DE60106469T2

DE60106469T2 - Verfahren zur Herstellung von genetisch veränderten Lymphozyten Vorläuferzellen von Wirbeltieren und deren Gebrauch zur Produktion von heterologen Bindeproteinen

Info

Publication number: DE60106469T2
Application number: DE60106469T
Authority: DE
Inventors: Ulf Grawunder; Georg Friedrich Melchers
Original assignee: 4-Antbody AG; ANTBODY AG BASEL 4
Current assignee: 4-Antbody AG; ANTBODY AG BASEL 4
Priority date: 2001-12-22
Filing date: 2001-12-22
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2021-12-23
Also published as: EP1321477A1; EP1321477B1; ATE279441T1; DE60106469D1; ES2231382T3; DK1321477T3

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Gebiete der Gentechnologie und der Herstellung von Antikörpern. Insbesondere betrifft sie die Generierung von genetisch modifizierten Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten mit der Fähigkeit, sich in reifere Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, und die Verwendung derselben zur Herstellung jedweder heterologer Antikörper oder Bindeproteine.
Hintergrund der Erfindung
Monoklonale Antikörper haben sich sowohl für die Diagnose als auch zur Prävention und Therapie von Erkrankungen als wirksame Reagenzien erwiesen (Glennie und Johnson, Immunol. Today, 21, S. 403–410, 2000). Dies liegt an ihrer einmaligen Fähigkeit, in sehr spezifischer Weise über ihre variablen Domänen an bestimmte Epitope von Zielmolekülen (Antigene) zu binden und gleichzeitig über die Domänen ihrer konstanten Regionen Effektorfunktionen auszuüben (Frazer und Capra, Fundamental Immunology, W. E. Paul (Hrsg.), Vierte Auflage, S. 37–74, 1999) (1). Hierdurch werden monoklonale Antikörper befähigt, einzigartige Antigene in komplexen Mischungen von Makromolekülen spezifisch zu identifizieren und auf diese Ziele Effektorfunktionen auszuüben.
Antikörper (oder Immunglobuline) bestehen aus zwei identischen Glykoproteinen der schweren (H) und leichten (L) Kette, welche über Disulphidbrücken verbunden sind (1). Jede H- und L-Kette umfasst eine N-terminale variable Domäne, welche zwischen verschiedenen Antikörpern variiert, und eine C-terminale konstante Region, welche in verschiedenen Antikörpern, die demselben Immunglobulin-Isotyp angehören, identisch ist (1). Die Kombination von variablen Domänen der H- und L-Kette bildet die Antigenbindungstasche des Antikörpers und bestimmt dessen Spezifität (oder Idiotyp), wohingegen die konstanten Regionen dessen Isotyp festlegen (Frazer und Capra, s. o.). Die Variabilität von Immunglobulinen resultiert aus der Tatsache, dass V_H- und V_L- Domänen von einer Vielzahl von Gensegmenten kodiert werden, welche mit V (variabel), D (Diversität; lediglich im Locus der H-Ketten vorhanden), und J (verknüpfend) bezeichnet werden (Tonogawa, Nature, 302, S. 575–581, 1983) (1). Während der Differenzierung von B-Lymphozyten erfolgt in jeder Zelle eine zufällige Auswahl eines V-, D- und J-Gensegments für den stellenspezifischen Rekombinationsprozess der V(D)J-Rekombination, durch den die Gensegmente derart zusammengefügt werden, dass neue kodierende Regionen für V_H- oder V_L-Domänen entstehen (Grawunder et al., Curr. Opin. Immunol., 10, S. 172–180, 1998). Aufgrund der Vielzahl von V-, D-, und J-Gensegmenten und der unpräzisen Verknüpfung der Gensegmente kann von den Millionen B-Lymphozyten, die täglich von dem Immunsystem gebildet werden, ein beachtliches Repertoire unterschiedlicher V-Regionspezifitäten generiert werden (Melchers et al., Curr. Opin. Immunol., 7, S. 214–227, 1995).
Während der Evolution haben sich die Immunglobulingene zwischen verschiedenen Spezies geringfügig unterschiedlich entwickelt, sodass sich die konstanten Regionen von Antikörpern zwischen verschiedenen Spezies unterscheiden. Folglich sind Immunglobuline aus einer Spezies zumeist immunogen, wenn sie in das Gefäßsystem einer anderen Spezies eingeführt werden.
Die Immunogenität xenogener monoklonaler Antikörper beschränkt daher deren Verwendung in der Therapie von Erkrankungen des Menschen, da die Konfrontationen von Patienten mit xenogenen Antikörpern zu Nebenwirkungen und sogar zu einer akuten Toxizität oder einfach zu einer Neutralisierung und Clearance des verabreichten Antikörpers führen kann, wodurch dessen pharmakologische Wirksamkeit vermindert wird (Clark, Immunol Today, 21, S. 397–402, 2000). Demgegenüber führt die Verabreichung vollständig humaner Antikörper an Patienten gewöhnlich zu keiner der zuvor beschriebenen Komplikationen.
Humane Antiseren oder humane polyklonale Antikörper sind gelegentlich aus dem Blut einzelner Patienten zur Behandlung oder Prävention von seltenen und gewöhnlich in hohem Maße tödlichen Erkrankungen, wie Infektionen mit dem Ebolavirus, oder z. B. für die Behandlung von Individuen nach Kontakt mit Schlangengiften isoliert worden. Dieser Ansatz ist jedoch aus vielerlei Gründen für die Behandlung von Erkrankungen, die größere Populationen betreffen, nicht praktikabel. Ferner ist es aus ethischen Gründen unmöglich, Menschen mit einem gegebenen Antigen zum Zwecke der Bildung monoklonaler Antikörper zu immunisieren, da die die gewünschten Antikörper produzierenden Zellen der B-Zelllinie beim Menschen in sekundären Lymphoidorganen entwickelt und gelagert werden und daher nicht in einfacher Weise erhalten werden können. Ferner sind viele potenzielle Target-Antigene für therapeutische Antikörper, wie insbesondere zur Krebstherapie, humane Proteine (Glennie und Johnson, s. o.). Gegen diese Ziele erfolgt im Menschen unter normalen Umständen keine Bildung von Antikörpern. Daher sind in der jüngeren Vergangenheit beachtliche Anstrengungen unternommen worden, um Verfahren zur Entwicklung von therapeutischen humanen oder humanisierten Antikörpern ohne Mitwirkung des humanen Immunsystems bereit zu stellen.
Der einfachste Ansatz besteht in der Anwendung standardisierter Verfahren der Gentechnik zur Klonierung von cDNAs, die für die variablen Domänen der H- und L-Ketten (V_H- und V_L-Domänen) kodieren, aus einer Hybridom-Zelllinie, die einen xenogenen Antikörper der gewünschten Spezifität sezerniert. Die klonierten cDNAs der variablen Regionen werden anschließend in geeignete Expressionsvektoren für E. coli, Hefe, Insekten- oder Säugerzellen kloniert, welche humane Gene für die konstanten Regionen enthalten. Hierdurch wird die Bildung monoklonaler Antikörper ermöglicht, bei denen die xenogenen V_H- und V_L-Domänen mit den Domänen der konstanten C_H- und C_L-Regionen humanen Ursprungs fusioniert sind, woraus ein humanisierter Antikörper resultiert. Dieser Ansatz weist jedoch den Nachteil auf, dass die Fusion der xenogenen V_H- und V_L-Domänen mit humanen, konstanten C_H- und C_L-Regionen entweder zu einer verminderten Affinität oder zu einer veränderten Spezifität führen kann. Zusätzlich sind die heterologen V_H und V_L des humanisierten Antikörpers in Menschen immer noch immunogen, da die Framework-Regionen von V-Domänen zwischen verschiedenen Spezies variieren. Dieses Problem kann in einigen Fällen durch das Aufpfropfen von individuellen, die Komplementarität bestimmenden Regionen (CDRs), durch die der direkte Kontakt mit Antigenen vermittelt wird, auf humane Framework-Regionen der variablen Domänen der schweren und leichten Kette umgangen werden (Fiorentini et al., Immunotechnology, 3, S. 45–59, 1997). Aus unbekannten Gründen führt das CDR-Pfropfen jedoch häufig immer noch zur Generierung immunogener Antikörper und/oder zur Verminderung/zum Verlust der Affinität und Spezifität.
Folglich sind in den zurückliegenden Jahren für die Herstellung von vollständig humanen Immunglobulinen zwei unterschiedliche und effektivere Ansätze entwickelt worden.
Das erste Verfahren basiert auf der Expression (dem Display) variabler, aus einer V_H- und V_L-Domäne bestehender Einzelkettenregionen (scFv) auf der Oberfläche filamentöser Bakteriophagen von E. coli (Hoogenboom und Chames, Immunol. Today, 21 S. 371–3818, 2000) (s. auch EP 0 585 287 B1 , EP 0 605 522 B1 ). Es können Phage-Display-Bibliotheken hergestellt werden, die ein diverses Repertoire von V_H- und V_L-Ketten enthalten, und individuelle scFv-Spezifitäten können aus derartigen Bibliotheken durch Bindung rekombinanter Phagen an immobilisierte Antigene isoliert werden (McCafferty et al., Nature, 348, S. 552–554, 1990).
Phage-Display-Bibliotheken für scFv-Bindeproteine, die von einem natürlichen humanen Repertoire abgeleitet sind, weisen den Nachteil auf, dass sie auf Spezifitäten beschränkt sind, die in diesem Repertoire enthalten sind, weshalb Spezifitäten für viele humane Antigene in derartigen Bibliotheken zumeist nicht repräsentiert sind. Obgleich kombinatorische oder synthetische Phage-Display-Bibliotheken zur Lösung dieses Problems verwendet werden können, liegt ein grundsätzlicher Nachteil dieser Technologie darin, dass Bindeproteine mit einer hohen Affinität für ein gegebenes Antigen häufig nicht isoliert werden können. Daher sind große Anstrengungen unternommen worden, um sehr große primäre Bibliotheken entweder im Wege der Brute-Force-Klonierung oder durch stellenspezifische Rekombinationsverfahren herzustellen.
Es wird geschätzt, dass die besten kombinatorischen oder synthetischen Bibliotheken 10⁹–10¹¹ potenziell unterschiedliche Bindungsstellen enthalten und Bindungsspezifitäten im Bereich von 1–200 nM ergeben können (Hoogenboom und Chames, s. o.). Höhere Affinitäten im pikomolaren Bereich (10^–12 M), wie sie während der in vivo Affinitätsreifung von Immunglobulinen in B-Zellen des Keimzentrums erreicht werden können, können jedoch lediglich erzielt werden durch den Einsatz von zusätzlichen zeitaufwendigen Gentechnikverfahren einschließlich V-Gene Shuffling, 'error prone'-PCR, und der Verwendung von E. coli-Mutantenstämmen etc.
Unabhängig von dem Ergebnis der Selektion einer Phage-Display-Bibliothek müssen die für die scFv-Bindungsstelle kodierenden Gene in geeignete Expressionsvektoren für humane Immunglobuline umkloniert werden, und diese müssen stabil in ein zelluläres Expressionssystem überführt werden, welches die Herstellung von humanen Antikörpern im Großmaßstab erlaubt, was eine weitere zeit- und kostenintensive Vorgehensweise bedeutet.
Der zweite Ansatz zur Herstellung vollständig humaner monoklonaler Antikörper basiert auf der Verwendung transgener Mäuse, die Konstrukte für Genloci der humanen H- und L-Immunglobulinketten beherbergen (Jakobovits, Curr. Opin. Biotechnol., 6, S. 561–566, 1995). Die humanen Immunglobulin-Transgene werden schließlich in einen genetischen Hintergrund eingekreuzt, auf dessen Grundlage ein Zusammenfügen der endogenen murinen Antigen-Rezeptorgene nicht mehr möglich ist. In diesen Mäusen hängt die Bildung von Zellen der B-Zelllinie von der Expression der schweren und leichten Immunglobulinketten von den humanen transgenen Konstrukten ab, und Zellen der B-Zelllinie dieser Mäuse können lediglich humane Antikörper herstellen. Es existieren drei Variationen dieser Verfahrensweise. Bei einer werden als Transgene humane Immunglobulin-Miniloci verwendet, von denen lediglich ein beschränktes Repertoire an humanen Antikörpern generiert werden kann (Fishwild et al., Nat. Biotechnol., 14, S. 845–851, 1996) (s. auch EP 0 546 073 B1 , US 5,874,299 , WO 92/03918). Nach einer zweiten Variante werden große Regionen der humanen IgH- und IgκL-Ketten-Genloci verwendet, die die Mehrzahl der in künstliche Hefechromosomen einklonierten Gensegmente der variablen Region umfassen. Nach einer dritten Variation werden Stücke menschlicher Chromosomen, die sämtliche humane Genloci der schweren und leichten Immunglobulinketten enthalten, in die Keimbahn von Mäusen eingeführt, wodurch sogenannte transchromosomale Tiere entstehen. Mäuse mit derartig komplexen Transgenen entwickeln ein praktisch normales humanes Immunglobulin-Repertoire.
Die Immunisierung dieser transgenen oder transchromosomalen Mäuse führt zu einer humoralen Immunantwort und damit zur Bildung von vollständig humanen Antikörpern. Dieser Ansatz zur Generierung humaner Antikörper weist gegenüber der Technologie der Phage-Display-Bibliothek einen wichtigen Vorteil auf: Es können für ein gegebenes Antigen hochaffine Antikörper generiert werden, da die humanen Immunglobuline in B-Zellen des Keimzentrums eine Affinitätsreifung durchlaufen können, was im Verlauf einer Immunreaktion ein normaler Vorgang ist.
Diese Technologie leidet jedoch an einem wichtigen Nachteil: Erstens ist die Generierung transgener oder transchromosomaler Mäuse sehr mühsam, schwierig und zeitaufwendig und daher relativ kostenintensiv. Beispielsweise beschreibt die WO 92/03918 B-Zellen einer transgenen Maus, die humane monoklonale Antikörper exprimieren. Um zu dieser transgenen Maus zu kommen, werden befruchtete Eizellen mit exogenen Elementen transfiziert, indem die heterologen Transgene der schweren und leichten Immunglobulinkette mittels pronukleärer Injektion eingeführt werden. Die gesamte Vorgehensweise erfordert die Bildung von mindestens vier verschiedenen Mausstämmen: Zwei Stämme mit zielgerichteten Disruptionen innerhalb der endogenen Genloci für die schwere und leichte Immunglobulinkette, als auch zwei Stämme, die Transgene oder Transchromosomen für einen Teil oder sämtliche der humanen Genloci für die schwere und leichte Immunglobulinkette tragen. Zusätzlich müssen diese vier Mausstämme miteinander gekreuzt werden, wodurch Mäuse mit einem Genotyp erzeugt werden, die homozygote Disruptionen der endogenen Genloci für die schwere und leichte Immunglobulinkette aufweisen und gleichzeitig die humanen Transgene tragen, die für die heterologen schweren und leichten Immunglobulinkette kodieren. Die Schaffung der verschiedenen Knockout- und transgenen Mausstämme, und deren Screening und anschließendes Kreuzen ist eine langwierige Prozedur und erfordert mindestens 2 Jahre, selbst wenn jeder Schritt vollständig optimiert ist. Die ausgedehnten Zeitabschnitte, die für die Entwicklung eines Xenomaus-Stammes erforderlich sind, lassen wenig Flexibilität bei der Schaffung unterschiedlicher Mausstämme, die modifizierte transgene Konstrukte enthalten. Daher ist diese Technologie für die Modifikation und Verbesserung existierender Antikörper (z. B. ihrer Affinität) nicht geeignet, da hierfür die langwierige Vorgehensweise der Generierung eines neuen transgenen Mausstammes für diesen einen Antikörper erforderlich wäre. Diese Technologie ist daher grundsätzlich beschränkt auf die de novo-Generierung humaner Antikörper.
Aufgrund der zuvor genannten Tatsachen besteht eindeutig der Bedarf an einer Technologie, welche die Herstellung vollständig humaner Antikörper erlaubt und bei der die Vorteile sowohl des Phage-Display-Systems (d. h. Schnelligkeit und Flexibilität bei der Generierung humaner Antikörper, und die Möglichkeit zur Modifizierung und Verbesserung der Eigenschaften existierender Antikörper) als auch der Technologie der hinsichtlich humaner Immunglobuline transgenen Maus (d. h. die Möglichkeit zum Erhalt hochaffiner Antikörper aufgrund der im Immunsystem stattfindenden Affinitätsreifung, und die Bildung von Antikörpern mit physiologischen und natürlichen Struktureigenschaften) vereinigt sind.
Zusammenfassung der Erfindung
Mit der vorliegenden Erfindung werden Mittel und Verfahren zur Herstellung von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten bereit gestellt, die verwendet werden können zur Produktion irgendeines Bindeproteins oder eines oder mehrerer funktioneller Fragmenten davon mit der Fähigkeit, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder mit modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahnkodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigenrezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines funktionellen Fragments davon. Insbesondere werden durch die Erfindung Mittel und Verfahren bereitgestellt, um Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten genetisch zu modifizieren und ihre Differenzierung in reifere Zellen der lymphoiden Linie entweder in vitro oder in vivo zu bewirken, wodurch Lymphozyten generiert werden, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment(e) davon zu produzieren, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Bindeproteins oder funktionellen Fragments davon. Ferner werden durch die vorliegende Erfindung genetisch modifizierte Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten und reife Zellen der lymphoiden Linie als auch immortalisierte, davon abgeleitete Zellen bereitgestellt, die zur Ausführung der erfindungsgemäßen Verfahren geeignet sind.
Demgemäß erlauben die Verfahren der vorliegenden Erfindung eine große Flexibilität bei der Schaffung von lymphoiden Zelllinien mit dem Potenzial, einfach jeden Typ von Antikörper oder Bindeprotein innerhalb kurzer Zeit zu exprimieren. Gleichzeitig erlaubt die Möglichkeit der Transplantation dieser Zellen in kompatible Vertebraten-Rezipienten, in denen die Zellen an spezifischen Immunfunktionen wie der Affinitätsreifung teilnehmen, die Ausnutzung der Selektivität des Immunsystems zur Schaffung von Antikörpern und Immunglobulin-ähnlichen oder sogar von artifiziellen Bindeproteinen mit hohen Bindungsaffinitäten für jedwede gegebene antigene Verbindung oder Zusammensetzung.
Beschreibung der Zeichnungen
1 ist eine schematische Darstellung der Struktur und Genetik eines Immunglobulins. Antikörper oder Immunglobuline (Ig) sind Glykoproteine, die in ihrer monomeren Form aus zwei identischen schweren Ketten (IgH) und zwei identischen leichten Ketten (IgL), die über Disulphidbrücken kovalent miteinander verknüpft sind, bestehen. Jede IgH-Kette umfasst eine N-terminale variable Domäne (V_H) und 3–4 Domänen der konstanten Region (C_H1–3, oder 4), was vom Antikörperisotyp abhängig ist. Zusätzlich enthalten Antikörper zwischen der ersten und der zweiten C_H-Domäne eine Gelenk-Region, durch die den beiden Antigen-Bindungsarmen des heterotetrameren Glykoproteins Flexibilität verliehen wird. Die leichten Ketten bestehen lediglich aus einer N-terminalen variablen (V_L) und einer C-terminalen konstanten Domäne (C_L). Das Arrangement der beiden IgH- und IgL-Ketten führt zu einem Y-förmigen monomeren Antikörper mit zwei hochvariablen Antigen-Bindungsstellen, welche durch die Assoziation der variablen Domänen der IgH- und IgL-Ketten gebildet werden. Beim Vergleich der V-Regionen verschiedener Antikörper variieren die variablen Domänen in einem großen Ausmaß im Bereich so genannter hypervariabler Regionen. Diese Variabilität resultiert aus der Tatsache, dass V-Regionen nicht durch einzelne Gene, sondern, im Falle von V_H-Regionen, durch eine Reihe verschiedener V-, D- und J-Gensegmente kodiert werden, von denen jedes einzelne zufällig ausgewählt und anschließend rekombiniert wird, um die variable Kodierungsregion von IgH-Ketten zu bilden (s. oberer linker Teil der Zeichnung). Dieser Prozess wird als V(D)J-Rekombination bezeichnet und tritt während der frühen Entwicklungsphase von B-Zellen auf. Die Genloci für die IgL-Kette enthalten lediglich eine Reihe verschiedener V- und J-Gensegmente, aus denen kodierende Regionen für variable Domänen durch ein zufälliges V- zu J-Rearrangement generiert werden (s. oberer rechter Teil der Zeichnung). Die Domänen der konstanten Region von Antikörpern derselben Unterklasse (Isotyp) bestimmen die Effektorfunktionen des Antikörpers und unterscheiden sich zwischen verschiedenen Antikörpern nicht. Individuelle B-Lymphozyten können jedoch im Verlauf einer Immunantwort zu einer Veränderung des Isotyps des exprimierten Antikörpers veranlasst werden. In diesem Fall kommt es zu einem somatischen DNA-Rekombinationsereignis zwischen Switch-Regionen (im unteren Teil der Zeichnung durch einen Punkt innerhalb der grafischen Darstellung der Gene der konstanten Region hervorgehoben), die 5' von den verschiedenen Genen der konstanten Region lokalisiert sind. Beispielsweise kann eine Rekombination zwischen den μ- und ε-Switch-Regionen zu einer Deletion sämtlicher Gene für die konstante Region von Cμ bis Cγ4 führen, wie in der Zeichnung angedeutet ist. Hierdurch wird eine variable VDJ-Kodierungsregion in unmittelbare Nähe einer konstanten Cε-Region gebracht, was zur Expression eines Antikörpers des IgE-Isotyps führt.
In 2 ist die Entwicklung von B-Zellen in der Maus veranschaulicht. Die Differenzierung von B-Lymphozyten in der Maus kann in voneinander getrennte Phasen unterteilt werden, die phänotypisch und genotypisch weiter unterteilt werden können. Die frühesten B-Vorläufer(präB)-Zellen, die im Knochenmark von Wildtypmäusen gefunden werden können, stammen von einer pluripotenten hämatopoetischen Stammzelle (HSC, links), die keine Zelllinien-spezifischen Marker (mit Lin bezeichnet) exprimiert, die aber durch die Expression des Stammzellen-Antigens 1 (Sca-1) auf ihrer Oberfläche gekennzeichnet ist. Hiervon ausgehend werden präB-Zellen generiert, die gewöhnlich auf beiden Allelen der IgH-Kette DJ_H-Rearrangements tragen und gekennzeichnet sind durch die Expression von B220 (ein pan-B-Zellmarker) und c-kit auf ihrer Oberfläche. In dieser Phase befinden sich sämtliche andere Ig-Genloci gewöhnlich immer noch in der Keimbahn(GL)-Konfiguration. PräB-Zellen mit einem DJ_H-Rearrangement werden als PräB-I-Zellen bezeichnet und können unter spezifischen Bedingungen in Gewebekultur gezogen werden. Das nächste Ereignis eines Rearrangements in diesen Zellen beinhaltet die Umlagerung eines der V_H-Gensegmente mit einem vorher existierenden DJ_H-Element. Sofern hierdurch ein produktives Rearrangement irgendeines Allels erreicht wird, so dass eine μH-Kette exprimiert werden kann, erhalten diese Zellen ein proliferatives Signal, wodurch sie sich vermehren und in PräB-II-Zellen differenzieren. Diese Zellen können den Oberflächenmarker c-kit nicht mehr exprimieren, erlangen aber die Fähigkeit zur Expression von CD25. Ein weiteres produktives Rearrangement auf irgendeinem der IgL-Allele führt zur Differenzierung in unreife B-Zellen, die membrangebundene Immunglobuline (IgM) exprimieren. Diese unreifen nativen B-Zellen können das Knochenmark verlassen und in periphere Lymphoidorgane einwandern, wo sie schließlich auf Antigene treffen können. Im Verlauf einer Immunreaktion können diese B-Zellen in Antikörper-sekretierende Plasmazellen differenzieren, währenddessen es zu einem weiteren DNA-Rekombinationsprozess (Class-Switch-Rekombination) im Locus der konstanten IgH-Region kommen kann, was zu einer Veränderung des von den Plasmazellen sekretierten Antikörperisotyps führt.
Die 3 zeigt einen schematischen Überblick über das erfindungsgemäße Verfahren zur Generierung humanisierter Vorläufer-B-Lymphozyten (HupräB's). PräB-I-Zellen mit einem murinen DJ_H-Rearrangement können aus der fötalen Mäuseleber 14–19 Tage nach der Befruchtung oder vom Knochenmark erwachsener Mäuse isoliert werden (Schritt 1). Die langfristige Kultivierung dieser Zellen erfordert besondere Gewebekulturbedingungen, einschließlich Schichten von Stroma-Nährzellen und/oder Anwesenheit bestimmter Wachstumsfaktoren, wie z. B. IL-7 (Interleukin 7). Unter diesen Bedingungen erfolgt keine weitere Differenzierung der PräB-I-Zellen (Schritt 2). Um diese Zellen für die Herstellung heterologer Antikörper zu verwenden muss verhindert werden, dass es in diesen Zellen zu weiteren produktiven endogenen Ig-Gen-Rearrangements kommt. Dies kann z. B. erfolgen, indem in beide Allele der Genloci für die schwere und leichte Kette eine oder mehrere cis-agierende Mutationen eingeführt werden (Schritt 3b), oder, alternativ, indem eine oder mehrere trans-agierende Mutationen eingeführt werden, die eine weitere V(D)J-Rekombination der Ig-Gene verhindert, z. B. durch Deletion eines der beiden Gene zur Aktivierung der Rekombination RAG-1 oder RAG-2 (Schritt 3a). Die letztgenannten Zellen können anschließend mit rekombinanten Retroviren, die in der Lage sind, die Expression von xenogenen, in diesem Fall humanen IgH- und IgL-Ketten zu vermitteln, stabil transduziert werden (Schritt 4a). Diese retroviralen Vektoren können ferner verwendet werden zur stabilen Transduktion der zuvor genannten Zellen, die cis-agierende Mutationen in endogenen Ig-Genloci aufweisen. Zusätzlich sind präB-Zellen mit cis-agierenden Mutationen immer noch in der Lage zur Durchführung von Ig-Gen-Rearrangements. Es ist daher möglich, diese Zellen mit heterologen Ig-Genloci der Keimbahn stabil zu transfizieren, welche V(D)J-Rearrangements durchlaufen können und von denen neue xenogene Antikörper produziert werden können (Schritt 4b). Sofern die heterologen oder xenogenen Gene für die IgH- und IgL-Kette menschlichen Ursprungs sind, werden die PräB-I-Zellen lediglich das Potenzial aufweisen für die Expression vollständig humaner Antikörper, weshalb sie als HupräB-Zellen bezeichnet werden.
Die 4 ist eine schematische Darstellung, in der das Targeting der endogenen Genloci unter Verwendung positiv/negativer Vektoren zum Gene-Targeting veranschaulicht wird. Für das Targeting endogener Genloci wird eine genomische Region von ungefähr 1 kb stromaufwärts (kurzer Arm) des Locus und eine Region von ungefähr 3 kb (langer Arm) stromabwärts des Gens in einen leeren positiv-negativen Targeting-Vektor kloniert. Beispielhaft ist die Strategie zum Targeting eines DJ_H3-rearrangierten Locus der IgH-Kette dargestellt. Mit diesem Konstrukt erfolgt die Transfektion von PräB-I-Zellen und die Integration des Targeting-Vektors mittels homologer Rekombination wird selektiert und schließlich nachgewiesen. Der positive Selektionsmarker erlaubt die Selektion nach der stabilen Integration des Konstrukts in das Genom der transfizierten Zelle. Die Expression des negativen Selektionsmarkers wäre für die Zelle toxisch, weshalb nur solche Zellen Überleben, die den negativen Selektionsmarker bei der stabilen Integration verloren haben, was durch zwei homologe Rekombinationsereignisse am richtigen Locus eintritt. Zwei mögliche Stellen für die homologe Rekombination zwischen dem endogenen Genlocus und dem Targeting-Konstrukt sind durch unterbrochene Linien angegeben. Sofern es durch derartige homologe Rekombinationsereignisse zu einer Integration des Konstrukts kommt, ersetzt der positive Selektionsmarker die endogene Region, die zwischen den homologen kurzen und langen Armen lokalisiert ist. Wenn der positive Selektionsmarker wie angegeben von zwei loxP-Rekombinationssignalen flankiert ist, kann die Deletion des Selektionsmarkers durch transiente Expression der cre-Rekombinase vermittelt werden, sodass dasselbe Targeting-Konstrukt zum Targeting des zweiten Allels desselben Genlocus verwendet werden kann.
In 5a ist die Klonierungsstrategie für die Herstellung eines Targeting-Vektors für einen Genlocus einer IgH-Kette veranschaulicht. Die detaillierte Klonierungsstrategie für die Herstellung eines möglichen Targeting-Konstrukts für DJ_H-rearrangierte murine Genloci der IgH-Kette ist hier am Beispiel eines D_FL16.1-J_H4-rearrangierten Genlocus dargestellt. Andere DJ_H-rearrangierte Genloci der IgH-Kette können mit demselben Targeting-Vektor erreicht werden. Einmalige Restriktionsstellen im endogenen Genlocus sind angegeben (oberes Konstrukt), und die Regionen von 1523 und 3215 Bp, die mittels PCR aus genomischer DNA in den leeren positiv-negativen Targeting-Vektor pBSL-flneo-DT4 kloniert worden sind, sind angegeben (s. 6b, pBSL-flneo-DT4 wurde als Beispiel für zahlreiche verschiedene leere Targeting-Vektoren ausgewählt). Die PCR-Primer für die kurzen und die langen Arme enthalten die Restriktionsstellen NotI und AscI zum Klonieren der Fragmente in die einmaligen und kompatiblen Restriktionsstellen von pBSL-flneo-DT4. Die Organisation des endgültigen Targeting-Konstrukts ist unten dargestellt, und die Positionen ausgewählter Restriktionsstellen sind angegeben.
In 5b ist die Klonierungsstrategie zur Herstellung eines Targeting-Vektors für den Genlocus der IgκL-Kette veranschaulicht. Die detaillierte Klonierungsstrategie zur Herstellung eines möglichen Targeting-Konstrukts für murine Genloci der IgκL-Kette für die zielgerichtete Deletion sämtlicher Jκ-Gensegmente der Keimbahn ist hier veranschaulicht. Einmalige Restriktionsstellen sind im endogenen Genlocus angegeben (oberes Konstrukt), und die Regionen von 739 und 3379 Bp, die aus genomischer DNA mittels PCR in den leeren positiv-negativen Targeting-Vektor pBSL-flneo-DT4 kloniert worden sind, sind angegeben (s. 6b, pBSL-flneo-DT4 wurde als Beispiel für zahlreiche verschiedene leere Targeting-Vektoren ausgewählt). Wie in 5a, enthalten die PCR-Primer für die kurzen und die langen Arme die Restriktionsstellen NotI und AscI zum Klonieren der kurzen und langen Arme in kompatible Restriktionsstellen von pBSL-flneo-DT4. Die Organisation des endgültigen Targeting-Konstrukts ist unten dargestellt, und die Positionen ausgewählter Restriktionsstellen sind angegeben.
Die 5c veranschaulicht die Klonierungsstrategie zur Herstellung eines Targeting-Vektors für den Genlocus RAG. Die detaillierte Klonierungsstrategie zur Herstellung eines möglichen Targeting-Konstrukts für den murinen Genlocus RAG für die zielgerichtete Deletion des Gens RAG-1 ist hier dargestellt. Der Genlocus RAG ist in der Maus auf dem Chromosom 2 lokalisiert und enthält die beiden sehr eng verknüpften Gene RAG-1 und RAG-2, die jeweils für sich für Rearrangements von Ig-Genen wesentlich sind. Die offenen Leserahmen (ORFs) beider Gene werden von einem einzigen Exon kodiert, aber ein kurzes, nicht-translatiertes Exon stromabwärts eines jeden Promotorelements (durch Dreiecke dargestellt) wird mit einem großen Exon gespleißt, dass die gesamten ORFs von RAG enthält. Einmalige Restriktionsstellen sind im endogenen Genlocus angegeben (oberes Konstrukt). Die genomischen Regionen von 1078 und 2950 Bp stromauf- bzw. stromabwärts des RAG-1 ORFs werden mittels PCR aus genomischer DNA in den leeren positiv/negativen-Targeting-Vektor pBSL-flneo-DT4 wie angegeben kloniert (s. 6b für pBSL-flneo-DT4, der als Beispiel für zahlreiche verschiedene leere Targeting-Vektoren ausgewählt wurde). Wie in 5a enthalten die PCR-Primer für die kurzen und langen Arme die Restriktionsstellen NotI und AscI zum Klonieren der kurzen und langen Armen in kompatible Restriktionsstellen von pBSL-flneo-DT4. Die Organisation des endgültigen Targeting-Konstrukts ist unten dargestellt, und die Positionen ausgewählter Restriktionsstellen sind angegeben.
Die 6a ist eine detaillierte Darstellung der Klonierungsstrategie für die auf DT-α und DT-α(tox176) basierenden positiv-negativen Vektoren zum Gene-Targeting (vorbereitende Schritte). Eine Vorbedingung für die Herstellung leerer Targeting-Vektoren ist die Verlängerung der multiplen Klonierungsstelle (MCS) eines gewöhnlichen Klonierungsplasmids, wie pBluescript, damit dem Polylinker zusätzliche geeignete Restriktionsstellen zugeführt werden, welche anschließend für die Insertion von Expressionskassetten für positive und negative Selektionsmarker als auch für genomische Regionen verwendet werden können, die zum Targeting eines endogenen Genlocus durch homologe Rekombination erforderlich sind. Dargestellt ist die Insertion eines zusätzlichen Oligomers mit zusätzlichen Restriktionsstellen in die MCS von pBlueskript, wodurch das Plasmid pBSL mit einem verlängerten Polylinker generiert wird. Dieses Konstrukt wird verwendet, um eine durch den β-Actin-Promotor gesteuerte Expressionskassette entweder für das Wildtyp-Diphterie-Toxin α oder für eine abgeschwächte Version davon, bezeichnet mit DTα(tox176), einzuführen (vgl. Beispiel 5b, Schritt 2). Diese beiden Konstrukte mit verlängerter multipler Klonierungsstelle sind mit pBSL-DT4 (unten links) bzw. pBSL-DT4tox176 (unten rechts) bezeichnet. Die Expressionskassetten für das Diphterie-Toxin werden unter Verwendung der Restriktionsstellen XbaI und BglII wie angegeben in pBSL kloniert. Eine diagnostische Restriktionsstelle NheI, die für die Expressionskassette des attenuierten Dttox176 einmalig ist, ist ebenfalls angegeben.
6b ist eine detaillierte Darstellung der Klonierungsstrategie der auf DT-α und DT-α(tox176) basierenden positiv-negativen Vektoren zum Gene-Targeting (letzte Klonierungsschritte). Beschrieben ist die Klonierung von leeren positiv/negativ Targeting-Vektoren, die als positive Selektionsmarker entweder Neomycin, HygromycinB oder Puromycin sowie eine Expressionskassette für das Wildtyp-Diphterie-Toxin α enthalten. Dieselben Klonierungsstrategien können für Vektoren angewendet werden, die stattdessen eine Expressionskassette für DT-α(tox176) enthalten. Die zum Klonieren von Fragmenten und für die Linearisierung von Konstrukten verwendeten Restriktionsenzyme sind angegeben. Sämtliche positive Selektionsmarker sind so gestaltet, dass sie von loxP-Stellen, welche von der cre-Rekombinase erkannt werden können, flankiert sind ('floxed'). Während eine gefloxte Expressionskassette für Neomycin von dem bestehenden Vektor pGL2-neo (m) + (DSM14705) rekloniert werden kann, müssen gefloxte Expressionskassetten für HygromycinB und Puromycin in zwei Schritten eingeführt werden. Hierfür wurde ein synthetisches DNA-Oligomer, das zwei loxP-Stellen enthält, die durch eine MluI-Stelle getrennt sind, unter Bildung von pBSL-DT4-2loxP wie angegeben in pBSL-DT4 eingeführt. In einem letzten Schritt wurden die Expressionskassetten für HygromycinB- und Puromycin-Resistenz mittels PCR in die einmalige MluI-Stelle von pBSL-DT4-2loxP kloniert.
Die 7a zeigt die schematische Organisation retroviraler Expressionsvektoren für humane IgH-Ketten. Rekombinante retrovirale Vektoren, die die Expression von humanen IgH- Kettenproteinen erlauben, sind modular aufgebaut und enthalten Promotor- und Enhancerelemente des Ig-Locus sowie kodierende Regionen für die Domänen der variablen und konstanten Region von IgH-Ketten. Die transkriptionelle Orientierung der IgH-Expressionskassette ist gegenläufig zum retroviralen 5'LTR-Promotorelement, um ein auf den Ig-spezifischen Promotor- und Enhancerelementen basierendes, für B-Zellen spezifisches Expressionsmuster zu schaffen. Die Expressionskassette enthält einen murinen V_H-Promotor, eine Leader(L)-Sequenz mit variable IgH-Domänen kodierenden VDJ-Exons, den murinen Intron-Enhancer der schweren Kette (EμH), konstante Regionen heterologer IgH-Ketten kodierende Exons, Exons für die Membran-überspannenden Regionen von Immunglobulinen, und Elemente des murinen IgH 3'α-Enhancers. Unter Verwendung von Restriktionsenzymen, die kompatible Überhänge generieren, können verschiedene L-VDJ-Regionen und selbst Bibliotheken von L-VDJ-Regionen in die einmaligen Restriktionsschnittstellen BamHI und HindIII des IgH-Expressionsvektors kloniert werden. Aufgrund des modularen Aufbaus können Exons oder Enhancerelemente der konstanten Region unter Anwendung einfacher molekularbiologischer Techniken ausgetauscht werden (wie angegeben).
Die 7b ist eine schematische Darstellung der Organisation retroviraler Expressionsvektoren für humane IgκL-Ketten. Wie die in 7a dargestellten Vektoren weisen rekombinante retrovirale Vektoren, die die Expression humaner IgκL-Kettenproteine erlauben, ein ähnliches modulares Design auf und enthalten für den IgL-Kettenlocus spezifische Promotor- und Enhancerelemente als auch kodierende Regionen für die Domänen der variablen und konstanten Region von IgκL-Ketten. Die transkriptionelle Orientierung der IgκL-Expressionskassette ist gegenläufig zum retroviralen 5'LTR-Promotorelement, um ein auf den Ig-spezifischen Promotor- und Enhancerelementen basierendes, für B-Zellen spezifisches Expressionsmuster zu schaffen. Die Expressionskassette enthält einen murinen V_κ-Promotor, eine Leader(L)-Sequenz mit variable IgκL-Domänen kodierenden VJ-Exons, den murinen κ-Intron-Enhancer (κiE), die konstante Region heterologer IgL-Ketten kodierenden Exons, sowie Elemente vom murinen Ig κ3'-Enhancer (κ3'E), wie angegeben. Zusätzlich enthalten retrovirale Expressionsvektoren für die IgκL-Kette eine vollständige Expressionskassette für Puromycin, wodurch die Selektion stabil transduzierter PräB-Zellen ermöglicht wird. Unter Verwendung von Restriktionsenzymen, die kompatible Überhänge generieren, können verschiedene L-VJ-Regionen und selbst Bibliotheken von L-VJ-Regionen in die einmaligen Restriktionsstellen BamHI und HindIII des IgH-Expressionsvektors kloniert werden. Aufgrund des modularen Designs können modifizierte Exons oder Enhancerelemente für die konstante Region unter Anwendung einfacher molekularbiologischer Techniken ausgetauscht werden (wie angegeben).
8 veranschaulicht die Vorgehensweise für die retrovirale Transduktion von murinen PräB-Zellen, die von Stromazellen und IL7 abhängig sind, mit retroviralen Vektoren, die heterologe IgH- und IgL-Ketten kodieren. Langfristig proliferierende, von Stromazellen und IL7 abhängige PräB-Zelllinien mit Mutationen, die mit endogenen Ig-Gen-Rearrangements interferieren (vgl. 3), können wie angegeben sequenziell mit IgL-Ketten und IgH-Ketten kodierenden retroviralen Expressionsvektoren transduziert werden. Nachdem die Zellen erfolgreich zunächst mit retroviralen Konstrukten zur Expression der heterologen IgL-Kette und anschließend mit solchen für die IgH-Kette transduziert worden sind, haben sie das Potenzial zur Expression heterologer Antikörper im Wege der Differenzierung dieser Zellen entweder in vitro oder in vivo (s. 10).
Die 9 zeigt einen schematischen Überblick über Quellen, aus denen variable Domänen kodierende Regionen isoliert werden können. Kodierende Regionen für die variablen Domänen können aus vielen unterschiedlichen Quellen isoliert werden, wie in dieser Figur dargestellt ist. Das modulare Design der retroviralen Vektoren erlaubt die Klonierung retroviraler Vektoren, die z. B. lediglich eine einzige Spezifität kodieren, beispielsweise von einem geeigneten, bereits existierenden monoklonalen Antikörper. Im Wege der Transduktion dieser Vektoren und der Transplantation transduzierter Zellen in Mäuse in vivo (s. 10) können dann einzelne Spezifitäten einer Affinitätsreifung zugeführt werden. Alternativ können vollständige VDJ- und VJ-Bibliotheken aus Lymphozyten des peripheren Blutes (PBLs) von entweder gesunden, kranken oder immunisierten Patienten isoliert und anschießend in retrovirale Expressionsvektoren für die IgH- und IgL-Kette kloniert werden. In der Tat ist es sogar möglich, vollständig synthetische Repertoires für die V_H- und V_L-Region zu generieren, die in retrovirale Ig-Expressionsvektoren kloniert werden können, welche dann nachfolgend stabil transduziert und in vivo funktionell selektiert werden können (s. 10).
Die 10 veranschaulicht die Transplantation von HuPräB's in immundefiziente Mäuse zur Herstellung vollständig humaner monoklonaler Antikörper. Wie normale murine PräB-Zellen können HuPräB-Zellen in murine Rezipienten transplantiert werden, wo sie an Immunreaktionen des Rezipienten teilnehmen können. Wenn HuPräB-Zellen in immundefiziente Rezipienten transplantiert werden, denen endogene B-Zellen fehlen, sind die einzigen Antikörper, die anschließend produziert werden können, heterologe (humane) Antikörper von den transplantierten HuPräB-Zellen. Es gibt viele verschiedene Rezipientenstämme, die für die Transplantation von HuPräB-Zellen verwendet werden können. Stämme ohne B- und T-Lymphozyten sind z. B. die bezüglich RAG-1 und RAG-2 defizienten sowie scid-Mausstämme. Um eine T-Zell-abhängige Immunreaktion unter Beteiligung von B-Lymphozyten, die von transplantierten HuPräB-Zellen stammen, auslösen zu können, können Populationen von T-Helferlymphozyten isoliert und in diese Mäuse co-transplantiert werden (linke Seite). Alternativ können Mausstämme lediglich ohne B-Lymphozyten, wie z. B. bezüglich J_H defiziente Mäuse, alleine durch Transplantation mit HuPräB-Zellen rekonstituiert werden (rechte Seite). Sobald die peripheren B- und T-Lymphozyten-Kompartimente nach der Transplantation rekonstituiert sind, können diese Mäuse unter Anwendung gewöhnlicher Protokolle zur Immunisierung gegen jedwedes gewünschte Antigen immunisiert werden. Von diesen Mäusen stammende Plasmazellen können anschießend z. B. durch Fusion mit Myelomzellen immortalisiert werden, um (Hybridom-)Zellen herzustellen, die in der Lage sind, permanent heterologe (humane) monoklonale Antikörper mit Spezifität für die injizierte immunogene Verbindung oder Zusammensetzung zu sezernieren.
Die 11a veranschaulicht die Konstruktion eines retroviralen Expressionsvektors für die konstitutive Expression des anti-apoptotischen Gens bcl-2 (vorbereitende Schritte). Das Entfernen von IL-7 aus kontinuierlich proliferierenden PräB-Zellkulturen in vitro führt zur Differenzierung von PräB-Zellen, gleichzeitig aber auch zur Induktion von Apoptose. Diese Apoptose kann durch konstitutive Expression eines antiapoptotischen Gens wie z. B. bcl-2 verhindert werden. Für die Schaffung eines selektierbaren retroviralen Expressionsvektors für bcl-2 wird die murine bcl-2 cDNA sequenziell mit einem offenen Leserahmen für HygromycinB in einen dualen Genexpressionsvektor pIRES kloniert. Dieser Vektor enthält eine interne ribosomale Eintrittssequenz, die von zwei multiplen Klonierungsstellen flankiert wird, in welche zwei verschiedene Gene kloniert werden können. Von einem einzigen Promotor können hierdurch in Säugerzellen zwei Gene simultan exprimiert werden. Die Strategie für die Insertion des bcl-2 ORF's und des Gens für den Selektionsmarker HygromycinB in pIRES zur Schaffung eines pBcl2-IRES-hygroB-Vektors ist angegeben.
Die 11b veranschaulicht die Konstruktion eines retroviralen Expressionsvektors für die konstitutive Expression des anti-apoptotischen Gens bcl-2 (finale Klonierungsschritte). Nach dem Zusammenbau der vom CMV-Promotor getriebenen bcl-2-IRES-HygromycinB-Kassette wird die gesamte duale Expressionskassette aus dem pBcl2-IRES-hygroB-Vektor wie angegeben als ein SalI/ClaI-Fragment in den retroviralen Transfervektor pLIB umkloniert. Hierdurch wird das rekombinante retrovirale Konstrukt pLIB-Bcl2-IRES-hygroB generiert, welches verwendet werden kann, um PräB-Zellen stabil zu transduzieren und ihnen die Fähigkeit zur simultanen Expression von bcl-2 und der Resistenz gegenüber HygromycinB zu verleihen.
Die 12a ist eine beispielhafte Darstellung der Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgH-Ketten (vorbereitender Schritt I). Die zahlreichen IgH-Promotor- und Enhancerelemente wie auch die kodierenden Regionen für die verschiedenen Domänen der variablen konstanten Region werden sequenziell in einen retroviralen Transfervektor, wie z. B. das Plasmid pLIB, kloniert. Dieses Plasmid enthält sämtliche Elemente, die für das retrovirale Packaging und die Integration des Provirus erforderlich sind, d. h. einen 5'LTR, ein Verpackungssignal, und einen 3'LTR, kloniert in ein bakterielles, mit Ampicillin selektierbares Plasmidrückgrat mit einem ColE1-Replikationsursprung (wie angegeben). Dargestellt sind die ersten Klonierungsschritte zur Insertion eines V_H-Promotors, des murinen Intron-Enhancers der schweren Kette (EμH), einschließlich flankierender Matrix-Attachment-Regionen (MAR), und des 3'α Enhancers der IgH-Kette (3'αE). Hervorgehoben sind Restriktionsenzyme, die an den Enden mittels PCR amplifizierter Fragmente eingebaut sind, sowie einzigartige kompatible Restriktionsstellen im Plasmidrückgrat, die für die zahlreichen Klonierungsschritte verwendet werden können.
Die 12b veranschaulicht die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgH-Ketten (vorbereitender Schritt II). Der IgH 3'α-Enhancer enthält vier funktionelle Regionen, die im Wege der Aktivierung des Enhancers während der terminalen Differenzierung der B-Zellen sensitiv gegenüber einem Verdau durch DNaseI werden und daher als hypersensitive Regionen HS 1, 2, 3, und 4 bezeichnet werden. Jede dieser HS-Regionen trägt zur Enhanceraktivität von 3'αE bei, wobei die Enhanceraktivität jedoch größtenteils von den HS-Regionen 1 und 2 erbracht wird. Obwohl die HS-Regionen 1 und 2 von 3'αE allein in der Lage sind, die Expression eines Reportergens auf annähernd gleichem Niveau wie die gesamte 3'αE-Region zu steuern, kann es für einige retrovirale IgH-Expressionskonstrukte wünschenswert sein, die anderen funktionellen Regionen von 3'αE einzuschließen. Aus diesem Grund ist hier die Klonierung der Regionen HS 3 und HS 4 von 3'αE dargestellt. Hervorgehoben sind Restriktionsenzyme, die an den Enden mittels PCR amplifizierter Fragmente eingebaut sind, sowie einzigartige kompatible Restriktionsstellen im Plasmidrückgrat, die für die zahlreichen Klonierungsschritte verwendet werden können.
Die 12c zeigt die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgH-Ketten (vorbereitender Schritt III). Im Anschluss an die Klonierung der IgH-Promotor- und Enhancerelemente in einen retroviralen Transfervektor müssen kodierende Regionen für IgH-Ketten eingeführt werden. Um membrangebundene als auch sezernierte Formen von Immunglobulinen exprimieren zu können, müssen in die retroviralen Expressionsvektoren Exons für die Membranüberspannenden Regionen von IgH-Ketten eingeschlossen werden. Die Membran-überspannenden Regionen unterscheiden sich signifikant zwischen verschiedenen Isotypen hinsichtlich der Länge, der primären Sequenz und der Exon/Intronstruktur. Daher müssen verschiedene Membran-überspannende Regionen für schwere Ketten von IgM, IgG, IgA und IgE kloniert werden. Als Beispiel ist die PCR-Klonierung und Insertion der vier unterschiedlichen Membran-überspannenden Regionen in das Plasmid pAB-3 dargestellt. Dieselbe Vorgehensweise der Klonierung kann mit den Vektoren pAB-4 und pAB5 durchgeführt werden, die verlängerte Versionen von IgH-3'αE enthalten. Hervorgehoben sind Restriktionsenzyme, die an den Enden mittels PCR amplifizierter Fragmente eingebaut sind, sowie kompatible Restriktionsstellen im Plasmidrückgrat, die für die zahlreichen Klonierungsschritte verwendet werden können.
Die 12d veranschaulicht die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgH-Ketten (vorbereitender Schritt IV). Humane B-Lymphozyten sind in der Lage, vier verschiedene IgG-Isotypen IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 zu bilden, die sich hinsichtlich ihrer Sequenz leicht voneinander unterscheiden und verschiedene physiologische Effektorfunktionen ausüben. Die Klonierung der Gene für die konstante Region in einen Zwischenvektor pAB-3.2, der bereits Membran-überspannende Ig-Exons enthält, ist hier dargestellt. Die endogene Exon/Intron-Organisation einschließlich der für die Gelenk(H)-Regionen kodierenden Exons für die zahlreichen IgG-Isotypen ist angegeben. Hervorgehoben sind Restriktionsenzyme, die an den Enden mittels PCR amplifizierter Fragmente eingebaut sind, sowie einzigartige kompatible Restriktionsstellen im Plasmidrückgrat, die für die zahlreichen Klonierungsschritte verwendet werden können. Im Wege der Klonierung eines VDJ-rearrangierten Exons für die variable Domäne sind diese Konstrukte in der Lage, vollständige IgG-Ketten zu exprimieren (s. 15).
Die 12e zeigt die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgH-Ketten (vorbereitender Schritt V). Die Klonierung der Gene der konstanten Region für die verbleibenden humanen Ig-Isotypen IgM, IgA1, IgA2 und IgE ist dargestellt. Ähnlich wie bei der in 12d dargestellten Vorgehensweise der Klonierung von Genen für konstante IgG-Regionen werden die genomischen Regionen dieser Isotypen als mit NotI gespaltene PCR-Fragmente in die einmaligen NotI-Restriktionsstellen stromaufwärts der jeweiligen Membranüberspannenden Exons dieser Isotypen insertiert. Die endogene Exon/Intron-Organisation einschließlich der die Gelenk(H)-Regionen für die verschiedenen Ig-Isotypen kodierenden Exons ist dargestellt. Hervorgehoben sind Restriktionsenzyme, die an den Enden mittels PCR amplifizierter Fragmente eingebaut sind, sowie einzigartige kompatible Restriktionsstellen im Plasmidrückgrat, die für die zahlreichen Klonierungsschritte verwendet werden können. Durch die Klonierung eines VDJ-rearrangierten Exons für die variable Domäne sind diese Konstrukte in der Lage, vollständige IgH-Ketten des jeweiligen Isotyps zu exprimieren (s. 15).
Die 13a zeigt die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgκL-Ketten (vorbereitender Schritt I). Ähnlich der Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für IgH-Ketten erfordern Expressionsvektoren für IgκL-Ketten die für den κL-Kettenlocus spezifischen Promotor- und Enhancerelemente zusätzlich zu den kodierenden Regionen für die κL-Kettenproteine, die sequenziell in einen retroviralen Transfervektor kloniert werden müssen. Ausgehend von dem retroviralen Basisvektor pLIB wird zunächst wie angegeben ein Vκ-Promotor in pLIB kloniert. Anschließend erfolgt die Insertion eines PCR-Produkts, dass den humanen κ-Intron-Enhancer (κiE mit seiner stromaufwärts liegenden Matrix-Attachment-Region, MAR) und das Gen für die konstante Region der humanen κL-Kette (linke Seite der Zeichnung) enthält, oder, alternativ, die Insertion eines PCR-Fusionsfragments aus dem κiE der Maus und dem Gen für die konstante Region der humanen κL-Kette (rechte Seite der Zeichnung), welches durch eine „Single Overlap Extension"(SOE)-PCR erhalten wird. In beide Konstrukte wird ein den murinen κ3'-Enhancer(κ3'E) enthaltendes PCR-Produkt insertiert. Hervorgehoben sind Restriktionsenzyme, die an den Enden mittels PCR amplifizierter Fragmente eingebaut sind, sowie einmalige kompatible Restriktionsstellen im Plasmidrückgrat, die für die zahlreichen Klonierungsschritte verwendet werden können.
Die 13b veranschaulicht die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgκL-Ketten (vorbereitender Schritt II). Retrovirale Expressionskonstrukte für humane IgH- und IgκL-Ketten werden sequenziell in PräB-Zellen transduziert, weshalb es wünschenswert ist, nach der ersten Runde der Transduktion mit IgκL-Ketten exprimierenden Vektoren auf stabil transduzierte Zellen selektieren zu können. Aus diesem Grund wird eine von dem Promotor SV40 gesteuerte Puromycin-Expressionskassette in die beiden möglichen retroviralen Transfervektorintermediate für die IgκL-Kette pAB-7.1 und pAB-8.1 wie angegeben eingeführt. Durch Klonierung eines VκJκ-rearrangierten Exons für die variable Domäne in diese Vektoren sind diese retroviralen Konstrukte in der Lage, humane IgκL-Ketten zu exprimieren (s. 15).
Die 14a zeigt die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgλL-Ketten (vorbereitender Schritt I). Retrovirale Expressionskonstrukte für humane IgλL-Ketten werden kloniert, indem zunächst ein PCR-Fusionsprodukt aus einer Puromycin-Kassette und einem Vλ-Promotor in pLIB eingeführt wird (die PCR-Fusion wird mittels der in den Beispielen beschriebenen „Single Overlap Extension"(SOE)-PCR durchgeführt). Im nächsten Schritt wird in das Konstrukt wie angegeben ein SOE-PCR Fusionskonstrukt mit den zwei murinen Enhancerelementen der λL-Kette λ2-4 und λ3-1 eingeführt. Schließlich wird die kodierende Region der humanen Region Cλ1 mittels PCR-Klonierung unter Verwendung der angegebenen Restriktionsenzyme in diesen retroviralen Klonierungsvektor insertiert. Durch Klonierung eines VλJλ-rearrangierten Exons für die variable Domäne in diese Vektoren sind diese retroviralen Konstrukte in der Lage, humane IgλL-Ketten zu exprimieren (s. 15).
Die 14b veranschaulicht die Konstruktion retroviraler Expressionsvektoren für die Expression humaner IgλL-Ketten (vorbereitender Schritt II). Andere Gene für die konstante Region der humanen IgλL-Kette können verwendet werden, um die für Cλ1 kodierende Region wie angegeben durch einfache Klonierung unter Verwendung der MluI-NotI Restriktionsenzyme auszutauschen. Durch Klonierung der VλJλ-rearrangierten Exons für die variable Domäne in diese Vektoren sind diese retroviralen Konstrukte in der Lage, die verschiedenen humanen Isotypen der IgλL-Kette wie angegeben zu exprimieren (s. 15).
Die 15a zeigt die Insertion von Genen der V-Region in retrovirale Expressionsvektoren für die humane IgH-, IgκL- und IgλL-Kette. Sämtliche bisher beschriebenen retroviralen Expressionskonstrukte für humane IgH- und L-Ketten enthielten keine kodierenden Regionen für die variablen Domänen. Diese können mittels PCR-Klonierung aus verschiedenen Quellen isoliert (s. z. B. 9) und in retroviralen Vektoren als eine einzige Spezifität kodierende Exons der V-Region, oder als verschiedene Spezifitäten kodierende Bibliotheken (welche mittels PCR mit degenerierten Primerpaaren amplifiziert werden müssen) insertiert werden. Die V-Regionen werden zusammen mit ihren charakteristischen Leader (L)-Sequenzen wie angegeben mittels PCR amplifiziert. Die für die Klonierung von Exons für die variable Region verwendbaren Restriktionsenzyme sind angegeben. In dieser Zeichnung sind einige ausgewählte endgültige retrovirale Expressionsvektoren für die IgH- und IgL-Kette dargestellt. Aufgrund des modularen Designs dieser Vektoren können unterschiedliche Kodierungsregionen und Promotor- und Enhancerelemente verwendet werden.
Definition der in der Beschreibung verwendeten Begriffe
Affinität: Die Stärke der Bindung eines Antigen-Rezeptors (oder irgendeines Rezeptors) an dessen spezifisches Antigen (oder dessen Liganden oder Bindungspartner), nachgewiesen durch das Verhältnis zwischen der Assoziations- und Dissoziationsrate der Rezeptor/Ligand-Interaktion.
Affinitätsreifung: Ein in hohem Maße regulierter immunologischer Prozess einer Antigen-getriebenen Verbesserung der Bindungsspezifitäten von Antikörpern, die von Antigen-stimulierten B-Lymphozyten in Keimzentren produziert werden. Der Prozess wird verursacht durch somatische Hypermutation innerhalb der kodierenden Regionen für die variablen Domänen von Antikörpern, gekoppelt mit der selektiven Expansion und dem Überleben von B-Lymphozyten, die Antikörper mit höherer Affinität generieren.
Antikörper: Ein von B-Lymphozyten und Plasmazellen produziertes glykosyliertes Polypeptid, welches in seiner monomeren Form zwei identische schwere (H) Ketten und zwei identische leichte Ketten umfasst, wobei jede aus einer variablen Domäne und einer (L-Ketten) oder mehreren (H-Ketten) Domänen der konstanten Region zusammengesetzt sind. Die zwei H- und zwei L-Ketten lagern sich zu einem symmetrischen, Y-förmigen und über Disulphide verknüpften Antikörpermolekül zusammen, welches zwei Bindungsdomänen aufweist, die durch die Kombination der variablen Regionen der H- und L-Ketten gebildet werden.
Antigen: Jedwedes Biomolekül oder jedwede chemische Einheit, das bzw. die von den variablen Domänen von Immunglobulinen (oder Antikörpern) gebunden werden kann.
Antigen-Rezeptor: Antigen-Rezeptoren sind aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzt, wobei erstere die Fähigkeit zum Binden an Antigene aufweisen, und letztere Effektorfunktionen vermitteln oder Signale in Zellen transduzieren. Antigen-Rezeptoren umfassen T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline.
Artifizielles Bindeprotein: Ein Bindeprotein, dass Polypeptidsequenzen (z. B. synthetische Spacer-Sequenzen) enthält, die nicht von natürlichen Genen oder Fragmenten derselben hergeleitet werden können.
Bindeprotein: Der allgemeinste Begriff für jedweden Typ von Polypeptid mit der Fähigkeit, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, mit oder ohne zusätzliche Effektorfunktionen. Bindeproteine schließen artifizielle Bindeproteine, Fragmente von Antikörpern, wie z. B. ein 'single chain variable fragment'(scFv), und auch variable Domänen und konstante Regionen von Immunglobulinen und T-Zell-Rezeptoren, oder umgekehrt, kombinierende Fusionsprodukte ein. Ferner kann ein Bindeprotein das Fusionsprodukt variabler Domänen und funktioneller Teile anderer Rezeptormoleküle sein. Demgegenüber kann ein Bindeprotein die Fusion eines Bindungsrestes eines nicht-Ig- oder TCR-verwandten Rezeptors mit Domänen der konstanten Region von Antigenrezeptoren sein.
Cis-agierend: Lediglich einen Einfluss auf solche genetischen Elemente und Genloci ausübend, die sich in direkter Nachbarschaft oder auf demselben Allel befinden.
Kodierende Region: Ein genetisches Element mit einem offenen Leserahmen, der in Form eines Polypeptids exprimiert werden kann.
Komplementarität-bestimmende Regionen (CDRs): Die Regionen in der dreidimensionalen Struktur einer variablen Antigen-Rezeptordomäne, die den direkten Kontakt mit Antigenen herstellen. Die CDRs sind gewöhnlich die am meisten diversifizierten Teile von Antigen-Rezeptoren.
Domäne: Eine strukturelle Einheit eines Biomoleküls, die gekennzeichnet ist durch eine besondere dreidimensionale Struktur (z. B. Domänen der variablen oder konstanten Region von Immunglobulinen, die strukturelle Beziehungen zueinander aufweisen, wie Ig-ähnliche Domänen, die in vielen Molekülen des Immunsystems gefunden werden können, die zur sogenannten Ig-Superfamilie gehören).
Effektorfunktionen: Funktionen konstanter Regionen von Immunglobulinen im Kontext des Immunsystems, z. B. die Fähigkeit zur Aktivierung eines Komplements oder zur Aktivierung bestimmter Immunzellen durch Binden an spezifisch Rezeptoren für die konstante Region (F_C-Rezeptoren).
Endogen: Eigenschaft einer bestimmten Zelle oder eines Organismus.
Enhancer: Ein genetisches Element, dass die Aktivität von Promotorelementen über große Entfernungen unabhängig von der Orientierung oder Position stimulieren kann.
Epitop: Eine dreidimensionale Struktureinheit eines Antigens, die von einer variablen Binderegion eines Antikörpers erkannt wird.
Funktionelles Fragment (eines Antikörpers, Antigen-Rezeptors oder Bindeproteins). Ein von einem gegebenen, aus der Gruppe bestehend aus Antikörpern, Antigen-Rezeptoren und Bindeproteinen, ausgewählten Polypeptid herleitbares funktionelles Fragment, dass mindestens eine der von dem Polypeptid entsprechend des spezifischen Anwendungsgebietes gewünschten inhärenten Eigenschaften teilt. Beispielsweise kann ein funktionelles Fragment ein Polypeptid oder Oligopeptid sein, dass die Fähigkeit des Polypeptids zum Binden an bestimmte Antigene und/oder Liganden beibehält. Dasselbe trifft auf Fragmente zu, die für das Polypeptid charakteristische spezifische Effektorfunktionen vermitteln. Ein weiteres Beispiel betrifft Fragmente, die in der Lage sind, spezifische immunogene und/oder physiologische Effektorfunktionen von Antikörpern, Antigen-Rezeptoren und gewöhnlichen Rezeptor/Liganden-Systemen zu aktivieren oder zu inhibieren.
Genetische Elemente: Gene, Genloci, oder Fragmente derselben, wie Promotoren, Enhancer, und kodierende Regionen, allein oder in jeglicher funktioneller oder nicht-funktioneller Kombination.
Keimzentrum: Eine histologisch distinkte Struktur in peripheren lymphoiden Organen (z. B. Lymphknoten oder Milz), in der es zu spezifischen Interaktionen zwischen Antigen-präsentierenden Zellen und verschiedenen Lymphozyten-Populationen kommt, was zu einer proliferativen Expansion von Antigen-reaktiven Lymphozyten wie auch zur Affinitätsreifung und zur 'Class-Switch'-Rekombination von Antikörpern führt, die von Antigen-reaktiven B-Lymphozyten produziert werden.
Keimbahn-Konfiguration: Die native Konfiguration von Genen und Genloci, wie sie von den Eltern geerbt werden, und wie sie auf weitere Generationen über die Keimbahn weitergegeben werden. In somatischen Zellen auftretende Ereignisse der DNA-Rekombination, wie z. B. V(D)J-Rekombination in Lymphozyten, führen zur Durchmischung oder zum Verlust genetischer Information auf bestimmten Genloci, und daher zu einer Veränderung der Keimbahn-Konfiguration der Gene.
Heterolog: Gegenteil von endogen.
Humanisierter Antikörper: Ein durch Fusion der variablen Domänen nicht-humaner Antiköper mit humanen Domänen der konstanten Region erzeugter künstlicher Antikörper.
Hybridom: Eine unsterbliche Zelllinie, die durch Fusion einer unsterblichen Myelom-Zelllinie (unfähig zur Antikörper-Sekretion) mit einer sterblichen Plasmazelle (die große Mengen an Antikörpern sektretieren kann) erzeugt worden ist.
Idiotyp: Die Bindeeigenschaften (Spezifität) eines Antigen-Rezeptors.
Isotyp: Die strukturelle Eigenschaft, die durch die konstante Region eines Antigen-Rezeptors verliehen wird und ihre (Effektor-) Funktionen bestimmt.
Immunglobulin (Ig): Synonym für Antikörper.
Immunglobulin-Minilocus: Ein artifizielles genetisches Konstrukt, dass wenige (d. h. einstellige) V-, D- und/oder J-Gensegmente umfasst und eine V(D)J-Rekombination durchlaufen kann, wodurch ein begrenztes, oligoklonales Repertoire an variablen Kodierungsregionen generiert wird.
Bibliothek: Eine Sammlung verschiedener genetischer Elemente.
Monoklonale Antikörper: Antikörper mit einer definierten Spezifität, die durch die einzigartige Struktur der variablen Antigen-bindenden Region eines Antikörpers bestimmt wird.
Myelomzelle: Eine unsterbliche Zelle, die von einer Zelle im Zustand der Plasmazelldifferenzierung stammt ohne die Fähigkeit zur Expression endogener Immunglobulinproteine.
Polyklonale Antikörper: Eine Mischung von Antikörpern mit verschiedenen Strukturen der variablen Antigen-bindenden Regionen, und daher, sehr wahrscheinlich, unterschiedlichen Bindespezifitäten.
PräB-Lymphozyt: Ein Vorläufer-B-Lymphozyt ist gekennzeichnet durch die Expression lymphoidspezifischer Faktoren, die an der V(D)J-Rekombination beteiligt sind (z. B. RAG-1, RAG-2), hat gewöhnlich die V(D)J-Rekombination mindestens eines Allels der IgH-Kette injiziert, weist aber die Genloci der leichte Kette immer noch in Keimbahn-Konfiguration auf und exprimiert daher keine vollständigen Antikörper.
Primäre Lymphoidorgane: Organe, in denen sich Lymphozyten aus hämatopoetischen Stammzellen entwickeln; in Mäusen und Menschen z. B. das Knochenmark, der Thymus, und während des fötalen Lebens die Leber.
Repertoire: Eine Sammlung von verschiedenen (Binde-) Spezifitäten.
Somatische Hypermutation: Ein Vorgang in somatischen Zellen, der zur Einführung von Punktmutationen in spezifische Regionen des Genoms mit einer hohen Frequenz (> 10^–4 Mutationen pro Basenpaar pro Zellteilung) führt.
Stromazellen: Proliferierende, aus dem Knochenmark stammende adhärierende Zellen mit der Fähigkeit, die Proliferation von PräB-Zellen in Gegenwart eines oder mehrer zusätzlicher PräB-Zell-Wachstumsfaktoren zu unterstützen.
Trans-agierend: Einen Einfluss auf genetische Elemente und Genloci ausübend, die auf unterschiedlichen Chromosomen lokalisiert sind.
Transfektion: Der Vorgang der Einführung von Nukleinsäuresequenzen in eukaryotische Zellen, gewöhnlich im Zusammenhang mit der Anwendung chemischer und physikalischer Verfahren.
Transformation: Der Vorgang der Immortalisierung einer Zelle zur Etablierung einer kontinuierlich proliferierenden Zelllinie.
Transgen: Ein artifizielles genetisches Element, dass in die Keimbahn von Tieren eingeführt ist. Das Transgen wird daher von einer Generation auf die andere vererbt.
Transduktion: Der Vorgang des Einbringens von DNA in Säugerzellen über die Produktion rekombinanter Viren. Hierfür wird eine Packaging-Zelllinie, die strukturelle Proteine für virale Partikel exprimiert, mit einem rekombinanten viralen DNA-Konstrukt transfiziert, welches die regulatorischen Elemente zum Verpacken des viralen DNA-Konstrukts in die viralen Strukturproteine umfasst. Hierdurch werden rekombinante Viren hergestellt, die zur Infektion von Säuger-Zielzellen verwendet werden können, was zur Einführung von genetischer Information führt, die in das rekombinante virale Genom kloniert ist.
V(D)J-Rekombination: Ein DNA-Rekombinationsvorgang, bei dem eins von vielen V(variabel)-, manchmal D(Diversität)- und J(verknüpfend)-Gensegmenten zu einer kodierenden Region für die variablen Domänen von Antigen-Rezeptoren zusammengesetzt werden.
Vektor: Ein künstlich hergestelltes Nukleinsäurekonstrukt, das als Shuttle für Nukleinsäureelemente zwischen verschiedenen Organismen und Spezies verwendet werden kann, und das ferner zur Vermehrung, Amplifizierung und Aufrechterhaltung genomischer Information eingesetzt werden kann.
Xenogen: von einer unterschiedlichen Spezies stammend (häufig als Synonym für heterolog verwendet).
Sämtliche in der vorliegenden Beschreibung genannten Referenzen sind hiermit eingeschlossen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Nach einem ersten Aspekt wird erfindungsgemäß ein Verfahren zur Herstellung von Vertebraten-Lymphozyten bereitgestellt, die verwendet werden können zur Produktion irgendeines Bindeproteins oder eines oder mehrerer funktioneller Fragmente davon mit der Fähigkeit, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigenrezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines funktionellen Fragments davon, umfassend die folgenden Schritte:

(a) genetische Modifizierung von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die
(i) aus primären lymphoiden Organen stammen und
(ii) das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, durch Einbringen mindestens eines exogenen genetischen Elementes, welches mindestens ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert; und
(b) Herbeiführung der Differenzierung der genetisch modifizierten Vorläufer-Lymphozyten in reife Zellen der lymphoiden Linie entweder in vitro oder in vivo, wodurch Lymphozyten generiert werden, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment(e) davon zu produzieren, unter der Maßgabe, dass die in vivo Produktion in Menschen ausgeschlossen ist.

Um die Produktion der obigen Bindeproteine oder funktionellen Fragmente derselben im Großmaßstab zu erreichen, ist es bevorzugt, dass die terminalen, die gewünschten Polypeptide produzierenden differenzierten Lymphozyten immortalisiert werden, oder, alternativ, dass die genetische Information zum Kodieren der heterologen Antikörper oder Bindeproteine isoliert und von diesen Zellen in unterschiedliche Expressionssysteme transferiert wird, wo die genetische Information aufrechterhalten, amplifiziert und/oder zur Herstellung der entsprechenden Immunglobuline oder Immunglobulin-ähnlichen Proteine oder funktionellen Fragmente derselben verwendet werden kann.
Die Immortalisierung der Lymphozyten kann vorzugsweise erreicht werden durch:

(a) Fusion derselben mit unsterblichen Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomzellen;
(b) Infektion derselben mit transformierenden Viren, wie z. B. dem Abelson murine leukemia virus (A-MuLV); oder
(c) Transfektion derselben mit einem geeigneten Vektorkonstrukt, welches die Expression sicherstellt von mindestens einem transformierenden Onkogen, wie z. B. v-abl, oder dem großen SV40 T-Antigen, welches im Wege der Überexpression zur Immortalisierung stabil transfizierter Zellen führt;

In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten in der Lage, mindestens eine Komponente der lymphoiden V(D)J-Rekombinationsmaschinerie zu exprimieren, und stammen ab von kiefertragenden Vertebraten umfassend Knorpelfische, Knochenfische, Amphibien, Reptilien, Vögel, Säugetiere einschließlich Schweine, Schafe, Rinder, Pferde und Nagetiere einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen, wobei murine Vorläufer(prä)-B-Lymphozyten von Mäusen bevorzugt sind.
Primäre Vorläufer-B-Lymphozyten in sämtlichen kiefertragenden Vertebraten-Spezies vom Menschen bis hinunter zum evolutionär primitivsten Knorpelfisch sind nicht nur gekennzeichnet durch die Expression eines spezifischen Satzes an Zelloberflächenmarkern (wie die Kombination von B220 und c-kit in Mäusen), sondern auch durch ihr Potenzial zur Zusammenlagerung der Gensegmente, die variable Domänen von Antikörpern kodieren, für die sie die lymphoidspezifischen Komponenten der V(D)J-Rekombinationsmaschinerie exprimieren, wie RAG-1, RAG-2, und TdT (terminale Desoxynukleotidyltransferase). Obgleich einige Spezies, wie Vögel, unterschiedliche primäre Lymphoidorgane (z. B. die Bursa von Fabricius) aufweisen, in denen diese Vorläufer-B-Lymphozyten gebildet werden, und ungeachtet der Tatsache, dass andere Spezies zusätzlich zur V(D)J-Rekombination auch unterschiedliche Mechanismen zur Antikörper-Diversifikation nutzen, wie somatische Hypermutation (z. B. Schafe), oder Genkonversion (z. B. Kaninchen), können Vorläufer-B-Lymphozyten von sämtlichen Vertebraten-Spezies eine V(D)J-Rekombination durchlaufen und haben das Potenzial zur Differenzierung in reifere Zellen der B-Zelllinie, sodass von VDJ-rearrangierten Immunglobulin-Genloci gebildete Antikörper exprimiert werden können. Wenn derartige Vertebraten-Vorläufer-B-Lymphozyten isoliert oder generiert werden, die nicht in der Lage sind, endogene Antikörper zu exprimieren, und wenn in diese Lymphozyten genetische Elemente stabil eingeführt werden, die sämtliche oder Teile von heterologen Immunglobulin-Genloci kodieren, werden sie daher das Potenzial zur Produktion heterologer Antikörper erlangen und sind demgemäß von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Das erfindungsgemäße Verfahren nutzt die in primären lymphoiden Organen vorhandenen Vertebraten-Vorläufer-B(präB)-Lymphozyten. Im Falle von Mäusen können diese Zellen aus der fötalen Leber oder dem Knochenmark eines erwachsenen Tieres isoliert werden, z. B. durch präparative Zellsortierung unter Verwendung herkömmlich markierter Antikörper, die beispielsweise an die Zelloberflächenmarker B220 und c-kit auf Maus-PräB-Zellen binden. Alternativ können sie aufgrund ihres starken proliferativen Ansprechens sowohl auf vom Knochenmark abgeleitete Nähr(Stroma-)-Zellen als auch auf Wachstumsfaktoren wie Interleukin-7 und Interleukin-3 selektiv in murinen Zellsuspensionen der fötalen Leber oder des Knochenmarks gezogen werden.
Hinsichtlich der Expression lymphoidaler Komponenten der V(D)J-Rekombinationsmaschinerie sind das Potenzial zur Differenzierung in reife Zellen der lymphoiden Linie und der genetische Mechanismus zur Diversifikation von Antigen-Rezeptorproteinen bei Lymphozyten der T-Zelllinie und bei Lymphozyten der B-Zelllinie sehr ähnlich. Es wird deshalb darauf hingewiesen, dass die vorliegend beschriebenen Verfahren zur genetischen Modifikation von Vorläufer-B-Lymphozyten zum Zwecke der Herstellung heterologer Antikörper oder Bindeproteine gleichermaßen auf Vorläufer-T-Lymphozyten angewendet werden können. Daher können die vorliegenden Verfahren, welche primär im Hinblick auf das System muriner PräB-Lymphozyten beschrieben werden, auch auf sämtliche Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten von all den zuvor genannten kiefertragenden Vertebraten angewendet werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Verwendung irgendwelcher anderer Vorläufer-Lymphozytensysteme zur Durchführung der Prinzipien der vorliegenden Erfindung lediglich davon abhängt, ob sowohl die Expression endogener Antikörper verhindert als auch heterologe Antikörper oder Bindeproteine kodierende heterologe genetische Elemente in diese Zellen eingeführt werden können. Da die breite Anwendbarkeit dieser Prinzipien vom Fachmann anerkannt werden wird, wird das der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende allgemeine Konzept in erster Linie im Hinblick auf die Verwendung muriner Vorläufer-B(präB)-Lymphozyten beschrieben.
Bei der Maus ist die Entwicklung von hämatopoetischen Stammzellen zu Antikörper-sezernierenden Plasmazellen ein in hohem Maße regulierter Vorgang und hängt in vivo ab von dem geordneten Rearrangement von Gensegmenten im Immunglobulin-Rezeptor-Genloci sowie von der regulierten Expression von Immunglobulinproteinen von produktiv rearrangierten Ig-Genloci (2). Gewöhnlich treten Umlagerungen zuerst auf beiden Allelen der Genloci für die IgH-Kette auf, wobei die D- bis J_H-Gensegmente zuerst rearrangiert werden, gefolgt von V_H bis DJ_H-Gen-Rearrangements (2). Wenn es auf einem Allel zu einem produktiven V_HDJ_H-Rearrangement gekommen ist, kann die μH-Kette auf der Zelloberfläche als ein PräB-Zellrezeptor exprimiert werden, der mit einer Surrogat-L-Kette (kodiert durch die für PräB-Zellen spezifischen Gene λ₅ und V_preB) ein Paar bildet (Karasuyama et al., Adv. Immunol., 63, 1–41, 1996). Die Expression eines PräB-Zellrezeptors ermöglicht die Differenzierung von PräB-Zellen bis zu einer Stufe, bei der V_L- bis J_L-Rearrangements initiiert werden, was gewöhnlich zunächst in den Allelen der κL-Kette und später in den Allelen der λL-Kette passiert (Melchers et al., Ann. Rev. Immunol., 12, S. 209–225, 1994). Sofern es zu einem produktiven IgL-Ketten-Rearrangement gekommen ist, können membrangebundene IgM- und/oder IgD-Antikörper durch sogenannte unreife B-Zellen exprimiert werden. Die Stimulierung peripherer, IgM/IgD-positiver, reifer B-Zellen mit geeigneten Signalen kann in den Allelen der IgH-Kette zu „Class-Switch"-Rekombinationen führen, wodurch der Isotyp der exprimierten Antikörper zu jedwedem der IgG-, IgA- und IgE-Subtypen verändert wird (in Mäusen: IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgA, IgE; bei Menschen: IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgE) (1).
Wie bereits zuvor erwähnt, sind die zur Ausführung der Erfindung geeigneten murinen PräB-Zellen gekennzeichnet durch die Expression der Oberflächenmarker B220 und c-kit, die Expression von mindestens einem der lymphoiden V(D)J-Rekombinationsgene RAG-1 und RAG-2, und die Fähigkeit zur Proliferation über längere Zeiträume infolge des Ansprechens auf Stromazellen und/oder IL7 oder IL3 (Rolink et al., EMBO J., 10, S. 327–336, 1991; Winkler et al., Blood, 85, S. 2045–2051, 1995). Sofern PräB-Zelllinien und Klone von Wildtyp-Mäusen etabliert werden, tragen sie gewöhnlich DJ_H-Rearrangements auf beiden Allelen der IgH-Kette (Alt et al., EMBO J., 3, S. 1209–1219, 1984), oder in einigen Fällen nicht-produktive V_HDJ_H-Rearrangements (2). Zur Etablierung von Mäusezellen mit dem Phänotyp einer PräB-Zelle, die auf Stromazellen, IL7 oder IL3 ansprechen, sind Rearrangements ihrer Allele für die IgH-Kette jedoch nicht erforderlich, da diese Zellen auch von mutierten Mausstämmen etabliert werden können, die bezüglich der V(D)J-Rekombination defizient sind (Grawunder et al., International Immunology, 7, S. 1915–25, 1995). In jedem Fall und unabhängig von der Fähigkeit zu Ig-Gen-Rearrangements behalten PräB-Zellen ihr Potenzial zur Differenzierung in reifere Zellen der B-Zelllinie in vitro, und schließlich in Plasmazellen mit einem 'switched'-Isotyp (Rolink et al., Immunity, 5, S. 319–330, 1996).
Langfristig proliferierende murine PräB-Zelllinien und -klone können von zahlreichen lymphoiden Organen der Maus, einschließlich fötale Leber, fötales Blut, fötale Milz, und Knochenmark erwachsener Tiere, aber auch aus anderen Organen des fötalen oder erwachsenen Tieres etabliert werden, die auf Stromazellen, IL7 oder IL3 ansprechende PräB-Zellen aufweisen, insbesondere in der frühen Lebensphase (Alter < 4 Wochen) (Rolink et al., Blood, 81, S. 2290–2300, 1993).
Die zur Gewinnung der oben genannten PräB-Zellen zu verwendenden Mäuse können Wildtyp-Mäuse, chimäre Mäuse, transplantierte Mäuse oder Mausstämme sein, die Mutationen aufweisen, welche eine V(D)J-Rekombination im endogenen murinen Ig-Genloci verhindern. Die oben genannten Mutationen können als cis-Mutationen vorliegen, einschließlich Deletionen von, oder innerhalb der IgH-Diversität (D)-Gensegmente, der IgH-J-Gensegmente (Chen et al., Int. Immunol., 5, S. 647–656, 1993), der konstanten Region der μH-Kette einschließlich der beiden Exons für den μH-Transmembrananker (Kitamura und Rajewsky, Nature, 356, S. 154–156, 1992), der Igκ- and Igλ-J-Gensegmente, der konstanten Region der κL-Kette (C_κ) (Chen et al., EMBO J., 12, S. 821–830, 1993), der konstanten Regionen der λL-Kette (C_λ 1–4) und der verschiedenen Enhancer der IgH- und L-Kette, einschließlich des Intron-Enhancers der schweren Kette (EμH), des κ-Intron-Enhancers (κiE), des 3'κ-Enhancers (3'κE), und der beiden λ-Enhancer (Eλ2-4 und Eλ3-1).
Erfindungsgemäß können PräB-Zellen, die irgendeine der oben genannten cis-agierenden Mutationen aufweisen, für die Einführung exogener genetischer Elemente verwendet werden, die einen Teil oder sämtliche der heterologen, insbesondere humanen Immunglobulin-Genloci in nicht-rearrangierter, d. h. Keimbahn-Konfiguration umfassen. Derartige genetisch modifizierte PräB-Zellen können für die de novo Produktion von Antikörperspezifitäten verwendet werden, da die neuen Spezifitäten lediglich im Wege der V(D)J-Rekombination im Bereich der heterologen genetischen Immunglobulin-Genloci generiert werden.
Alternativ können geeignete PräB-Zellen auch von Mäusen generiert werden, die aufgrund trans-agierender Mutationen, wie z. B. in den die lymphoidspezifische Rekombination aktivierenden Genen RAG-1 und RAG-2 (Mombaerts et al., Cell, 68, S. 869–877, 1992; Shinkai et al., Cell, 68, S. 855–867, 1992), oder in den ubiquitär exprimierten DNA-Reparaturfaktoren Ku70, Ku86, XRCC4, DNA-Ligase IV, Artemis oder der katalytischen Untereinheit der DNA-abhängigen Proteinkinase (DNA-PKcs), die an der nicht-homologen DNA-Endverknüpfung beteiligt sind und auch für eine V(D)J-Rekombination erforderlich sind, nicht in der Lage sind, ein Rearrangement der endogenen Immunglobulin-Genloci ablaufen zu lassen. Für die Herstellung heterologer Antikörper und Bindeproteine in PräB-Zellen mit derartigen trans-agierenden Mutationen sollten Expressionskonstrukte verwendet werden, bei denen DNA-Rearrangements von V-, (D)- und J-Gensegmenten nicht erforderlich sind (siehe unten).
Im Falle cis-agierender Mutationen in der Maus sollten diese vorzugsweise zumindest eine homozygote Mutation in den Immunglobulin-Genloci für die schwere und die κL-Kette einschließen. Im Falle trans-agierender Mutationen reicht eine der oben genannten homozygoten Mutationen in einer gegebenen PräB-Zelllinie aus, um die Expression endogener Immunglobuline auszuschließen, was eine fundamentale Anforderung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist.
Vorläufer-B-Lymphozyten mit cis- oder trans-agierenden genetischen Modifikationen, die mit der Expression endogener Immunglobuline interferieren, können aus Mäusen isoliert werden, die entweder natürliche (z. B. scid-Mäuse) oder artifiziell herbeigeführte Mutationen aufweisen. Alternativ können PräB-Lymphozyten von Wildtyp-Mäusen einem Screening für solche Mutationen im Bereich ihrer Immunglobulin-Allele zugeführt werden, durch die die Expression endogener Antikörper ausgeschlossen wird, z. B. terminale 'out-of-frame' DJ_H-Rearrangements in beiden Allelen der schweren Kette. Mutationen, durch die die Expression endogener muriner Antikörper verhindert wird, können in hämatopoetische Stammzellen oder in frühe Vorläuferzellen eingeführt werden, von denen geeignete langfristig proliferierende PräB-Zellen entweder durch Differenzierung in vitro oder in vivo generiert werden können.
Alternativ können die zuvor beschriebenen genetischen Effekte auch direkt in mindestens ein Allel der für eine genetische Modifikation vorgesehenen Vorläufer-Lymphozyten eingeführt werden. Die Inaktivierung eines Allels kann zur Ausführung der vorliegenden Erfindung ausreichen, da mutierte Klone isoliert werden können, welche bereits bestimmte Mutationen auf dem anderen Allel (heterozygote Mutationen) aufweisen, so dass in den erfindungsgemäß zu verwendenden Vorläufer-Lymphozytenzellen ein homozygot mutierter Genlocus etabliert wird.
Obgleich darauf hingewiesen wird, dass die Erfindung mit Wildtyp-Vorläufer-Lymphozyten realisiert werden kann, ist es bei dem erfindungsgemäßen Verfahren bevorzugt, dass die Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten ihr Potential zur Expression endogener Antikörper und/oder Antigen-Rezeptoren oder funktioneller Fragmente davon verloren haben, was erreicht wird durch Isolation/Selektion von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten die hinsichtlich der Expression endogener Immunglobuline oder funktioneller Fragmente davon defizient sind, und/oder durch Einbringen in die Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten von mindestens einem Vektorkonstrukt zur funktionellen Inaktivierung von mindestens einem Allel mindestens eines genetischen Elementes, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:

(a) den kodierenden Regionen des Immunglobulin-Genlocus für die schwere Kette, einschließlich sämtlicher oder Teilen der V-, D- und J-Gensegmente, und irgendeiner der kodierenden Regionen für die Exons der konstanten Regionen für die schweren Ketten μ, δ, γ, ε, und α, mit oder ohne ihrer Membran-überspannenden Exons;
(b) den kodierenden Regionen der Immunglobulin-Genloci für die leichte Kette κ und/oder λ, einschließlich jedweder kodierender Regionen der V- und J-Gensegmente, als auch jedweder Exons für die konstanten Regionen;
(c) den kodierenden Regionen der T-Zell-Rezeptor-Genloci α, β, γ, and δ, einschließlich sämtlicher oder Teilen der V-, D- und J-Gensegmente, und irgendeiner der kodierenden Regionen für die Exons α, β, γ, und δ der konstanten Regionen;
(d) den cis-agierenden Enhancer-Elementen des Immunglobulin-Genlocus für die schwere Kette, einschließlich des Intron-Enhancers und des 3'α Enhancers der schweren Kette;
(e) den cis-agierenden Enhancer-Elementen des Immunglobulin-Genlocus für die leichte Kette, einschließlich des κ-Intron-Enhancers (κiE), des 3'κ Enhancers und des λ2-4 und λ3-1 Enhancers;
(f) den cis-agierenden Enhancer-Elementen der T-Zell-Rezeptor Genloci, einschließlich der TCR-Enhancer α, β, γ, und δ;
(g) den trans-agierenden, die Rekombination aktivierenden Genen RAG-1 und RAG-2, einschließlich ihrer Promotor- und Enhancer-Elemente als auch ihrer kodierenden Regionen; und
(h) den trans-agierenden, für die V(D)J-Rekombination essentiellen DNA-Reparaturgenen, einschließlich Ku70, Ku86, der katalytischen Untereinheit der DNA-abhängigen Protein-Kinase (DNA-PKcs), DNA-Ligase IV, XRCC4 und Artemis, einschließlich ihrer Promotor- und Enhancer-Elemente als auch der kodierenden Regionen dieser Gene.

Vorzugsweise schließen die obigen Vektorkonstrukte Gene-Targeting-Vektoren ein, welche DNA-Regionen mit Sequenzhomologie zu dem mindestens einen genetischen Element umfassen und vorzugsweise einen positiven Selektionsmarker flankieren, der die Selektion positiver Transfektanten ermöglicht. Beispielsweise enthalten geeignete Targeting-Vektoren zwei Regionen hoher Sequenzhomologie (> 99%), oder Sequenzidentität mit dem zum Ziel erklärten Genlocus, vorzugsweise einen positiven Selektionsmarker (wie einen Antibiotika-Resistenzmarker) flankierend, so dass ein doppeltes Crossing over-Ereignis in jeder der Regionen mit Sequenzhomologie zur zielgerichteten Integration des positiven Selektionsmarkers und damit zur zielgerichteten Disruption eines endogenen Gens führt (4a–c). Innerhalb dieser Targeting-Vektoren eingesetzte positive Selektionsmarker können Expressionskassetten einschließen, durch die Resistenz gegenüber Antibiotika wie Puromycin, HygromycinB, Neomycin (G418), Histidinol, Mycophenolsäure, Zeocin und dergleichen verliehen wird.
Vorzugsweise umfassen derartige Gene-Targeting-Vektoren zusätzlich ein Paar von DNA-Erkennungssequenzen für ortspezifische DNA-Rekombinationsenzyme, die den positiven Selektionsmarker flankieren, wodurch die Deletion des positiven Selektionsmarkers bei Transfektion und transienter Expression von Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eines der spezifischen Rekombinase-Enzyme kodieren, ermöglicht wird. Beispielsweise kann der positive Selektionsmarker von loxP- oder FLP-Sequenzen flankiert sein, die von der cre-Rekombinase bzw. von FLP-Rekombinaseenzymen erkannt werden (Kühn und Schwenk, Curr. Opin. Immunol., 9, S. 183–188, 1997), wodurch das ortspezifische Entfernen der Selektionsmarker-Expressionskassette aus dem Genom der Gen-targetierten PräB-Zellen durch transiente Transfektion von cre- oder flp-Rekombinase-Expressionsvektoren ermöglicht wird (6a, b). Diese Vorgehensweise erlaubt die wiederholte Verwendung von Targeting-Vektoren unter Verwendung desselben positiven Selektionsmarkers.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfassen derartige Gene-Targeting-Plasmidvektoren zusätzlich einen negativen Selektionsmarker, welcher die Selektion gegen Transfektanten ermöglicht, in denen diese Gene-Targeting-Vektoren zufällig durch nicht-homologe Rekombination in das Genom integriert sind. Beispielsweise können geeignete negative Selektionsmarker zur Selektion gegen zufällige Integration von Targeting-Konstrukten Expressionskassetten einschließen für das Thymidinkinase-Gen des Herpes simplex-Virus (HSV-TK), für das Diphtherie-Toxingen (DT) (McCarrick et al., Transgenic Res., 2, S. 183–190, 1993), oder für dessen attenuierte Version DTtox176 (Maxwell et al., Mol. Cell. Biol., 7, S. 1576–1579, 1987). Diese negativen Selektionsmarker werden in den Targeting-Konstrukten derart positioniert, dass eine zielgerichtete Integration des positiven/negativen Targeting-Konstrukts zur Entfernung des negativen Selektionsmarkers führt (s. 6a, b). Lediglich die Integration des Targeting-Vektors durch homologe Rekombination wird daher gewährleisten, dass die Zellen überleben und – als Konsequenz – hinsichtlich des zielgerichteten Auffindens und der Disruption eines Teils der endogenen Genloci durch homologe Rekombination eine Selektion erlauben.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Verwendung von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die ihr Potenzial zur Expression endogener Antikörper und/oder Antigen-Rezeptoren oder funktionellen Fragmenten davon verloren haben, bevorzugt ist. In gleicher Weise können erfindungsgemäß jedoch auch Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten verwendet werden, die das Potenzial zur Expression von Antikörpern und/oder Antigen-Rezeptoren oder funktionellen Fragmenten davon aufweisen. Ungeachtet des tatsächlichen genetischen Hintergrundes der Vorläufer-Lymphozyten müssen diese Zellen einer genetischen Modifikation unterzogen werden, um die Produktion heterologer Antikörper oder Bindeproteine zu ermöglichen. Es wird darauf hingewiesen, dass diese Modifikation vorzugsweise durchgeführt wird, nachdem geeignete Zielzellen oder -klone wie zuvor beschrieben durch Selektion und/oder Generierung identifiziert worden sind. Es ist jedoch auch möglich, die Zellen genetisch zu modifizieren, bevor sie ihre Eigenschaft verlieren, endogene Immunglobuline oder Teile derselben zu exprimieren. Ferner kann es sogar geeignet erscheinen, beide Schritte gleichzeitig durchzuführen.
Nach einer weiteren Ausführungsform ist es daher bevorzugt, dass das mindestens eine exogene genetische Element, das ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert und zur Herbeiführung der gewünschten genetischen Modifikation verwendet worden ist, auf einem genetischen Konstrukt liegt, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:

(a) rekombinanten retroviralen DNA-Konstrukten umfassend Promotor-, Enhancer- und kodierende Nukleinsäuresequenzen, die operationell gekoppelt sind, um die Expression zu ermöglichen von mindestens einem Bindeprotein oder funktionellen Fragment davon, welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist oder artifiziell ist;
(b) rekombinanten, auf Plasmiden basierenden DNA-Konstrukten umfassend Promotor-, Enhancer- und kodierende Nukleinsäuresequenzen, die operationell gekoppelt sind, um die Expression zu ermöglichen von mindestens einem Bindeprotein oder funktionellen Fragment davon, welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist oder artifiziell ist;
(c) rekombinanten, auf Plasmiden basierenden Mini-Immunglobulin- oder T-Zell-Rezeptor-Genloci mit nicht-umgelagerten V-, D- und J-Gensegmenten, die operationell gekoppelt sind, um eine V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression zu ermöglichen von mindestens einem heterologen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor oder funktionellen Fragment davon, welcher bzw. welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist;
(d) artifiziellen Chromosomen von Bakterien, Hefen oder Vertebraten, die Teile oder sämtliche Genloci für Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in Keimbahnkonfiguration umfassen und operationell gekoppelt sind, um eine V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression zu ermöglichen von mindestens einem heterologen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor oder funktionellen Fragment davon, welcher bzw. welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist;
(e) artifiziellen Chromosomen von Bakterien, Hefen oder vertebraten, die Teile oder sämtliche Bereiche mindestens eines heterologen Genlocus für Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in derart modifizierter Anordnung umfassen, damit die V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression ermöglicht wird von mindestens einem heterologen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor oder funktionellen Fragment davon, welcher bzw. welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist;
(f) transchromosomalen Elementen, welche Fragmente von heterologen Chromosomen sind und Teile oder sämtliche Genloci für Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in Keimbahnkonfiguration aufweisen und eine V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression mindestens eines heterologen Antikörpers oder T-Zell-Rezeptors erlauben, welcher hinsichtlich der primären Aminosäuresequenz(en) die Wildtyp-Form aufweist;

Weiterhin ist es bevorzugt, dass das mindestens eine exogene genetische Element einen heterologen oder artifiziellen Rezeptor kodiert, dessen Binderegion einer Affinitätsreifung unterzogen werden kann.
Zur Durchführung des Schrittes der genetischen Modifikation können erfindungsgemäß mehrere verschiedene Vorgehensweisen, die nachfolgend veranschaulicht werden, angewendet werden.
Ein erster Ansatz basiert auf der stabilen Einführung von rekombinanten Plasmid-DNA-Konstrukten, die Teile heterologer Antigen-Rezeptor-Genloci in nicht-umgelagerter Keimbahn-Konfiguration kodieren, und ist daher ähnlich dem, was zuvor im Zusammenhang mit transgenen Mäusen erreicht worden ist. Diese heterologen Antigen-Rezeptor-Genloci können V-, D- und J-Gensegmente der Immunglobulin-Genloci für die schwere Kette und für die leichten Ketten κ und λ, als auch Gensegmente von irgendeinem Genloci α, β, γ oder δ des T-Zell-Rezeptors (TCR) einschließen.
Ein zweiter Ansatz betrifft die stabile Integration heterologer Antigen-Rezeptor-Genloci im Größenbereich von Megabasen einschließlich Teilen oder sämtlicher Immunglobulin- und/oder TCR-Genloci in nicht-umgelagerter Keimbahn-Konfiguration entweder als transchromosomale Fragmente, oder kloniert in bakterielle artifizielle Chromosomen (BACs), artifizielle Hefe-Chromosomen (YACs), oder artifizielle Chromosomen von Vertebraten (VACs), was mit transgenen Mäusen ebenfalls durchgeführt worden ist (Green et al., Nat. Genet., 7, S. 13–21, 1994; Tomizuka et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 97, S. 722–727, 2000).
Die genetischen Elemente beider Ansätze müssen stabil in PräB-Zellen integriert werden, die in ihren endogenen murinen Ig-Genloci cis-agierende Mutationen aufweisen, welche lediglich mit der Umlagerung der endogenen Ig-Genloci interferieren, aber immer noch die Generierung diverser Antikörper-Repertoires ausgehend von heterologen Antigen-Rezeptor-Genloci in nicht-umgelagerter und/oder Keimbahn-Konfiguration ermöglichen. Die Herstellung von DNA-Konstrukten, die die humanen Ig-Genloci kodieren, basiert auf der Kenntnis der Organisation sämtlicher humanen Ig-Genloci und ihrer als Ergebnis des humanen Genomprojekts nahezu vollständig publizierten DNA-Sequenz. Beispielweise ist der Genlocus für die humane IgH-Kette auf Chromosom 14q32.33 innerhalb eines Bereiches von 1,25 MBp lokalisiert. Er enthält 123–129 (abhängig von allelischer Variation) V_H-Gensegmente (41–47 davon funktional), 27D-, und 6J_H-Gensegmente stromaufwärts des Genclusters der konstanten Region. Der humane Genlocus für die IgκL-Kette umfasst 1,82 MBp, ist auf Chromosom 2p12 lokalisiert und enthält 40 oder 76 (Allel-abhängig) V_κ-Gensegmente (34 bzw. 64 davon funktional), sowie 5Jκ-Gensegmente stromaufwärts einer einzelnen Cκ-Region. Der 1,05 MBp abdeckende humane Locus für die IgλL-Kette ist auf Chromosom 22q11.2 lokalisiert und enthält 70 oder 71 (31 oder 32 funktional) Vλ-Gensegmente stromaufwärts von 7 bis 11 sich in Tandemform wiederholende Jλ-Cλ-Gensegmente.
Die DNA-Konstrukte, die einen, mehrere oder sämtliche Teile der Genloci für heterologe Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in Keimbahn-Konfiguration aufweisen, welche auf transchromosomalen Fragmenten vorhanden sind oder in BAC-, YAC- oder VAC-Vektorkonstrukte kloniert werden können, können stabil in langfristig proliferierende Ziel-PräB-Zellen transferiert werden, indem standardisierte Verfahren zum Gentransfer angewendet werden, einschließlich z. B. Elektroporation, Calciumphosphat- oder DEAE-Dextran-Transfektion, Liposomenvermittelter Transfer, Sphäro- oder Protoplastenfusion, ballistischer Transfer, Mikroinjektion, oder spezifische Protein/Addukt-Bildung, oder eine Kombination davor. Stabile Transfektanten können mittels geeigneter (Antibiotika-) Selektionsmarker selektiert werden, die sich in den YAC-, BAC- und VAC-Vektoren befinden und Gene umfassen, die Resistenz gegenüber z. B. Puromycin, HygromycinB, Neomycin (G418), Histidinol, Mycophenolsäure, Zeocin und dergleichen vermitteln.
Ein dritter, konzeptionell unterschiedlicher Ansatz kann zur Einführung heterologer genetischer Elemente angewendet werden, die heterologe, vorzugsweise humane Antikörper und Bindeproteine kodieren. Nach dieser alternativen Methode werden heterologe genetische Elemente unter Anwendung retroviraler Transduktion stabil in murine PräB-Zeller transferiert, was im Zusammenhang mit der Gentherapie für Erbkrankheiten unter Verwendung pluripotenter hämatopoetischer Stammzellen als Zielzellen beschrieben worden ist (s. An Dong Sung et al., J. Virol. 75 (8), 3547–3555 (2001)). Retrovirale Transfer-Vektoren können lediglich 7–10 kb Fremd-DNA aufnehmen, wodurch die Klonierung von Expressionsvektoren für heterologe, vorzugsweise humane Antikörper und Bindeproteine signifikant erleichtert wird. Sämtliche Eigenschaften heterologer Antikörper und Bindeproteine können daher unter Verwendung retroviraler Transfer-Vektoren leicht und schnell mittels standardisierter molekularbiologischer Verfahren modifiziert werden. Im Gegensatz dazu stellt die Einführung von Modifikationen im Kontext eines transgenen Maussystems zur heterologen Antikörperexpression einen sehr arbeits- und zeitaufwendigen Vorgang dar, der daher praktisch ausgeschlossen ist. Die Verwendung transgener Mäuse zur Veränderung der Funktionen transgen kodierter heterologer Antikörper würde die Generierung mehrerer neuer transgener Mausstämme einschließlich Einkreuzung eines immundefizienten genetischen Hintergrundes erforderlich machen.
Rekombinante retrovirale Transfer-Vektoren, die heterologe Antikörper oder Bindeproteine kodieren, können entweder als monoklonale Bindespezifitäten exprimierende Klone hergestellt oder in Form von Bibliotheken generiert werden, die polyklonale Bindespezifitäten kodieren. Da retrovirale Vektoren nicht groß genug sind, um signifikante Regionen der Antigen-Rezeptor-Genloci in Keimbahn-Konfiguration aufzunehmen, müssen die heterologen Kodierungsregionen bereits V(D)J-rearrangierte, für variable Domänen kodierende Gensegmente in Kombination mit Kodierungsregionen für die konstanten Regionen heterologer Antikörper und Bindeproteine enthalten. Die Expression von Klonen oder Bibliotheken retroviraler Expressionsvektoren für heterologe Antikörper oder Bindeproteine erfordert daher keine funktionelle zelluläre Maschinerie für die V(D)J-Rekombination und kann daher in Verbindung mit PräB-Lymphozyten durchgeführt werden, die cis- und/oder trans-agierende Mutationen aufweisen, welche, wie zuvor beschrieben, die Expression endogener Immunglobulin-Gene verhindern.
Die retroviralen Expressionsvektoren, die es murinen PräB-Zellen ermöglichen, heterologe Antikörper oder Bindeproteine zu exprimieren, werden zunächst in retrovirale Packaging-Zelllinien transfiziert, von denen eine große Auswahl mit der Fähigkeit zur Bildung rekombinanter Retroviren mit entweder ökotropem, amphotropem, oder pantropem Infektabilitätsspektrum kommerziell erhältlich sind. Derartige Packaging-Zelllinien sind mit Expressionskonstrukten für die retroviralen Gene gag, pol und env stabil transfiziert. Die Transfektion retroviraler Packaging-Zellen mit rekombinanten retroviralen Plasmidvektoren, die heterologe Antikörper oder Bindeproteine kodieren, führt dann zur Bildung von rekombinanten Retroviren mit der Fähigkeit, PräB-Zellen zu infizieren und die heterologe genetische Information stabil in PräB-Zelllinien und -klone zu transduzieren (8). Die bei diesen Verfahren verwendeten retroviralen Expressionsvektoren werden ausgehend von einem handelüblich erhältlichen leeren retroviralen Transfervektor hergestellt, der über die minimal erforderlichen retroviralen Elemente verfügt, einschließlich 5'-LTR, eines Psi-Packaging-Signals und einem 3'-LTR (11a).
Die endgültigen retroviralen Vektoren für die Expression heterologer Antikörper oder Bindeproteine können jedwede der folgenden genetischen Elemente enthalten, welche operationell gekoppelt sind, um die Expression heterologer Antikörper und Bindeproteine in Zellen der B-Linie sicherzustellen, wobei die Elemente ausgewählt werden aus:

(a) Promotor-Elementen einschließlich konstitutiver Promotoren, wie z. B. CMV(Cytomegalovirus)-, SV40(simian virus 40)-, β-Actin- oder PGK(Phosphoglycerat-Kinase)-Promotoren, oder B- Zelllinien-spezifischen Promotoren wie z. B. der CD19 Promotor, oder die Promotoren der Gene für die IgH- und IgL-Kette;
(b) Exons der variablen (V) Region von irgendeinem Antigen-Rezeptor-Genlocus, einschließlich Immunglobulin- und TCR-Genloci;
(c) Enhancer-Elementen, die eine hohe und B-Zelllinienspezifische Expression heterologer Antikörper oder Bindeproteine ermöglichen, wie z. B. EμH- oder κiE-Intron-Enhancer-Elemente;
(d) Exons der konstanten Region, einschließlich Exons, die die sezernierten und membrangebundenen Formen von Antikörpern und Bindeproteinen kodieren (7a, b); und
(e) den 3'-Immunglobulin-Gen-Enhancern der Genloci für die schwere und leichte Kette (d. h. die 3'α-, 3'κ- oder λ3-1- und λ2-4-Enhancer), die für eine somatische Hypermutation der für die variable Region kodierenden Exons der heterologen Antikörper oder Bindeproteine erforderlich sind (7a, b).

Darüber hinaus können Expressionskassetten für geeignete (Antibiotika-) Selektionsmarker, wie z. B. Puromycin, HygromycinB, Neomycin (G418), Histidinol, Mycophenolsäure, Zeocin, oder für geeignete Reportergene, wie EGFP (enhanced green fluorescent protein) und seine Mutanten YFP (yellow fluorescent protein), CFP (cyan fluorescent protein), und BFP (blue fluorescent protein), oder RFP (red fluorescent protein), Teil der retroviralen Vektoren sein, wodurch die Selektion beziehungsweise Isolation stabil transduzierter Zellen ermöglicht wird (7b). Das Arrangement und die Gegenwart sämtlicher dieser Kodierungsregionen und Kontrollelementen muss sorgfältig ausgearbeitet und umgesetzt werden, um eine differenzielle Expression von membrangebundenen oder sezernierten Formen heterologer Ig-Glykoproteine, als auch eine Antigen-getriebene Affinitätsreifung der heterologen Antikörper und Bindeproteine in Keimzentren in vivo zu ermöglichen. Falls gewünscht, können Exons für Domänen der konstanten Region zwischen Isotypen ausgetauscht werden, oder es können Mutationen eingeführt werden, die die Effektorfunktionen der exprimierten heterologen Antikörper beeinflussen (7a, b). Diese nicht beschränkenden Beispiele dienen der Veranschaulichung, dass dieses System die schnelle Modifikation einfach jeglicher Region der retroviral kodierten heterologen Antikörper oder Bindeproteine ermöglicht.
Das Exon, welches innerhalb dieser rekombinanten retroviralen Vektoren die variablen Domänen kodiert, kann hinsichtlich der Expression einer gegebenen Spezifität, wie z. B. derjenigen eines existierenden Antikörpers, dessen Spezifität der Antigenbindung mittels Affinitätsreifung nach Transplantation stabil transduzierter PräB-Zellen in murine Rezipienten und nachfolgender Immunisierung (9) modifiziert werden soll, monoklonal sein. Zusätzlich kann das variable Domänen kodierende Exon aus einer Bibliothek diverser V(D)J-Rearrangements abgeleitet werden. Diese V-Region-Bibliotheken können unter Verwendung degenerierter Primerpaare, die eine Vielzahl von verschiedenen V_H-Genfamilien und J_H-Gensegmenten amplifizieren, mittels PCR aus heterologen, vorzugsweise humanen B-Lymphozyten isoliert werden (9). Die B-Lymphozyten können von immunisierten oder nicht-immunisierten Individuen ('primed versus naive repertoire'), oder von Patienten stammen, die an Autoimmunkrankheiten leiden (Autoimmun-Repertoire). Ferner können vollständig synthetische Bibliotheken von Domänen der V-Region unter Anwendung der in vitro Zusammenstellung von für V-Domänen spezifischen Genfragmenten konstruiert werden, die zufällige Nukleotidsequenzen in Regionen aufweisen, die den die Komplementarität bestimmenden Regionen entsprechen (9).
Kombinationen retroviraler Konstrukte können simultan oder sequenziell in PräB-Zellen transduziert werden, wodurch die Expression und Sekretion vollständig heterologer Immunglobuline und dimerer Bindeproteine im Wege der Differenzierung der PräB-Zellen in vitro oder in vivo ermöglicht wird (8).
Vertebraten-PräB-Zellen, die durch irgendeine der oben beschriebenen Verfahren derart genetisch modifiziert worden sind, dass sie das Potenzial erworben haben, heterologe Antikörper oder Bindeproteine zu exprimieren, müssen in reife Zellen der B-Zelllinie und schließlich in Plasmazellen differenziert werden, damit die heterologen Antikörper oder Bindeproteine exprimiert und schließlich sekretiert werden können. Dies kann entweder durch Differenzierung in Gewebekultur in vitro oder durch Transplantation der genetisch modifizierten PräB-Zellen in geeignete Vertebraten-Rezipienten in vivo erfolgen, unter der Maßgabe, dass die in vivo-Herstellung im Menschen ausgeschlossen ist.
Demgemäß ist es bevorzugt, die Differenzierung von Vertebraten-Vorläufer-B-Lymphozyten in vitro herbeizuführen durch:

(a) Anhalten der Proliferation der Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten und Induzieren der Differenzierung in reife Zellen der lymphoiden Linie durch Kultivieren derselben in Abwesenheit irgendeines Vorläufer-Lymphozyten-Wachstumsfaktors; und
(b) Induzieren der terminalen Lymphozyten-Differenzierung durch weiteres Kultivieren der Zellen in Gegenwart mindestens einer der folgenden Komponenten ausgewählt aus:
(i) löslichen, mit T-Zellen im Zusammenhang stehenden stimulierenden Faktoren, umfassend Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-10, Interleukin-13, TGF-β, und IFN-γ;
(ii) Faktoren, die co-stimulatorische B-Zell-Rezeptoren aktivieren, umfassend agonistische Antikörper oder aktive rekombinante Liganden, spezifisch für CD40, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), Komplement-Rezeptoren 1 (CD35) und 2 (CD21), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), CD19, CD20, CD30, CD32, CD37, CD38, CD70, CD71, Igα (CD79α), Igβ (CD79β), TAPA-1(CD81), Fas (CD95), TNF-Rezeptor1 (p55, CD120a), TNF-Rezeptor2 (p75, CD120b), Ox-40 (CD134), und Lymphotoxin-b-Rezeptor; und
(iii) B-Zell mitogenen Faktoren, T-Zell-unabhängigen Antigenen des Typs 1, und anderen polyklonalen Aktivatoren, einschließlich Lipopolysacchariden (LPS), Lipoproteinen von Gram-negativen Bakterien, Polyanionen, Poly-dIdC, Pokeweed-Mitogen (PWM), und Anti-Immunglobulin-Reagenzien; und Kombinationen davon.

Die in vitro-Differenzierung in Gewebekultur kann durch ein zweistufiges Verfahren erreicht werden, das (a) die Entfernung von PräB-Zell-Wachstumsfaktoren, wie z. B. IL7, oder IL3, aus dem Gewebekulturmedium, wodurch die Proliferation von PräB-Zellen angehalten und gleichzeitig die Differenzierung in Zellen eines reifen B-Zell-Phänotyps induziert wird, und (b) die Stimulierung der differenzierten B-Zellen durch die mit T-Zellen in Beziehung stehenden und/oder mitogenen, T-Zell-unabhängigen Stimuli einschließen, sodass die endgültige Differenzierung zur Plasmazelle induziert wird. Die anfängliche Differenzierung von PräB-Zellen in Zellen mit einem B-Zell-Phänotyp durch Entfernung von PräB-Zell-Wachstumsfaktoren geht mit der Induktion von Apoptose einher. Daher werden gemäß einer bevorzugten Ausführungsform PräB-Zellen verwendet, die anti-apoptotische Gene überexprimieren, wie z. B. bcl-2 oder bcl-x_L. Diese antiapoptotischen Gene können in PräB-Zellen entweder durch Verwendung von PräB-Zellen, die aus bezüglich bcl-2 oder bcl-x_L transgenen Tieren isoliert worden sind, oder durch Transfektion oder Transduktion von PräB-Zellen mit Vektoren zur Überexpression von irgendeinem der anti-apoptotischen Gene eingeführt werden.
Als Alternative zur in vitro-Differenzierung genetisch modifizierter Vorläufer-Lymphozyten können diese Zellen auch in vivo differenziert werden durch Transplantation in einen geeigneten nicht-humanen Vertebraten-Rezipienten, wodurch diese Zellen zu sekundären Lymphoidorganen migrieren und in reifere Zellen der lymphoiden Linie differenzieren. Vorzugsweise werden diese Lymphozyten in den Rezipienten mit nativen oder Antigengeprimten T-Helfer-Lymphozyten co-transplantiert, wobei der Begriff „co-transplantiert" nicht auf die simultane Transplantation zum exakt gleichen Zeitpunkt beschränkt zu verstehen ist. Nach einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt anschließend an die Differenzierung in vivo die Immunisierung des Rezipienten mit mindestens einer gewünschten immunogenen Verbindung oder Zusammensetzung. Im Gegensatz zu dem vorliegend beschriebenen Verfahren gestattet die Transplantation genetisch unmodifizierter humaner CD34+ hämatopoetischer Stammzellen in SCID-Mäuse (WO 01/87058) weder die Herstellung von Antikörpern mit hoher Affinität (aufgrund des Mangels an kompatiblen humanen T-Zellen), noch irgendeine Flexibilität hinsichtlich des Typs und der Eigenschaften der von diesen B-Zellen hergestellten Antikörper.
Weiterhin ist es bevorzugt, dass der Vertebraten-Rezipient ein kompatibler Wirt ist und hinsichtlich der Bildung von endogenen B-Zellen, T-Zellen und/oder NK(natürliche Killer)-Zellen oder einer Kombination derselben defizient ist.
Wie bereits zuvor in Bezug auf die Selektion geeigneter Quellen für Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten ausgeführt worden ist, ist es bevorzugt, dass der Vertebraten-Rezipient ausgewählt wird aus kiefertragenden Vertebraten umfassend Knorpelfische, Knochen fische, Amphibien, Reptilien, Vögel, und Säugetiere einschließlich Schweine, Schafe, Rinder, Pferde, und Nagetiere einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen, wobei Mäuse die bevorzugte Rezipienten-Spezies ist.
Die geeigneten, als Rezipienten für die Transplantation genetisch modifizierter Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten dienenden Wirte können hinsichtlich der Lymphozytenentwicklung den Wildtyp aufweisen, oder sie können vorzugsweise irgendeine der zahlreichen cis-agierenden Mutationen aufweisen, durch die die endogenen murinen Rearrangements der Ig-Gene inhibiert werden. Diese können Mutationen in Enhancer-Elementen von Ig-Genloci, wie die zuvor genannten EμH- und κiE-Enhancer-Elemente, Deletionen innerhalb der für Immunglobuline kodierenden Genregionen, wie den D_H, den J_H- oder J_L-Gensegmenten und den IgC-Regionen einschließlich ihrer Membran-überspannenden Exons einschließen. Ferner können geeignete Wirte eingesetzt werden, die trans-agierende Mutationen aufweisen, durch die selektiv die Entwicklung von B-(und T-)Lymphozyten behindert werden kann, z. B. Mutationen in Linien- oder Lymphozyten-spezifischen Transkriptionsfaktoren oder den für die Initiation der V(D)J-Rekombination erforderlichen Genen RAG-1 und RAG-2 (Mombaerts et al.; s. a. Shinkai et al., s. o.).
Darüber hinaus umfassen trans-agierende Mutationen, die zu immundefizienten Wirten führen, Mutationen in den ubiquitär exprimierten DNA-Reparaturgenen, die auch für die V(D)J-Rekombination erforderlich sind, wie Ku70, Ku86, die katalytische Untereinheit der DNA-abhängigen Protein-Kinase (DNA-PKcs), XRCC4, DNA-Ligase IV und Artemis. Vertebraten-Rezipienten mit irgendeiner der zuvor genannten Mutationen, denen es entweder nur an B-Lymphozytenpopulationen oder sowohl an B- als auch an T-Lymphozyten mangelt, können anschließend mit genetisch modifizierten PräB-Zellen transplantiert werden, wobei sie im Falle von Mäusen, die hinsichtlich B- und T-Zellen defizient sind, mit histokompatiblen T-Helferzell-Populationen co-transplantiert werden können. Die T-Helferzell-Populationen umfassen vorzugsweise native T-Helferzellen, Antikörper-geprimte Effektor-T-Zell-Populationen oder Gedächtnis-T-Zellen, oder irgendeine Kombination davon. Die Co-Transplantation von T-Helferzell-Populationen kann simultan, vor oder nach dem tatsächlichen Zeitpunkt der Transplantation genetisch modifizierter PräB-Zellen erfolgen.
Murine oder Vertebraten-Wirte, deren periphere Lymphozyten-Populationen partiell oder vollständig durch Transplantation modifizierter PräB-Zellen und die optionale Co-Transplantation von T-Helferzell-Populationen partiell oder vollständig rekonstituiert worden sind, können anschließend zur Immunisierung mit irgendeinem gewünschten Antigen verwendet werden, um eine Immunantwort auf dieses Antigen auszulösen und solche Lymphozyten zu stimulieren, die die geeignete heterologe Rezeptorspezifität exprimieren, wodurch es zu einer proliferativen Expansion von B-Zell-Klonen, zur Affinitätsreifung der Bindungsdomänen der kodierten heterologen Antikörper oder Bindeproteine, und zur terminalen Differenzierung in Plasmazellen kommt, die die heterologen Antikörper oder Bindeproteine sekretieren.
Aus dem vorhergehenden wird deutlich, dass ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung irgendeines Bindeproteins oder eines oder mehrerer funktioneller Fragmente davon mit der Fähigkeit betrifft, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines funktionellen Fragmentes davon, in einer per se bekannten Weise, beinhaltend die folgenden Schritte:

(a) genetische Modifizierung von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die
(i) aus primären lymphoiden Organen stammen und
(ii) das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, durch Einbringen mindestens eines exogenen genetischen Elementes, welches mindestens ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert; oder, alternativ, durch Verwendung genetisch modifizierter Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die
(i) aus primären lymphoiden Organen stammen und
(ii) das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, und
(iii) mindestens ein exogenes genetisches Element aufweisen, welches mindestens ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert;
(b) Herbeiführung der Differenzierung der genetisch modifizierten Vorläufer-Lymphozyten in reife Zellen der lymphoiden Linie entweder in vitro oder in vivo, wodurch genetisch modifizierte und differenzierte Vertebraten-Lymphozyten generiert werden, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon herzustellen, oder, alternativ, Verwendung der genetisch modifizierten und differenzierten Vertebraten-Lymphozyten, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon herzustellen;
(c) Herbeiführung der Expression des Bindeproteins oder funktionellen Fragments davon; unter der Maßgabe, dass die in vivo Produktion in Menschen ausgeschlossen ist.

In diesem Zusammenhang ist es bevorzugt, dass irgendeines der obigen Verfahren, die die Bildung der genetisch modifizierten und differenzierten Vertebraten-Lymphozyten beinhalten, gefolgt wird von den Schritten:

(a) Isolierung des mindestens einen exogenen genetischen Elementes aus den differenzierten Lymphozyten, und
(b) Platzierung des bzw. der genetischen Elementes) in einen Kontext, der die Produktion des mindestens einen Bindeproteins oder funktionellen Fragments davon ermöglicht.

Um eine Herstellung des gewünschten Immunglobulins oder Immunglobulin-ähnlichen Proteins oder funktionellen Fragments davon im Großmaßstab zu erreichen, kann die genetische Information, welche für die interessierenden Polypeptide kodiert, aus diesen Zellen isoliert und in verschiedene Expressionssysteme transferiert werden, wo die genetische Information gespeichert, amplifiziert und/oder zur Herstellung des gewünschten Proteins oder Teils desselben verwendet werden kann.
Genauer gesagt, können die offenen Leserahmen, die die Kodierungsregionen für die heterologen Antikörper oder Bindeproteine repräsentieren, mittels molekularbiologischer Standardverfahren isoliert werden, einschließlich der PCR-Amplifikation mit spezifischen Primerpaaren, und in den Kontext verschiedener Expressionssysteme transferiert werden, wodurch die kontinuierliche Produktion der heterologen Antikörper oder Bindeproteine ermöglicht wird. Diese Expressionssysteme umfassen in vitro Transkriptions-/Translations-Systeme, prokaryotische Expressionssysteme, wie z. B. E. coli, oder eukaryotische Expressionssysteme, wie die Expression in Hefezellen, Insektenzellen unter Anwendung einer Bakulovirus-Infektion, oder Säugerzellen.
Das bzw. die oben genannten Bindeproteine oder funktionellen Fragmente davon können entweder eine einzigartige Spezifität aufweisen und daher monoklonal sein, oder sie können durch mehre als eine einzigartige Spezifität kodiert und daher polyklonal sein.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform stimmt das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon vollständig oder teilweise hinsichtlich der strukturellen und/oder funktionellen Eigenschaften mit einem menschlichen Antikörper, Antigen-Rezeptor, oder Bindeprotein, wie er bzw. es auf der Basis des menschlichen genetischen Repertoires oder Teilen davon zusammengebaut werden kann, überein.
Ferner ist es bevorzugt, dass das herzustellende Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus:

(a) membrangebundenen oder sezernierten Antikörpern, bestehend aus heterologen Polypeptiden der schweren und leichten Ketten in der bei natürlichen Antikörpern vorliegenden stöchiometrischen Zusammensetzung, und bestehend aus irgendeinem der für die schweren (μ, δ, γ, α, ε) und/oder leichten (κ und λ) Ketten bekannten Isotypen;
(b) Antikörpern mit Kombinationen von Polypeptiden der schweren und leichten Ketten, die im Hinblick auf die primäre Aminosäuresequenz vollständig human sind;
(c) Hybrid-Antikörpern, die heterologe Polypeptide der schweren oder leichten Ketten von verschiedenen Vertebraten-Spezies enthalten;
(d) sezernierten Fab-, scFv- und F(ab')2-Antikörperfragmenten, die entweder vollständig oder teilweise heterolog sind;
(e) Fragmenten von Antikörpern, die über Linkerpeptide kovalent verbunden sind, woraus bispezifische oder multispezifische Antikörperfragmente resultieren;
(f) T-Zell-Rezeptoren des α-, β-, γ- und δ-Isotyps, Antigen-Rezeptoren, und anderen Bindeproteinen mit struktureller Ähnlichkeit zu Proteinen der Immunglobulin-Superfamilie;

Nach einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß genetisch modifizierte Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten bereitgestellt, die

(a) aus primären lymphoiden Organen stammen und das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren,
(b) mindestens ein exogenes genetisches Element tragen, das mindestens ein heterologes Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon mit der Fähigkeit kodiert, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten heterologen Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines heterologen artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines beliebigen funktionellen Fragments davon, und
(c) mindestens einen Selektionsmarker tragen, der mit dem mindestens einen exogenen genetischen Element operationell verbunden ist.

Entsprechend einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß reife Zellen der lymphoiden Linie bereitgestellt, die

(a) mindestens ein exogenes genetisches Element tragen, das mindestens ein heterologes Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon mit der Fähigkeit kodiert, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten heterologen Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines heterologen artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines beliebigen funktionellen Fragments davon, und
(b) mindestens einen Selektionsmarker tragen, der mit dem mindestens einen exogenen genetischen Element operationell verbunden ist.

Nach einem weiteren Aspekt werden erfindungsgemäß immortalisierte Zellen bereitgestellt, die von reifen Zellen der lymphoiden Linie abstammen, und

(a) mindestens ein exogenes genetisches Element tragen, das mindestens ein heterologes Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon mit der Fähigkeit kodiert, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten heterologen Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines heterologen artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines beliebigen funktionellen Fragments davon, und
(b) mindestens einen Selektionsmarker tragen, der mit dem mindestens einen exogenen genetischen Element operationell verbunden ist, und
(c) das mindestens eine heterologe Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon produzieren.

Es wird darauf hingewiesen, dass vollständig humane oder humanisierte Antikörper oder funktionelle Fragmente davon aufgrund ihrer Fähigkeit, mit ihren Domänen der variablen Region an spezifischer Antigene zu binden, und, darüber hinaus, aufgrund ihrer Fähigkeit, über ihre Domänen der konstanten Region Immuneffektorfunktion zu vermitteln, zur Diagnose, Prävention und Therapie von menschlichen Erkrankungen eingesetzt werden können. Einige mögliche Anwendungen für humane monoklonale Antikörper, welche erfindungsgemäß hergestellt werden können, zur Diagnose, Prävention und Therapie menschlicher Erkrankungen werden nachfolgend detailliert ausgeführt. Für diagnostische Zwecke können humane monoklonale Antikörper zur Identifizierung und Sichtbarmachung bestimmter pathologischer Zustände durch Einführung markierter Antikörper in das Gefäßsystem von Individuen verwendet werden, wo spezifische, mit der Erkrankung im Zusammenhang stehende antigene Strukturen (z. B. auf bestimmten pathologischen Zellen exprimiert) nachgewiesen werden können. Anwendungen zur Prävention menschlicher Erkrankungen schließen Antikörper mit der Fähigkeit ein, Wechselwirkungen bestimmter Zelloberflächenabhängiger Rezeptor/Liganden-Systeme in pathologischen Zuständen (antagonistischer Antikörper) zu blockieren, oder umgekehrt, die Wirkung einer Ligandenbindung an Zelloberflächen-Rezeptoren im Falle der pathologischen Abwesenheit eines Liganden (agonistischer Antikörper) nachzuahmen. Darüber hinaus können humane monoklonale Antikörper verwendet werden, um die Funktionen von toxischen Substanzen oder Pathogenen zu blockieren, z. B. bei Vergiftung, Entzündung und Infektionen. In diesem Zusammenhang sind humane Antikörper von besonderer Qualität, da sie das Tagging dieser Substanzen und Antigene zur Entfernung durch spezialisierte Zellen des eigenen Immunsystems vermitteln. Humane monoklonale Antikörper können auch zum Targeting von Immunfunktionen zu krebsartigen Zellen verwendet werden, da sie in der Lage sind, an veränderte Eigenstrukturen spezifisch zu binden, die auf der Oberfläche von malignen Zellen exprimiert werden. Im Falle von Autoimmunerkrankungen können humane monoklonale Antikörper hilfreich sein zur Neutralisierung oder Gegenwirkung der pathologischen Effekte von Autoimmunfaktoren (Autoantikörper, allergische Antikörper). Humane monoklonale Antikörper sind deshalb so hilfreich zur Diagnose, Prävention und Therapie von menschlichen Erkrankungen, da sie in das Gefäßsystem von Individuen eingeführt werden können, ohne irgendwelche Nebenwirkungen auszulösen, da Antikörper normale Bestandteile des Blutplasmas und fluiden Komponenten des Menschen (z. B. Schleim, Speichel, Lymphflüssigkeit etc.) sind.
Hinterlegung biologischen Materials
Plasmide, die genetische Elemente tragen, welche erfindungsgemäß eingesetzt werden, sind nach dem Budapester Vertrag am 17.12.2001 unter den folgenden Zugriffsnummern bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) in Braunschweig, Deutschland, hinterlegt worden:

Plasmid Zugriffsnummer

pBS-DT4 DSM 14703

pPGK-hygro DSM 14704

pGL2neo(m)+ DSM 14705

pBS-DT4-tox176 DSM 14706
Die folgenden experimentellen Vorgehensweisen beschreiben detaillierte Verfahren zur Herstellung humaner monoklonaler Antikörper unter Verwendung muriner PräB-Zellen, die genetisch modifiziert worden sind, um die Fähigkeit zur Produktion humaner Antikörper zu erhalten. Es werden nachfolgend ausgewählte Verfahrensbeispiele beschrieben, mit denen die genetischen Modifikationen muriner PräB-Zellen derart durchgeführt werden können, dass endogene Antikörper nicht länger exprimiert werden können, aber dass humane Antikörper ausgehend von stabil eingeführten heterologen retroviralen Expressionskonstrukten produziert werden können. Darüber hinaus werden experimentelle Details vorgestellt, die die Transplantation dieser genetisch modifizierten murinen PräB-Zellen in geeignete murine Rezipienten betreffen, als auch Verfahren, die die Immunisierung dieser transplantierten Mäuse, die Isolierung von Antikörper-sezernierenden Zellen, und deren Etablierung als unsterbliche, monoklonale humane Antikörper sezernierende Hybridom-Zelllinien betreffen. Obgleich die dargelegten Verfahren vollständig und zur Herstellung heterologer, insbesondere humaner monoklonaler Antikörper unter Verwendung muriner PräB-Zellen, die genetisch modifiziert sind, ausreichend sind, sollten die Verfahren lediglich als Veranschaulichung, nicht aber als Beschränkung betrachtet werden.
Beispiele
Beispiel 1: Etablierung langfristig proliferierender, muriner Vorläufer-B-Zellen mit dem Potenzial zur Differenzierung in reife Zellen der B-Zelllinie
Auf Stromazellen und IL7 ansprechende murine Vorläufer-B-Zellen werden 15 bis 18 Tage nach der Befruchtung in fötaler Leber von Mausföten sowie im Knochenmark ausgewachsener Mäuse als auch in der Milz neugeborener Tiere (< 3 Wochen alt) gefunden (Rolink et al., Blood, 81, 2290–2300, 1993). Um diese PräB-Zellen zu isolieren, werden Mäuse durch Begasung mit CO₂ eingeschläfert, und die entsprechenden Organe werden unter sterilen Bedingungen entnommen. Das gesamte Zellmaterial des Knochenmarks wird erhalten, indem Femur und Tibia entfernt und die Knochen an beiden Enden mit sterilen Scheren geöffnet werden und das Mark mit 2–5 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) unter Verwendung einer einstellbaren 5 ml Spritze und einer 25er oder 26er Nadel gespült wird. Die Präparation der isolierten Milz oder der fötalen Leber erfolgt ebenfalls unter sterilen Bedingungen, und das Material wird auf ein steriles Stahlgitter (200 Maschen) in einer Petrischale mit 5–10 ml PBS überführt. Die Organe werden in Stücke geschnitten und mit Hilfe des Kolbens einer 5 ml Kunststoffspritze durch das Metallgitter gedrückt. Die Zellsuspensionen werden mittels Zentrifugation (200 g, 10 Minuten, 4°C) einmal gewaschen und in 10–20 ml PBS resuspendiert. Sämtliche Zellpräparationen erfolgen mit eiskalten Lösungen, und die Zellsuspensionen werden bis zum Transfer in Gewebekultur auf Eis gehalten.
Die Etablierung individueller PräB-Zellklone erfolgt durch Grenzverdünnung in Platten mit 96 Vertiefungen, die beschichtet sind mit semikonfluenten murinen, mit 3000 rad γ-bestrahlten ST-2 (Ogawa et al., EMBO J., 7, 1337–1343, 1988) oder PA-6 (Kodama et al., J. Cell. Physiol., 118, 233–240, 1984) Stromazellen, die in speziellem Medium für Stromazellen (siehe unten) kultiviert worden sind. Zum Ausplattieren der Grenzverdünnung können die gesamten Zellpopulationen des Organs oder, alternativ, Zellen der B-Zelllinie verwendet werden, die die Oberflächenmarker B220⁺ oder CD19⁺ aufweisen und durch Fluoreszenz- oder magnetische Partikel aktiviertes Zellsortieren (FACS oder MACS) unter Verwendung handelsüblich erhältlicher Antikörper, die für diese Marker spezifisch sind, angereichert werden.
Die langfristige Kultur muriner PräB-Zellen erfolgt in einem speziellen serumfreien Medium, welches 100 Einheiten rekombinantes Interleukin-7 (IL-7) enthält (siehe unten). Unter Bedingungen der Grenzverdünnung und einer Kultivierung für eine Dauer von 6 bis 7 Tagen bei 37°C in einem Feuchtinkubator bei 10% CO₂ Atmosphäre entwickeln sich auf Stroma-Nährzellen individuelle PräB-Zellkolonien. Einzelne PräB-Zellkolonien werden zunächst in Platten mit 24 Vertiefungen überführt und anschließend nacheinander in Gewebekulturflaschen von 25 cm² und schließlich 75 cm² angereichert, wobei die Flaschen zuvor stets mit Stromazellen vorbeschichtet werden, die mit 3000 rad γ-bestrahlt worden sind. Nach der anfänglichen Anreicherung müssen die PräB-Zelldichten zwischen 1 × 10⁵ und 2 × 10⁶ PräB-Zellen/ml Gewebekulturmedium gehalten werden, wozu alle 2 bis 3 Tage eine Subkultivierung dieser Zellen erforderlich ist.

Das spezielle serumfreie Gewebekulturmedium (Iscove und Melchers, J. Exp. Med., 147, 923–933, 1978), das für die Etablierung langfristig proliferierender, Stromazell- und IL-7-abhängiger muriner PräB-Zellen erforderlich ist, ist wie folgt zusammengesetzt (Formulierung für 1 Liter Medium):

• 11 g	DMEM-Pulver (ohne Bicarbonat)
• 10 ml	1 M HEPES, pH-Wert 7,3
• 33,3 ml	7,5% NaHCO3-Lösung
• 8 ml	Aminosäure-Vorratslösung enthaltend: – L-Alanin 600 mg – L-Asparagin 520 mg – L-Aspartat 720 mg – L-Glutamat 1800 mg – L-Prolin 960 mg – Na-Pyruvat 2640 mg + 1,6 ml Biotin/Vitamin B12 Vorratslösung enthaltend – Vitamin B12 5,0 mg – D-Biotin 5,0 mg gelöst in 20 ml + 10 μl 1 M HCl alle Komponenten gelöst in 240 ml ultrareinem H₂O

• 4 ml	Cystein-Vorratslösung enthaltend – L-Cystein 1,4 g gelöst in 150 ml H₂O, 50 ml 1 M HCl
• 5 ml	10% BSA (Bovines Serumalbumin)-Lösung
• 0,15 ml	humane Transferrin-Vorratslösung zusammengesetzt aus: – 10 ml Lösung a.) und 80 μl Lösung b.) a.) 1 g humanes Transferrin, gelöst in 10 ml DMEM (1,3 g/100 ml H₂O) + 100 μl 1 M HEPES, pH-Wert 7,3 b.) 440 mg FeCl₃ × 6 H₂O + 185 ml H₂O + 200 μl 1 M HCl
• 5 ml	Soyalipid-Vorratslösung – 200 mg Soyalipide vermischt mit 45 ml DMEM (1,3 g/100 ml H₂O) + 5 ml 10% BSA. 3× Ultraschall für 15 min in Eiswasser.
• 20 ml	Kanamycin (5000 μg/ml)
• 30 μl	2-Mercaptoethanol (1,43 M)
• 10⁵ U	rekombinantes Maus-Interleukin-7 (IL7).

Sämtliche Komponenten werden in einem Endvolumen von 1000 ml dreifach destillierten, ultrareinen H₂O gelöst, steril filtriert und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.

Die Stroma-Nährzellen ST-2 oder PA-6 müssen in einem speziellen, nachfolgend aufgeführten Medium mit einem niedrigen Gehalt an Serum kultiviert werden (Formulierung für 1 Liter):

• 17,7 g	IMDM-Pulver (ohne Bicarbonat)
• 3 g	NaHCO₃
• 10 ml	100× nicht-essentielle Aminosäuren (GIBCO-BRL)
• 10 ml	100× Penicillin/Streptomycin (GIBCO-BRL)
• 1 ml	5 mg/ml Schweineinsulinlösung
• 1 ml	50 mM 2-Mercaptoethanol

• 3 ml	10% Primaton (ultrafiltriert, um Proteine > 10 kD auszuschließen) (Quelle: Quest International, Naarden, NL)
• 20 ml	fötales Kälberserum.

Sämtliche Komponenten werden in einem Endvolumen von 1000 ml dreifach destillierten, ultrareinen H₂O gelöst, steril filtriert und bis zur Verwendung bei 4°C aufbewahrt.
Beispiel 2: Schrittweise Differenzierung muriner Vorläufer-B-Zellen in Antikörper-sezernierende Plasmazellen in vitro
Langfristig proliferierende, von Stromazellen und IL7 abhängige murine PräB-Zellen behalten ihr Potenzial zur Differenzierung in reifere Zellen der B-Zelllinie (Rolink et al., EMBO J., 10, 327–336, 1991), was in vitro erreicht werden kann. Diese Differenzierung kann in zwei Schritten durchgeführt werden, wobei zunächst die Differenzierung in Zellen mit einem unreifen B-Zell-Phänotyp und anschließend die Differenzierung in Zellen mit einem Phänotyp Antikörper-sezernierender Plasmazellen induziert wird.
Die erste Differenzierungsstufe wird erreicht, indem den PräB-Zellen in fortgesetzter Anwesenheit von Stromazellen das IL7 genommen wird. Hierfür werden PräB-Zellen aus proliferierenden Kulturen geerntet, drei mal mit serumfreiem PräB-Zellkultur-Medium ohne IL7 gewaschen und in einer Dichte von 1–2 × 10⁶ Zellen/ml auf frische, mit 3000 rad γ-bestrahlte Stromazellen in Abwesenheit von IL7 plattiert. Innerhalb einer Zeitdauer von 3 Tagen stellen die PräB-Zellen die Proliferation ein und differenzieren in Zellen mit einem Phänotyp unreifer B-Zellen. Die phänotypischen Veränderungen schließen z. B. den Verlust an der Expression von c-kit, λ₅ und V_preB und den Gewinn der Expression von CD25 und CD40 ein. In PräB-Zellen von Wildtyp- Mäusen wird diese Differenzierung ferner begleitet durch sequenzielle Umgruppierungen von V_H zu DJ_H auf den Genloci für die IgH-Kette, gefolgt von Umgruppierungen von V_L zu J_L auf den Genloci für die IgL-Kette, woraus die Expression Oberflächengebundener IgM-Antikörper auf den differenzierten Zellen der B-Linie resultieren kann (Rolink et al., EMBO J., 10, 327–336, 1991). Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass die geordnete Umgruppierung von IgH- und L-Gensegmenten keine Vorbedingung für die phänotypische Differenzierung dieser PräB-Zellen in vitro ist (Grawunder et al., Int. Immunol., 7, 1915–1925, 1995).
Die zweite Differenzierungsstufe kann erreicht werden, indem die von IL7 entkoppelten Zellen entweder mit einem agonistischen Anti-CD40-Antikörper oder LPS in Kombination mit Cytokinen, wie z. B. IL4, IL5, IL10 oder TGF-β, stimuliert werden. Diese Behandlung führt zur Induktion der Proliferation, der „Class-Switch"-Rekombination zu zahlreichen Ig-Gen-Isotypen (abhängig von der verwendeten Cytokinkombination), und schließlich zur Differenzierung in Antikörper-sezernierende Plasmazellen. Im Falle der Stimulation mit z. b. Anti-CD40/IL4 werden die Zellen drei mal mit PräB-Zell-Gewebekulturmedium gewaschen, und für eine Zeitdauer von 4 bis 6 Tagen auf frische, subkonfluent wachsende und mit 3000 rad γ-bestrahlte Stromazellen in Anwesenheit von 100 U/ml IL4 und 5 μg/ml monoklonalem Anti-CD40-Antikörper plattiert. Große proliferierende Zellen der Plasmazellstufe können aufgrund ihrer großen Abmessung, durch die deutlich erhöhte Werte für die Vorwärtsstreuung resultieren, mittels Fluoreszenz-aktiviertem Zellsortieren (FACS) identifiziert und getrennt werden.
Die Differenzierung von Wildtyp-PräB-Zellen in vitro geht gewöhnlich einher mit dem Verlust einer beträchtlichen Anzahl von Zellen aufgrund einer durch den Entzug von Wachstumsfaktoren induzierten Apoptose. Dieses Problem kann durch Überexpression von anti-apoptotischen Genen wie bcl-2 oder bcl-x_L in diesen Zellen umgangen werden (Rolink et al., J. Exp. Med., 178, 1263–1270, 1993). Dies kann erreicht werden, indem PräB-Zellen aus Mäusen isoliert werden, die über ein B-Zelllinien-spezifisch exprimiertes bcl-2 Transgen verfügen (Strasser et al., Curr. Top. Microbiol. Immunol., 166, 175–181, 1990), oder indem ein bcl-2 kodierender rekombinanter retroviraler Vektor in die langfristig proliferierenden, Stromazell- und IL7-abhängigen murinen PräB-Zellen transduziert wird (siehe unten).
Beispiel 3: Klonierung eines retroviralen Expressionskonstrukts zur murinen Bcl2-Überexpression
Eine Vorbedingung für die stabile Transduktion von Genen in langfristig proliferierende, von Stromazellen und IL7 abhängige murine PräB-Zellen ist die Herstellung eines rekombinanten retroviralen Transfervektors, der eine Expressionskassette für ein interessierendes Gen enthält. Retrovirale Transfervektoren bestehen aus retroviralen 5' und 3' langen endständigen Wiederholungssequenzen (LTR), die ein retrovirales Verpackungssignal Psi(+) flankieren, eine multiple Klonierungsstelle (MCS), in die heterologe Sequenzen insertiert werden können, und bakterielle Plasmid-Kontrollelemente, die für die Replikation und Aufrechterhaltung des Vektors in E. coli erforderlich sind. Ein Beispiel für einen leeren retroviralen Transfervektor ist das handelsüblich erhältliche Plasmid pLIB (Clontech) (11a).
Zur Konstruktion eines retroviralen, das anti-apoptotische Gen bcl-2 enthaltenden Expressionsmarkers wird eine Strategie zur Co-Expression der murinen bcl-2 cDNA und des Antibiotika-Selektionsmarkers HygromycinB angewendet, bei der eine Verknüpfung der Expression von bcl-2 und HygromycinB unter Verwendung einer internen ribosomalen Eintrittssequenz (IRES) erfolgt, wodurch die simultane Expression zweier Gene von einem einzigen Promotor ermöglicht wird. Mit dieser Strategie wird die stabile Integration des Vektorkonstrukts, welches mit dem Antibiotikum HygromycinB selektiert werden kann, gleichzeitig zur Selektion von Zellen für die Expression des antiapoptotischen Gens bcl-2 führen. Die Erstellung des retroviralen Vektors für die gekoppelte Expression der cDNAs für bcl-2 und HygromycinB erfolgt in zwei Stufen. Zuerst erfolgt der Zusammenbau der aus Promotor, bcl-2, IRES und HygromycinB bestehenden Expressionskassette, und anschließend erfolgt die Klonierung dieser Kassette in die MCS des retroviralen Transfervektors pLIB (11a + b).
(a) Herstellung der Promotor/bcl-2/IRES/HygromycinB-Expressionskassette
Sowohl die murine bcl-2 cDNA als auch der offene Leserahmen (ORF) für den Antibiotika-Resistenzmarker HygromycinB werden in den handelsüblich erhältlichen CMV-Promotor/IRES-Vektor pIRES (Clontech) kloniert. Hierfür wird der ORF von HygromycinB aus dem Plasmid pPGK-hygro (SEQ ID Nr. 1) mittels Polymerase-Kettenreaktion (PCR) unter Verwendung des folgenden Primerpaares amplifiziert:
wobei diese zusätzliche Restriktionsenzym-Erkennungsstellen (in Großbuchstaben angegeben) für die Restriktionsendonukleasen XbaI und NotI (2–4 zufällige Nukleotide 5' der Restriktionsenzym-Erkennungssequenz sind auch hinzugefügt, da die meisten Restriktionsenzyme DNA nicht effizient spalten, wenn die Erkennungssequenz direkt am Ende der mittels PCR amplifizierten DNA-Fragmente lokalisiert ist. Diese flankierenden Nukleotide sind in Kleinbuchstaben angegeben, um die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen hervorzuheben. Die stromabwärts oder 3' der hervorgehobenen Restriktionsstellen befindlichen Sequenzen korrespondieren mit DNA-Sequenzen des zu amplifizierenden Fragments. Diese Art der Darstellung von Primersequenzen wird über die gesamte Beschreibung der experimentellen Beispiele beibehalten. Eine PCR mit den Primern P001 und P002 führt zur Amplifikation eines DNA-Fragments von 1017 Basenpaaren (Bp) mit einmaligen Erkennungsstellen für die Restriktionsendonukleasen XbaI und NotI an den Enden des Fragments. Das PCR-Fragment wird anschließend mit den Restriktionsenzymen XbaI und NotI doppelt geschnitten und anschließend direktional in das mit XbaI/NotI doppelt gespaltene Plasmid pIRES kloniert, um das Plasmidkonstrukt pIRES-hygroB zu bilden (11a). Der ORF der murinen bcl-2α cDNA wird aus mRNA der Milz einer Maus mittels Reverser Transkriptase-gekoppelter Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) isoliert und amplifiziert, wobei die folgenden auf der Grundlage der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzen M16506 und L31532 erstellten Primer verwendet werden (Primer P003 bindet an Position 1821-53 von M16506, und der Primer P004 bindet an die Position 506-535 von L31532):
die Restriktionsenzym-Schnittstellen (in Großbuchstaben) für NheI und MluI enthalten. Zur Schaffung von pBcl2-IRES-hygroB wird ein mit NheI/NotI doppelt gespaltenes PCR-Produkt mit einer Größe 699 Bp direktional in den mit NheI/MluI doppelt geschnittenen Vektor pIRES-hygroB kloniert.
(b) Herstellung eines retroviralen, Bcl-2 exprimierenden Transfervektors
Aufgrund des Mangels an kompatiblen Restriktionsenzymstellen in der multiplen Klonierungsstelle des leeren retroviralen Transfervektors pLIB und dem dualen bcl-2/HygromycinB-Expressionsvektor pBcl2-IRES-hygroB wird die gesamte Expressionskassette für Bcl-2-IRES-HygromycinB einschließlich des konstitutiven CMV-Promotors und der Polyadenylierungsstelle unter Anwendung von PCR mit geeigneten Restriktionsenzym-Erkennungsstellen in pLIB kloniert. Hierfür wird die CMV-bcl2-IRES-HygromycinB-Expressionskassette mittels PCR unter Verwendung von pBcl2-IRES-hygroB als PCR-Template und der folgenden Primer amplifiziert:
die Restriktionsenzym-Erkennungsstellen für SalI und ClaI (in Großbuchstaben) enthalten. Anschließend wir ein mit SalI/ClaI doppelt verdautes PCR-Produkt von 3714 Bp direktional in den mit SalI/ClaI doppelt gespaltenen pLIB-Vektor kloniert, wodurch der retrovirale Transfervektor pLIB-bcl2-IRES-hygroB generiert wird, der die gekoppelte Expression von bcl-2 und HygromycinB ermöglicht.
Beispiel 4: Retrovirale Transduktion langfristig proliferierender, Stromazell- und IL7-abhängiger muriner PräB-Zellen
Einer der Wege zum stabilen Transfer von genetischen Elementen in murine PräB-Zellen liegt in der retroviralen Transduktion (8). Hierfür wird ein rekombinantes DNA-Konstrukt, welches die für die Verpackung eines retroviralen Genoms erforderlichen retroviralen Sequenzen (5'LTR, Verpackungssignal Psi(+), 3'LTR) als auch heterologe Sequenzen oder Gene von Interesse enthält, transient oder stabil in eine Verpackungszelllinie transfiziert, die konstitutiv die für die Produktion retroviraler Partikel erforderlichen Gene exprimiert.
Für die Transduktion Stromazell- und IL7-abhängiger muriner PräB-Zellen kann die ökotrope retrovirale Verpackungs-Zelllinie GPE (Markowitz et al., J. Virol., 62, S. 1120–1124, 1988) verwendet werden, welche routinemäßig zu einer stabilen Transduktion von PräB-Zellen mit Effizienzen von 50–80% führt. Diese ökotrope Verpackungszelllinie in Verbindung mit (rekombinanten) retroviralen Transfervektoren wird lediglich zur Bildung von replikationsdefizienten (rekombinanten) Retroviren führen, die in der Lage sind, murine Zellen zu transduzieren. Für die transiente Transfektion der ökotropen GPE-Verpackungszelllinie wird, wie nachfolgend detailliert beschrieben, die Standartmethode zur Transfektion mittels Kalziumphosphat angewendet:
(a) Transiente Transfektion der ökotropen retroviralen Verpackungszelline GPE
GPE-Zellen werden kultiviert in einem auf IMDM basierenden Medium mit geringem Serumgehalt, das auch für die Stromazellen ST-2 und PA-6 verwendet wurde und in Beispiel 1 beschrieben worden ist. Einen Tag vor der Transfektion werden adhärierende GPE-Verpackungszellen mittels Trypsinierung geerntet und mit einer Konfluenz von 50% in frisches, auf IMDM basierendes Medium mit geringem Serumgehalt überführt und bei 37°C in Anwesenheit von 10% CO₂ kultiviert. Am folgenden Tag wurden 20 μg retrovirale DNA pro T75 (75 cm²)-Gewebekulturflasche mit GPE-Zellen unter Anwendung der Standardfällung mit Kalziumphosphat transfiziert. 24 Stunden nach der Transfektion können die transfizierten GPE-Zellen zur Transduktion rekombinanter Retroviren in PräB-Zellen verwendet werden.
(b) Retrovirale Transduktion von PräB-Zellen unter Verwendung eines Kulturüberstandes transfizierter GPE-Zellen oder durch Co-Kultur mit transfizierten GPE-Zellen
Für die Transduktion mittels transfizierter GPE-Zellen hergestellter rekombinanter Retroviren können wahlweise zwei Verfahren angewendet werden. Das erste Verfahren basiert auf der Infektion von PräB-Zellen mit konditioniertem Zellkulturüberstand. Hierfür wird das Zellkulturmedium von transfizierten GPE-Zellen 24 Stunden nach der Transfektion ersetzt und nach weiteren 24 Stunden Zellkultur geerntet. Der rekombinante Retroviren enthaltende Zellkulturüberstand wird anschließend Kulturen proliferierender PräB-Zellen in den Verhältnissen von 1 : 8 (Vol.) bis 1 : 1 (Vol.) in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren zugegeben, und die Inkubation wird 3 bis 6 Stunden lang bei 37°C fortgeführt. Anschließend werden die Zellen geerntet, das Polybren/Retroviren enthaltende Medium wird entfernt, und die Zellen werden in einer Dichte von 1–2 × 10⁵ auf frische, mit 3000 rad γ-bestrahlte Stromazellen in PräB-Zellmedium enthaltend 100 U rlL7 plattiert. Retroviral transduzierte PräB-Zellen werden dann 24 Stunden später geerntet.
Das zweite Verfahren basiert auf der Co-Kultur von PräB-Zellen mit transfizierten, rekombinante Retroviren produzierenden GPE-Zellen. Hierfür werden PräB-Zellen in der log-Phase geerntet und in frischem PräB-Zellkulturmedium enthaltend 100 U rlL7 und 8 μg/ml Polybren in einer Dichte von 2–4 × 10⁵ Zellen resuspendiert und 24 Stunden nach der Transfektion mit retroviralen Konstrukten auf transfizierte GPE-Zellen plattiert. Die PräB-Zellen werden 6 Stunden lang bei 37°C co-kultiviert, anschließend geerntet und auf frische, mit 3000 rad γ-bestrahlte Stromazellen in PräB-Zellmedium enthaltend 100 U rlL7 für die Wiedergewinnung plattiert. Retroviral transduzierte PräB-Zellen werden anschließend geerntet und können 24 Stunden später verwendet werden.
Beispiel 5: Inaktivierung endogener Immunglobulin-Genloci für die leichte und schwere Kette in langfristig proliferierenden murinen Vorläufer-B-Zellen
Der erste Schritt zur Generierung heterologer, vorzugsweise humaner Antikörper von murinen Vorläufer-B-Zellen ist die Inaktivierung der endogenen murinen IgH und IgL, was unter anderem z. B. durch Gene-Targeting innerhalb des Immunglobulin-Genlocus in PräB-Zellen erreicht werden kann. Theoretisch wäre es erforderlich, sämtliche drei murinen Immunglobulin-Genloci zu inaktivieren, d. h. die Genloci für die Ketten IgH, IgκL und IgλL. Der murine Genlocus für die Kette λL umfasst jedoch lediglich drei funktionelle V-J-C Cluster mit jeweils einem Gensegment, und λL-Ketten verfügen nur über eine sehr eingeschränkte Diversität. Darüber hinaus exprimieren weniger als 5% muriner B-Zellen die Genloci der λL-Kette. In praktischer Hinsicht reicht es daher aus, die endogenen murinen Genloci für die IgH- und κL-Kette zu inaktivieren um sicherzustellen, dass die überwiegende Mehrzahl der von PräB-Zellen gebildeten B-Zellen (> 95%) durch den Transfer heterologer Gene oder Genloci für die IgH- und IgκL-Kette heterologe Antikörper exprimieren.
(a) Isolierung von PräB-Zellen mit natürlicherweise auftretenden, irreversibel unfunktionellen IgH-Allelen
Im Allgemeinen ist der am besten kontrollierte Weg zur Inaktivierung der endogenen Genloci für die IgH- und κL-Kette die Anwendung des Gene-Targeting (siehe unten). Im Falle des Genlocus für die IgH-Kette kann jedoch ein anderes Verfahren angewendet werden:
Langfristig proliferierende, Stromazell- und IL7-abhängige murine PräB-Zellen tragen auf beiden ihrer Allele für die schwere Kette DJ_H-Umgruppierungen. Aufgrund einer Ungenauigkeit beim Verbinden von D mit J_H können diese DJ_H-Umgruppierungen derart vorkommen, dass D-Gensegmente in sämtlichen drei möglichen Leserahmen in Relation zum festgelegten Leserahmen des J_H-Gensegments gelesen werden können. Diese Leserahmen sind zufällig als Leserahmen 1, 2 und 3 bezeichnet worden (Kaartinen und Mäkelä, Immunol. Today, 6, S. 324–330, 1985). Die meisten D-Gensegmente enthalten Stopcodons, wenn es im Leserahmen III zu DJ_H-Verknüpfungen kommt (Kaartinen und Mäkelä, s. o.), sodass von einem derartigem Allel für die schwere Kette niemals eine funktionelle H-Kette exprimiert werden kann.
Statistisch gesehen weisen daher ungefähr 1/9 (11,1%) aller Stromazell- und IL7-abhängigen PräB-Zellen auf beiden ihrer Allele für die IgH-Kette DJ_H-Umgruppierungen im Leserahmen III mit Stopkodierung auf. Diese PräB-Zellen können durch Subklonierung unter Anwendung von Grenzverdünnungen isoliert und hinsichtlich der gewünschten nicht-funktionalen Umgruppierungen einem Screening unterzogen werden. Um die Isolierung stabiler Klone sicherzustellen, müssen die Umgruppierungen hinsichtlich zweier nicht-funktionaler DJ_H4-Genumgruppierungen, welche nicht durch sekundäre Umgruppierungen revertiert werden können, untersucht werden, da das letzte J_H-Gensegment verbraucht worden ist. Derartige Klone können für weitere zielgerichtete Inaktivierung der Allele für die κL-Kette eingesetzt werden.
(b) Herstellung von Targeting-Konstrukten für die murinen Loci der IgH- und IgκL-Kette
Zur Inaktivierung der beiden endogenen Genloci für die IgH- und IgκL-Kette werden zwei Verfahren als Beispiele für viele cis-agierende Mutationen vorgestellt, die in gleicher Weise zu PräB-Zellen ohne das Potenzial zur Expression endogener Proteine der IgH- und IgκL-Kette führen würden (5a, b). Für beide Targeting-Strategien müssen zunächst leere positiv/negative Vektoren für das Gene-Targeting hergestellt werden, die einmalige Klonierungsstellen, welche die Insertion von DNA- Sequenzen ermöglichen, die homolog zum Target-Genlocus sind, einen positiven Arzneimittel-Selektionsmarker, wie Neomycin oder Puromycin, flankiert von loxP-Stellen, und einen negativen Selektionsmarker, wie Diphtherie-Toxin, oder Herpes Simplex Virus Thymidin-Kinase (HSV-tk), enthalten, wodurch gegen zufällige Integration des Gene-Targeting-Vektors in das Genom von Zellen selektiert wird. Die Anwesenheit eines von loxP flankierten ('gefloxten') positiven Selektionsmarkers erlaubt das sequenzielle Gene-Targeting beider Allele in demselben Zellklon unter Verwendung desselben Antibiotikums, da der Antibiotika-Resistenzmarker nach erfolgreichem Targeting des ersten Allels durch transiente Expression von cre-Rekombinase aus Zellen deletiert werden kann, wobei die Rekombinase jedwede Nukleotidsequenz deletiert, die sich zwischen den betreffenden loxP-Erkennungsstellen befindet. Die leeren positiv/negativen Targeting-Vektoren werden wie folgt hergestellt (6a, b):
Schritt 1: Verlängerung der multiplen Klonierungsstelle von pBluescript SK(+)
Zwei komplementäre synthetische DNA-Oligomere:
werden anneliert durch Mischen von 100 pmol eines jeden Oligomers mit 50 μl 50 mM Tris/HCl, 100 mM NaCl, pH-Wert 8,0. Diese Mischung wird anschließend 2 Minuten lang bei 95°C denaturiert und innerhalb von 20 Minuten langsam von 65°C auf Raumtemperatur abgekühlt. Hierdurch werden die folgenden doppelsträngigen DNA-Linker mit kompatiblen Überhängen für XhoI und KpnI (in Großbuchstaben) gebildet:
Der annelierte synthetische DNA-Linker wird anschließend in den mit XhoI und KpnI linearisierten, handelsüblich erhältlichen pBlueskriptSK(+)-Vektor (Stratagene) ligiert, wodurch das Plasmid pBSL geschaffen wird, welches eine für die folgenden Klonierungsschritte erforderliche verlängerte multiple Klonierungsstelle (MCS+, siehe 6a) enthält.
Schritt 2: Insertion von Expressionskassetten für das Diphtherie-Toxin α in der Wildtyp- oder attenuierten Form als negativer Selektionsmarker gegen zufällige Integration von Targeting-Konstrukten
Als negativer Selektionsmarker, der die Selektion gegen zufällige chromosomale Integration von Gene-Targeting-Konstrukten ermöglicht, kann eine Expressionskassette für das Diphtherie-Toxin α (McCarrick et al., s. o.) oder seine attenuierte Version, Diphtherie-Toxin α (DT-αtox176) (Maxwell et al., s. o.) unter der Kontrolle eines konstitutiven β-Actin-Promotors verwendet werden. Obgleich bei Gene-Targeting-Experimenten mit murinen embryonalen Stammzellen häufig andere negative Selektionsmarker, wie das Gen für die Thymidin-Kinase des Herpes Simplex Virus (HSV-tk), verwendet werden, haben sich das Diphtherie-Toxin α und seine attenuierte Mutante tox176 als wirksam für das Gene-Targeting in somatischen Zellen erwiesen (Grawunder et al., Mol. Cell, 2, S. 477–484, 1998). Die Expressionskassetten für das Diphtherie-Toxin werden als 2,1 kb BglII-XbaI-Fragmente aus den Plasmiden pBS-DT4 (SEQ ID Nr. 2) oder pBS-DT4tox176 (SEQ ID Nr. 3; S. 6a) isoliert und in den mit BglII und NheI linearisierten Vektor pBSL ligiert, wodurch die Plasmide pBSL-DT4 bzw. pBSLDT4tox176 gebildet werden (s. 6a).
Schritt 3: Insertion der mit loxP flankierten positiven Antibiotika-Selektionsmarker in pBSL-DT4 und pBSLDT4tox176 zur Herstellung leerer Gene-Targeting-Vektoren
Der nächste Schritt zur Schaffung positiv/negativer Vektoren zum Gene-Targeting besteht in der Insertion eines positiven Antibiotika-Selektionsmarkers in den Vektor pBSL-DT4 oder pBSL-DT4-tox176 stromaufwärts der Diphtherie-Expressionskassette. Als repräsentative Beispiele wird die Insertion von mit loxP flankierten Expressionskassetten für Neomycin, Puromycin und HygromycinB stromaufwärts der Expressionskassette für das Diphtherie-Toxin α in pBSL-DT4 vorgestellt. Es wird jedoch darauf hingewiesen, dass identische Strategien zur Klonierung auf den Vektor pBSL-DT4tox176, der die attenuierte Version des Diphtherie-Toxins α enthält, angewendet werden können. Darüber hinaus können andere positive Antibiotika-Selektionsmarker eingesetzt werden, die Resistenz gegenüber z. B. Histidinol, Mycophenolsäure, Bleomycin oder Zeocin verleihen.
In jedem Fall wird die Kassette für den positiven Antibiotika-Selektionsmarker im Hinblick auf die sequenzielle Verwendung desselben Selektionsmarkers von loxP-Stellen flankiert, die von dem cre-Rekombinaseenzym erkannt werden können, und die zur Deletion des zwischen den loxP-Stellen lokalisierten Antibiotika-Selektionsmarkers im Wege der transienten Transfektion eines cre-Rekombinase-Expressionsvektors verwendet werden können.
i) Insertion einer 'gefloxten' Neomycin-Resistenz-Kassette
Eine mit loxP flankierte Neomycin-Resistenz-Kassette kann aus dem Plasmid pGL2neo(m)+ (SEQ ID Nr. 4) als ein 1497 Bp langes, mit XbaI und Bsp120I gespaltenes DNA-Fragment isoliert und zur Schaffung des leeren Targeting-Vektors pBSL-flneo-DT4 in das mit NotI und XbaI linearisierte Plasmid PBSL-DT4 ligiert werden.
ii) Klonierung der 'gefloxten' Puromycin- und HygromycinB-Kassetten (6b)
Da außer Neomycin nur selten andere 'gefloxte' Antibiotika-Selektionsmarker angetroffen werden, ist der präparative Schritt der Insertion von zwei loxP-Stellen ein essentieller Schritt für die Insertion von mit loxP flankierten Puromycin- oder HygromycinB-Markern in pBSL-DT4. Dies kann durch Insertion von annelierten synthetischen DNA-Oligomeren in pBSL-DT4 erreicht werden. Die synthetischen loxP-Stellen sind in den folgenden zwei komplementären DNA-Oligos enthalten:
Diese beiden DNA-Oligomere werden, wie in Beispiel 5(b), Schritt 1, beschrieben, anneliert, was zu einem doppelsträngigen DNA-Fragment führt, welches zwei loxP-Stellen enthält, die durch eine einmalige MluI-Restriktionsstelle getrennt sind. Zusätzlich enthalten die annelierten synthetischen DNA-Oligomere zwei 5'-CTAG einzelsträngige Überhänge, welche direkt in kompatible Restriktionsstellenüberhänge (generiert durch Restriktionsenzyme wie z. B. SpeI, NheI, XbaI oder AvrII) ligiert werden können.
Das annelierte, eine doppelte loxP-Stelle enthaltende DNA-Fragment wird anschließend unter Bildung des Vektors pBSL-DT4-2loxP in den mit SpeI linearisierten Vektor pBSL-DT4 ligiert (6b).
Die Expressionskassetten für Resistenz gegenüber Puromycin oder HygromycinB können unter Verwendung der Plasmide pPur (Clontech) bzw. pPGK-hygro (SEQ ID Nr. 1) als PCR-Templates mittels PCR amplifiziert werden. Die zur PCR-Amplifikation der 1366 Bp großen Expressionskassette für Puromycin aus pPur (enthaltend den ORF für Puromycin unter Kontrolle des frühen SV40 Promotors) verwendeten Primer sind:
Beide Primer enthalten Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuklease MluI (angegeben in Großbuchstaben), sodass das resultierende PCR-Produkt unter Verwendung dieses Restriktionsenzyms kloniert werden kann.
Nach einem Verdau des isolierten PCR-Produkts mit MluI wird das Puromycin-Markerfragment unter Schaffung des leeren Targeting-Vektors pBSL-flpur-DT4 in das mit MluI linearisierte Plasmid pBSL-DT4-2loxP ligiert (6b).
Die zur PCR-Amplifikation der 2007 Bp großen HygromycinB-Expressionskassette aus pPGK-hygro (SEQ ID Nr. 1; enthaltend den ORF für HygromycinB unter Kontrolle des Promotors für Phosphoglyceratkinase) verwendeten Primer sind:
Beide Primer enthalten Erkennungsstellen für die Restriktionsendonuklease MluI (angegeben in Großbuchstaben), sodass das resultierende PCR-Produkt unter Verwendung dieses Restriktionsenzyms geschnitten und ligiert werden kann.
Nach einem Verdau des isolierten PCR-Produkts mit MluI wird das HygromycinB-Markerfragment unter Schaffung des leeren Targeting-Vektors pBSL-flhyg-DT4 in das mit MluI linearisierte Plasmid pBSL-DT4-2loxP ligiert (6b).
Schritt 4: Klonierung der endgültigen Targeting-Vektoren für murine IgH- und κL-Genloci, als auch für das Gen RAG1
Als repräsentative Beispiele für die Klonierung von Targeting-Vektoren für endogene Genloci werden die Klonierungsstrategien für Gene-Targeting-Vektoren beschrieben, die für die cis-agierende zielgerichtete Mutation der endogenen IgH- und IgκL-Genloci sowie für die trans-agierende Mutation des Gens RAG1 in murinen PräB-Zellen geeignet sind.
i) Herstellung von Targeting-Vektoren für die IgH-Kette (5a)
Die Inaktivierung des endogenen murinen Genlocus für die IgH-Kette in PräB-Zellen kann durch Schaffung vieler unterschiedlicher cis-agierender zielgerichteter Deletionen auf beiden Allelen der IgH-Kette erreicht werden. Eine der Deletionen zur Inaktivierung von IgH ist beispielsweise die Deletion sämtlicher D_H- und J_H-Gensegmente, was vorliegend als eine der Möglichkeiten beschrieben wird, um die Unfähigkeit endogener IgH-Allele zur Herstellung endogener Immunglobuline zu erreichen. Die Konstruktion von Targeting-Vektoren wird hier unter beispielhafter Verwendung eines „gefloxten" Neomycin-Targeting-Konstrukts vorgestellt (siehe 5a). Zur Klonierung von Vektoren für das Gene-Targeting, die andere positive Antibiotika-Selektionsmarker wie z. B. Puromycin oder HygromycinB enthalten, können ähnliche Strategien angewendet werden.
Von Stromazellen und IL7 abhängige murine PräB-Zellen tragen gewöhnlich DJ_H-Umgruppierungen auf beiden Allelen (siehe oben), was beim Design von Targeting-Vektoren berücksichtigt werden muss. Unabhängig von dem Typ der DJ_H-Umgruppierung sind die DNA-Sequenzen, die die variablen Gensegmente und das Cluster für das D-Gensegment intervenieren, wie auch die intervenierenden Sequenzen zwischen dem J_H-Gencluster und der für Cμ kodierenden Region in sämtlichen PräB-Zellen immer noch auf beiden IgH-Allelen vorhanden. Targeting-Vektoren für DJ_H-umgruppierte Allele müssen daher stromaufwärts der meisten 5' lokalisierten D-Elemente (D_FL16.1) und stromabwärts der meisten 3' lokalisierten J_H-Gensegmente (J_H4) Homologieregionen aufweisen.
Die genomische Organisation eines möglichen D_FL16.1-J_H4 umgruppierten Allels mit umgebenden genomischen DNA-Sequenzen ist in 5a dargestellt. Als allgemeine Strategie für das Gene-Targeting wird eine stromaufwärts der bzw. des zu deletierenden Region oder Gens lokalisierte kurze Region mit DNA-Sequenzhomologie (1–1,5 kb) in eine einmalige Restriktionsenzym-Erkennungsstelle stromaufwärts eines 'gefloxten' positiven Selektionsmarkers (hier NotI) kloniert, und eine längere, stromabwärts der bzw. des zu deletierenden Region oder Gens lokalisierte Region mit DNA-Sequenzhomologie (> 2,5 kb) wird in eine zwischen dem 'gefloxten' positiven Selektionsmarker und der Expressionskassette für das Diphtherie-Toxin α lokalisierte Restriktionsenzym-Erkennungsstelle (5a) (hier AscI) kloniert. Die Expression des negativen Selektionsmarkers (Diphtherie-Toxin α) wird daher nur dann verhindert, wenn es zwischen der langen Region der DNA-Sequenzhomologie des Targeting-Vektors und dem endogenen Genlocus zu einer homologen Rekombination kommt, wodurch die Expressionskassette für DT-α im Wege der zielgerichteten Integration des Targeting-Vektors in die chromosomale DNA verloren geht. Wenn es ferner zu einer homologen Rekombination in dem kurzen Homologiearm kommt, wird die zwischen dem doppelten Crossing Over lokalisierte Region durch den positiven Antibiotika-Selektionsmarker ersetzt. Daher führt die Antibiotika-Selektion bei PräB-Zellen, die mit dem Targeting-Konstrukt transfiziert worden sind, zu einer starken Selektion hinsichtlich der zielgerichteten Integration des Targeting-Vektors mittels homologer Rekombination und damit zur Deletion des endogenen Genlocus.
Eine kurze Homologieregion stromaufwärts der meisten 5' lokalisierten D-Elemente (D_FL16.1) kann mittels PCR aus der murinen genomischen DNA unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert werden, die auf der in der NCBI-Genbank publizierten Sequenz AF018146 basieren:
Die Nukleotide der für Klonierungszwecke angefügten NotI-Restriktionsenzym-Erkennungsstellen sind in Großbuchstaben angegeben. Die Primer führen zur Amplifikation eines genomischen PCR-Fragments mit einer Größe von 1465 Bp, welches mit dem Restriktionsenzym NotI verdaut und unter Bildung von pBSL-5'J_H-flneo-DT4 in das mit NotI linearisierte Plasmid pBSL-flneo-DT4 ligiert werden kann (5a). Der lange Bereich an Sequenzhomologie stromabwärts des J_H-Gensegmentclusters, welches auch den Intron-Enhancer EμH für die schwere Kette umfasst, kann mittels PCR aus muriner genomischer DNA unter Verwendung der folgenden Primer amplifiziert werden, die auf der Basis des in der NCBI-Genbank publizierten Sequenzeintrags J00440 gebildet worden sind (die Nukleotide der angefügten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle AscI sind in Großbuchstaben angegeben):
Die Primer führen zur PCR-Amplifikation eines 3215 Bp großen genomischen PCR-Fragments aus muriner genomischer DNA, das mit dem Restriktionsenzym AscI verdaut und zur Schaffung des endgültigen J_H-Targeting-Vektors pBSL-5'J_H-flneo-3'J_H-DT4 in das mit AscI linearisierte Plasmid pBSL-5'J_H-flneo-DT4 ligiert werden kann, wobei der endgültige Vektor zur Deletion sämtlicher verbleibender D_H- und J_H-Gensegmente in DJ_H-umgruppierte PräB-Zellen verwendet werden kann (5a).
ii) Herstellung von Targeting-Vektoren für die κL-Kette (5b)
Wie im Falle des Locus für die IgH-Kette können die Genloci für die κL-Kette durch verschiedene cis-agierende Mutationen, einschließlich z. B. Deletionen sämtlicher J_κ-Gensegmente, des Intron-Enhancers für die κL-Kette (κiE), der konstanten Region der κL-Kette (C_κ), oder des 3'κ-Enhancer (3'κE), inaktiviert werden. Als Beispiel werden vorliegend Targeting-Konstrukte und Methoden beschrieben, die für die zielgerichtete Deletion sämtlicher J_κ-Gensegmente eingesetzt werden können. Darüber hinaus erfolgt die vorliegende Beschreibung der Konstruktion von Targeting-Konstrukten lediglich für Targeting-Konstrukte, die einen 'gefloxten' Neomycin-Resistenzmarker enthalten. Die Klonierung von Targeting-Konstrukten, die 'gefloxte' Puromycin- oder HygromycinB-Expressionskassetten enthalten, erfolgt in analoger Weise. Ein kurzer Homologiebereich stromaufwärts des J_κ-Gensegmentclusters wird mittels PCR aus muriner genomischer DNA amplifiziert und unter Verwendung der folgenden Primer, die entsprechend des in der NCBI-Genbank publizierten Eintrages V00777 geschaffen wurden (die für Klonierungszwecke verwendeten Nukleotide der angefügten Restriktionsenzym-Erkennunsstelle NotI sind in Großbuchstaben angegeben):
Der Primer P019 bindet an die Position 1–30, und der Primer P020 bindet an die Position 711–738 des Eintrags V00777 der NCBI-Genbank. Das resultierende PCR-Fragment mit einer Größe von 738 Bp wird mit dem Restriktionsenzym NotI gespalten und unter Schaffung des Vektors pBSL-5'J_κ-flneo-DT4 in den mit NotI linearisierten leeren Targeting-Vektor pBSL-flneo-DT4 ligiert (5b). Der lange Bereich mit DNA-Sequenzhomologie stromabwärts des J_κ-Gensegmentclusters, umfassend κiE und die konstante Region für die κL-Kette (Cκ), wird mittels PCR aus muriner genomischer DNA amplifiziert unter Verwendung der folgenden Primer, die auf der Basis des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Eintrags V00777 geschaffen worden sind (die Nukleotide der angefügten Restriktionsenzym-Erkennungsstelle für AscI sind in Großbuchstaben angegeben):
Der Primer P021 bindet an die Position 2129–2158, und der Primer P022 an die Position 5456–5483 der NCBI-Genbank-Sequenz V00777. Das resultierende PCR-Fragment mit einer Größe von 3379 Bp wird mit dem Restriktionsenzym AscI gespalten und unter Schaffung des Vektors pBSL-5'J_κ-flneo-3'J_κ-DT4 in den mit AscI linearisierten Vektor pBSL-5'J_κ-flneo-DT4 ligiert (5b).
iii) Herstellung eines Targeting-Vektors für den RAG-Locus (5c)
Als Alternative zur Inaktivierung des Potenzials von PräB-Zellen zur Expression endogener Immunglobuline durch Einführung cis-agierender Mutationen in die Genloci der IgH- und IgκL-Kette können PräB-Zellen durch Einführung trans-agierender Mutationen dahingehend verändert werden, dass sie nicht mehr in Lage sind, eine Umgruppierung ihrer endogenen Ig-Gene durchzuführen. Dies kann beispielsweise durch zielgerichtetes Aufspüren eines der beiden die Rekombination aktivierenden (RAG) Gene erfolgen, die für die Umgruppierungen von Ig-Genen essentiell sind. Murine PräB-Zellen mit Deletionen in einem der Gene RAG-1 oder RAG-2 werden zur Umgruppierung von Immunglobulin-Gensegmenten nicht befähigt sein und sind daher nicht in der Lage, endogene Immunglobuline zu exprimieren.
Als Beispiel wird die Herstellung eines Targeting-Vektors beschrieben, welcher die vollständige Deletion des ORFs für das Gen RAG-1 ermöglicht. Ein kurzer Bereich mit DNA-Sequenzhomologie von etwa 1 kb der genomischen Sequenz stromaufwärts der für RAG-1 kodierenden Region wird amplifiziert unter Verwendung des auf der Basis der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz AC084753 geschaffenen Primerpaares:
Die an das 5'-Ende eines jeden Primers angefügten NotI-Klonierungsstellen sind in Großbuchstaben angegeben und werden verwendet für die Klonierung eines PCR-Fragments von 1095 Bp, das die genomische Region stromaufwärts des offenen Leserahmens für RAG-1 enthält (5c). Das PCR-Produkt wird mit NotI gespalten und in die einmalige NotI-Stelle eines positiv/negativen Targeting-Vektors wie z. B. pBSL-flneo-DT4 ligiert. Ein Plasmidklon, der den kurzen Homologiebereich stromaufwärts der für RAG-1 kodierenden Region in richtiger Orientierung enthält, wird isoliert und mit pBSL-5'R1-flneo-DT4 bezeichnet.
Zur Klonierung des langen Bereiches eines Targeting-Konstrukts für das Gen RAG-1 wird eine direkt stromabwärts der für RAG-1 kodierenden Region gelegene genomische Region von ungefähr 3 kb (5c) unter Verwendung des auf Basis der Genbank-Sequenz AC084753 geschaffenen folgenden Primerpaares amplifiziert:
Die Erkennungssequenzen für das Restriktionsenzym AscI werden an das 5'-Ende eines jeden Primers angefügt und zur Klonierung des 2954 Bp langen PCR-Fragments verwendet, welches den langen DNA-Sequenzhomologiebereich stromabwärts des offenen Leserahmens für RAG-1 enthält. Nach Spaltung mit AscI wird dieses PCR-Produkt in die einmalige Schnittstelle AscI des Vektors pBSL-5'R1-flneo-DT4 kloniert. Ein Plasmidklon, der den langen Homologiebereich stromabwärts der für RAG-1 kodierenden Region in korrekter Orientierung enthält, wird isoliert und mit pBSL-5'R1-flneo-3'R1-DT4 bezeichnet (5c) und kann direkt zur zielgerichteten Deletion des endogenen Gens RAG-1 in PräB-Zellen verwendet werden.
Schritt 5: Targeting endogener Genloci in langfristig proliferierenden, Stromazell- und IL7-abhängigen murinen PräB-Zellen
Für die sequenzielle, zielgerichtete Deletion beider Allele eines endogenen Genlocus können zwei unterschiedliche Strategien angewendet werden. Eine Strategie besteht in der Verwendung von Targeting-Vektoren mit zwei unterschiedlichen positiven Selektionsmarkern für das Targeting der beiden unterschiedlichen Allele. Alternativ besteht eine andere Strategie in der zweifachen Verwendung desselben Targeting-Konstrukts für das sequenzielle Targeting beider endogenen Allele. Im Falle der letztgenannten Strategie muss dem Targeting des ersten Allels jedoch die transiente Expression eines Expressionsvektors für cre-Rekombinase in PräB-Zellen erfolgen, was zur dauerhaften Deletion des mit loxP flankierten Antibiotika-Selektionsmarkers führt, sodass dieselbe Antibiotika-Selektion für das zweite Targeting des anderen Allels angewendet werden kann.
Als Beispiel wird die experimentelle Vorgehensweise für das sequenzielle Targeting beider Allele eines endogenen Gens entsprechend der ersten Strategie beschrieben, d. h. unter Verwendung von Targeting-Vektoren mit zwei unterschiedlichen Antibiotika-Resistenzmarkern (Puromycin und HygromycinB).
Zum Targeting eines Genlocus auf dem ersten Allel werden 20 μg eines linearisierten Targeting-Vektors mit einem Puromycin-Resistenzmarker zur Transfektion von 10⁷ in PBS resuspendierten PräB-Zellen verwendet, durch Elektroporation bei 350 V mit einer Kapazität von 960 μF unter Verwendung eines Elektroporators von BioRad und einer 0,4 cm Eletroporator-Küvette. Die Zellen werden anschließend in einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in Wachstumsmedium mit IL7 in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen überführt, die mit einer subkonfluenten Schicht von mit 3000 rad bestrahlten, gegenüber Puromycin resistenten ST-2-Stromazellen beschichtet sind. 30 Stunden nach der Transfektion wird Puromycin in einer Endkonzentration von 2 μg/ml zugegeben. Gegenüber Puromycin resistente Kolonien werden 7–10 Tage nach der Transfektion isoliert und auf frischen, bestrahlten und gegenüber Puromycin resistenten ST-2-Stromazellen unter fortgesetzter Selektion mit 2 μg/ml Puromycin kultiviert. Individuelle, gegenüber Puromycin resistente PräB-Zellklone werden hinsichtlich der zielgerichteten Integration des Targeting-Vektors in ein Allel mittels standardisierter PCR und genomischer Southern Blot-Hybridisierungsanalysen analysiert. Die PräB-Zellklone mit einer zielgerichteten Integration des Targeting-Vektors auf einem Allel werden erneut transfiziert, dieses Mal unter denselben Bedingungen wie zuvor beschrieben mit 20 μg linearisiertem Targeting-Vektor, der einen HygromycinB-Resistenzmarker enthält. Transfizierte PräB-Zellen werden anschließend in IL7-Wachstumsmedium mit einer Dichte von 5 × 10⁴ Zellen/Vertiefung in Kulturplatten mit 96 Vertiefungen plattiert, die mit einer subkonfluenten Schicht von mit 3000 rad bestrahlten, gegenüber Puromycin und HygromycinB doppeltresistenten ST-2-Stromazellen beschichtet sind. Doppelt resistente PräB-Zellklone werden 30 Stunden nach Transfektion durch Zugabe von 2 μg/ml Puromycin und 400 μg/ml HygromycinB selektiert. Gegenüber Puromycin und HygromycinB doppelt resistente Kolonien werden 7–10 Tage nach der Transfektion isoliert und unter fortgesetzter Selektion mit 2 μg/ml Puromycin und 400 μg/ml HygromycinB auf frischen, bestrahlten und gegenüber Puromycin und HygromycinB doppelt resistenten ST-2-Stromazellen kultiviert. Individuelle, gegenüber Puromycin und HygromycinB doppelt resistente PräB-Zellklone werden hinsichtlich der zielgerichteten Integration des Targeting-Vektors in das zweite Allel wieder durch standardisierte genomische PCR und/oder Southern Blot-Analyse analysiert.
Gegenüber Puromycin und HygromycinB doppelt resistente PräB-Zellkolonien mit zwei targetierten Allelen können anschießend transient mit einem konstitutiven Expressionsvektor für cre-Rekombinase transfiziert werden, um Experimente des Gene-Targetings auf andere Genloci und Allele zu wiederholen. Dies kann durch transiente Transfektion von PräB-Zellen mit 20 μg eines ,supercoiled' Expressionsvektors für cre-Rekombinase unter Anwendung der zuvor beschriebenen Elektroporation durchführt werden. Die transient transfizierten Zellen werden anschließend unter Bedingungen der Grenzverdünnung in IL-7-Wachstumsmedium in verschiedene Platten mit 96 Vertiefungen auf mit 3000 rad bestrahlte, subkonfluente ST-2-Stromazellen plattiert. Nach einer Kulturdauer von 7 Tagen wird ein Satz von 48 Klonen für eine weitere Kulturdauer auf normale ST-2-Stromazellen und auf entweder gegenüber Puromycin oder HygromycinB resistente ST-2 Zellen unter entsprechender Selektion plattiert. Zuvor gegenüber Puromycin und HygromycinB doppelt resistente PräB-Zellklone, die gegenüber beiden Antibiotika sensitiv geworden sind, haben wahrscheinlich eine von der cre-Rekombinase vermittelte Deletion beider mit loxP flankierter Resistenzmarker durchlaufen. Nachdem die durch cre-Rekombinase vermittelte Deletion der beiden Resistenzmarker durch Southern Blot-Analysen bestätigt worden ist, können die Klone zusätzlichen Gene-Targeting-Verfahren für andere endogene Genloci und Allele zugeführt werden.
Beispiel 6: Herstellung retroviraler Expressionskonstrukte für humane Immunglobulin-Polypeptide
Um murine, Stromazell- und IL7- abhängige PräB-Zellen für die Herstellung humaner Immunglobuline neu zu programmieren, können neue retrovirale Expressionsvektoren verwendet werden, die für humane Antikörper-Polypeptide kodieren. Es werden Verfahren zur Herstellung rekombinanter retroviraler Vektoren beschrieben, welche die regulierte Expression humaner Proteine der IgH- und L-Kette in Abhängigkeit der Differenzierungsstufe der B-Zellen zuerst als membrangebundene und später als sezernierte Immunglobuline erlauben. Es wird darauf hingewiesen, das jedweder Typ eines heterologen Bindeproteins in diese retroviralen Vektoren kloniert werden kann, wodurch die Expression jedweden Typs eines heterologen oder humanen Bindeproteins exprimiert werden kann. Die Offenbarung der Klonierung retroviraler Transfervektoren für die Expression der vorliegend beschriebenen humanen IgH- und IgL-Ketten sollte daher lediglich als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung betrachtet werden. Rekombinante retrovirale Vektoren können bis zu 7–10 kb heterologer DNA-Sequenzen aufnehmen, wodurch die Schaffung separater Konstrukte für Glykoproteine der IgH- und L-Kette einschließlich sämtlicher erforderlicher Zelltyp- und Differenzierungsstufen-spezifischer Promotoren, Enhancer- und Kontrollelemente, als auch endogener Ig-Gen-Spleiß-Signale erforderlich wird. Diese Kontrollelemente sind notwendig, um eine saubere Expression, Membrandeposition und Sezernierung von Immunglobulinen, sowie ihre Affinitätsreifung, in den verschiedenen B-Zell-Differenzierungsstufen, als auch die verstärkte Sezernierung heterologer Antikörper in Plasmazellen zu gewährleisten. Individuelle retrovirale Konstrukte für IgH- und L-Ketten können in PräB-Zellen co-transduziert werden, wodurch die Konstrukte stabil in das Genom der infizierten PräB-Zellen integrieren. Bei Verwendung muriner PräB-Zellen, denen das Potenzial zur Expression endogener Immunglobuline abhanden gekommen ist (siehe obige Beschreibung), werden im Wege der Differenzierung der retroviral transduzierten PräB-Zellen in Zellen der B-Linie lediglich heterologe oder humane Antikörper oder Bindeproteine exprimiert.
(a) Herstellung retroviraler Konstrukte für die regulierte Expression von IgH-Ketten
Da die retroviralen Konstrukte für die verschiedenen Proteine der IgH- und L-Kette letztendlich in murine Zellen transduziert werden, sollten die die Expression von Immunglobulinen kontrollierenden Promotor- und Enhancerelemente murinen Ursprungs sein, damit optimale Interaktionen mit murinen Transkriptionsfaktoren sichergestellt ist, die für die B-Zelllinie spezifisch sind.
Der Ausgangsvektor zur Schaffung retroviraler Expressionskonstrukte ist der leere retrovirale Klonierungsvektor pLIB (Clontech) (12a). Die Schaffung eines rekombinanten retroviralen Expressionsvektors für humane schwere Immunglobulinketten bedeutet ein mehrstufiges Klonierungsverfahren, welches die sequenzielle Klonierung von Promotor- und Enhancerelementen als auch der Kodierungsregionen für die vielfältigen variablen und konstanten Regionen humaner Antikörper in den leeren retroviralen Klonierungsvektor pLIB beinhaltet. In einem ersten Schritt wird ein muriner V_H-Promotor mittels PCR in die einmalige ClaI-Restriktionsstelle der multiplen Klonierungsstelle von pLIB kloniert. Dies erfolgt durch PCR-Amplifikation eines murinen V_H-Promotorelements aus muriner genomischer DNA unter Verwendung der auf der Basis der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Zugriffsnummer X71119 geschaffenen Primer.
Diese Primer führen zur PCR-Amplifikation eines 394 Bp großen V_H-Promotorfragments, welches an seinen 5'- und 3'-Enden Restriktionsenzym-Erkennungsstellen für ClaI (ATCGAT) enthält, da sie an den 5'-Enden der Primer P027 und P028 eingebaut worden sind. Zusätzlich zu den ClaI-Stellen in beiden Primern enthält der reverse Primer P028 eine zusätzliche BamHI-Schnittstelle (GGATCC, unterstrichen), wodurch eine weitere einmalige Schnittstelle in das PCR-Produkt eingeführt wird (siehe 12a), welche für die weiteren Klonierungsschritte erforderlich ist. Nach Spaltung des PCR-Fragments mit dem Restriktionsenzym ClaI wird das die neue BamHI-Stelle enthaltende V_H-Promotor-PCR-Fragment in den mit ClaI linearisierten Vektor pLIB ligiert. Die den V_H-Promotor in der gewünschten Orientierung (umgekehrt zur transkriptionellen Orientierung des 5'LTR-Promotors) enthaltenden Ligationsprodukte werden identifiziert durch diagnostische Restriktionsenzymspaltungen und DNA-Sequenzierung, und sind bezeichnet mit pAB-1 (12a).
Der zweite Schritt betrifft die Klonierung des murinen Intron-Enhancers der schweren Kette (EμH) mit seinen flankierenden Regionen für die Matrixanhaftung (MARs) in den retroviralen Vektor pAB-1. Es ist bekannt, dass das Enhancerelement EμH mit seinen flankierenden MARs für die effiziente Expression von Immunglobulinproteinen in Zellen der B-Zelllinie erforderlich ist. Die Klonierung des Enhancerelements EμH erfolgt durch Amplifikation eines 983 Bp großen PCR-Fragments aus muriner genomischer DNA unter Verwendung der folgenden auf Basis der veröffentlichten NCBI-Genbank-Sequenz J00440 geschaffenen Primer:
Die an das 5'-Ende eines jeden Primers angefügten Restriktionsstellen (BamHI/HindIII für P029 und NotI für P030) sind in Großbuchstaben dargestellt. Das PCR-Produkt kann dann mit den Restriktionsenzymen BamHI und NotI gespalten und direktional in den mit BamHI und NotI linearisierten retroviralen Vektor pAB1 unter Bildung des Vektors pAB-2 ligiert werden. Der Sense-Primer P029 enthält die Sequenz für eine zusätzliche HindIII-Stelle (unterstrichen), wodurch in pAB-2 eine neue einmalige Restriktionsenzym-Erkennungsstelle geschaffen wird, die für spätere Klonierungsschritte benötigt wird.
Anschließend wird in das Konstrukt pAB-2 ein den murinen 3'α-Enhancer enthaltendes DNA-Fragment eingefügt. Es ist bekannt, dass der 3'α-Enhancer für eine optimale und starke Expression und Sezernierung von Antikörpern im Differenzierungszustand von Plasmazellen erforderlich ist. Es ist ebenfalls bekannt, dass der 3'α-Enhancer vier gegenüber DNAseI hypersensitive Stellen (HS1, HS2, HS3, und HS4) enthält, die zahlreiche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren umfassen, welche für die späte B-Zelle oder Plasmazelle spezifisch sind. In Reportergen-Assays konnte gezeigt werden, dass HS1 und 2, die innerhalb eines 0,6 kb großen genomischen DNA-Fragments lokalisiert sind, mit mindestens 80% an der Aktivität des 3'α-Enhancers beteiligt sind, während HS3 und 4, die hinsichtlich ihrer DNA-Sequenz in hohem Maße homolog sind, nur einen geringen Beitrag leisten.
Sämtliche vier 3'α-Enhancerkomponenten HS1, 2, 3 und 4 bilden eine so genannte Locus-Kontroll-Region (LCR), mit welcher die transkriptionale Aktivität eines gegebenen Genlocus unhabhängig von flankierenden DNA-Sequenzen reguliert werden kann. Ein retroviraler Expressionsvektor für schwere Immunglobulinketten sollte daher grundsätzlich mindestens die HS-Regionen 1 und 2 des 3'α-Enhancers enthalten, welche mittels PCR aus muriner genomischer DNA unter Verwendung von Primern amplifiziert werden können, die entsprechend des veröffentlichten NCBI-Genbank-Sequenzeintrags X96607 geschaffen worden sind (die Erkennungssequenzen für zusätzliche Restriktionsenzymstellen, die für die Klonierung des PCR-Fragments oder für spätere Klonierungsschritte benötigt werden, sind in Großbuchstaben dargestellt):
Zusätzlich zu den 5'-terminalen SalI-Stellen (GTCGAC) in jedem der Primer enthält der Sense-Primer P031 eine zusätzliche MluI-Stelle (unterstrichen), und der reverse Primer P028 enthält eine zusätzliche XhoI-Stelle (unterstrichen). Die Primer P031 und P032 führen zur Amplifikation eines 644 Bp großen PCR-Fragments, das mit dem Restriktionsenzym SalI gespalten und in den mit SalI linearisierten Vektor pAB-2 ligiert werden kann. Die Bestimmung eines Klons mit dem Insert in der gewünschten Orientierung (siehe 12b) erfolgt durch diagnostische Restriktionsenzymspaltung und DNA-Sequenzierung und wird mit pAB-3 bezeichnet (12b).
Gewünschtenfalls können die weiteren Komponenten des 3'α-Enhancers HS3 und 4 in die retroviralen Vektorkonstrukte für die Expression von IgH eingeschlossen werden. Hierfür kann ein 466 Bp großes Fragment, welches die Region HS4 des 3'α-Enhancers umfasst, mittels PCR aus muriner genomischer DNA als Template amplifiziert werden unter Verwendung der folgenden Primer, die entsprechend des veröffentlichten NCBI-Genbank-Sequenzeintrages S74166 geschaffen worden sind:
Die an die 5'-Termini eines jeden Primers angehängten Restriktionsenzymstellen sind mit Großbuchstaben gekennzeichnet. Zusätzlich zu den in beiden Primern vorhandenen XhoI-Restriktionsstellen (CTCGAG) enthält der reverse Primer P034 eine zusätzliche SphI-Restriktionsstelle (GCATGC, unterstrichen), die eine zusätzliche einmalige Restriktionsstelle enthält, welche für spätere Klonierungszwecke erforderlich ist. Die PCR-Amplifikation der genomischen Maus-DNA mit dem Primerpaar P033 und P034 führt zu einem PCR-Fragment mit einer Größe von 466 Bp, das mit dem Restriktionsenzym XhoI gespalten und anschließend in den mit XhoI linearisierten Vektor pAB-3 ligiert wird. Die Bestimmung eines Klones mit dem HS4-Insert in der gewünschten Orientierung erfolgt durch diagnostische Restriktionsenzymspaltung und DNA-Sequenzierung und wird als Vektorkonstrukt pAB-4 bezeichnet (12b). Das letzte 3'α-Enhancerfragment HS3 kann mittels PCR aus muriner genomischer DNA als Template amplifiziert werden mit den folgenden Primern, die entsprechend des veröffentlichten NCBI-Genbank-Sequenzeintrags X96607 geschaffen worden sind (die Erkennungssequenzen für das Restriktionsenzym SphI sind wieder in Großbuchstaben hervorgehoben):
Die mittels PCR amplifizierte Region HS3 des 3'α-Enhancers wird mit dem Restriktionsenzym SphI gespalten und zur Schaffung von pAB-5 in den mit SphI linearisierten Vektor pAB-4 ligiert. Jeder der Vektoren pAB-3, 4 oder 5 kann zur Insertion der Kodierungsregion für heterologe schwere Immunglobulinketten verwendet werden (12b).
Jeder der humanen Immunglobulin-Isotypen kann als membrangebundenes Oberflächen-Immunglobulin oder als sezernierter Antikörper exprimiert werden, wobei die Regulation durch alternatives Spleißen erfolgt, wodurch die Membranüberspannenden Exons in dem mRNA-Transkript entweder erhalten bleiben oder deletiert werden. Obgleich jeder Immunglobulin-Isotyp seine eigene kodierende Region für die Membranüberspannenden Exons aufweist, sind die Membranregionen sämtlicher humaner IgG-, IgA- und IgE-Antikörper tatsächlich hinsichtlich ihrer individuellen Subtypen identisch. Daher können dieselben IgG-Membranexons für die membranbindenden IgG1-, IgG-, IgG3- und IgG4-Antikörper eingesetzt werden, während sowohl für IgA1 als auch für IgA2 unterschiedliche Exonsätze verwendet werden, und wobei für jeden IgE- und IgM-Antikörper unterschiedliche Exons erforderlich sind.
Daher besteht der nächste Schritt in der Klonierung zur Schaffung rekombinanter retroviraler Ig-Expressionskonstrukte in der Insertion der vielfältigen Membran-überspannenden Regionen für humane IgG-, IgA-, IgM- und IgE-Antikörper in irgendeinen der Vektoren pAB-3, -4 oder -5. Als repräsentatives Beispiel wird die weitere Klonierung für das retrovirale Grundkonstrukt pAB-3 beschrieben, das den V_H-Promotor, den EμH-Enhancer und die minimalen 3'αE-Enhancer-Elemente (HS1, 2) enthält (12c).
Die Membran-überspannende Region der μH-Kette wird von zwei Exons μM1 und μM2 kodiert, die 1,85 kb stromabwärts der Exons C_μH₁–C_μH₄ der konstanten Region von C_μH lokalisiert sind. Die Exons μM1 und μM2 einschließlich der endogenen Polyadenylierungsstelle sind innerhalb eines genomischen Fragments mit einer Größe von 773 Bp enthalten, welches aus muriner genomischer DNA mittels PCR amplifiziert werden kann unter Verwendung der folgenden, auf Grundlage der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Contig-Sequenz NT_010168 geschaffenen Primer:
Die an die 5'-Enden eines jeden Primers angefügten MluI-Restriktionsstellen sind in Großbuchstaben hervorgehoben. Das resultierende PCR-Produkt kann mit dem Restriktionsenzym MluI gespalten werden, und das resultierende Fragment mit einer Größe von 773 Bp wird in den mit MluI linearisierten Vektor pAB-3 ligiert. Ein Klon, der nach bestätigter Restriktionenzym-Kartierung und DNA-Sequenzierung die Exons μM1 und μM2 in korrekter Orientierung und DNA-Sequenz enthält, wird als Konstrukt pAB-3.1 bezeichnet (12c).
Der Membraneinbau von IgG-Antikörpern kann z. B. über die Membran-überspannenden Exons des Gens IgG₁ erfolgen. Die Membranüberspannende IgG₁-Region wird kodiert von zwei Exons, die 1,25 kb stromabwärts der eine Region von 1,9 kb abdeckenden C_γ1H-Exons lokalisiert sind. Um das Intron zwischen γ1M1 und γ1M2 zu verkürzen, wird die 'Single Overlap Extension' (SOE)-PCR angewendet, wodurch die beiden Exons zu einem kleineren PCR-Fragment fusioniert werden. Im Allgemeinen kann die Fusion zweier PCR-Produkte erreicht werden, wenn der reverse Primer des stromaufwärts ausgerichteten PCR-Produkts und der Sense-Primer des stromabwärts ausgerichteten PCR-Produkts eine Komplementarität über ungefähr 30–40 Bp aufweisen. Diese Regionen perfekter Komplementarität können in Form von Nukleotiden mit einer Länge von 15–20 Kettengliedern an die 5'-Enden des reversen Primers und des Forward-Primers, die für die Amplifikation der stromaufwärts beziehungsweise stromabwärts ausgerichteten PCR-Produkte verwendet werden, angefügt werden. Im Falle der Fusion der beiden Exons γ1M1 und γ1M2 kommt es jedoch zu zwei vollständig identischen Sequenzen von 28 Bp, die sich 78 Bp stromabwärts des Exons γ1M1 und 256 Bp stromaufwärts des Exons γ1M2 befinden. Diese Sequenzen können verwendet werden, um mittels SOE-PCR ein kürzeres PCR-Fragment zu schaffen, welches die beiden Exons γ1M1 und γ1M2 für die Membran-überspannenden Regionen von γH-Ketten enthält. Daher werden zwei PCR-Reaktionen an humaner genomischer DNA parallel durchgeführt unter Verwendung der folgenden Primer, die auf der Grundlage der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz AL122127 geschaffen worden sind. Ein PCR-Fragment mit einer Größe von 315 Basenpaaren, welches das γ1 Membran-überspannende Exon 1(γ1M1) enthält, wird aus humaner genomischer DNA unter Verwendung der Primer:
amplifiziert, wobei der Primer P039 an die Position 9710–9741 und der Primer P040 an die Position 9435–9462 des Sequenzeintrags AL122127 der NCBI-Genbank binden.
Ein 555 Basenpaare großes PCR-Fragment, welches das Membranüberspannende Exon 2(γ1M2) enthält, kann aus humaner genomischer DNA unter Verwendung der folgenden Primer:
amplifiziert werden, wobei der Primer P041 an die Position 8137–8164, und Primer P042 an die Position 7624–7654 des Sequenzeintrags AL122127 der NCBI-Genbank binden. Die beiden PCR-Produkte können anschließend zu einem 822 Bp großen PCR-Fusionsprodukt fusioniert werden, indem 1/100 des PCR-Produkts des Exons γ1M1 mit 1/100 des PCR-Produkts des Exons γ1M2 vermischt werden und anschließend eine PCR mit den Sense- und reversen Primern P039 und P042 durchgeführt wird. Zusätzlich zu den in beiden Primern P039 und P042 vorhanden Erkennungsstellen für das Restriktionsenzym MluI (hervorgehoben durch Großbuchstaben), welche für die Klonierung des SOE-Fusions-PCR-Produkts erforderlich sind, enthält der Primer P042 zusätzlich die komplementäre Sequenz eines artifiziellen Polyadenylierungssignals (unterstrichen), welches die korrekte transkriptionale Terminierung des Immunglobulin-Transkripts im endgültigen retroviralen Immunglobulin-Expressionsvektor erlaubt. Das 832 Bp große PCR-Fragment γ1M1γ1M2-PolyA-Signal wird anschließend mit dem Restriktionsenzym MluI gespalten und in den Vektor pAB-3 ligiert. Ein Klon, dessen korrekte Orientierung des Inserts mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung verifiziert worden ist, wird als Klon pAB-3.2 bezeichnet (12c).
Die Klonierung der Membran-überspannenden Kodierungsregion al kann mittels PCR-Amplifikation eines Fragments aus humaner genomischer DNA erreicht werden, das das einzelne Exon für α1M einschließlich seiner endogenen PolyA-Stelle enthält. Für diese PCR-Amplifikation können die folgenden Primer verwendet werden, die entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags M60193 geschaffen worden sind:
Beide Primer enthielten MluI-Klonierungsstellen, die an die 5'-Enden eines jeden Primers angefügt worden sind (hervorgehoben durch Großbuchstaben), und zur Amplifikation eines PCR-Produkts von 768 Basenpaaren führen, das mit dem Restriktionsenzym MluI gespalten und anschließend in den mit MluI linearisierten Vektor pAB-3 ligiert wird. Ein Klon, dessen korrekte Orientierung des Inserts mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung bestätigt worden ist, wird als Klon pAB-3.3 bezeichnet.
Zur Expression membrangebundener IgE-Antikörper erfolgt die PCR-Klonierung der Membran-überspannenden Region für ε₁H-Ketten, welche von den beiden Exons ε₁M1 und ε₁M2 kodiert wird. Hierfür wird ein 858 Bp großes PCR-Produkt aus humaner genomischer DNA amplifiziert unter Verwendung der folgenden Primer, die entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags X63693 geschaffen worden sind:
Beide Primer enthalten MluI-Klonierungsstellen, die an das 5'-Ende eines jeden Primers angefügt worden sind (hervorgehoben durch Großbuchstaben), und führen zu einem 858 Bp großen PCR-Produkt, das mit dem Restriktionsenzym MluI gespalten werden kann. Zusätzlich wird der reverse Primer P046 so ausgelegt, dass er die komplementäre Sequenz eines artifiziellen PolyA-Signals enthält (unterstrichen), wodurch die saubere Terminierung der mRNA-Transkription in dem endgültigen Expressionskonstrukt sichergestellt wird. Das mit MluI gespaltene PCR-Fragment wird in den mit MluI linearisierten Vektor pAB-3 ligiert. Ein Klon, dessen korrekte Orientierung des Inserts mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung bestätigt worden ist, wird als Klon pAB-3.4 bezeichnet.
Im Anschluss an die Klonierung der zahlreichen Membranüberspannenden Exons für die Isotypen IgG, IgA, IgM und IgE müssen die Exons für die zahlreichen humanen konstanten Regionen in die retroviralen Konstrukte pAB-3.1 bis 3.4 insertiert werden. Hierfür werden DNA-Fragmente, die die Exons der konstanten Region kodieren, in die einmalige Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym NotI eines jeden der Konstrukte pAB-3.1 bis 4 kloniert.
Die Klonierung retroviraler Expressionsvektoren für sämtliche Immunglobulin-Isotypen der H-Kette γ1, γ2, γ3 und γ4 ist in 12d dargestellt. Für die PCR-Amplifikation der vier unterschiedlichen Subtypen der schweren IgG-Kette unter Verwendung humaner genomischer DNA als PCR-Template können die folgenden Primer verwendet werden:
Für γ1 (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz AL122127):
Für γ2 (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz J00230):
Für γ3 (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz AL122127):
Für γ4 (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz K01316):
In jedem Fall können die PCR-Produkte für γ₁H (1788 Bp), γ₂H (1959 Bp), γ₃H (2374 Bp), und γ₄H (1820 Bp) mit dem Restriktionsenzym NotI gespalten werden, wonach das gespaltene Fragment in den mit NotI linearisierten Vektor pAB-3.2 ligiert wird (12d). Konstrukte, die die Inserts nach Bestätigung durch Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung in korrekter Orientierung und ohne jegliche Mutationen enthalten, werden mit pAB-3.2-G1, pAB-3.2-G2, pAB-3.2-G3 beziehungsweise pAB-3.2-G4 bezeichnet.
Zur Klonierung der Exons für die konstanten Regionen, die μH-, α1H-, α2H- und εH-Ketten kodieren, wird dasselbe Verfahren angewendet (12e). Für die PCR-Amplifikation der verschiedenen IgH-Isotypen unter Verwendung humaner genomischer DNA als Template werden die folgenden Primer verwendet:
Für μH (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz AB019441):
Für α₁H und α₂H (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzen J00220 und J00221):
Für εH (Primer entsprechend der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenz L00022):
In jedem Fall können die PCR-Produkte für μH (2229 Bp), α₁H und α₂H (1667 Bp), und für εH (1908 Bp) mit dem Restriktionsenzym NotI gespalten und in die mit NotI linearisierten Vektoren pAB-3.1, pAB-3.3 beziehungsweise pAB-3.4 ligiert werden (12e). Konstrukte, die die Inserts nach Bestätigung mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung in korrekter Orientierung und ohne jegliche Mutationen enthalten, werden mit pAB-3.1-M, pAB-3.3-A1, pAB-3.3-A2 beziehungsweise pAB-3.4-E bezeichnet.
Die unterschiedlichen retroviralen Expressionskonstrukte für die H-Kette, die von natürlichen Promotor- und Enhancerelementen für die IgH-Kette kontrolliert werden, erfordern immer noch die Insertion einer die variable Domäne kodierenden Region, wobei die Darstellung nach der Beschreibung der Verfahren zur Klonierung der retroviralen Expressionsvektoren für die IgL-Kette erfolgt, da ähnliche Strategien zur Expression einmaliger oder diverser Spezifitäten für die vollständigen retroviralen Expressionskonstrukte für die IgH- und die IgL-Kette vorgestellt werden.
(b) Herstellung retroviraler Konstrukte für die regulierte Expression von IgκL-Ketten
Ähnlich wie bei den für die Expression der IgH-Kette geschaffenen Konstrukten erfordern retrovirale Konstrukte, die für die Differenzierungsstufen-spezifische Expression von IgκL-Ketten geschaffen werden, die Anwesenheit definierter und für den Locus der κL-Kette spezifischer Promotor- und Enhancerelemente. Diese schließen einen Vκ-Promotor, den Intron-Enhancer der leichten κ-Kette (κiE) und die κ3'-Enhancerelemente (κ3'E) ein. Die sequenzielle Klonierung dieser Elemente kann wie folgt durchgeführt werden (13a, b).
Mittels PCR wird aus muriner genomischer DNA ein muriner Vκ-Promotor als 290 Bp großes PCR-Fragment amplifiziert unter Verwendung der folgenden Primer (erstellt entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags X52768):
Die an das 5'-Ende eines jeden Primers angefügten Restriktionsstellen sind durch Großbuchstaben hervorgehoben. Zusätzlich zu den an den 5'-Enden beider Primer vorhandenen ClaI-Stellen enthält der reverse Primer P062 eine zusätzliche BamHI-Restriktionsstelle (GGATCC, unterstrichen), mit welcher eine weitere einmalige Restriktionsstelle in das PCR-Produkt eingeführt wird, welche für spätere Klonierungszwecke benötigt wird. Nach der Spaltung des PCR-Fragments mit dem Restriktionsenzym ClaI wir der amplifizierte V_κ-Promotor in den mit ClaI linearisierten Vektor pLIB ligiert. Legationsprodukte, die den V_κ-Promotor nach Bestätigung durch diagnostische Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung in der gewünschten Orientierung enthalten (umgekehrt zur Leserichtung des 5'LTR-Promotors) ergeben das Konstrukt pAB-6 (13a).
κiE und die Kodierungsregion für die konstante Domäne der κL-Kette sind sowohl im Genlocus der κL-Kette des Menschen als auch der Maus eng benachbart lokalisiert, und der Enhancer scheint speziesübergreifend zu funktionieren. Daher werden optionale Vorgehensweisen zur Klonierung zweier unterschiedlicher retroviraler, für κL-Ketten kodierender Expressionsvektoren beschrieben, wobei eine den humanen und die andere den murinen κ-Intron-Enhancer (κiE) verwendet. Es wird darauf hingewiesen, dass beide Konstrukte gleichrangig verwendet werden können. Die Klonierung des den humanen κiE enthaltenden Konstrukts kann durch Amplifikation eines PCR-Fragments aus genomischer humaner DNA, das sowohl den humanen κiE als auch das humane Cκ-Exon einschließlich einer 5' lokalisierten MAR enthält, unter Verwendung der folgenden Primer erfolgen (erstellt auf der Basis des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags AF017732):
Die an das 5'-Ende eines jeden Primers angefügten zusätzlichen Restriktionsstellen sind wieder in Großbuchstaben angegeben (BamHI im Primer P063 und NotI in P064). Der Primer P063 enthält die Sequenz für eine zusätzliche MluI-Restriktionsstelle, die in späteren Klonierungsschritten verwendet wird. Die PCR-Primer amplifizieren ein 2359 Bp großes Fragment, das mit BamHI und NotI gespalten werden kann, und welches anschließend direktional unter Schaffung des retroviralen Konstrukts pAB-7 in den mit BamHI und NotI linearisierten Vektor pAB-6 kloniert werden kann (13a).
Für das den murinen κiE nutzende Konstrukt wird ein den murinen κiE enthaltendes PCR-Produkt mit einem PCR-Produkt, welches die humane Cκ-Region enthält, mittels SOE-PCR in der zuvor beschriebenen Weise fusioniert. Hierfür erfolgt zuerst die parallele PCR-Amplifikation des murinen κiE und der humanen Cκ-Region, wobei der reverse Primer für κiE und der Forward-Primer für die Cκ-Region eine komplementäre Region von 39 Bp aufweisen. In der zweiten PCR, welche der Fusion dieser beiden PCR-Produkte dient, werden 1/100 einer jeden PCR-Reaktion gemischt und amplifiziert mit dem κiE Forward-Primer (P065) und dem reversen Primer der Cκ-Region (P064), wodurch die Fusion der beiden PCR-Produkte im Bereich der terminalen Komplementarität von 36 Bp erreicht wird.
Für die Amplifikation des murinen κiE können die folgenden Primer (erstellt entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags V00777) unter Verwendung muriner genomischer DNA als Template verwendet werden:
Für die Amplifikation der humanen Cκ-Region können die folgenden Primer (erstellt entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags AF017732) unter Verwendung humaner genomischer DNA als Template verwendet werden:
Die Regionen der terminalen Komplementarität in den Primern P066 und P067 sind unterstrichen und vermitteln die Fusion der beiden PCR-Produkte in einer zweiten PCR, die mit den Primern P065 und P064 und einer Mischung der beiden ersten PCR-Produkte als Template durchgeführt wird. Das resultierende murine, aus κiE und der humanen Cκ-Region fusionierte PCR-Produkt mit einer Größe von 1524 Bp kann mit BamHI und NotI gespalten und anschließend direktional unter Schaffung des Vektors pAB-8 in den mit BamHI und NotI linearisierten Vektor pAB-6 kloniert werden (13a).
Als nächstes wird der murine κ3'E stromabwärts der humanen Cκ-Regionen in beide Vektoren pAB-7 und pAB-8 kloniert, wodurch die Konstrukte pAB-7.1 beziehungsweise pAB-8.1 geschaffen werden. Die für die PCR-Amplifikation von κ3'E aus muriner genomischer DNA verwendeten Primer sind wie folgt (erstellt entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags X15878):
Beide Primer enthalten SalI-Restriktionsstellen (durch Großbuchstaben hervorgehoben), sodass das resultierende PCR-Produkt mit einer Größe von 827 Bp in kompatible SalI-Restriktionsstellen von pAB-7 und pAB-8 kloniert werden kann. Vektorklone, die das Insert nach Bestimmung mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung in der korrekten Orientierung und mit der korrekten DNA-Sequenz tragen, werden mit pAB-7.1 und pAB-8.1 bezeichnet (13a).
Im Rahmen einer weiteren Klonierung wird ein Puromycin-Resistenzmarker unter der Kontrolle eines konstitutiven SV40-Promotors in die retroviralen Konstrukte für die Expression der κL-Kette kloniert. Der Einbau einer Expressionskassette für Resistenz gegenüber Puromycin ist bevorzugt, da die beiden retroviralen Konstrukte für die IgH- und die IgL-Kette stabil in murine PräB-Zellen co-transduziert werden müssen, um die Expression vollständig heterologer Antikörper zu ermöglichen. Um die Effizienz der retroviralen Co-Transduktion zu erhöhen, werden die retroviralen Konstrukte für die IgL-Kette zuerst transduziert, und stabil transduzierte Zellen werden für die Integration der Konstrukte für die IgL-Kette unter Anwendung der Selektion mit Puromycin selektiert. Eine zweite Transduktion von retroviralen Vektoren für die IgH-Kette führt dann zur Entstehung von Zellen mit dem Potenzial zur Bildung von Antikörpern in jeder Zelle, die mit einem retroviralen Vektor für die IgH-Kette transduziert ist.
Die Expressionskassette für Puromycin kann mittels SOE-PCR aus dem Vektor pPur für Puromycin-Resistenz (Clontech) kloniert werden, wodurch einige unerwünschte interne Restriktionsenzymstellen deletiert und geeignete ClaI-Klonierungsstellen an die Enden des amplifizierten PCR-Fragments angefügt werden.
Die für die SOE-PCR verwendeten Primer sind:
Zunächst werden zwei PCR-Amplifikationen parallel mit den Primerpaaren P070/P071 und P072/P073 unter Verwendung desselben pPur-Templates für die PCRs durchgeführt. Der reverse Primer P071 und der Forward-Primer P072 enthalten eine Region perfekter Komplementarität von 36 Bp (unterstrichen), wodurch die Fusion der beiden PCR-Produkte im Rahmen einer zweiten PCR ermöglicht wird, in der Aliquots der vorhergehenden PCR-Fragmente in einer zusätzlichen PCR-Amplifikation unter alleiniger Verwendung der Primer P070 und P073 eingesetzt werden. Die letztgenannten Primer enthalten ClaI-Restriktionsstellen (Großbuchstaben), wodurch die Klonierung der resultierenden Expressionskassette für Puromycin mit einer Größe von 1351 Bp in kompatible ClaI-Stellen von pAB-7.1 und pAB-8.1 ermöglicht wird. Hierdurch entstehen die retroviralen Konstrukte pAB-7.1Pur beziehungsweise pAB-8.1Pur (13b), welche diejenigen Konstrukte darstellen, in die einzelne VJ_κ-Regionen oder Bibliotheken der VJ_κ-Region, die einzigartige beziehungsweise diverse variable Domänen von κL-Ketten kodieren, insertiert werden können. Die Vorgehensweise zur Klonierung der Exons für die variable Region wird nachfolgend zusammen mit der Klonierung der variablen Regionen der H-Kette und λL-Kette beschrieben, nachdem auch noch die Klonierung der retroviralen Expressionsvektoren für heterologe, humane λL-Ketten beschrieben worden ist.
(c) Herstellung retroviraler Konstrukte für die regulierte Expression von IgλL-Ketten
In einigen Fällen ist es wünschenswert, heterologe Antikörper herzustellen, die anstelle der κL-Ketten λL-Ketten enthalten. Obgleich es ausreichend sein kann, die für die humane Cκ kodierende Region in den retroviralen Konstrukten pAB-7.1Pur und pAB-8.1Pur durch irgendeine der humanen Cλ-Kodierungsregionen zu ersetzen, wird ein perfektes endogenes Expressionsmuster für die λL-Kette lediglich erreicht durch Kontrolle der Expression von λL-Ketten durch Promotor- und Enhancerelemente, die für den Genlocus der λL-Kette spezifisch sind. Dies trifft insbesondere auf das murine System zu, in dem die Umgruppierung und Expression der Gene der κL-Kette der Umgruppierung und Expression von λL-Ketten während der B-Zelldifferenzierung vorausgeht.
Die für den Genlocus der murinen λL-Kette spezifischen Enhancer-Elemente sind die Enhancer λ2-4 und λ3-1, welche den Exons für die konstanten Regionen Cλ2, Cλ4, Cλ1 und Cλ3 benachbart lokalisiert sind und die Expression der Isotypen für die leichte Kette λ2, λ4, beziehungsweise λ1, λ3 regulieren.
Wie im Falle der retroviralen Expressionskonstrukte für die κL-Kette (siehe oben), enthalten retrovirale Expressionsvektoren für die λL-Kette eine Expressionkassette für ein Puromycin-Resistenzgen. Daher wird eine von einem SV40-Promotor kontrollierte Expressionskassette für Puromycin in einem ersten Klonierungsschritt mittels SOE-PCR mit einem Vλ-Promotor fusioniert unter Verwendung muriner genomischer DNA und pAB-7.1Pur als Templates für die PCR-Amplifikation. Die Primer für die beiden parallelen SOE-PCR-Reaktionen sind wie folgt (wobei die für den Vλ-Promotor spezifischen Primer P076 und P077 entsprechend des in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeintrags J00591 erstellt worden sind):
Wie für die zuvor beschriebene SOE-Fusions-PCRs werden die ersten beiden PCR-Amplifikationen parallel durchgeführt, d. h. die Expressionskassette für Puromycin mit den Primern P074 und P075 auf pAB-7.1Pur als Template, und der Promotor Vλ mit den Primern P076 und P077 auf muriner genomischer DNA als Template.
Jedes der Aliquots mit einem Volumen von 1/100 der ersten beiden parallelen PCRs werden dann vermischt und wiederum mit den Primern P074 und P077 amplifiziert. Die Expressionskassette für Puromycin wird dabei an das 5'-Ende des Vλ-Promotors fusioniert, aufgrund der in dem reversen Primer P075 und dem Sense-Primer P076 perfekt geschaffenen Komplementarität von 36 Bp (unterstrichen), welche für die ersten parallelen PCR-Runden verwendet wird.
Beide Primer P074 und P077 enthalten ClaI-Restriktionsstellen, die zur Klonierung des PCR-Fusionsprodukts in den mit ClaI linearisierten Vektor pLIB verwendet werden können. In den reversen Primer P077 wird eine zusätzliche MluI-Restriktionsstelle (unterstrichen) eingefügt, wodurch eine zusätzliche einmalige MluI-Stelle 3' vom Vλ-Promotor entsteht, die für weitere Klonierungen erforderlich ist. Ein Vektorklon mit dem fusionierten PCR-Fragment Puromycin-Vλ-Promotor, das in pLIB nach Bestätigung mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung in korrekter Orientierung und mit der korrekten DNA-Sequenz enthalt ist, wird als Vektor pAB-9 bezeichnet (14a).
Im nächsten Schritt werden zwei murine Enhancer-Elemente λ2-4E und λ3-1E mittels PCR aus muriner genomischer DNA amplifiziert, wonach sich wiederum eine Fusion beider Sequenzen mittels SOE-PCR anschießt. Die folgenden Primer können verwendet werden (basierend auf den in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzeinträgen X54550 beziehungsweise X54608):
Wie im vorhergehenden Ansatz werden zunächst zwei PCR-Fragmente parallel mit den Primerpaaren P078/P079 und P080/P081 aus muriner genomischer DNA als Template amplifiziert, und in einer zweiten PCR-Runde werden Aliquots dieser PCR-Produkte als Template verwendet und mittels PCR-Amplifikation mit den Primern P078 und P081 aufgrund der 36 Bp großen Komplementarität der Primer P079 und P080 (unterstrichen) fusioniert.
Das resultierende PCR-Fusionsprodukt mit einer Größe von 1513 Bp kann mit den Restriktionsenzymen NotI und EcoRI gespalten werden (die entsprechenden Erkennungsstellen sind in die Primer P078 und P081 eingeführt; hervorgehoben durch Großbuchstaben), und es wird direktional in den mit NotI/EcoRI linearisierten Vektor pAB-9 kloniert. Ein Vektorklon mit der nach Bestätigung mittels Restriktionsenzymkartierung und DNA-Sequenzierung korrekten DNA-Sequenz wird als Vektor pAB-10 bezeichnet (14a). Die komplementären Regionen der Primer P079 und P080 sind derart geschaffen, dass sie eine zusätzliche einmalige XhoI-Stelle enthalten (hervorgehoben durch Großbuchstaben), um gewünschtenfalls die separate Entfernung eines jeden Enhancerelements zu ermöglichen.
In einem nächsten Schritt wird irgendeine der humanen Cλ-Regionen unter Verwendung der folgenden Primer (erstellt auf der Basis der in der NCBI-Genbank veröffentlichten Sequenzen D87023 und D87017) in das retrovirale Konstrukt pAB-10 kloniert:
Diese Primer sind in der Lage, irgendeine der funktionalen humanen Cλ-Regionen als 1094 Bp große PCR-Fragmente zu amplifizieren, wenn humane genomische DNA als Template verwendet wird. Die Primer P082 und P083 enthalten Restriktionsstellen für ClaI beziehungsweise NotI, wodurch eine doppelte Spaltung der PCR-Fragmente mit ClaI und NotI und deren direktionale Ligation in pAB-10 ermöglicht werden, um (in Abhängigkeit der amplifizierten Cλ-Region) entweder pAB-11-λ1, pAB-11-λ2, pAB-11-λ3, oder pAB-11-λ7 zu bilden (14b).
Zur Herstellung eines vollständigen retroviralen Expressionsvektors für die IgλL-Kette muss ein Exon einer VλJλ-umgruppierten variablen Region in die einmaligen MluI- und HindIII-Stellen der verschiedenen pAB-11-Konstrukte kloniert werden, wobei die Darlegung im folgenden Abschnitt zusammen mit der Herstellung vollständiger retroviraler Expressionsvektoren für die IgH- und IgκL-Kette vorgenommen wird.
Beispiel 7 : Klonierung von Exons für die V_HDJ_H- oder V_LJ_L-variable Region in retrovirale Konstrukte für die Expression der IgH- und L-Kette
Die bisher beschriebenen retroviralen Expressionskonstrukte für die unterschiedlichen humanen IgH- und IgL-Ketten enthalten sämtliche Kodierungsregionen und Kontrollelemente für die Expression humaner Antikörper, mit Ausnahme der kodierenden Regionen für die variablen Domänen. Diverse Repertoires (Bibliotheken) von Exons, die Domänen der variablen Region kodieren, können z. B. aus genomischer DNA humaner peripherer Blutlymphozyten kloniert werden, die B-Lymphozyten mit diversen V_HDJ_H- und V_LJ_L-DNA-Umgruppierungen enthalten. Diese Kodierungsregionen für die variablen Domänen müssen ein gemeinsames Leader-Exon enthalten, das 5' eines jeden V_HDJ_H- und V_LJ_L- umgruppierten Exons (15) lokalisiert ist und für den sauberen Transport von IgH- und IgL-Ketten durch das endoplasmatische Retikulum, das Golgi-Netzwerk und schließlich an die Zelloberfläche benötigt wird. Degenerierte Primer, die an die Mehrzahl der Leader-Sequenzen der humanen IgH-, IgκL- und IgλL-variablen Region binden, sind beschrieben und werden in Kombination mit degenerierten Primern verwendet, die die zahlreichen humanen J_H- und J_L-Gensegmente zur Klonierung der für die variablen Regionen V_HDJ_H oder V_LJ_L kodierenden Regionen amplifizieren. Die zum direktionalen Klonieren der PCR-Produkte verwendeten Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme (siehe 15) sind an die 5'-Enden der degenerierten Primer angefügt und in Großbuchstaben hervorgehoben. Positionen in den degenerierten Primern, die mehr als nur ein Nukleotid enthalten können, sind in Klammern angegeben.
Die Forward-Primer für die PCR-Amplifikation von variablen Domänen der humanen schweren Ig-Kette einschließlich der Leader-Sequenzen aus humaner genomischer DNA peripherer B-Lymphozyten sind wie folgt:
Ein Forward-Primer für die Amplifikation der variablen Domänen der leichten humanen Igκ-Kette einschließlich Leader-Sequenz aus humaner genomischer DNA peripherer B-Lymphozyten ist wie folgt:
Ein Forward-Primer für die Amplifikation der variablen Domänen der humanen leichten Igλ-Kette einschließlich Leader-Sequenz aus humaner genomischer DNA peripherer B-Lymphozyten ist wie folgt:
Es wird darauf hingewiesen, dass anstelle der an das 5'-Ende der Primer P084–P087 für Klonierungszwecke angefügten Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BamHI eine Erkennungsstelle für das Restriktionsenzym BglII verwendet werden kann (vergleiche mit 15), da BglII dieselben kompatiblen Überhänge wie BamHI bildet. Im Falle der Klonierung von VλJλ-Regionen enthält der Forward-Pimer P088 eine MluI-Stelle, da das retrovirale Konstrukt, welches das Fragment akzeptiert, bereits interne BamHI-Restriktionsstellen enthält. Alternativ kann ein Primer verwendet werden, der P088 ähnlich ist und eine AscI-Stelle enthält, die denselben CGCG-Überhang wie das Restriktionsenzym MluI erzeugt.
Die reversen Primer für die Amplifikation aller sechs humaner Gensegmente für die IgH-J-Kette sind wie folgt. HindIII-Stellen, hervorgehoben durch Großbuchstaben, einschließlich einiger flankierender Nukleotide werden an die 5'-Enden der Primer für Klonierungszwecke angefügt.
Ein reverser Primer für die PCR-Amplifikation von Exons der variablen Region enthaltend J_H1-, J_H4- und J_H5-Gensegmente unter Verwendung genomischer DNA humaner B-Lymphozyten ist wie folgt:
Ein degenerierter reverser Primer für die Amplifikation von Exons der variablen Region enthaltend J_H2-, J_H3- und J_H6-Gensegmente unter Verwendung genomischer DNA humaner B-Lymphozyten ist wie folgt:
Ein degenerierter reverser Primer für die Amplifikation von Exons der variablen κ-Region enthaltend humane Jκ1–4-Gensegmente unter Verwendung genomischer DNA humaner B-Lymphozyten ist wie folgt:
Ein reverser Primer für die Amplifikation von Exons für die variable κ-Region enthaltend das humane Gensegment Jκ5 unter Verwendung genomischer DNA humaner B-Lymphozyten ist wie folgt:
Ein reverser degenerierter Primer für die PCR-Amplifikation von Exons der variablen Region IgλL enthaltend die Gensegmente Jλ1–3 unter Verwendung genomischer DNA humaner B-Lymphozyten ist wie folgt:
Ein reverser Primer für die PCR-Amplifikation von Exons der variablen Region IgλL enthaltend Jλ7 unter Verwendung genomischer DNA humaner B-Lymphozyten ist wie folgt:
Für die PCR-Amplifikation und Klonierung der Exons für die variable Domäne enthaltend umgruppierte Gensegmente V_HDJ_H und V_LJ_L unter Verwendung der oben beschriebenen Primer P084–P094 werden die Primer in äquimolaren Mengen eingesetzt, sofern mehr als ein Forward- oder reverser Primer für eine bestimmte variable Region angezeigt ist. Im Falle der Klonierung variabler Regionen für H- und κL-Ketten werden die PCR-Fragmente mit BamHI und HindIII gespalten und direktional in mit BamHI/HindIII doppelt gespaltene Vektoren für die Expression von IgH- und IgκL-Ketten kloniert. Im Falle der Klonierung variabler Regionen für λL-Ketten werden die PCR-Fragmente mit MluI und HindIII gespalten und zur Expression der IgλL-Kette direktional in mit MluI/HindIII doppelt gespaltene Vektoren kloniert.
Beispiel 8: Sequenzielle Transduktion retroviraler Expressionsvektoren für heterologe IgH- und L-Ketten in genetisch modifizierte murine PräB-Zellen
Die retrovirale Transduktion Stromazell- und Il7-abhängiger muriner PräB-Zellen ist detailliert in Beispiel 3 beschrieben worden. Für die sequenzielle Transduktion retroviraler Expressionskonstrukte, die IgH- und IgL-Ketten kodieren, werden identische Protokolle für die Transfektion der ökotropen Verpackungszellen und Bedingungen zur Infektion von PräB-Zellen mit rekombinanten Retroviren angewendet. Der einzige Unterschied liegt darin, dass in dem nachfolgend dargelegten Protokoll zwei retrovirale Expressionskonstrukte sequenziell transduziert werden.
Von Stromazellen und IL7 abhängige PräB-Zellen werden zunächst mit einem Überstand von GPE-Verpackungszellen infiziert, die mit dem retroviralen Konstrukt, welches heterologe IgL-Ketten kodiert, transient transfiziert worden sind. Wie zuvor beschrieben, enthält der Expressionsvektor für die IgL-Kette zusätzlich einen Puromycin-Resistenzmarker. Daher können stabil transduzierte Zellen 24 Stunden nach der Transduktion durch Zugabe von 2 μg/ml Puromycin zum Gewebekulturmedium selektiert werden. Die transduzierten Zellen werden kultiviert und für eine zusätzliche Zeitdauer von 48 Stunden in Puromycin enthaltendem Medium expandiert. Aufgrund der Puromycin-Selektion werden nicht-transduzierte PräB-Zellen eliminiert, und nach einer Kulturdauer von 48 Stunden wird eine Population von PräB-Zellen erhalten, die bezüglich der IgL-Kette 100% transduziert sind.
Zu diesem Zeitpunkt werden die Zellen mit dem Überstand der ökotropen Verpackungszelllinie GPE inkubiert, die transient mit den heterologe IgH-Ketten kodierenden retroviralen Vektoren transfiziert worden sind. Diese Zellen werden für eine zusätzliche Zeitdauer von 24 Stunden kultiviert, wodurch sie ihre Proliferation aufgrund der Expression heterologer schwerer Immunglobulinketten einstellen. Die Zellen werden anschließend geerntet und können für die Transplantation in immundefiziente Mäuse verwendet werden, wo diese Zellen B-Zelllinien-Kompartimente rekonstituieren, und wo sie in der Lage sind, an einer Immunantwort teilzunehmen und Zellen entstehen zu lassen, die heterologe Antikörper sezernieren.
Beispiel 9: Transplantation langfristig proliferierender muriner Vorläufer-B-Zellen in Mäuse zur Herstellung heterologer Antikörper
Von Stromazellen und IL7 abhängige PräB-Zellen, die heterologe IgH- und L-Ketten von stabil transduzierten retroviralen Expressionsvektoren exprimieren, werden intravenös in entweder B-Zell-defiziente JHT-Mäuse, oder zusammen mit CD4⁺T-Helferzellen in CB17 SCID, RAG-2 oder RAG-2-defiziente Mäuse injiziert, sodass die transplantierten Zellen nach antigener Stimulierung der transplantierten Mäuse T-zell-abhängige oder -unabhängige Immunantworten ausbilden können.
Hierfür werden 1,5 bis 3 Monate alte Mäuse subletal mit 300–600 rad γ-bestrahlt, und 4–6 Stunden nach der Bestrahlung werden den Mäusen intravenös 5 × 10⁶ bis 10⁷ in PBS resuspendierte PräB-Zellen injiziert. Im Falle der zusätzlichen Transplantation von CD4⁺T-Helferzellen werden CD4⁺-Zellen isoliert aus einem Pool zervikaler, axillärer, mesenterialer und inguinaler Lymphknoten syngener Mäuse, indem B-Zellen und CD8⁺ T-Zellen durch Verwendung von Dynabeads, die mit anti-Maus-Ig-Antikörpern von Schafen beschichtet sind (Milan Analytica AG, La Roche, Schweiz), entfernt werden. 10⁶ Zellen hiervon, die gewöhnlich mehr als 90% reine CD4⁺T-Helferzellen sind, werden zusammen mit PräB-Zellen co-injiziert. Innerhalb eines Zeitraums von 6 Wochen nach der Transplantation rekonstituieren die Zellpopulationen in den transplantierten Rezipienten B- und T-Zell-Kompartimente.
Beispiel 10: Immunisierung von Mäusen mit PräB-Zell-Implantat
Die Immunisierungen immungeschädigter Mäuse, die mit HuPräB-Zellen und T-Helferzellen transplantiert und rekonstituiert worden sind, erfolgen im wesentlichen wie beschrieben (Harlow und Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, S. 150–173, 1988). Kurz gesagt, werden 10 bis 50 μg Antigen in 250 μl PBS gelöst und kräftig mit 250 μl vollständigem Freund's Adjuvanz vermischt, bevor die Mischung aus Antigen und Adjuvanz intraperitoneal injiziert wird. Zwei Wochen später erhalten die Mäuse einen intraperitonealen Boost mit 5–20 μg Antigen, welches dieses Mal mit unvollständigem Freund's Adjuvanz vermischt ist. Zehn Tage nach dem ersten Boost werden die Mäuse auf das Vorhandensein antigenspezifischer heterologer Antikörper im Serum analysiert. Die besten Kandidaten werden wiederum vier Wochen später einem Boost mit 5–20 μg Antigen in unvollständigem Freund's Adjuvanz sowohl intraperitoneal als auch intravenös ausgesetzt. 3 Tage später werden aus den Mäusen Milzzellen isoliert und für die Herstellung von Hybridomzellen verwendet, die heterologe Antigen-spezifische monoklonale Antikörper sezernieren.
Beispiel 11: In vitro Stimulierung von HuPräB-Zellen zur Differenzierung in Antikörper-sezernierende Plasmazellen
Von Stromazellen und IL7 abhängige HuPräB-Zellen können auch vollständig in Gewebekultur in vitro in Antikörper-sezernierende Zellen differenziert werden. Hierfür werden kontinuierlich proliferierende HuPräB-Zellkulturen zuerst in B-Zellen differenziert, die bezüglich Oberflächen-gebundener Immunglobuline positiv sind, indem dem Gewebekulturmedium Il7 entzogen und die Kultivierung auf bestrahlten Stromazellen für weitere 2 oder 3 Tage fortgesetzt wird. Die Abwesenheit von Wachstumsfaktoren im Medium führt zum Stillstand der Proliferation und zur Induktion einer Differenzierung, welche von der Induktion von Apoptose begleitet wird, sofern in den differenzierenden Zellen nicht ein anti-apoptotisches Gen wie Bcl-2 exprimiert wird.
Die differenzierten Zellen werden geerntet und auf frische bestrahlte Stromazellen überführt, z. B. in Anwesenheit von 100 U/ml rIL4 und 20 μg/ml eines monoklonalen agonistischen Anti-CD40-Antikörpers. Die Zellen differenzieren sich innerhalb einer Kulturdauer von 5–6 Tagen in große proliferierende Zellen des Plasmazell-Phänotyps, die in der Lage sind, große Mengen an Antikörpern von den heterologen Ig-Genloci zu sezernieren, und die zur Herstellung von heterologe monoklonale Antikörper sezernierenden Hypridom-Zellklonen verwendet werden können.
Beispiel 12: Fusion von Myelomzellen mit von HuPräB-Zellen abgeleiteten Plasmazellen zur Herstellung von humane monoklonale Antikörper produzierenden Hybridomas
Zur Immortalisierung von aus HuPräB-Zellen abgeleiteten Plasmazellen, entweder im Wege der Differenzierung in vitro (Beispiel 11), oder nach Immunisierung transplantierter Mäuse (Beispiel 10), müssen die Plasmazellen mit einer unsterblichen Myelom-Zellline fusioniert werden. Die für die Zellfusion verwendeten Myelom-Zelllinen weisen einen Mangel bezüglich der Expression des Gens HGPRT auf, das in dem Salvage-Pathway der Nukleotid-Biosynthese eine Rolle spielt. Während sich diese Zellen in gewöhnlichem Gewebekulturmedium unendlich kultivieren lassen, werden sie sterben, wenn die de novo Nukleotidsynthese durch Zugabe von z. B. des Wirkstoffes Aminopterin zum Gewebekulturmedium blockiert wird. Demgegenüber können Zellen, die das Gen HGPRT exprimieren, überleben aufgrund der de novo Nukleotidsynthese durch Aminopterin, insbesondere, wenn zusätzliches Thymidin und Hypoxanthin zugesetzt werden, da das HGPRT-Genprodukt diese Substanzen für die Synthese von Pyrimidin- beziehungsweise Purinnukleotiden verwenden kann. Daher werden in HAT-Selektionsmedium (enthaltend Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin) lediglich solche Zellen überleben und proliferieren, die aus einer Fusion der sterblichen, aber HGPRT⁺ aufweisenden, Antikörper-sezernierenden Plasmazelle mit der unsterblichen, aber HGPRT-negativen und daher gegenüber Aminopterin sensitiven Myelomzelle entstanden sind. Diese Zellen werden Hybridomzellen genannt und, sofern subkloniert, sezernieren einen monoklonalen Antikörper mit einer Spezifität, die von der Plasmazelle als Fusionspartner kodiert wird.
Für die Herstellung von Hybridomzellen werden entweder Plasmazellen aus der Milz von immunisierten Mäusen, die HuPräB-Zell-Transplantate enthalten, oder Plasmazellen verwendet, die in vitro durch Stimulierung mit Anti-CD40 und IL4 gebildet worden sind. In jedem Falle wird eine homogene Zellsuspension hergestellt und zweimal mit IMDM Medium ohne jegliche Zusätze gewaschen, was durch wiederholte Schritte der Zentrifugation (500 g, 5 min) und Resuspension erfolgt.
5 × 10⁶ Myelomzellen (Sp2/0 Köhler und Milstein, Eur. J. Immunol., 6, S. 511–519, 1976, oder X63Ag8.653 Kearney et al., J. Immunol., 123, S. 1548–1550, 1979) und 5 × 10⁷ Milzzellen (oder 5 × 10⁷ in vitro-differenzierte Plasmazellen) werden kombiniert, vermischt und wiederum 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Dem Zellpellet wird langsam 1 ml einer 50%igen Verdünnung von Polyethylenglykol (PEG) 1500 in IMDM Medium zugegeben, während die Zellen mittels Tapping resuspendiert werden. Nach einer Inkubation von 2 Minuten werden langsam 10 ml DMEM Medium ohne Zusätze zugegeben, und die Zellen werden 5 Minuten lang bei 500 g zentrifugiert. Nach dem Entfernen des Überstandes wird das Zellpellet in 1 Liter eines auf IMDM basierenden Stromazell-Wachstumsmediums (beschrieben im Beispiel 1) resuspendiert, welches 100 U/ml rekombinantes IL6 und 1× konzentrierten HAT-Zusatz enthält. Die Zellen werden auf 50 Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen verteilt und bei 37°C inkubiert, bis einzelne Hybridomklone identifiziert und zur weiteren Kultivierung und Charakterisierung in Gewebekultur isoliert werden können.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Herstellung von Vertebraten-Lymphozyten, die verwendet werden können zur Produktion irgendeines Bindeproteins oder eines oder mehrerer funktioneller Fragmente davon mit der Fähigkeit, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigenrezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines funktionellen Fragments davon, umfassend die folgende Schritte: (a) genetische Modifizierung von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die (i) aus primären lymphoiden Organen stammen und (ii) das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, durch Einbringen mindestens eines exogenen genetischen Elementes, welches mindestens ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert; und (b) Herbeiführung der Differenzierung der genetisch modifizierten Vorläufer-Lymphozyten in reife Zellen der lymphoiden Linie entweder in vitro oder in vivo, wodurch Lymphozyten generiert werden, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment(e) davon zu produzieren, unter der Maßgabe, dass die in vivo Produktion in Menschen ausgeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 1, ferner umfassend den Schritt der Immortalisierung der differenzierten Lymphozyten durch: (a) Fusion derselben mit Myelomzellen zur Erzeugung von Hybridomzellen; (b) Infektion derselben mit transformierenden Viren; oder (c) Transfektion derselben mit einem Vektorkonstrukt, welches die Expression von mindestens einem transformierenden Onkogen sicherstellt; wodurch Vertebraten-Lymphozyten erzeugt werden, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment(e) davon permanent zu produzieren.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten in der Lage sind, mindestens eine Komponente der lymphoiden V(D)J-Rekombinationsmaschinerie zu exprimieren, und abstammen von kiefertragenden Vertebraten umfassend Knorpelfische, Knochenfische, Amphibien, Reptilien, Vögel, und Säugetiere einschließlich Schweine, Schafe, Rinder, Pferde, und Nagetiere einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen, wobei murine Vorläufer(prä)-B-Lymphozyten von Mäusen bevorzugt sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten ihr Potential zur Expression endogener Antiköper und/oder Antigen-Rezeptoren oder funktioneller Fragmente davon verloren haben, was erreicht wird durch Isolation/Selektion von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die hinsichtlich der Expression endogener Immunglobuline oder funktioneller Fragmente davon defizient sind, und/oder durch Einbringen in die Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten von mindestens einem Vektorkonstrukt zur funktionellen Inaktivierung von mindestens einem Allel mindestens eines genetischen Elementes, welches ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (a) den kodierenden Regionen des Immunglobulin-Genlocus für die schwere Kette, einschließlich sämtlicher oder Teilen der V-, D- und J-Gensegmente, und irgendeiner der kodierenden Regionen für die Exons der konstanten Regionen für die schweren Ketten μ, δ, γ, ε, und α, mit oder ohne ihrer Membran-überspannenden Exons; (b) den kodierenden Regionen der Immunglobulin-Genloci für die leichte Kette κ und/oder λ, einschließlich jedweder kodierender Regionen der V- und J-Gensegmente, als auch jedweder Exons für die konstanten Regionen; (c) den kodierenden Regionen der T-Zell-Rezeptor Genloci α, β, γ, and δ, einschließlich sämtlicher oder Teilen der V-, D- und J-Gensegmente, und irgendeiner der kodierenden Regionen für die Exons α, β, γ, and δ der konstanten Regionen; (d) den cis-agierenden Enhancer-Elementen des Immunglobulin-Genlocus für die schwere Kette, einschließlich des Intron-Enhancers und des 3'α Enhancers der schweren Kette; (e) den cis-agierenden Enhancer-Elementen des Immunglobulin-Genlocus für die leichte Kette, einschließlich des κ-Intron-Enhancers (κiE), des 3'κ Enhancers und des λ2-4 und λ3-1 Enhancers; (f) den cis-agierenden Enhancer-Elementen der T-Zell-Rezeptor Genloci, einschließlich der TCR-Enhancer α, β, γ, and δ; (g) den trans-agierenden, die Rekombination aktivierenden Genen RAG-1 und RAG-2, einschließlich ihrer Promotor- und Enhancer-Elemente als auch ihrer kodierenden Regionen; und (h) den trans-agierenden, für die V(D)J-Rekombination essentiellen DNA-Reparaturgenen, einschließlich Ku70, Ku86, der katalytischen Untereinheit der DNA-abhängigen Protein-Kinase (DNA-PKcs), DANN Ligase IV, XRCC4 und Artemis, einschließlich ihrer Promotor- und Enhancer-Elemente als auch der kodierenden Regionen dieser Gene.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Vektorkonstrukte Gen-Targeting-Vektoren einschließen, welche DNA-Regionen mit Sequenzhomologie zu dem mindestens einen genetischen Element umfassen und die homologe Rekombination ermöglichen und vorzugsweise einen positiven Selektionsmarker flankieren, der die Selektion positiver Transfektanten ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Gen-Targeting-Vektoren zusätzlich ein Paar von DNA-Erkennungssequenzen für ortsspezifische DNA-Rekombinationsenzyme umfassen, die den positiven Selektionsmarker flankieren, wodurch die Deletion des positiven Selektionsmarkers bei Transfektion und transienter Expression von Nukleinsäuresequenzen, die mindestens eines der spezifischen Rekombinaseenzyme kodieren, ermöglicht wird.
verfahren nach Anspruch 5 oder 6, wobei die Plasmid-Vektoren für das Gen-Targeting zusätzlich einen negativen Selektionsmarker umfassen, der die Selektion gegen Transfektanten ermöglicht, in denen die Gen-Targeting-Vektoren zufällig durch nicht-homologe Rekombination in das Genom integriert sind.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei das mindestens eine exogene genetische Element, das ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert, auf einem genetischen Konstrukt liegt, welches ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) rekombinanten retroviralen DNA-Konstrukten umfassend Promotor-, Enhancer- und kodierende Nukleinsäuresequenzen, die operationell gekoppelt sind, um die Expression zu ermöglichen von mindestens einem Bindeprotein oder funktionellen Fragment davon, welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist oder artifiziell ist; (b) rekombinanten, auf Plasmiden basierenden DNA-Konstrukten umfassend Promotor-, Enhancer- und kodierende Nukleinsäuresequenzen, die operationell gekoppelt sind, um die Expression zu ermöglichen von mindestens einem Bindeprotein oder funktionellen Fragment davon, welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist oder artifiziell ist; (c) rekombinanten, auf Plasmiden basierenden Mini-Immunglobulin- oder T-Zell-Rezeptor-Genloci mit nicht-umgelagerten V-, D- und J-Gensegmenten, die operationell gekoppelt sind, um eine V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression zu ermöglichen von mindestens einem heterologen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor oder funktionellen Fragment davon, welcher bzw. welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist; (d) artifiziellen Chromosomen von Bakterien, Hefen oder Vertebraten, die Teile oder sämtliche Genloci für Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in Keimbahnkonfiguration umfassen und operationell gekoppelt sind, um eine V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression zu ermöglichen von mindestens einem heterologen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor oder funktionellen Fragment davon, welcher bzw. welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist; (e) artifiziellen Chromosomen von Bakterien, Hefen oder Vertebraten, die Teile oder sämtliche Bereiche mindestens eines heterologen Genlocus für Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in derart modifizierter Anordnung umfassen, damit die V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression ermöglicht wird von mindestens einem heterologen Antikörper oder T-Zell-Rezeptor oder funktionellen Fragment davon, welcher bzw. welches entweder die Wildtyp-Form oder eine oder mehrere Mutation(en) in der bzw. den primären Aminosäuresequenz(en) aufweist; (f) transchromosomalen Elementen, welche Fragmente von heterologen Chromosomen sind und Teile oder sämtliche Genloci für Immunglobuline oder T-Zell-Rezeptoren in Keimbahnkonfiguration aufweisen und eine V(D)J-Rekombination und die nachfolgende Expression mindestens eines heterologen Antikörpers oder T-Zell-Rezeptors erlauben, welcher hinsichtlich der primären Aminosäuresequenz(en) die Wildtyp-Form aufweist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das mindestens eine exogene genetische Element einen nativen oder modifizierten humanen Antikörper, ein humanes Bindeprotein, einen humanen Antigen-Rezeptor, oder ein oder mehrere funktionelle Fragmente davon kodiert.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das mindestens eine exogene genetische Element einen heterologen oder artifiziellen Rezeptor kodiert, dessen Binderegion einer Affinitätsreifung unterzogen werden kann.
Verfahren nach irgendeinem der vorhergehenden Ansprüche, bei dem die Differenzierung der Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten in vitro herbeigeführt wird durch: (a) Anhalten der Proliferation der Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten und Induzieren der Differenzierung in reife Zellen der lymphoiden Linie durch Kultivieren derselben in Abwesenheit irgendeines Vorläufer-Lymphozyten-Wachstumsfaktors, und (b) Induzieren der terminalen Lymphozyten-Differenzierung durch weiteres Kultivieren der Zellen in Gegenwart mindestens einer der folgenden Komponenten ausgewählt aus: (i) löslichen, mit T-Zellen im Zusammenhang stehenden stimulierenden Faktoren, umfassend Interleukin-2, Interleukin-4, Interleukin-5, Interleukin-6, Interleukin-10, Interleukin-13, TGF-β, und IFN-γ; (ii) Faktoren, die co-stimulatorische B-Zell-Rezeptoren aktivieren, umfassend agonistische Antikörper oder aktive rekombinante Liganden, spezifisch für CD40, B7-1 (CD80), B7-2 (CD86), Komplement-Rezeptoren 1 (CD35) und 2 (CD21), LFA-1 (CD11a), LFA-3 (CD58), CD19, CD20, CD30, CD32, CD37, CD38, CD70, CD71, Igα (CD79α), Igβ (CD79β), TAPA-1(CD81), Fas (CD95), TNF-Rezeptor1 (p55, CD120a), TNF-Rezeptor2 (p75, CD120b), Ox-40 (CD134), und Lymphotoxin-β-Rezeptor; und (iii) B-Zell mitogenen Faktoren, T-Zell-unabhängigen Antigenen des Typs 1, und anderen polyklonalen Aktivatoren, einschließlich Lipopolysacchariden (LPS), Lipoproteinen von Gram-negativen Bakterien, Polyanionen, Poly-dIdC, Pokeweed-Mitogen (PWM), und Anti-Immunglobulin-Reagenzien; und Kombinationen davon.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Differenzierung in vivo durch die Transplantation der genetisch modifizierten Vorläufer-Lymphozyten in einen geeigneten Vertebraten-Rezipienten herbeigeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Lymphozyten in den Rezipienten zusammen mit nativen oder Antigen-vorbehandelten T-Helfer-Lymphozyten co-transplantiert werden.
Verfahren nach Anspruch 12 oder 13, wobei sich an die Differenzierung in vivo die Immunisierung des Rezipienten mit mindestens einer gewünschten immunogenen Verbindung oder Zusammensetzung anschließt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 14, wobei der Vertebraten-Rezipient ein kompatibler Rezipient ist und eine Defizienz aufweist im Hinblick auf die Erzeugung endogener B-Zellen, T-Zellen und/oder NK(Natürliche Killer)-Zellen, oder einer Kombination davon.
verfahren nach einem der Ansprüche 12 bis 15, wobei der Vertebraten-Rezipient ausgewählt wird aus kiefertragenden Vertebraten umfassend Knorpelfische, Knochenfische, Amphibien, Reptilien, Vögel, und Säugetiere einschließlich Schweine, Schafe, Rinder, Pferde, und Nagetiere einschließlich Mäuse, Ratten, Kaninchen und Meerschweinchen, wobei Mäuse die bevorzugte Rezipientenspezies ist.
Verfahren zur Herstellung irgendeines Bindeproteins oder eines oder mehrerer funktioneller Fragmente davon mit der Fähigkeit, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahnkodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines funktionellen Fragmentes davon, in einer per se bekannten Weise, beinhaltend die folgenden Schritte: (a) genetische Modifizierung von Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die (i) aus primären lymphoiden Organen stammen und (ii) das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, durch Einbringen mindestens eines exogenen genetischen Elementes, welches mindestens ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert; oder, alternativ, durch Verwendung genetisch modifizierter Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die (i) aus primären lymphoiden Organen stammen und (ii) das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, und (iii) mindestens ein exogenes genetisches Element aufweisen, welches mindestens ein Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon kodiert; (b) Herbeiführung der Differenzierung der genetisch modifizierten Vorläufer-Lymphozyten in reife Zellen der lymphoiden Linie entweder in vitro oder in vivo, wodurch genetisch modifizierte und differenzierte Vertebraten-Lymphozyten generiert werden, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon herzustellen, oder, alternativ, Verwendung der genetisch modifizierten und differenzierten Vertebraten-Lymphozyten, die in der Lage sind, das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon herzustellen; (c) Herbeiführung der Expression des Bindeproteins oder funktionellen Fragments davon; unter der Maßgabe, dass die in vivo Produktion in Menschen ausgeschlossen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 17, wobei Schritt (b) gefolgt wird von den Schritten: (a) Isolierung des mindestens einen exogenen genetischen Elementes aus den differenzierten Lymphozyten, und (b) Platzierung des bzw. der genetischen Elemente(s) in einen Kontext, der die Produktion des mindestens einen Bindeproteins oder funktionellen Fragments davon ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon eine einzigartige Spezifität aufweist und daher monoklonal ist.
Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, wobei das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon mehr als eine einzigartige Spezifität aufweist und daher polyklonal ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei das Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon vollständig oder teilweise hinsichtlich der strukturellen und/oder funktionellen Eigenschaften übereinstimmt mit einem menschlichen Antikörper, Antigen-Rezeptor, oder Bindeprotein, wie er bzw. es auf der Basis des menschlichen genetischen Repertoires oder Teilen davon zusammengebaut werden kann.
Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei das herzustellende Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus: (a) membrangebundenen oder sezernierten Antikörpern, bestehend aus heterologen Polypeptiden der schweren und leichten Ketten in der bei natürlichen Antikörpern vorliegenden stöchiometrischen Zusammensetzung, und bestehend aus irgendeinem der für die schweren (μ, δ, γ, α, ε) und/oder leichten (κ und λ) Ketten bekannten Isotypen; (b) Antikörpern mit Kombinationen von Polypeptiden der schweren und leichten Ketten, die im Hinblick auf die primäre Aminosäuresequenz vollständig human sind; (c) Hybrid-Antikörpern, die heterologe Polypeptide der schweren oder leichten Ketten von verschiedenen Vertebraten-Spezies enthalten; (d) sezernierten Fab-, scFv- und F(ab')2-Antikörperfragmenten, die entweder vollständig oder teilweise heterolog sind; (e) Fragmenten von Antikörpern, die über Linkerpeptide kovalent verbunden sind, woraus bispezifische oder multispezifische Antikörperfragmente resultieren; (f) T-Zell-Rezeptoren des α-, β-, γ- und δ-Isotyps, Antigen-Rezeptoren, und anderen Bindeproteinen mit struktureller Ähnlichkeit zu Proteinen der Immunglobulin-Superfamilie; und funktionellen Fragmenten davon.
Genetisch modifizierte Vertebraten-Vorläufer-Lymphozyten, die (a) aus primären lymphoiden Organen stammen und das Potential haben, sich in reife Zellen der lymphoiden Linie zu differenzieren, (b) mindestens ein exogenes genetisches Element tragen, das mindestens ein heterologes Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon mit der Fähigkeit kodiert, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten heterologen Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines heterologen artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp- Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines beliebigen funktionellen Fragments davon, und (c) mindestens einen Selektionsmarker tragen, der mit dem mindestens einen exogenen genetischen Element operationell verbunden ist.
Reife Zellen der lymphoiden Linie, die (a) mindestens ein exogenes genetisches Element tragen, das mindestens ein heterologes Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon mit der Fähigkeit kodiert, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten heterologen Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines heterologen artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines beliebigen funktionellen Fragments davon, und (b) mindestens einen Selektionsmarker tragen, der mit dem mindestens einen exogenen genetischen Element operationell verbunden ist.
Immortalisierte Zellen, die von reifen Zellen der lymphoiden Linie abstammen, und (a) mindestens ein exogenes genetisches Element tragen, das mindestens ein heterologes Bindeprotein oder funktionelles Fragment davon mit der Fähigkeit kodiert, selektiv an ein Antigen oder einen Liganden zu binden, einschließlich irgendeines heterologen Antikörpers, irgendeines aus variablen Domänen und konstanten Regionen zusammengesetzten heterologen Antigen-Rezeptors umfassend T-Zell-Rezeptoren und membrangebundene Immunglobuline, irgendeines heterologen artifiziellen Bindeproteins mit entweder Wildtyp-Immuneffektorfunktionen oder modifizierten oder artifiziellen Effektorfunktionen, welche nicht von Keimbahn-kodierten heterologen Immunglobulinen oder Antigen-Rezeptoren hergeleitet werden können, und irgendeines beliebigen funktionellen Fragments davon, (b) mindestens einen Selektionsmarker tragen, der mit dem mindestens einen exogenen genetischen Element operationell verbunden ist, und (c) das mindestens eine heterologe Bindeprotein oder funktionelle Fragment davon produzieren.