden physikalischen Karten des genomischen Locus der leichten Kette oder der cDNA-Sequenz gezeigt.
6 Ein Modell, das die Regulation von Ig-Genkonversion und Ig-Hypermutation erklärt.
7 In situ-Mutagenese des GFP-Gens. (A) Ig VJ-Ersatzvektor. (B) in vivo Mutagenese des GFP Gens durch Hypermutation. (C) ψV Spender Ersatzvektor. (D) in vivo Mutagenese des GFP Gens durch Genkonversion und Hypermutation.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung macht ein besonders nützliches Zellsystem zur gezielten und selektiven genetischen Diversifizierung einer jeden Nukleinsäure durch Hypermutation oder eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion erhältlich. Das System basiert auf B-Zelllinien, welche die rearrangierten Immunglobulin-V-Gene konstitutiv in vitro diversifizieren, ohne extrazellulärer Stimuli wie einer Interaktion mit anderen Zellen oder Molekülen oder eines Erhalts des B-Zell-Antigenrezeptors zu bedürfen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich „gezielte und selektive Diversifizierung" auf die Fähigkeit bestimmter Zellen, eine Änderung der Nukleinsäuresequenz einer spezifischen Region einer endogenen oder transgenen Nukleinsäure zu bewirken, wobei Sequenzen außerhalb dieser Regionen keiner Mutation unterliegen.
„Genetische Diversifizierung" bezieht sich auf Änderung von individuellen Nukleotiden oder Abschnitten von Nukleotiden in einer Nukleinsäure. Genetische Diversifizierung in den erfindungsgemäßen Zellen tritt durch Hypermutation, Genkonversion oder eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion auf.
„Hypermutation" bezieht sich auf die Mutation einer Nukleinsäure einer Zelle in einer Geschwindigkeit über dem Hintergrund. Bevorzugt bezieht sich Hypermutation auf eine Mutationsrate zwischen 10^–5 und 10^–3 bp^–1 Generation^–1. Dies liegt deutlich über Hintergrund-Mutationsraten, welche auf dem Niveau von 10^–9 bis 10^–10 Mutationen bp^–1 Generation^–1 liegen (Drake et al., 1988), und von spontanen, bei der PCR beobachteten Mutationen. Dreißig Amplifikationszyklen mit Pfu-Polymerase würden zu < 0,05 × 10^–3 Mutationen bp^–1 in dem Produkt führen, was im vorliegenden Fall für weniger als 1 von 100 der beobachteten Mutationen verantwortlich ist (Lundberg et al., 1991).
„Genkonversion" bezieht sich ein Phänomen, bei dem Sequenzinformation in einer Richtung von einem homologen Allel zu dem anderen transferiert wird. Genkonversion kann das Ergebnis einer DNA-Polymerase sein, die die Matrix tauscht und von einer homologen Sequenz kopiert, oder das Ergebnis der Reparatur einer falschen Paarung nach der Bildung eines Heteroduplex (Nukleotide werden aus einem Strang entfernt und durch Reparatur-Synthese unter Verwendung des anderen Stranges ersetzt).
Hypermutation und Genkonversion führen zu einer natürlichen Diversität in dem Immunglobulin V(D)J-Segment von B-Zellen. Hypermutation findet in den Keimzentren von Spezies wie Maus und Mensch nach Antigenstimulation statt. Genkonversion findet in primären lymphoiden Organen wie der Bursa von Fabricius oder dem Darm-assoziierten lymphoiden Gewebe in Spezies wie Huhn, Kuh, Kaninchen, Schaf und Schwein unabhängig von antigener Stimulation statt. Bei Hühnern werden Abschnitte aus dem oberhalb liegenden Pseudo-V-Genen in das rearrangierte V(D)J-Segment transferiert. Nach der vorliegenden Erfindung ist die Zelle oder Zelllinie daher bevorzugt eine Immunglobulin produzierende Zelle oder Zelllinie, welche dazu in der Lage ist, ihre rearrangierten Immunglobulingene zu diversifizieren.
Eine direkte Verbindung zwischen der Initiation von Hypermutation und Genkonversion wurde zum ersten Mal in den hierin berichteten Experimenten gefunden. Insbesondere führt eine teilweise oder vollständige Deletion von Pseudo-V-Genen in einer Zelllinie, welche in Zellkultur weiterhin Genkonversion durchführt, zu der Aktivierung der Hypermutation in dem Immunglobulin-Locus. Eine Deletion aller Pseudogene führt zu dem Ende der Genkonversion und gleichzeitiger Aktivierung von hohen Raten der Hypermutation, während Deletion von einigen wenigen Pseudogenen zu einer Herunterregulation der Genkonversion und gleichzeitiger Aktivierung von Hypermutation mit Raten führt, die geringer sind als diejenigen, die bei vollständiger Deletion der Pseudogene beobachtet werden. Daher korreliert die Anzahl von verfügbaren Pseudogen-Spendern direkt mit den Raten der Genkonversion und korreliert invers mit den Hypermutationsraten. Es wird gezeigt, dass Genkonversion und Hypermutation sich in einer reziproken Beziehung zueinander befinden. Damit stellt die vorliegende Erfindung zum ersten Mal ein Zellsystem zur Verfügung, welches es erlaubt, eine Zielnukleinsäure durch eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion genetisch zu diversifizieren, wobei der Beitrag dieser zwei Phänomene reguliert werden kann, indem die Anzahl der Genkonversions-Spender, ihre Orientierung oder ihr Grad oder ihre Länge der Homologie geändert werden.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Zellsystems gegenüber einem Zellsystem mit reiner hypermutierender Aktivität wie demjenigen basierend auf der humanen Burkitt-Lymphom Zelllinie Ramos ( WO 00/2211 und WO 02/100998 ) ist die Fähigkeit, in einer Zelle genetische Diversifizierung durch Hypermutation und Genkonversion zu kombinieren. Zum Beispiel können in das Zielgen durch Genkonversion definiertere Änderungen als durch zufällige Hypermutation eingeführt werden, da Genkonversions-Spender so konstruiert werden können, dass sie Sequenzen enthalten, die die Aktivität der Zielnukleinsäure wahrscheinlich auf eine vorteilhafte Weise beeinflussen. Genkonversion und Hypermutation können so die Wahrscheinlichkeit erhöhen, gewünschte Varianten herzustellen, da vorher getestete Sequenzblöcke mit zufälligen Hypermutationen kombiniert werden. Pseudogene mit Sequenzen, die identisch zu einer bestimmten Region des Zielgens sind, können auch verwendet werden, um einen Teil der Zielnukleinsäure durch häufige Konversionen stabil zu halten, was den Effekt hat, dass die Hypermutation sich nur in dem nicht konvertierenden Teil durchsetzt. Dieser Ansatz ist nützlich, wenn die Zielnukleinsäure eine Region enthält, welche für eine optimale Aktivität stabil bleiben sollte.
Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Zellsystems gegenüber einem Zellsystem, das auf der Suppression einer Aktivität der homologen Rekombination in Zellen mit aktiver Genkonversion basiert ( WO 02/100998 ) ist eine genetische Stabilität der Zelle, welche sich in einer normalen Teilungsrate, Resistenz gegenüber Strahlung und Fähigkeit zur DNA-Reparatur widerspiegelt.
Ein besonderer Vorteil des vorliegenden Zellsystemsgegen- über allen bekannten Systemen ist die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Zellen, transfizierte Nukleinsäurekonstrukte durch gezielte Integration in den homologen endogenen Locus zu integrieren.
„Gezielte Integration" ist eine Integration eines transfizierten Nukleinsäurekonstrukts, welches eine Nukleinsäuresequenz homolog zu einer endogenen Nukleinsäuresequenz umfasst, durch homologe Rekombination in den endogenen Locus. Gezielte Integration erlaubt es, jede Nukleinsäure direkt in eine definierte chromosomale Position einzufügen. In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine für ein Genprodukt von Interesse kodierende Nukleinsäure durch gezielte Integration an Stelle des rearrangierten V(D)J-Segments oder eines Teils davon in den Immunglobulin-Locus eingefügt.
In einer bevorzugten Ausführungsform stammen die in den erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Zellen von Zellen ab, welche in vivo einer Ig-Genkonversion unterliegen oder sind damit verwandt. Zellen, welche in vivo einer Ig-Genkonversion unterliegen, sind z. B. Oberflächen-Ig exprimierende B-Zellen in primären lymphoiden Organen sowie B-Zellen aus Vogel-Bursa. Lymphomzellen, welche von den B-Zellen aus primären lymphoiden Organen abgeleitet sind, sind besonders gute Kandidaten zur Herstellung von Zellen und Zelllinien gemäß der vorliegenden Erfindung. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform sind die Zellen von einer Hühner Bursa Lymphomzelllinie DT40 abgeleitet.
Der Prozess der konstitutiven genetischen Diversifizierung durch Hypermutation und Genkonversion wird in der vorliegenden Erfindung genutzt, um Genprodukte mit einer gewünschten, neuen oder verbesserten Aktivität herzustellen.
Eine „Zielnukleinsäure" ist eine Nukleinsäuresequenz oder Chromosomenregion in der erfindungsgemäßen Zelle, welche einer direkten und selektiven genetischen Diversifizierung unterliegt. Die Zielnukleinsäure kann entweder endogen oder transgen sein und kann eine oder mehrere Transkriptionseinheiten, welche für Genprodukte kodieren, umfassen.
Wie hierin verwendet, ist ein „Transgen" ein Nukleinsäuremolekül, welches in eine Zelle eingefügt wird, z. B. durch Transfektion oder Transduktion. Zum Beispiel kann ein Transgen eine heterologe Transkriptionseinheit umfassen, welche an einem gewünschten Ort in das Genom einer Zelle eingefügt werden kann.
In einer Ausführungsform sind Transgene Immunglobulin-V-Gene, wie sie in Immunglobulin herstellenden Zellen gefunden werden, oder Fragmente von V-Genen. Bevorzugt ist die Zielnukleinsäure ein humanes Immunglobulin-V-Gen. In diesem Fall sind die erfindungsgemäßen Zellen „Fabriken" von humanen Antikörpervarianten, die in der Lage sind, an jedes vorgegebene Antigen zu binden.
Alternativ ist die Zielnukleinsäure eine Nicht-Immunglobulin-Nukleinsäure, z. B. ein Gen, welches für Selektionsmarker, DNA-bindende Proteine, Enzyme oder Rezeptorproteine kodiert. Zum Beispiel kann ein neuartiger fluoreszierender Selektionsmarker produziert werden, indem ein bekannter Marker durch Hypermutation oder durch eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion mit der Hilfe von anderen bekannten Markern mit einem anderen Fluoreszenzspektrum, die als Genkonversions-Spender dienen, mutiert wird.
In einer Ausführungsform der Erfindung kodiert die Zielnukleinsäure direkt für ein Genprodukt von Interesse. Gendiversifizierung einer solchen Nukleinsäure wird zu einer Trunkierung des kodierten Genprodukts oder einer Änderung in seiner primären Sequenz führen. Mit jeder Runde der Diversifizierung und Selektion wird nach einer Zelle gesucht, welche das Genprodukt mit einer verbesserten Aktivität exprimiert.
Alternativ ist die Zielnukleinsäure ein regulatorisches Element, z. B. ein Transkriptions-regulatorisches Element wie ein Promotor oder Enhancer oder interferierende RNA (interfering RNA, RNAi). In dieser Ausführungsform wird eine zusätzli che Nukleinsäure (Reportergen) benötigt, welche durch die Zielnukleinsäure beeinflusst wird und für ein identifizierbares Genprodukt kodiert, um Zellen zu identifizieren, welche die Zielnukleinsäure von Interesse tragen.
In der Ausführungsform, in der genetische Diversifizierung der Zielnukleinsäure durch eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion stattfindet, werden zusätzlich Nukleinsäuren, die in der Lage sind, als Genkonversions-Spender zu dienen, in das Zellgenom eingefügt, bevorzugt oberhalb der Zielnukleinsäure.
Eine „Nukleinsäure, welche in der Lage ist, als Genkonversions-Spender zu dienen" ist eine Nukleinsäure, die eine Sequenz homolog zu der Zielnukleinsäure aufweist. Beispiele von natürlichen Genkonversions-Spendern sind Pseudo-V-Gene in dem Immunglobulin-Locus von bestimmten Spezies.
Gemäß einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Zelle, die zu einer gezielten und selektiven Diversifizierung einer Zielnukleinsäure in der Lage ist, konstruiert, indem man die Zielnukleinsäure durch gezielte Integration an einem definierten chromosomalen Ort in die Wirtszelle einfügt. Zu diesem Zweck kann das transfizierte Konstrukt oberhalb und unterhalb der Zielnukleinsäure Sequenzen homolog zu dem gewünschten chromosomalen Integrationsort enthalten. Bevorzugt wird die Zelle hergestellt, indem man die endogenen V-Gene oder Abschnitte davon durch homologe Rekombination mit einem Transgen ersetzt, oder durch Gentargeting, so dass das Transgen ein Ziel für die Genkonversions- und/oder Hypermutations-Ereignisse wird.
In einer anderen Ausführungsform enthalten erfindungsgemäße Transgene auch Sequenzen, welche Hypermutation und/oder Genkonversion steuern. Damit wird ein vollständiger Locus, der in der Lage dazu ist, ein Genprodukt zu exprimieren und Hypermutation und Genkonversion in Bezug auf diese Transkriptionsein heit zu steuern, in die Zellen transferiert und wird sogar nach zufälliger chromosomaler Integration aktiv diversifiziert.
Ein Screening von Klonen, welche das Transgen durch gezielte Integration eingefügt haben kann, kann durch Southernblot Analyse oder durch PCR durchgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform enthalten erfindungsgemäße Transgene ein selektierbares Markergen, welches eine Selektion von Klonen, die das Transgen stabil integriert haben, erlaubt. Dieses selektierbare Markergen kann danach durch Rekombination entfernt oder mit anderen Mitteln inaktiviert werden.
Die vorliegende Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts mit einer gewünschten Aktivität durch wiederholte Runden der Zellexpansion und Selektion auf Zellen, welche eine Zielnukleinsäure mit einer gewünschten Aktivität tragen, zur Verfügung. Wie hierin verwendet, bezieht sich „Selektion" auf die Bestimmung der Anwesenheit von Sequenzänderungen in der Zielnukleinsäure, welche zu einer gewünschten Aktivität des Genprodukts führen, das durch die Zielnukleinsäure kodiert wird, oder zu einer gewünschten Aktivität der regulatorischen Funktion der Zielnukleinsäure.
Der Prozess der Genkonversion und Hypermutation wird in vivo genutzt, um verbesserte oder neue Bindungsspezifitäten in Immunglobulinmolekülen herzustellen. Daher können durch die Selektion von erfindungsgemäßen Zellen, welche Immunglobuline herstellen, die in der Lage sind, an das gewünschte Antigen zu binden, und dann durch Kultivieren dieser Zellen, um die Herstellung weiterer Mutanten zu erlauben, Zellen isoliert werden, welche Immunglobuline mit verbesserter Bindung an das gewünschte Antigen exprimieren.
Eine Vielzahl von Selektionsverfahren kann zur Isolierung von Mutanten mit einer gewünschten Spezifität verwendet werden. Diese schließen Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren (Fluorescence Activated Cell Sorting, FACS), Trennung von Zellen unter Verwendung von magnetischen Partikeln, Antigen-Chromatographie-Verfahren und andere Zelltrennungstechniken so wie die Verwendung von Polystyrenkügelchen ein.
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) kann verwendet werden, um Zellen auf der Grundlage ihrer sich unterscheidenden Oberflächenmoleküle, z. B. an der Oberfläche gezeigter Immunglobuline, zu isolieren. Zellen in der zu sortierenden Probe oder Population werden mit spezifischen fluoreszierenden Reagenzien gefärbt, welche an die Zelloberflächenmoleküle binden. Diese Reagenzien würden das Antigen/die Antigene von Interesse sein, verbunden (entweder direkt oder indirekt) mit Fluoreszenzmarkern wie Fluorescein, Texas-Rot, Malachitgrün, grünem fluoreszenten Protein (green fluorescent protein, GFP) oder jedem anderen dem Fachmann bekannten Fluorophor. Die Zellpopulation wird dann in die vibrierende Durchflusskammer der FACS-Maschine eingeführt. Der Strom von Zellen, der aus der Kammer austritt, wird in einer Scheide einer Pufferflüssigkeit wie PBS (Phosphat-gepufferte Salzlösung, Phosphate Buffered Saline) umhüllt. Dieser Strom wird mit Laserlicht illuminiert und jede Zelle wird in Bezug auf Fluoreszenz gemessen, welche auf die Bindung des fluoreszierenden markierten Antigens hinweist. Die Vibration in dem Strom von Zellen führt dazu, dass er in Tröpfchen aufbricht, welche eine kleine elektrische Ladung tragen. Diese Tröpfchen können durch elektrische Ablenkungsplatten unter Kontrolle eines Computers gesteuert werden, um unterschiedliche Zellpopulationen gemäß ihrer Affinität zu dem fluoreszierend markierten Antigen zu sammeln. Auf diese Art können Zellpopulationen, welche unterschiedliche Affinitäten zu dem Antigen/den Antigenen von Interesse zeigen, leicht von solchen Zellen getrennt werden, die das Antigen nicht binden. FACS-Maschinen und Reagenzien zur Verwendung im FACS sind weltweit von Quellen wie Becton-Dickinson oder von Dienstleistern wie Arizona Research Laboratories (http://www.arl.arizona.edu/facs/) erhältlich.
Ein anderes Verfahren, welches verwendet werden kann, um Populationen von Trennen gemäß der Affinität ihres Zelloberflächenproteins/ihrer Zelloberflächenproteine zu einem bestimmten Antigen zu trennen, ist Affinititätschromatographie. In diesem Verfahren wird ein geeignetes Harz (z. B. CL-600 Sepharose, Pharmacia Inc.) kovalent mit dem geeigneten Antigen verbunden. Dieses Harz wird in eine Säule geschichtet und die gemischte Population von Zellen wird über die Säule gegeben. Nach einer geeigneten Inkubationszeit (z. B. 20 Minuten) werden nicht gebundene Zellen unter Verwendung von (z. B.) PBS-Puffer weggewaschen. Dies lässt nur die Untergruppe von Zellen, die Immunglobuline exprimieren, welche an das Antigen/die Antigene von Interesse binden, zurück, und diese Zellen werden dann unter Verwendung (z. B.) von einem Überschuss des Antigens von Interesse oder durch enzymatische oder chemische Spaltung des Antigens von dem Harz der Säule eluiert. Das kann unter Verwendung einer spezifischen Protease, wie z. B. Faktor X, Thrombin oder einer anderen spezifischen, dem Fachmann bekannten Protease geschehen, um das Antigen mit einer geeigneten Spaltungsstelle von der Säule zu spalten, die vorher in den Antigen-Harz-Komplex eingebaut wurde. Alternativ kann eine nichtspezifische Protease, z. B. Trypsin, verwendet werden, um das Antigen von dem Harz zu entfernen, was zur Freisetzung der Population von Zellen führt, welche eine Affinität für das Antigen von Interesse aufwies.
Die vorliegende Erfindung stellte das erste Mal ein Mechanismus zur Verfügung, welcher es erlaubt, die genetische Diversifizierung einer Zielnukleinsäure zu steuern. Wie von den vorliegenden Erfindern demonstriert, ist Aktivierungs-induzierte Deaminase (AID) ein Faktor, welcher sowohl Genkonversion als auch Hypermutation in dem Immunglobulin-Locus re guliert. Es wird vorgeschlagen, dass AID eine gemeinsame Modifikation in dem rearrangierten V(D)J-Segment induziert, welche in der Anwesenheit von benachbarten Spendersequenzen zu einem Konversionstrakt und in ihrer Abwesenheit zu einer Punktmutation führt. Daher können durch Regulation der AID-Expression beide Phänomene moduliert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird das AID-Gen transient in der eine Zielnukleinsäure enthaltenden Zelle exprimiert. Zum Beispiel kann AID unter Kontrolle eines Medikamenten-sensitiven Promotors wie dem auf Tetracyclin reagierenden Genexpressionssystem (tetracycline responsive gene expression system) exprimiert werden. Alternativ kann die Genexpression durch das Ausschneiden der AID-Expressionskassette durch induzierte Rekombination beendet werden. Ein Abschalten der AID-Expression wird eine weitere Diversifizierung der Zielsequenz verhindern. Bevorzugt wird die AID-Expression in der Zelle abgeschaltet, welche ein Genprodukt mit einer gewünschten Aktivität produziert, um weitere Mutationen zu verhindern, die zu einem Verlust der gewünschten Aktivität führen können.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele illustriert.
BEISPIELE
1. AID initiiert Konversion von Immunoglobulingenen und Hypermutation durch ein gemeinsames Zwischenprodukt
Es wird hierin berichtet, dass Entfernung von ΨV Spendern eine von AID abhängige Ig-Hypermutation in der Hühner B-Zelllinie DT40 aktiviert. Dies zeigt, dass Ig-Genkonversion und Hypermutation im Wettbewerb liegende Wege sind, die von dem gleichen, von AID initiierten Zwischenprodukt abgeleitet sind. Weiterhin wird das ΨV Knockout DT40 als ideales Modellsystem vorgeschlagen, um sich an die molekularen Mechanismen der Ig-Hypermutation anzunähern, und als neues Werkzeug zur in situ Mutagenese.
Verfahren
Zelllinien. DT40^Cre1, welches wegen eines v-myb-Transgens eine gesteigerte Ig-Genkonsversion aufweist und eine durch Tamoxifen induzierbare Cre-Rekombinase enthält, wurde bereits beschrieben (Arakawa et al., 2001). DT40^Cre1AID^–/– wurde durch gezielte Störung von beiden AID-Allelen von DT40^Cre1 (Arakawa et al., 2002) hergestellt. AID^R stammt von DT40^Cre1AID^–/– nach stabiler Integration einer mit Flox-Stellen versehenen AID-IRES-GFP bicistronischen Kassette ab, in der sowohl AID als auch GFP von dem gleichen β-Actin-Promotor aus exprimiert werden. AID^RψV^– wurde von AID^R durch Transfektion von pψVDel1-25 (1A) abgeleitet. Stabile Transfektanten, die das Konstrukt in den rearrangierten leichte Ketten-Locus integriert hatten, wurden dann durch Locus-spezifische PCR identifiziert. Gezielte Integration von pψVDel1-25 führt zu der Deletion der vollständigen ψV Gen-Loci, beginnend 0,4 kB oberhalb von ψV25 und endend ein bp unterhalb von ψV1. AID^RψV^teilweise wurde auf ähnliche Art wie AID^RψV^– durch Transfektion von pψVDel3-25 hergestellt, welches bei gezielter Integration zu einer teilweisen Deletion der ψV Loci führt, beginnend 0,4 kB oberhalb von ψV25 und endend 1 bp unterhalb von ψV3. Zellkultur und Elektroporation wurden wie bereits beschrieben durchgeführt (Arakawa et al., 2002). XRCC3^–/– wurde von DT40^Cre1 abgeleitet, indem Aminosäuren 72–170 des XRCC3-Gens nach Transfektion von XRCC3-Knockout-Konstrukten deletiert wurden. Klone, welche einer gezielten Integration unterworfen waren, wurden anfänglich durch weite PCR (long-range PCR) identifiziert und die XRCC3-Deletion wurde dann durch Southernblot Analyse bestätigt.
Ig-Reversionsassay. Subklonierung, Antikörperfärbung, Durchflusszytometrie und Quantifizierung der sIgM Expression wurden bereits beschrieben (Arakawa et al., 2002). Alle in der Studie verwendeten Klone waren wegen der Reparatur der Raster schubmutation der leichten Kette der Original Cl18(–) Variante (Buerstedde et al., 1990) durch ein Genkonversionsereignis sIgM(+).
PCR. Um durch PCR eingeführte künstliche Mutationen zu minimieren, wurde PfuUltra Hotstart Polymerase (Stratagene) vor der Sequenzierung zur Amplifizierung verwendet. PCR im weiten Bereich (long-range PCR), RT-PCR und Sequenzierung der Ig leichten Kette wurden wie bereits beschrieben durchgeführt (Arakawa et al., 2002). Der Promotor und die J-C-Intron-Region der Plasmidklone für Ig leichte Kette wurde unter Verwendung von M13 Vorwärts- und Rückwärtsprimern sequenziert. Bu-1 und EF1α Gene wurden unter Verwendung von BU1/BU2 amplifiziert (jeweils BU1, GGGAAGCTTGATCATTTCCTGAATGCTATATTCA; BU2, GGGTCTAGAAACTCCTAGGGGAAACTTTGCTGAG) und EF6/EF8 (EF6, GGGAAGCTTCGGAAGAAAGAAGCTAAAGACCATC; EF8, GGGGCTAGCAGAAGAGCGTGCTCACGGGTCTGCC) Primerpaare. Die PCR-Produkte dieser Gene wurden in den pBluescript Plasmidvektor kloniert und wurden unter Verwendung des M13 Rückwärtsprimers sequenziert.
Ergebnisse
Gezielte Deletion von ψV Spendersequenzen in dem rearrangierten leichte Ketten-Locus
Zwei ψV Knockout-Konstrukte wurden durch Klonierung der genomischen Sequenzen hergestellt, welche die gewünschten Endpunkte der Deletion oberhalb und unterhalb einer mit Flox-Stellen versehenen gpt (Guaninphosphoribosyltransferase)-Kassette (Arakawa et al., 2001) flankieren. Nach gezielter Integration deletiert das erste Konstrukt, pψVDel1-25, alle Pseudogene (ψV25 bis ψV1), während das zweite Konstrukt, pψVDel3-25, die meisten Pseudogene deletiert (ψV25 bis ψV3) (1A). Ein für Oberflächen-IgM positiver (sIgM(+)) Klon, abgeleitet von DT40^Cre1AID^–/– Zellen (Arakawa et al., 2002) durch Transfektion und stabile Integration eines mit Flox-Stellen versehenen AID-IRES(interne Ribosomeneintrittsstelle, inter nal ribosome entry site)-GFP-Transgens, wurde für die Transfektion der ψV Knockout-Konstrukte gewählt. Dieser mit AID rekonstituierte Klon, als AID^R bezeichnet, weist den Vorteil auf, dass das Auftreten einer schädlichen Mutation in der Ig leichten Kette leicht durch Verlust der sIgM Expression detektiert werden kann, und dass mit GFP markierte AID-Expression nach Induktion des von DT40^Cre1 (Arakawa et al., 2002) geerbten Cre-Rekombinase-Transgens abgeschaltet werden kann.
Nach Transfektion der ψV Knockout-Konstrukte in den AID^R-Klon wurden gegen Mycophenolsäure resistente Klone, welche gezielte Deletionen des rearrangierten leichte Ketten-Locus enthielten, identifiziert. Diese primären ψV Knockout-Klone enthalten zwei mit Flox-Stellen versehene Transgene, das eingefügte gpt-Markergen in dem rearrangierten leichte Ketten-Locus und das AID-IRES-GFP-Gen des AID^R Vorläuferklons. Da das gpt-Gen die benachbarte Transkription oder Chromatin-Konfiguration stören könnte, wurden die primären ψV Knockouts einer geringen Konzentration von Tamoxifen ausgesetzt und dann durch begrenzte Verdünnung subkloniert. Auf diese Art konnten sekundäre ψV Knockout-Klone isoliert werden, die entweder nur das gpt-Gen (AID^RψV^– und AID^RψV^teilweise) oder das gpt-Gen zusammen mit dem AID-IRES-GFP-Gen (AID^–/–ψV^– und AID^–/–ψV^teilweise) deletiert hatten. Die Störung von ψV Genen in dem rearrangierten leichte Ketten-Locus und das Ausschneiden der AID-Überexpressionskassette wurden jeweils durch Southernblot Analyse (1C) und PCR (1C) bestätigt.
Gesteigerter Verlust der sIgM Expression nach Deletion von ψV Genen in AID-positiven Klonen
Um die Raten einer schädlichen Ig Mutation abzuschätzen, wurde die Expression von sIg durch FACS nach 2 Wochen Kultur für jeweils 24 Subklone der DT40^Cre1, AID^R, DT40^Cre1AID^–/– und ψV Knockout-Klone gemessen (2A und 2B). Eine Analyse der Kontrollen mit intaktem ψV Locus zeigte einen Durchschnitt von jeweils 0,52% und 2,27% sIgM(–) Zellen bei den DT40^Cre1 und AID^R Subklonen, aber nur von 0,08% für die DT40^Cre1AID^–/–. Vorhergehende Analyse von spontan entstehenden sIgM(–) DT40-Varianten zeigte, dass etwa ein Drittel Rasterschubmutationen in dem rearrangierten V-Segment der leichten Kette enthielt, welche als Nebenprodukte der Ig-Konversionsaktivität betrachtet wurden (Burstedde et al., 1990). Diese Ansicht wird nun durch die Entdeckung unterstützt, dass der für AID negative DT40^Cre1AID^–/– Klon, welcher die Ig-Genkonversionsaktivität verloren haben sollte, für sIgM(+)stabil bleibt. Es ist am interessantesten, dass Subklone der für AID positiven ψV Knockout-Klone (AID^RψV^teilweise und AID^RψV^–) schnell sIgM(–) Populationen ansammeln, während Subklone der für AID negativen ψV Knockout-Klone (AID^–/–ψV^teilweise und AID^–/–ψV^–) sIgM(+) bleiben (2A und 2B). Dies legt nahe, dass die Deletion der Pseudogene die Rate von schädlichen Mutationen der leichten Kette in AID exprimierenden Zellen dramatisch erhöht.
Ersatz der Genkonversion durch Hypermutation in der Abwesenheit von ψV Spendern
Um die neu identifizierte Mutationsaktivität zu analysieren, wurden die rearrangierten leichte Ketten VJ-Segmente der ψV Knockout-Klone 5 bis 6 Wochen nach der Subklonierung sequenziert. Eine Gesamtheit von 135 Nukleotidänderungen (4A, Tabelle 1) wurden in der 0,5 kB Region zwischen dem V-Leader und dem 5'-Ende des J-C-Introns in 95 Sequenzen von dem AID^RψV^– Klon gefunden (3, über der Referenzsequenz). Im Gegensatz zu den Konversionstrakten, die in Wildtyp DT40-Zellen beobachtet werden, sind fast alle Änderungen Substitutionen einzelner Basen und, abgesehen von einigen kurzen Deletionen und Änderungen von zwei Nukleotiden, wurden keine Cluster von Mutationen beobachtet. Die Abwesenheit von Konversions-Ereignissen in AID^RψV^–, welche noch die ψV Gene des nicht rearrangierten leichte Ketten-Locus enthalten, bestätigt, dass Ig-Genkonversion nur die ψV Gene auf dem gleichen Chromosom für die Diversifizierung des rearrangierten leichte Ketten-Gens heranzieht (Carlson et al., 1990). Keine Sequenzdiversität wurde in einer Sammlung von 95 leichte Ketten-Gensequenzen aus dem AID^–/–ψV^– Klon gefunden (4A, Tabelle 1), was darauf hinweist, dass AID für die Mutationsaktivität benötigt wird.
Von dem AID^RψV^teilweise Klon abgeleitete Sequenzen zeigen gelegentlich Abschnitte von Mutationen, die durch die überbleibenden ψV1 und ψV2 begründet werden können (3, unter Referenzsequenz). Die Mehrheit der AID^RψV^teilweise Mutationen sind jedoch einzelne Basensubstitutionen ohne Matrix, wie bei den AID^RψV^– Zellen beobachtet (4A, Tabelle 1). Nur 3 Basensubstitutionen, die möglicherweise PCR-Artefakte sind, wurden in 92 Sequenzen des AID^–/–ψV^teilweise Klons gefunden, was bestätigt, dass sowohl die Genkonversion als auch die Mutationsaktivitäten von AID^RψV^teilweise von AID abhängig sind.
Neue Mutationsaktivität der ψV Knockout-Klone ähnelt stark der somatischen Hypermutation
Die entdeckte Ig-Mutationsaktivität in den ψV Knockout-Klonen mit einem Vorherrschen von einzelnen Nukleotidsubstitutionen legt es nahe, dass somatische Hypermutation Ig-Genkonversion ersetzt hatte. Es gibt jedoch ein Unterschied zwischen den Nukleotidsubstitutionen in den AID^RψV^teilweise und den AIR^RψV^– Klonen gegenüber Ig-Hypermutationen in Keimzentren von B-Zellen, insoweit, dass die Klone sehr wenige Mutationen in A/T-Basen und eine Vorliebe für Transversions-Mutationen aufweisen (4B).
Ig-Hypermuationen sind normalerweise innerhalb von 1 kB von der transkribierten Gensequenz lokalisiert, mit Vorlieben für die Komplementaritäts-bestimmende Regionen (Complementary determining regions, CDRs) der V(D)J-Segmente, während keine oder wenige Mutationen in den unterhalb liegenden C-Regionen vorhanden sind (Lebecque und Gearhart, 1990). Um zu erforschen, ob die Mutationen in dem AID^RψV^– Klon einer ähnlichen Verteilung folgen, wurde die Sequenzanalyse auf die Promotorregion und das J-C-Intron des rearrangierten leichte Ketten-Gens erstreckt (5). Obwohl Mutationen nahe dem Promotor und dem Intron unterhalb der J-Segmente gefunden werden, liegt die gehäufte Inzidenz klar zusammen mit CDR1 und CDR3, welches auch bevorzugte Orte der Genkonversion in DT40 sind (nicht veröffentlichte Ergebnisse). Etwa die Hälfte aller Punktmutationen fallen in das RGYW (R = A/G; Y = C/T; W = A/T) Sequenzmotiv oder sein Komplement WRCY (4C), bekannt als Hotspots der Ig-Hypermutation in Menschen und Mäusen.
Es wurde bereits berichtet, dass die Deletion von RAD51-Paralogen in DT40 Ig-Hypermutation induziert (Sale et al., 2001). Um die Hypermutationsaktivität in den für das ψV Gen negativen und für das RAD51-Paralog negativen Hintergründen zu vergleichen, wurde das XRCC3-Gen in dem DT40^Cre1-Klon unterbrochen und die rearrangierten VJ-Gene wurden 6 Wochen nach der Subklonierung sequenziert. Ähnlich zu dem Mutationsspektrum in dem AID^RψV^– Klon und zu dem bereits berichteten (Sale et al., 2001) zeigten die Mutationen in den Sequenzen von den XRCC3^–/– Zellen eine Transversions-Präferenz und eine Abwesenheit von Mutationen in A/T-Basen (4B). Die Mutationsrate in der XRCC3-Mutante war jedoch etwa 2,5-fach geringer als in dem AID^RψV^– Klon und es gab einen klaren Phänotyp langsamen Wachstums bei dem XRCC3 Mutanten verglichen zu Wildtyp DT40 und dem AID^RψV^– Klon (4D).
Um die für den Verlust von sIgM Expression verantwortlichen Mutationen in dem AID^RψV^– Klon zu identifizieren, wurden 94 leichte Ketten cDNAs von sortierten sIgM(–) Zellen amplifiziert und sequenziert. Obwohl eine kurze Insertion und 5 Deletionen in dieser Sammlung detektiert wurden (Tabelle 1), sind 89% der gesamten 245 Mutationen einzelne Nukleotidsubstitutionen in den VJ-Segmenten (5). Überraschenderweise enthielten nur etwa 10% der Sequenzen ein Stopkodon oder einen Rasterschub, was nahelegt, dass der Mangel der sIgM(–) Expression hauptsächlich durch Aminosäuresubstitutionen bewirkt wird, welche die Paarung der Ig leichte und schwere Ketten Proteine beeinträchtigen.
Ig-Locusspezifität der Hypermutation
Es wurde berichtet, dass hohe AID-Expression in Fibroblasten (Yoshikawa et al., 2002) und B-Zellhybridomen (Martin und Scharff, 2002) zu häufigen Mutationen in transfizierten Transgenen führt. Um auszuschließen, dass die Deletionen von Pseudogenen einen globalen Hypermutations-Phänotyp induziert hatten, wurden die 5'-Enden der für den B-Zell-spezifischen Marker Bu-1 und den Translations-Elongationsfaktor EF1α kodierenden Gene bei dem AID^RψV^– Klon sequenziert. Nur eine einzige 1 bp-Deletion wurde in 95 Sequenzen des Bu-1 Gens gefunden, und nur zwei einzelne Nukleotidsubstitutionen in 89 Sequenzen von EF1α (Tabelle 1). Da diese Änderungen am wahrscheinlichsten PCR-Artefakte repräsentieren, unterstützt dies weiter die Ansicht, dass die durch die ψV Deletionen induzierten Hypermutationen für den Ig-Locus spezifisch sind.
Diskussion
Die Ergebnisse zeigen, dass die Deletion von naheliegenden Pseudogen-Spendern die Ig-Genkonversion in DT40 beendet und eine Mutationsaktivität aktiviert, welche einer Ig-Hypermutation stark ähnelt. Die der neuen Aktivität und der somatischen Hypermutation gemeinsamen Merkmale schließen ein 1) AID-Abhängigkeit, 2) ein Überwiegen von einzelnen Nukleotidsubstitutionen, 3) Verteilung der Mutationen in der 5'-transkribierten Region, 4) ein Vorliebe für Hotspots und 5) Spezifizität für das Ig-Gen. Der einzige Unterschied in Bezug auf Ig-Hypermutation in vivo ist der relative Mangel an Mutationen in A/T-Basen und ein Überwiegen von Transversions-Mutationen in den ψV Knockout-Klonen. Dieser Unterschied wird jedoch auch in hypermutierenden EBV-transformierten B-Zelllinien (Bachl und Wabl, 1996; Faili et al., 2002) und DT40-Mutanten von RAD51-Paralogen (Sale et al., 2001) beobachtet, was darauf hinweist, dass ein Teil der Ig-Hypermutationsaktivität in transformierten B-Zelllinien fehlt. Interessanterweise ist die Rate von Ig-Hypermutation in dem AID^RψV^– Klon scheinbar höher als die Rate der Ig-Genkonversion in dem DT40^Cre1 Vorläufer. Eine Erklärung dafür könnte sein, dass einige Konversionstrakte auf Abschnitte identischer Spender und Zielsequenzen beschränkt sind und damit keine Spuren hinterlassen.
Die Induktion von Ig-Hypermutation durch die Blockierung von Ig-Genkonversionen unterstützt ein einfaches Modell, das erklärt, wie Hypermutation und Rekombination induziert und reguliert werden (6). Am Beginn der Ereignisse liegt eine Modifikation des rearrangierten V(D)J-Segments, welche entweder direkt oder indirekt durch AID induziert wird. Die normale Prozessierung dieser Läsion in der Abwesenheit von naheliegenden Spendern oder in der Abwesenheit von hoher homologer Rekombinationsaktivität führt zu Ig-Hypermutation in der Form einer einzelnen Nukleotidsubstitution (6, rechte Seite). Wenn jedoch Spendersequenzen verfügbar sind, kann die Prozessierung der durch AID induzierten Läsion in ein Stadium vor dem Austausch von Strängen aufgeteilt werden, wenn eine Verschiebung zu Ig-Hypermutation noch möglich ist, und in ein Stadium nach dem Austausch von Strängen, wenn eine Festlegung zur Ig-Genkonversion bereits getroffen wurde (6, linke Seite). Während eine Vollendung des ersten Stadiums der Teilnahme der RAD51-Paraloge bedarf, spielen in dem zweiten Stadium anderen Rekombinationsfaktoren wie das RAD54-Protein eine Rolle.
Dieser Unterschied bei der Festlegung erklärt, warum Störungen der RAD51-Paraloge nicht nur Ig-Konversion vermindern, sondern auch Ig-Hypermutation induzieren (Sale et al., 2001), während Störung des RAD54-Gens nur die Ig-Genkonsversion vermindert (Bezzubova et al., 1997). Das Modell sagt auch voraus, dass eine geringe zelluläre homologe Rekombinationsaktivität eine Ig-Genkonversion selbst in der Anwesenheit von Konversions-Spendern verhindert. Solch eine geringe homologe Rekombinationsaktivität könnte der Grund sein, warum menschliche und murine B-Zellen trotz der Anwesenheit von naheliegenden Kandidaten für Spender in der Form von nicht-arrangierten V-Segmenten nie Ig-Konversion nutzen, und warum Hühner-Keimzentren B-Zellen von der Ig-Genkonversion zur Ig-Hypermutation übergegangen sind (Arakawa et al., 1998).
Die AID^R und ψV Knockout DT40 Klone sind ein leistungsfähiges experimentelles System, um die Rolle von in trans wirkenden Faktoren und in cis wirkenden regulatorischen Sequenzen bei Ig-Genkonversion und Hypermutation zu betrachten. Im Vergleich zu alternativen Tier- oder Zell-Kultursystemen bietet es die Vorteile von: 1) parallele Analyse von Ig-Genkonversion und Ig-Hypermutation, 2) konditionelle AID-Expression, 3) leichte Modifikationen des Genoms durch Gentargeting, 4) normale Zellproliferation und Fähigkeit zur Reparatur und 5) Spezifität der Hypermutation für den Ig-Locus. Die Fähigkeit, Gen-spezifische Hypermutation in der DT40 Zelllinie zu induzieren, kann auch Anwendungen in der Biotechnologie finden. Eine Möglichkeit ist es, die für Hühner Antikörper kodierenden Regionen durch ihre menschliche Gegenstücke zu ersetzen, und dann eine Antikörper-Affinitätsreifung auf Basis eines Repertoires zu simulieren, welches sich kontinuierlich evolutiv durch Ig-Hypermutation fortentwickelt.
2. Gezielte in vivo Mutagenese von GFP durch Genkonversion und Hypermutation
Das für Grünes Fluoreszentes Protein (Green Fluorescent Protein, GEP) kodierende Gen ist ein Beispiel einer Zielnukleinsäure, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Zellsystems, insbesondere der DT40 Zelllinie, genetisch diversifiziert werden kann. Das GFP-Gen, welches durch gezielte Integration in den Ig leichte Ketten-Locus eingefügt ist, wird ei ner Hypermutation unterliegen und seine Aktivität in Bezug auf Farbe, Intensität und Abbau wird sich mit der Zeit evolutiv entwickeln (7B). Wenn eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion verwendet wird, um die GFP-Aktivitäten zu verändern, werden auch Varianten von GFP-Sequenzen, die als Spender für die Genkonversion für GFP dienen können, in den Ig-Locus eingefügt (7D).
Ein Ig-VJ-Ersatzvektor, pVjRepBsr, welcher es erlaubt, dass Ig leichte Ketten VJ-Gen durch jedes Nukleinsäure-Ziel zu ersetzen, ist in 7A abgebildet. Ein mögliches Ziel der Mutagenese kann in die SpeI-Stelle kloniert werden, welche kompatibel mit XbaI-, NheI-, AvrII- und SpeI-Schnittstellen ist. Zum Beispiel kann das GFP-Gen durch gezielte Integration unter Verwendung von pVjRepBsr in den Ig leichte Ketten-Locus eingefügt werden. Ein ψV Genspender-Ersatzvektor, pPseudoRepBsr, welcher es erlaubt, den Ig ψV Gen leichte Ketten-Locus durch jedes Nukleinsäure-Ziel zu ersetzten, ist in 7C abgebildet. Mögliche Spender für die Genkonversion können entweder in die NheI- oder SpeI-Schnittstelle kloniert werden, welche kompatibel mit XbaI-, NheI-, AvrII- und SpeI-Schnittstellen ist. Da die NheI-Schnittstelle zwischen zwei loxPs lokalisiert ist, kann diese Stelle für das Design von konditionellen Knockouts verwendet werden. Durch schrittweise gezielte Integration unter Verwendung von pPseudoRepGpt und pVjRepBsr, können ψV Gene durch das ψGFP Gen und seine Varianten ersetzt werden (z. B. ψCFP: Cyan Fluoreszentes Protein und ψYFP: Yellow Fluorescence Protein, Gelbes Fluoreszentes Protein), und das VJ-Gen kann durch GFP mit einer Rasterschubmutation (frameshift mutation, FsGFP) ersetzt werden, um eine genetische Diversifizierung des GFP-Gens zu überwachen. Es wird erwartet, dass der Rasterschub in FsGFP durch Genkonversion mit ψGFP, ψCFP und ψYFP als Matrix repariert wird. Zusätzlich wird das Gen weiter durch Hypermutation diversifiziert werden.
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20. Martin, A. & Scharff, M. D. Somatic hypermutation of the AID transgene in B and non-B cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 12304–12308 (2002).
21. Bachl, J. & Wabl, M. An immunoglobulin mutator that targets G. C base pairs. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 851–855 (1996).
22. Faili, A. et al. .AID-dependent somatic hypermutation occurs as a DNA single-strand event in the BL2 cell line. Nat. Immunol. 3, 815–821 (2002).
23. Arakawa, et al. Oligoclonal development of B cells bearing discrete Ig chains in chicken single germinal centers. J. Immunol. 160, 4232–4241 (1998).
24. Drake, J. W. Genetics 148, 1667–1686 (1998).
25. Lundberg, K. S. et al. Gene 108, 1–6 (1991).
26. Buerstedde, J. M. & Takeda, S. Increased ratio of targeted to random integration after transfection of chicken B cell lines. Cell Oct 4, 67(1): 179–88 (1991).

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur gezielten und selektiven Diversifizierung von endogenen Immunglobulingenen oder Teilen davon durch Hypermutation oder eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion, umfassend die Deletion von allen oder einem Teil der Genkonversions-Spender in einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, die Immunglobulingen-Konversionsaktivität aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins aufweist.
Verfahren zur gezielten und selektiven Diversifizierung einer transgenen Zielnukleinsäure durch (a) Hypermutation oder (b) eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion, umfassend die Insertion eines genetischen Konstrukts, das (a) die Zielnukleinsäure oder (b) die Zielnukleinsäure und mindestens eine Sequenz enthält, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure in den Immunglobulin-Locus einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen zu dienen, die Immunglobulingen-Konversionsaktivität aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins aufweist.
Verfahren zur gezielten und selektiven Diversifizierung einer transgenen Zielnukleinsäure durch (a) Hypermutation oder (b) eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion, umfassend die Insertion eines genetischen Konstrukts, welches Sequenzen enthält, die Hypermutation und/oder Genkonversion steuern und (a) der Zielnukleinsäure oder (b) der Zielnukleinsäure und mindestens einer Sequenz, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure in den Immunglobulin-Locus einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen zu dienen, die Immunglobulingen-Konversionsaktivität aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, die Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle zum Wildtyp homologe Rekombinationsaktivität enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine nicht beeinträchtigte Proliferationsrate aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle in der Lage ist, DNA-Reparatur auszuführen.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine bursale Lymphomzelle aus Huhn ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle eine DT40-Zelle oder ein Derivat davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle Aktivierungs-induzierte Deaminase exprimiert (AID).
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure für ein Protein kodiert oder eine regulatorische Aktivität ausübt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure für eine Immunglobulinkette, einen Selektionsmarker, eine DNA-bindendes Protein, ein Enzym, ein Rezeptorprotein oder einen Teil davon kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure ein humanes Immunglobulin V-Gen oder ein Teil davon ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure ein Transkriptions-regulatorisches Element oder eine RNAi-Sequenz enthält.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure durch gezielte Integration an einem definierten Ort in das Chromosom integriert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure arbeitsfähig mit Kontroll-Nukleinsäuresequenzen verbunden ist, die genetische Diversifizierung steuern.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, dass die Zelle die Zielnukleinsäure auf eine Art exprimiert, die Selektion von Zellen erleichtert, welche Mutanten der Nukleinsäure mit einer erwünschten Aktivität umfassen.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion eine direkte Selektion auf die Aktivität der Zielnukleinsäure in der Zelle, auf der Zelloberfläche oder außerhalb der Zelle ist.
Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Selektion eine indirekte Selektion auf die Aktivität einer Reporternukleinsäure ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Diversifizierung der Zielnukleinsäure durch Genkonversion und Hypermutation von in cis wirkenden regulatorischen Sequenzen moduliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Diversifizierung der Zielnukleinsäure durch Genkonversion und Hypermutation durch Variation der Anzahl, der Orientierung, der Länge oder des Grads der Homologie der Genkonversions-Spender moduliert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Diversifizierung der Zielnukleinsäure durch Genkonversion und Hypermutation durch einen in trans wirkenden regulatorischen Faktor moduliert wird.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der in trans wirkende regulatorische Faktor Aktivierungsinduzierte Deaminase (AID) ist.
Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass der in trans wirkende Faktor ein DNA-Reparatur- oder Rekombinations-Faktor außer einem Paralog oder Analog von RAD51 ist.
Verfahren zur Herstellung einer Zelle, die zu direkter und selektiver genetischer Diversifizierung einer Zielnukleinsäure durch Hypermutation oder eine Kombination von Hypermutation und Genkonversion in der Lage ist, umfassend (a) die Transfektion einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, die eine Immunglobulingen-Konversionsaktivität aufweist und keine schädlichen Mutationen in Genen aufweist, welche für Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins kodieren, mit einem genetischen Konstrukt, das die Zielnukleinsäure enthält, und (b) die Identifizierung einer Zelle, bei der das endogene V-Gen oder ein Fragment davon durch die Zielnukleinsäure ersetzt ist.
Verfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, dass das genetische Konstrukt, welches die Zielnukleinsäure enthält, ferner mindestens eine Nukleinsäure enthält, die in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen.
Verfahren nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, dass der Locus, welcher die Zielnukleinsäure enthält, durch mutiple Transfektionsrunden hergestellt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 26, ferner umfassend (c) die Transfektion der Zelle aus Schritt (b) mit einem weiteren genetischen Konstrukt, welches ein Reportergen umfasst, das in der Lage ist, von der Zielnukleinsäure beeinflusst zu werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 27, ferner umfassend (d) die bedingte Expression eines in trans wirkenden regulatorischen Faktors.
Verfahren nach Anspruch 28, dadurch gekennzeichnet, dass der in trans wirkende regulatorische Faktor Aktivierungsinduzierte Deaminase (AID) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 24 bis 29, dadurch gekennzeichnet, dass die Zielnukleinsäure durch gezielte Integration an einem bestimmten Ort in das Chromosom der Zelle eingefügt ist.
Verfahren zur Herstellung eines Genprodukts mit einer gewünschten Aktivität, umfassend die Schritte: (a) Transfektion einer B-Zelle aus Huhn, Schaf, Kuh, Schwein oder Kaninchen, welche Immunglobulingen-Konversionsaktivität aufweist und keine schädlichen Mutati onen in Genen aufweist, die für Paraloge und Analoge des RAD51-Proteins kodieren, mit einem genetischen Konstrukt, das eine transgene Zielnukleinsäure und optional mindestens eine Sequenz enthält, welche in der Lage ist, als Genkonversions-Spender für die Zielnukleinsäure zu dienen; (b) die Kultur der Zellen unter angemessenen Bedingungen, um die Zielnukleinsäure zu exprimieren, (c) die Identifizierung einer Zelle oder von Zellen in der Population von Zellen, welche ein mutiertes Genprodukt mit der gewünschten Aktivität exprimiert; und (d) die Etablierung von einer oder mehreren klonalen Populationen von Zellen aus der Zelle oder den Zellen, welche in Schritt (c) identifiziert wurden, und die Selektion aus dieser klonalen Populationen von einer Zelle oder Zellen, welche ein Genprodukt mit einer verbesserten gewünschten Aktivität exprimieren.
Verfahren nach Anspruch 31, dadurch gekennzeichnet, dass Schritte (c) und (d) iterativ wiederholt werden.
Verfahren nach Anspruch 31 oder 32, ferner den Schritt umfassend, genetische Diversifizierung abzuschalten.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 33, dadurch gekennzeichnet, dass die Diversifizierung der Zielnukleinsäure ferner durch Optimierung der Zielsequenz modifiziert wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 31 bis 34, dadurch gekennzeichnet, dass die genetische Diversifizierung durch Herunterregulation der Expression eines in trans wirkenden regulatorischen Faktors abgeschaltet wird.
Verfahren nach Anspruch 35, dadurch gekennzeichnet, dass der in trans wirkende regulatorische Faktor Aktivierungsinduzierte Deaminase (AID) ist.