ES2297672T3 - Metodos para la diversificacion genetica en celulas activas en la conversion genica. - Google Patents
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Abstract
Método para la diversificación dirigida y selectiva de genes de inmunoglobulinas endógenos o partes de los mismos mediante hipermutación o una combinación de hipermutación y conversión génica que comprende delecionar todos o parte de los donadores de conversión génica en una célula B de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de conversión génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones perjudiciales en genes que codifican para parálogos y análogos de la proteína RAD51.
Description
Métodos para la diversificación genética en
células activas en la conversión génica.
La presente invención se refiere a un método
para la diversificación genética dirigida y selectiva de una
secuencia de ácido nucleico diana o producto génico aprovechando la
relación entre la conversión génica de inmunoglobulinas y la
hipermutación en células productoras de anticuerpos.
Muchos enfoques de la generación de diversidad
en productos génicos se basan en la generación de un número muy
grande de mutantes que entonces se seleccionan usando potentes
tecnologías de selección. Sin embargo, estos sistemas tienen varias
desventajas. Si la mutagénesis se realiza in vitro con
constructos génicos que posteriormente se expresan in vitro
o como transgenes en células o animales, la expresión génica en el
contexto fisiológico es difícil y el repertorio de mutantes está
fijado en el tiempo. Si por otra parte la mutagénesis se realiza en
células vivas, es difícil dirigir las mutaciones a un ácido nucleico
diana en el que se desean. Por tanto, es limitada la eficacia de
aislar moléculas con actividad mejorada mediante ciclos repetidos de
mutaciones y selección con eficacia suficiente. Además, la
mutagénesis al azar in vivo es tóxica y es probable que
induzca un alto nivel de mutaciones secundarias no deseables.
En la naturaleza, la diversificación dirigida de
una secuencia de ácido nucleico seleccionado tiene lugar en los
segmentos V(D)J reorganizados de los loci de los genes
de inmunoglobulinas (Ig). El repertorio primario de especificidades
de anticuerpos se genera mediante un procedimiento de reorganización
del ADN que implica unir los segmentos génicos V, D y J de
inmunoglobulinas. Tras el encuentro con el antígeno, los segmentos
V(D)J reorganizados en esas células B, cuya Ig de
superficie puede unirse al antígeno con afinidad baja o moderada,
se someten a una segunda oleada de diversificación mediante
hipermutación. Esta denominada hipermutación somática genera el
segundo repertorio a partir del cual se seleccionan especificidades
de unión mejoradas permitiendo así la maduración de la afinidad de
la respuesta inmunitaria humoral (Milstein y Rada, 1995).
Los loci de inmunoglobulinas de ratón y ser
humano contienen grandes combinaciones de segmentos génicos V, D y
J que pueden participar en la reorganización V(D)J, de
manera que se crea una diversidad significativa en esta fase
mediante combinación al azar. Otras especies tales como pollo,
conejo, vaca, oveja y cerdo emplean una estrategia diferente para
desarrollar su repertorio de Ig primario (Butler, 1998). Tras la
reorganización de un único segmento V y J funcional, se produce la
diversificación adicional del gen de la cadena ligera del pollo
mediante conversión génica en un órgano linfoide especializado, la
bolsa de Fabricio (Reynaud et al., 1987; Arakawa y
Buerstedde, en impresión). Durante este proceso, se transfieren
tramos de secuencias de genes pseudo-V no
funcionales al gen V reorganizado. Los veinticinco genes
pseudo-V está situados en el sentido de 5' del gen
V funcional y comparten homología de secuencia con el gen V. De
manera similar a la situación en seres humanos y ratones, la
maduración de la afinidad tras el encuentro con el antígeno tiene
lugar mediante hipermutación en los centros germinales esplénicos
del pollo (Arakawa et al., 1996).
Las tres actividades específicas de células B de
formación del repertorio de Ig (conversión génica (Arakawa et
al., 2002), hipermutación y recombinación de cambio de isotipo
(Muramatsu et al., 2000; Revy et al., 2000))
requieren la expresión del gen de la desaminasa inducida por
activación (AID). Aunque inicialmente se propuso que la AID es una
enzima de corrección de ADN (Muramatsu et al., 1999),
estudios más recientes indican que la AID modifica directamente el
ADN mediante desaminación de citosina en uracilo (Di Noia y
Neuberger, 2002). Sin embargo, la actividad de desaminación de
citosina debe regularse adicionalmente, dado que sólo diferencias
en el tipo, la ubicación y el procesamiento de la modificación de
ADN inducida por AID pueden explicar la aparición selectiva de
recombinación o hipermutación en diferentes especies y entornos de
células B. Basándose en el hallazgo de que ciertas mutaciones por
AID afectan a la recombinación de cambio, pero no a la hipermutación
somática, se sugirió que la AID necesita la unión de un cofactor
para iniciar la recombinación de cambio (Ta et al., 2003;
Barreto et al.,
2003).
2003).
El análisis de mutantes deficientes de DT40
indica que se necesitan el gen RAD54 (Bezzubova et al., 1997)
y otros miembros de la ruta de reparación de la recombinación de
RAD52 para la conversión génica de Ig eficaz (Sale et al.,
2001). La perturbación de análogos y parálogos de RAD51 reduce la
conversión génica de Ig e induce hipermutación en el gen de cadena
ligera reorganizado (Sale et al., 2001) lo que sugiere que un
defecto en la reparación del ADN mediante recombinación homóloga
puede cambiar la conversión génica de Ig en hipermutación.
Recientemente, se han desarrollado los primeros
sistemas celulares que aprovechan el fenómeno de la hipermutación
somática en el locus de inmunoglobulinas para generar mutantes de un
gen diana de manera constitutiva y dirigida. Estos sistemas
celulares permiten preparar un producto génico que tiene una
actividad deseada mediante etapas cíclicas de generación de
mutación y selección. Así, los documentos WO 00/22111 y WO 02/100998
describen una línea celular de linfoma de Burkitt humano (Ramos)
que puede producir hipermutación constitutiva dirigida de una
región de ácido nucleico específica. Esta región mutada puede ser el
segmento V reorganizado endógeno o un gen exógeno operativamente
unido a secuencias control que dirigen la hipermutación. Una
desventaja significativa de este sistema celular es que las células
humanas no pueden manipularse genéticamente de manera eficaz
mediante integración dirigida, ya que los constructos transfectados
se insertan principalmente en posiciones cromosómicas al azar.
El documento WO 02/100998 también describe otro
sistema celular para generar diversidad genética en el locus de Ig
que se basa en la línea de células B de pollo DT40. DT40 continúa la
conversión génica del gen de inmunoglobulinas de cadena ligera
reorganizado durante el cultivo celular (Buerstedde et al.,
1990). De manera importante, esta línea celular tiene una elevada
razón de integración dirigida con respecto a al azar de constructos
transfectados, permitiendo así una manipulación genética eficaz
(Buerstedde y Takeda, 1991). Según el documento WO 02/100998, la
deleción en DT40 de los parálogos del gen RAD51 que están implicados
en la recombinación homóloga y la reparación de ADN condujo a una
disminución de la conversión génica y una activación simultánea de
la hipermutación del segmento V reorganizado. Sin embargo, la
principal desventaja de este sistema es que las células mutantes
tienen una deficiencia de reparación del ADN según se refleja
mediante sensibilidad a los rayos X e inestabilidad cromosómica.
Los mutantes también tienen una baja tasa de proliferación y una
baja eficacia de direccionamiento génico. Por tanto este sistema
está mal adaptado para la diversificación y selección génica
eficaces.
La presente invención supera las desventajas de
los sistemas de la técnica anterior y también proporciona ventajas
adicionales.
En un primer aspecto de la invención, se
proporciona un método para la diversificación dirigida y selectiva
de genes de inmunoglobulinas endógenos o partes de los mismos
mediante hipermutación o una combinación de hipermutación y
conversión génica que comprende delecionar todos o parte de los
donadores de conversión génica en una célula B de pollo, oveja,
vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de conversión génica de
inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones perjudiciales en genes
que codifican para parálogos y análogos del gen RAD51 que codifica
para importantes factores de recombinación homóloga.
En un segundo aspecto de la invención, se
proporciona un método para la diversificación dirigida y selectiva
de un ácido nucleico diana transgénico mediante (a) hipermutación o
(b) una combinación de hipermutación y conversión génica que
comprende insertar un constructo genético que comprende (a) el ácido
nucleico diana o (b) el ácido nucleico diana y al menos una
secuencia que puede servir como donador de conversión génica para
el ácido nucleico diana en el locus de inmunoglobulinas de una
célula B de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad
de conversión génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones
perjudiciales en genes que codifican para parálogos y análogos de
la proteína RAD51.
En un tercer aspecto de la invención, se
proporciona un método para la diversificación dirigida y selectiva
de un ácido nucleico diana transgénico mediante (a) hipermutación o
(b) una combinación de hipermutación y conversión génica que
comprende insertar un constructo genético que contiene secuencias
que dirigen la hipermutación y/o conversión génica y (a) el ácido
nucleico diana o (b) el ácido nucleico diana y al menos una
secuencia que puede servir como donador de conversión génica para
el ácido nucleico diana en el genoma de una célula B de pollo,
oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de conversión génica
de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones perjudiciales en
genes que codifican para parálogos y análogos de la proteína
RAD51.
Específicamente, la célula usada en los métodos
de la invención contiene factores de recombinación homóloga de tipo
natural. Debido a la maquinaria de recombinación homóloga intacta,
la célula según la invención es competente para la recombinación y
reparación y tiene una tasa de proliferación normal.
La célula usada en los métodos de la invención,
es decir una célula B de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo, es un
linfocito B que expresa inmunoglobulinas derivado de especies
animales que utilizan el mecanismo de conversión génica para
desarrollar su repertorio de inmunoglobulinas. Preferiblemente, la
célula se deriva de un linfoma bursal de pollo. Lo más
preferiblemente, la célula se deriva de, o está relacionada con, la
línea celular
DT40.
DT40.
El ácido nucleico diana puede codificar para una
proteína o presentar una actividad reguladora. Ejemplos de
proteínas son una cadena de inmunoglobulina, un marcador de
selección, una proteína de unión a ADN, una enzima, una proteína
receptora o una parte de los mismos. En una realización preferida,
el ácido nucleico diana es el segmento V(D)J de un
gen de inmunoglobulinas humano reorganizado. Ejemplos de ácido
nucleicos reguladores son un elemento regulador de la transcripción
o una secuencia de ARNi.
En una realización, en la que el ácido nucleico
diana se diversifica mediante una combinación de hipermutación y
conversión génica, la célula según la invención contiene al menos
una secuencia que puede servir como donador de conversión génica
para el ácido nucleico diana.
En una realización adicional, el ácido nucleico
diana es un ácido nucleico exógeno operativamente unido a
secuencias de ácido nucleico de control que dirigen la
diversificación genética.
En una realización adicional, el ácido nucleico
diana se expresa en la célula según la invención de manera que
facilita la selección de células que muestran una actividad deseada.
La selección puede ser una selección directa de la actividad del
ácido nucleico diana dentro de la célula, sobre la superficie
celular o fuera de la célula. Alternativamente, la selección puede
ser una selección indirecta de la actividad de un ácido nucleico
indicador.
En una realización adicional, la invención
proporciona medios genéticos para modular la diversificación
genética del ácido nucleico diana en la célula según la invención.
La modulación puede ser mediante la modificación de secuencias
reguladoras que actúan en cis, variando el número de donadores de
conversión génica, o mediante la modificación de factores
reguladores que actúan en trans tales como desaminasa inducida por
activación (AID) o un factor de reparación o recombinación de ADN
distinto de un análogo o parálogo de RAD51. La célula expresa
preferiblemente desaminasa inducida por activación (AID) de manera
condicional.
En un aspecto adicional, la invención
proporciona un método para preparar una célula que puede producir
diversificación genética dirigida y selectiva de un ácido nucleico
diana mediante hipermutación o una combinación de hipermutación y
conversión génica. El método comprende (a) transfectar una célula B
de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de
conversión génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones
perjudiciales en genes que codifican para parálogos y análogos de
la proteína RAD51 con un constructo genético que contiene el ácido
nucleico diana, y (b) identificar una célula que tiene el segmento
de gen V endógeno de una parte del mismo sustituido por el ácido
nucleico diana.
Según una realización adicional, el constructo
genético que contiene el ácido nucleico diana contiene además al
menos un ácido nucleico que puede servir como donador de conversión
génica para el ácido nucleico diana. El locus que contiene el ácido
nucleico diana puede construirse mediante transfección única o
múltiples tandas de transfección con constructos que contienen
diferentes componentes del locus.
En la realización en la que la selección de una
célula con una actividad deseada es indirecta, el método de la
invención comprende además (c) transfectar la célula de la etapa (b)
con un constructo genético adicional que comprende un gen indicador
que puede verse influido por el ácido nucleico diana.
En una realización adicional, el método de la
invención comprende además (d) la expresión condicional de un
factor regulador que actúa en trans. En una realización preferida,
el factor regulador que actúa en trans es desaminasa inducida por
activación (AID).
Según una realización particularmente preferida,
el ácido nucleico diana se inserta en la célula mediante
integración dirigida.
En un aspecto adicional, se proporciona un
método para preparar un producto génico que tiene una actividad
deseada, que comprende las etapas de: (a) transfectar una célula B
de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de
conversión génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones
perjudiciales en genes que codifican para parálogos y análogos de
la proteína RAD51 con un constructo genético que contiene un ácido
nucleico diana transgénico y opcionalmente al menos una secuencia
que puede servir como un donador de conversión génica para el ácido
nucleico diana; (b) cultivar las células en condiciones apropiadas
para expresar el ácido nucleico diana, (c) identificar una célula o
células dentro de la población de células que expresa un producto
génico mutado que tiene la actividad deseada; y (d) establecer una o
más poblaciones clonales de células a partir de la célula o células
identificadas en la etapa (c), y seleccionar a partir de dichas
poblaciones clonales una célula o células que expresa(n) un
producto génico que tiene una actividad deseada mejorada.
En una realización, las etapas (c) y (d) se
repiten de manera iterativa hasta que se produce un producto génico
con una actividad deseada optimizada.
Según una realización adicional, la
diversificación genética puede inactivarse, por ejemplo, mediante
regulación por disminución de la expresión de un factor regulador
que actúa en trans, cuando se ha identificado la célula que produce
un producto génico con una actividad deseada optimizada. El factor
regulador que actúa en trans puede ser, por ejemplo, desaminasa
inducida por activación (AID) o un factor implicado en la
recombinación homóloga o la reparación de ADN, distinto de un
parálogo o análogo de RAD51.
En otra realización, la diversificación del
ácido nucleico diana se modifica adicionalmente mediante la
optimización de la secuencia diana tal como la introducción de
puntos calientes de hipermutación de Ig o un aumento del contenido
en GC.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1 Deleción del gen \psiV. (A) Un
mapa físico del locus de cadena ligera de Ig reorganizado y los
constructos deficientes en \psiV. El locus contiene un total de 25
genes \psiV en el sentido de 5' del segmento V funcional. La
estrategia deficiente de genes \psiV mediante la integración
dirigida de los constructos p\psiVDel1-25 y
p\psiVDel3-25 se muestra a continuación. Sólo se
indican los sitios EcoRI relevantes. (B) Análisis de transferencia
de tipo Southern de clones de tipo natural y deficientes usando la
sonda mostrada en (A) tras la digestión con EcoRI. El locus de tipo
natural hibrida como un fragmento de 12 kb, mientras que los loci
\psiV^{parcial} y \psiV hibridan como un fragmento de 7,4 kb y
6,3 kb, respectivamente. (C) Estado de AID. Se amplificó el gen de
AID mediante PCR para verificar la presencia o ausencia del casete
de expresión de ADNc de AID.
Figura 2 Análisis de la expresión de IgMs de
clones control y deficientes en \psiV. (A) Perfiles de tinción
anti-IgM por FACS de subclones representativos
derivados de clones que eran inicialmente IgMs(+). (B) Porcentajes
promedio de acontecimientos que se dividen en grupos de IgMs(-)
basándose en la medición de 24 subclones.
Figura 3 Análisis de secuencia de la cadena
ligera de Ig de los clones deficientes en \psiV. Perfiles de
mutación de los clones AID^{R}\psiV^{-} y
AID^{R}\psiV^{parcial}. Todas las sustituciones de nucleótidos
identificadas en diferentes secuencias en la región desde la
secuencia líder hasta el intrón J-C se mapean en la
secuencia de cadena ligera reorganizada presente en el clon
precursor de AID^{R}. Las mutaciones de los clones
AID^{R}\psiV^{-} y AID^{R}\psiV^{parcial} se muestran
por encima y por debajo de la secuencia de referencia,
respectivamente. También se indican los acontecimientos de
conversión génica, inserciones y deleciones. Los motivos de puntos
calientes (RGYW y su complemento WRCY) se resaltan mediante
caracteres en negrita.
Figura 4 Perfiles de mutación de líneas
celulares de hipermutación. (A) Porcentajes de secuencias que
llevan un cierto número de mutaciones. Se cuenta cada sustitución
de nucleótidos sin molde, pero la conversión génica, deleciones e
inserciones que implican múltiples nucleótidos se cuentan como un
único acontecimiento. PM, mutación puntual; GC, conversión génica;
D, deleción; I, inserción. (B) Patrón de sustituciones de
nucleótidos dentro de secuencias de clones deficientes en \psiV y
XRCC3. Se excluyen las sustituciones de nucleótidos como parte de
acontecimientos de conversión génica. También se muestran las
razones de transición (trs) con respecto a transversión (trv). (C)
Preferencia de puntos calientes de mutaciones por sustitución de
nucleótidos sin molde. Las mutaciones que se producen dentro de un
motivo de puntos calientes (RGYW o su complemento WRCY) se muestran
mediante porcentajes. (D) Células positivas para azul trípano como
indicador de células que mueren de manera espon-
tánea.
tánea.
Figura 5 Distribución de sustituciones de
nucleótidos dentro de secuencias genómicas de células
AID^{R}\psiV^{-} no clasificadas y dentro de secuencias de
ADNc de células AID^{R}\psiV^{-} clasificadas como IgM(-).
Se cuenta el número de mutaciones para cada 50 pb, y se muestra
junto con los correspondientes mapas físicos del locus genómico de
la cadena ligera o la secuencia de ADNc.
Figura 6 Un modelo que explica la regulación
de la conversión génica de Ig y la hipermutación de Ig.
Figura 7 Mutagénesis in situ del gen
de la GFP. (A) Vector de sustitución de VJ de Ig. (B)
Mutagénesis in vivo del gen de la GFP mediante
hipermutación. (C) Vector de sustitución del donador de \psiV. (D)
Mutagénesis in vivo del gen de la GFP mediante conversión
génica e hipermutación.
La presente invención pone a disposición un
sistema celular particularmente útil para la diversificación
genética dirigida y selectiva de cualquier ácido nucleico mediante
hipermutación o una combinación de hipermutación y conversión
génica. El sistema se basa en líneas de células B que diversifican
de manera constitutiva in vitro el gen V de inmunoglobulinas
reorganizado sin requerir estímulos extracelulares tales como una
interacción con otras células o moléculas o el mantenimiento del
receptor antigénico de células B.
Tal como se usa en el presente documento,
"diversificación dirigida y selectiva" se refiere a la
capacidad de ciertas células para provocar la alteración de la
secuencia de ácido nucleico de una región específica de un ácido
nucleico endógeno o transgénico, mediante lo cual las secuencias
fuera de estas regiones no se someten a mutación.
"Diversificación genética" se refiere a la
alteración de nucleótidos individuales o tramos de nucleótidos en
un ácido nucleico. La diversificación genética en las células según
la invención se produce mediante hipermutación, conversión génica o
una combinación de hipermutación y conversión génica.
"Hipermutación" se refiere a la mutación de
un ácido nucleico en una célula a una tasa superior a la de fondo.
Preferiblemente, la hipermutación se refiere a una tasa de mutación
de entre 10^{-5} y 10^{-3} pb^{-1} generación^{-1}. Esto es
muy superior a las tasas de mutación de fondo, que son del orden de
10^{-9} a 10^{-10} mutaciones pb^{-1} generación^{-1}
(Drake et al. 1988) y de mutaciones espontáneas observadas
en PCR. Treinta ciclos de amplificación con polimerasa Pfu
producirán < 0,05 x 10^{-3} mutaciones pb^{-1} en el
producto, que en el presente caso representaría menos de 1 de cada
100 de las mutaciones observadas (Lundberg et al.,
1991).
"Conversión génica" se refiere a un
fenómeno en el que se transfiere información de secuencia de manera
unidireccional de un alelo homólogo al otro. La conversión génica
puede ser el resultado de una ADN polimerasa que cambia los moldes
y copia de una secuencia homóloga, o el resultado de una reparación
de apareamientos erróneos (nucleótidos que se eliminan de una
cadena y se sustituyen mediante síntesis de reparación usando la
otra cadena) tras la formación de un heterodúplex.
La hipermutación y la conversión génica generan
diversidad natural dentro del segmento V(D)J de
inmunoglobulinas de células B. La hipermutación tiene lugar en los
centros germinales de especies tales como el ratón y el ser humano
tras la estimulación antigénica. La conversión génica tiene lugar en
órganos linfoides primarios tales como la bolsa de Fabricio o el
tejido linfoide asociado al intestino en especies tales como pollo,
vaca, conejo, oveja y cerdo independientemente de la estimulación
antigénica. En el pollo, se transfieren tramos de los genes
pseudo-V en el sentido de 5' al segmento
V(D)J reorganizado. Por tanto, según la presente
invención la célula o línea celular es preferiblemente una célula o
línea celular productora de inmunoglobulinas que puede diversificar
sus genes de inmunoglobulinas reorganizados.
En los experimentos notificados en el presente
documento, se establece por primera vez una conexión directa entre
el inicio de la hipermutación y la conversión génica.
Específicamente, la deleción parcial o completa de genes
pseudo-V en una línea celular que continúa la
conversión génica en cultivo celular conduce a la activación de la
hipermutación en el locus de inmunoglobulinas. La deleción de todos
los pseudogenes da como resultado la supresión de la conversión
génica y la activación simultánea de altas tasas de hipermutación,
mientras que la deleción de unos cuantos pseudogenes da como
resultado la regulación por disminución de la conversión génica y
la activación simultánea de la hipermutación a tasas inferiores a
las observadas para la deleción completa de pseudogenes. Por tanto,
el número de donadores de pseudogenes disponibles está directamente
correlacionado con las tasas de conversión génica y está
inversamente correlacionado con las tasas de hipermutación. Se
establece que la conversión génica y la hipermutación están en
relación inversa entre sí. Por tanto, la presente invención
proporciona por primera vez un sistema celular que permite
diversificar genéticamente un ácido nucleico diana mediante una
combinación de hipermutación y conversión génica, mediante lo cual
la contribución de estos dos fenómenos puede regularse cambiando el
número de donadores de conversión génica, su orientación o su grado
o longitud de homología.
Una ventaja del sistema celular según la
invención con respecto a un sistema celular que sólo tiene actividad
de hipermutación tal como el basado en la línea celular de linfoma
de Burkitt humano Ramos (documentos WO 00/22111 y WO 02/100998) es
la capacidad para combinar la diversificación genética mediante
hipermutación y conversión génica en una célula. Por ejemplo,
pueden introducirse cambios más definidos en el gen diana mediante
conversión génica que mediante hipermutación al azar, ya que los
donadores de conversión génica pueden modificarse mediante
ingeniería para que contengan secuencias que es probable que
influyan en la actividad del ácido nucleico diana de manera
favorable. Así, la conversión génica y la hipermutación podrían
aumentar la posibilidad de producir variantes deseables, ya que se
combinan bloques de secuencias sometidos a prueba previamente con
hipermutaciones al azar. También pueden usarse pseudogenes con
secuencias idénticas a cierta región del gen diana para mantener
una parte del ácido nucleico diana estable mediante conversiones
frecuentes que tienen el efecto de que las hipermutaciones
persisten sólo en la parte sin conversión. Este enfoque es útil
cuando el ácido nucleico diana contiene una región que debe
permanecer estable para una actividad óptima.
Una ventaja del sistema celular según la
invención con respecto a un sistema celular basado en la supresión
de la actividad de recombinación homóloga en células activas en la
conversión génica (documento WO 02/100998) es la estabilidad
genética de la célula reflejada en una tasa de proliferación normal,
resistencia a la radiación y competencia de reparación de ADN.
Una ventaja particular del presente sistema
celular con respecto a todos los sistemas conocidos es la capacidad
de las células según la invención para integrar constructos de ácido
nucleico transfectados mediante integración dirigida en el locus
endógeno homólogo.
"Integración dirigida" es la integración de
un constructo de ácido nucleico transfectado que comprende una
secuencia de ácido nucleico homóloga a una secuencia de ácido
nucleico endógena mediante recombinación homóloga en el locus
endógeno. La integración dirigida permite insertar directamente
cualquier ácido nucleico en una posición cromosómica definida. En
una realización preferida, un ácido nucleico que codifica para un
producto génico de interés se inserta mediante integración dirigida
en el locus de inmunoglobulinas en lugar del segmento
V(D)J reorganizado o una parte del mismo.
En una realización preferida, las células usadas
en los métodos de la invención se derivan de, o están relacionadas
con, células que experimentan conversión génica de Ig in
vivo. Células que experimentan conversión génica de Ig in
vivo son, por ejemplo, células B que expresan Ig de superficie
en órganos linfoides primarios tales como células B bursales de
aves. Las células de linfoma, derivadas de células B de órganos
linfoides primarios, son candidatos particularmente buenos para
construir células y líneas celulares según la presente invención.
En la realización más preferida, las células se derivan de una línea
celular de linfoma bursal de pollo, DT40.
El procedimiento de diversificación genética
constitutiva mediante hipermutación y conversión génica se usa en
la presente invención para producir productos génicos con una
actividad deseada, novedosa o mejorada.
Un "ácido nucleico diana" es una secuencia
de ácido nucleico o región cromosómica en la célula según la
presente invención que se somete a diversificación genética directa
y selectiva. El ácido nucleico diana puede ser o bien endógeno o
bien transgénico y puede comprender una o más unidades de
transcripción que codifican para productos génicos.
Tal como se usa en el presente documento, un
"transgén" es una molécula de ácido nucleico que se inserta en
una célula, tal como mediante transfección o transducción. Por
ejemplo, un transgén puede comprender una unidad de transcripción
heteróloga que puede insertarse en el genoma de una célula en una
ubicación deseada.
En una realización, los transgenes son genes V
de inmunoglobulinas tal como se encuentran en células productoras
de inmunoglobulinas o fragmentos de genes V. Preferiblemente, el
ácido nucleico diana es un gen V de inmunoglobulinas humano. En
este caso, las células según la invención son "fábricas" de
variantes de anticuerpos humanos que pueden unirse a cualquier
antígeno dado.
Alternativamente, el ácido nucleico diana es un
ácido nucleico que no es de inmunoglobulinas, por ejemplo un gen
que codifica para marcadores de selección, proteínas de unión a ADN,
enzimas o proteínas receptoras. Por ejemplo, puede producirse un
marcador de selección fluorescente novedoso mutando un marcador
conocido mediante hipermutación o mediante una combinación de
hipermutación y conversión génica con ayuda de otros marcadores con
un espectro fluorescente diferente que sirven como donadores de
conversión génica.
En una realización de la invención, el ácido
nucleico diana codifica directamente para un producto génico de
interés. La diversificación génica de un ácido nucleico de este tipo
dará como resultado un truncamiento del producto génico codificado
o un cambio de su secuencia primaria. Con cada tanda de
diversificación y selección, se busca una célula que expresa el
producto génico con una actividad mejorada.
Alternativamente, el ácido nucleico diana es un
elemento regulador, por ejemplo, un elemento regulador de la
transcripción tal como un promotor o potenciador, o ARN de
interferencia (ARNi). En esta realización, se requiere un ácido
nucleico adicional (gen indicador), que se ve influido por el ácido
nucleico diana y codifica para un producto génico identificable,
para identificar células que llevan el ácido nucleico diana de
interés.
En la realización, en la que la diversificación
genética del ácido nucleico diana tiene lugar mediante una
combinación de hipermutación y conversión génica, se insertan ácidos
nucleicos adicionales que pueden servir como donadores de
conversión génica en el genoma de la célula, preferiblemente en el
sentido de 5' del ácido nucleico diana.
Un "ácido nucleico que puede servir como
donador de conversión génica" es un ácido nucleico que tiene una
secuencia homóloga al ácido nucleico diana. Ejemplos de donadores
naturales de conversión génica son genes pseudo-V
en el locus de inmunoglobulinas de ciertas especies.
Según una realización de la invención, se
construye una célula que puede producir diversificación dirigida y
selectiva del ácido nucleico diana insertando el ácido nucleico
diana en la célula huésped mediante integración dirigida en un
sitio cromosómico definido. Para ello, los constructos transfectados
pueden contener en el sentido de 5' y 3' del ácido nucleico diana
secuencias homólogas al sitio de integración cromosómica deseado.
Preferiblemente, la célula se construye sustituyendo el gen V
endógeno o fragmentos del mismo por un transgén mediante
recombinación homóloga, o mediante direccionamiento génico, de tal
manera que el transgén se convierte en una diana para los
acontecimientos de conversión génica y/o hipermutación.
En otra realización, los transgenes según la
invención también comprenden secuencias que dirigen la hipermutación
y/o conversión génica. Por tanto, se transfiere un locus entero que
puede expresar un producto génico y dirigir la hipermutación y
conversión génica a esta unidad de transcripción al interior de las
células y se diversifica activamente incluso tras la integración
cromosómica al azar.
La selección de clones que tienen el transgén
incorporado mediante integración dirigida puede realizarse mediante
análisis de transferencia de tipo Southern o mediante PCR.
En una realización preferida, los transgenes
según la invención contienen un gen de marcador seleccionable que
permite la selección de clones que tienen el transgén integrado de
manera estable. Este gen de marcador seleccionable puede eliminarse
posteriormente mediante recombinación o inactivarse por otros
medios.
La presente invención proporciona además un
método para preparar un producto génico que tiene una actividad
deseada mediante tandas repetidas de expansión celular y selección
de células que llevan un ácido nucleico diana con una actividad
deseada. Tal como se usa en el presente documento, "selección"
se refiere a la determinación de la presencia de alteraciones de
secuencia en el ácido nucleico diana que dan como resultado una
actividad deseada del producto génico codificado por el ácido
nucleico diana o una actividad deseada de la función reguladora del
ácido nucleico diana.
El procedimiento de conversión génica e
hipermutación se emplea in vivo para generar especificidades
de unión mejoradas o novedosas en moléculas de inmunoglobulina. Por
tanto, seleccionando células según la invención que producen
inmunoglobulinas que pueden unirse al antígeno deseado y después
propagando estas células con el fin de permitir la generación de
mutantes adicionales, pueden aislarse células que expresan
inmunoglobulinas que tienen una unión mejorada al antígeno
deseado.
Puede aplicarse una variedad de procedimientos
de selección para el aislamiento de mutantes que tienen una
especificidad deseada. Éstos incluyen citometría de flujo activada
por fluorescencia (FACS), separación de células usando partículas
magnéticas, métodos de cromatografía de antígenos y otras técnicas
de separación de células tales como el uso de perlas de
poliestireno.
La citometría de flujo activada por
fluorescencia (FACS) puede usarse para aislar células basándose en
sus moléculas de superficie diferentes, por ejemplo
inmunoglobulinas presentadas en superficie. Se tiñen las células en
la muestra o la población que va a clasificarse con reactivos
fluorescentes específicos que se unen a las moléculas de la
superficie celular. Estos reactivos serán el/los antígeno(s)
de interés unido(s) (ya sea directa o indirectamente) a
marcadores fluorescentes tales como fluoresceína, rojo Texas, verde
malaquita, proteína fluorescente verde (GFP) o cualquier otro
fluoróforo conocido por los expertos en la técnica. Entonces se
introduce la población de células en la cámara de flujo vibrante de
la máquina de FACS. La corriente de células que pasa hacia fuera de
la cámara se reviste con un recubrimiento de fluido tampón tal como
PBS (solución salina tamponada con fosfato). Se ilumina la
corriente mediante luz láser y se mide cada célula para determinar
la fluorescencia, indicando la unión del antígeno marcado con
fluorescencia. La vibración en la corriente de células hace que se
rompa en gotitas, que portan una pequeña carga eléctrica. Estas
gotitas pueden dirigirse mediante placas de deflexión eléctrica
controladas por ordenador para recoger diferentes poblaciones de
células según su afinidad por el antígeno marcado con
fluorescencia. De esta manera, las poblaciones de células que
muestran diferentes afinidades por el/los antígeno(s) de
interés pueden separarse fácilmente de las células que no se unen
al antígeno. Las máquinas de FACS y reactivos para su uso en FACS
están ampliamente disponibles a partir de fuentes de todo el mundo
tales como Becton-Dickinson, o de proveedores de
servicios tales como Arizona Research Laboratories
(http://www.arl.arizona.edu/facs/).
Otro método que puede usarse para separar
poblaciones de células según la afinidad de su(s)
proteína(s) de superficie celular por un antígeno particular
es la cromatografía de afinidad. En este método, se une
covalentemente una resina adecuada (por ejemplo
CL-600 Sepharose, Pharmacia Inc.) al antígeno
apropiado. Se rellena una columna con esta resina y se hace pasar
la población de células mixta por la columna. Tras un periodo de
incubación adecuado (por ejemplo 20 minutos), se eliminan las
células no unidas mediante lavado usando (por ejemplo) tampón PBS.
Esto deja sólo el subconjunto de células que expresan
inmunoglobulinas que se unen al/a los antígeno(s) de
interés, y entonces se eluyen estas células de la columna usando
(por ejemplo) un exceso del antígeno de interés, o escindiendo
enzimática o químicamente el antígeno de la resina. Esto puede
realizarse usando una proteasa específica tal como factor X,
trombina u otra proteasa específica conocida por los expertos en la
técnica para escindir el antígeno de la columna mediante un sitio de
escisión apropiado que se incorporó previamente en el complejo
antígeno-resina. Alternativamente, puede emplearse
una proteasa no específica, por ejemplo tripsina, para eliminar el
antígeno de la resina, liberando así la población de células que
mostró afinidad por el antígeno de interés.
La presente invención proporciona por primera
vez un mecanismo que permite regular la diversificación genética
del ácido nucleico diana. Tal como se demuestra por los presentes
inventores, la desaminasa inducida por activación (AID) es un
factor que regula la conversión génica así como la hipermutación en
el locus de inmunoglobulinas. Se sugiere que la AID induce una
modificación común en el segmento V(D)J reorganizado
que conduce a una sección de conversión en presencia de secuencias
donadoras adyacentes y a una mutación puntual en su ausencia. Por
tanto, mediante la regulación de la expresión de AID, pueden
modularse ambos fenómenos. En una realización preferida, el gen de
AID se expresa transitoriamente en la célula que contiene un ácido
nucleico diana. Por ejemplo, la AID puede expresarse bajo un
promotor sensible a fármaco tal como el sistema de expresión génica
responsable de tetraciclina. De otro modo, la expresión génica puede
interrumpirse mediante la escisión del casete de expresión de AID
mediante recombinación inducida. La inactivación de la expresión de
AID evitará la diversificación adicional de la secuencia diana.
Preferiblemente, la expresión de AID se inactiva en la célula que
produce un producto génico con una actividad deseada con el fin de
evitar mutaciones adicionales que pueden conducir a la pérdida de
la actividad deseada.
La invención se ilustra mediante los siguientes
ejemplos.
En el presente documento se notifica que la
ablación de donadores de \psiV activa la hipermutación de Ig
dependiente de AID en la línea de células B de pollo DT40. Esto
muestra que la conversión génica y la hipermutación de Ig son rutas
que compiten derivadas del mismo producto intermedio iniciado por
AID. Además, se propone DT40 deficiente en \psiV como sistema de
modelo ideal para hacer un enfoque del mecanismo molecular de la
hipermutación de Ig y como nueva herramienta para la mutagénesis
in situ.
Líneas celulares. Previamente se ha descrito
DT40^{CreI} que presenta un aumento de la conversión génica de Ig
debido a un transgén v-myb y contiene una Cre
recombinasa inducible por tamoxifeno (Arakawa et al., 2001).
Se generó DT40^{CreI}AID^{-/-} mediante perturbación dirigida de
ambos alelos de AID de DT40^{CreI} (Arakawa et al., 2002).
Se derivó AID^{R} de DT40^{CreI}AID^{-/-} tras la integración
estable de un casete bicistrónico
AID-IRES-GFP flanqueado por sitios
loxP, en el que tanto AID como GFP se expresan a partir del mismo
promotor de \beta-actina. Se derivó
AID^{R}\psiV^{-} de AID^{R} mediante transfección de
p\psiVDell-25 (figura 1A). Entonces se
identificaron transfectantes estables que habían integrado el
constructo en el locus de cadena ligera reorganizado, mediante PCR
específica de locus. La integración dirigida de
p\psiVDel1-25 da como resultado la deleción de los
loci del gen \psiV completo comenzando 0,4 kb en el sentido de 5'
de \psiV25 y acabando un pb en el sentido de 3' de \psiV1. Se
produjo AlDR\psiV^{parcial} de manera similar a
AID^{R}\psiV^{-} mediante transfección de
p\psiVDel3-25 que tras la integración dirigida
conduce a una deleción parcial de los loci de \psiV comenzando 0,4
kb en el sentido de 5' de \psiV25 y acabando un pb en el sentido
de 3' de \psiV3. Se realizaron cultivo celular y electroporación
tal como se describió anteriormente (Arakawa et al., 2002).
Se derivó XRCC3^{-/-} de DT40^{CreI} delecionando los
aminoácidos 72-170 del gen XRCC3 tras la
transfección de constructos deficientes en XRCC3. Inicialmente se
identificaron clones que habían experimentado integración dirigida
mediante PCR de larga distancia y entonces se confirmó la deleción
de XRCC3 mediante análisis de transferencia de tipo Southern.
Ensayo de reversión de Ig. La
subclonación, tinción de anticuerpos, citometría de flujo y
cuantificación de la expresión de IgMs se han descrito previamente
(Arakawa et al., 2002). Todos los clones usados en el estudio
fueron IgMs(+) debido a la reparación del desplazamiento del marco
de la cadena ligera de la variante C118(-) original (Buerstedde
et al., 1990) mediante un acontecimiento de conversión
génica.
PCR. Para minimizar las mutaciones
artificiales introducidas por PCR, se usó la polimerasa activada por
calor PfuUltra (Stratagene) para la amplificación antes de la
secuenciación. Se realizaron PCR de larga distancia,
RT-PCR y secuenciación de la cadena ligera de Ig tal
como se describió previamente (Arakawa et al., 2002). Se
secuenciaron el promotor y la región de intrón J-C
de clones de plásmidos de cadena ligera de Ig usando los cebadores
M13 directo e inverso. Se amplificaron los genes
Bu-1 y EF1\alpha usando pares de cebadores
BU1/BU2 (BU1, GGGAAGCTTGATCATITCCTGAATGCTATATTCA; BU2,
GGGTCTAGAAACTCCTAGGGGAAACTTTGCTGAG) y EF6/EF8 (EF6,
GGGAAGCTTCGGAAGAAAGAAGCTAAAGACCATC; EF8,
GGGGCTAGCAGAAGAGCGTGCTCACGGGTC
TGCC), respectivamente. Se clonaron los productos de PCR de estos genes en el vector de plásmido pBluescript y se secuenciaron usando el cebador M13 inverso.
TGCC), respectivamente. Se clonaron los productos de PCR de estos genes en el vector de plásmido pBluescript y se secuenciaron usando el cebador M13 inverso.
Se prepararon dos constructos deficientes en
\psiV clonando secuencias genómicas, que flanquean los puntos
finales de la deleción prevista, en el sentido de 5' y 3' de un
casete de gpt (guanina fosforribosil transferasa) flanqueado por
sitios loxP (Arakawa et al., 2001). Tras la integración
dirigida, el primer constructo, p\psiVDell-25,
deleciona todos los pseudogenes (de \psiV25 a \psiV1) mientras
que el segundo constructo, p\psiVDel3-25,
deleciona la mayor parte de los pseudogenes (de \psiV25 a
\psiV3) (figura 1A). Se seleccionó un clon positivo para IgM de
superficie (IgMs(+)), derivado de células DT40^{CreI}AID^{-/-}
(Arakawa et al., 2002) mediante transfección e integración
estable de un transgén de AID-IRES (sitio interno de
entrada al ribosoma) -GFP flanqueado por sitios loxP, para
determinar la transfección de los constructos deficientes en
\psiV. Este clon reconstituido por AID, denominado AID^{R},
tiene la ventaja de que las apariciones de mutaciones de la cadena
ligera de Ig perjudiciales pueden detectarse fácilmente mediante la
pérdida de la expresión de IgMs y que la expresión de AID marcada
por GFP puede interrumpirse tras la inducción por tamoxifeno del
transgén de Cre recombinasa heredado de DT40^{CreI} (Arakawa
et al., 2002).
Tras la transfección de los constructos
deficientes en \psiV en el clon AID^{R}, se identificaron clones
resistentes al ácido micofenólico que contenían deleciones
seleccionadas como diana del locus de cadena ligera reorganizado.
Estos clones deficientes en \psiV primarios contienen dos
transgenes flanqueados por sitios loxP, el gen marcador gtp
insertado en el locus de cadena ligera reorganizado y el gen de
AID-IRES-GFP del clon progenitor
AID^{R}. Ya que el gen gpt puede perturbar la transcripción
adyacente o la configuración de cromatina, se expusieron los clones
deficientes en \psiV primarios a una baja concentración de
tamoxifeno y después se subclonaron mediante dilución limitada. De
esta manera, pudieron aislarse clones deficientes en \psiV
secundarios que o bien habían delecionado sólo el gen gpt
(AID^{R}\psiV^{-} y AID^{R}\psiV^{parcial}) o el gen
gpt junto con el gen de AID-IRES-GFP
(AID^{-/-}\psiV^{-} y AID^{-/-}\psiV^{parcial}). La
perturbación de los genes \psiV en el locus de cadena ligera
reorganizado y la escisión del casete de sobreexpresión de AID se
confirmaron mediante análisis de transferencia de tipo Southern
(figura 1B) y PCR (figura 1C), respectivamente.
Para estimar las tasas de mutaciones de Ig
perjudiciales, se midió la expresión de Igs mediante FACS tras dos
semanas de cultivo para 24 subclones de cada uno de los clones
DT40^{CreI}, AID^{R}, DT40^{CreI}AID^{-/-} y deficientes en
\psiV (figuras 2A y 2B). El análisis de los controles con el locus
de \psiV intacto reveló un promedio del 0,52% y el 2,27% de
células IgMs(-) para los subclones DT40^{CreI} y AID^{R}
respectivamente, pero sólo del 0,08% para DT40^{CreI}AID^{-/-}.
Análisis previos de variantes de DT40 IgMs(-) que surgían
espontáneamente demostraron que aproximadamente un tercio contenía
mutaciones de desplazamiento del marco en el segmento V de cadena
ligera reorganizado que se consideraron como subproductos de la
actividad de conversión génica de Ig (Buerstedde et al.,
1990). Este punto de vista está ahora apoyado por el hallazgo de que
el clon DT40^{CreI}AID^{-/-} negativo para AID, que debería
haber perdido la actividad de conversión génica de Ig, permanece de
manera estable IgMs(+). De la manera más interesante, los subclones
de los clones deficientes en \psiV positivos para AID
(AID^{R}\psiV^{parcial} y AID^{R}\psiV^{-}) acumulan
rápidamente poblaciones IgMs(-) mientras que los subclones de los
clones deficientes en \psiV negativos para AID
(AID^{-/-}\psiV^{parcial} y AID^{-/-}\psiV^{-})
permanecen IgMs(+) (figuras 2A y 2B). Esto sugiere que la deleción
de los pseudogenes aumenta drásticamente la tasa de mutaciones de
cadena ligera perjudiciales en células que expresan AID.
Para analizar la actividad de mutación recién
identificada, se secuenciaron los segmentos VJ de cadena ligera
reorganizados de los clones deficientes en \psiV
5-6 semanas tras la subclonación. Se encontró un
total de 135 cambios de nucleótidos (figura 4A, tabla 1) en la
región de 0,5 kb entre la secuencia líder V y el extremo 5' del
intrón J-C dentro de 95 secuencias del clon
AID^{R}\psiV^{-} (figura 3, secuencia de referencia
superior). Al contrario que las secciones de conversión observadas
en las células DT40 de tipo natural, casi todos los cambios son
sustituciones de una única base y aparte de unas cuantas deleciones
cortas y cambios de dinucleótidos, no se observaron agrupaciones de
mutaciones. La falta de acontecimientos de conversión en
AID^{R}\psiV^{-}, que todavía contiene los genes \psiV del
locus de cadena ligera no reorganizado, confirma que la conversión
génica de Ig sólo incluye los genes \psiV en el mismo cromosoma
para la diversificación del gen cadena ligera reorganizado (Carlson
et al., 1990). No se encontró diversidad de secuencia en una
colección de 95 secuencias de gen de cadena ligera del clon
AID^{-/-}\psiV^{-} (figura 4A, tabla 1), lo que indica que se
requiere AID para la actividad de mutación.
Las secuencias derivadas del clon
AID^{R}\psiV^{parcial} presentan ocasionalmente tramos de
mutaciones que pueden explicarse mediante las secuencias \psiV1 y
\psiV2 restantes (figura 3, secuencia de referencia inferior). No
obstante, la mayor parte de las mutaciones
AID^{R}\psiV^{parcial} son sustituciones de una única base
sin molde tal como se observa con las células AID^{R}\psiV^{-}
(figura 4A, tabla 1). Sólo se encontraron 3 sustituciones de bases,
que posiblemente son artefactos de PCR, en 92 secuencias del clon
AID^{-/-}\psiV^{parcial} lo que confirma que las actividades
tanto de conversión génica como de mutación de
AID^{R}\psiV^{parcial} dependen de AID.
La actividad de mutación de Ig descubierta en
los clones deficientes en \psiV con un predominio de sustituciones
de un único nucleótido sugiere que la hipermutación somática había
sustituido a la conversión génica de Ig. Sin embargo, hay una
diferencia entre las sustituciones de nucleótidos en los clones
AID^{R}\psiV^{parcial} y AID^{R}\psiV^{-} y las
hipermutaciones de Ig en células B de centros germinales ya que los
clones muestran muy pocas mutaciones en bases A/T y una preferencia
por mutaciones de transversión (figura 4B).
Las hipermutaciones de Ig se localizan
normalmente dentro de un kb de la secuencia génica transcrita con
preferencias por las regiones determinantes de complementariedad
(CDR) de los segmentos V(D)J, mientras que no hay
ninguna o hay muy pocas mutaciones presentes en la región C en el
sentido de 3' (Lebecque y Gearhart, 1990). Para investigar si las
mutaciones en el clon AID^{R}\psiV^{-} siguen una distribución
similar, se extendió el análisis de secuencia a la región del
promotor y el intrón J-C del gen de cadena ligera
reorganizado (figura 5). Aunque se encuentran mutaciones cerca del
promotor y en el intrón en el sentido de 3' de los segmentos J, la
incidencia máxima coincide claramente con CDR1 y CDR3, que también
son los sitios preferidos de conversión génica en DT40 (resultados
no publicados). Aproximadamente la mitad de todas las mutaciones
puntuales se encuentran en el motivo de secuencia RGYW (R = A/G; Y
= C/T; W = A/T) o su complemento WRCY (figura 4C), conocidos como
puntos calientes de hipermutación de Ig en seres humanos y
ratones.
Previamente se notificó que la deleción de
parálogos de RAD51 induce la hipermutación de Ig en DT40 (Sale
et al., 2001). Para comparar la actividad de hipermutación en
el gen \psiV negativo y referencias negativas para parálogo de
RAD51, se perturbó el gen XRCC3 en el clon DT40^{CreI} y se
secuenciaron los genes VJ reorganizados 6 semanas tras la
subclonación. De manera similar al espectro de mutaciones en el clon
AID^{R}\psiV^{-} y a lo que se notificó previamente (Sale
et al., 2001), las mutaciones en las secuencias de las
células XRCC3^{-/-} muestran una preferencia de transversión y
una ausencia de mutaciones en las bases A/T (figura 4B). No
obstante, la tasa de mutaciones en el mutante XRCC3 fue
aproximadamente 2,5 veces inferior a la del clon
AID^{R}\psiV^{-} y hubo un claro fenotipo de crecimiento
lento del mutante XRCC3 en comparación con DT40 de tipo natural y
el clon AID^{R}\psiV^{-} (figura 4D).
Para identificar las mutaciones responsables de
la pérdida de expresión de IgMs en el clon AID^{R}\psiV^{-},
se amplificaron y secuenciaron 94 ADNc de cadena ligera de células
clasificadas como IgMs(-). Aunque se detectaron una inserción corta
y cinco deleciones en esta colección (tabla 1), el 89% de las 245
mutaciones totales son sustituciones de un único nucleótido dentro
de los segmentos VJ (figura 5). Sorprendentemente, tan sólo
aproximadamente el 10% de las secuencias contenían un codón de
terminación o un desplazamiento del marco, lo que sugiere que la
falta de expresión de IgMs(-) está provocada principalmente por
sustituciones de aminoácidos que afectan al apareamiento de las
proteínas de cadena ligera y pesada de Ig.
Se ha notificado que la alta expresión de AID en
fibroblastos (Yoshikawa et al., 2002) e hibridomas de células
B (Martin y Scharff, 2002) conduce a frecuentes mutaciones en
transgenes transfectados. Para descartar que las deleciones de
pseudogenes hayan inducido un fenotipo de hipermutación global, se
secuenciaron los extremos 5' de los genes que codifican para el
marcador específico de células B Bu^{-1} y el factor de elongación
de la traducción EF1\alpha para el clon AID^{R}\psiV^{-}.
Sólo se encontró una deleción de un pb dentro de 95 secuencias del
gen de Bu^{-1} y sólo dos sustituciones de un único nucleótido
dentro de 89 secuencias de EF1\alpha (tabla 1). Ya que estos
cambios representan lo más probablemente artefactos de PCR, esto
apoya adicionalmente el punto de vista de que las hipermutaciones
inducidas por las deleciones de \psiV son específicas del locus
de Ig.
Los resultados demuestran que la deleción de los
donadores de pseudogenes próximos suprime la conversión génica de
Ig en DT40 y activa una actividad de mutación que se parece
estrechamente a la hipermutación de Ig. Las características
compartidas entre la nueva actividad y la hipermutación somática
incluyen 1) dependencia de AID, 2) un predominio de sustituciones
de un único nucleótido, 3) distribución de las mutaciones dentro de
la región transcrita en 5', 4) una preferencia por los puntos
calientes y 5) especificidad por el gen de Ig. La única diferencia
con respecto a la hipermutación de Ig in vivo es la falta
relativa de mutaciones en las bases A/T y un predominio de
mutaciones de transversión en los clones deficientes en \psiV. Sin
embargo, esta diferencia también se observa en líneas de células B
transformadas por VEB de hipermutación (Bachl y Wabl, 1996; Faili
et al., 2002) y mutantes de DT40 de parálogos de RAD51 (Sale
et al., 2001) lo que indica que parte de la actividad de
hipermutación de Ig falta en las líneas de células B transformadas.
De manera interesante, la tasa de hipermutación de Ig en el clon
AID^{R}\psiV^{-} parece ser superior a la tasa de conversión
génica de Ig en el progenitor DT40^{CreI}. Una explicación para
esto podría ser que ciertas secciones de conversión están limitadas
a tramos de secuencias donadoras y diana idénticas y por tanto no
deja rastro.
La inducción de hipermutación de Ig mediante
bloqueo de la conversión génica de Ig apoya un modelo sencillo que
explica cómo se inicia y regula la hipermutación y la recombinación
(figura 6). Encabezando los acontecimientos existe una modificación
del segmento V(D)J reorganizado que se induce o bien
directa o bien indirectamente por AID. El procesamiento por defecto
de esta lesión en ausencia de donadores cercanos o en ausencia de
alta actividad de recombinación homóloga conduce a la hipermutación
de Ig en forma de una sustitución de un único nucleótido (figura 6,
lado derecho). Sin embargo, si hay secuencias donadoras disponibles,
el procesamiento de la lesión inducida por AID puede dividirse en
una fase antes del intercambio de cadenas, cuando todavía es
posible un cambio a la hipermutación de Ig, y una fase tras el
intercambio de cadenas cuando se ha realizado la implicación hacia
la conversión génica de Ig (figura 6, lazo izquierdo). Mientras que
la finalización de la primera fase requiere la participación de los
parálogos de RAD51, en la segunda fase participan otros factores de
recombinación tales como la proteína RAD54.
Esta diferencia en la implicación explica por
qué las perturbaciones de los parálogos de RAD51 no sólo disminuyen
la conversión génica de Ig, sino que también inducen la
hipermutación de Ig (Sale et al., 2001) mientras que la
perturbación del gen RAD54 sólo disminuye la conversión génica de Ig
(Bezzubova et al., 1997). El modelo también predice que la
baja actividad de recombinación homóloga celular evita la conversión
génica de Ig incluso en presencia de donadores de conversión. Tal
actividad de recombinación homóloga baja puede ser el motivo por el
que las células B humanas y murinas nunca usan la conversión génica
de Ig a pesar de la presencia de donadores candidatos cercanos en
forma de segmentos V no reorganizados y por qué las células B de
centros germinales de pollo se han cambiado de la conversión génica
de Ig a la hipermutación de Ig (Arakawa et al., 1998).
Los clones de DT40 AID^{R} y deficientes en
\psiV son un potente sistema experimental para tratar el papel de
factores que actúan en trans y secuencias reguladoras que actúan en
cis para la conversión génica y la hipermutación de Ig. En
comparación con sistemas de cultivo celular o con animales
alternativos, ofrece las ventajas de: 1) análisis paralelo de la
conversión génica de Ig y la hipermutación de Ig, 2) expresión de
AID condicional, 3) modificaciones fáciles del genoma mediante
direccionamiento génico, 4) proliferación celular normal y
competencia para la reparación y 5) especificidad de hipermutación
del locus de Ig. La capacidad para inducir hipermutación específica
del gen en la línea celular DT40 también podría encontrar
aplicaciones en la biotecnología. Una posibilidad es sustituir las
regiones codificantes de anticuerpos del pollo por sus homólogos
humanos y entonces estimular la maduración de afinidad de
anticuerpos a partir de un repertorio que evoluciona continuamente
mediante hipermutación de Ig.
El gen que codifica para la proteína
fluorescente verde (GFP) es un ejemplo de un ácido nucleico diana
que puede diversificarse genéticamente usando el sistema celular de
la invención, en particular la línea celular DT40. El gen de la GFP
insertado en el locus de cadena ligera de Ig mediante integración
dirigida se someterá a hipermutación y su actividad con respecto al
color, intensidad y semivida evolucionará con el tiempo (figura
7B). Si se usa una combinación de hipermutación y conversión génica
para modificar las actividades de GFP, también se insertan
secuencias de GFP variantes que pueden servir como donadores de
conversión génica para GFP en el locus de Ig (figura 7D).
En la figura 7A, se representa un vector de
sustitución de VJ de Ig, pVjRepBsr, que permite sustituir el gen VJ
de cadena ligera de Ig por cualquier ácido nucleico diana. Puede
clonarse una posible diana para la mutagénesis en el sitio SpeI,
que es compatible con los sitios XbaI, NheI, AvrII y SpeI. Por
ejemplo, puede insertarse el gen de la GFP en el locus de cadena
ligera de Ig mediante integración dirigida usando pVjRepBsr. En la
figura 7C, se representa un vector de sustitución del donador del
gen \psiV, pPseudoRepBsr, que permite sustituir el locus de
cadena ligera del gen \psiV de Ig por cualquier ácido nucleico
diana. Pueden clonarse posibles donadores de conversión génica o
bien en el sitio NheI o bien en el SpeI, que es compatible con
sitios XbaI, NheI, AvrII y SpeI. Dado que el sitio NheI está
ubicado entre dos loxP, este sitio puede usarse para el diseño
deficiente condicional. Mediante integración dirigida gradual usando
pPseudoRepGpt y pVjRepBsr, pueden sustituirse genes \psiV por el
gen de la \psiGFP y sus variantes (por ejemplo, \psiCFP:
proteína fluorescente ciano y \psiYFP: proteína fluorescente
amarilla) y el gen VJ puede sustituirse por GFP que porta una
mutación de desplazamiento del marco (FsGFP) para monitorizar la
diversificación genética del gen de GFP. Se espera que el
desplazamiento del marco en FsGFP se repare mediante conversión
génica de \psiGFP, \psiCFP y \psiYFP como moldes. Además, el
gen se diversificará adicionalmente mediante hipermuta-
ción.
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<120> Método para la diversificación
genética en células activas en la conversión génica
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<130> P 68167
\vskip0.400000\baselineskip
<140> Documento PCT/EP2005/001897
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<141>
23-02-2005
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<150> Documento EP 04004062.8
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<151>
23-02-2004
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<160> 5
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<170> PatentIn versión 3.3
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<210> 1
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<211> 34
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<212> ADN
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<213> Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador
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<400> 1
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\hskip-.1em\dddseqskipgggaagcttg atcatttcct gaatgctata ttca
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<213> Artificial
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<223> Cebador
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<400> 2
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<220>
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<223> Cadena ligera de Ig
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
Claims (36)
1. Método para la diversificación dirigida y
selectiva de genes de inmunoglobulinas endógenos o partes de los
mismos mediante hipermutación o una combinación de hipermutación y
conversión génica que comprende delecionar todos o parte de los
donadores de conversión génica en una célula B de pollo, oveja,
vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de conversión génica de
inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones perjudiciales en genes
que codifican para parálogos y análogos de la proteína RAD51.
2. Método para la diversificación dirigida y
selectiva de un ácido nucleico diana transgénico mediante (a)
hipermutación o (b) una combinación de hipermutación y conversión
génica que comprende insertar un constructo genético que contiene
(a) el ácido nucleico diana o (b) el ácido nucleico diana y al menos
una secuencia que puede servir como donador de conversión génica
para el ácido nucleico diana en el locus de inmunoglobulinas de una
célula B de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad
de conversión génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones
perjudiciales en genes que codifican para parálogos y análogos de la
proteína RAD51.
3. Método para la diversificación dirigida y
selectiva de un ácido nucleico diana transgénico mediante (a)
hipermutación o (b) una combinación de hipermutación y conversión
génica que comprende insertar un constructo genético que contiene
secuencias que dirigen la hipermutación y/o conversión génica y (a)
el ácido nucleico diana o (b) el ácido nucleico diana y al menos
una secuencia que puede servir como donador de conversión génica
para el ácido nucleico diana en el genoma de una célula B de pollo,
oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad de conversión
génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones perjudiciales
en genes que codifican para parálogos y análogos de la proteína
RAD51.
4. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que la célula contiene actividad de
recombinación homóloga de tipo natural.
5. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4, en el que la célula tiene una tasa de
proliferación inalterada.
6. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que la célula es competente para la
reparación de ADN.
7. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que la célula es una célula de linfoma
bursal de pollo.
8. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que la célula es una célula DT40 o un
derivado de la misma.
9. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en el que la célula expresa desaminasa
inducida por activación (AID).
10. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 9, en el que el ácido nucleico diana codifica
para una proteína o ejerce una actividad reguladora.
11. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 10, en el que el ácido nucleico diana codifica
para una cadena de inmunoglobulina, un marcador de selección, una
proteína de unión a ADN, una enzima, una proteína receptora o una
parte de las mismas.
12. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 11, en el que el ácido nucleico diana es un gen
V de inmunoglobulina humano o una parte del mismo.
13. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 11, en el que el ácido nucleico diana contiene
un elemento regulador de la transcripción o una secuencia de
ARNi.
14. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 13, en el que el ácido nucleico diana está
integrado en el cromosoma en una ubicación definida mediante
integración dirigida.
15. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 2 a 14, en el que el ácido nucleico diana está
operativamente unido a secuencias de ácido nucleico de control que
dirigen la diversificación genética.
16. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que la célula expresa el ácido
nucleico diana de manera que facilita la selección de células que
comprenden mutantes de dicho ácido nucleico que tienen una
actividad deseada.
17. Método según la reivindicación 16, en el que
la selección es una selección directa de la actividad del ácido
nucleico diana dentro de la célula, sobre la superficie celular o
fuera de la célula.
18. Método según la reivindicación 16, en el que
la selección es una selección indirecta de la actividad de un ácido
nucleico indicador.
19. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 18, en el que la diversificación genética del
ácido nucleico diana mediante conversión génica e hipermutación está
modulada por secuencias reguladoras que actúan en cis.
20. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 19, en el que la diversificación genética del
ácido nucleico diana mediante conversión génica e hipermutación se
modula variando el número, la orientación, la longitud o el grado
de homología de los donadores de conversión génica.
21. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 20, en el que la diversificación genética del
ácido nucleico diana mediante conversión génica e hipermutación está
modulada por un factor regulador que actúa en trans.
22. Método según la reivindicación 21, en el que
el factor regulador que actúa en trans es desaminasa inducida por
activación (AID).
23. Método según la reivindicación 21, en el que
el factor que actúa en trans es un factor de recombinación o
reparación de ADN distinto de un parálogo o análogo de RAD51.
24. Método para preparar una célula que puede
producir diversificación genética dirigida y selectiva de un ácido
nucleico diana mediante hipermutación o una combinación de
hipermutación y conversión génica que comprende (a) transfectar una
célula B de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que tiene actividad
de conversión génica de inmunoglobulinas y que no tiene mutaciones
perjudiciales en genes que codifican para parálogos y análogos de
la proteína RAD51 con un constructo genético que contiene el ácido
nucleico diana, y (b) identificar una célula que tiene el gen V
endógeno o un fragmento del mismo sustituido por el ácido nucleico
diana.
25. Método según la reivindicación 24, en el que
el constructo genético que contiene el ácido nucleico diana
contiene además al menos un ácido nucleico que puede servir como
donador de conversión génica para el ácido nucleico diana.
26. Método según la reivindicación 24 ó 25, en
el que el locus que contiene el ácido nucleico diana se construye
mediante múltiples tandas de transfección.
27. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 26, que comprende además (c) transfectar la
célula de la etapa (b) con un constructo genético adicional que
comprende un gen indicador que puede verse influido por el ácido
nucleico diana.
28. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 27, que comprende además (d) expresar de
manera condicional un factor regulador que actúa en trans.
29. Método según la reivindicación 28, en el que
el factor regulador que actúa en trans es desaminasa inducida por
activación (AID).
30. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 24 a 29, en el que el ácido nucleico diana se
inserta en el cromosoma de la célula en una ubicación particular
mediante integración dirigida.
31. Método para preparar un producto génico que
tiene una actividad deseada, que comprende las etapas de: (a)
transfectar una célula B de pollo, oveja, vaca, cerdo o conejo que
tiene actividad de conversión génica de inmunoglobulinas y que no
tiene mutaciones perjudiciales en genes que codifican para parálogos
y análogos de la proteína RAD51 con un constructo genético que
contiene un ácido nucleico diana transgénico y opcionalmente al
menos una secuencia que puede servir como donador de conversión
génica para el ácido nucleico diana; (b) cultivar las células en
condiciones apropiadas para expresar el ácido nucleico diana, (c)
identificar una célula o células dentro de la población de células
que expresan un producto génico mutado que tiene la actividad
deseada; y (d) establecer una o más poblaciones clonales de células
a partir de la célula o células identificadas en la etapa (c), y
seleccionar a partir de dichas poblaciones clonales una célula o
células que expresa(n) un producto génico que tiene una
actividad deseada mejorada.
32. Método según la reivindicación 31, en el que
las etapas (c) y (d) se repiten de manera iterativa.
33. Método según las reivindicaciones 31 ó 32,
que comprende además la etapa de inactivar la diversificación
genética.
34. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 33, en el que la diversificación del ácido
nucleico diana se modifica adicionalmente mediante la optimización
de la secuencia diana.
35. Método según una cualquiera de las
reivindicaciones 31 a 34, en el que la diversificación genética se
inactiva mediante regulación por disminución de la expresión de un
factor regulador que actúa en trans.
36. Método según la reivindicación 35, en el que
el factor regulador que actúa en trans es desaminasa inducida por
activación (AID).
TABLA 1
Perfil de mutación
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